CN110314252A - 胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，属于生物医学材料领域，该胶原蛋白为牛皮纯化胶原蛋白，复原物为具有三维孔隙结构、孔径分布为150～450μm的海绵状胶原蛋白‑壳聚糖基质，作为手术辅助复原物用于青光眼小梁切除手术。本发明提供的复原物能促进细胞或房水穿过或在其中离散增生以维持低眼压，降低碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、纤维结缔组织生长因子的表达量，使滤过道瘫痕化程度降低；其制备方法不使用戊二醛作交联剂，能降低壳聚糖结构中裸露氨基数量，避免过量氨基与组织黏连造成抗瘢痕化作用不显著的问题，破坏壳聚糖链的保护性水合作用，使基质内部孔道更小且致密，提升吸水性能。

Description

胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途。
背景技术
正常情形下房水(aqueous humor)自睫状体(ciliary body)生成后经小梁网(trabecular meshwork)，流到薛氐管(canal of Schlemm)然后流到血液中回收。青光眼患者是指此一流通渠道受阻，造成眼球内压力(Intra-ocular Pressure，IOP)异常增加(一般人正常眼压在10-21mmHg，青光眼患者IOP>21mmHg)，此高眼压会压迫视网膜及视神经，亦可能造成局部血管塌陷，影响眼球正常的血液供应，造成视神经萎缩及视野缺损，临床上称为青光眼。
青光眼是一类由病理性高眼压导致的视神经损害性疾病，是全球第二位的致盲性眼病，它呈进行性发展且不可逆，是我国老年人群常见致盲原因。青光眼患者眼部房水的正常流出道受阻，房水循环障碍，病理性眼压升高，进而导致进行性视网膜神经节细胞(retinalganglion cells，RGCs)凋亡、视神经萎缩最终导致失明。青光眼的治疗首要目的在于降低升高的眼球内压力，防止视神经及视野进一步恶化，以保护视网膜、视神经及其它组织，因此，控制眼压是目前唯一有效的治疗手段。尽管近年来抗青光眼药物、激光技术为控制眼内压提供了技术和可能，也取得较大进展，但由于疾病的特殊性，手术治疗仍是重要治疗手段。
小梁切除术或滤过性手术是青光眼手术治疗中最常用的方法，而滤过手术失败的主要原因之一是手术后术区成纤维细胞增殖，滤过泡瘢痕形成，导致人造的房水流通通道受到阻塞，眼压再度升高。因此如何减少滤过性手术后的滤过泡瘢痕化，即减少成纤维细胞增殖、减少胶原纤维合成和抑制纤维血管肉芽组织形成，一直是青光眼手术治疗研究的热点。
一些药物和方法已应用于临床，在小梁切除术或滤过性手术时常会使用如丝裂霉素-C(MMC)或抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)，虽然MMC作为青光眼手术后并用治疗为现在国内标准治疗，但是于青光眼小梁切除手术后并用MMC的治疗的并发症发生率却是58.5％。而且MMC可能引发许多的副作用(包括低眼压、浅前房、结膜变薄、眼内炎等)。显然这些药物和方法也有不足之处，应用不慎时还会带来一些负面效应，寻找更有效、更安全的药物和方法仍是目前青光眼研究的方向之一。
胶原蛋白为动物体内含量最高的蛋白质，广泛存在动物体的结缔组织间造成稳固的支架作用。胶原蛋白具有独特的稳定的三重螺旋结构，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等，其产品广泛应用于生物医学领域，具有良好的生物相容性；能保持细胞的正常生长、分化、增殖能力和分泌基质；具有可控的降解时间；材料及其降解产物对机体无毒副作用；具有可消毒性。胶原蛋白作为青光眼手术辅助是目前最有潜力的技术。截至目前为止此类可吸收性胶原蛋白作为青光眼手术辅助的临床研究，皆显示此技术是一个极安全的技术，在有效性上并不比目前的青光眼手术加上MMC药物辅助差，且不会增加青光眼手术并发症的机率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有三维孔隙结构，促进细胞、房水等穿过或在其中离散增生维持正常眼压，抑制结膜瘢痕和结膜收缩，保持滤过道通畅，降低碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)的表达量，使滤过道瘫痕化程度降低的复原物。
本发明的目的还在于提供一种不使用细胞毒性组分戊二醛作为交联剂；能降低壳聚糖结构中裸露的氨基数量，避免过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题；能破坏壳聚糖链的保护性水合作用，使基质材料内部孔道更小且致密，提升吸水性能的复原物的制备方法。
本发明的目的还在于提供胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，还包括在新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术中用于切口抗术后瘢痕化的用途，以及在组织缺失残腔、骨钉拔除空腔及骨质酥松患者骨髓腔的填充治疗中作为填充物的用途。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其中胶原蛋白为牛皮纯化胶原蛋白；复原物为具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质，该基质孔隙结构孔径分布为150～450μm；上述复原物的制备不使用细胞毒性组分戊二醛作为交联剂。该复原物基质在被置于个体眼中时，能有效促进细胞、房水等穿过该基质或在该基质中离散增生，干扰胶原沉积模式，维持正常眼压，并抑制结膜瘢痕和结膜收缩，出于对基质使用安全性的需要，用戊二醛作为交联剂不是理想或优选地，因此选用细胞毒性低的组分来制备复原物。
于本发明的一些具体实施例中，胶原蛋白为第I型胶原蛋白，胶原蛋白是通过酶溶法提取获得。酶溶法提取得胶原蛋白分子组成类型为(α1)2α2型，其三螺旋结构未被破坏，热稳定性好，具有松散、均匀的孔径结构，多孔结构对细胞行为如细胞生长、迁移、分化、质量传递、基因表达和新组织形成等都有一定的有益影响，所以在人造皮肤模板、止血海绵、药物传递载体等生物医学材料领域具有广阔的应用前景。
更具体的，酶溶法用酶为胃蛋白酶，酶添加量为4500～6000U/g，pH为1.5～2.5，温度为30～35℃，辅助微波功率为300～500W，提取时间为6～9h；酶溶法用提取介质为乙酸，提取底物为经预处理过的牛皮匀浆液，匀浆液与提取介质的料液重量比为1:10～18。酶解提取效率高，且能降低胶原的抗原性，对环境污染较小，不使用大量的酸碱等溶剂，所得胶原蛋白纯度高、品质好，是理想的提取方式。
于本发明的一些具体实施例中，复原物通过以下步骤制备：将胶原蛋白溶于介质乙酸溶液中，配制成体积浓度为1～2％的溶液，然后向其中以1:0.5～1.5的重量比例添加体积浓度为1～2％的壳聚糖乙酸混合溶液，均质乳化后，进行紫外辐照交联，所得交联产物经深冻干燥，即得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白- 壳聚糖基质。壳聚糖能选择性抑制纤维细胞生长增殖，胶原蛋白具有低免疫源性及组织修复功能，两者混制成基质材料，可用于促进伤口愈合、止血材料，在本发明中基质作为植入物可机械隔离巩膜瓣和巩膜床，避免或减少纤维粘连，保持滤过道通畅，且可在眼内缓慢降解，生物相容性良好。
更具体的，深冻干燥操作条件为：深冻温度为-80～-40℃，时间为4～10h，然后于-20～-10℃下干燥12～24h。将交联产物先进行深冻，在深冻温度下，产物及体系中的液体分子迅速形成冰晶，相较普通冷冻(-20～-10℃)而言，冰冻速度快，汁液流失率少，产物内部冰晶分布均匀，在经干燥脱水后内部冰晶留下均匀的孔洞，使得基质内部趋向蜂窝状组织，可以增加基质材料的孔隙率和吸水倍数，能较好的吸收创面渗出液、房水等，并防止体液及水分损失。
更具体的，紫外辐照交联操作条件为：辐照强度为297nm，辐照距离为 15～25cm，温度为0～4℃。体系在紫外线辐照产生的能量波冲击作用下，壳聚糖和胶原蛋白结构中的链节被轰击，并重新进行排列和链接以维持分子结构的稳定性，结构因此发生变化，从分离的片层式结构转变成交联的三维空间结构。
更具体的，溶解胶原蛋白的介质乙酸溶液中含有0.03～0.1mM的β-羟基-β- 甲基丁酸钙和0.02～0.07mM的反丁烯二酸钠。介质为胶原蛋白和壳聚糖的交联提供了场所，在紫外线辐照下，壳聚糖和胶原蛋白为了维持分子构象的稳定性，壳聚糖中的氨基及胶原蛋白中的氨基酸残基趋向于相互靠近的收缩方式，然而相同电荷的基团容易受到静电斥力作用而产生排斥，因此加入β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠利用其自身羟基及羧基与氨基或氨基酸残基结合，与中间进行桥架，使得壳聚糖和胶原蛋白链节间相互交联以完成稳定分子结构的目的，且降低了裸露的氨基数量，避免过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题，另一方面两者在基质降解过程中被释放，并进入结膜囊成纤维细胞内，使细胞内溶质中Ca2+、Na+浓度增高，抑制细胞代谢功能，降低碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF) 的表达量，从而使滤过道瘫痕化程度降低，提高手术成功率。
于本发明的一些具体实施例中，复原物为含眼用药物的嵌合式基质，上述眼用药物包括含双醛基的氧化多糖、丝裂霉素-C(MMC)、环孢素A、干扰素(IFN)、透明质酸钠/透明质酸/透明质酸醛、藻酸盐/酯、雷公藤甲素。优选地，上述含双醛基的氧化多糖包括但不限于：含双醛基的氧化肝素、含双醛基的氧化硫酸软骨素、含双醛基的氧化海藻酸钠、含双醛基的氧化岩藻多糖、含双醛基的氧化淀粉、含双醛基的氧化透明质酸、含双醛基的氧化瓜尔胶、含双醛基的氧化葡聚糖中的一种或几种。上述眼用药物的作用包括但不限于：具有防治青光眼术后滤过泡纤维化的功效，抑制成纤维细胞活化增殖及胶原蛋白合成；减轻创伤后炎症反应，从而抑制术后纤维瘢痕形成；对视网膜神经节细胞(RGCs)有一定的保护作用。当复原物基质植入眼内时，药物也随着植入到眼内，随着载体基质降解，药物逐渐释放而起到治疗作用，且存在显著的药物缓释作用，减少了外部用药频率和刺激性损伤，增强愈合效果。
于本发明的一些具体实施例中，复原物包括在青光眼小梁切除手术中的用途，所述复原物植入方式为进行结膜缝合前植入巩膜瓣上的结膜下空间。复原物的施用主要是借助基质的多孔性结构给植入部位增生的组织细胞提供增生环境，引导纤维母细胞随机分布于孔隙中而不产生结膜下瘢痕，保持功能性滤过泡畅通不堵塞；能够提供多余房水储存处，吸收房水后的基质在巩膜瓣下形成一定压力作用，在结膜开/合情况下，伴随的压力得以控制房水的进出，如此可以调节和稳定初期未愈合伤口下的眼压；可取代MMC等抑制结疤药物的使用，避免产生因为使用该等药物所导致的不良副作用；能与眼内降解吸收，建立长久有效的愈合组织，没有毒副作用，提高青光眼的手术成功率。
于本发明的一些具体实施例中，复原物还包括在新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术中用于切口抗术后瘢痕化的用途。复原物的施用主要是借助基质的多孔性结构给植入部位增生的组织细胞提供增生环境，使其随机分布于孔隙中而不产生结膜下瘢痕，不影响角膜内皮数量和房水循环系统，眼内生物相容性好，可在眼内降解吸收，不需要二次手术取出，没有毒副作用，建立长久有效的愈合组织，可使裸露的伤口愈合正常化。
于本发明的一些具体实施例中，复原物还包括在组织缺失残腔、骨钉拔除空腔及骨质酥松患者骨髓腔的填充治疗中作为填充物的用途。该复原物作为填充物使用，如骨髓基质细胞、组织细胞在基质中均生长良好，细胞及纤维束伸展更充分，细胞形态更好引，有利于机体细胞及组织修复及再生。
本发明的有益效果为：
1)本发明中制备的胶原蛋白热稳定性好，具有松散、均匀的孔径结构，其制备用酶具有高活性和高稳定性，提取反应效率及产物得率高，且能降低胶原的抗原性，对环境污染较小，不使用大量的酸碱等溶剂；
2)本发明中制备的复原物基质材料为具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白- 壳聚糖基质，能有效促进细胞、房水等穿过该基质或在该基质中离散增生，干扰胶原沉积模式，维持正常眼压，并抑制结膜瘢痕和结膜收缩，保持滤过道通畅，降低碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)的表达量，从而使滤过道瘫痕化程度降低，提高手术成功率；
3)本发明中复原物的制备不使用细胞毒性组分戊二醛作为交联剂，采用紫外辐照交联，能降低壳聚糖结构中裸露的氨基数量，避免过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题，且能破坏壳聚糖链的保护性水合作用，使形成的基质材料内部孔道更小且致密，有利于表现出更优异的吸水性能，进而有效将术后初期眼压维持或稳定在较低的状态下；
4)本发明中胶原蛋白植入物及复原物基质材料用于青光眼小梁切除手术中，还包括在新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术中用于切口抗术后瘢痕化的用途，还包括在组织缺失残腔、骨钉拔除空腔及骨质酥松患者骨髓腔的填充治疗中作为填充物的用途。
本发明采用了上述技术方案提供胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为胶原蛋白微结构的扫描电镜图像；
图2为复原物基质材料的扫描电镜图像；
图3为复原物基质材料的生物相容性组织学观察(40×)示意图；
图4为术后免疫组化的b-FGF表达观察图。
附图标记说明：
图2：a-实施例2，b-实施例3；
图3：a-植入第3天，b-植入第1周，c-植入第2周，d-植入第4周；
图4：A-实施例2，B-实施例5。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其中胶原蛋白为牛皮纯化胶原蛋白；复原物为具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质，该基质孔隙结构孔径分布为150～450μm；上述复原物的制备不使用细胞毒性组分戊二醛作为交联剂。该复原物基质在被置于个体眼中时，能有效促进细胞、房水等穿过该基质或在该基质中离散增生，干扰胶原沉积模式，维持正常眼压，并抑制结膜瘢痕和结膜收缩，出于对基质使用安全性的需要，用戊二醛作为交联剂不是理想或优选地，因此选用细胞毒性低的组分来制备复原物。
胶原蛋白为第I型胶原蛋白，胶原蛋白是通过酶溶法提取获得。酶溶法提取得胶原蛋白分子组成类型为(α1)2α2型，其三螺旋结构未被破坏，热稳定性好，具有松散、均匀的孔径结构，多孔结构对细胞行为如细胞生长、迁移、分化、质量传递、基因表达和新组织形成等都有一定的有益影响，所以在人造皮肤模板、止血海绵、药物传递载体等生物医学材料领域具有广阔的应用前景。
酶溶法用酶为胃蛋白酶，酶添加量为5000U/g，pH为2.0，温度为30℃，辅助微波功率为350W，提取时间为9h；酶溶法用提取介质为乙酸，提取底物为经预处理过的牛皮匀浆液，匀浆液与提取介质的料液重量比为1:15。酶解提取效率高，且能降低胶原的抗原性，对环境污染较小，不使用大量的酸碱等溶剂，所得胶原蛋白纯度高、品质好，是理想的提取方式。
预处理过的牛皮匀浆液通过以下步骤获得：将牛皮机械脱毛，清除毛屑、皮下肉和脂肪，冲洗干净后，将皮切成1cm×1cm的小块，在10℃下，用质量分数为5％的Na2CO3水溶液脱脂16h，得到脱脂牛皮，然后以料液重量比1:15的比例加入质量分数为5％的NaCl溶液去除盐溶性非胶原成分，最后用蒸馏水漂洗数次，得到干净的牛皮颗粒，再将牛皮颗粒以料液重量比1:10加入到0.5mol/L 的乙酸介质中溶胀12h，然后用高速组织捣碎机在转速为12000r/min、温度为15℃条件下匀浆即得。
酶溶法制备过程中所得酶解液需经过盐析、透析进行纯化，具体步骤如下：将酶解液离心并取上清液，向上清液中缓慢加入NaCl，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(NaCl的最终浓度为0.9mol/L，静置分层12h)，然后于8000r/min 条件下离心20min，收集絮状物，用0.5mol/L的乙酸复溶后，置于0.1mol/L的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2～3d，最后冷冻干燥即得胶原蛋白，上述操作均在4℃条件下进行。
复原物通过以下步骤制备：将胶原蛋白溶于介质乙酸溶液中，配制成体积浓度为1％的溶液，然后向其中以1:0.8的重量比例添加体积浓度为1.5％的壳聚糖乙酸混合溶液，均质乳化后，进行紫外辐照交联，所得交联产物经深冻干燥，即得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质。壳聚糖能选择性抑制纤维细胞生长增殖，胶原蛋白具有低免疫源性及组织修复功能，两者混制成基质材料，可用于促进伤口愈合、止血材料，在本发明中基质作为植入物可机械隔离巩膜瓣和巩膜床，避免或减少纤维粘连，保持滤过道通畅，且可在眼内缓慢降解，生物相容性良好。
均质乳化具体步骤如下：使用胶体磨乳化机将混合体系在转速1800r/min、频率50Hz的条件下搅拌30min，再在转速1400r/min、频率40Hz的条件下搅拌 60min完成乳化。
深冻干燥操作条件为：深冻温度为-60℃，时间为10h，然后于-10℃下干燥 24h。将交联产物先进行深冻，在深冻温度下，产物及体系中的液体分子迅速形成冰晶，相较普通冷冻(-20～-10℃)而言，冰冻速度快，汁液流失率少，产物内部冰晶分布均匀，在经干燥脱水后内部冰晶留下均匀的孔洞，使得基质内部趋向蜂窝状组织，可以增加基质材料的孔隙率和吸水倍数，能较好的吸收创面渗出液、房水等，并防止体液及水分损失。
紫外辐照交联操作条件为：辐照强度为297nm，辐照距离为15cm，温度为 4℃。体系在紫外线辐照产生的能量波冲击作用下，壳聚糖和胶原蛋白结构中的链节被轰击，并重新进行排列和链接以维持分子结构的稳定性，结构因此发生变化，从分离的片层式结构转变成交联的三维空间结构。
溶解胶原蛋白的介质乙酸溶液中含有0.08mM的β-羟基-β-甲基丁酸钙和 0.07mM的反丁烯二酸钠。介质为胶原蛋白和壳聚糖的交联提供了场所，在紫外线辐照下，壳聚糖和胶原蛋白为了维持分子构象的稳定性，壳聚糖中的氨基及胶原蛋白中的氨基酸残基趋向于相互靠近的收缩方式，然而相同电荷的基团容易受到静电斥力作用而产生排斥，因此加入β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠利用其自身羟基及羧基与氨基或氨基酸残基结合，与中间进行桥架，使得壳聚糖和胶原蛋白链节间相互交联以完成稳定分子结构的目的，且降低了裸露的氨基数量，避免过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题，另一方面两者在基质降解过程中被释放，并进入结膜囊成纤维细胞内，使细胞内溶质中Ca2+、 Na+浓度增高，抑制细胞代谢功能，降低碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)的表达量，从而使滤过道瘫痕化程度降低，提高手术成功率。
实施例2：
青光眼手术辅助复原物的制备方法，具体步骤如下：
1)将牛皮机械脱毛，清除毛屑、皮下肉和脂肪，冲洗干净后，将皮切成 1cm×1cm的小块，在5℃下，用质量分数为5％的Na2CO3水溶液脱脂16h，得到脱脂牛皮，然后以料液重量比1:15的比例加入质量分数为5％的NaCl溶液去除盐溶性非胶原成分，最后用蒸馏水漂洗数次，得到干净的牛皮颗粒，再将牛皮颗粒以料液重量比1:10加入到0.5mol/L的乙酸介质中溶胀12h，然后用高速组织捣碎机在转速为12000r/min、温度为15℃条件下匀浆，即得预处理过的牛皮匀浆液；
2)以料液重量比为1:18的比例向匀浆液中加入浓度为1mol/L的乙酸溶液，混均后，添加6000U/g的胃蛋白酶，调节体系pH为1.8，在温度为33℃、辅助微波功率400W的条件下提取7.5h，得到酶解液；
3)将酶解液离心并取上清液，向上清液中缓慢加入NaCl，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(NaCl的最终浓度为0.9mol/L，静置分层12h)，然后于 8000r/min条件下离心20min，收集絮状物，用0.5mol/L的乙酸复溶后，置于 0.1mol/L的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2～3d，最后冷冻干燥即得胶原蛋白，上述操作均在4℃条件下进行；
4)将胶原蛋白溶于含有0.05mM的β-羟基-β-甲基丁酸钙和0.04mM的反丁烯二酸钠的乙酸溶液中，配制成体积浓度为1.5％的溶液，然后向其中以1:1.3的重量比例添加体积浓度为1.8％的壳聚糖乙酸混合溶液，使用胶体磨乳化机将上述混合体系在转速1800r/min、频率50Hz的条件下搅拌30min，再在转速 1400r/min、频率40Hz的条件下搅拌60min完成均质乳化后，在辐照强度为297nm、辐照距离为20cm、温度为4℃的条件下进行紫外辐照交联，所得交联产物经-80℃下深冻6h，然后于-20℃下干燥20h，即得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白- 壳聚糖基质。
实施例3：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤2)以料液重量比为1:18的比例向匀浆液中加入浓度为1mol/L的乙酸溶液，混均后，添加6000U/g的胃蛋白酶，调节体系pH为1.8，在温度为33℃、辅助微波功率400W的条件下提取7.5h，得到酶解液，上述乙酸溶液中含有 0.05mM的甘油磷酸钙和0.05mM的D-3-羟基丁酸，首先甘油磷酸钙和D-3-羟基丁酸在体系中引入如磷酸离子、钙离子等，改变体系活化能，降低底物内部粘度，然后利用酶的两性电解属性，深入酶结构的疏水非极性区，将在酶内部低介电环境中的催化基团保护起来，以此保证了酶的高活性和高稳定性，以此提高酶解反应效率及产物得率，其次两者能利用其亲水性基团附着于胶原蛋白上，同时能通过氢键及多醇基团将壳聚糖链的保护性水合作用破坏，使得壳聚糖聚合成更大的分子以及空间空隙，在壳聚糖聚合中将胶原蛋白有效填补进空间空隙中，使形成的基质材料内部孔道更小且致密，有利于表现出更优异的吸水性能，进而能将更多房水储存在内，从而有效将术后初期眼压维持或稳定在较低的状态下；
其他步骤与实施例2中一致，制得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质。
实施例4：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤4)所得基质材料经在处理后，嵌合有眼用药物氧化硫酸软骨素，其具体步骤如下：
5)称取12重量份的硫酸软骨素，加入10倍量的水搅拌溶解，用1mol/L的盐酸水溶液调pH值至pH5.0，加入1重量份的氧化剂NaIO4，于4℃下密闭容器中避光氧化反应18h。反应毕，将反应液装入截留分子量为3000Da的透析袋中，避光、4℃下蒸馏水透析24h，其中每6h更换蒸馏水一次，透析结束后，将透析袋内的液体于冷冻干燥机冷冻干燥48h，制得含双醛基的氧化硫酸软骨素，其双醛基百分含量为2.5％(双醛基百分含量是指多糖分子中含双醛基的糖单元占多糖分子总糖单元的百分数)；
6)将制得的氧化硫酸软骨素溶解于浓度为1％的医用几丁糖溶液中，配制成浓度为2.5mg/mL的溶液，然后将制得的基质放入其中，待浸泡平衡后，放入-20℃冰箱深冻过夜10h，然后冷冻干燥即得含眼用药物的嵌合基质；
其他步骤与实施例2中一致，制得具有含眼用药物的嵌合式胶原蛋白-壳聚糖基质。
实施例5：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤4)中，胶原蛋白溶解介质乙酸溶液中未添加β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠的；
其他步骤与实施例2中一致，制得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质。
实施例6：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤4)中，所得交联产物未经深冻干燥，其干燥操作条件为：温度为-20℃，干燥时间为30h；
其他步骤与实施例2中一致，制得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质。
实施例7：
本实施例中，将实施例2所制复原物用作青光眼小梁切除手术辅助植入物，植入方式为进行结膜缝合前植入巩膜瓣上的结膜下空间。使用后，患者眼内眼压未出现升高状态，适应效果良好，未出现机体排斥反应及副作用。
实施例8：
本实施例中，将实施例2所制复原物用作新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术中切口及缝合处植入物。使用后，患者切口愈合良好，未见或少见切口瘢痕化，生物相容性好，可在机体内直接降解吸收，不需要二次手术取出，未出现机体排斥反应及副作用，使裸露的伤口愈合正常化。
实施例9：
本实施例中，将实施例2所制复原物用作组织缺失残腔、骨钉拔除空腔及骨质酥松患者骨髓腔的填充治疗中的填充物。使用后，患者填充处的细胞及组织修复及再生效果良好，未出现机体排斥反应及副作用。
试验例1：
胶原蛋白植入物及复原物基质材料的形貌观察
试验方法：将干燥的胶原蛋白或复原物基质材料样品在SCD005离子溅射仪上进行喷金处理，再于扫描电镜上观察样品的表面和截面结构，扫描电压为5kV。
试验样品：实施例2所制胶原蛋白和复原物基质材料，以及实施例3所制复原物基质材料。
所得扫描电镜结果图如附图1、2所示，其中图1为胶原蛋白微结构的扫描电镜图像，图2为复原物基质材料的扫描电镜图像(a-实施例2，b-实施例3)。由图1可知，胶原蛋白呈现均匀、多孔的网络结构；图2可知，基质材料整体排列有序，网孔大小基本一致，测量出海绵孔径大小为150～450μm，其中实施例3 (b)所得基质材料结构内部孔道更小且致密，得益于实施例3中胶原蛋白提取中加入的甘油磷酸钙和D-3-羟基丁酸。
试验例2：
复原物基质材料吸水性能的测定
试验方法：取相同重量的基质材料，室温下将其浸于20mL PBS溶液中使其充分吸水，用钝头镊子轻轻夹住一角提出水面，于滤网上控干约1min，称量海绵吸水后重量，取平均值，并按下式进行计算：
，其结果如下表1所示。
试验样品：实施例2、3所制复原物基质材料。
表1复原物基质材料吸水性能的测定结果
实施例2 实施例3
吸水倍数 15.36 17.56
由上表可知，实施例3所制基质材料的吸水倍数显著高于实施例2所制基质材料，这是由于实施例3中胶原蛋白提取中加入的甘油磷酸钙和D-3-羟基丁酸，使得所得基质材料结构内部孔道更小且致密，故而增强其吸水性能，吸水性能的增强，能将更多房水储存在内，从而有效将术后初期眼压维持或稳定在较低的状态下。
试验例3：
复原物的体内降解性试验
试验样品：实施例2所制基质材料。
1、体内生物相容性测定：选用封闭群纯系雄性SD大鼠作为试验动物，在大鼠双侧腿部肌肉为植入位点，每只鼠植入2个点，每个植入点植入一片直径为 5mm的圆片状基质材料，左腿为空白组，右腿为试验组，分别在第3天、1周、 2周、4周分别处死动物，每次2只。首先进行大致观察，然后迅速取注射部位的肌肉进行10％甲醛固定，石蜡包埋，然后进行染色。结果如图3所示。
图3为复原物基质材料的生物相容性组织学观察(40×)示意图，其中a为术后第3天，箭头指示处表明植片产生大量炎性细胞；b为植入1周后，植片周围仍有少量炎性细胞，但较第一周急剧减少；c为植入第2周，d为植入第4周，皆无明显的炎性反应，炎性细胞消失，植入部位肌肉纤维排列规则紧密，已和正常的组织无异。由试验可知，复原物植入大鼠的腿部肌肉后，植入部位无明显的红肿现象，随着时间的推移，复原物植片表现出良好的生物相容性。
2、体内生物降解性测定：选用封闭群纯系雄性SD大鼠作为试验动物，在背部皮下为植入位点，每个植入点植入一片直径5mm的基质材料，分别在第1、 2、4、8、12周分别处死动物，每次2只，观察基质材料残留情况，以及剥离基质材料，并观察海绵剥离后的组织反应情况。
试验结果：基质材料植于鼠的背部皮下时，基质材料吸水后变软，并紧紧贴附在背部肌肉上方，在前两周，降解的速度较慢，2周后，其降解速度加快，部分吸收，植片变小，壳聚糖也被逐渐降解，分子量变小，至第12周末时，肉眼已看不出植片，仅病理切片中可见组织间隙少量壳聚糖残留，壳聚糖可被降解，而且植片部位组织无出血、红肿等炎性反应；
经过不同时间段观察残留植片的情况，其中可以发现，植片早期降解速度较慢，而且吸收了周围的液体，形成物理性的间隙，随着时间的推移，各种酶的降解，植片的体积逐渐减小，直至3月末基本消失。
试验例4：
复原物预防青光眼术后瘢痕化的体内试验
试验样品：实施例2、3、4、5、6所制基质材料。
试验方法：
1、造模：健康成年新西兰兔30只，随机分为5组，每组6只，进行非穿透性小梁切除手术，左眼为空白组(生理盐水)，右眼为复原物基质组；试验动物以3％戊巴比妥钠按40mg/kg体重耳源静脉注射麻醉，留置导管，必要时追加麻醉，术眼滴可乐必妥眼液3次，爱尔卡因表面麻醉术眼3次，碘伏消毒术眼；
2、手术：选以穹隆部为基底的结膜瓣，作1/2巩膜厚度、5mm×5mm三角形巩膜瓣，剪除1mm×3mm长方形小梁组织和2mm×3mm周边虹膜，将基质直接植入巩膜瓣上的结膜下空间，用10-0尼龙线间断缝合巩膜瓣1～2针，并缝合球结膜瓣，术后类固醇激素眼药水点眼1个月，术后1d、3d、7d和1个月、2 个月、3个月、6个月测眼压，观察并记录滤过泡形态及临床不良反应；
3、观察：1)滤过泡：使用超生生物显微镜对生成的滤过泡及滤过道的面积和高度进行观察，显微镜探头频率为50Hz，探查深度为4mm，分辨率为20μm；
2)眼压：取上午9:00时用手持回弹式眼压计，测量兔眼双眼眼压，每眼测量3次，取平均值。
试验结果：1、新西兰兔眼滤过手术后术眼结膜充血、角膜水肿及其他眼部刺激症状5组间比较无明显差异，5组术眼均表现为手术区结膜轻度充血及少量出血，但恢复较快，3天左右充血反应消失；
2、各组在手术后3天形成形态良好的滤过泡，3个月乃至6个月后仍维持可见，且未形成明显的瘢痕，术后各时间点测量的滤过泡高度及面积结果如下表 2、3所示：
表2术后各时间点测量的滤过泡高度的比较(单位：mm)
表3术后各时间点测量的滤过泡面积的比较(单位：mm2)
1d 3d 7d 1个月 2个月 3个月 6个月
实施例2 176.6 165.4 153.6 139.2 113.5 81.6 57.2
实施例3 175.6 167.5 154.3 135.9 116.4 82.4 53.9
实施例4 186.2 172.3 162.3 136.8 117.0 82.5 59.2
实施例5 126.2 115.1 91.4 76.6 65.3 60.6 36.9
实施例6 158.1 151.6 136.2 128.3 106.2 76.2 0.43
空白组 118.2 101.6 75.3 63.3 26.3 0 0
由表2和3可知，实施例2、3、4的抗瘢痕化效果最好，术后6个月仍能维持滤过泡形态，然而实施例4中药物容易引起眼部刺激及副作用，在实际应用中可酌情使用；实施例6效果略差，是由于制备过程中深冻操作条件的差异导致的，经过深冻的基质材料明显效果更好；实施例5效果最差，是由于制备中介质溶液的差异引起的，说明β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠可以避免壳聚糖分子中过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题，使滤过道瘫痕化程度降低；
3、各组在手术前及手术后各时间点眼压的测定结果如下表4所示：
表4术前及术后各时间点眼压值的比较(单位：mmHg)
0d 1d 3d 7d 1个月 2个月 3个月 6个月
实施例2 18.6 11.63 11.62 11.63 11.68 11.70 11.85 12.36
实施例3 18.5 11.62 11.32 11.34 11.52 11.63 11.81 12.14
实施例4 18.6 11.59 11.23 11.24 11.56 11.62 11.92 12.34
实施例5 18.4 11.56 11.67 11.86 12.65 15.89 18.26 18.98
实施例6 18.5 11.62 11.65 11.75 12.39 15.24 17.64 18.11
空白组 18.4 11.60 11.69 11.92 12.84 16.01 17.68 18.69
由表4可知，实施例2、3、4的抗瘢痕化效果最好，术后6个月仍能维持眼压处于较低的范围内，然而实施例4中药物容易引起眼部刺激及副作用，在实际应用中可酌情使用；实施例6效果在2个月以后表现略差，是由于制备过程中深冻操作条件的差异导致的，经过深冻的基质材料明显效果更好；实施例5效果最差，是由于制备中介质溶液的差异引起的，说明β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠可以避免壳聚糖分子中过量氨基与组织发生黏连造成的抗瘢痕化作用不显著的问题，使滤过道瘫痕化程度降低，从而降低并维持低眼压。
试验例5：
复原物在青光眼术后免疫组化试验
试验样品：实施例2及5所制复原物基质材料。
试验方法：分别检测手术后3d、7d、14d滤过区标本内碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)抗原的表达，步骤如下：将滤过区组织进行脱蜡、水化组织切片，用浓度为3％的双氧水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，然后滴加一抗于37℃孵育2小时，冲洗，再滴加二抗于37℃孵育30min，冲洗，选用DBA显色剂进行显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明，用封片剂进行封片，在光镜下进行观察细胞间质及抗原阳性细胞的表达情况，结果如图4、表5、表6、表7所示。
图4为术后免疫组化的b-FGF表达观察图，其中A组为实施例2，B组为实施例5。
表5兔眼切片组织b-FGF免疫组化密度值及阳性细胞个数结果
表6兔眼切片组织TGF-β2免疫组化密度值及阳性细胞个数结果
表7兔眼切片组织CTGF免疫组化密度值及阳性细胞个数结果
由图4和表5可知，A组术后3天b-FGF表达增加，术后7天达到高峰， 14天表达减少，而B组切片组织中b-FGF的表达较A组弱；由表6可知，A组术后3天TGF-β2的表达增加，术后7天到高峰，14天表达量减少，B组结膜滤过泡免疫组化染色稀疏、密度低，TGF-β2呈弱阳性表达，与A组有显著性差异；由表7可知，A组CTGF的变大呈强阳性，术后7d时染色密度最大，B组免疫组化染色稀疏、密度低，CTGF呈弱阳性表达，与A组有显著性差异；对比可知，实施例2较实施例5制备所用介质差异造成的，说明介质中加入的β-羟基-β-甲基丁酸钙和反丁烯二酸钠有显著的降低碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β2)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)的表达量的效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述胶原蛋白为牛皮纯化胶原蛋白；所述复原物为具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质，所述基质孔隙结构孔径分布为150～450μm；所述复原物的制备不使用细胞毒性组分戊二醛作为交联剂。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述胶原蛋白为第I型胶原蛋白，所述胶原蛋白是通过酶溶法提取获得。
3.根据权利要求2所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述酶溶法用酶为胃蛋白酶，酶添加量为4500～6000U/g，pH为1.5～2.5，温度为30～35℃，辅助微波功率为300～500W，提取时间为6～9h；所述酶溶法用提取介质为乙酸，提取底物为经预处理过的牛皮匀浆液，匀浆液与提取介质的料液重量比为1:10～18。
4.根据权利要求1所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述复原物通过以下步骤制备：将胶原蛋白溶于介质乙酸溶液中，配制成体积浓度为1～2％的溶液，然后向其中以1:0.5～1.5的重量比例添加体积浓度为1～2％的壳聚糖乙酸混合溶液，均质乳化后，进行紫外辐照交联，所得交联产物经深冻干燥，即得具有三维孔隙结构的海绵状胶原蛋白-壳聚糖基质。
5.根据权利要求4所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述深冻干燥操作条件为：深冻温度为-80～-40℃，时间为4～10h，然后于-20～-10℃下干燥12～24h。
6.根据权利要求4所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述紫外辐照交联操作条件为：辐照强度为297nm，辐照距离为15～25cm，温度为0～4℃。
7.根据权利要求4所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述溶解胶原蛋白的介质乙酸溶液中含有0.03～0.1mM的β-羟基-β-甲基丁酸钙和0.02～0.07mM的反丁烯二酸钠。
8.根据权利要求1所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述复原物包括在青光眼小梁切除手术中的用途，所述复原物植入方式为进行结膜缝合前植入巩膜瓣上的结膜下空间。
9.根据权利要求1所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述复原物还包括在新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术中用于切口抗术后瘢痕化的用途。
10.根据权利要求1所述的胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其特征在于：所述复原物还包括在组织缺失残腔、骨钉拔除空腔及骨质酥松患者骨髓腔的填充治疗中作为填充物的用途。
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