CN105288733B - 一种生物视膜的新应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种生物视膜，其应用于眼科领域的组织修复，所述组织修复包括青光眼小梁切除手术、新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术；其制备方法包括：按预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液后进行乳化；将乳化所得浆液进行抽真空之后浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜。本发明有益效果：制备的生物视膜主要成分为胶原蛋白，具有良好生物相容性、可降解性，控制炎症反应；高纯度胶原无抗原性和排斥性；具有三维孔隙结构可引导纤维母细胞随机且离散增生；可抑制结膜瘢痕和结膜收缩，维持正常眼压。

Description

一种生物视膜的新应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料领域，特别是指一种生物视膜的新应用及其制备方法。

背景技术

在眼科术后防止受损组织瘢痕形成的治疗中，常采用的抗代谢药物治疗方法存在不足之处，应用不慎甚至会带来一些负面效应，寻找更有效、更安全的生物医用材料是目前眼科研究的方向之一，而生物视膜是理想眼组织修复材料。

生物视膜主要原料为高纯度I型胶原蛋白，胶原蛋白主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础，分子量为300KD。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，其由3条α链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3条左手螺旋链叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构，胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位，胶原蛋白产品广泛应用于生物医学领域，具有良好的生物相容性；能保持细胞的正常生长、分化、增殖能力和分泌基质；具有可控的降解时间；材料及其降解产物对机体无毒副作用；具有可消毒性。

随着医疗科学技术的进步及医学材料的不断发展，在医疗领域以胶原蛋白为基础的产品获得了显著的发展。如本公司在先的专利，专利号为02121227.9，专利名称为医用胶原蛋白材料及其制造工艺，就公开了一种医用胶原蛋白材料，其由牛肌腱组织为基料，经过除杂、清洗、酸碱酶处理、冷冻干燥、温度交联、及γ-辐射或环氧乙烷灭菌等工序制成具有三维孔隙结构的海绵状医用胶原蛋白材料，具有结构稳定、生物相容性好、可吸收等特点。

眼科领域中，青光眼发病率较高，其治疗最主要的方式为小梁切除术，虽然这类手术应用广泛，但术后2年内失败率仍达15～25％。导致手术失败的主要原因是成纤维细胞的增殖，细胞外间质的合成(主要是胶原和葡糖氨聚糖的合成)，以及继之发生的结膜下组织纤维化，从而使手术形成的外引流通道狭窄甚至关闭，其组织病理学特征为成纤维细胞增殖，滤过性瘢痕形成。因此如何抑制术后滤过泡瘢痕化，即减少成纤维细胞增殖、减少胶原纤维合成和抑制纤维血管肉芽组织形成是应用材料与药物治疗的关键。

具有三维孔隙结构的生物视膜有望应用于青光眼小梁切除术中以抑制结膜细胞增生，防止瘢痕形成，维持滤泡功能，维持低眼压。该生物视膜在与人体组织相互作用时，并非抑制纤维母细胞，而是为眼内纤维母细胞提供了良好的生长环境，引导纤维母细胞离散地依附在基质的孔洞上生长，而建立一个以正常生理结构为主的眼内组织，从而抑制组织瘢痕化。将多孔生物视膜直接植入于小梁切除术造成的巩膜瓣上的结膜下空间可以减少滤过泡瘢痕化，从而提高青光眼的手术成功率，同时，到目前为止，还没有一种被临床公认为确切有效的药物。许多药物仅在动物实验中表现出良好的效果，而在临床试验中却并无抑制瘢痕的作用。临床上现在仍多采用术中联合抗代谢药物如丝裂霉素来抑制成纤维细胞的增生，从而达到抗粘连的作用。但抗代谢药物存在许多副作用，如术后结膜瓣渗漏，角膜内皮损伤，有时甚至会造成伤口不愈合、组织坏死、低眼压、黄斑变性等严重后果，故临床应用比较慎重，因此，寻找高效、低毒的抗瘢痕物质来提高手术成功率成为当务之急。从而具有三维孔隙结构的生物视膜取代以往眼科手术中所应用的抗代谢药物等副作用较大的治疗方法。

眼科手术后胬肉的高复发率是翳状胬肉切除后最主要的问题，研究报告报道其术后复发率为25％到80％，复发的翳状胬肉在组织病理学上观察特征，主要为纤维母细胞增生及新生血管增生，且通常复发的深度比初发的翳状胬肉所导致的弹力层变性更深，范围更广。而应于生物视膜进行治疗，可使裸露的巩膜伤口愈合正常化，限制复发的翳状胬肉局部生长。

除此之外，生物视膜还可用于鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术中预防瘢痕、结疤。

因此，应用于眼科的生物视膜，具备以下优点：引导纤维母细胞随机分布增生，使伤口不产生瘢痕；在青光眼滤过显微手术后，提供一个引流的功能；提供多余房水储存处；加快手术伤口愈合但不粘连；大幅地减少伤口收缩反应及形成一个正常的结膜组织；建立长久有效的愈合组织。因此，生物视膜具备替代现有药物治疗青光眼等眼科疾病的用途。同时，研发一种用于眼科的生物视膜的制备方法，是很有必要的。

发明内容

一种生物视膜，其应用于眼科领域的组织修复，所述组织修复包括青光眼小梁切除手术、新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术。

本发明还提出一种生物视膜的制备方法，解决了现有技术中尚无较好地生物视膜制备方法的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物视膜的制备方法，包括：

按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液；

将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化；

将乳化所得的浆液进行抽真空；

将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜。

进一步地，所述按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液的步骤具体为：

每600ml冰醋酸水溶液加入3～5g高纯度I型胶原蛋白，在0～30℃的温度条件下混合搅拌，所述冰醋酸水溶液的浓度为0.3～0.5％，所述冰醋酸水溶液的pH值为2.5～5.0。

进一步地，所述将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化的步骤具体为：

使用胶体磨乳化机将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌35～45min，然后根据黏稠度缓慢下调转速和频率搅拌20～30min，再在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌60～120min进行乳化。

进一步地，所述将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜的步骤具体为：

将抽真空之后的浆液在温度-50～-40℃、压力≤0.2mbar的条件下进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜。

进一步地，在所述按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液的步骤之后，以及所述将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化的步骤之前，还包括以下步骤：

在高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液中添加氨基酸，所述氨基酸包括酪氨酸和苯丙氨酸，所述酪氨酸的浓度为72mg/L，所述苯丙氨酸的浓度为66mg/L。

进一步地，在将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜的步骤之后，还包括以下步骤：

将得到的胶原膜进行交联。

进一步地，所述将得到的胶原膜进行交联的步骤具体为：

将得到的胶原膜在温度95～110℃的条件下进行高温真空物理交联。

进一步地，本发明所述的生物视膜的制备方法，还包括以下步骤：

将在温度95～110℃的条件下进行高温真空物理交联后的胶原膜再进行紫外线辐照交联，所述紫外线辐照交联的辐照强度为254nm，辐照距离为15～25cm。

进一步地，所述将得到的胶原膜进行交联的步骤具体为：

将得到的胶原膜通过戊二醛或EDC-NHS进行化学交联，所述戊二醛的浓度为0.25～0.5％，所述EDC-NHS的浓度分别为0.3～0.6％和0.03～0.07％，化学交联的时间为120～360min。

本发明的有益效果为：

本发明所述的生物视膜的制备方法，所制备的生物视膜主要成分为胶原蛋白，具有良好的生物相容性、可降解性，控制炎症反应；高纯度胶原，无抗原性和排斥性；天然细胞外基质提取，可降解吸收；并且，所制备的生物视膜具有三维孔隙结构，可以引导纤维母细胞随机且离散的增生；同时，还可抑制结膜瘢痕和结膜收缩，维持正常眼压，从而减轻患者的痛苦和经济负担；可以应用于眼科领域的组织修复，包括青光眼小梁切除手术、新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种生物视膜的制备方法的步骤流程图；

图2为本发明一种生物视膜的制备方法的另一步骤流程图；

图3为本发明一种生物视膜的制备方法制备的生物视膜的三维孔隙结构图；

图4为本发明一种生物视膜的制备方法制备的生物视膜的动物实验组织学切片结果；

图5为本发明一种生物视膜的制备方法制备的生物视膜的另一动物实验效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种生物视膜，其应用于眼科领域的组织修复，所述组织修复包括青光眼小梁切除手术、新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术。

如图1-3所示，本发明所述的一种生物视膜的制备方法，包括：

按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液；

将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化；

将乳化所得的浆液进行抽真空；

将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜。

其中，所述高纯度I型胶原蛋白来源于健康牛跟腱；将乳化所得的浆液进行抽真空，排除乳化时进入浆液的空气。

其中，所述按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液的步骤具体为：

每600ml冰醋酸水溶液加入3～5g高纯度I型胶原蛋白，在0～30℃的温度条件下混合搅拌，发明冰醋酸水溶液的浓度为0.3～0.5％，发明冰醋酸水溶液的pH值为2.5～5.0。

其中，所述将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化的步骤具体为：

使用胶体磨乳化机将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌35～45min，然后根据黏稠度缓慢下调转速和频率搅拌20～30min，再在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌60～120min进行乳化。

其中，所述将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜的步骤具体为：

将抽真空之后的浆液在温度-50～-40℃、压力≤0.2mbar的条件下进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜。

其中，在发明按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液的步骤之后，以及发明将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化的步骤之前，还可以包括以下步骤：

在高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液中添加氨基酸，发明氨基酸包括酪氨酸和苯丙氨酸，发明酪氨酸的浓度为72mg/L，发明苯丙氨酸的浓度为66mg/L。

其中，在将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜的步骤之后，还可以包括以下步骤：

将得到的胶原膜进行交联。通过交联，可提高制备的生物视膜在体内形态稳定性，并使降解时间可控。

其中，所述将得到的胶原膜进行交联的步骤具体为：

将得到的胶原膜在温度95～110℃的条件下进行高温真空物理交联。

其中，本发明所述的生物视膜的制备方法，还可以包括以下步骤：

将在温度95～110℃的条件下进行高温真空物理交联后的胶原膜再进行紫外线辐照交联，发明紫外线辐照交联的辐照强度为254nm，辐照距离为15～25cm。

其中，所述将得到的胶原膜进行交联的步骤具体为：

将得到的胶原膜通过戊二醛或EDC-NHS进行化学交联，发明戊二醛的浓度为0.25～0.5％，发明EDC-NHS的浓度分别为0.3～0.6％和0.03～0.07％，化学交联的时间为120～360min。

其中，在所述将得到的胶原膜进行交联的步骤之后，还可以包括以下步骤：

将交联后的胶原膜切割为预设规格；

将切割后的胶原膜采用双层PETG盒和Tyvek透析膜进行包装；

将包装后的胶原膜进行环氧乙烷灭菌。

其中，所述将交联后的胶原膜切割为预设规格的步骤具体为：

通过环钻、刀片等工具对交联后的胶原膜切割呈圆形或方形等规格，包括高度为1～5mm、直径为5～15mm的圆形规格，或长度为5～15mm宽度为5～15mm、高度为1～5mm的方形规格。

本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜，可以应用于眼科领域的组织修复，包括青光眼小梁切除手术、新生血管性青光眼手术、葡萄膜炎青光眼、翳状胬肉手术、斜视手术、鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术、结膜瘢痕组织重建手术、灼伤后修复手术和角膜溃疡手术。

其中，本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜，具有三维孔隙结构，应用于青光眼小梁切除术中可以抑制结膜细胞增生，防止瘢痕形成，维持滤泡功能，维持低眼压。该生物视膜在与人体组织相互作用时，并非抑制纤维母细胞，而是为眼内纤维母细胞提供了良好的生长环境，引导纤维母细胞离散地依附在基质的孔洞上生长，而建立一个以正常生理结构为主的眼内组织，从而抑制组织瘢痕化。将多孔生物视膜直接植入于小梁切除术造成的巩膜瓣上的结膜下空间可以减少滤过泡瘢痕化，从而提高青光眼的手术成功率，从而取代以往眼科手术中所应用的抗代谢药物等副作用较大的治疗方法。

翳状胬肉手术后应用本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜进行治疗，可使裸露的巩膜伤口愈合正常化，限制复发的翳状胬肉局部生长。

除此之外，本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜，还可用于鼻泪管手术、眼窝手术、眼整形手术中预防瘢痕、结疤。

因此，本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜，应用于眼科具备以下优点：引导纤维母细胞随机分布增生，使伤口不产生瘢痕；在青光眼滤过显微手术后，提供一个引流的功能；提供多余房水储存处；加快手术伤口愈合但不粘连；大幅地减少伤口收缩反应及形成一个正常的结膜组织；建立长久有效的愈合组织。

为了更好地说明本发明所述的生物视膜的制备方法制备的生物视膜的应用效果，提供实施例如下：

本实施例描述生物视膜抑制结膜组织瘢痕形成的动物实验效果。

试验动物模型选用新西兰大白兔，在兔角膜缘上方约2mm处，用普通环钻，直径为8mm，切除结膜组织，还包括结膜下的筋膜，直到暴露巩膜组织，注意不要损伤任何巩膜组织，也可用维纳斯剪子剪切除筋膜组织，整理伤口周边使其成为圆形，直径约10mm。选用生物视膜，敷贴于伤口处并缝合8针；术后2周，1月时，进行外观检查，组织学分析。

实验结果表明：

术后2周时，组织切片可见大量胶原材料，胶原疏松排列，材料孔隙内有大量炎症细胞和成纤维细胞；在1月时生物视膜大部分降解后，新形成胶原沉积，疏松排列，无炎症细胞，未见瘢痕样组织，如图4所示。

因此，多孔的生物视膜可能通过引导成纤维细胞随机生长于孔壁内，干扰胶原沉积模式，使胶原随机排列，从而抑制结膜瘢痕形成。实验结果表明，生物视膜降解后，留下一个松散排列的生理性组织，与正常组织结构高度相似，如图5所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种生物视膜的制备方法，其特征在于，所述生物视膜用于植入于小梁切除术造成的巩膜瓣上的结膜下空间，所述制备方法如下：

按照预设比例配置高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液，具体步骤为每600ml冰醋酸水溶液加入3～5g高纯度I型胶原蛋白，在0～30℃的温度条件下混合搅拌，所述冰醋酸水溶液的浓度为0.3～0.5％，所述冰醋酸水溶液的pH值为2.5～5.0；

在高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液中添加氨基酸，所述氨基酸包括酪氨酸和苯丙氨酸，所述酪氨酸的浓度为72mg/L，所述苯丙氨酸的浓度为66mg/L；

将添加氨基酸的高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液进行乳化，具体步骤为使用胶体磨乳化机将高纯度I型胶原蛋白和冰醋酸水溶液在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌35～45min，然后根据黏稠度缓慢下调转速和频率搅拌20～30min，再在转速1400～1800r/min、频率43～47Hz的条件下搅拌60～120min进行乳化；

将乳化所得的浆液进行抽真空；

将抽真空之后的浆液进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜，其具体步骤为将抽真空之后的浆液在温度-50～-40℃、压力≤0.2mbar的条件下进行冷冻干燥，得到具有三维孔隙结构的胶原膜；

将得到的胶原膜进行物理交联；

其中将得到的胶原膜进行物理交联的步骤具体为：将得到的胶原膜在温度95～110℃的条件下进行高温真空物理交联，然后胶原膜再进行紫外线辐照交联，所述紫外线辐照交联的辐照强度为254nm，辐照距离为15～25cm；

按以上方法制备获得的生物视膜，具有抑制结膜细胞增生，防止瘢痕形成，维持滤泡功能，维持低眼压的作用。