CN101357242B - 调节眼内压力的支架结构 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种用以调节青光眼眼球内压力的三维孔状支架结构。该结构可以包括共聚物的混合物，例如，胶原蛋白与葡萄胺聚糖。

Description

调节眼内压力的支架结构
技术领域
本发明部分实施例涉及一种三维多孔状胶原蛋白与葡萄胺聚糖共同形成的、不含药物的、生物可分解支架，其可用做植入装置，特别是防止疤痕组织形成同时可以在结膜空间内形成房水缓冲生理结构以调节青光眼眼内压力的装置。 
背景技术
青光眼发病时会有一系列的症状，例如眼球内压力增加、视神经受损以及进展性视野丧失的症状。多数患者在初期对于药物治疗会有明显疗效，但许多案例随着时间开始出现抗药性。对于对药物治疗无效的患者则需要进行外科手术以维持其眼压。 
事实上，对于一些药物治疗无效的青光眼病患，或者是预防药物治疗所带来的副作用及减少药物的使用，临床上也逐渐能够接受将手术视为第一线治疗方式。青光眼的治疗手术中，最具代表性的是滤过(filtering)显微手术。其手术程序是在眼球表面巩膜边缘(limbal sclera)上，制造出一个替代性低阻力的通道(channel)，使眼球内过量的前房液得以经此通道排出，释放至结膜下(subconjunctival)空间，以降低过高的眼球内压力。然而手术后，往往由于结膜下的组织再生而形成疤痕组织，导致此通道阻塞或结膜下液体缓冲空间消失，前房液因此无法排出，此时眼球内压力再度上升。这种现象在一些组织再生效率较高的病患(例如，年轻人、化学性灼伤、新血管性的青光眼患者)身上更为显著。 
临床运用丝裂霉素C(Mitomycin-C)、氟嘧啶二酮(5-fluorouracil)及博莱霉素(bleomycin)、β-胺丙腈(beta-aminopropionitrile)、D-青霉胺(D-penicillamine)、组织血纤维蛋白溶原活化剂(tissue plasminogen activator)、皮质醇(corticosteroid)抑制纤维母细胞增生而避免在青光眼手术后形成疤痕。然而，已知的副作用包括结膜变薄以及眼内发炎，这将导致眼睛失明的发生。 
美国专利5,713,844及5,743,868揭露了以人工材料制成的帮浦式或管状装置，用于植入结膜下空间(subconjunctival space)或前房周边以作为降低眼压的滤泡或导流管。该作为滤泡或导流管而无法被生物分解的装置可以发挥短期的效果，只是该手术程序最后会因疤痕形成而失败。再者，由于该装置无法被生物分解，因此会有不适感与二次感染的风险。此外，临床上在植入后也未观察到疤痕明显减少的状况。事实上，再生的组织往往会侵入或拑压到装置，而导致流出管道发生阻塞。最重要的是，这也不是通常考虑的医疗方法。 
组织再生工程方面在抑制疤痕上的研究已有多年且大有进展(Yannas等人，1989；Yannas，1998)。例如在伤口愈合上十分有用的人工皮肤(Orgil等人，1996；Yannas等人，1982)。美国专利4,060,081及5,489,304也揭露了用于伤口愈合且可抑制疤痕形成的人工皮肤。两种人工皮肤皆包含有可分解层与不可分解层。由合成纤维构成的不可分解层具有控制湿气通透的功能；而由胶原蛋白-黏多糖类或胶原蛋白-糖胺聚糖共聚物组成的立体可分解层则引导纤维母细胞及所分泌的细胞间基质以任意的方式组织而降低了疤痕的生成。 
为仿真细胞的生理功能，现有技术中有些方法与装置，其以在组成物间运用高密度的化学链接以及以功能性控制湿气的通透来设计。此外，这些产品一般是外用的而非用做植入物装置。这些人工皮肤无法直接运用为青光眼治疗用途的植入物装置。因此另一种避免疤痕形成与调节眼内压力的解决途径具有高度需求性。 
美国专利5,713,844及5,743,868揭露了一种携带有可抑制细胞增生、修改组织再生与避免疤痕形成的生物活性分子的植入物装置。然而其构成成分无法完全被生物分解。直接运用在眼科组织的美国专利6,013,628及6,218,360则结合细胞增生抑制物至不同生物可分解介质。尽管这些专利处理了不可分解的药物介质的问题，但其仍有药物自注入处渗漏的风险。而受影响的区域也无法控制。再者，这些生物可分解基质并不能具有透过物理方式调节眼压的压力调节功能，也就是说，无法透过建立生理性房水储存器来调解眼内液体的压力。 
发明内容
本发明涉及一种三维多孔状胶原蛋白与葡萄胺聚糖共同形成的支架，其在植入下结膜空间后可完全被生物所分解。该三维多孔状结构可以减低眼内压 力，引导增生的细胞与基质的再排列、预防疤痕形成以及在分解后提供持久的房水液体生理缓冲系统。 
本发明的目的在于在部分实施例中提供一种新颖的青光眼植入物。在较佳实施例中也揭露了纯化第一型胶原蛋白的方法以及制备用于植入物的生物可分解多孔胶原蛋白/葡萄胺聚糖支架的方法。本装置在细胞再生阶段引导细胞的再分布并且建立可以在青光眼手术后调节眼内压力的房水液体生理储纳槽。另一方面，无需在制备过程中使用醛链接(aldehyde linkage)而可以降低其硬度与减少化学残留的风险。 
本发明的另一目的在于在部分实施例中提供一种将装置植入动物结膜下空间的特殊程序，且无需在植入后施用药物。本发明可防止疤痕的形成以及能仅以三维结构以及生物分解后残存的空间调节眼内压力。本发明并不用于药物介质或载体。 
在一个实施例中，在植入后测量眼压。在另一个实施例中，分别于植入后的第3、7、14、21及28天执行不同的细胞评估，以观测支架的分解与组织再生。 
前述及其它本发明的目的、特征、方面与优点将可透过仔细阅读本文后述的发明详细说明与适当参照附图，而得以更好的理解。 
附图说明
图1是含不同胶原蛋白与葡萄胺聚糖浓度的支架的静水压变化； 
图2是雌性新西兰白兔眼睛植入支架后的型态分析。其中(a)、(c)、(e)、(g)为植入组，(b)、(d)、(f)、(h)为对照组；其中 
(a)为大量发炎反应相关的细胞聚集于植入区附近(＊)，支架已部分分解，再生组织渗入该空间(向上粗箭号)(H&E染色，40X，第3天)； 
(b)为大量发炎反应相关的细胞聚集在植入对照区附近(＊)(H&E染色，40X，第3天)； 
(c)为胶原母细胞(▲)与胶原纤维(↑)散乱排列于支架植入区(曼森氏三色染色法，400X，第14天)； 
(d)为胶原母细胞(▲)与胶原纤维(↑)致密排列在植入对照组的切面区域(曼森氏三色染色法，400X，第14天)； 
(e)为极少数α-SMA免疫染色细胞(↑)分布于被分解支架的残余区(α-SMA免疫染色，400X，植入后第14天)； 
(f)为大量棕色α-SMA免疫染色细胞(↑)紧密排列于对照组的切面区域(α-SMA免疫染色，400X，植入后第14天)； 
(g)为极少数胶原蛋白散布在支架完全分解后的残余空间(↑)(第28天，2X，森氏三色染色法)；及 
(h)为典型的疤痕组织(↑)以致密排列的胶原蛋白方式分布于对照组的切面区域(第28天，2X，森氏三色染色法)； 
图3是支架植入后，眼球内压力的变化； 
图4是胶原蛋白基质的电子显微影像； 
图5是一个位于结膜下空间的完整植入物，其内有细胞(白色箭头)移入。细胞核染色为棕色(曼森氏三色染色法，20x，第7天)； 
图6是一个位于明显滤泡中的部分分解植入物(白色箭头)，相对于只有胶原蛋白残留(黑色箭号)的植入物分解区域，其内存有细胞(曼森氏三色染色法，20x，第14天)； 
图7是对照组中线形胶原蛋白(白色箭号)沉积于塌陷的滤泡中。可在此面中观测到巩膜，10-0尼龙(直径20-30um，黑色短箭号)位于右上角(曼森氏三色染色法，第21天)； 
图8是植入组中随意分布的胶原蛋白(白色箭号)沉积于明显滤泡(黑色长箭号)中(深度以黑色长箭号表示，其是黑色短箭号所示的10-0尼龙的16倍)，未在此面中观测到巩膜，10-0尼龙(直径20-30um，黑色箭号)位于右上角(曼森氏三色染色法，第21天)； 
图9是支架植入前的组织型态分析； 
图10是支架植入前的组织型态分析；及 
图11是PBS饱和后胶原蛋白支架抗挤压压力与形变的关系。其压力在0.32KPa时直接升高并伴随形变的发生。 
具体实施方式
本发明在部分实施例中提供一种可被生物完全分解的三维多孔状支架，其是包含胶原蛋白与糖胺聚糖的共聚物。“支架”与“胶原蛋白基质”皆指含有胶原 蛋白与糖胺聚糖共聚物或与下述聚合物的功能方式近似的聚合物的基质。尽管许多研究及专利说明了胶原蛋白自身或者与其它成分组合的生物材料的应用，本发明以高温及UV光作为聚合的主要能量，且具有进步性地在制成中不使用醛链接反应，因此不会有醛的残留。因此，最终产物不仅维持了可以引导组织进行再分布的三维多孔状结构，也比其它现有技术所揭露的更柔软(美国专利5,629,191，美国专利6,063,396及Hsu等人，2000)。再者，本发明在部分实施例中还揭露了具有饱和静水压与刚性特征的支架，且其饱和静水压与刚性是在能使支架起调整眼压的立体房水生理储存槽功能以及降低巩膜通道的伤口成熟前发生沾黏的所预定范围内。 
另一方面，许多其它方法或装置可以作为提供药物媒介或者载体的植入装置，其中药物由介质物或载体中释放且能局部抑制细胞增生与防止疤痕生成。然而，药物的填入十分复杂且部分药物的副作用也没有予以研究，本发明因此提供了一种解决这些问题而用于调节青光眼眼压的结构。本支架以引导细胞在其立体多孔结构中散乱增生以及所分泌的基质散乱排列的方式而防止疤痕组织的形成。因此，在支架分解后的残留空间会充满疏松的结缔组织，并且可以作为缓冲眼内液体的永久性液体储存槽。本支架不仅解决不正常眼压的复发，同时亦消除药物填充与其副作用的风险。 
支架的饱和静水压能依支架所用的共聚合物比例而增加，因此，在部分实施例中的支架具有约0.5毫米汞柱至约5.5毫米汞柱的净水压。在其它实施例中的支架具有约0.5毫米汞柱至约5毫米汞柱的净水压、约0.75毫米汞柱至约4.75毫米汞柱的净水压、约1毫米汞柱至约4.5毫米汞柱的净水压、约1.25毫米汞柱至约4.25毫米汞柱的净水压、约1.5毫米汞柱至约4毫米汞柱的净水压、约1.75毫米汞柱至约3.75毫米汞柱的净水压、约2毫米汞柱至约3.5毫米汞柱的净水压、约2.25毫米汞柱至约3.25毫米汞柱的净水压、约2.5毫米汞柱至约3毫米汞柱的净水压、或者2.75毫米汞柱的净水压。本领域技术人员能理解还有其它例如变更支架中胶原蛋白比例的方法以改变该净水压。 
支架的刚性是指支架在未发生压力出现突然下降又再急速上升的模式前所能承受的最大压力(图11)。在某些实施例中，刚性界于约0.1千帕(KPa)至约1.5KPa： 
  糖胺聚糖/胶原蛋白   1/6   1/12   1/24   1/48   1/96
  刚性   0.13KPa   0.51KPa   1.43KPa   0.46KPa   0.21KPa
然而由于支架应有最低物理强度以使支架在植入后仍维持其形状而不发生塌陷。支架较佳的刚性最少应有0.5KPa。在更佳的实施例中，刚性最少应有1KPa，在最佳的实施例中，刚性最少应有1.4KPa。 
以上所有的实施例中都是由胶原蛋白-糖胺聚糖所构成，而以类似于胶原蛋白的明胶或其它聚合物或共聚物所制成的支架，其如果应用于青光眼的治疗或者眼睛伤口的覆盖料则应具有上述净水压与刚性的特性。 
实施例中制备用于青光眼植入物支架的胶原蛋白与糖胺聚糖共聚物的比例为在醋酸水溶液或水中0.125～8％。在部分实施例中的胶原蛋白是第一型胶原蛋白。 
糖胺聚糖可以为，但不限于，包含下列成分中一种或多种：软骨素-6-硫酸盐(chondroitin-6-sulfate)、软骨素-4硫酸盐(chondroitin-4-sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、皮肤素硫酸盐(dermatan sulfate)、几丁质(chitin)及几丁聚糖(chitosan)及其组合。胶原蛋白可以为，但不限于，与胶原蛋白近似的明胶(gelatin)。 
部分实施例中，第一型胶原蛋白与糖胺聚糖可以以6∶1、10∶1、12∶1、24∶1、48∶1或者96∶1的重量比经高温以及充分混合予以链接，且在生理磷酸盐缓冲液饱和后比利用醛链接所制成的更加柔软，而无需在制备中实施第二次醛链接。本支架在使用前宜以干燥状态保存。 
部分实施例中，支架的孔洞尺寸在约10μm至约300μm之间，其孔洞尺寸可以在约20μm至约200μm之间。在部分实施例中，孔洞尺寸是对生理液饱和后或者干燥的支架进行测量。 
本发明的部分实施例揭露一种作为青光眼手术一部分程序的支架使用方法。如实施例所示，胶原蛋白/糖胺聚糖共聚物经切割后在生理液中饱和。手术者可以小心分离穹窿部(fornix)至轮部(limbus)区域的结膜以使巩膜(sclera)露出。于小梁(trabeculum)处建立一条连结前房与巩膜下方空间的通道，手术者可在结膜下方及巩膜皮瓣上方的空间植入经PBS饱和的支架。 
PBS饱和的支架提供对抗眼压的净水压以避免过多房水自前房渗出，因而可避免青光眼术后的低眼压。此外，由于此物理性质与植入的部位，巩膜皮瓣与巩膜床接触的机会与时间因眼压与净水压间的压力差波动而减少。因此，巩 膜通道的沾黏将可以有效地避免。所述三维多孔状结构的植入支架提供了一种不含药物以及化学品的环境，引导增生细胞与基质的重新排列而避免疤痕生成。其在分解后形成松散的组织结构而可作为调节眼压的持久生理房水储存槽。 
本发明的部分实施例也包含在其中具有支架的套件组，该套件组用于眼科激光手术而包含有例如(但不限于)美国专利6,607,527或5,533,997的定位标记。 
下列实施例用于说明而非限制。 
实施例1、第一型胶原蛋白的制备
下列步骤可用于第一型胶原蛋白的制备。将300kg牛筋切成大小约0.5cm3的正立方体。放入10L 95％的酒精中，于4℃下搅拌24小时。将牛筋自95％的酒精中取出，放入10L的0.5M醋酸溶液中，于4℃下搅拌72小时后加入胃蛋白酶(pepsin，SIGMA P7000，4000单位/ml)，继续于4℃下搅拌24小时。过滤去除未分解残渣后加入氯化钠至最终氯化钠浓度为1.0M。于4℃下搅拌30分钟后以10,000g(Bekman Avanti J-20)转速离心30分钟后去除上清液。加入10L 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)并于4℃下搅拌30分钟以混匀沉淀物。加入氯化钠至氯化钠浓度达4.0M。于4℃下搅拌30分钟后以10,000g转速离心30分钟后去除上清液。加入10L 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)并于4℃下搅拌30分钟以混匀沉淀物。加入氯化钠至氯化钠浓度达2.5M。置于4℃下搅拌30分钟后以10,000g转速离心30分钟后去除上清液。加入5L异丙醇与纯水的混合液(Isopropanol∶H2O＝1∶4)，于4℃下搅拌30分钟后以10,000g转速离心30分钟。去除上清液后，加入5L 0.05M醋酸溶液。重复此离心/再混匀步骤两次。于-90℃下冷冻再以冷冻干燥机干燥，所得产物即为第一型胶原蛋白(Type I Collagen)。 
不含药物、生物可分解的三维多孔状胶原蛋白/葡萄胺聚糖支架的制备
将4.8g由第一实施例所得的第一型胶原蛋白加入400毫升0.05M醋酸溶液中，在10℃水浴保温环境下，先以3,500rpm搅拌60分钟，再以7,000rpm搅拌30分钟，最后提高至11,500rpm高速搅拌60分钟。取0.48kg软骨素-6-硫酸盐(Chondroitin-6-Sulfate，C-6-S)，先以80毫升0.05M醋酸溶液溶解。将 此溶液与第一型胶原蛋白溶液混合。以3,500rpm搅拌60分钟，再以7,000rpm搅拌30分钟，最后提高至11,500rpm高速搅拌60分钟。将搅拌均匀的胶原蛋白与C-6-S混合液倒入4升三角锥瓶中，用真空帮浦于低于30mtorr下抽真空后置于4℃保存。将160毫升低温的胶原蛋白与C-6-S混合液置入14cm×22cm的不锈钢盘中，于-90℃下冷冻干燥至呈现片状。将片状的干燥胶原蛋白与C-6-S混合物装入铝箔袋中再放入烘箱，在真空状态下以105℃加热24小时。自铝箔袋中取出片状的干燥胶原蛋白/C-6-S共聚物后，以254nm波长紫外光每面照射2小时。将此胶原蛋白/软骨素-6-硫酸盐构成的三维多孔片状物置入干燥铝箔袋中，于4℃保存。 
本支架的胶原蛋白/葡萄胺聚糖比例为10∶1。实施例不同于本领域已知技术之处在于制备本发明的人工结膜时，并没有使用醛类链接；因此没有化学药剂残留的疑虑。再者，制成的支架较为柔软亦无需在制备过程中运用第二次化学链接。 
实施例2、生理液中饱和静水压的计算
将含0.25％、0.5％及1％胶原蛋白/C-6-S共聚物的青光眼用调节眼内压力结构剪裁成直径分别为7、7.5、8、8.5及9毫米、厚度约为2～3毫米圆盘状薄片后，分别用天平测量其重量并记录。将其浸泡于0.1M磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)中至吸水饱和并称重。重复上述步骤10次，所得数值依下列公式计算单位面积支架在吸水饱和后的静水压：支架的饱和静水压(mmHg)＝[饱和支架的重量(mg)-干燥支架的重量(mg)]×0.0736/支架面积(mm2)。其方差以t-test计算。 
支架饱和吸水后产生的静水压代表其在植入眼球后所能缓冲眼压的最大值，上述测试结果显示，随着支架所含胶原蛋白/C-6-S共聚物浓度增高，单位面积吸水饱和后的静水压也增加(图1)，这是因为支架的主要成分胶原蛋白/C-6-S共聚物中胶原蛋白的含量越高，其吸附的水分子也越多。另外，测试数据也显示，不同面积但具相同胶原蛋白/C-6-S共聚物浓度的支架，其饱和吸水静水压也与面积成正比例增加，这显示本发明的胶原蛋白/C-6-S共聚物性质均一且稳定。因此在调控眼压的应用上，可预先制备不同胶原蛋白/C-6-S共聚物浓度的支架，同时配合剪裁不同的尺寸与形状以备各种状况所需。 
实施例3、在植入调节眼内压力的结构后动物模型的青光眼眼球内压力的调节
将含0.5％胶原蛋白/C-6-S共聚物的调节青光眼眼内压力的结构剪裁成直径为8毫米，厚度约为2～3毫米的圆盘后，浸泡于磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline，PBS)中约4～6小时，使其达到饱和吸收状态。对十七只体重为2.5至3.5kg的雌性新西兰白兔，以肌肉注射方式注射氯胺酮(ketamine，35mg/k，BW)及甲苯噻嗪(xylazine)(5mg/kg，BW)进行麻醉。所有支架都植入雌性纽西兰白兔右眼，未植入的左眼则作为对照组。以开睑器(speculum)撑开眼睑。在结膜外上侧，约10到12点钟方向，距角膜边缘(corneal-scleral limbus)2毫米处，以眼科剪剪开一条长约8-10毫米的伤口，分开结膜下组织，露出下方的巩膜。于小梁(trabeculum)处建立一条连结前房与巩膜下方空间的通道，并在其中植入支架。缝合伤口。左眼则实施相同的程序但不植入支架。 
实施例4、植入调节眼内压力的结构后眼球的组织学变化
将17只植入支架的纽西兰雌性白兔于植入后第3、7、14、21及28天分别以注射过量麻醉剂(氯胺酮，2×35mg/kg BW及甲苯噻嗪2×5mg/kg BW)方式处死，取出包括眼睑部分的完整眼球，将其浸泡于4％甲醛过夜进行组织固定(fixation)。固定完成后将植入区及其邻近组织块切下，脱水(dehydration)并分别以石蜡包埋后，以切片机(microtome)切出7μm厚度的组织薄片。经苏木素及伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色后进行细胞组织学观察，曼森氏三色染色标示胶原蛋白的分布情形。另以α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)抗体确认出肌纤维母细胞中的肌动蛋白(actin)。各项组织染色详细实施步骤如下： 
以苏木素及伊红染色法对调节青光眼眼压结构植入后的一般性组织学分析： 
将组织切片于56℃加热10分钟以去除石蜡，将切片浸泡于100％二甲苯中3分钟(重复此步骤三次)。移入100％酒精中2分钟(重复此步骤三次)，之后再继续浸泡于90％、80％、70％与50％的酒精中各3分钟。切片浸泡于苏木素(Hematoxylin)溶液中染色10分钟，再以蒸馏水中冲洗5分钟以洗去多 余染料(重复此步骤二次)。将切片浸泡在伊红(Eosin)溶液中20秒。之后以蒸馏水中冲洗5分钟以除去多余染料(重复此步骤二次)。之后分别浸泡于70％、80％、90％及100％的酒精中各10秒，并于第二次浸泡100％的酒精10秒后，放入100％二甲苯10秒(重复此步骤三次)，再以封片胶封片并置于光学显微镜下观察。 
植入组及对照组中的植入伤口附近区域在植入后第3及第7天，皆呈现典型细胞急性发炎反应特征：包括偶而可见的狭长型的纤维母细胞以及巨细胞与各种淋巴球等大量发炎相关的细胞出现聚集。纤维母细胞分泌的胶原蛋白沉积于伤口附近。植入组的植入物内部靠近巩膜附近的1/3至1/2区域为发炎相关细胞及纤维母细胞所浸润(图2a，b)。尽管支架于其植入后的第7天已逐渐被分解，但残余部分依然可见。残余的三维多孔状构造中可见再生组织细胞沿不规则孔壁分布。纤维母细胞占大多数且延伸至孔壁之外而连接到巩膜的上皮层。免疫反应至植入后第14天即逐渐消退，至植入后第21天，完全消退。植入组与对照组中的免疫反应与消退时间并无显著差异，这显示支架并不引发额外的免疫反应。再者，支架在分解之后，残存有结构松散但内部伴随有零散分布的再生细胞与所分泌的胶原蛋白的网状结构。相反地，对照组的手术区内则受致密排列的胶原蛋白所占据，结膜的厚度也比未植入的左眼厚。 
曼森氏三色染色法标示胶原蛋白
将组织薄片浸泡于100％二甲苯(xylene)中5分钟以去除石蜡(重复二次)，再将玻片浸泡于100％、95％、80％及70％的酒精中重复浸泡与取出，连续各动作10-20次，以使其再含水份。将玻片浸泡于含染料(Sigma M1782)的Bouin氏溶液(Sigma HT10-1-32)中，先升温至56℃浸泡1小时而后于室温下浸泡过夜，以流水充分洗至无黄色残留再以蒸馏水略为冲洗。之后浸泡于Weiger氏含铁苏木素溶液(Sigma HT10-79)中10分钟以进行组织染色，之后以流水充分清洗至无黄色残留，再以蒸馏水略为冲洗。将组织切片浸泡在新配制的磷钼酸-磷钨酸溶液中10-15分钟。该新配制的磷钼酸-磷钨酸溶液可将磷钼酸(phosphomolybdic acid Sigma HT15-3)与10％(w/v)磷钨酸溶液(phosphorungstic acid 10％ w/v，Sigma HT15-2)以1∶1体积比的方式混合予以配制。将切片转浸泡于苯胺蓝(aniline blue，Sigma HT15)溶液中5分钟，再以蒸馏水略为冲洗。将组织片浸泡于1％冰醋酸溶液中3-5分钟，之后分别浸 泡于70％、80％、90％及100％的酒精中各10秒。于第二次浸泡于100％的酒精中10秒后，浸泡于100％二甲苯中10秒(重复此步骤三次)。以封片胶封片并于光学显微镜下观察。 
于植入后第3天即可见到被染色的胶原蛋白纤维分布于伤口区域。植入后14天所取下的切片，对照组伤口逐渐形成胶原蛋白纤维排列紧密的疤痕组织(图2c，d)。疤痕组织于植入后28天仍持续发展(图2g，h)。对照于经以α-SMA免疫染色的植入后14天后的组织，有更多排列紧密的肌纤维母细胞出现于伤口区域(图2的e，f)。此观察证实支架可以防止疤痕的发生。 
以α-SMA免疫化学法确认活化的肌纤维母细胞的分布
将组织切片于56℃加热10分钟以去除石蜡，将切片浸泡于100％二甲苯中3分钟(重复此步骤三次)。移入100％酒精中3分钟(重复此步骤二次)，之后再继续浸泡于90％、80％、70％与50％的酒精中各3分钟。重复两次将切片浸于0.1M磷酸盐缓冲液中3分钟，之后浸泡于3％的过氧化氢(H2O2)，并于室温下作用15分钟。其后以含0.2％Triton-X 100的0.1M磷酸盐缓冲液清洗(PBST)2-3分钟(重复三次)，再将切片浸泡于含10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)的PBST中，于室温下作用25分钟以阻断非专一性结合。将组织切片于α-SMA鼠单克隆抗体(mouse monoclonal antibody，1∶500，Neomarkers)内在4℃下反应过夜。之后以0.2％Triton-X 100的0.1M磷酸盐缓冲液(PBST)重复三次清洗2-3分钟，再在接有Biotin的抗小鼠或兔的G型免疫球蛋白(DAKO LSAB2R System；生物素化抗鼠/兔IgG)于室温下反应15分钟。重复三次以0.2％Triton-X 100的0.1M磷酸盐缓冲液(PBST)清洗2-3分钟，之后在Streptavidin-HRP(DAKO LSAB2R System)内于室温下反应15分钟。重复三次以0.2％Triton-X 100的0.1M磷酸盐缓冲液(PBST)清洗2-3分钟，之后再以DAKO LSAB2R System的显色剂反应10分钟。重复三次以0.2％Triton-X 100的0.1M磷酸盐缓冲液(PBST)清洗2-3分钟，将切片浸泡于苏木素溶液中30秒，并以PBS冲洗5分钟(重复此步骤三次)及浸泡于蒸馏水中5分钟(重复此步骤二次)。以56℃甘油胶(DAKO glycerol gel)封片，然后用光学显微镜观察。上述DAKO LSAB2R系统包含有生物素接合(biotinylated link)与链霉亲和素化辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)。生物素接合包括在磷酸盐缓冲液中含有安定作用蛋白质与0.015mol/L叠氮化钠的 生物素标示的羊抗兔或兔抗鼠免疫球蛋白。链霉亲和素化辣根过氧化物酶则包括在磷酸盐缓冲液中含有安定作用蛋白质与抗微生物剂的链霉亲和素接合的辣根过氧酶。 
在未植入支架的眼睛中，由α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)免疫染色的结果显示，迟至植入后14天，大量肌纤维母细胞才不平行排列于巩膜表面，其所分泌的胶原蛋白纤维集结而形成伤口紧缩。相反的，植入组中仅有零星少数的肌纤维母细胞散布于植入物植入区附近，而附着于残余支架与伤口附近(图2的e，f)。因此，植入组极少发生伤口紧缩的现象，而未植入的对照组于植入手术后21天因胶原蛋白堆积于皮膜下区域以及因伤口附近的肌纤维母细胞收缩，而发生明显的伤口收缩。皮膜下空间因而缩小或者塌陷。与被植入的眼睛相比，植入组因胶原蛋白纤维与肌纤维母细胞散乱分布，再加上人工结膜的分解，其皮膜下空间较大。至植入后28天，纤维母细胞与肌原母细胞分布减少，此时植入伤口其基质逐渐受纤维母细胞所分泌的胶原蛋白所取代。胶原蛋白的分布仍维持随机分散的分布，而相反地，未植入的对照则有明显的疤痕产生(图2的g，h)。 
实施例5、眼球内压力的变化
实施例4中的雌性新西兰白兔以眼压笔(tonopen)测量其眼球内压力。测量前，于第3、7、14、21及28天时以氯胺酮(35mg/kg，BW)及甲苯噻嗪(5mg/kg，BW)麻醉。在处死前进行同样的测量。相较于支架植入前的眼压下降比例计算方式如下列公式所示：眼压下降比率(％)＝(植入前眼压一植入后眼压)/植入前眼压×100％。 
在未植入的对照组中眼球内压力在前房通道建立后立即下降约16％，并维持此眼压至前房通道建立后14天，之后逐渐上升至手术前的数值。而在植入组内，其眼球内压力在前房通道建立与人工结膜植入后也立即下降约14％，之后于植入后七天进一步降低至植入前的33％。在组织再生的过程中，眼球内压力降低比率仍然维持在55％(图3)。该结果与形态变化相符。 
实施例6、胶原蛋白基质
经扫描式电子显微镜显示，胶原蛋白基质由多孔的物质所构成。孔洞尺寸 界于20μm至200μm之间(胶原蛋白/葡萄胺聚糖的百分比为1％)(图4)，由于孔洞尺寸与共聚物的比例相关，孔洞尺寸在较低共聚物百分比的支架中会大于200μm。 
基于先前的发现，胶原蛋白基质提供一种组织(皮膜、基底层(stroma)与血管)再生的生理结构，引发结膜的伤口以较为生理而非病理的方式愈合。在兔子模型中，对比于对照组，一个月的分解时间内可充分构成明显的滤泡。结膜的基底层在支架植入后也与滤泡成为系统的一部分，而其中散布的胶原蛋白也与周边的胶原蛋白没有区别而无疤痕的生成。 
胶原蛋白基质提供了一种可能替代抗纤维化成分的途径，产生结构较为松散的滤泡组织而非在未使用抗纤维化成分下所形成的滤泡。本发明提供一种从物理与生理观点都有利的术后伤口愈合用胶原蛋白基质。 
随着在PBS饱和的支架上的重量增加，压力会随着支架高度的减少而升高。然而，该支架内得压力在形变(strain)达到约3.2时会少量下降。此时，PBS会自支架中显著释出(胶原蛋白/葡萄胺聚糖的百分比为1％，胶原蛋白与葡萄胺聚糖的比例为24∶1)(图11)。以改变的高度/原高度计算形变。基质受外力压缩时会变得较为坚硬且较难发生变形，然而，一旦外力超过其刚性时(约1.12至1.19KPa)，该PBS饱和的支架会发生极度的结构塌陷而引起支架内所含PBS流出，进而使得变形的支架无法维持其三维结构与净水压。 
本支架可解决为维持滤泡在完全愈合前的功能而需于巩膜皮瓣上加压的问题。 
苏木素-伊红染色
植入组及对照组中植入伤口附近区域在植入后第3、第7天，皆呈现典型细胞急性发炎反应特征。增长的纤维母细胞以及巨细胞与各种淋巴球聚集于植入物表面。植入的基质于术后七天开始分解。 
再生的细胞分布于植入物的孔洞，但较表面稀疏。对照组中免疫反应在植入后14天即逐渐消退，至植入后21天完全消退，在28天时，植入物完全分解。 
在对照组中，经α-SMA免疫染色后显示大量肌纤维母细胞平行排列于巩膜表面直至植入后14天而所分泌的胶原蛋白纤维造则致密地集结。相对地在植入组中，肌纤维母细胞较少且其散乱附着于剩余的基质与伤口周边(图5)。 在植入物分解期间，滤泡的空间仍然明显(图6)。 
在术后21天，对照组可明确辨认出滤泡尺寸变小，且伴随胶原蛋白纤维沉积于结膜下方空间(图7)，术后28天，滤泡空间变小且伴随致密线型的胶原蛋白纤维填充于结膜下方空间。而植入组中，滤泡于术后21天仍然具有明显的空间，且仅有部分散乱的胶原蛋白散布于结膜下方空间，而植入物的形状则不再可见(图8)。比较滤泡的深度后，植入组织滤泡深度较对照组深5至6倍(10-0尼龙的直径于此作为单位)。 
现今的三维胶原蛋白基质以实现提供一种供细胞生长的生理环境以及提供一种物理性的重量于巩膜皮瓣以避免前房过窄的两种目标。浓度与温度参数与基质的内部结构相关。在这一例示中，胶原蛋白/葡萄胺聚糖共聚物的百分比为1％并进行冷冻干燥的步骤。 
基于先前的发现，胶原蛋白基质提供一种组织(皮膜、基底层(stroma)与血管)再生的生理结构，引发结膜的伤口以较为生理而非病理的方式愈合。在兔子模型中，对比于对照组下，一个月的分解时间可充分构成明显的滤泡。结膜的基底层于支架植入后也与滤泡成为系统的一部分，而其中散布的胶原蛋白也与周边的胶原蛋白没有区别而无疤痕的生成。 
胶原蛋白基质提供了一种可能替代抗纤维化成分的途径，产生一种结构较为松散的滤泡组织而非在未使用抗纤维化成分下所形成的滤泡。本发明提供一种从物理与生理观点都有利的术后伤口愈合用胶原蛋白基质。 
实施例7、
造成滤泡失效的原因在结膜下纤维化与巩膜皮瓣纤维化的层面上已有充分探讨。多数研究着重于胶原纤维母细胞的增生与其抑制。然而组织工程提供另一避免纤维化的途径，其不是抑制胶原纤维母细胞的增生而是引导其迁移的模式与胶原蛋白的沉积。然而，伤口自然减少伤口愈合面积的能力是另一影响滤过手术(filtering surgery)成功率的关键。本实施例中，可以以基质受压后回弹的效果计算胶原蛋白支架刚性并且测量滤泡在植入手术后的尺寸大小。 
在伤口愈合过程中，肌纤维母细胞扮演收缩的重要角色。收缩的生理意义在于减少覆盖于伤口缺损上的新生组织其面积。然而，在过滤手术中，此现象增加了滤泡因深度与大小发生收缩而失败的机率(图6)。另一方面来看，伤 口愈合的步骤不会一直持续。伤口在发炎阶段中会发展到收口而至成熟，也就是较少的细胞量而较多的细胞间基质。换言之，持续存续的异物并不是成熟伤口中滤泡能够维持所需。依上述概念，具有足以对抗肌纤维母细胞缩拢效应的刚性特性且可于发炎过程终止前的时段内存在的生物可分解材料，可以增加滤过手术的成功率。 
本实施例的结果显示多数细胞位于支架的表面而不涉入其内部结构(孔洞尺寸)，事实上，滤泡尺寸可以透过支架本身来维持而在伤口愈合的期间内不会发生塌陷(图7)。在组织图中可以发现水层覆盖于支架之上使得厚实的细胞量维持于支架之外，这对滤泡尺寸的维持有所贡献。 
在实施滤过手术中对于结膜所造成的伤口实际是一种以剪刀与缝合结膜伤口而延生滤泡的程序，此程序会引发结膜下方基底层发炎以及纤维母细胞转变为肌肉纤维母细胞。受到肌肉纤维母细胞的收缩效应，滤泡尺寸会逐渐减少甚至最后可能完全消失。这在发炎时间较长的病人身上会较明显。临床上在未于发炎早期就控制或抑制纤维母细胞增生的病人中可观察到较高的失败率。即使抗代谢药物可以得到较好的早期术后结果，长期的并发症仍然为外科医生所忧心。 
成功的滤过手术应有下列特征：首先结膜应该结构正常且功能正常；其次，滤泡得以维持在稳定的生理状况下；第三则是巩膜通道能够在伤口成熟后仍然存在。因此，具有能够抵销缩拢效应的刚性的生物可分解支架可以使得滤过手术成功。 
对于一些非生物可分解的植入物而言，其可提供大小持久的植入物以及坚固的滤泡，而事实上其储存槽的功能是由其植入物本身而非滤泡提供。滤泡的功能是一巩膜层外缘的动态房水排出的效果。然而持续的异物会使伤口发炎，甚至会持续至伤口愈合后的一段时间，因此滤泡发生减缩实际上是慢性发炎反应的结果之一。一种具有长期效果的较安全方法是在传统滤过手术中，在前房与结膜排水系统间以不用任何异物的方式去制造出新的排水环境系统。如何增进传统滤过手术在高风险案例中的结果是本发明的目标，具有功能的结膜可以透过在结膜伤口中植入胶原蛋白基质来产生(2000IOVS Hsu)，而一种可以对抗伤口愈合时所发生的收缩以及可以维持滤泡大小的支架提供了能良好控制眼压以及具有长期效果的较好方式。组织工程也可以成为增大滤过手术效果的 下一种可能方法。 
本发明尽管是参考实施例来予以说明，但本发明并不因此而局限于实施例。不同的替换与修改都在前述说明中所提示，而其它则是本领域技术人员所熟知。因此，所有的替换或者变更都被如所附权利要求的范围所定义本发明所涵盖，所有此处所援引的文件皆整体纳入参考数据中。 

Claims (9)

1.一种青光眼支架，包括至少一聚合物选自胶原蛋白及明胶所组成的群组中至少一种，另一聚合物选自软骨素-6-硫酸盐、软骨素-4-硫酸盐、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、皮肤素硫酸盐、几丁质及几丁聚糖所组成的群组中至少一种，所述的二聚合物由高温及紫外光交联，所述二聚合物交联的重量比为6∶1、10∶1、12∶1、24∶1、48∶1或者96∶1，且所述二聚合物在醋酸水溶液或水中的比例为0.125～8％，所述青光眼支架的孔洞尺寸为10μm至300μm，该青光眼支架在生理液中饱和后具有：
饱和静水压介于0.5毫米汞柱至5.5毫米汞柱之间；及
刚性介于0.5KPa至2KPa之间，
所述0.125-8％指所述二聚合物于冷冻干燥前在0.05M醋酸溶液或水中的所述二聚合物重量对所述0.05M醋酸溶液或水的体积的百分比或所述二聚合物重量对所述0.05M醋酸溶液或水的重量的百分比。
2.如权利要求1所述的青光眼支架，其特征在于，所述饱和静水压介于1.75毫米汞柱至3.5毫米汞柱之间。
3.如权利要求1所述的青光眼支架，其特征在于，所述刚性介于1KPa至1.6KPa之间。
4.如权利要求2所述的青光眼支架，其特征在于，所述刚性介于1KPa至1.6KPa之间。
5.如权利要求1所述的青光眼支架，其特征在于，所述二聚合物其中之一是第一型胶原蛋白。
6.一种具有权利要求1所述的青光眼支架的套件组。
7.一种青光眼支架，包含0.25％、0.5％或1％的胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐共聚物，其特征在于，胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐以高温及紫外光进行交联，且所述胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐交联的重量比为6∶1、10∶1、12∶1、24∶1、48∶1或者96∶1，在0.1M磷酸盐缓冲液中饱和后，所述青光眼支架的孔洞尺寸介于10μm与300μm之间，饱和静水压介于1毫米汞柱至4毫米汞柱之间，及刚性介于1KPa至1.6KPa之间，所述0.25％、0.5％或1％指所述胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐于冷冻干燥前在0.05M醋酸溶液或水中的胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐重量对所述0.05M醋酸溶液或水的体积的百分比或所述胶原蛋白及软骨素-6-硫酸盐重量对所述0.05M醋酸溶液或水的重量的百分比。
8.如权利要求7所述的青光眼支架，其特征在于，所述孔洞尺寸介于20μm与200μm之间，且青光眼支架具有饱和静水压介于1.75毫米汞柱至3.5毫米汞柱之间。
9.一种具有权利要求8所述的青光眼支架的套件组。
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