KR20080106136A - 안압 조절을 위한 구조물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 요체는 안압을 조절하기 위한 3차원 다공성 구조물들에 관한 것이다. 상기 구조물들은 공중합체들의 혼합물, 예를 들면 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을 포함할 수 있다.
녹내장, 안압, 스캐폴드, 이식

Description

안압 조절을 위한 구조물{STRUCTURE FOR MODULATING INTRAOCULAR PRESSURE}
본 발명은 2002년 12월 20일에 출원되고 지금은 포기된 10/327,528의 일부계속출원으로서 2006년 6월 21일에 출원된 11/471,695의 일부계속출원으로, 양 발명은 본 명세서 내에 포함되어 있다.
일부 실시예들에서 본 발명은 일반적으로 이식 장치의 역할을 하는, 비투약 생분해성 3차원 다공성 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드, 특히 흉터 형성을 방지하고 녹내장에 있어 안압을 조절하기 위한 결막 공간 내의 생리학적 수성 버퍼 환경을 조성하기 위해 설계된 장치에 관한 것이다.
녹내장은 안압상승, 시신경 손상 및 점진적인 시야 감소와 같은 일련의 증상을 포함한다. 대부분의 환자들은 혈관에 의한 물이 재흡수를 향상시켜 결과적으로 안압을 낮추기 위해 약물의 경구섭취 또는 베타차단제(beta-blocker), 축동제(miotics), 아드레날린성 촉진제(adrenergic agonist) 또는 탄산탈수효소억제제( carbonic anhydrase inhibitor)의 국부적 도포에 의한 치료를 받는다. 대부분의 환자들은 초기에는 약물 치료에 대해 현저히 반응하지만, 많은 경우에 시간 경과에 따라 무반응하게 된다. 약물 치료에 신속하게 반응하지 못하는 환자들을 위해서는 안압을 유지하기 위해 외과적 시술이 요구된다.
녹내장 누공수술(glaucoma filtering surgery)은 안압을 감소시키기 위해 최근 시술되는 방법이다. 상기 녹내장 누공수술 방법은 전방으로부터 안구방수를 배출하기 위해 섬유주를 통한 구멍을 천공하는 단계, 및 안압을 감소시키기 위해 전방(anterior chamber)과 결막하 공간 사이에 여과포(filtering bleb) 또는 누출공을 제작하는 단계로 이루어진다(Bergstrom 등, 1991; 밀러 등, 1989). 그러나, 수술 후 흉터의 발달은 여과포(filtering bleb) 또는 누출공에 장애물을 야기시키고 결과적으로 높은 안압의 재발을 유도한다(Peiffer 등, 1989). 그러므로, 녹내장 수술에 있어서 흉터 형성의 방지가 중요 관심사가 되어야 한다.
임상 치료는 녹내장 수술 후 흉터 발달을 방지하도록 섬유모세포의 증식 억제를 위해 미토마이신-C, 5-플루오로우라실, 블레오마이신, 베타-아미노프로피오나이트릴, D-페니실아민, 조직 플라스키노겐 활성화제 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 사용한다. 그럼에도 불구하고, 결막이 얇아 지거나 안구 내 염증과 같이 시력상실을 야기시킬 수 있는 부작용이 관찰된다.
미국특허 US No.5,713,844 및 미국특허 US No.5,743,868호는 안압을 떨어뜨리기 위해 여과포 또는 누출공의 대용으로 결막하 공간 또는 전방 주변에 이식된 인공 물질들로 제작된 펌프 또는 튜브형 장치들을 기재하고 있다. 이러한 비-분해성 장치들은 누출공 또는 여과포로서 작용하는데, 단기간의 이익이 있으나 흉터 형성에 의해 결과적으로 실패하게 된다. 더욱이, 상기 장치들은 생분해성이 아니어서 이물감 또는 이차 감염의 위험을 야기시킨다. 또한, 이러한 장치들을 이식한 후 흉 터 형성에 현저한 감소를 보여주는 임상 보고도 없다. 그 결과, 재생 조직이 종종 이식된 장치들 내로 침투하거나 끼게 되어 결과적으로 배출 경로를 방해하게 된다. 대부분의 경우 이는 일반적인 치료를 위한 고려대상이 아니다.
수년동안, 조직공학 분야의 연구에 의해 흉터 방지에 지대한 발전이 달성되었다(Tannas 등, 1989; Yannas, 1998). 예를 들면, 인공 피부는 상처 치료에 큰 유익을 공헌한다(Orgill 등, 1996; Yannas 등, 1982). 미국특허 US No.4,060,081 및 미국특허 US No.5,489,304호는 상처 치료 및 흉터 형성 방지에 유익한 인공 피부에 대해 기재하고 있다. 인공 피부의 두가지 타입은 분해성 층 및 기타 비-분해성 층을 조합하고 있다. 합성 폴리머들로 이루어진 비-분해성 층은 피부의 수분 유통을 조절하고; 3차원 콜라겐-뮤코폴리사카라이드 또는 콜라겐-글리코스아미노글리칸 공중합체로 이루어진 분해성 층은 조직 재생을 지원하기 위해 상처를 직접 덮는다. 3차원 콜라겐-뮤코폴리사카라이드 또는 콜라겐-글리코스아미노글리칸 공중합체들은 재생 섬유모세포 및 분비된 세포간 메트릭스의 임의이 재구성을 유도하며, 결과적으로 흉터 형성의 감소를 유발한다.
유사 피부의 생리적 기능에 대해, 성분들 사이의 화학 결합 및 수분 유통의 기능성 제어와 함께 몇몇 앞선 방법들 및 장치들이 설계되었었다. 또한, 이러한 제품들은 일반적으로 외부 적용을 위한 것들로서, 이식 장치로 사용하기 위한 것은 아니었다. 이러한 인공 피부를 녹내장 치료에 있어서 이식 장치로 직접 적용하는 것은 불가능하다. 녹내장 수술 후 흉터 형성의 방지 및 안압 조절을 위한 다른 해결책이 매우 절실하다.
미국특허 US No.6,299,895 및 미국특허 US No.6,063,116호는 세포증식을 방지하고, 조직 재생을 수정하며 흉터 발달을 방지하기 위한 상이한 생물학적 활성 분자들을 포함하는 이식 장치들을 기재하고 있다. 그러나, 구성성분들은 전적으로 생분해성이지 않다. 미국특허 US No.6,013,628 및 미국특허 US No.6,218,369호는 세포 증식 억제자 및 상이한 생분해성 매개체, 및 안구내 조직으로의 직접 적용을 제시하고 있다. 이러한 특허들이 투약 매개체의 비-분해성의 문제를 언급하고 있을지라도, 약제가 투여부위로부터 새어 나올 수 있는 위험이 여전히 존재한다. 영향을 받은 영역은 통제불능이 될 것이다. 더욱이, 이러한 생분해성 메트릭스는 생리적인 방법을 통해 안압을 조절, 즉 생리적인 액성 완충 저장소를 형성함으로써 안구 내 유체의 압력을 조절할 수 있는 압력 조절자로서 기능하지 않는다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 결막하 공간 내에 이식된 후 전적으로 생분해성인 3D 다공성 콜라겐 글루코스아미노글리칸 스캐폴드를 제공한다. 3D 다공성 구조는 안압을 감소시키고, 세포들 및 메트릭스의 증식의 재배열을 유도하며, 흉터 형성을 방지하고, 생분해된 후 영구적인 생리적 액성 저장소 시스템을 제공한다.
일부 실시예들에서 본 발명의 목적은 녹내장 이식술(glaucoma implantation)을 위한 새로운 장치를 제공하는 것이다. 몇몇 바람직한 실시예들에서, 타입 I 콜라겐의 정제 방법, 및 이식 장치 역할을 하는 생분해성 3D 다공성 콜라겐/글루코사미노글리칸 스캐폴드의 제작 방법이 제공된다. 본 장치는 녹내장 수술 후 안압(IOP)의 조절을 위해 재생 동안 세포의 재구성을 유도하고 생리적 액성 완충 저장소를 형성한다. 또한, 제작 공정에 있어서 더이상 알데하이드 결합이 유도되지 않으며, 결과적으로 경직 및 화학 잔여물의 위험을 감소시킨다.
일부 실시예들에서 본 발명의 또 다른 목적은, 동물의 결막하 공간 내에 장치 이식의 특수한 방법을 제공하는 것이다. 이식 중 또는 후에 약은 투여되지 않는다. 본 발명은 3D 다공성 구조 및 생분해성 잔여 공간에만 의존하여 흉터 발달을 방지하고, 안압을 조절한다.
일 실시예에서, 안압은 이식 후 측정된다. 다른 실시예들에서는 이식 후 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 상이한 세포 평가가 수행되어 스캐폴드의 생분해 및 조직의 재생을 모니터한다.
상술한, 및 기타의 목적, 형태, 양태 및 이점은 첨부된 도면들을 적절히 참조하여 아래에 제공되는 상세한 설명을 주의깊게 읽어봄으로써 더욱 이해하게 될 것이다.
일부 실시예들에서 본 발명은 전적으로 생분해성인 3D 다공성 스캐폴드를 제공하는데, 이는 콜라겐-글루코사미노글리칸 공중합체들을 포함한다. "스캐폴드" 또는 "콜라겐 메트릭스"라는 용어는 모두 콜라겐-글루코사미노글리칸 공중합체, 또는 아래 기재된 폴리머들과 유사한 방식으로 작용하는 폴리머들을 의미하는 것이다. 수많은 연구결과 및 특허문헌들이 생체적합물질로서 콜라겐 단독 사용 또는 기타 성분들과의 조합에 대해 기재하고 있을지라도, 본 발명은 고온(실시예 참조) 및 UV광을 중합화의 주요 에너지로서 채용하며 이는 자명한 것이 아니며, 제조에 걸쳐 더이상의 알데하이드 결합 반응이 일어나지 않는다. 그러므로, 알데하이드 잔여물이 존재하지 않는다. 그 결과, 최종 물질은 3D 다공성 구조를 유지하여 재생 조직의 재구성을 유도할 뿐만 아니라 기타 선행 기술들(미국특허 No.5,629,191, 미국특허 No.6,063,396 및 Hsu 등, 2000)에 기재된 것들에 비해 더욱 부드럽다. 또한, 본 발명의 일부 실시예들은 안구내 유체 압력을 조절하고 나아가 상처가 성숙되기 전 공막관 내 유착 기회를 줄여주는 3D 생리적 액성 완충 저장소로서 스캐폴드가 작용할 수 있도록 바람직한 범위 내로 포화된 정압 및 경도의 특성을 가지는 스캐폴드를 제공한다.
한편, 다른 방법들 및 장치들은 투약 매개체 또는 담체가 되는 이식 장치들 을 제공하는데, 매개체 또는 담체로부터 방출된 약물은 국부적으로 세포 증식을 억제하고 흉터 발달을 방지한다. 그러나, 약물의 보충이 복잡하고 특정 약물에 대한 부작용이 검증되지 않았다. 본 발명은 따라서 녹내장에 대한 이러한 문제점들의 해결책으로서 안압을 조절하는 구조물을 제공한다. 이 스캐폴드는 증식 세포들 및 메트릭스가 3D 다공성 구조 내에서 분산되어 재배치되도록 직접 유도함으로써 흉터 형성을 방지한다. 이 스캐폴드는 안압의 비정상적인 재발을 해결할 뿐만 아니라 약물 주입 중에 발생할 수 있는 위험 및 부작용을 제거한다.
스캐폴드의 포화된 정압은 스캐폴드에 사용된 공중합체의 비율에 따라 증가할 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 스캐폴드는 약 0.5mmHg 내지 약 5.5mmHg의 포화된 정압을 가진다. 다른 실시예들에서, 포화된 정압은 약 0.5mmHg 내지 5mmHg, 약 0.75mmHg 내지 4.75mmHg, 약 1mmHg 내지 4.5mmHg, 약 1.25mmHg 내지 4.25mmHg, 약 1.5mmHg 내지 4mmHg, 약 1.75mmHg 내지 3.75mmHg, 약 2mmHg 내지 3.5mmHg, 약 2.25mmHg 내지 3.5mmHg, 약 2.5mmHg 내지 3mmHg 또는 약 2.75mmHg이다. 당업자가 이해함에 따라 스캐폴드의 포화된 정압을 변화시키는 다양한 방법이 있는데, 예를 들면 스캐폴드 내의 콜라겐의 비율을 변화시키는 것이 포함된다.
스캐폴드의 경도는 스캐폴드가 갑작스런 압력 저하 및 연이은 압력의 갑작스런 상승의 패턴인 압력의 변화가 발생하지 않고 견딜 수 있는 최대 압력을 의미한다(도 11). 일부 실시예들에서, 경도는 약 0.1KPa 내지 약 1.5KPa 사이이다:
GAGs/콜라겐 1/6 1/12 1/24 1/48 1/96
경도 0.13KPa 0.51KPa 1.43KPa 0.46KPa 0.21KPa
그러나, 스캐폴드는 이식된 후 붕괴 없이 형태를 유지하기 위해 최소의 생리 적 강도를 가져야 한다. 스캐폴드가 적어도 0.5KPa의 경도를 가지는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 실시예에서, 경도는 적어도 1KPa이며, 가장 바람직한 실시예에서 경도는 적어도 약 1.4KPa이다.
상기 모든 실시예들은 콜라겐-글루코사미노글리칸들로 이루어지며, 콜라겐과 유사한 젤라틴 또는 폴리머나 공중합체로 만들어진 스캐폴드는 녹내장 치료를 위한 이식물 또는 안구 상처의 덮개로 사용된다면 이러한 포화된 정압 특성 및 경도를 가져야 한다.
일부 실시예들에서, 녹내장 이식물로서 사용하기 위한 스캐폴드를 제조할 때 용액 내의 콜라겐-글리코사미노글리칸 공중합체들의 비율은 아세트산 용액 또는 물 내에서 약 0.125% 내지 약 8%의 범위이다.
글리코사미노글리칸은 다음 중 하나 이상일 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다: 콘드로이틴-6-설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄(dermtan) 설페이트, 키틴(chitin), 키토산, 및 이들의 혼합물들. 콜라겐은 콜라겐과 유사한 젤라틴일 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시예들에서, 타입I 콜라겐 및 글리코사미노글리칸은 6:1, 10:1, 12:1, 24:1, 48:1, 또는 96:1의 중량비로 고온을 통과하여 고속으로 전체 혼합되어 교차결합될 수 있다. 스캐폴드가 생리적 인산 완충된 식염수(PBS)로 포화된 후 알데하이드 결합으로 제조된 것보다 부드럽게 유지하기 위해 제조 동안에 다른 제2의 알데하이드 결합을 가지지 않는다. 바람직하게는, 스캐폴드는 이식을 위해 준비될 때까지 건조하게 유지해야 한다.
일부 실시예들에서, 약 10㎛ 내지 약 300㎛ 범위의 크기의 기공을 가진다. 기공의 크기는 약 20㎛ 내지 약 200㎛일 수도 있다. 일부 실시예들에서, 기공의 크기는 스캐폴드가 식염수로 포화된 후 측정되나, 다른 실시예들에서는 기공 크기가 건조한 스캐폴드에서 측정된다.
본 발명의 일부 실시예들은 녹내장 수술의 일부로서 본 명세서에 기재된 스캐폴드의 사용 방법에 적용된다. 이하의 실시예들에서 보이는 바와 같이, 기재된 스캐폴드의 비율 및 크기를 포함하는 콜라겐/글리코사미노글리칸 공중합체들은 절단되고 생리적 인산 완충된 식염수로 포화된다. 외과의는 결막을 천장(fornix)으로부터 가장자리(limbus)까지 주의깊게 절개하여 공막을 노출시킨다. 외과의는 결막하 공간과 전방을 연결하는 지주관을 만들 수도 있다. 이후, 외과의는 PBS 포화된 스캐폴드를 결막하 공간 주변내 및 공막 자락 상에 이식할 수 있다.
PBS 포화된 스캐폴드는 전방으로부터 과도한 누수를 피하기 위해 안압에 대해 정압을 제공하며, 결과적으로 녹내장 수술 직후의 저안압을 예방한다. 또한, 이러한 생리적 효과 및 이식 위치를 기반으로 안구 내 압력 및 정압 사이의 압력차의 기복에 의해 공막 자락 및 기저 사이의 접촉 기회 및 시간을 감소시킬 수 있다. 이로인해 공막관 내의 유착의 기회를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 이식된 스캐폴드의 생분해성 3D 다공성 구조는 약물 및 화학약품이 없는 환경을 제공하여 증식 세포들 및 메트릭스의 재구성을 유도하며, 결과적으로 흉터 발달을 방지한다. 이는 전체가 분해된 후 조직의 느슨한 구조를 야기시킨다. 느슨한 구조는 안압을 조절하 기 위한 생리적 안구방수 완충 저장소를 영구적으로 제공한다.
본 발명은 일부 실시예들에서, 본 명세서에 기재된 스캐폴드를 포함하는 키트들을 제공한다. 이러한 안구 레이저 수술에 사용되는 키트는 미국특허 6,607,527 또는 5,533,997에 기재된 것과 같은 표지물들과 같은 위치 표지물을 포함할 수도 있다.
이하의 실시예들은 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.
본 발명에 따르면, 일반적으로 이식 장치의 역할을 하는, 비투약 생분해성 3차원 다공성 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드, 특히 흉터 형성을 방지하고 녹내장에 있어 안압을 조절하기 위한 결막 공간 내의 생리학적 수성 버퍼 환경을 조성하기 위해 설계된 구조물을 얻을 수 있다.
실시예 1
타입I 콜라겐의 제조
타입I 콜라겐을 제조하기 위해 다음 공정이 이용될 수 있다. 300g의 소 힘줄을 약 0.5㎤의 작은 조각으로 토막내 95%의 에탄올 10리터와 4℃에서 24시간 동안 혼합하였다. 힘줄 조각들을 0.5M 아세트산 용액 10리터로 옮기고 혼합물을 4℃에서 72시간 동안 교반하였다. 혼합물에 펩신(SIGMA P7000, 4000 개체/ml)을 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 나머지를 버렸다. 염화나트륨을 용액에 첨가하고 최종 농도를 1.0M로 맞추었다. 4℃의 자력 교반 하에서 용액을 30분 동안 혼합하였다. 10,000g(Beckman Avanti J-20)에서 30분 동안 준비된 용액을 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 50mM의 Tris-HCl 용액(pH 7.4) 10리터를 가하여 침전물을 재현탁하고, 용액을 4℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종 농도 4.0M이 되도록 염화나트륨을 첨가하였다. 용액을 4℃에서 30분 동안 완전히 혼합시켰다. 10,000g에서 30분 동안 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 50mM의 Tris-HCl 용액(pH 7.4) 10리터를 가하여 침전물을 재현탁하고, 용액을 4℃에서 30분 동안 완전히 혼합시켰다. 최종 농도가 2.5M이될 때까지 염화나트륨을 재차 가하고, 용액을 4℃에서 30분 동안 교반하였다. 10,000g에서 30분 동안 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 침전물을 재현탁하기 위해 이소프로판올과 H2O의 혼합용액(이소프로판올:H2O = 1:4) 5리터를 가하고 자력교반하에 4℃에서 30분 동안 혼합하였다. 10,000g, 4℃에서 30분 동안 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 그리고 0.05M 아세트산 용액 5리터로 침전물을 재현탁하였다. 원심분리/재현탁의 공정을 2회 반복하였다. 용액을 -90℃에서 동결시켰다. 용액을 동결건조하여 타입I 콜라겐의 건조제품을 얻었다.
비-투약 생분해성 3D 다공성 콜라겐/글루코사미노글리칸 스캐폴드의 제조
상기 실시예1의 방법을 통해 얻은 타입I 콜라겐 4.8g을 0.05M 아세트산 400ml에 용해시켰다. 용액을 60분간 3,500rpm, 30분간 7,000rpm, 그리고 60분간 11,500rpm의 단계적 자력교반하에 10℃ 물중탕으로 혼합하였다. 콘드로이틴-6-설페이트(C-6-S) 0.48g을 0.05M 아세트산 80ml에 용해시켰다. 이후 C-6-S 용액과 타입I 콜라겐 용액을 60분간 3,500rpm, 30분간 7,000rpm, 그리고 60분간 11,500rpm의 단계적 자력교반하에 혼합하였다. 콜라겐과 C-6-S 혼합물을 4리터 플라스크에 넣었다. 압력이 30mtorr 이하가 될때까지 혼합물을 흡인하고 혼합물을 4℃에 보관하였다. 차가운 콜라겐과 C-6-S 혼합물 160ml를 14cm×22cm의 스테인리스 접시에 부었다. 얇은 모양의 콜라겐과 C-6-S 혼합물을 얻을 때까지 콜라겐과 C-6-S 혼합물을 -90℃에서 동결건조시켰다. 콜라겐과 C-6-S 혼합물 박층을 알루미늄 호일 통에 밀봉하고 105℃에서 24시간 동안 진공에 노출하여 중합시켰다. 콜라겐/C-6-S 공중합체를 알루미늄 호일 통으로부터 꺼내어 UV 교차결합기 내에서 양면을 2시간 동안 254nm의 UV에 노출하여 추가로 교차결합시켰다. 콜라겐/C-6-S 공중합체의 3D 다공성 박층을 4℃의 건조 알루미늄 호일 통 안에 보관하였다.
스캐폴드 내의 콜라겐/글리코사미노글리칸의 비율은 10:1로 유지될 수 있다. 전술한 본 발명의 실시예들과 선행 기술에 개시된 것들 사이의 차이는 스캐폴드 제작과정에 더이상의 알데하이드 교차-결합이 적용되지 않는다는 것이다. 따라서, 화학 잔여물의 위험이 없다. 또한, 제조과정에 제2의 화학 교차결합이 일어나지 않기 때문에 얻어지는 스캐폴드는 훨씬 부드럽다.
실시예 2
생리버퍼에 의해 포화된 후 정압의 측정
0.25%, 0.5% 및 1%의 콜라겐/C-6-S 공중합체를 각각 포함하는, 녹내장에서 안압을 조절하기 위한 구조물은 두께가 2 내지 3mm이고 직경이 7, 7.5, 8, 8.5 및 9mm인 원반으로 절단된다. 저울로 원반들을 계량하여 기록한다. 콜라겐/C-6-S 공중 합체들이 포화될때까지 원반들을 0.1M PBS에 넣고 원반들의 무게를 쟀다. 이 단계들을 10회 반복하였다. 다음 공식에 의거 스캐폴드의 단위 영역당 포화된 정압을 계산하였다:
스캐폴드의 포화된 정압(mmHg) = [포화된 스캐폴드의 무게(mg) - 건조한 스캐폴드의 무게(mg)]×0.0736/스캐폴드의 면적(㎟).
측정치의 편차는 t-테스트에 의해 평가하였다.
스캐폴드의 포화된 정압은 안구 내의 압력을 완충하는 최대 기대값이다. 이 자료는 스캐폴드 내에서 콜라겐/C-6-S 공중합체의 농도가 클수록 포화된 정압이 커지는 것을 나타낸다(도 1 참조). 콜라겐 분자들이 H2O와의 결합에 높은 친화도를 가지기 때문이다. 또한, 이 자료는 동일한 농도의 콜라겐/C-6-S 공중합체를 가지며 그 크기가 다른 스캐폴드는 포화된 정압이 영역의 크기와 정비례한다는 것을 나타낸다. 결과는 안정적이고 균일한 특성의 콜라겐/C-6-S 공중합체를 나타낸다. 그러므로, 다양한 농도의 콜라겐/C-6-S 공중합체 및 상이한 형태를 가지는 스캐폴드가 서로 다른 요구에 맞춰 제작될 수 있게된다.
실시예 3
녹내장의 안압을 조절하는데 있어서 안압 제어 구조물의 동물 이식 모델
녹내장의 안압 조절 구조물로 0.5%의콜라겐/C-6-S 공중합체를 절단하여 깊이 2-3mm, 직경 8mm의 고유한 작은 원반들 여러개에 담았다. 원반들은 포화되도록 0.1M PBS에 4 내지 6시간 동안 전부 침지하였다. 체중이 2.5 내지 3.5kg 사이인 암 컷 뉴질랜드 알비노 토끼 17마리를 케타민(35mg/kg, BW) 및 크실라진(xylazine)(5mg/kg, BWV)의 정맥내주사를 통해 마취시켰다. 동물들의 모든 우측 안구에 스캐폴드를 이식하고, 좌측 안구는 외과적 모의 대조군 역할을 하였다. 눈꺼풀을 겸자로 열었다. 우측눈에 안과용 가위를 이용해 약 8-10mm길이의 상처를 냈다. 상처는 각막-공막 가장자리로부터 2mm의 거리에 10시와 12시 방향 사이에 위치하였다. 공막을 노출시키기 위해 각막하 상피 및 프로피아(propia) 기질을 분리하였다. 각막하 공간 및 전방을 연결하기 위해 섬유주를 통하는 관을 형성하여 내부에 스캐폴드를 삽입하였다. 상처를 봉합하였다. 수술에 대한 모의 대조군이 되도록 스캐폴드의 이식 없이 좌측 눈에도 동일한 외과적 수술을 행하였다.
실시예 4
안압 조절 구조물 이식 후 조직학적 평가
이식 후 3, 7, 14, 21 및 28일에 과도한 케타민(2×35mg/kg, BW) 및 크실라진(2×5mg/kg, BWV)으로 17마리의 이식된 토끼들을 희생시켰다. 눈꺼풀과 함께 눈을 신속히 분리하여 4% 포름알데하이드에 밤새 고정시켰다. 이식물 및 그 밑의 공막 베이스를 절개하여 디하이드레이트 후 파라핀에 담갔다. 부위들은 박절기로 7㎛로 절단하여 일반적인 조직학적 검사를 위해 H&E(헤마톡실린 및 에오신)로 염색하고 콜라겐 증착 및 재구성을 조사하기 위해 Masson 트리크롬으로 염색하였다. 추가의 조직 조각들은 근육섬유모세포의 영향을 동정하기 위해 α-SMA(smooth muscle actin) 면역세포화학에 사용되었다. H&E 염색, Masson 트리크롬 염색 및 α-SMA(smooth muscle actin) 면역세포화학의 공정들은 아래에 기재하였다:
슬라이드들을 56℃로 10분간 가열하고 100% 크실렌에 3분간 침지(3회 반복)하여 조직 조각들의 파라핀을 제거하였다. 슬라이드들을 100% 에탄올로 옮겨 2분(3회 반복) 후 순차적으로 90%, 80%, 70% 및 50% 에탄올에 각 단계별로 3분씩 하여 다시 수화시켰다. 슬라이드들을 헤마톡실린 용액에서 10분간 염색하고 과량의 염료를 증류수 내에서 5분간 제거하였다(2회 반복). 그런다음 슬라이드들을 20초 동안 에오신 용액에 둔다. 슬라이드들을 증류수로 씻어 5분 동안 과량의 염료를 제거하였다(2회 반복). 염색된 조직은 순차적으로 50%, 70%, 80%, 90% 및 100%의 에탄올 내에서 각 10초 동안 디하이드레이트시켰다. 100% 내에서의 2차 처리 후 슬라이드들을 100% 크실렌에 10초간 두었다(3회 반복). 슬라이드들을 퍼마운트(Permount) 또는 폴리마운트로 덮고 광학 현미경으로 관찰하였다.
이식된 및 이식되지 않은 눈 모두의 상처 영역은 수술 후 3일 및 7일에 전형적인 정확한 염증 반응을 보였다. 다수의 면역 세포들이 무리지었는데, 섬유모세포의 우연히 신장된 세포들, 마크로파지 및 상이한 형태의 림프구들로 이루어졌다. 섬유모세포로부터 분비된 콜라겐들은 상처 주위로 증착되었다. 염증 세포들 및 섬유모세포들은 공막 주위의 스캐폴드의 1/3 내지 1/2 내부 영역으로 침투하였다. 이식된 스캐폴드가 7일 후 점차적으로 분해되었지만 나머지 부위가 보였다(도 2a 및 2b). 재생된 세포들에 대한 남은 3D 다공성 구조물 불규칙적인 기공을 따라 분포하였다. 섬유모세포들이 기공들 아래에 우세하게 연장되어 공막의 상피층으로 직접 연결되었다. 수술 14일 후부터 면역 반응들이 점차적으로 감소되고 21일 후 완전히 가라앉았다. 면역 반응 및 소멸 시간은 이식 및 비이식 상처들 사이에 차이가 없었 다. 이 결과는 스캐폴드가 추가의 면역 반응을 일으키지 않는다는 것을 보여준다. 더욱이, 스캐폴드가 분해된 후 느슨하게 배열된 그물망이, 분산되어 재생된 세포들 및 분비된 콜라겐의 침투로 이식 영역 상에 남겨졌다. 반대로, 비이식 수술 영역은 콜라겐 섬유들의 밀집된 배열에 의해 점유되었고 비이식된 좌측 눈의 결막은 훨씬 두꺼웠다.
Masson 트리크롬 염색에 의한 콜라겐의 동정
조직 슬라이드들을 100% 크실렌에서 5분간 파라핀을 제거(2회 반복)하고 100%, 100%, 95%, 80%, 70%의 에탄올에 10 내지 20회 넣었다 꺼내어 다시 수화시켰다. 조직 슬라이드들은 Bouin 용액(Sigma M HT10-32) 내에서 56℃로 1시간 동안 매염되었고 실온의 후드 내에 밤새 두었다. 흐르는 수도물에 조직 슬라이드들을 세척하여 조직 조각들로부터 노란색을 제거하고 증류수로 가볍게 헹궜다. 조직 조각들을 Weigert의 아이언 헤마톡실린 용액(Sigma HT10-79) 내에서 10분 동안 염색하였다. 흐르는 수도물로 10분 동안 세척하고 증류수로 헹궜다. 조직 슬라이드들을 새로 제조된 포스포몰리브딕산(phosphomolybdic acid)/포스포텅스틱산(phosphotungstic acid) 용액에 10 내지 15분 동안 두었다. 포스포몰리브딕산(phosphomolybdic acid)/포스포텅스틱산(phosphotungstic acid) 용액은 포스포몰리브딕산(Sigma HT15-3)과 10%(v/v)의 포스포텅스틱산(Sigma HT15-2)을 1:1의 부피비로 혼합하여 제조할 수 있다. 조직 조각들을 아닐린 블루 용액 내에서 5분 동안 염색하고 증류수로 가볍게 헹궜다. 조직 슬라이드들을 1% 빙초산 용액에 3-5분 동안 두고, 70%, 80%, 90% 및 100%의 에탄올에 각각 10초씩 순차적으로 노출하여 디 하이드레이트 시켰다. 100% 에탄올 내에서의 2차 처치 후 조직 슬라이드들을 100% 크실렌 용액으로 옮겨 10초간 두었다(3회 반복). 퍼마운트 또는 폴리마운트로 조직 슬라이드들을 덮고 광학 현미경으로 관찰하였다.
염색된 콜라겐 섬유들이 수술 후 단 3일만에 이식 및 비이식된 상처 영역 내에 나타났다. 수술 14일 후 관찰된 조직 조각들에서, 비이식된 상처 영역에서 훨씬 밀집된 다발의 콜라겐 섬유들로 흉터가 형성되었다(도 2c 및 2d). 수술 후 28일까지 흉터는 연속적으로 발전하였다(도 2g 및 2h). 수술 14일 후 α-SMA의 면역염색(immunostain)의 결과와 비교하면, 비이식된 상처 영역 내에 밀집되어 늘어선 더 많은 근섬유모세포들이 있다(도 2e 및 2f). 관찰에 의해 스캐폴드가 흉터 형성을 방지하는 것이 확인되었다.
α-SMA 면역세포화학에 의한 활성 근섬유모세포의 분포 동정
슬라이드들을 56℃로 10분간 가열하고 100% 크실렌에 3분간 침지(3회 반복)하여 조직 조각들의 파라핀을 제거하였다. 슬라이드들을 100% 에탄올로 옮겨 3분(2회 반복) 후 순차적으로 90%, 80%, 70% 및 50% 에탄올에 각 단계별로 3분씩 하여 다시 수화시켰다. 조직 슬라이드들을 0.1M PBS 내에서 3분간 세척(2회 반복)하고, 조직 슬라이드들을 실온에서 3% H2O에 15분 동안 두었다. 조직 슬라이드들을 0.2% 트라이톤-X 100을 포함하는 0.1M PBS(PBST) 내에서 2-3분 동안 세척하였다(3회 반복). 비-특이적 결합들을 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 0.1M PBST 내에서 실온에서 25분 동안 차단하였다. 조직 슬라이드들을 α-SMA(Neomarkers) 단클론 항체로 1:500의 비율로 희석시켜 4℃에서 밤새 배양하였다. 조직 슬라이드들을 PBST에서 2-3분 동안 세척한 후(3회 반복), 조직 슬라이드들을 바이오틴화된 항마우스/토끼 IgG(DAKO LSAB2R 시스템)로 1:400의 비율로 희석시켜 실온에서 15분 동안 배양하였다. 조직 슬라이드들을 PBST에서 2-3분 동안 세척(3회 반복)하였다. 조직 조각들에 스트렙타비딘-HRP(DAKO LSAB2R 시스템)를 떨구고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 조직 슬라이드들을 PBST에서 2-3분 동안 세척(3회 반복)하였다. 실온에서 10분 동안 크로모겐(DAKO LSAB2R 시스템)반응을 수행하였다. 조직 슬라이드들을 PBST에서 2-3분 동안 세척(3회 반복)하였다. 30초 동안 헤마톡실린 용액으로 교차염색하고 PBS 내에서 3분 동안 세척한 후(3회 반복), 증류수로 5분 동안 세척하였다(2회 반복). 슬라이드들을 56℃에서 글리세롤 겔(DAKO)로 덮고, 현미경으로 관찰하였다. 상기 DAKO LSAB2R 시스템의 물질들은 바이오틴화된 결합 및 스트렙타비딘-HRP를 포함한다. 바이오틴화된 결합은 안정화 단백질 및 0.015몰/l의 소듐 아자이드를 포함하는 인산 완충된 식염수(PBS) 내에서 분리된 염소 항 토끼 및 염소 항 마우스 면역 글로불린의 바이오틴 표지된 친화도를 포함한다. 스트렙타비딘-HRP는 안정화 단백질 및 항 미생물 제제를 포함하는 PBS 내의 당근 퍼옥시다아제와 혼성된 스트렙타비딘을 포함한다.
비이식된 안구 내에서, α-SMA의 면역염색은 수술 14일 후 까지 결막 표면 및 상처 수축으로 야기된 근섬유모세포들에 의해 분비된 밀집된 콜라겐 섬유들의 다발에 평행하게 배열된 수많은 근섬유모세포들을 밝혀내었다. 대조적으로, 이식된 안구들의 이식 영역 내에 소수의 분산된 근섬우모세포들만이 분포되었다. 이들은 남은 스캐폴드 및 주변 상처 영역에 불규칙적으로 부착되었다(도 2e 및 2f). 그 결과, 상처 수축은 이식된 안구들에서 거의 발생하지 않았다. 상처는 수술 21일 후 명백히 수축하였는데, 비이식된 안구들의 상처에 인접한 근섬유모세포들의 수축 및 상피하 공간 내에서의 콜라겐 섬유들의 응집 때문이다. 상피하 공간은 결과적으로 더 작고 붕괴되었다. 이식된 안구들과 비교해보면, 더 넓은 상피하 공간은 콜라겐 섬유들 및 근섬유모세포들의 불규칙한 분포뿐만 아니라 콜라겐/C-6-S 공중합체의 분해 때문이다. 수술 28일 후의 관찰은 이식된 안구들 내에서 섬유모세포 및 근섬유모세포의 수가 감소함과 이식된 상처 영역에서의 콜라겐 섬유들에 의해 기질이 대체됨을 보여준다. 콜라겐 섬유들은 불규칙한 방향으로 배열되었다. 대조적으로, 비 이식된 안구들에서는 명백한 흉터 형성이 나타났다(도 2g 및 2h).
실시예 5
안압(IOP)의 변화
실시예 4의 암컷 뉴질랜드 알비노 토끼들의 안압이 토노펜으로 측정되었다. 측정 과정에서, 토끼들은 3, 7, 14, 21 및 28일의 측정 전에 케타민(35mg/kg, BW) 및 크실라진(5mg/kg, BWV)의 절반 용량의 근육내 주사에 의해 마취되었다. 추가의 형태학적 연구를 위해 동일한 측정이 토끼들이 희생되기 전에 수행되었다. 이식 전의 압력과 비교하여, 안압의 변화율이 다음 공식에 의해 얻어졌다:
IOP 변화율(%) = [이식 전 IOP - 이식 후 IOP]/이식 전 IOP × 100%.
비이식된 안구들에서, IOP는 전방과 연결된 관이 설치된 직후 약 16% 감소하였고 14일까지 지속되었으며, 이후 점진적으로 증가하여 수술 전 측정된 수치를 회복하였다. 이식된 안구들의 경우, 관이 설치된 직후 약 14% 감소하였다가 수술 7일 후 33%까지 추가로 감소하였다. 조직 재생 동안 IOP도 감소하고 수술 28일 후 약 55%에 도달하였다(도 3). 이 결과는 일시적으로 형태학적 관찰에 적합하다.
실시예 6
콜라겐 메트릭스
전자현미경을 통해 확산된 다공성 물질로 이루어진 콜라겐 메트릭스가 스캔되었다. 콜라겐 메트릭스의 기공의 크기는 20㎛ 내지 200㎛의 범위이다(콜라겐/글리코사미노글리칸의 함량은 약 1%)(도 4). 기공의 크기가 공중합체의 비율에 관련있기때문에, 더 낮은 비율의 공중합체를 가지는 스캐폴드의 기공 크기는 200㎛ 보다 크다.
앞서의 발견들을 기반으로, 콜라겐 메트릭스는 조직 재생(상피, 기질 및 혈관)에 생리학적 구조물을 제공하며, 병리학적 과정보다 생리학적으로 결막 상처를 치료하는 것을 포함한다. 본 토끼 모델들의 누공 수술의 경우에, 1개월의 분해 기간은 대조군에 비해 돌출 수포를 생성하기에 충분하다. 본 발명의 스캐폴드를 사용한 후의 결막 기질은 돌출수포와 함께 수성 시스템의 일부가 되었으며, 안구방수 내로 분산된 콜라겐은 흉터를 형성하지 않는 주변 콜라겐들로부터 구별할 수 없었다.
콜라겐 이식물은 항섬유 제제들 없이 생성된 수포보다 더 느슨하게 배열된 수포 조직들 및 항섬유 제제들로 생성된 것보다 더 풍부한 조직을 생성하여 항섬유 제제의 잠재적인 대용물을 제공한다. 외과적 상처 치유를 정상화시키는 분해성 콜라겐 이식물을 이용하는 이러한 새로운 접근은 물리적 및 생리학적 관점 모두에서 잠재적인 유익을 제공한다.
스캐폴드에 흡수된 상부 PBS 상에 점차 증가하는 무게 하에 압력은 스캐폴드의 높이의 감소와 더불어 일반적으로 상승하였다. 그러나, 변형이 3.2 근방에 다다랐을때 PBS 흡수 스캐폴드의 압력이 소폭 감소하였다. 동시에, PBS가 스캐폴드로부터 현저하게 방출되었다(콜라겐/글리코사미노글리칸의 함량은 약 1%이고, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸의 비율은 24:1)(도 11). 변형은 길이변화/원래길이 이다. 메트릭스가 외부 힘에 의해 압축될 때, 더욱 견고해지고 변형되기 어렵게 된다. 그러나, 외부 힘이 일단 강도(약 1.12 내지 1.19KPa)를 초과하면 PBS-흡수된 스캐폴드는 구조에 스캐폴드에 보유된 PBS가 흘러나오게 되는 치명적인 균열이 생기게 되고, 그리하여 변형된 스캐폴드는 3D 구조 및 포화된 정압을 계속 유지할 수 없게 된다.
스캐폴드는 결막 자락의 압력 적용의 문제 및 치유가 완료될 때까지 기능성 수포를 유지하는 문제 모두를 해결할 수 있다.
헤마톡실린-에오신 염색
이식 및 대조 안구들 모두의 상처 영역은 수술 3일 및 7일 후 전형적이고 정확한 염증 반응을 보였다. 연장된 섬유모세포들, 마크로파지, 및 림프구의 상이한 형태들이 이식물의 표면에 응집되었다. 이식된 메트릭스는 수술 7일 후 분해하기 시작했다.
내부로 파고드는 세포들은 이식물의 다공성 패턴에 걸쳐 분포되었으나, 표면 보다는 덜 밀집되었다. 염증 반응들은 수술 후 14일부터 점차 감소하였고 대조군에서는 21일 후 완전히 가라앉았고 이식물의 완전 분해는 28일이었다.
대조군의 안구들에서, α-SMA 면역염색은 수술 후 14일까지 결막 표면에 평행하게 배열된 수많은 근섬유모세포들, 및 근섬유모세포들에 의해 분비된 밀집되어 응집된 콜라겐 섬유들이 보였다. 대조적으로, 이식된 안구들에서는 소수의 근섬유모세포들이 보였는데, 이들은 남겨진 메트릭스 및 상처 영역 주변에 불규칙하게 부착되었다(도 5). 이식물의 분해 기간 동안, 수포 공간은 돌출된 채로 있었다(도 6).
수술 21일 후, 대조군의 안구들 내에서 수포의 감소된 크기가 판명되었는데, 결막하 공간 내의 콜라겐 섬유들의 응집과 조합되었다(도 7). 대조군의 안구들은 수술 28일 후 결막하 공간을 채우고 있는 빽빽한 선형 콜라겐과 함께 감소된 수포 공간을 보였다. 이식된 그룹은 수술 21일 후 결막하 공간 내부에 분산된 약간의 콜라겐을 가지는 돌출된 수포를 가졌고, 구성된 임플란트는 더이상 보이지 않았다(도 8). 수포의 깊이와 비교하면 이식된 그룹의 수포들의 깊이는 대조군의 경우보다 5 내지 6배 더 깊다는 것을 밝혀준다(여기서 10-0나일론의 직경이 단위로 사용됨).
현재 3-D 콜라겐 메트릭스는 두가지 목적을 달성하기 위해 제작된다: 세포 성장을 제어하기 위한 생리학적 환경의 제공 및 좁은 전방을 방지하기 위한 공막 자락에 물리적 중량의 제공. 농도와 온도의 두가지 변수들은 메트릭스의 내부 구조 와 연관이 있다. 본 실시예에서, 1% 콜라겐/글리코사미노글리칸 공중합체가 적용되었고, 본 실시예에서 동결 건조 공정이 수행되었다.
앞서의 발견들을 기반으로, 콜라겐 메트릭스는 조직 재생(상피, 기질 및 혈관)에 생리학적 구조물을 제공하며, 병리학적 과정보다 생리학적으로 결막 상처를 치료하는 것을 포함한다. 본 토끼 모델들의 누공 수술의 경우에, 1개월의 분해 기간은 대조군에 비해 돌출 수포를 생성하기에 충분하다. 본 발명의 스캐폴드를 사용한 후의 결막 기질은 돌출수포와 함께 수성 시스템의 일부가 되었으며, 안구방수 내로 분산된 콜라겐은 흉터를 형성하지 않는 주변 콜라겐들로부터 구별할 수 없었다.
콜라겐 이식물은 항섬유 제제들 없이 생성된 수포보다 더 느슨하게 배열된 수포 조직들 및 항섬유 제제들로 생성된 것 보다 더 풍부한 조직을 생성하여 항섬유 제제의 잠재적인 대용물을 제공한다. 외과적 상처 치유를 정상화시키는 분해성 콜라겐 이식물을 이용하는 이러한 새로운 접근은 물리적 및 생리학적 관점 모두에서 잠재적인 유익을 제공한다.
실시예 7
수포가 실패할 수 있는 이유들이 각막하 및 공막 자락 섬유증 분야에서 잘 검토되었다. 대부분의 연구는 섬유모세포의 증식 및 이를 막기위한 것에 초점을 맞추었다. 그러나 조직 공학은 섬유증을 피하기 위한 다른 접근을 제시한다: 섬유모세포의 증식을 막는 것이 아니라 대신에 섬유모세포들에 의한 이주 및 콜라겐 증착의 패턴을 유도하는 것이다. 그러나, 상처 치료 표면을 감소시키는 자연의 치유 능 력이 누공 수술의 성공률과 관계된 다른 열쇠이다. 본 실시예에서, 우리는 그 상부의 압축성 반동효과에 의해 콜라겐 스캐폴드의 강도, 및 이식 후 수포의 크기를 계산해내었다.
상처 치유 동안, 근섬유모세포들은 수축에 있어 중요한 역할을 담당한다. 수축의 생리학적 의미는 상처 결손을 덮는 새로운 조직의 영역의 감소이다. 그러나, 누공 수술에 있어서, 이러한 현상은 저장소의 깊이 및 크기를 수축시킴으로써 수포의 실패 기회를 증가시킨다(도 6에 도시). 다른 면에서, 상처의 치유 과정은 영원히 지속되지 않는다. 염증 기간에 상처는 상처의 봉쇄를 향하고 성숙, 즉 세포질(cellularity) 감소 및 세포외 메트릭스의 증가가 있게 된다. 이는 성숙된 상처에서 수포를 유지하는데 지속적인 외계 물체가 필요하지 않다는 것이다. 상기한 개념에 따르면, 근섬유모세포들의 주머니효과(purse effect)에 대항하는 강도를 제공할 수 있고 염증 구간이 지나갈 때까지 지속될 수 있는 생분해성 물질이 누공 수술의 성과를 향상시킬 수 있다.
본 실시예의 결과는 스캐폴드의 내부 구조(기공 크기)를 교란함 없이 스캐폴드의 표면에 대다수의 세포들이 있다는 것을 보여준다. 사실, 수포의 크기는 붕괴 없이 상처 치유 기간 동안 스캐폴드에 의해 유지될 수 있고(도 7에 도시), 수포의 크기의 유지에 공헌할 수 있는 스캐폴드 외부 세포질을 치밀하게 만들어 스캐폴드를 덮는 하나의 수성 층이 조직학적 그림 내에서 발견된다는 것은 흥미롭다.
누공 수술 중 결막에 형성된 상처는 가위에 의한 수포의 확장 및 결막 상처의 봉합이다. 본 방법은 결막하 스토마(storma) 염증 및 근섬유모세포들 내부로 섬 유모세포의 전이를 유발할 수 있다. 근섬유모세포들의 수축의 효과에 의해 수포 크기는 점진적으로 감소하며, 결과적으로 수포가 전부 없어질 수 있게 된다. 이는 장기 염증 과정을 가질 수 있는 고위험 환자들에게 더 현저히 발생할 수 있다.초기의 염증 제어 또는 섬유모세포들의 증식 억제 없이는 임상에서 높은 실패율을 보였다. 항대사제의 약효가 수술후 약간의 초기의 좋은 결과를 얻을 수 있을지라도 장기의 합병증은 여전히 외과의들의 걱정거리이다.
성공적인 누공 수술은 다음 특성들을 가져야만 한다:
첫째, 결막은 정상적인 구조로 기능적으로 작동해야 한다; 둘째, 수포는 안정적인 생리학적 상태로 유지될 수 있어야 한다; 셋째, 공막관은 상처가 숙성된 후 여전히 개방 가능해야 한다. 그리하여 주머니 효과를 방지하기 위한 강도를 제공할 수 있는 스캐폴드는 성공적인 누공 수술이 가능하게 한다.
일부 비-생분해성 이식물에 있어서, 이들은 일정한 수포 크기와 함께 이식물 자체의 지속적인 크기를 제공할 수 있다. 실제로, 저장소는 이식물 자체이지 수포가 아니다. 수포의 기능은 안구방수의 동적 배출구로서 작용하는 외부 결막층이다. 그러나 지속적인 외부물체 효과는 특정 기간 동안 상처가 소멸되더라도 상처에 염증을 일으킬 수 있다. 수포의 고용화는 만성 염증 반응의 결과들 중 하나이다. 장기적인 효과를 위한 더 안전한 방법은 성공적인 전통의 누공 수술 같이 어떠한 외부 물체 없이 전방과 결막 사이의 배출 시스템에 새로운 배출 시스템 환경을 생성하는 것이다. 종래의 누공 수술의 결과를 어떻게 향상시키는가 하는 것은 고위험 경우에 있어서 본 발명의 목적이다. 기능성 결막은 콜라겐 메트릭스를 결막 상처 내에 이식함으로써 재생될 수 있다는 것이 밝혀졌다(2000 IOVS Hsu). 상처치유의 수축에 저항하고 저장소의 크기를 유지할 수 있는 스캐폴드는 IOP 조절 및 장기적 효과에 더 나은 우수한 기회를 제공한다. 조직 공학은 누공 수술의 결과를 향상시키는데 있어 잠재적인 차제의 방법이 될 수 있다.
본 발명은 바람직한 실시예들을 참조로 기재되어졌으나, 상세한 살명에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 다양한 대안 및 변형이 앞서의 기재 내용에 제안될 수 있으며, 다른 사항들은 당업자에게 인식될 수 있다. 그리하여 모든 이러한 대안 및 변형들은 제시된 청구항들 내에 제한된 바와 같은 발명의 범위 내에 포함될 의도이다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 참증으로서 전체가 통합되었다.
본 명세서 내에 포함되어 있음.
도 1은 상이한 농도의 콜라겐-글리코사미노글리칸 내에서 스캐폴드들의 정압의 변화를 보여준다.
도 2는 뉴질랜드 알비노 토끼 암컷에 스캐폴더가 이식된 후 형태학적인 평가를 나타낸다. (a)(c)(e)(g)는 이식된 그룹으로부터의 결과를 나타내며, (b)(d)(f)(h)는 모의 그룹(sham group)으로부터의 결과를 나타낸다.
(a) 면역반응된 세포들이 이식 영역의 교차-참조 영역 내로 침윤되었다(*). 스캐폴드는 일부 퇴화되었고, 재생된 세포들이 상기 영역으로 침투하였다(굵은 상방 화살표)(H&E 염색, 40x, 3일).
(b) 면역반응된 세포들이 모의 그룹의 교차-참조 영역 내로 침윤되었다(*)(H&E 염색, 40x, 3일).
(c) 동정된 섬유모세포들(굵은 꼬임) 및 분비된 콜라겐(굵은 상방 화살표)이 이식된 부분의 교차-참조 영역 내에 불규칙적으로 배열되었다(Masson Trichrome 염색, 400x, 14일).
(d) 동정된 섬유모세포들(굵은 꼬임) 및 분비된 콜라겐(굵은 상방 화살표)이 모의 그룹의 교차-참조 영역 내에 밀집되게 배열되었다(Masson Trichrome 염색, 400x, 14일).
(e) 매우 소수의 α-SMA 면역반응성 세포들(굵은 상방 화살표)이 분해된 스캐폴드의 나머지 영역 내에 불규칙하게 나타났다(알파-SMA 면역세포화학, 400x, 14일).
(f) 다수의 α-SMA 면역반응성 세포들(굵은 상방 화살표)이 모의 그룹의 교차-참조 영역 내에 밀집되게 배열되었다(알파-SMA 면역세포화학, 400x, 14일).
(g) 매우 작은 동정된 콜라겐이 전체 분해된 스캐폴드의 나머지 영역 내에 불규칙하게 분포되었다(굵은 상방 화살표)(Masson Trichrome 염색, 2x, 28일).
(h) 전형적인 흉터 조직(굵은 상방 화살표)이 모의 그룹의 교차-참조 영역 내에 분포된 밀집하여 배열된 콜라겐 섬유들로 나타났다(Masson Trichrome 염색, 2x, 28일).
도 3은 스캐폴드 이식 후 안압의 발전을 나타낸다.
도 4는 콜라겐 메트릭스의 전자현미경 사진을 보여준다.
도 5는 표면상에 이주한 세포들을 가지는 결막하 공간 내의 온전한 이식물을 나타낸다(Masson Trichrome 염색, 20x, 7일).
도 6은 돌출된 수포 내의 부분적으로 분해된 이식물(흰 화살표)을 보여준다. 이식물이 분해된 영역의 반대방향으로 세포들이 이식물 내에 존재하며, 내부에는 콜라겐만이 남아있다(검은 화살표)(Masson Trichrome 염색, 20x, 14일).
도 7은 대조군 내의 붕괴된 수포(긴 검은 화살표) 내에 증착된 선형 콜라겐(흰 화살표)을 보여준다. 공막이 보이고 있다. 10-0 나일론(20-30um 직경, 짧은 검은 화살표)이 우측 상단 구석에 존재한다(Masson Trichrome 염색, 21일).
도 8은 이식된 그룹 내의 돌출된 수포(긴 검은 화살표) 내에 증착된 불규칙한 콜라겐(흰 화살표)을 보여준다(깊이는 가장 긴 검은 화살표로 표시됨, 가장 짧은 검은 화살표로 지시된 1000 나일론의 16배). 공막이 보이지 않는다. 10-0 나일 론(20-30um 직경, 검은 화살표)이 우측 상단 구석에 존재한다(Masson Trichrome 염색, 21일).
도 9는 스캐폴드가 이식되기 전 형태학적 평가를 나타낸다.
도 10은 스캐폴드가 이식되기 전 형태학적 평가를 나타낸다.
도 11은 PBS가 흡수된 콜라겐 메트릭스의 내압축성 압력 및 응력 사이의 관계를 나타낸다. 압력은 0.32KPa 까지 응력의 변화를 직접 측정하였다.

Claims (16)

  1. 식염수로 포화된 후 약 0.5mmHg 내지 약 5.5mmHg의 포화된 정압; 및
    식염수로 포화된 후 약 0.5KPa 내지 약 2KPa의 경도를 가지며,
    적어도 두가지 공중합체를 포함하는 스캐폴드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    포화된 정압이 약 1.75mmHg 내지 약 3.5mmHg인 스캐폴드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    경도가 1KPa 내지 1.6KPa인 스캐폴드.
  4. 제 2 항에 있어서,
    경도가 1KPa 내지 1.6KPa인 스캐폴드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    경도가 0.5KPa 내지 2KPa인 스캐폴드.
  6. 제 2 항에 있어서,
    경도가 0.5KPa 내지 2KPa인 스캐폴드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 공중합체들이 콜라겐 또는 젤라틴을 포함하는 스캐폴드.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드의 공중합체들이 콘드로이틴-6-설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄(dermtan) 설페이트, 키틴(chitin), 키토산, 및 이들의 혼합물들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 글리코사미노글리칸을 포함하는 스캐폴드.
  9. 제 1 항에 있어서,
    공중합체들 중 하나는 타입I 콜라겐인 스캐폴드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    스캐폴드가 약 10㎛ 내지 약 300㎛의 기공 크기를 가지는 스캐폴드.
  11. 제 1 항에 따른 스캐폴드를 포함하는 키트.
  12. 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을 포함하고, 포화된 정압이 약 1mmHg 내지 약 4mmHg인 스캐폴드.
  13. 제 12 항에 따른 스캐폴드를 포함하는 키트.
  14. 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을 포함하고, 약 10㎛ 내지 약 300㎛의 기공 크기를 가지는 스캐폴드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    기공 크기가 약 20㎛ 내지 약 200㎛인 스캐폴드.
  16. 제 15 항에 따른 스캐폴드를 포함하는 키트.
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