CN114540299A

CN114540299A - 一种胃黏膜免疫单细胞提取方法

Info

Publication number: CN114540299A
Application number: CN202111673478.7A
Authority: CN
Inventors: 梁廷波; 吴鸿昆; 谢雨婷; 张承; 沈杭; 石夫康; 卢娜; 林丹妮; 王佳宁
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114540299B

Abstract

一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，属于生物细胞提取技术领域。本发明通过物理方法除掉胃黏膜组织的黏膜上皮层和黏膜下层，留下免疫细胞富集的固有层进行消化处理，同时全程添加5μM BFA来抑制胃黏膜上皮细胞分泌黏液，通过双重手段阻止胃黏膜分泌的黏液影响单细胞提取。

Description

一种胃黏膜免疫单细胞提取方法

技术领域

本发明属于生物细胞提取技术领域，具体是涉及一种胃黏膜免疫单细胞提取方法。

背景技术

质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向。它可以对复杂的样品进行精细的免疫分型和信号通路分析；对免疫细胞进行自动分群，并对免疫细胞的功能多态性进行细致分析；可以对癌症组织进行精细的亚群分析，帮助研究者找到与临床预后密切相关的细胞亚群；可以深入探讨当前技术下所区分出的干细胞群体的异质性，对于以后干细胞治疗等领域具有重要的指导意义。

目前，质谱流式细胞技术已经广泛应用于人体各种组织。但，当应用于胃黏膜组织时，由于胃黏膜组织的特异性，表面包裹有一层厚达1mm的黏液层，用于保护胃黏膜组织不受胃液消化，用以往的方法单纯剪碎消化，免疫细胞得率低，而且黏液一直存在于细胞悬液中，并与黏膜下层的纤维结缔组织形成网状结构，致使细胞聚团，甚至使细胞悬液粘稠，离心时无法沉淀。通过强行处理大量组织提取出来的少量细胞仅仅能够做单细胞测序和普通流式，且所得数据质量不佳，分群图像异常，如图1所示，细胞活率及CD45比例较低。同时，在上机收样时，因细胞悬液粘稠以及上样针仅允许单细胞通过，导致极易堵塞，以至无法完成实验，而且应用于质谱流式时，由于质谱流式染色时间长，细胞不停聚团，不停丢失。因此，现有的免疫单细胞提取方案完全无法应用于质谱流式细胞技术，严重阻碍了人们对胃的免疫微环境探索。

发明内容

本发明主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种胃黏膜免疫单细胞提取方法。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，包括如下步骤：

步骤1，取胃黏膜组织，用冰D-HBSS缓冲液清洗多次，洗去残留的分泌物和胃液；

步骤2，用刮刀刮去胃黏膜组织表面的黏液；

步骤3，称取1g胃黏膜组织，将其置于50ml离心管内，并加入10ml冰D-HHSS缓冲液，然后将离心管置于振荡器内进行振荡清洗5S；若D-HHSS缓冲液浑浊，则再次振荡清洗；

步骤4，用弯剪将胃黏膜组织的黏膜下层剪去；

步骤5，用吸水纸将去除黏膜下层的胃黏膜组织表面残留的液体吸去，并剪碎至0.5平方厘米的组织碎片；

步骤6，将组织碎片置于装有10ml预消化缓冲液的50ml离心管内，以37℃、转速150rpm的条件在摇床上消化15min；

步骤7，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡10S，去除悬浮在预消化缓冲液内呈絮状碎片的黏膜上皮层；然后，利用100μm的筛网，用不含钙镁离子的PBS缓冲液反复冲刷洗涤组织碎片；接着，将组织碎片置于50ml离心管内，并装入冰D-HBSS缓冲液，然后将50ml离心管置于振荡器内进行振荡清洗5S；若D-HBSS缓冲液浑浊，则再次振荡清洗，直至黏膜上皮层被完全清除；

步骤8，将组织碎片置于1.5ml离心管内，在消化液的缓冲下剪碎至糊状，消化液的总体积为10ml，然后以37℃、转速150rpm的条件在摇床上消化30min；

步骤9，利用70μm的筛网过滤，用添加有1％浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液反复冲洗，协助单细胞滤过筛网，用50ml离心管收集滤过的单细胞悬液，弃去筛网上残余未被消化的纤维结缔组织及死细胞团块；收集完成后，在50ml离心管内加入添加有1％浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液至40ml，然后将50ml离心管离心，离心机升9降9，转速450G，温度4℃，离心时间10min；

步骤10，离心后，用3ml添加有1％浓度bsa的不含钙镁离子的PBS缓冲液重悬，然后过40μm的筛网，弃去筛网上残余组织，滤过的细胞悬液收集入15ml离心管后离心，离心机升9降9，转速450G，温度4℃，离心时间5min；

步骤11，将2ml 70％浓度percoll滴加在15ml新的离心管中，将3ml 40％浓度percoll重悬细胞沉淀后，缓慢滴加在2ml 70％浓度percoll的上方，再用3ml 40％浓度percoll重悬离心管管底残留细胞，然后将15ml离心管置于离心机离心，离心机升3降1，转速450G，温度20℃，离心时间25min；

步骤12，吸取最上层的细胞层，弃去；吸取中间细胞层，即为免疫细胞层，将其转移至15ml离心管内，加满不含钙镁离子的PBS缓冲液后离心，离心机升9降9，转速500G，温度4℃，离心时间5min；

步骤13，弃去上清液，用不含钙镁离子的PBS缓冲液重悬后得到纯净的胃黏膜免疫单细胞悬液。

作为优选，所述预消化缓冲液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS；2％的1M HEPES；1％的0.5M EDTA；1％的0.1M DTT；91.99％的D-HBSS缓冲液；0.01％的50MBFA。

作为优选，所述消化液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS；0.06％的1MHEPES；1％的1mg/ml胶原酶Ⅳ；1％的0.1mg/mlDNA酶Ⅰ；93.89％的1640；0.01％的50M BFA；0.04％的1M氯化钙溶液。

作为优选，所述D-HBSS缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、预消化缓冲液和消化液中均添加有5μM BFA。

作为优选，在步骤2中，采用刮刀多次刮除胃黏膜组织表面的黏液，每次刮除后用D-HBSS缓冲液冲洗。

作为优选，将步骤6和步骤7洗脱的预消化缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、D-HBSS缓冲液收集，利用步骤11和步骤12收集免疫细胞层，然后将免疫细胞层转移至步骤13所制得的胃黏膜免疫单细胞悬液中。

作为优选，所述振荡器为vortex涡旋振荡器。

本发明具有的有益效果：本发明通过物理方法除掉胃黏膜组织的黏膜上皮层和黏膜下层，留下免疫细胞富集的固有层进行消化处理，同时全程添加5μM BFA来抑制胃黏膜上皮细胞分泌黏液，通过双重手段阻止胃黏膜分泌的黏液影响单细胞提取。本发明中，1g胃黏膜组织可以提取2×10⁶细胞，可以达到70％存活率，80％的免疫细胞占比。

附图说明

图1是传统方法所得到的胃黏膜免疫单细胞的普通流式图；

图2是本发明所得到的胃黏膜免疫单细胞的普通流式图；

图3是本发明所得到的胃黏膜免疫单细胞的质谱流式图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，包括如下步骤：

步骤1，取胃黏膜组织，用冰D-HBSS缓冲液(即D-Hanks缓冲液，温度4℃)清洗多次，洗去残留的分泌物和胃液；胃黏膜组织为胃组织上剥离，连带有黏膜上皮层和黏膜下层；

步骤2，用刮刀多次刮除胃黏膜组织表面的黏液，每次刮除后用D-HBSS缓冲液冲洗；在本实施例中，第一次刮时，刮除的黏液呈胶冻状；第二次刮时，刮除的黏液为大块絮状物；第三次刮时，已不再出现大块絮状物，即基本清除胃黏膜组织表面的黏液；在刮除过程中，注意动作轻柔，勿破坏胃黏膜组织的完整性；

步骤3，称取1g胃黏膜组织，将其置于50ml离心管内，并加入10ml冰D-HHSS缓冲液(温度4℃)，然后将离心管置于vortex涡旋振荡器内进行振荡清洗5S；若D-HHSS缓冲液浑浊，则再次振荡清洗；

步骤4，用弯剪将胃黏膜组织的黏膜下层剪去；具体为：用镊子将呈白色的黏膜下层提起，然后用弯剪小心往前推动将黏膜下层剪去，剪时，勿使弯剪太过靠下，导致黏膜穿孔；

步骤7，将50ml离心管从摇床取下，置于vortex涡旋振荡器内进行振荡10S；振荡后，预消化缓冲液悬浮有呈絮状碎片的黏膜上皮层，将黏膜上皮层去除；然后，利用100μm的筛网，用不含钙镁离子的PBS缓冲液反复冲刷洗涤组织碎片；接着，将组织碎片置于50ml离心管内，并装入冰D-HBSS缓冲液，然后将50ml离心管置于vortex涡旋振荡器内进行振荡清洗5S；若D-HBSS缓冲液浑浊，则再次振荡清洗，直至黏膜上皮层被完全清除；

在本实施例中，步骤6、步骤7重复操作一次，以保证黏膜上皮层完全被清除；

步骤11，将2ml 70％浓度percoll(比重1.090)滴加在15ml新的离心管中，将3ml40％浓度percoll(比重1.056)重悬细胞沉淀后，缓慢滴加在2ml 70％浓度percoll的上方，再用3ml 40％浓度percoll重悬离心管管底残留细胞，总体积8ml，然后将15ml离心管置于离心机离心，离心机升3降1，转速450G，温度20℃，离心时间25min；

步骤12，吸取最上层的细胞层，细胞层为粘稠的细胞碎片、脂肪组织等，弃去；吸取中间细胞层，即为免疫细胞层，将其转移至15ml离心管内，加满不含钙镁离子的PBS缓冲液后离心，离心机升9降9，转速500G，温度4℃，离心时间5min；

所述预消化缓冲液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS(即HyClone特级胎牛血清)；2％的1M HEPES；1％的0.5M EDTA；1％的0.1M DTT；91.99％的D-HBSS缓冲液；0.01％的50M BFA(即布雷非德菌素A)。

所述消化液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS(即HyClone特级胎牛血清)；0.06％的1M HEPES；1％的1mg/ml胶原酶Ⅳ；1％的0.1mg/mlDNA酶Ⅰ；93.89％的1640(即HyClone RPMI 1640培养基)；0.01％的50M BFA(即布雷非德菌素A)；0.04％的1M氯化钙溶液。

在本实施例中，所述D-HBSS缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、预消化缓冲液和消化液中均添加有5μM BFA；通过添加5μM BFA，抑制胃黏膜上皮细胞分泌黏液，从而避免黏液影响单细胞提取。

在本实施例中，将步骤6和步骤7洗脱的预消化缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、D-HBSS缓冲液进行收集，利用步骤11和步骤12收集免疫细胞层，然后将免疫细胞层转移至步骤13所制得的胃黏膜免疫单细胞悬液中，以实现免疫细胞的回收。

图2为本发明所得到的胃黏膜免疫单细胞的普通流式图，细胞活性86.0％，高表达CD45免疫标记，数值均高于现有技术(即图1)；图3本发明所得到的胃黏膜免疫单细胞的质谱流式图，细胞分群明显，细胞活性69.6％，高表达CD45免疫标记。

综上所述，本发明通过物理方法除掉胃黏膜组织的黏膜上皮层和黏膜下层，留下免疫细胞富集的固有层进行消化处理，同时全程添加5μM BFA来抑制胃黏膜上皮细胞分泌黏液，通过双重手段阻止胃黏膜分泌的黏液影响单细胞提取。本发明中，1g胃黏膜组织可以提取2×10⁶细胞，可以达到70％存活率，80％的免疫细胞占比。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明不限于上述实施例，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2，用刮刀刮去胃黏膜组织表面的黏液；

步骤4，用弯剪将胃黏膜组织的黏膜下层剪去；

2.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，所述预消化缓冲液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS；2％的1M HEPES；1％的0.5M EDTA；1％的0.1M DTT；91.99％的D-HBSS缓冲液；0.01％的50M BFA。

3.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，所述消化液由以下体积百分含量的各物质组成：4％的FBS；0.06％的1M HEPES；1％的1mg/ml胶原酶Ⅳ；1％的0.1mg/mlDNA酶Ⅰ；93.89％的1640；0.01％的50M BFA；0.04％的1M氯化钙溶液。

4.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，所述D-HBSS缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、预消化缓冲液和消化液中均添加有5μM BFA。

5.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，在步骤2中，采用刮刀多次刮除胃黏膜组织表面的黏液，每次刮除后用D-HBSS缓冲液冲洗。

6.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，将步骤6和步骤7洗脱的预消化缓冲液、不含钙镁离子的PBS缓冲液、D-HBSS缓冲液收集，利用步骤11和步骤12收集免疫细胞层，然后将免疫细胞层转移至步骤13所制得的胃黏膜免疫单细胞悬液中。

7.根据权利要求1所述的一种胃黏膜免疫单细胞提取方法，其特征在于，所述振荡器为vortex涡旋振荡器。