BR112013030828B1 - Processo para preparar um equivalente de couro cabeludo - Google Patents

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Abstract

processo para preparar um equivalente de couro cabeludo a presente invenção trata de um couro cabeludo reconstruído, do o processo para prepará-lo e de seu uso para avaliar o efeito dos produtos tópicos cosméticos, farmacêuticos ou dermatológicos o couro cabeludo reconstruído de acordo com a presente invenção pode também ser usado para a preparação dos enxertos destinado ao tratamento dos distúrbios cutâneos do couro cabeludo.

Description

“PROCESSO PARA PREPARAR UM EQUIVALENTE DE COURO CABELUDO” [001] A presente invenção trata de um modelo de couro cabeludo reconstruído, do processo para prepará-lo e de seu uso para avaliar o efeito de produtos tópicos cosméticos, farmacêuticos ou dermatológicas.
[002] O couro cabeludo reconstruído de acordo com a presente invenção pode também ser usado para preparação de enxertos destinados a ser transplantados em mamíferos, mais particularmente em pacientes humanos que sofreram queimaduras de terceiro grau.
[003] Modelos de pele reconstruída que são mais ou menos similares à pele humana foram desenvolvidos nos últimos anos. Os exemplos de modelos de pele reconstruída que podem ser citados incluem os modelos descritos nos seguintes documentos: EP 0 285 471, EP 0 285 474, EP 0 418 035, WO 90/02796, WO 91/16010, EP 0 197 090, EP 0 020 753, FR 2 665 175, FR 2 689 904. Esses modelos permitem, em primeiro lugar, realizar os estudos necessários a um melhor entendimento do papel da pele tanto no campo mecânico quanto no campo fisiológico e, em segundo lugar, constituir testes preditivos da atividade dos agentes ativos cosméticos e/ou farmacêuticos ou dos efeitos colaterais de ingredientes tópicos.
[004] A Depositante observou que esses modelos são apropriados para estudos referentes à pele do corpo humano, mas não são ideais para estudos referentes a uma pele específica, o couro cabeludo. Até onde vão os conhecimentos da Depositante, não foi proposto nenhum couro cabeludo reconstruído até a presente data.
[005] O couro cabeludo é a parte da pele localizada sob a cabeleira, isto é, sobre o crânio. Em um adulto, sua área pode variar entre 650 e 700 cm2. Ela possui uma estrutura convencional, mas possui diversas características que a distinguem da pele de outras partes do corpo humano:
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2/26 sua epiderme é mais espessa, devido à renovação mais rápida dessas células, seu stratum corneum é mais espesso, mas é desorganizado, as atividades desses folículos capilares são maiores devido a sua maior presença (aproximadamente 200 a 300 folículos/cm2), a produção de suas glândulas sebáceas é intensa e a atividade de suas glândulas sudoríparas é elevada, o que permite uma colonização bacteriana e fúngica substancial dessas glândulas.
[006] Em geral, os modelos de pele reconstruída descritos nos documentos supramencionados são preparados a partir de fibroblastos das papilas dérmicas ou da bainha conjuntiva e/ou células tiradas da bainha epitelial externa (também conhecida como BRE para Bainha Radicular Externa) devido à facilidade de produção dessas células. Especificamente, essas células são removidas quando um cabelo é puxado, e são suscetíveis de fabricar uma epiderme quando são colocadas em um suporte, habitualmente um equivalente dérmico, e cultivadas em um meio de cultura adequado. Entretanto, o tecido que é obtido pela cultura das células das papilas dérmicas apresentam uma expressão de macromoléculas (especialmente colágeno) que não correspondem à de um couro cabeludo in vivo. O tecido que é obtido pela cultura de Células BRE também não possui as características de um couro cabeludo. Além disso, o fenômeno normal de descamação que ocorre em um couro cabeludo in vivo não será observado uma vez que, como as Células BRE nunca estiveram em contato com o ar, elas não descamam. O modelo assim obtido não pode, portanto, ser usado para reproduzir in vitro o aspecto da caspa. Finalmente, os tamanhos e as morfologias das epidermides e dermides obtidos usando essas várias células não serão os mesmos que os das epidermides e dermides do couro cabeludo: no caso do couro cabeludo, a derme é mais espessa e mais invaginada que no caso da pele.
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3/26 [007] A Depositante demonstrou, de modo surpreendente, que a cultura das células interfoliculares do couro cabeludo permite desenvolver um couro cabeludo reconstruído que possui a maior parte das características de um in couro cabeludo vivo.
[008] Uma característica desse modelo de couro cabeludo é a expressão, nas camadas suprabasais finais, isto é, nas camadas granulares da epiderme, de involucrina e queratina K10 (ver, em particular, a figura 1). As células da camada granular estão localizadas abaixo do stratum corneum. A camada granular (ou stratum granulosum) é formada de três camadas de queratinócitos achatados, com um núcleo denso de forma oval. A expressão tardia de involucrina e de queratina K10 é encontrada em uma fatia de couro cabeludo obtida a partir de uma amostra tirada durante um lifting, ao passo que, em uma fatia de pele reconstruída, a expressão desses marcadores é observada ao longo das camadas suprabasais, isto é, nas células da substância mucosa malpigiana (que constitui o stratum spinosum). Isso demonstra que o modelo de couro cabeludo de acordo com a presente invenção possui as especificidades de um couro cabeludo in vivo.
[009] Essas características permitem, em particular, distinguir um modelo de couro cabeludo obtido de acordo com o processo da presente invenção em relação aos modelos de pele reconstruída padrão.
[010] Assim, a Depositante desenvolveu um novo processo parra preparar um equivalente de couro cabeludo.
[011] A Depositante isolou as células interfoliculares do couro cabeludo e teve a ideia de usá-las para desenvolver um equivalente de couro cabeludo.
[012] O termo equivalente de couro cabeludo, também referido a seguir como modelo de couro cabeludo, designa o conjunto de um couro equivalente epidérmico do couro cabeludo situado sobre um equivalente dérmico
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4/26 do couro cabeludo. Essa é uma estrutura produzida in vitro por meio de um processo técnico.
[013] A presente invenção trata, assim, de um processo para preparar um equivalente de couro cabeludo, que compreende uma etapa de semeadura e uma etapa de cultura dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo em um equivalente dérmico, e o referido equivalente dérmico compreende colágeno e fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo.
[014] Os equivalentes dérmicos podem ser preparados de acordo com vários processos, por exemplo, os descritos nos documentos EP 0 418 035, WO 00/29553 ou EP 0 285 471, tomando-se o cuidado de usar os fibroblastos mencionados acima.
[015] Os equivalentes dérmicos que podem ser mencionados incluem as redes mistas de colágeno/fibroblastos, a derme que foi préepidermizada anteriormente, as membranas artificiais, por exemplo, os filtros da marca Millipore, os substratos subcutâneos à base de colágeno, o plástico ou qualquer outro suporte que seja compatível com a viabilidade celular. De preferência, o equivalente dérmico de acordo com a presente invenção está na forma de uma rede de colágeno ou uma esponja de colágeno.
[016] O termo rede de colágeno é bem conhecido da arte anterior (Bell et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No. 3, pp. 12741278) e designa um modelo conhecido de equivalente dérmico que vem sendo usado há décadas.
[017] De preferência, de acordo com a presente invenção, a rede é preparada de acordo com o método descrito por Asselineau et al., 1987 (Models in dermato., vol. III, Ed Lowe & Maibach, 1-7).
[018] O termo esponja de colágeno é também conhecido do técnico no assunto. Ele designa biopolímeros à base de colágeno (por exemplo: Mimedisk® vendido pela BASF Beauty Care).
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5/26 [019] De acordo com a presente invenção, o colágeno pode ser qualquer tipo de colágeno de qualquer origem. A esse respeito, será feita referência aos vários tipos de colágeno mencionados nos artigos de Van der Rest e Garonne, 1990, Biochem., vol. 72, 473-484 ou 1991, Faseb Journal, vol. 5, 2814-2823. Assim, de acordo com a presente invenção, o colágeno é escolhido, de preferência, entre os colágenos fibrilares de tipo I, III ou V.
[020] De preferência, de acordo com a presente invenção, é usado o colágeno de origem animal e particularmente o colágeno de origem bovina.
[021] O colágeno usado de preferência de acordo com a presente invenção é o colágeno tipo I. Mais preferencialmente, de acordo com a presente invenção, é usado o colágeno bovino tipo I.
[022] Evidentemente, de acordo com a presente invenção, uma mistura de diferentes tipos de colágeno em qualquer proporção e/ou de diferentes origens pode ser usada.
[023] De preferência, o equivalente dérmico é uma rede contraída (áspera) de colágeno e a semeadura com queratinócitos é realizada, de preferência, após 2 a 6 dias, mais preferencialmente após 3 a 5 dias e mais preferencialmente ainda após 3 dias de contração da rede. A contração do gel de colágeno é devida, de preferência, à ação dos fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo no colágeno.
[024] Os fibroblastos e/ou queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo são de preferência isolados, respectivamente, da derme e da epiderme obtidas a partir de uma amostra de couro cabeludo. Em um modo de realização preferido, os queratinócitos da bainha epitelial externa serão retirados dessa amostra previamente, por exemplo por depilação do cabelo na referida amostra. A depilação do cabelo na amostra de couro cabeludo, por exemplo usando uma pinça, será realizada de modo a remover totalmente da amostra os queratinócitos da bainha epitelial externa.
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6/26 [025] Os queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo são obtidos, de preferência, através das seguintes etapas:
- separação da derme do couro cabeludo da epiderme por tratamento proteolítico de uma amostra de couro cabeludo e, em particular, colocando uma amostra de couro cabeludo em contato com dispase ou termolisina,
- recuperação da epiderme couro do cabeludo,
- colocação da epiderme do couro cabeludo assim obtida em contato com tripsina,
- recuperação dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo e
- cultura dos queratinócitos assim obtidos.
[026] Os queratinócitos são amplificados antes da semeadura de acordo com a técnica de Rheinwald e Green (Cell, vol. 6, 331-344,1975) por cultura em um suporte de nutrientes constituído de fibroblastos em um meio apropriado conhecido do técnico no assunto, na presença de fatores de crescimento, em particular aminoácidos, soro, toxina da cólera, insulina, triiodotrionina e solução tampão de pH. Em particular, tal meio de cultura pode conter, em particular, pelo menos um fator de crescimento mitogênico para queratinócitos (por exemplo, fator de crescimento epidérmico (FCE) e/ou fator de crescimento de queratinócitos (KGF), em particular, KGF), insulina, hidrocortisona e opcionalmente um antibiótico (por exemplo: gentamicina ou anfotericina B).
[027] Vantajosamente, o referido meio pode também compreender soro ou um extrato de pituitária, por exemplo de origem bovina, epinefrina, transferrina e/ou aminoácidos não essenciais.
[028] Os fibroblastos usados para essa cultura serão mais preferencialmente fibroblastos 3T3. Os fibroblastos 3T3 são bem conhecidos do técnico no assunto. Trata-se de uma linha celular de fibroblastos que é bem
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7/26 conhecida desde 1962. 3T3 designa inóculo de células 3x105, transferência de 3 dias”.
[029] A cultura dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo é de preferência uma cocultura com fibroblastos (de preferência fibroblastos 3T3) cuja proliferação foi interrompida previamente, de preferência irradiando-os previamente (por exemplo com UV) ou tratando-os previamente com mitomicina. A mitomicina (em particular, mitomicina C) bloqueia a proliferação dessas células sem, entretanto, evitar que elas produzam as substâncias nutrientes que são úteis para a proliferação dos queratinócitos.
[030] De acordo com outro modo de realização, os queratinócitos são amplificados antes da semeadura pela cultura em um meio de cultura que foi tratado ou suplementado com fibroconectina (por exemplo, uma caixa de cultura revestida com fibroconectina) ou com colágeno (por exemplo uma caixa de cultura revestida com colágeno de tipo I ) ou um meio de cultura rico tal como o meio Epilife® (Gibco).
[031] A Dispase (também conhecida como protease neutra) é uma enzima que pertence à família das proteases, que possui uma capacidade de clivar a fibroconectina e os colágenos de tipo I e IV.
[032] Os queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo são obtidos, de preferência, através das seguintes etapas:
- separação da derme do couro cabeludo da epiderme por tratamento proteolítico de uma amostra de couro cabeludo e especialmente colocando uma amostra de couro cabeludo em contato com a dispase ou a termolisina,
- recuperação da derme do couro cabeludo,
- colocação da derme do couro cabeludo assim obtida em contato com a colagenase e/ou a tripsina,
- recuperação dos fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo
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8/26 e
- cultura dos fibroblastos assim obtidos.
[033] Deve ficar claro que enzimas mencionadas acima são usadas em concentrações, conhecidas do técnico do assunto, que permitem que elas tenham os efeitos desejados. De preferência, é a dispase que será usada para separar a derme do couro cabeludo da epiderme. A tripsina (Gibco) permitirá obter uma suspensão de queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo a partir de uma epiderme do couro cabeludo. A colagenase (Boehringer) e/ou tripsina permitirão obter uma suspensão de fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo a partir de uma derme do couro cabeludo.
[034] A recuperação dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo ou fibroblastos é realizada de preferência por filtração da suspensão obtida pela ação da tripsina ou da colagenase, seguida de centrifugação, nas condições conhecidas do técnico no assunto, e re-suspensão do sedimento de centrifugação.
[035] Mais particularmente, o processo de acordo com a presente invenção inclui:
a- semear com os queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo de uma rede de colágeno situada sobre um suporte imerso em um meio de cultura;
b- a multiplicação dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo na superfície do referida rede de colágeno;
c- elevação do referido suporte de tal forma que meio de cultura não cubra a face superior do equivalente dérmico durante a produção.
[036] Em particular, o suporte pode ser uma grade de suporte.
[037] O equivalente dérmico de acordo com a presente invenção é obtido, em particular, por semeadura do meio de cultura com fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo, seguida da adição de colágeno.
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9/26 [038] O processo de acordo com a presente invenção pode compreender as seguintes etapas de cultura
a) células contráteis cultivadas, por exemplo, a partir de culturas em monocamadas produzidas em um meio nutriente semeado com fragmentos de tecido animal ou humano com
b) um meio nutriente suplementado com componentes da matriz extracelular dérmica, em particular, com colágeno, e a referida mistura forma um gel que se contrai, expelindo o meio nutriente para formar o equivalente dérmico e em particular, a rede contraída de colágeno.
[039] Os fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo obtidos a partir de doadores humanos saudáveis e semeados a partir de culturas em monocamadas, por tripsinaização controlada ou pelo uso de colagenase, serão usados como célula contrátil.
[040] A implementação do processo de preparação de acordo com a presente invenção consiste em semear o equivalente dérmico - ou substrato dérmico - com queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo.
[041] As condições que permitem a multiplicação dos queratinócitos na superfície do referido substrato são mantidas, e o desenvolvimento dessa cultura de queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo é promovida pelo uso de pelo menos um meio nutriente mínimo, de preferência, um meio 3F tal como descrito no Exemplo 1, em contato com os referidos queratinócitos.
[042] Vantajosamente, após semear dos queratinócitos no substrato, o substrato implantado é mantido, de preferência, durante entre 5 e 7 dias, por imersão nesse meio nutriente que cobre os queratinócitos.
[043] Em seguida, o equivalente dérmico é colocado em contato com o ar. Para isso, ele é colocado em uma grade de suporte que é levantada
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10/26 em relação à base no receptáculo, e o nível do meio nutriente é ajustado, de forma que a grade de suporte seja simplesmente coberta, mas que não cubra a face superior do equivalente da pele durante a produção.
[044] De acordo com o processo da presente invenção, o equivalente dérmico contraído com os queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo é assim, de preferência, cultivado durante 5 a 7 dias por imersão em um meio de cultura seguida de emersão durante 5 a 7 dias em um suporte adequado.
[045] O equivalente de couro cabeludo de acordo com a presente invenção assim constituído é bem diferenciado e bem organizado. Ele é também globalmente homogêneo.
[046] De acordo com uma variante do processo de acordo com a presente invenção, é possível obter um equivalente de couro cabeludo que compreenda cabelo por implantação, no referido equivalente dérmico de couro cabeludo (em particular, na rede de colágeno), que seja contraído ou que esteja em processo de contração, dos fibroblastos capilares escolhidos entre os fibroblastos das papilas dérmicas e/ou fibroblastos da bainha conjuntiva, e/ou papilas dérmicas inteiras e/ou bainhas conjuntivas e/ou frações de bainhas conjuntivas. Essa implementação pode ser feita, por exemplo, por meio de uma seringa. Esses fibroblastos capilares, as papilas dérmicas inteiras, as bainhas conjuntivas e/ou as frações de bainhas conjuntivas serão adicionadas depois que os fibroblastos interfoliculares tiverem iniciado sua ação sobre o colágeno. Sua adição, portanto, não ocorre ao mesmo tempo que os fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo. Os fibroblastos capilares serão adicionados, de preferência, em uma quantidade 1000 a 10 000 células, isto é, uma proporção de aproximadamente 1 a 10 fibroblastos capilares por 100 fibroblastos interfoliculares de couro cabeludo.
[047] Pela implantação de fibroblastos capilares tais como os
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11/26 fibroblastos papilares ou os fibroblastos da bainha conjuntiva ou a papila inteira ou da bainha conjuntiva ou frações da bainha conjuntiva no equivalente dérmico, os queratinócitos reproduzirão a morfogênese do corpo ou da cabeleira (haste do cabelo) (Reynolds A.J., Lawrence C.M., Jahoda C.A., Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J. Invest. Dermatol. 1993 Oct.;101 (4): 6348).
[048] Outro objeto da presente invenção é um equivalente de couro cabeludo que pode ser obtido pelo processo de acordo com a presente invenção.
[049] Esse equivalente de couro cabeludo apresenta a expressão de involucrina e/ou de queratina K10 em suas camadas granulares, que é uma expressão comparável com a de um couro cabeludo in vivo. O termo expressão comparável designa uma expressão dos genes que codificam para essas proteínas que ocorre nas células localizadas no mesmo lugar que o tecido in vivo e/ou na mesma intensidade.
[050] Uma vez que o equivalente de couro cabeludo possui as características de um couro cabeludo in vivo, ele pode ser enxertado da mesma maneira e com o mesmo sucesso que os enxertos tirados da nuca ou da região occipital do indivíduo a ser tratado. Técnicas autógrafas são descritas, por exemplo, por Bouhanna et al. (Dermatol. Surg. ; Nov. 2003, 29(11), 1130-4). Após um enxerto, o equivalente de couro cabeludo de acordo com a presente invenção possui, portanto, a capacidade de substituir adequadamente a parte do couro cabeludo original [051] O equivalente de couro cabeludo encontrará também aplicações para a preparação de enxertos destinados a tratar um distúrbio cutâneo do couro cabeludo tal como uma queimadura, um defeito de cicatrização ou cabelos grisalhos, e destinados, portanto, a ser transplantados em mamíferos e mais particularmente em pacientes humanos que sofrem de queimaduras de
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12/26 terceiro grau. Um enxerto é definido como sendo parte de um tecido destinado a ser enxertado.
[052] Assim, outro objeto da presente invenção diz respeito a um equivalente de couro cabeludo tal como definido acima, para seu uso para tratar ou no tratamento de um dos distúrbios cutâneos do couro cabeludo mencionados acima. Esse equivalente de couro cabeludo ou enxerto terá características em termos expressão de involucrina e de queratina K10 comparáveis aos de um couro cabeludo in vivo (isto é, expressão nas camadas granulares finais da epiderme de involucrina e de queratina K10). A presente invenção diz ainda respeito ao uso de um equivalente de couro cabeludo tal como descrito acima, para a fabricação de um enxerto para tratar um desses distúrbios cutâneos do couro cabeludo.
[053] Independentemente da variante do processo adotado para sua preparação, o equivalente de couro cabeludo que é obtido é um modelo tridimensional que é útil como um teste alternativo para qualquer teste que requeira experimentação animal, por exemplo, estudos sobre a liberação de agentes ativos, sua penetração cutânea e/ou sua absorção e/ou sua biodisponibilidade, ou estudos sobre a tolerância, a compatibilidade ou a eficácia dos agentes ativos e/ou dos ingredientes cosméticos, farmacêuticos ou dermatológicos.
[054] Assim, outro objeto da presente invenção é o uso de um equivalente de couro cabeludo tal como descrito acima, para testar a penetração cutânea e/ou a absorção e/ou biodisponibilidade e/ou a eficácia dos compostos sobre o couro cabeludo e/ou para testar a tolerância e/ou a compatibilidade dos compostos em relação ao couro cabeludo.
[055] Esse uso permite, portanto, ver se um composto penetra nas várias camadas do couro cabeludo, ou se ele não possui, na verdade, o efeito desejado.
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13/26 [056] Esse equivalente de couro cabeludo é especialmente útil para a identificação de um composto que é um modulador do crescimento capilar e/ou das moléculas que atuam sobre a qualidade e a homeostase do couro cabeludo e especialmente sobre a descamação do couro cabeludo, o tratamento da caspa ou de um couro cabeludo sensível.
[057] Ele pode, ainda, permitir a pesquisa de biomarcadores relacionados com o estado normal ou patológico do couro cabeludo. Uma vantagem adicional repousa na possibilidade de estudar a implementação de folículos capilares, glândulas sudoríparas ou glândulas sebáceas a fim de chegar ainda mais perto de um couro cabeludo in vivo.
[058] Esse modelo é necessário para induzir a formação do cabelo por injeção de células-tronco.
[059] O couro cabeludo reconstruído de acordo com a presente invenção pode permitir quantificar a atividade de moléculas que são suscetíveis de induzir a formação de células-tronco capilares (por exemplo, de células de bulbo).
[060] Os equivalentes de couro cabeludo que compreendem folículos capilares permitirão, em particular, realizar uma cinética do crescimento do corpo ou da cabeleira e possibilitar, assim, qualquer estudo que requeira numerosos cabelos vivos que sejam tão completos quanto possível em um contexto in vivo, tal como o estudo do ciclo capilar e dos fatores suscetíveis de influenciar esse ciclo, até o estudo de agentes ativos que promovam o crescimento capilar, de agentes ativos para combater a perda de cabelo ou de agentes ativos que retardem o crescimento capilar.
[061] Os processos de rastreamento de produtos para identificar novos agentes ativos incluem uma etapa (a) de colocar o referido produto em teste em contato com um equivalente de couro cabeludo de acordo com a presente invenção e, depois, uma etapa (b) de analisar o efeito do referido produto sobre pelo menos um parâmetro do equivalente de couro cabeludo e
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14/26 uma etapa (c) de escolha do produto que modifica o referido parâmetro.
[062] De preferência, para realizar a etapa (a), o produto em teste é aplicado topicamente, por exemplo, formulado em formulações tópicas padrão ou ainda introduzido no meio de cultura.
[063] O parâmetro do equivalente de couro cabeludo é escolhido, de preferência, entre a expressão, a produção e/ou a atividade dos marcadores escolhidos previamente no equivalente de couro cabeludo e/ou a descamação do equivalente de couro cabeludo.
[064] A etapa (b) pode ser realizada, em particular, pela análise da expressão, produção e/ou atividade de marcadores associados com a qualidade e/ou homeostase do couro cabeludo, por exemplo, marcadores epidérmicos e/ou dérmicos tais como as proteínas estruturais, em particular as proteínas de diferenciação epidérmica e as proteínas macromoleculares da matriz dérmica. Como exemplos de proteínas estruturais, podem ser citadas as queratinas capilares.
[065] Esses marcadores associados com a qualidade e/ou a homeostase do couro cabeludo podem ser representativos da descamação do couro cabeludo, da caspa ou de um couro cabeludo sensível.
[066] Quando o modelo de couro cabeludo de acordo com a presente invenção compreender fibroblastos capilares tais como fibroblastos papilares ou fibroblastos da bainha conjuntiva ou da papila inteira ou da bainha conjuntiva ou frações da bainha conjuntiva que podem ser implantados do modo escrito acima no equivalente dérmico, os testes de rastreamento podem também se destinar a identificar produtos suscetíveis de induzir o crescimento da haste do cabelo.
[067] Para isso, a etapa (b) do processo de rastreamento analisará o efeito sobre o crescimento da haste do cabelo.
[068] Quando o modelo de couro cabeludo de acordo com a presente
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15/26 invenção compreender células do sistema imune, tais como as células de Langerhans, os testes de rastreamento podem ser também destinados a identificar produtos que sejam suscetíveis de induzir reações irritativas ou alérgicas.
[069] Para isso, a etapa (b) do processo de rastreamento analisará o efeito do produto sobre pelo menos um dos parâmetros escolhido de preferência entre:
- a citotoxidade;
- a liberação de mediadores de inflamação;
- o dano celular revelado pela histologia ou pela liberação de lactato desidrogenase (um marcador da integridade da membrana queratinocítica) (Roguet et al., J. Tox. In vitro 6:303 (1992) e Ponec M in In Vitro Toxicology. Eds Rougier, Maibach e Golberg p. 107, 1994);
- a modificação da síntese e da composição dos lipídios cutâneos, particularmente as ceramidas e os fosfolipídios (JID 86, 598 (1986));
- a estratificação das células epiteliais como um marcador de sua diferenciação (M. Prunieras e R. Roguet Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications, Eds M. Adolphe, A. Guillouzo e F. Marano publicado por INSERM 1995 pp. 191-236) (Duffy P.A., Flint O.P.: In vitro dermal irritancy teste. In C.K. Atterwill e C.E. Steele (Eds): In vitro methods in Toxicology, Cambridge Univ. Press Cambridge 1987, pp. 279-297) (Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion e cutaneous irritancy, Roguet, Cell Biology e Toxicology, 1999:15, 63-75).
[070] A etapa (b) de análise do efeito do produto será preferência uma comparação de pelo menos um parâmetro medido no equivalente de couro cabeludo colocado em contato com o produto em teste com o ou os medidos em um equivalente de couro cabeludo de controle cultivado nas mesmas condições, mas que não recebeu o produto em teste.
[071] A etapa (c) de seleção do produto que modifica parâmetro
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16/26 do equivalente de couro cabeludo será realizada em função de um critério determinado antecipadamente.
[072] A modificação desse parâmetro pode ser uma estimulação, uma diminuição ou de uma inibição total ou parcial da expressão, produção e/ou atividade dos referidos marcadores e/ou do crescimento da haste do cabelo e/ou da descamação do equivalente de couro cabeludo.
[073] O critério para escolher o referido produto será, por exemplo, tal que esse produto tenha um efeito estimulante ou inibidor sobre o parâmetro medido.
[074] O equivalente de couro cabeludo de acordo com a presente invenção pode também ser usado em processos de rastreamento automatizados para compostos cosméticos, farmacêuticos ou dermatológicos para identificar novos agente ativos.
[075] A Figura 1 ilustra a presente invenção mais claramente sem, entretanto, limitar seu alcance.
[076] Nessa figura, as fotografias mostram fatias de pele reconstruída (equivalente de pele) (A), de equivalente de couro cabeludo de acordo com a presente invenção (B) e de uma amostra de couro cabeludo (C) após imunorrotulagem usando anticorpo anti-involucrina (I) e anticorpo anti-K10 (II).
[077] Os exemplos dados a seguir são apresentados como ilustrações não limitativas da presente invenção.
Exemplo 1
Preparação De Um Modelo De Couro Cabeludo [078] Queratinócitos e fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo são isolados de amostras de couro cabeludos recuperada durante um “facelift” (e, portanto, obtidos em mulheres relativamente maduras) ou de amostras de couro cabeludo obtidas em homens relativamente jovens.
[079] Para isolar essas células de couro cabeludo, uma depilação
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17/26 capilar é realizada de forma a remover os queratinócitos da bainha epitelial externa, e a derme é então separada da epiderme a fim de extrair as duas populações celulares alvo, isto é, os fibroblastos e queratinócitos interfoliculares.
Protocolo Experimental [080] Salvo indicação contrária, todos os meios e tampões usados nos exemplos estão descritos em Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau e Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et al., 1987, (Modelos in dermato., vol. III, Ed. Lowe e Maibach, 1-7).
[081] O meio MEM + 10% FCS + 3F (conhecido como meio 3F) possui a seguinte composição:
Reagente Marca Volume
MEM Biochrom KG 500 ml
L-Glutamina 200 mM Gibco 5 ml
Piruvato de Sódio 100 mM Biochrom KG 5 ml
NEA Biochrom KG 5 ml
FCS Biochrom KG 50 ml
Penicilina-estreptomicina Biochrom KG 1 ml
Antibiótico-antimicótico Gibco 0,5 ml
EGF 10 pg/ml TEBU 0,5 ml
Toxina da Cólera 10-5 M Sigma 5 pl
Hidrocortisona 0,5 mg/ml Sigma 0,4 ml
- Colocar as peças da parte Superior em uma placa de cultura com 100 mm de diâmetro que contém 30-40 ml de dispase (Roche) e armazenar durante a noite (aproximadamente 15 horas) a 4°C ou armazenar durante 1 hora 30 minutos a 37°C em um incubador a seco, tomando o cuidado de cortar pedaços pequenos.
1. Preparação Da Cultura Primária De Queratinócitos Humanos Normais
- Remover as amostras do banho de dispase e colocá-las em uma
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18/26 placa de cultura (100 mm de diâmetro) que contém 10 ml de tripsina-EDTA (0,05%-0,02%).
- Realizar a separação da derme da epiderme usando uma pinça curva e raspar suavemente a superfície da derme com as costas da pinça de forma a recuperar os queratinócitos basais.
- Colocar a epiderme em um tubo cônico (50 ml) com as 10 ml de tripsina-EDTA da placa.
- Enxaguar a placa com 5 ml de tripsina-EDTA.
- Filtrar em gaze estéril.
- Neutralizar com 20 ml de soro fetal de bezerro puro (FCS).
- Colocar a suspensão em um tubo cônico de 50 ml.
- Centrifugar a suspensão celular durante 10 minutos a 1200 rpm.
- Remover o sobrenadante, recuperar o sedimento com MEM 10% FCS + 7F (esse meio compreende os mesmos compostos que o meio 3F e quatro compostos adicionais: adenina, transferrina, T3, insulina).
- Contar as células viáveis.
- Semear as placas de cultura com 10 000 células vivas /cm2.
- 24 horas mais tarde, realizar uma cocultura padrão adicionado o 3T3 (12 000 células/cm2) tratado com mitomicina C (Ametycine®) sem trocar o meio.
2. Protocolo Para Isolar As Células Dérmicas:
a) Preparar uma solução que compreende 0,1% de glicose, 0,8% de NaCl e 0,04% de KCl.
- Adicionar colagenase a 0,1 % (Worthington).
- Filtrar a solução com um filtro Millipore ou Nalgene 0,22 pm.
b) Colocar a derme na forma de pequenos pedaços com um comprimento lateral de aproximadamente 2 mm, 20 ml da solução de colagenase e uma barra estéril em um beaker de 50 ml.
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19/26
- Agitar a 37°C sob 5% CO2 durante 1 hora e 30 minutos.
- Filtrar a suspensão obtida através de uma gaze estéril de espessura dupla.
- Centrifugar a suspensão filtrada nas condições usuais para centrifugação celular.
c) Ressuspender o sedimento em meio fresco de cultura, contar as células e semear as placas.
3. Preparação Das Redes:
[082] Se o experimento a ser realizado compreender mais de 25 redes, todos os volumes acima precisam ser dobrados.
Mem 1.76x
17,6 ml de MEM 10X
5,1 ml de NaHCO3 7,5%
0,88 ml de L-Glutamina (1,76 mM)
0,88 ml de piruvato de sódio (0,88 mM)
0,88 ml de aminoácidos não essenciais 0,88 X (Ref.: K 0293 Fornecedor: Biochrom KG)
0,088 ml de penicilina estreptomicina 8.8 U/8.8 pg/ml (0,088%) (Ref.: A2212 - Fornecedor: Biochrom KG)
0,044 ml de antimicótico antibiótico 0,04 X (0,04%) ml de água ultrapura estéril
Mem Hepes 10% Fcs ml de MEM 25 mM HEPES
0,5 ml de L-Glutamina (2 mM)
0,5 ml de piruvato de sódio (1 mM)
0,5 ml de aminoácidos não essenciais 1 X
0,1 ml de penicilina estreptomicina 20 U/20 pg/ml (0,2%)
0,05 ml de antimicótico antibiótico 0,1 X (0,1%)
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20/26 ml de FCS 10%.
Naoh 0,1N ml NaOH 1N ml de água ultrapura estéril [083] Essa solução é passada através de um filtro Millipore com uma membrana GV Durapore 0,22 pm.
Ácido Acético 1/1000
0,5 ml de 100% glacial ácido acético
499,5 ml de água ultrapura estéril [084] Usando os meios assim preparados:
[085] Preparar em um frasco cônico estéril 5 ml da seguinte solução:
3,22 ml de MEM 1,76 X
0,63 ml de FCS
0,35 ml de NaOH 0,1N
0,6 ml de ácido acético 1/1000
0,2 ml de MEM HEPES 10% FCS.
[086] Adicionar 0,5 ml de suspensão celular de fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo a essa solução.
[087] Em seguida, adicionar lentamente o volume necessário de colágeno frio (2,1 ml se esse colágeno for colágeno Gattefossé ou Symatèse ou 1,5 ml se for colágeno Coletica).
[088] Agitar vigorosamente o frasco cônico até homogeneização (a solução rosa-fúcsia adquire uma coloração salmão).
[089] Esvaziar o conteúdo do frasco cônico em 60 mm de placa bacteriana Falcon0.
[090] Colocar a placa no forno (37°C - 5% CO2) durante aproximadamente 1 hora 30 minutos - 2 horas.
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21/26 [091] Quando o gel tiver endurecido e o meio tiver sido expelido, verificar o início de contração.
[092] Durante a tarde, agitar as redes regularmente de modo que eles não fiquem colados novamente.
[093] Deixar a contração continuar durante 3 dias.
4. Semeadura Da Cultura- Com Queratinócitos [094] A semeadura com queratinócitos é realizada após 3 dias de contração das redes.
A) Preparação Do Adesivo
- Preparar 0,7 ml da solução a seguir, dada para colar duas redes:
0,46 ml de MEM 1.76 X
0,09 ml de FCS
0,05 ml de NaOH 0,1N
0,1 ml de MEM HEPES 10% FCS.
[095] Adicionar a esse tubo 0,3 ml de colágeno dialisado. O volume final é, assim, 1 ml.
Comentários:
[096] Os volumes acima são dados para colar as duas redes.
[097] Para diversas redes, preparar uma solução global que corresponde a n+1 amostras a ser coladas em um frasco cônico.
[098] Distribuir, pelo tubo, 0,7 ml dessa solução usando uma multipipeta.
[099] Em seguida, adicionar 0,3 ml por tubo de colágeno.
[100] Trabalhar as redes duas a duas.
B) Colagem Da Rede [101] Pegar um tubo enchido com 6 ml solução adesiva.
[102] Agitar com um misturador vórtex.
[103] Aspirar a solução com uma pipeta e colocar em duas placas
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22/26 de cultura Corning uma gota de aproximadamente 0,45 ml dessa solução no meio de cada placa.
[104] Erguer a rede usando uma pinça curva e um cell lifter (espátula) [105] Colocar a rede na tampa de sua placa original a fim de remover o meio excedente.
[106] Erguer a rede e colocá-la na gota de adesivo.
[107] Espalhar uniformemente girando a placa de forma que o adesivo seja distribuído em torno da rede.
[108] Colocar as placas em um forno (37°C - 5% CO2) durante 20- minutos para permitir que o adesivo endureça.
C) Semear Com Queratinócitos
- Descongelar as células tão rapidamente quanto possível agitando o frasco em um banho de água a 37°C, se essas células estiverem congeladas.
- Transferir o conteúdo do frasco para um tubo de cultura Falcon de ml que contém 35 ml de MEM 10% FCS + de meio 3F.
- Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm.
- Remover o sobrenadante.
- Aspirar o sedimento de centrifugação com MEM 10% FCS + 3F meio para obter uma solução que contém 100 000 células/ml.
[109] Ressuspender as células várias vezes por succão-ejeção.
[110] Colocar um anel de semeadura de 14 mm em diâmetro nas redes coladas.
[111] Nesse anel, colocar 0,5 ml de suspensão celular (= 50 000 células/anel 1.5 cm2, isto é, aproximadamente 33 000 células por cm2).
[112] Em torno do anel, adicionar 5 a 7 ml de MEM 10% FCS + 3F meio suavemente de modo a não destacar a rede.
- paralelamente, semear dois anéis de controle (placa com anéis
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23/26 que não contém a rede).
- Colocar a placa em um forno a 37°C - 5% CO2 durante 2 horas.
- Remover os anéis usando uma pinça curva após 2 horas de acoplamento.
- Colocar novamente as placas no forno a 37°C - 5% CO2.
- Trocar o meio na quarta e na sexta (5 a 7 ml de MEM 10%FCS + 3F meio por placa).
Cultura-Emersão De Peles Reconstruídas [113] Após sete dias de cultura em imersão, as peles são colocadas em emersão.
[114] Verificar, entretanto, se os queratinócitos emergem da rede observando com um microscópio.
[115] Colocar uma grade de emersão em uma placa bacteriana Falcon.
[116] Adicionar 5 ml de MEM 10% FCS + 3 F tomando o cuidado de evitar a formação de bolhas.
[117] Cortar o adesivo em torno da pele a ser emersa usando um bisturi estéril.
[118] Transferir a pele para a grade com uma pinça curva e um cell lifter.
[119] Colocar as placas no forno a 37°C - 5% CO2.
[120] Trocar o meio na quarta e na sexta (7 a 7,5 ml de MEM 10%FCS + meio 3F).
[121] Após sete dias de emersão, as peles do couro cabeludo reconstruído estão prontas para ser usadas.
Exemplo 2
Comparação Da Expressão De Involucrina E De Queratina K10 [122] A expressão de involucrina e de queratina K10 no
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24/26 equivalente de couro cabeludo obtido no Exemplo 1 é observada após imunorrotulagem usando anticorpos monoclonais de camundongo dirigidos contra a involucrina ou contra K10. Essa expressão é também observada em um equivalente de pele padrão e em uma amostra de couro cabeludo.
Preparação Do Equivalente De Pele Padrão E Da Amostra De Couro Cabeludo:
[123] Para preparar um equivalente dérmico padrão, 3,22 ml de MEM 1.76 X meio, 0,63 ml de soro fetal de bezerro, 0,35 ml de hidróxido de sódio 0,1 N e 0,20 ml de uma mistura de meio MEM/HEPES contendo 10% de soro fetal de bezerro (MEM/HEPES/FCS10) são colocados em um tubo Falcon estéril.
[124] 0,50 ml de meio MEM/HEPES/FCS10 contendo fibroblastos obtidos de cirurgias mamárias humanas preparados previamente de acordo com o método descrito por Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau e Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111,219-222) ou Asselineau et al., 1987, (Modelos in dermato., vol. III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7), é então adicionado a uma concentração de 1x106 células por 0,5 ml de meio de cultura.
[125] 2 ml de uma mistura volume/volume de colágeno a uma concentração de 3 mg/ml em ácido acético a 1/1000 são então adicionados lentamente, ao longo da parede do tubo de modo a observar o aspecto de uma nuvem esbranquiçada. O todo é então misturado cuidadosamente e colocado em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro (tipo Falcon 60 mm, ref. 1016). A placa de Petri é então colocada em um forno a 37°C e deixada por aproximadamente 2 horas e 30 minutos. Quando o aspecto das duas fases (gel + meio) é observado, a rede é cuidadosamente destacada de seu suporte, e a rede assim destacada de seu suporte é deixada durante 4 dias em um forno [126] Para preparar um equivalente de pele padrão, o equivalente dérmico padrão é espalhado em uma placa de cultura de tipo Corning 60 mm de diâmetro em uma gota de colágeno adesivo (0,6 ml) e depois mantido 37°C em
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25/26 um forno por 20-30 minutos.
[127] Um anel de aço estéril é colocado sobre a rede e 0,5 ml de uma suspensão celular de queratinócitos humanos obtidos de cirurgias mamárias preparados de acordo com Régnier et al. (Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35, Karger, Basle 1981), a uma taxa de 100 000 células/ml in MEM 10% FCS + meio 3F são colocados no interior do anel.
[128] Aproximadamente 6 ml de meio (MEM 10% FCS + 3F) são colocados em torno do anel e a placa é preparada em um forno a 37°C durante 2 horas. O anel é então removido e a placa é recolocada no forno.
[129] Após oito dias, a cultura é então colocada na interface ar/líquido, e o referido líquido consiste, então, do mesmo meio que acima.
[130] A cultura continua a ser realizada por 1 semana até que um equivalente dérmico histologicamente satisfatório seja obtido, isto é, um equivalente dérmico que possui as quatro camadas celulares padrão, isto é, as camadas basal, suprabasal, granular e córnea.
[131] A amostra de couro cabeludo é recuperada após “lifting” de acordo com os métodos conhecidos do técnico no assunto.
Medida Da Expressão De Involucrina E De Queratina K10 [132] Após congelamento, os vários tecidos são cortados em fatias de 5 μm de espessura por meio de um criostato.
[133] As fatias são então enxaguadas duas vezes com PBS e 25 μl de anticorpo anti-involucrina (Sigma - Ref.: I9018) e anticorpo anti K10 (Immuquest Ltd -Ref. AE20) diluídos a 1/50 são colocados em cada fatia e deixados por 30 minutos à temperatura ambiente (25°C). As fatias são então enxaguadas duas vezes com PBS e 25 μl de FITC anticorpo conjugado (Coelho anticamundongo FITC, Dako F232), são depositados em cada fatia e deixados por 30 minutos à temperatura ambiente (25°C). As fatias são enxaguadas duas vezes com PBS e observadas após montagem sob um microscópio de
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26/26 fluorescência da marca Leica, modelo Leitz DMRB.
[134] A observação mostra que no controle (pele reconstruída), involucrina (figura 1, I) e queratina K10 (figura 1, II) estão expressas em todas as camadas suprabasais da epiderme reconstruída (figura 1, A), ao passo que estão expressas tardiamente, isto é, apenas nas camadas granulares, da epiderme dos equivalentes de couro cabeludo (figura 1, B) e das amostras de couro cabeludos (figura 1, C).
[135] A expressão desses dois marcadores ocorre precocemente na pele reconstruída (A) e tardiamente no couro cabeludo reconstruído (B) e na amostra de couro cabeludo (C) no local indicado pelas setas na figura 1.
[136] Esses resultados permitem confirmar que couro cabeludo reconstruído de acordo com a presente invenção é semelhante à estrutura e à funcionalidade de um couro cabeludo in vivo.

Claims (8)

  1. Reivindicações
    1. PROCESSO PARA PREPARAR UM EQUIVALENTE DE COURO CABELUDO, caracterizado por queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo serem semeados e cultivados em um equivalente dérmico, o dito equivalente dérmico compreendendo colágeno e fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo, o dito processo compreendendo a etapa de obter os ditos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo a partir de uma amostra do couro cabeludo, e remover previamente os queratinócitos da bainha epitelial externa.
  2. 2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo equivalente dérmico ser uma rede de colágeno contraída e em que a semeadura com queratinócitos ser realizada após 2 a 5 dias de contração da dita rede.
  3. 3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelos ditos fibroblastos e queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo serem isolados, respectivamente, a partir da derme e epiderme obtidas a partir de uma amostra de couro cabeludo.
  4. 4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo serem obtidos por meio das seguintes etapas:
    - separação da derme do couro cabeludo a partir da epiderme por tratamento proteolítico de uma amostra de couro cabeludo,
    - recuperação da epiderme do couro cabeludo,
    - colocação da epiderme do couro cabeludo assim obtida, em contato com tripsina,
    - recuperação dos queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo e
    - cultura dos queratinócitos assim obtidos.
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    2/2
  5. 5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela cultura de queratinócitos ser uma co-cultura com fibroblastos tratados previamente com mitomicina ou irradiados ou uma cultura em um meio de cultura suplementado com fibroconectina ou com colágeno.
  6. 6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo serem obtidos por meio das seguintes etapas:
    - separação da derme do couro cabeludo a partir da epiderme por tratamento proteolítico de uma amostra de couro cabeludo,
    - recuperação da derme do couro cabeludo,
    - colocação da derme do couro cabeludo assim obtida, em contato com colagenase e/ou tripsina,
    - recuperação dos fibroblastos interfoliculares do couro cabeludo e
    - cultura dos fibroblastos assim obtidos.
  7. 7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo equivalente dérmico contraído semeado com os queratinócitos interfoliculares do couro cabeludo ser cultivado durante 5 a 7 dias por imersão em um meio de cultura seguido por imersão durante 5 a 7 dias em um suporte adequado.
  8. 8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender uma etapa em que fibroblastos capilares escolhidos a partir dos fibroblastos da papila dérmica e/ou fibroblastos da bainha conjuntiva, e/ou papila dérmica inteira e/ou bainhas conjuntivas e/ou frações de bainhas conjuntivas serem implantados no dito equivalente dérmico que foi contraído ou que está em processo de contração.
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