JP2014518099A - 再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法 - Google Patents
再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
- 頭皮の表皮は、その細胞の再生がより速いため、より厚く、
- 頭皮の角質層はより厚いが、整然としておらず、
- 頭皮の毛包はより多く存在するため(毛包約200〜300個/cm2)、その活動がより活発であり、
- 頭皮の皮脂腺の産生力は強く、頭皮の汗腺の活動度は高く、そこにかなりの細菌および真菌のコロニー形成が可能になる。
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、とりわけ頭皮試料をディスパーゼまたはテルモリシンに接触させることによって頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 頭皮表皮を回収するステップ、
- このようにして得られた頭皮表皮をトリプシンに接触させるステップ、
- 毛包間頭皮ケラチノサイトを回収するステップ、および
- このようにして得られたケラチノサイトを培養するステップ。
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、特に頭皮試料をディスパーゼまたはテルモリシンに接触させることによって、頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 頭皮真皮を回収するステップ、
- このようにして得られた頭皮真皮をコラゲナーゼおよび/またはトリプシンに接触させるステップ、
- 毛包間頭皮線維芽細胞を回収するステップ、および
- このようにして得られた線維芽細胞を培養するステップ。
a-培養培地中に浸漬した担体上に置いたコラーゲン格子に毛包間頭皮ケラチノサイトを播種するステップ、
b-前記コラーゲン格子の表面で毛包間頭皮ケラチノサイトを増殖させるステップ、
c-生成中に培養培地が表皮同等物の上表面を覆わないように、前記担体を上げるステップ。
a)たとえば、動物またはヒトの組織片を播種した栄養培地で生成した単層培養物から回収した収縮性細胞と、
b)真皮の細胞外マトリックスの成分、特にコラーゲンを補充した栄養培地と
の前記混合物が収縮したゲルを形成し、栄養培地を除去して真皮同等物および特に収縮したコラーゲン格子を形成するステップ。
- 細胞毒性、
- 炎症メディエーターの放出、
- 組織構造によって、または乳酸デヒドロゲナーゼの放出(ケラチノサイト膜統合のマーカー)によって明らかにされる細胞傷害(Roguetら、J. Tox. In vitro 6:303[1992年]およびPonec M著In Vitro Toxicology、Rougier、MaibachおよびGolberg編、107頁、1994年)、
- 皮膚脂質、特にセラミドおよびリン脂質の合成および組成の変更(JID86、598[1986年])、
- 上皮細胞の分化のマーカーとしての層形成(M. PrunierasおよびR. Roguet、Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications、M.Adolphe、A.GuillouzoおよびF.Marano編、INSERM発行、1995年、191〜236頁)(Duffy P.A.、Flint O.P.、In vitro dermal irritancy test、掲載はC.K. AtterwillおよびC.E.Steele[編]、In vitro methods in Toxicology、Cambridge Univ. Press Cambridge、1987年、279〜297頁)(Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy、Roguet、Cell Biology and Toxicology、1999年、15、63〜75頁)。
- 頭皮モデルの調製
毛包間頭皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞を、顔の除皺術中に採取した(したがって比較的熟年の女性から得られる)頭皮試料から、または比較的若い男性から得られる頭皮試料から単離する。
他に指示がない限り、実施例において使用するすべての培地および緩衝液は、Bellら、1979年(P.N.A.S. USA、76、1274〜1278頁)、AsselineauおよびPrunieras、1984年(British J. of Derm.、111、219〜222頁)またはAsselineauら、1987年(Models in dermato.、III巻、LoweおよびMaibach編、1〜7頁)に記載されているものである。
- ディスパーゼ槽から試料を取り出し、これを、10mlのトリプシン-EDTA(0.05%〜0.02%)を含有する培養皿(直径100mm)に入れる。
- カーブしたピンセットを使用して真皮を表皮から分離し、ピンセットの背部で真皮の表面を丁寧にこすり落として、基底層のケラチノサイトを回収する。
- 皿から、表皮を、10mlのトリプシン-EDTAとともにコニカルチューブ(50ml)に入れる。
- 5mlのトリプシン-EDTAで皿をすすぐ。
- 滅菌ガーゼで濾過する。
- 20mlの純粋なウシ胎仔血清(FCS)で中和する。
- 懸濁液を50mlコニカルチューブに入れる。
- 細胞懸濁液を10分間1200rpmで遠心分離する。
- 上澄みを除去し、MEM10%FCS+7F(この培地は、3F培地と同一の化合物および4種の追加の化合物、すなわちアデニン、トランスフェリン、T3、インスリンを含む)に沈殿物を採る。
- 生存細胞を計数する。
- 培養皿に生細胞10000個/cm2を播種する。
- 24時間後、培地を変更せず、マイトマイシンC(Ametycine(登録商標))で処理した3T3(細胞12000個/cm2)を添加することによって標準的な共培養を実施する。
a)0.1%グルコース、0.8%NaClおよび0.04%KClを含む溶液を調製する。
- コラゲナーゼを0.1%まで添加する(Worthington)。
- 溶液をMilliporeまたはNalgene0.22μmフィルターで濾過する。
- 37℃、5%CO2下で1時間30分攪拌する。
- 得られた懸濁液を、厚みを倍にした滅菌ガーゼで濾過する。
- 濾過した懸濁液を、細胞遠心分離の通例の条件下で遠心分離する。
実施すべき実験が25を超える格子を含む場合、上記のすべての体積を2倍にしなければならない。
17.6mlのMEM 10X
5.1mlのNaHCO3 7.5%
0.88mlのL-グルタミン(1.76mM)
0.88mlのピルビン酸ナトリウム(0.88mM)
0.88mlの非必須アミノ酸0.88X(照会番号:K0293-供給業者:Biochrom KG)
0.088mlのペニシリンストレプトマイシン8.8U/8.8μg/ml(0.088%)(照会番号.:A2212-供給業者:Biochrom KG)
0.044mlの抗真菌抗生物質0.04X(0.04%)
75mlの滅菌超純水
50mlのMEM 25mM HEPES
0.5mlのL-グルタミン(2mM)
0.5mlのピルビン酸ナトリウム(1mM)
0.5mlの非必須アミノ酸1X
0.1mlのペニシリンストレプトマイシン20U/20μg/ml(0.2%)
0.05mlの抗真菌抗生物質0.1X(0.1%)
5mlのFCS10%。
10ml NaOH 1N
90mlの滅菌超純水
0.5mlの100%氷酢酸
499.5mlの滅菌超純水
- 滅菌コニカルフラスコ中に次の溶液5mlを調製する。
3.22mlのMEM 1.76X
0.63mlのFCS
0.35mlのNaOH 0.1N
0.6mlの酢酸1/1000
0.2mlのMEM HEPES 10% FCS。
- 0.5mlの毛包間頭皮線維芽細胞の細胞懸濁液をこの溶液に添加する。
- 次に、必要な体積の冷たいコラーゲン(このコラーゲンがGattefosseまたはSymateseのコラーゲンの場合2.1ml、またはColeticaのコラーゲンの場合1.5ml)をゆっくりと添加する。
- コニカルフラスコを、均質化する(フクシャピンクの溶液がサーモン色に変わる)まで激しく振盪する。
- コニカルフラスコの内容物を60mmのFalconφ
- 皿を乾燥器(37℃-5%CO2)に入れ、約1時間30分〜2時間置く。
- ゲルが凝固すれば、培地を除去し、収縮の開始を確認する。
- 午後に、格子を規則的に振盪し、再度くっつき合わないようにする。
- 収縮が進展するように3日間放置する。
ケラチノサイトの播種を格子の収縮の3日後に実施する。
- 2つの格子を接着するために付与される、次の溶液0.7mlを調製する。
0.46mlのMEM 1.76X
0.09mlのFCS
0.05mlのNaOH 0.1N
0.1mlのMEM HEPES 10% FCS。
- このチューブに0.3mlの透析コラーゲンを添加する。したがって最終体積は1mlになる。
- 上記の体積を、2つの格子を接着するために付与する。
- いくつかの格子については、接着されるべきn+1の試料に対応する全体的な溶液をコニカルフラスコ中に調製する。
- マルチピペットを使用して、この溶液0.7mlをチューブごとに分注する。
- 次に、チューブ1つにつき0.3mlのコラーゲンを添加する。
- 格子を2つずつ処理する。
- 接着剤溶液を充填した6mlチューブを取る。
- ボルテックスミキサーで攪拌する。
- ピペットで溶液を取り出し、溶液約0.45mlの液滴を、Corningの培養皿2つの各々の中央に載せる。
- カーブしたピンセットおよび細胞リフターを使用して、格子を取り上げる。
- 格子を元の皿の蓋の中に入れて、過剰な培地を除去する。
- 格子を取り上げ、これを接着剤の液滴に載せる。
- 接着剤が格子の周囲に配分されるように、皿を回転させて均一に広げる。
- 皿を乾燥器(37℃-5%CO2)に入れ、20〜30分間置いて接着剤を凝固させる。
- 細胞が凍結している場合、37℃の水浴中でバイアルを攪拌することによって、可能な限り速やかにこの細胞を解凍する。
- バイアルの内容物を、35mlのMEM 10% FCS+3F培地を含有する50mlのFalconの培養チューブ中に移す。
- 5分間1000rpmで遠心分離する。
- 上澄みを除去する。
- 遠心分離による沈殿物をMEM 10% FCS+3F培地に採って、細胞100000個/mlを含有する溶液を得る。
- 数回吸引-吐出することによって細胞を再懸濁する。
- 直径14mmの播種リングを、接着した格子に載せる。
- このリングの中に、0.5mlの細胞懸濁液(=細胞50000個/リング1.5cm2、すなわちcm2当たり約33000細胞)を入れる。
- リングの周囲に、5〜7mlのMEM 10% FCS+3F培地を、格子を分離しないように静かに添加する。
- 同時に、2つの「対照リング」(リングを入れてあるが格子を含有しない皿)に播種する。
- 皿を37℃-5%CO2の乾燥器に入れ、2時間置く。
- リングを、取り付けの2時間後に、カーブしたピンセットを使用して取り外す。
- 皿を37℃-5%CO2の乾燥器に戻す。
- 培地を水曜日および金曜日に交換する(1つの皿につき5〜7mlのMEM 10%FCS+3F培地)。
7日間浸漬して培養した後、皮膚を培地の上に出して置く。
- 培地の上に出すためのグリルをFalconの細菌皿に入れる。
- 泡の形成を避けるように注意しながら7.5mlのMEM 10% FCS+3Fを添加する。
- 滅菌メスを使用して、培地の上に出すべき皮膚の周囲の接着剤を切除する。
- カーブしたピンセットおよび細胞リフターで、皮膚をグリルの上に移す。
- 皿を37℃-5%CO2の乾燥器に入れる。
- 培地を水曜日および金曜日に交換する(7〜7.5mlのMEM 10%FCS+3F培地)。
インボルクリンおよびケラチンK10の発現の比較
実施例1で得られた頭皮同等物におけるインボルクリンおよびケラチンK10の発現は、インボルクリンまたはK10に対するマウスモノクローナル抗体を使用して免疫標識した後に観察される。この発現は、標準的な皮膚同等物および頭皮試料においても観察される。
標準的な真皮同等物を調製するために、3.22mlのMEM 1.76X培地、0.63mlのウシ胎仔血清、0.35mlの0.1N水酸化ナトリウムおよび10%ウシ胎仔血清を含有する0.20mlのMEM/HEPES培地の混合物(MEM/HEPES/FCS10)を、Falconの滅菌チューブに入れる。
凍結した後、種々の組織を、クライオスタットを使用して厚さ5μmの切片に切り分ける。
Claims (16)
- 毛包間頭皮ケラチノサイトが、コラーゲンおよび毛包間頭皮線維芽細胞を含む真皮同等物上で、播種および培養されることを特徴とする、頭皮同等物の調製方法。
- 前記真皮同等物が、収縮したコラーゲン格子であり、ケラチノサイトの前記播種が前記格子の収縮の2〜5日後に実施されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記毛包間頭皮線維芽細胞およびケラチノサイトが、頭皮試料から得られる真皮および表皮からそれぞれ単離されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記毛包間頭皮ケラチノサイトが、外上皮の鞘のケラチノサイトが事前に除去されている頭皮試料から得られることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記毛包間頭皮ケラチノサイトが、次のステップ:
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、前記頭皮真皮を前記表皮から分離するステップ、
- 前記頭皮表皮を回収するステップ、
- このようにして得られた前記頭皮表皮をトリプシンに接触させるステップ、
- 前記毛包間頭皮ケラチノサイトを回収するステップ、および
- このようにして得られた前記ケラチノサイトを培養するステップ
によって得られることを特徴とする、請求項3または4に記載の方法。 - 前記ケラチノサイトの培養が、事前にマイトマイシンで処理したか、もしくは照射した線維芽細胞との共培養である、またはフィブロネクチンもしくはコラーゲンを補充した培養培地での培養であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記毛包間頭皮線維芽細胞が、次のステップ:
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、前記頭皮真皮を前記表皮から分離するステップ、
- 前記頭皮真皮を回収するステップ、
- このようにして得られた前記頭皮真皮をコラゲナーゼおよび/またはトリプシンに接触させるステップ、
- 前記毛包間頭皮線維芽細胞を回収するステップ、および
- このようにして得られた前記線維芽細胞を培養するステップ
によって得られることを特徴とする、請求項3に記載の方法。 - 前記毛包間頭皮ケラチノサイトを播種した前記収縮した真皮同等物が、培養培地中に浸漬して5〜7日間、次いで好適な担体上で培地の上に出して5〜7日間培養されることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 真皮乳頭の線維芽細胞および/もしくは結合組織鞘の線維芽細胞、ならびに/または真皮乳頭全体および/もしくは結合組織鞘および/もしくは結合組織鞘の部分から選択される毛の線維芽細胞が、収縮したまたは収縮途中の前記真皮同等物の中に移植されるステップを含むことを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- インボルクリンおよび/またはケラチンK10を顆粒層の中に発現することを特徴とする頭皮同等物。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の方法によって得られる頭皮同等物。
- インボルクリンおよび/またはケラチンK10を顆粒層の中に発現することを特徴とする、請求項11に記載の頭皮同等物。
- 頭皮皮膚障害の処置において使用するための、請求項10から12のいずれか一項に記載の頭皮同等物。
- 前記皮膚障害が頭皮熱傷であることを特徴とする、請求項13に記載の使用するための頭皮同等物。
- 頭皮での化合物の皮膚浸透性および/もしくは吸収性ならびに/またはバイオアベイラビリティならびに/または有効性を試験するための、請求項10から12のいずれか一項に記載の頭皮同等物の使用。
- 新規な活性剤を特定するための生成物スクリーニング方法であって、前記試験生成物を請求項10から12のいずれか一項に記載の頭皮同等物に接触させるステップ(a)と、次いで前記頭皮同等物の少なくとも1つのパラメーターについて前記生成物の効果を分析するステップ(b)と、前記パラメーターを変更する生成物を選択するステップ(c)とを含む、方法。
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