KR20140036271A

KR20140036271A - 재현된 두피 모델 및 활성 분자 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20140036271A
Application number: KR1020137034775A
Authority: KR
Inventors: 칼리드 바카르
Original assignee: 로레알
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2014-03-25
Also published as: EP2714893A1; FR2976001A1; JP2014518099A; CN103764816B; JP6144672B2; BR112013030828B1; ES2710577T3; US20140199721A1; CN103764816A; FR2976001B1; US10281457B2; JP2017113030A; JP6839003B2; BR112013030828A2; EP2714893B1; KR101974672B1; WO2012163974A1

Abstract

본 발명은 재현된 두피 모델, 그것의 제조 방법 및 미용, 약학적 또는 피부과용 국소 제품의 효과를 평가하기 위한 그것의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재현된 두피는 또한 피부 두피 장애의 치료를 위한 이식편의 제조에 사용될 수 있다.

Description

재현된 두피 모델 및 활성 분자 스크리닝 방법 {RECONSTRUCTED SCALP MODEL AND PROCESS FOR SCREENING ACTIVE MOLECULES}

본 발명은 재현된 두피 모델, 그것의 제조 방법 및 미용, 약학적 또는 피부과용 국소 제품의 효과를 평가하기 위한 그것의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 재현된 두피는 또한 포유류, 더욱 특히 인간 환자 예컨대 3 도 화상을 입은 자에게 이식하기 위한 이식편의 제조에 사용될 수 있다.

인간 피부와 다소 유사한 재현된 피부 모델이 최근 몇 년간 개발되어 왔다. 언급될 수 있는 재현된 피부 모델의 예는 하기 문헌들에 기재된 모델들을 포함한다: EP 0 285 471, EP 0 285 474, EP 0 418 035, WO 90/02796, WO 91/16010, EP 0 197 090, EP 0 020 753, FR 2 665 175, FR 2 689 904. 이들 모델은 첫째로 역학 분야 및 생리학 분야 둘다에서 피부의 역할을 더 잘 이해하는데 필수적인 연구를 수행할 수 있게 해주고, 둘째로 미용 및/또는 약학적 활성제의 활성 또는 국소 성분의 부작용의 예측 시험을 구성한다.

출원인은 이들 모델이 인체의 피부에 관한 연구에는 적합하지만, 특정 피부, 두피에 관한 연구에는 이상적이지 않음을 관찰했다. 출원인이 아는 바로는, 재현된 두피 모델은 지금까지 제안된 적이 없다.

두피는 모발 아래, 즉 두개골 위에 위치하는 피부의 일부이다. 성체에서, 두피의 면적은 650 ~ 700 ㎠ 범위일 수 있다. 두피는 평범한 구조를 갖지만, 그것을 인체의 다른 부분의 피부와 구별시키는 하기 여러 중요한 특색들을 갖는다:

- 세포의 더욱 신속한 재생으로 인해, 두피의 표피가 더 두껍다,

- 두피의 각질층 (stratum corneum) 이 더 두껍지만 무질서하다,

- 더 많은 존재로 인해 (약 200 ~ 300 모낭/㎠), 두피의 모낭의 활성이 더 크다,

- 두피의 피지샘의 생산이 강렬하고, 두피의 땀샘의 활성이 높으며, 이는 상당한 세균 및 진균 콜로니화를 허용한다.

일반적으로, 위에 언급된 문헌들에 기재된 재현된 피부 모델은 진피 유두 또는 결합 초의 섬유모세포 및/또는 외상피 초 (또한 외근초 (Outer Root Sheath) 에 대한 ORS 로서 알려짐) 로부터 취해진 세포로부터 제조되는데, 이는 이들 세포의 생산이 용이하기 때문이다. 구체적으로, 이들 세포는 모발이 당겨졌을 때 제거되고, 지지체, 통상적으로 진피 대체물 상에 배치되고, 적합한 배양 배지에서 배양될 때 표피를 제조하는 능력이 있다. 그러나, 진피 유두 세포를 배양함으로써 수득되는 조직은 거대분자 (특히 콜라겐) 의 발현을 보이는데, 이는 생체 내 두피의 경우와 일치하지 않는다. 또한 ORS 세포를 배양함으로써 수득되는 조직은 두피의 특징을 갖지 않는다. 게다가, 생체 내 두피에서 발생하는 정상적 낙설 현상이 관찰되지 않을 것인데, 그 이유는 ORS 세포는 공기와 접촉된 적이 없으면 낙설하지 않기 때문이다. 그러므로 이와 같이 수득된 모델은 시험관 내에서 비듬의 출현을 재현하는데 사용될 수 없다. 마지막으로, 이들 다양한 세포를 사용하여 수득된 표피 및 진피의 크기 및 형태는 두피의 표피 및 진피의 크기 및 형태와 동일하지 않을 것이다: 두피의 경우에, 피부의 경우보다 진피가 더 두껍고 더 함입되어 있다.

놀랍게도 출원인은 모낭간 두피 세포의 배양으로 생체 내 두피의 특성을 대부분 갖는 재현된 두피 모델을 개발할 수 있음을 입증했다.

이러한 두피 모델의 하나의 특징은, 마지막 초기저층 내, 즉 표피의 과립층 내, 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현이다 (특히 도 1 참고). 과립층의 세포는 각질층 밑에 위치한다. 과립층 (granular layer 또는 stratum granulosum) 은 밀도 높은 난형 핵을 갖는 편평 각질세포의 3 개 층으로부터 형성된다. "리프팅 (lifting)" 동안 취해진 샘플로부터 수득된 두피의 슬라이스에서 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 만기 발현이 발견되는 반면에, 재현된 피부의 슬라이스에서 이들 마커의 발현은 초기저층 전체에서, 즉 말피기 점액성 물질의 층의 세포 (이는 유극층 (stratum spinosum) 을 구성함) 내에서 관찰된다. 이는 본 발명에 따른 두피 모델이 생체 내 두피의 특이성을 가짐을 입증한다.

이들 특징은 특히 본 발명의 방법에 따라 수득된 두피 모델을 표준 재현된 피부 모델과 구별할 수 있게 해준다.

따라서, 출원인은 두피 대체물의 신규한 제조 방법을 개발했다.

출원인은 모낭간 두피 세포를 단리했고, 그것을 사용하여 두피 대체물을 개발할 생각을 했다.

용어 "두피 대체물" 은 이하에서 두피 모델로도 언급되며, 두피 진피 대체물 위에 놓여 있는 두피 표피 대체물의 집합체를 의미한다. 이것은 기술 과정을 통해 시험관 내에서 생성된 구조이다.

따라서 본 발명은 파종 단계, 및 진피 대체물 상에서 모낭간 두피 각질세포를 배양하는 단계를 포함하는 두피 대체물의 제조 방법으로서, 상기 진피 대체물이 콜라겐 및 모낭간 두피 섬유모세포를 포함하는 방법에 관한 것이다.

진피 대체물은 위에 언급된 섬유모세포를 조심스럽게 사용하여, 예를 들어 문헌 EP 0 418 035, WO 00/29553 또는 EP 0 285 471 에 기재된, 다양한 과정에 따라 제조될 수 있다.

언급될 수 있는 진피 대체물은 콜라겐/섬유아세포 혼합 격자, 사전에 표피제거된 (de-epidermized) 진피, 인공 막, 예를 들어 Millipore 브랜드 필터, 콜라겐계 피하 기질, 세포 생활력과 화합성인 플라스틱 또는 임의의 기타 지지체를 포함한다. 우선적으로, 본 발명에 따른 진피 대체물은 콜라겐 격자 또는 콜라겐 스폰지 형태이다.

용어 "콜라겐 격자" 는 선행 기술에서 잘 알려졌고 (Bell et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No. 3, pp. 1274-1278), 수십 년간 사용되어 온 알려진 진피 대체물 모델을 나타낸다.

우선적으로, 본 발명에 따르면, 격자는 Asselineau 등 (Models in dermato., vol. III, Ed Lowe & Maibach, 1-7, 1987) 에 의해 기술된 방법에 따라 제조된다.

용어 "콜라겐 스폰지" 도 또한 통상의 기술자에게 알려져 있다. 그것은 콜라겐계 생체고분자를 나타낸다 (예를 들어: BASF Beauty Care 가 판매하는 Mimedisk®).

본 발명에 따르면, 콜라겐은 임의의 기원의 임의의 유형의 콜라겐일 수 있다. 이와 관련하여, Van der Rest 및 Garonne 에 의한 리뷰, 1990, Biochem., vol. 72, 473-484 또는 1991, Faseb Journal, vol. 5, 2814-2823 에서 언급된 다양한 유형의 콜라겐이 언급될 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 콜라겐은 바람직하게는 유형 I, III 또는 V 의 원섬유 콜라겐으로부터 선택된다.

우선적으로, 본 발명에 따르면, 동물 기원의 콜라겐, 특히 소 기원의 콜라겐이 사용된다.

본 발명에 따라 우선적으로 사용되는 콜라겐은 유형 I 콜라겐이다. 가장 우선적으로 본 발명에 따르면, 소 유형 I 콜라겐이 사용된다.

말할 필요도 없이, 본 발명에 따르면, 상이한 기원의 및/또는 임의의 비율의 상이한 유형의 콜라겐의 혼합물이 사용될 수 있다.

우선적으로, 진피 대체물은 수축된 콜라겐 격자이고, 각질세포의 파종은 우선적으로 격자의 수축 2 ~ 6 일 후에, 더욱 우선적으로 3 ~ 5 일 후에, 더욱더 우선적으로 3 일 후에 수행된다. 콜라겐 겔의 수축은 우선적으로 콜라겐에 대한 모낭간 두피 섬유모세포의 작용으로 인한 것이다.

모낭간 두피 섬유모세포 및/또는 각질세포는 우선적으로 두피 샘플로부터 수득된 진피 및 표피로부터 각각 단리된다. 하나의 우선적 구현예에서, 외상피 초의 각질세포가 사전에 이러한 샘플로부터, 예를 들어 상기 샘플 상의 모발의 탈모에 의해, 제거되었을 것이다. 예를 들어 핀셋을 사용하여, 두피 샘플 상의 모발의 탈모를 수행하여, 샘플로부터 외상피 초의 각질세포를 완전히 제거할 것이다.

모낭간 두피 각질세포는 우선적으로 하기 단계를 통해 수득된다:

- 두피 샘플의 단백질분해 처리에 의해, 특히 두피 샘플을 디스파제 또는 써몰리신과 접촉시킴으로써, 두피 진피를 표피로부터 분리하는 단계,

- 두피 표피를 회수하는 단계,

- 이와 같이 수득된 두피 표피를 트립신과 접촉시키는 단계,

- 모낭간 두피 각질세포를 회수하는 단계, 및

- 이와 같이 수득된 각질세포를 배양하는 단계.

각질세포는 Rheinwald 및 Green (Cell, vol. 6, 331-344,1975) 의 기술에 따른 파종 전에 통상의 기술자에게 알려진 적합한 배지 내의 섬유모세포로 이루어지는 영양소 지지체 상에서 성장 인자, 특히 아미노산, 혈청, 콜레라 독소, 인슐린, 트리요오드사이로닌 및 pH 완충액의 존재 하에 배양함으로써 증폭된다. 특히, 그러한 배양 배지는 특히 각질세포에 대한 하나 이상의 분열촉진 성장 인자 (예를 들어 표피 성장 인자 (EGF) 및/또는 각질세포 성장 인자 (KGF), 특히, 인슐린, 하이드로코르티손 및 임의로 항생제 (예를 들어: 젠타마이신 또는 암포테리신 B) 를 함유할 수 있다.

유리하게는, 상기 배지는 또한, 예를 들어 소 기원의, 혈청 또는 뇌하수체 추출물, 에피네프린, 트랜스페린 및/또는 비필수 아미노산을 포함할 수 있다.

이러한 배양에 사용되는 섬유모세포는 더욱 우선적으로 3T3 섬유모세포일 것이다. 3T3 섬유모세포는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이것은 1962 년부터 알려진 섬유아세포 세포주이다. "3T3" 은 "3-일 전달, 3x10⁵ 세포의 접종물" 을 의미한다.

모낭간 두피 각질세포의 배양은 우선적으로 증식을 사전에 중단시킨 섬유모세포 (우선적으로 3T3 섬유모세포) 와의 공배양이며, 상기 증식의 중단은 우선적으로 사전에 방사선조사하여 (예를 들어 UV 로) 또는 사전에 미토마이신으로 처리하여 실시된다. 미토마이신 (특히 미토마이신 C) 은 이들 세포의 증식은 차단하지만, 이들 세포가 각질세포 증식에 유용한 영양소 물질을 생산하는 것은 막지 않는다.

또다른 구현예에 따르면, 각질세포는 파종 전에, 피브로넥틴 (예를 들어 "피브로넥틴으로 코팅된" 배양 박스) 또는 콜라겐 (예를 들어 "유형 I 콜라겐으로 코팅된" 배양 박스) 으로 처리 또는 보충된 배양 배지에서 또는 풍부 배양 배지 예컨대 Epilife® 배지 (Gibco) 에서 배양함으로써 증폭된다.

디스파제 (또한 중성 프로테아제로도 알려짐) 는, 피브로넥틴 및 유형 I 및 IV 콜라겐을 절단하는 능력을 갖는, 프로테아제 패밀리에 속하는 효소이다.

모낭간 두피 섬유모세포는 우선적으로 하기 단계를 통해 수득된다:

- 두피 진피를 회수하는 단계,

- 이와 같이 수득된 두피 진피를 콜라게나제 및/또는 트립신과 접촉시키는 단계,

- 모낭간 두피 섬유모세포를 회수하는 단계, 및

- 이와 같이 수득된 섬유모세포를 배양하는 단계.

위에 언급된 효소들이 요망되는 효과를 가질 수 있게 하는, 통상의 기술자에게 알려진 농도에서 사용된다는 것이 명백히 이해된다. 우선적으로, 디스파제가 두피 진피를 표피로부터 분리하는데 사용될 것이다. 트립신 (Gibco) 은 두피 표피로부터 모낭간 두피 각질세포의 현탁액을 수득할 수 있게 해줄 것이다. 콜라게나제 (Boehringer) 및/또는 트립신은 두피 진피로부터 모낭간 두피 섬유모세포의 현탁액을 수득하는 것을 가능하게 해줄 것이다.

모낭간 두피 각질세포 또는 섬유모세포를 회수하는 단계는 우선적으로 트립신 또는 콜라게나제의 작용을 통해 수득된 현탁액의 여과에 뒤이어, 통상의 기술자에게 알려진 조건 하에서의 원심분리 및 원심분리 펠렛의 재현탁에 의해 수행된다.

더욱 특히, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:

a- 배양 배지에 침지된 지지체 위에 놓인 콜라겐 격자에 모낭간 두피 각질세포를 파종하는 단계;

b- 상기 콜라겐 격자의 표면에서 모낭간 두피 각질세포가 증식하는 단계;

c- 생성 동안 배양 배지가 표피 대체물의 윗면을 덮지 않도록 상기 지지체를 들어올리는 단계.

특히, 지지체는 지지체 그릴 (grille) 일 수 있다.

본 발명에 따른 진피 대체물은 특히 배양 배지에 모낭간 두피 섬유모세포를 파종한 후, 뒤이어 콜라겐을 첨가하여 수득된다.

본 발명에 따른 방법은 하기 배양 단계를 포함할 수 있다:

a) 예를 들어, 동물 또는 인간 조직 절편이 파종된 영양소 배지에서 생성된 단층 배양물으로부터, 수확된 수축성 세포를,

b) 진피 세포외 매트릭스의 성분, 특히 콜라겐이 보충된 영양소 배지와 혼합하는 단계,

상기 혼합물은 겔을 형성하고, 겔은 수축하여, 영양소 배지를 배출하여 진피 대체물, 특히 수축된 콜라겐 격자를 형성함.

제어되는 트립신처리법에 의해 또는 콜라게나제를 사용하여, 건강한 인간 공여자로부터 수득되고 단층 배양물로부터 수확된 모낭간 두피 섬유모세포가 수축성 세포로서 사용될 것이다.

본 발명에 따른 제조 방법의 실행은 진피 대체물 - 또는 진피 기질 - 에 모낭간 두피 각질세포를 파종하는 것으로 이루어진다.

상기 기질의 표면에서 각질세포의 증식을 가능케 하는 조건이 유지되고, 이러한 모낭간 두피 각질세포 배양물의 발달은 하나 이상의 최소 영양소 배지, 바람직하게는 실시예 1 에 기재된 3F 배지를 상기 각질세포와 접촉시켜 사용함으로써 촉진된다.

유리하게는, 각질세포를 기질 위에 파종한 후, 이식된 기질은, 바람직하게는 5 ~ 7 일 동안, 각질세포를 덮는 이러한 영양소 배지 내 침지에 의해 유지된다.

그 다음에, 진피 대체물이 공기와 접촉된다. 이를 위해, 진피 대체물은 용기의 맨 아래 부분에 비해 상승되어 있는 지지체 그릴 위에 놓여지고, 영양소 배지의 수준을 조정하여, 지지체 그릴은 간신히 덮히지만 생성 동안 영양소 배지가 피부 대체물의 윗면을 덮지 않도록 한다.

본 발명의 방법에 따르면, 모낭간 두피 각질세포가 파종된 수축된 진피 대체물은 따라서 우선적으로 5 ~ 7 일 동안 배양 배지 내 침지에 뒤이어 5 ~ 7 일 동안 적합한 지지체 상에서의 출현 (emersion) 에 의해 배양된다.

이와 같이 구성된 본 발명에 따른 두피 대체물은 잘 분화되고 잘 조직화되어 있다. 그것은 또한 전체적으로 균질이다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 변형에 따르면, 수축된 또는 수축되는 중인, 상기 진피 두피 대체물 내로 (특히 콜라겐 격자 내로), 진피 유두의 섬유모세포 및/또는 결합 초의 섬유모세포, 및/또는 전체 진피 유두 및/또는 결합 초 및/또는 결합 초의 분획으로부터 선택되는 모발 섬유모세포를 이식함으로써 모발을 포함하는 두피 대체물을 수득할 수 있다. 이러한 실행은, 예를 들어, 주사기를 사용하여 이루어질 수 있다. 이들 모발 섬유모세포, 전체 진피 유두, 결합 초 및/또는 결합 초의 분획은 모낭간 섬유모세포가 콜라겐에 대한 작용을 시작한 후에 첨가될 것이다. 그러므로 그들의 첨가는 모낭간 두피 섬유모세포와 동시에 실행되지 않는다. 모발 섬유모세포는 우선적으로 1000 ~ 10 000 세포의 양, 즉 모낭간 두피 섬유모세포 100 개 당 모발 섬유모세포 약 1 ~ 10 개의 비율로 첨가될 것이다.

모발 섬유모세포 예컨대 유두 섬유모세포 또는 결합 초의 섬유모세포 또는 전체 유두 또는 결합 초 또는 결합 초의 분획을 진피 대체물 내로 이식함으로써, 각질세포는 체모 또는 모발 (모발 줄기) 의 형태발생을 재현할 것이다 (Reynolds A.J., Lawrence C.M., Jahoda C.A., Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J. Invest. Dermatol. 1993 Oct.;101 (4): 634-8).

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 방법을 통해 수득될 수 있는 두피 대체물이다.

이러한 두피 대체물은 그것의 과립층 내에서 인볼루크린 및/또는 케라틴 K10 의 발현을 보이며, 이러한 발현은 생체 내 두피의 경우와 비슷하다. 용어 "비슷한 발현" 은 이들 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 생체 내 조직과 동일한 위치에 있는 세포 내에서 및/또는 동일한 강도로 일어남을 의미한다.

두피 대체물이 생체 내 두피의 특징을 갖는 것을 고려할 때, 두피 대체물은 처리될 개체의 항부 또는 후두부로부터 취해진 이식편과 동일한 방식과 동일한 성공률로 이식될 수 있다. 자가이식 기술은, 예를 들어, Bouhanna 등 (Dermatol. Surg. ; Nov. 2003, 29(11), 1130-4) 에 의해 기술된다. 따라서 이식 후에, 본 발명에 따른 두피 대체물은 원래의 두피 부분을 적절히 대체하는 능력을 갖는다.

또한 두피 대체물은 피부 두피 장애 예컨대 화상, 반흔형성 결함 또는 백모증을 치료하기 위한, 및 따라서 포유류, 더욱 특히 인간 환자 예컨대 3 도 화상을 입은 자에게 이식하기 위한 이식편의 제조에 사용될 것이다. 이식편은 이식을 위한 조직의 일부로서 정의된다.

따라서, 본 발명의 또다른 주제는 위에 언급된 피부 두피 장애 중 하나를 치료하기 위한 또는 치료에 사용되는 앞서 정의된 두피 대체물에 관한 것이다. 이러한 두피 대체물 또는 이식편은 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현의 면에서 생체 내 두피와 비슷한 특징을 가질 것이다 (즉 표피의 마지막 과립층 내 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현). 따라서 본 발명은 또한 이들 피부 두피 장애 중 하나의 치료용 이식편의 제조를 위한 앞서 기재된 두피 대체물의 용도에 관한 것이다.

그것의 제조를 위해 채택된 과정 변이형과 관계 없이, 수득되는 두피 대체물은 동물 실험을 요구하는 임의의 시험, 예를 들어 활성제의 방출, 그것의 피부 침투 및/또는 그것의 흡수 및/또는 그것의 생체이용률에 대한 연구, 또는 활성제 및/또는 미용, 약학적 또는 피부과용 성분의 내성, 화합성 또는 효능에 대한 연구의 대안적 시험으로서 유용한 3 차원 모델이다.

따라서, 본 발명의 또다른 주제는 두피에 대한 화합물의 피부 침투 및/또는 흡수 및/또는 생체이용률 및/또는 효능을 시험하기 위한 및/또는 두피에 관한 화합물의 내성 및/또는 화합성을 시험하기 위한 앞서 기재된 두피 대체물의 용도이다.

따라서 이러한 용도는 화합물이 두피의 다양한 층 내로 침투하는지 여부, 또는 화합물이 실제로 요망되는 효과를 갖는지 여부를 확인할 수 있게 해준다.

이러한 두피 대체물은 특히 모발 성장 조절인자인 화합물 및/또는 두피의 질 및 항상성, 특히 두피의 낙설에 작용하는 분자의 확인, 비듬 또는 민감성 두피의 치료에 유용하다.

게다가, 이러한 두피 대체물은 두피의 정상적 또는 병적 상태와 연관되는 바이오마커의 탐색을 가능하게 할 수 있다. 부가적 이점은 생체 내 두피에 더욱 근접하기 위해 모낭, 땀샘 또는 피지샘의 구현을 연구하는 것이 가능해진다는 점이다.

줄기 세포의 주입에 의해 모발의 형성을 유도하기 위해 이러한 모델은 필수적이다.

본 발명에 따른 재현된 두피 모델은 줄기 세포 (예를 들어 구근 (bulb) 세포) 로부터 모발의 형성을 유도하는 능력이 있는 분자의 활성을 정량화할 수 있게 해줄 것이다.

모낭을 포함하는 두피 대체물은 특히 체모 또는 모발 성장 동역학을 수행할 수 있게 해줄 것이고, 따라서 생체 내 상황과 같이 가능한 한 완벽한 수많은 살아 있는 모발을 요구하는 임의의 연구, 예컨대 모발 주기 및 이러한 주기에 영향을 미칠 수 있는 인자의 연구에서부터, 모발 성장을 촉진하는 활성제, 모발 손실에 대항하는 활성제 또는 모발 성장을 둔화시키는 활성제의 연구까지 가능하게 할 것이다.

신규한 활성제를 식별하기 위한 제품 스크리닝 방법은 (a) 상기 시험 제품을 본 발명에 따른 두피 대체물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 두피 대체물의 하나 이상의 파라미터에 대한 상기 제품의 효과를 분석하는 단계, 및 (c) 상기 파라미터를 변화시키는 제품을 선별하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 단계 (a) 를 수행하기 위해, 시험 제품은 국소 적용되며, 예를 들어 표준 국소 제형으로 제형화되거나 배양 배지 내로 도입된다.

두피 대체물의 파라미터는 우선적으로 두피 대체물 및/또는 두피 대체물의 낙설 내에서 사전에 선택된 마커의 발현, 생성 및/또는 활성으로부터 선택된다.

단계 (b) 는, 특히, 두피의 질 및/또는 항상성과 연관되는 마커, 예를 들어 표피 및/또는 진피 마커 예컨대 구조 단백질, 특히 표피 분화 단백질 및 진피 매트릭스의 거대분자 단백질의 발현, 생성 및/또는 활성을 분석함으로써 수행될 수 있다. 언급될 수 있는 구조 단백질의 예는 모발 케라틴이다.

두피의 질 및/또는 항상성과 연관되는 이들 마커는 두피의 낙설, 비듬 상태 또는 민감성 두피를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 두피 모델이 진피 대체물 내로 위에 기재된 바와 같이 이식된 모발 섬유모세포 예컨대 유두 섬유모세포 또는 결합 초의 섬유모세포 또는 전체 유두 또는 결합 초 또는 결합 초의 분획을 포함할 때, 스크리닝 시험은 또한 모발 줄기의 성장을 유도하는 능력이 있는 제품을 식별하기 위한 것일 수 있다.

이를 위해, 스크리닝 과정의 단계 (b) 는 모발 줄기의 성장에 대한 효과를 분석할 것이다.

본 발명에 따른 두피 모델이 면역계의 세포, 예컨대 랑게르한스 세포를 포함할 때, 스크리닝 시험은 또한 자극 또는 알레르기 반응을 유도하는 능력이 있는 제품을 식별하기 위한 것일 수 있다.

이를 위해, 스크리닝 과정의 단계 (b) 는 하기로부터 우선적으로 선택되는 하나 이상의 파라미터에 대한 제품의 효과를 분석할 것이다:

- 세포독성;

- 염증 매개인자의 방출;

- 조직구조에 의해 또는 락테이트 데히드로게나제 (각질세포 막 완전성의 마커) 의 방출에 의해 나타나는 세포 손상 (Roguet et al., J. Tox. In vitro 6:303 (1992) 및 Ponec M in In Vitro Toxicology. Eds Rougier, Maibach and Golberg p. 107, 1994);

- 피부 지질, 특히 세라미드 및 인지질의 합성 및 조성의 변화 (JID 86, 598 (1986));

- 상피 세포의 분화의 마커로서의 상피 세포의 계층화 (M. Prunieras and R. Roguet Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications, Eds M. Adolphe, A. Guillouzo and F. Marano published by INSERM 1995 pp. 191-236) (Duffy P.A., Flint O.P.: In vitro dermal irritancy test. In C.K. Atterwill and C.E. Steele (Eds): In vitro methods in Toxicology, Cambridge Univ. Press Cambridge 1987, pp. 279-297) (Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy, Roguet, Cell Biology and Toxicology, 1999:15, 63-75).

제품의 효과를 분석하는 단계 (b) 는 우선적으로 시험 제품과 접촉시킨 두피 대체물에서 측정된 하나 이상의 파라미터와 시험 제품을 수령하지 않은 것 외에는 동일한 조건 하에 배양된 대조군 두피 대체물에서 측정된 파라미터와의 비교일 것이다.

두피 대체물의 파라미터를 변화시키는 제품을 선별하는 단계 (c) 는 앞서 확인된 기준에 따라 수행될 것이다.

이러한 파라미터의 변화는 상기 마커의 발현, 생성 및/또는 활성 및/또는 모발 줄기의 성장 및/또는 두피 대체물의 낙설의 자극, 감소 또는 전적 또는 부분적 저해일 수 있다.

상기 제품의 선별 기준은, 예를 들어, 이러한 제품이 측정된 파라미터에 자극 또는 저해 효과를 갖는 것일 것이다.

본 발명에 따른 두피 대체물은 또한 신규한 활성제를 식별하기 위한 미용, 약학적 또는 피부과용 화합물의 자동화된 스크리닝 과정에 사용될 수 있다.

도 1 은 본 발명을 더욱 명백히 설명하지만, 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

도 1 에서, 사진은 항-인볼루크린 항체 (I) 및 항-K10 항체 (II) 를 사용하여 면역라벨링한 후의 재현된 피부 (피부 대체물) (A), 본 발명에 따른 두피 대체물 (B) 및 두피 샘플 (C) 의 슬라이스를 보여준다.

아래 제공된 실시예는 본 발명의 비제한적 설명으로서 제시된다.

실시예 1 - 두피 모델의 제조

안면 거상 (face-lift) 동안 수집된 (및 따라서 비교적 성숙한 여성으로부터 수득된) 두피 샘플 또는 비교적 젊은 남성으로부터 수득된 두피 샘플로부터 모낭간 두피 각질세포 및 섬유모세포를 단리한다.

이들 두피 세포를 단리하기 위해, 모발 탈모를 수행하여 외상피 초의 각질세포를 제거한 후, 진피를 표피로부터 분리하여 2 개의 표적 세포 집단, 즉 모낭간 섬유모세포 및 각질세포를 추출한다.

실험 프로토콜:

다르게 명시되지 않으면, 실시예에서 사용된 모든 배지 및 완충액은 Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau and Prunieras, 1984 (British J. of Derm., 111, 219-222), 또는 Asselineau et al., 1987 (Models in dermato., vol. III, Ed. Lowe and Maibach, 1-7) 에 기재되어 있다.

배지 MEM + 10% FCS + 3F (3F 배지로 알려짐) 는 하기 조성을 갖는다:

- "상" 부 ("top" part) 의 조각들을 30-40 ㎖ 의 디스파제 (Roche) 를 함유하는 직경 100 ㎜ 의 배양 디쉬에 넣고, 4℃ 에서 밤새 (약 15 시간) 저장하거나 건식 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 1 시간 30 분 동안 저장하여, 조심스럽게 작은 조각들을 절단한다.

1. 정상적 인간 각질세포의 일차 배양물의 제조

- 샘플을 디스파제 바쓰로부터 제거하고, 10 ㎖ 의 트립신-EDTA (0.05%-0.02%) 를 함유하는 배양 디쉬 (직경 100 ㎜) 에 넣는다.

- 굽은 핀셋을 사용하여 진피를 표피로부터 분리하고, 진피의 표면을 핀셋 뒷면으로 부드럽게 긁어서 기저 각질세포를 회수한다.

- 표피를 디쉬로부터 10 ㎖ 의 트립신-EDTA 를 함유하는 코니칼 튜브 (50 ㎖) 로 옮긴다.

- 디쉬를 5 ㎖ 의 트립신-EDTA 로 헹군다.

- 멸균 거즈를 통해 여과한다.

- 20 ㎖ 의 순수한 소태아 혈청 (FCS) 으로 중화시킨다.

- 현탁액을 50 ㎖ 코니칼 튜브에 넣는다.

- 세포 현탁액을 10 분 동안 1200 rpm 에서 원심분리한다.

- 상청액을 제거하고, 펠렛을 MEM 10% FCS + 7F (이 배지는 3F 배지와 동일한 화합물 및 4 가지 부가적 화합물: 아데닌, 트랜스페린, T3, 인슐린을 포함한다) 에 녹인다.

- 생존 세포를 계수한다.

- 배양 디쉬에 10 000 생 세포/㎠ 를 파종한다.

- 24 시간 후에, 배지를 교환하지 않고 미토마이신 C (Ametycine®) 로 처리된 3T3 (12 000 세포/㎠) 를 첨가하여 표준 공배양을 수행한다.

2. 진피 세포 단리에 관한 프로토콜:

a) 0.1% 글루코스, 0.8% NaCl 및 0.04% KCl 을 포함하는 용액을 제조한다.

- 콜라게나제를 0.1% (Worthington) 까지 첨가한다.

- 용액을 Millipore 또는 Nalgene 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.

b) 옆 길이가 약 2 ㎜ 인 작은 조각 형태의 진피, 20 ㎖ 의 콜라게나제 용액 및 멸균 막대를 50 ㎖ 비이커에 넣는다.

- 37℃ 에서 5% CO₂ 하에 1 시간 30 분 동안 교반한다.

- 수득된 현탁액을 두배 두께의 멸균 거즈를 통하여 여과한다.

- 여과된 현탁액을 통상적인 세포 원심분리 조건 하에 원심분리한다.

c) 펠렛을 신선한 배양 배지에 재현탁시키고, 세포를 계수하고, 디쉬에 파종한다.

3 . 격자의 제조:

수행된 실험이 25 개 초과의 격자를 포함하는 경우, 모든 상기 부피는 2 배여야 한다.

MEM 1.76X

17.6 ㎖ 의 MEM 10X

5.1 ㎖ 의 NaHCO₃ 7.5%

0.88 ㎖ 의 L-글루타민 (1.76 mM)

0.88 ㎖ 의 나트륨 피루베이트 (0.88 mM)

0.88 ㎖ 의 비필수 아미노산 0.88 X (Ref.: K 0293 - 공급자: Biochrom KG)

0.088 ㎖ 의 페니실린 스트렙토마이신 8.8 U/8.8 ㎍/㎖ (0.088%) (Ref.: A2212 - 공급자: Biochrom KG)

0.044 ㎖ 의 항진균제 항생제 0.04 X (0.04%)

75 ㎖ 의 멸균 초순수 (ultrapure water)

MEM HEPES 10% FCS

50 ㎖ 의 MEM 25 mM HEPES

0.5 ㎖ 의 L-글루타민 (2 mM)

0.5 ㎖ 의 나트륨 피루베이트 (1 mM)

0.5 ㎖ 의 비필수 아미노산 1 X

0.1 ㎖ 의 페니실린 스트렙토마이신 20 U/20 ㎍/㎖ (0.2%)

0.05 ㎖ 의 항진균제 항생제 0.1 X (0.1%)

5 ㎖ 의 FCS 10%.

NaOH 0.1N

10 ㎖ NaOH 1N

90 ㎖ 의 멸균 초순수

이러한 용액을 GV Durapore 0.22 ㎛ 막을 갖는 Millipore 필터를 통하여 통과시킨다.

아세트산 1/1000

0.5 ㎖ 의 100% 빙초산

499.5 ㎖ 의 멸균 초순수

이와 같이 제조된 배지를 사용하여:

- 멸균 코니칼 플라스크 내에 5 ㎖ 의 하기 용액을 제조한다:

3.22 ㎖ 의 MEM 1.76 X

0.63 ㎖ 의 FCS

0.35 ㎖ 의 NaOH 0.1N

0.6 ㎖ 의 아세트산 1/1000

0.2 ㎖ 의 MEM HEPES 10% FCS.

- 모낭간 두피 섬유모세포의 세포 현탁액 0.5 ㎖ 를 이러한 용액에 첨가한다.

- 그 다음에, 필요 부피의 차가운 콜라겐 (이러한 콜라겐이 Gattefosse 또는 Symatese 콜라겐인 경우 2.1 ㎖ 또는 이러한 콜라겐이 Coletica 콜라겐인 경우 1.5 ㎖) 을 서서히 첨가한다.

- 코니칼 플라스크를 균질화될 때까지 격절히 진탕시킨다 (푸시아 핑크 용액이 살몬 색으로 변한다).

- 코니칼 플라스크의 내용물을 비워 60 ㎜ FalconØ 박테리아 디쉬에 넣는다.

- 디쉬를 오븐 (37℃ - 5% CO₂) 내에 약 1 시간 30 분 - 2 시간 동안 배치한다.

- 겔이 굳고 배지가 배출될 때, 수축의 시작을 체크한다.

- 오후에, 격자를 규칙적으로 진탕시켜 그들이 다시 서로 달라붙지 않게 한다.

- 수축이 3 일 동안 진행되도록 놔둔다.

4. 각질세포의 배양물-파종

격자의 수축 3 일 후에 각질세포의 파종을 실시한다.

a) 접착제의 제조

- 2 개의 격자의 결합의 경우, 0.7 ㎖ 의 하기 용액을 제조한다:

0.46 ㎖ 의 MEM 1.76 X

0.09 ㎖ 의 FCS

0.05 ㎖ 의 NaOH 0.1N

0.1 ㎖ 의 MEM HEPES 10% FCS.

- 이러한 튜브에 0.3 ㎖ 의 투석된 콜라겐을 첨가한다. 최종 부피는 따라서 1 ㎖ 이다.

코멘트:

- 상기 부피는 2 개의 격자의 결합에 대한 것이다.

- 여러 개의 격자의 경우, 코니칼 플라스크 내에서 결합될 n+1 샘플에 상응하는 전체 용액을 제조한다.

- 튜브에, 0.7 ㎖ 의 이러한 용액을 멀티피펫을 사용하여 분배한다.

- 그 다음에, 튜브 마다 0.3 ㎖ 의 콜라겐을 첨가한다.

- 격자를 둘씩 짝을 지어 (two by two) 작업한다.

b) 격자의 결합

- 6 ㎖ 튜브에 접착제 용액을 채운다.

- 볼텍스 믹서로 교반한다.

- 용액을 피펫으로 빨아들이고, 2 개의 Corning 배양 디쉬 각각의 중앙에 이러한 용액 한 방울 (약 0.45 ㎖) 을 놓는다.

- 격자를 굽은 핀셋 및 세포 리프터 (lifter) 를 사용하여 들어올린다.

- 격자를 그것의 원래의 디쉬의 뚜껑에 놓아서 과잉 배지를 제거한다.

- 격자를 들어올리고 접착제의 방울 위에 놓는다.

- 접착제가 격자 주위에 분포되도록 디쉬를 회전시켜 균일하게 퍼지게 한다.

- 디쉬를 오븐 (37℃ - 5% CO₂) 내에 20-30 분 동안 배치하여 접착제를 굳힌다.

c) 각질세포의 파종

- 이들 세포가 동결된 경우, 바이알을 37℃ 의 수조 내에서 교반하여 가능한 한 신속히 세포를 해동시킨다.

- 바이알의 내용물을 50 ㎖ 35 ㎖ 의 MEM 10% FCS + 3F 배지를 함유하는 Falcon 배양 튜브 내로 옮긴다.

- 5 분 동안 1000 rpm 에서 원심분리한다.

- 상청액을 제거한다.

- 원심분리 펠렛을 MEM 10% FCS + 3F 배지에 녹여 100 000 세포/㎖ 를 함유하는 용액을 수득한다.

- 세포를 여러 번 흡입-방출하여 재현탁시킨다.

- 직경이 14 ㎜ 인 파종 링 (seeding ring) 을 결합된 격자 위에 놓는다.

- 이러한 링 내에, 0.5 ㎖ 의 세포 현탁액 (= 50 000 세포/링 1.5 ㎠, 즉 약 33 000 세포/㎠) 을 넣는다.

- 링 주변에, 5 ~ 7 ㎖ 의 MEM 10% FCS + 3F 배지를 격자가 분리되지 않도록 조심스럽게 첨가한다.

- 병행하여, 2 개의 "대조군 링" 을 파종한다 (격자를 함유하지 않는 링이 있는 디쉬).

- 디쉬를 오븐 (37℃ - 5% CO₂) 내에 2 시간 동안 배치한다.

- 2 시간의 부착 후에 굽은 핀셋을 사용하여 링을 제거한다.

- 디쉬를 다시 오븐 (37℃ - 5% CO₂) 내에 배치한다.

- 배지를 수요일 및 금요일에 교환한다 (5 ~ 7 ㎖ 의 MEM 10%FCS + 3F 배지/디쉬).

- 재현된 피부의 배양물-출현

수일의 침지 내 배양 후, 피부를 출현물에 배치한다.

그러나, 각질세포가 격자로부터 출현하는지를 현미경으로 관찰함으로써 체크한다.

- 출현 그릴을 Falcon 박테리아 디쉬에 넣는다.

- 7.5 ㎖ 의 MEM 10% FCS + 3 F 을 거품이 형성되지 않도록 주의하면서 첨가한다.

- 출현되는 피부 주변의 접착제를 멸균 메스를 사용하여 절단한다.

- 굽은 핀셋 및 세포 리프터를 사용하여 피부를 그릴 위로 옮긴다.

- 디쉬를 오븐 (37℃ - 5% CO₂) 내에 배치한다.

- 배지를 수요일 및 금요일에 교환한다 (7 ~ 7.5 ㎖ 의 MEM 10%FCS + 3F 배지).

수 일의 출현 후, 재현된 두피 피부는 당장 사용가능하다.

실시예 2 : 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현의 비교

인볼루크린 또는 K10 에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 면역라벨링한 후에 실시예 1 에서 수득된 두피 대체물 내에서의 인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현을 관찰한다. 또한 표준 피부 대체물 및 두피 샘플 내에서도 이러한 발현을 관찰한다.

표준 피부 대체물 및 두피 샘플의 제조:

표준 진피 대체물을 제조하기 위해, 3.22 ㎖ 의 MEM 1.76 X 배지, 0.63 ㎖ 의 소태아 혈청, 0.35 ㎖ 의 0.1 N 수산화나트륨 및 0.20 ㎖ 의 10% 소태아 혈청 함유 MEM/HEPES 배지 혼합물 (MEM/HEPES/FCS10) 을 멸균 Falcon 튜브에 넣는다.

그 후 Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau and Prunieras, 1984 (British J. of Derm., 111, 219-222), 또는 Asselineau et al., 1987 (Models in dermato., vol. III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7) 에 기재된 방법에 따라 사전에 제조한 인간 유방 수술로부터 수득된 섬유모세포를 함유하는 0.50 ㎖ 의 MEM/HEPES/FCS10 배지를 배양 배지 0.5 ㎖ 당 1x10⁶ 세포의 농도로 첨가한다.

그 후 아세트산 (1/1000) 중 3 ㎎/㎖ 농도의 콜라겐의 부피/부피 혼합물 2 ㎖ 를 튜브의 벽을 따라 아래로 서서히 첨가하여 희끄무레한 구름의 출현을 관찰한다. 그 후 전부 조심스럽게 혼합하고 직경이 60 ㎜ 인 페트리 디쉬 (Falcon 60 ㎜ 유형, ref. 1016) 에 넣는다. 그 후 페트리 디쉬를 37℃ 의 오븐 내에 배치하고, 약 2 시간 30 분 동안 놔둔다. 2 개의 상 (겔 + 배지) 의 출현이 관찰될 때, 격자를 지지체로부터 조심스럽게 분리하고, 이와 같이 지지체로부터 분리된 격자를 4 일 동안 오븐 내에 놔둔다.

표준 피부 대체물을 제조하기 위해, 표준 진피 대체물을 직경 60 ㎜ 의 Corning 유형 배양 디쉬 내의 콜라겐 "접착제" (0.6 ㎖) 한 방울 위에 놓은 후, 오븐 내에서 37℃ 에서 20-30 분 동안 유지한다.

멸균 강철 링을 격자 위에 놓고, MEM 10% FCS + 3F 배지 중 100 000 세포/㎖ 의 비율로 Regnier 등 (Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35, Karger, Basle 1981) 에 따라 제조된 유방 수술로부터 수득된 인간 각질세포의 세포 현탁액 0.5 ㎖ 를 링 내에 넣는다.

약 6 ㎖ 의 배지 (MEM 10% FCS + 3F) 를 링 주위에 놓고, 디쉬를 오븐 내에 37℃ 에서 2 시간 동안 배치한다. 그 후 링을 제거하고, 디쉬를 다시 오븐 내에 배치한다.

8 일 후, 배양물을 공기/액체 경계면에 놓고, 이때 상기 액체는 이전과 동일한 배지로 구성된다.

그 후 조직학적으로 만족스러운 표피 대체물, 즉 4 개의 표준 세포 층, 즉 기저, 초기저, 과립 및 각질 층들을 갖는 표피 대체물이 수득될 때까지 1 주 동안 배양을 계속한다.

통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 리프팅한 후에 두피 샘플이 회수된다.

인볼루크린 및 케라틴 K10 의 발현의 측정

동결 후, 다양한 조직을 크리오스타트를 사용하여 5 ㎛ 두께의 슬라이스로 절단한다.

그 후 슬라이스를 PBS 로 2 회 헹구고, 25 ㎕ 의 1/50 로 희석된 항-인볼루크린 항체 (Sigma - Ref.: I9018) 및 항 K10 항체 (Immuquest Ltd -Ref. AE20) 를 각각의 슬라이스 위에 놓고, 30 분 동안 실온 (25℃) 에서 놔둔다. 그 후 슬라이스를 PBS 로 2 회 헹구고, 25 ㎕ 의 FITC 접합 항체 (토끼 항-마우스 FITC, Dako F232) 를 각각의 슬라이스 위에 놓고, 30 분 동안 실온 (25℃) 에서 놔둔다. 슬라이스를 PBS 로 2 회 헹구고, 마운팅 후에 Leica 브랜드 형광 현미경, Leitz DMRB 모델로 관찰한다.

관찰은 인볼루크린 (도 1, I) 및 케라틴 K10 (도 1, II) 이 대조군 (재현된 피부) 에서는 재현된 표피 (도 1, A) 의 모든 초기저층에서 발현되는 반면에, 그들이 두피 대체물 (도 1, B) 및 두피 샘플 (도 1, C) 의 만기에, 즉 표피의 과립층에서만 발현됨을 보여준다.

이들 2 가지 마커의 발현은 재현된 피부 (A) 에서는 조기에, 재현된 두피 모델 (B) 및 두피 샘플 (C) 에서는 만기에 도 1 에 화살표로 표시된 위치에서 일어난다.

따라서 이들 결과로 본 발명에 따른 재현된 두피 모델이 생체내 두피와 구조 및 기능이 유사함을 확인할 수 있다.

Claims

모낭간 두피 각질세포가 진피 대체물 위에 파종되고 배양되고, 상기 진피 대체물이 콜라겐 및 모낭간 두피 섬유모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 두피 대체물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 진피 대체물이 수축된 콜라겐 격자이고, 각질세포의 파종이 상기 격자의 수축 2 ~ 5 일 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 모낭간 두피 섬유모세포 및 각질세포가 두피 샘플로부터 수득된 진피 및 표피로부터 각각 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 외상피 초의 각질세포가 사전에 제거된 두피 샘플로부터 모낭간 두피 각질세포가 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 모낭간 두피 각질세포가 하기 단계를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 두피 샘플의 단백질분해 처리에 의해 두피 진피를 표피로부터 분리하는 단계,
- 두피 표피를 회수하는 단계,
- 이와 같이 수득된 두피 표피를 트립신과 접촉시키는 단계,
- 모낭간 두피 각질세포를 회수하는 단계, 및
- 이와 같이 수득된 각질세포를 배양하는 단계.
제 5 항에 있어서, 각질세포 배양이 미토마이신으로 사전에 처리된 또는 방사선조사된 섬유모세포와의 공배양 또는 피브로넥틴 또는 콜라겐으로 보충된 배양 배지 위에서의 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 모낭간 두피 섬유모세포가 하기 단계를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 두피 샘플의 단백질분해 처리에 의해 두피 진피를 표피로부터 분리하는 단계,
- 두피 진피를 회수하는 단계,
- 이와 같이 수득된 두피 진피를 콜라게나제 및/또는 트립신과 접촉시키는 단계,
- 모낭간 두피 섬유모세포를 회수하는 단계, 및
- 이와 같이 수득된 섬유모세포를 배양하는 단계.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 모낭간 두피 각질세포가 파종된 수축된 진피 대체물이 5 ~ 7 일 동안 배양 배지 내 침지에 뒤이어 5 ~ 7 일 동안 적합한 지지체 상에서의 출현에 의해 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 진피 유두의 섬유모세포 및/또는 결합 초의 섬유모세포, 및/또는 전체 진피 유두 및/또는 결합 초 및/또는 결합 초의 분획로부터 선택되는 모발 섬유모세포가 수축된 또는 수축되는 중인 상기 진피 대체물 내로 이식되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
과립층 내에서 인볼루크린 및/또는 케라틴 K10 의 발현을 나타내는 것을 특징으로 하는 두피 대체물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 수득된 두피 대체물.
제 11 항에 있어서, 과립층 내에서 인볼루크린 및/또는 케라틴 K10 의 발현을 나타내는 것을 특징으로 하는 두피 대체물.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 두피 장애의 치료에 사용되는 두피 대체물.
제 13 항에 있어서, 피부 장애가 두피 화상인 것을 특징으로 하는 두피 대체물.
두피에 대한 화합물의 피부 침투 및/또는 흡수 및/또는 생체이용률 및/또는 효능을 시험하기 위한, 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 두피 대체물의 용도.
신규한 활성제를 식별하기 위한 제품 스크리닝 방법으로서, (a) 상기 시험 제품을 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 두피 대체물과 접촉시키는 단계, 및 그 후 (b) 두피 대체물의 하나 이상의 파라미터에 대한 상기 제품의 효과를 분석하는 단계, 및 (c) 상기 파라미터를 변화시키는 제품을 선별하는 단계를 포함하는 방법.