CN109628393A - 一种用于分离脐带间充质干细胞的方法及其消化液 - Google Patents

一种用于分离脐带间充质干细胞的方法及其消化液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于分离脐带间充质干细胞的方法及其消化液，涉及干细胞技术领域，该方法包括采用脐带消化液对脐带组织进行消化，脐带消液包括有浓度为0.05～0.5％的II型胶原酶、浓度为0.05～0.5％的IV型胶原酶、以及浓度为0.1％的透明质酸酶，采用该消化液能够有效提高细胞的分离效率以及分离的细胞数量，且获得的脐带间充质干细胞具有表面标志物表达量高的优点。

Description

一种用于分离脐带间充质干细胞的方法及其消化液
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体而言，涉及一种用于分离脐带间充质干细胞的方法及其消化液。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是中胚层来源的，具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。
事实上，MSC广泛存在于全身多种组织中，几乎来源于机体所有的组织器官，如骨髓、骨膜、脂肪组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊水以及胎儿组织等。
不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特征方面，如可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。
MSC除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。
脐带间充质干细胞(UC-MSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能，脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。
与其他来源的MAC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增值和分化能力比胚胎干细胞低，但是明显高于成体干细胞。
脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，UC-MSC不仅能分化成骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。
人脐带是一种胶状的结缔组织，如何高效地从脐带中分离脐带间充质干细胞是一直以来的难题。原代脐带间充质干细胞的最常见的方法包括酶消化法和组织块培养法。酶消化法的经济成本高，通常需要使用专用的消化设备，消化设备非常昂贵。
消化的时间很长，通常为4～5h，消化程度不易把控，消化不够便无法得到足够数量的细胞；消化时间过久，使用的酶对细胞的损伤太大，细胞会大量死亡。且由于消化液为粘稠液体，离心时不易分离出细胞。
组织块培养法过程简便易行，且经济成本低，但原代培养时间太长，通常需要14～20d才能够得到数量不多的原代细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其能够有效提高细胞的分离效率以及分离的细胞数量，且获得的脐带间充质干细胞具有表面标志物表达量高的优点。
本发明的另一目的在于提供一种用于分离脐带间充质干细胞的消化液，其能够有效提高脐带间充质干细胞的消化时间，且经该消化液消化后分离的细胞具有表面标志物表达量高的优点。
本发明是这样实现的：
一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其包括有脐带分离步骤、脐带消化步骤以及细胞培养步骤。
脐带分离步骤：
无菌条件下，取出脐带，去除脐带中的血液、脐带外膜、脐带动脉、脐带静脉以及其他杂质，采用无菌PBS充分冲洗，将脐带剪成(0.5～3mm)×(0.5～3mm)×(0.5～3mm)的脐带组织。
脐带消化步骤：
脐带组织的第一阶段消化：
将脐带分离步骤获得的脐带组织与胰酶混合，然后在30℃～40℃恒温孵育10～30min，得到未消化完的组织块与第一消化液，然后将采用150～300目的筛网过滤第一消化液，离心得到第一份消化后的细胞；
具体地，第一阶段消化过程中，胰酶的浓度为0.1％、0.20％、0.22％、0.24％、0.25％、0.27、0.29％、0.3％或0.4％，优选地，胰酶的浓度可以为0.2～0.3％之间选择。
脐带组织的第二阶段消化：
脐带消化液的配制：脐带消化液包括有PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酸。
具体地，在脐带消化液中，II型胶原酶的终浓度可以为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％。在一些实施例中，II型胶原酶的终浓度可以在0.05～0.5％的范围内选择，优选地，II型胶原酶的终浓度优选范围为0.1～0.3％。
IV型胶原酶的终浓度可以为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％，在一些实施例中，IV型胶原酶的终浓度可以在0.05～0.5％的范围内选择，优选地，IV型胶原酶的终浓度优选范围为0.1～0.3％。
透明质酸酶的终浓度可以为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％，在一些实施例中，透明质酸酶的终浓度可以在0.1～0.3％的范围内选择，优选地，透明质酸酶的终浓度优选范围为0.05～0.2％。
采用本发明实施例提供的脐带消化液对脐带组织进行消化能够有效提高细胞的分离效率以及分离的细胞数量，且获得的脐带间充质干细胞具有表面标志物表达量高的优点。
需要说明的是，在本发明实施例中，脐带消化液采用PBS配制，上述II型胶原酶的浓度为1％的情况为：10mL无菌PBS中加入100mg的II型胶原酶。其他浓度同样，不再赘述。
脐带消化液配制完之后，将脐带消化液与第一消化阶段未消化完的消化组织混合，然后30～45℃恒温孵育2～6h。消化后，得到未消化完的脐带组织(如果有的话)和第二消化液，采用150目～300目的筛网过滤第二消化液，1500rpm离心5min后得到第二份消化后的细胞。
需要说明的是，在本发明的一些实施例中，也可以直接进入脐带组织的第二阶段消化。第一阶段消化是为了提前获得消化细胞，在配制脐带消化液的时候，加快脐带组织的效果过程，同时也能够加快获得间充质干细胞的获得时间。
脐带组织的第三阶段消化：
将第二阶段消化得到的未消化完的脐带组织或脐带分离步骤得到的脐带组织块与胰酶混合，30～45℃恒温孵育10～30min后得到未消化完的脐带组织(如果有的话)以及第三份消化液；
然后采用150目～300目的筛网过滤第三消化液，离心后得到第三份消化后的细胞。
具体地，第三阶段加入的胰酶的终浓度为0.05％、0.1％、0.15％或0.2％，在一些实施例中，胰酶的浓度可以在0.05～0.2％的范围内选择，优选地，胰酶的浓度优选范围为0.08～0.12％。
需要说明的是，在本发明的一些实施例中，如果脐带消化组织在第二阶段消化已经被消化完成，即可省略去第三阶段的消化过程。第三阶段的消化过程是实际操作过程中根据不同情况灵活选择的步骤，避免出现脐带组织在第二阶段消化过程中，出现的消化不完全，从而导致未能完全地从脐带中或者足够数量的脐带间充质干细胞。
细胞培养步骤：
细胞培养步骤包括：将以下1份或多份细胞培养繁殖：上述第一份消化后的细胞、第二份消化后的细胞以及第三份消化后的细胞。
需要说明的是，在本发明实施例中，上述第一份消化后的细胞、第二份消化后的细胞以及第三份消化后的细胞获得后，均采用完全培养基进行细胞重悬，然后至于37℃恒温培养备用。完全培养基的制备：α-MEM，10％FBS，1％谷氨酰胺，1％双抗溶液，bFGF20ng/mL以及EGF20ng/mL。
此外，本发明实施例还提供一种用于分离脐带间充质干细胞的消化液，其包括有以下组分：PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酶；
在消化液中，II型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，IV型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，透明质酸酶的浓度为0.05～0.3％。消化液中的各组分的浓度如上述脐带消化液相同，在此不再赘述。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，该方法包括采用脐带消化液对脐带组织进行消化，脐带消液包括有浓度为0.05～0.5％的II型胶原酶、浓度为0.05～0.5％的IV型胶原酶、以及浓度为0.1％的透明质酸酶，采用该消化液能够有效提高细胞的分离效率以及分离的细胞数量，且获得的脐带间充质干细胞具有表面标志物表达量高的优点。
此外，本发明实施例还提供了一种用于分离脐带间充质干细胞的消化液，其能够有效提高脐带间充质干细胞的消化时间，且经该消化液消化后分离的细胞具有表面标志物表达量高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明对比例1中现有技术分离的脐带间充质干细胞结果图；
图2为本发明对比例1中实施例1提供的方法分离的脐带间充质干细胞结果图；
图3为本发明对比例1中实施例1提供的方法分离的干细胞表面分子CD73表达量测试结果图；
图4为本发明对比例1中实施例1提供的方法分离的干细胞表面分子CD90表达量测试结果图；
图5为本发明对比例1中实施例1提供的方法分离的干细胞表面分子CD105表达量测试结果图；
图6为本发明对比例1中现有技术提供的方法分离的干细胞表面分子CD73表达量测试结果图；
图7为本发明对比例1中现有技术提供的方法分离的干细胞表面分子CD90表达量测试结果图；
图8为本发明对比例1中现有技术提供的方法分离的干细胞表面分子CD105表达量测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其包括有以下步骤：
脐带分离步骤：
无菌条件下，取出脐带，去除脐带中的血液、脐带外膜、脐带动脉、脐带静脉以及其他杂质，采用无菌PBS充分冲洗，将脐带剪成1mm×1mm×1mm的脐带组织。
脐带消化步骤：
脐带组织的第一阶段消化：
脐带分离步骤获得的脐带组织与0.25％胰酶混合，然后在37℃恒温孵育20min，得到未消化完的组织块与第一消化液，然后将采用200目的筛网过滤第一消化液，1500rpm离心5min得到第一份消化后的细胞；
脐带组织的第二阶段消化：
脐带消化液的配制：脐带消化液包括有PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酸混合制得脐带消化液。具体地，在脐带消化液中，II型胶原酶的浓度为0.2％，IV型胶原酶的浓度为0.2％，透明质酸酶的浓度0.1％。
脐带消化液配制完之后，将脐带消化液与第一消化阶段未消化完的消化组织混合，然后37℃恒温孵育4h。消化后，得到未消化完的脐带组织(如果有的话)和第二消化液，采用200目的筛网过滤第二消化液，1500rpm离心5min后得到第二份消化后的细胞。
脐带组织的第三阶段消化：
将第二阶段消化得到的未消化完的脐带组织与0.1％胰酶混合，37℃恒温孵育20min后得到未消化完的脐带组织(如果有的话)以及第三份消化液；然后采用200目的筛网过滤第三消化液，1500rpm离心5min后得到第三份消化后的细胞。
细胞培养步骤：
将脐带消化步骤得到的第一份消化后的细胞、第二份消化后的细胞以及第三份消化后分别接种到培养瓶中，加入完全培养基，放置入37℃饱和湿度CO2培养箱中培养后混合，培养第3天半量换液，然后视情况进行传代。
实施例2
本实施例提供一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其与实施例1提供的方法大致相同，区别在于参数的不同，其包括以下步骤：
脐带分离步骤：
无菌条件下，取出脐带，去除脐带中的血液、脐带外膜、脐带动脉、脐带静脉以及其他杂质，采用无菌PBS充分冲洗，将脐带剪成1mm×1mm×1mm的脐带组织。
脐带消化步骤：
脐带组织的第一阶段消化：
脐带分离步骤获得的脐带组织与0.20％胰酶混合，然后在37℃恒温孵育20min，得到未消化完的组织块与第一消化液，然后将采用200目的筛网过滤第一消化液，1500rpm离心5min得到第一份消化后的细胞；
脐带组织的第二阶段消化：
脐带消化液的配制：脐带消化液包括有PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酸混合制得脐带消化液。具体地，在脐带消化液中，II型胶原酶的浓度为0.2％，IV型胶原酶的浓度为0.2％，透明质酸酶的浓度0.1％。
脐带消化液配制完之后，将脐带消化液与第一消化阶段未消化完的消化组织混合，然后37℃恒温孵育4h。消化后，得到未消化完的脐带组织(如果有的话)和第二消化液，采用200目的筛网过滤第二消化液，1500rpm离心5min后得到第二份消化后的细胞。
脐带组织的第三阶段消化：
将第二阶段消化得到的未消化完的脐带组织与0.1％胰酶混合，37℃恒温孵育20min后得到未消化完的脐带组织(如果有的话)以及第三份消化液；然后采用200目的筛网过滤第三消化液，1500rpm离心5min后得到第三份消化后的细胞。
细胞培养步骤：
将脐带消化步骤得到的第一份消化后的细胞、第二份消化后的细胞以及第三份消化后分别接种到培养瓶中，加入完全培养基，放置入37℃饱和湿度CO2培养箱中培养后混合，培养第3天半量换液，然后视情况进行传代。
实施例3
本实施例提供一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其与实施例1～2提供的方法大致相同，区别在于参数的不同，其包括以下步骤：
脐带分离步骤：
无菌条件下，取出脐带，去除脐带中的血液、脐带外膜、脐带动脉、脐带静脉以及其他杂质，采用无菌PBS充分冲洗，将脐带剪成1mm×1mm×1mm的脐带组织。
脐带消化步骤：
脐带组织的第一阶段消化：
脐带分离步骤获得的脐带组织与0.25％胰酶混合，然后在37℃恒温孵育20min，得到未消化完的组织块与第一消化液，然后将采用200目的筛网过滤第一消化液，1500rpm离心5min得到第一份消化后的细胞；
脐带组织的第二阶段消化：
脐带消化液的配制：脐带消化液包括有PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酸混合制得脐带消化液。具体地，在脐带消化液中，II型胶原酶的浓度为0.2％，IV型胶原酶的浓度为0.2％，透明质酸酶的浓度0.1％。
脐带消化液配制完之后，将脐带消化液与第一消化阶段未消化完的消化组织混合，然后37℃恒温孵育6h。消化后，得到未消化完的脐带组织(如果有的话)和第二消化液，采用200目的筛网过滤第二消化液，1500rpm离心5min后得到第二份消化后的细胞。
脐带组织的第三阶段消化：
将第二阶段消化得到的未消化完的脐带组织与0.12％胰酶混合，37℃恒温孵育20min后得到未消化完的脐带组织(如果有的话)以及第三份消化液；然后采用200目的筛网过滤第三消化液，1500rpm离心5min后得到第三份消化后的细胞。
细胞培养步骤：
将脐带消化步骤得到的第一份消化后的细胞、第二份消化后的细胞以及第三份消化后分别接种到培养瓶中，加入完全培养基，放置入37℃饱和湿度CO2培养箱中培养后混合，培养第3天半量换液，然后视情况进行传代。
对比例1
验证本发明提供的用于分离脐带间充质干细胞的方法的分离效果。
实验方法
取一根脐采用实施例1提供的脐带分离步骤制得两份脐带组织，并分别采用本发明实施例1提供的方法以及现有技术提供的分离方法进行间充质干细胞的分离。
现有技术的分离方法如下：将获得的脐带组织放入直径为15cm无菌培养皿内，37℃CO2培养箱中静置1h。然后用移液管缓慢缓慢加入完全培养基中，至刚刚淹没脐带组织，然后每隔3～4d换液一次。
实验结果
实施例1分离的干细胞的状态良好，生长速度非常快，第3天换液时，已经能看到大量细胞贴壁，第5天细胞开始增值，呈长梭形，典型漩涡状生长，显微镜下观察干细胞的结果如附图2所示。
而现有技术分离的干细胞需要在第10～14d时，开始有少量的脐带间充质干细胞从组织块中爬出，待细胞爬出较多后，将组织块移走，收获细胞，然后在显微镜下观察，结果如附图1所示。
由附图1～2可知，实施例1提供的分离方法分离的脐带间充质干细胞数量明显多于现有技术分离的干细胞数量，且分离的时间明显短于现有技术所需时长。
验证分离干细胞的表面标志物表达量
采用流式细胞仪分别测试实施例1提供的方法分离得到的MSC细胞表面分子CD73、CD90、CD105的表达量以及现有技术分离的干细胞表面分子CD73、CD90、CD105的表达量。
实验方法
将实施例1提供的方法分离的干细胞与现有技术分离的干细胞收集，分别弃去培养瓶中的培养基上清液，采用PBS洗贴壁细胞2次，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞皱缩脱落后，用适量血清终止消化，用适量的PBS将细胞悬液转移至离心管中。1000rpm离心5min，用PBS缓冲液调整细胞浓度至1×105/mL。
分别取1mL细胞悬液装于18个流式管中，2000rpm离心5min，吸取大部分上清，仅保留80-100μL液体。将18个流式管按照表1分组，加入荧光抗体，FITC标记每管加入抗体20μL，PE标记每管加入抗体20μL，PE-cy5标记每管加抗体10μL，APC标记每管加抗体10μL，漩涡混合后，4℃避光孵育30分钟。
表1流式管
孵育完毕后，用1mL PBS缓冲液悬浮细胞，1000rpm离心5min。最后分别用500μLPBS缓冲液将细胞重悬，上机进行检测。
实验结果
经检测，实施例1提供的方法分离得到的MSC细胞表面分子CD73、CD90、CD105表达量都非常高，分别为99.78％、99.98％和99.66％请参照附图3～5。CD73、CD90和CD105为间充质干细胞的典型分子标记物，高的表达量说明分离得到的细胞均为间充质干细胞，纯度非常高，且细胞的状态非常好。
且现有技术分离的干细胞表面分子CD73、CD90、CD105表达量94.90％、98.97％和86.81％，结果请参照附图6～8所示。现有技术分离的细胞状态较实施例1差，且典型表面分子表达量CD73、CD90和CD105表达量也低，细胞纯度和状态均没有实施例1好。
综上，本发明实施例提供了一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，该方法包括采用脐带消化液对脐带组织进行消化，脐带消液包括有浓度为0.05～0.5％的II型胶原酶、浓度为0.05～0.5％的IV型胶原酶、以及浓度为0.1％的透明质酸酶，采用该消化液能够有效提高细胞的分离效率以及分离的细胞数量，且获得的脐带间充质干细胞具有表面标志物表达量高的优点。
此外，本发明实施例还提供了一种用于分离脐带间充质干细胞的消化液，其能够有效提高脐带间充质干细胞的消化时间，且经该消化液消化后分离的细胞具有表面标志物表达量高的优点。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于分离脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括脐带消化步骤；
所述脐带消化步骤包括：采用脐带消化液与分离后的脐带组织混合孵育；
所述脐带消化液包括有PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酸，在所述脐带消化液中，II型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，IV型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，透明质酸酶的浓度为0.05～0.3％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述脐带消化液中，II型胶原酶的浓度为0.1～0.3％，IV型胶原酶的浓度为0.1～0.3％，透明质酸酶的浓度为0.05～0.2％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述脐带消化步骤中，采用所述脐带消化液消化脐带组织后，得到未消化完的脐带组织以及第二消化液，采用150～350目的筛网过滤第二消化液，离心得到第二份消化后的细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在采用所述脐带消化液消化脐带组织后，所述方法包括：将未消化完的脐带组织与胰酶混合，30～45℃恒温孵育后得到第三份消化后的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在采用所述脐带消化液消化脐带组织之前，所述方法包括：将脐带组织与胰酶混合，恒温孵育10～30min后得到第一份消化后的细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在采用所述脐带消化液消化脐带组织之前，与脐带组织混合的胰酶的浓度为0.1％～0.4％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在脐带组织与0.1～0.4％胰酶混合孵育后，所述方法包括：将采用150～350目的筛网过滤后，离心得到第一份消化后的细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在脐带消化步骤后，所述方法包括有细胞培养步骤；
所述细胞培养步骤包括将以下1份或多份细胞培养繁殖：所述第一份消化后的细胞、所述第二份消化后的细胞以及所述第三份消化后的细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在脐带消化步骤前，所述方法包括有脐带分离步骤；所述脐带分离步骤包括将脐带分离清洗，得到脐带组织。
10.一种用于分离脐带间充质干细胞的消化液，其特征在于，其包括有以下组分：PBS、II型胶原酶、IV型胶原酶以及透明质酸酶；
在所述消化液中，II型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，IV型胶原酶的浓度为0.05～0.5％，透明质酸酶的浓度为0.05～0.3％。
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