CN105567630A

CN105567630A - 一种同步分离脐血prp、脐血血浆和脐血细胞的试剂盒

Info

Publication number: CN105567630A
Application number: CN201610025135.2A
Authority: CN
Inventors: 齐湘杰; 王盛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-14
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2036-01-14
Also published as: CN105567630B

Abstract

本发明的目的是提供一种同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞试剂盒及使用方法，采用本试剂盒同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞。本发明通过脐血PRP两部分浓缩，血小板浓度增加一倍多，红细胞数成数量级较少；通过血浆二次纯化，分离获得的脐血血浆纯度高，镜检下几乎没有红细胞、血小板、单个核细胞和粒细胞；通过脐血细胞二次纯化，分离获得的脐血细胞纯度可达到95％以上，红细胞和血小板残留率小，极大地避免了由于上述组分导致的过敏风险；分离第一步血浆初分离，与常规分离技术相比，在分离脐血细胞步骤中降低了一半分离试剂的使用剂量，有效降低分离成本。

Description

一种同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞的试剂盒

技术领域

本发明属于细胞血浆分离技术领域，具体涉及一种同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞试剂盒及使用方法。

背景技术

高浓度血小板血浆(Platelet-richplasma，PRP)，是利用血液制作的富含血小板的高浓度血浆，一般用自体外周血制备。人体的血小板在高浓度状态下，能够产具有细胞粘合功能的蛋白质(fibrin，中文名称：纤维连接蛋白、纤粘蛋白)，可以促进血小板大量分泌有促进伤口、组织愈合及细胞再生的多种生长因子，所以PRP也叫做富含生长因子血浆(plasma-richgrowthfactors，PRGFs))。PRP具有迅速止血、止痛、加速伤口愈合的作用，可极大程度减轻术后疤痕的形成，从上世纪九十年代中期开始，被广泛应用于各种外科手术、心脏手术以及整形手术，目前亦广泛用于医学美容方面。PRP抗衰老修复的原理，是根据生长因子的强大再生力量，促使肌肤新生而成。PRP中主要生长因子成分为①TGF(变形生长因子)：促进血管上皮细胞修复再生；②FGF(纤维细胞生长因子)：激发新活细胞，加速组织修复；③EGF(表皮生长因子):修复上皮细胞，加速血管生长，加快组织修复；④PDGF(血小板衍生生长因子):产生胶原蛋白，促进血管生长，激活细胞再生；⑤VEGF(血管内皮生长因子):强力修复组织，产生胶原蛋白，激生透明质酸。脐血PRP分泌各种因子含量能力更强及脐血血浆富含的生长因子更强大，同一血型的脐血PRP止血、止痛、加速伤口愈合的作用及医学美容方面会慢慢体现。

《科学》杂志公布的2014年年度十大科学突破第二项为：年轻者的血液修复年迈者的健康问题。研究人员证明，来自年轻小鼠的血液，甚或只是来自年轻小鼠血液中的一个叫做GDF11的因子，能够让较老迈的小鼠的肌肉和大脑“返老还童”，而GDF11因子是血浆中的一种成分，此项发现开启了阿尔茨海默氏症患者接受年轻捐赠人的血浆等多项临床试验。相对于年轻人血浆，脐血血浆富含更多、更原始的各种因子，治疗效果毋庸置疑比年轻人血浆效果好。近期在细胞培养上很多用脐血血清代替胎牛血清，并取得非常满意的效果。脐血血浆临床及科研应用会越来越广，所以在分离脐血细胞时高质量分离出脐血血浆非常有价值。

脐血中含有大量的干细胞，干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体。这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。随着科技的发达，利用脐带血中的干细胞可治疗多种疾病。脐带血中含有非常丰富的造血干细胞(HSC)，可以重建人体造血和免疫系统，可用于造血干细胞移植，治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性及先天性疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，已经被广泛地应用于临床，是宝贵的人类生物资源。

在分离脐血细胞同时分离分离出脐血PRP、脐血血浆，具有很大的临床应用价值，现有技术中尚没有涉及同步分离三种成分的技术，本试剂盒满足了同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞，填补了技术上的空白。采用本申请所述的分离试剂盒以及分离方法，不仅可使脐血PRP中血小板浓度增加一倍多，红细胞数成数量级较少；并且分离获得的脐血血浆纯度高，镜检下几乎没有红细胞、血小板、单个核细胞和粒细胞；再者，分离获得的脐血细胞纯度可达到95％以上，红细胞和血小板残留率小，极大地避免了由于上述组分导致的过敏风险；而且与常规分离技术相比，在分离脐血细胞步骤中降低了一半分离试剂的使用剂量，有效降低分离成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞试剂盒及使用方法，采用本试剂盒同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞，填补了技术上的空白。

本发明首先提供一种脐血细胞分离液，是将40％聚蔗糖液或粉状Fi-coll-400以Hank’s液配制成浓度为9％聚蔗糖液；再将60％复方泛影葡胺注射液以Hank’s液配制成浓度为34％的复方泛影葡胺溶液，最后将聚蔗糖液和复方泛影葡胺溶液按体积比50：19.11的比例混合，0.22μm过滤除菌制成脐血细胞分离液。

作为优选，分离液的质量浓度为1.075±0.001g/ml，

上述的脐血细胞分离液用于制备用于脐带血分离的试剂盒；

上述的试剂盒，包含有A号稀释液、B号分离液和C号液为洗涤液；

上述的试剂盒还包含有耗材；

所述A号稀释液，是PBS溶液，其pH7.4±0.1；

作为优选，A号稀释液还添加有人血白蛋白，其中人血白蛋白添加的体积比终浓度为1-3％；

其中脐血血浆的制备方法，是将脐带血在2000-2500rpm离心20-30分钟后，吸取上层血浆获得的。

所述C号洗涤液为0.9％生理盐水或pH7.4±0.1不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液。

利用上述的试剂盒可同步分离脐血中的脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞，包括如下的步骤：

1)血浆初分离：

将脐带血分装到离心管a中，2000-2500rpm离心20-30分钟后，吸取上层血浆和少量血小板层到离心管b中；

2)脐血细胞初分离：

向步骤1)的离心管a中加入A号液，充分混匀后，再沿管壁加入到加有B号液的离心管中，2000-2500rpm离心20-30分钟后使溶液分成四层；收集第一层到离心管c中，把第二层细胞放入离心管d中，用C号液混匀离心管d后，以1800-2000rpm离心5-10分钟，弃去上清留沉淀重新用C号液悬起，重复洗涤得脐血细胞；

3)血浆二次纯化：

将离心管b和离心管c以2000-2500rpm离心5-10分钟后，吸取离心管b上清液即为脐血血浆

4)脐血PRP的浓缩：

去除离心管c的上清液，将离心管b和离心管c的沉淀用脐血血浆悬浮即为脐血PRP。

作为优选，步骤2)制备的脐血细胞进行二次纯化：向步骤2中获得的脐血细胞的离心管d中加入A号稀释液，吸管吹打均匀后沿管壁加入到事先加有B号液的离心管中，2000-2500rpm离心20-30分钟后使溶液分成四层，收集第二层细胞放入离心管中，加入C号液充分混匀，以1800-2000rpm离心5-10分钟，弃去上清留沉淀重新悬起，重复洗涤既得所需二次纯化脐血细胞。

本发明通过脐血PRP两部分浓缩，血小板浓度增加一倍多，红细胞数成数量级较少；通过血浆二次纯化，分离获得的脐血血浆纯度高，镜检下几乎没有红细胞、血小板、单个核细胞和粒细胞；通过脐血细胞二次纯化，分离获得的脐血细胞纯度可达到95％以上，红细胞和血小板残留率小，极大地避免了由于上述组分导致的过敏风险；分离第一步血浆初分离，与常规分离技术相比，在分离脐血细胞步骤中降低了一半分离试剂的使用剂量，有效降低分离成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：制备用于同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞的试剂盒

1、试剂配制

本发明用于分离外周血单个核细胞的试剂盒包括以下试剂：

(1)A号液：稀释液为PBSpH7.4±0.1，不含Ca²⁺和Mg²⁺，其中加入1-3％人血白蛋白；其中PBS溶液的配制方法如下：

母液的配制：

0.2MNa₂HPO₄：称取71.6gNa₂HPO₄-12H₂O，溶于1000ml水

0.2MNaH₂PO₄：称取31.2gNaH₂PO₄-2H₂O，溶于1000ml水

先配0.2MPB(pH＝7.4，100ml)：取19ml0.2mol/L的NaH₂PO₄，81ml0.2mol/L的Na₂HPO₄,即可。

然后将0.2MPB(pH＝7.4)按如下稀释即0.01MPB(PH＝7.4)：取50ml0.2MPB，加入NaCl至0.9％(g/100ml)，离子水定容至1000ml，调节pH为7.2，高压灭菌制成。

(2)B号液为分离液：将40％聚蔗糖液或粉状Fi-coll-400以Hank’s液配制成9％聚蔗糖液，为A液，密度为1.028g/ml；将60％复方泛影葡胺注射液以Hank’s液配制成34％溶液，为B液，密度为1.198g/ml；然后根据公式：d＝(dAVA+dBVB)/(VA+VB)(d和V分别为溶液的密度和体积)，将A液和B液按50：19.11的比例混合，混合液的密度为1.075±0.001g/ml，0.22微米一次性过滤器过滤除菌，此为脐血细胞分离液。

(3)C号液为洗涤液：0.9％生理盐水或pH7.4±0.1的PBS。

2、耗材包括50ml一次性离心管10支，15ml一次性离心管18支，10ml一次性移液管6支，3ml巴氏吸管2支。密封无菌包装。

3、各组分的分装

试剂盒规格为1次/盒，讲述试剂组分按提取所需量进行分装，包装后获得用于同步分离脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞试剂盒。

实施例2：B号液分离液密度对脐血细胞分离效果的影响

三种密度分离液的配制：将40％聚蔗糖液或粉状Fi-coll-400以Hank’s液配制成9％聚蔗糖液，为A液，密度为1.028g/ml；将60％复方泛影葡胺注射液以Hank’s液配制成34％溶液，为B液，密度为1.198g/ml；然后根据公式：d＝(dAVA+dBVB)/(VA+VB)(d和V分别为溶液的密度和体积)，将A液和B液分别按50:18.29、50：19.11、50：20.25的比例混合，0.22微米一次性过滤器过滤除菌，分别配制成密度为1.073±0.001g/ml、1.075±0.001g/ml、1.077±0.001g/ml的分离液。取一份120ml左右的脐血，平均分成三份分别采用三种分离液分离脐血细胞，分别标记为073、075、077，调整三种细胞浓度约为1×10⁶个/ml，分别取100μl，加入包括CD34-PE、CD45-FITC、CD14-APC、CD3-PerCP等特异性荧光直标单抗100μl。三种细胞悬液再分别取100μl加入荧光标记的无关单抗作为对照。流式细胞仪检测得细胞表型结果，将CD34⁺、CD45⁺和CD14⁺做为脐血细胞群标记。

表1：三种密度的分离液分离脐血细胞的表型比较

从上表中可看到，使用密度为(1.0750±0.0001)g/mL的分离液可得到较高比例的脐血细胞群，密度为(1.0750±0.001)g/mL的分离液是分离脐血细胞的理想介质。

实施例3：本发明方法的具体描述

取脐血120ml，分装到3支50ml离心管a中，2500rpm离心20min，脐血明显分成两层：上层为血浆和少量血小板，下层为红细胞、粒细胞和大量血小板层。用10ml吸管吸取上层血浆和少量血小板层到两支50ml离心管b中。向离心管a中加入1.5倍“红细胞、粒细胞和大量血小板层”的A号液，充分混匀后，小心沿管壁加入到15支事先加有7mlB号液的15ml离心管中，2500rpm离心20min后，此时离心管中由上至下细胞分为四层，第一层：A号液和大量血小板层，第二层：为富含脐血细胞层，第三层：为透明B号液层，第四层：为红细胞和粒细胞层；用3ml巴氏吸管轻轻收集第一层吸取到两支50ml离心管c中，把第二层细胞吸入一支50ml离心管d中，用C号液充分混匀离心管d后，以2000rpm离心5min，弃去上清留沉淀重新用C号液悬起，重复洗涤2次既得所需脐血细胞。离心管b和离心管c以2000rpm离心5min后，吸取离心管b上清液即为脐血血浆，去除离心管c上清液，离心管b和离心管c沉淀用5ml脐血血浆悬浮即为脐血PRP。分离的脐血细胞悬液进行高倍镜检观测，残留红细胞数目＞2个/HP，则故采用二次纯化。向步骤2中获得的脐血细胞的离心管d中加入A号稀释液20ml，10ml吸管吹打均匀后小心沿管壁加入到事先加有7mlB号液的3支15ml离心管中，2500rpm离心20min后，此时离心管中由上至下细胞分为四层，用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入离心管中，加入C号液充分混匀，以2000rpm离心5min，弃去上清留沉淀重新悬起，重复洗涤2次既得所需二次纯化脐血细胞。所得二次纯化脐血细胞用C号液重悬，高倍镜下检查复验，残留红细胞≤1个/HP，提示纯化成功。对分离的脐血PRP、脐血血浆和脐血细胞进行细菌、真菌和支原体、内毒素检测，结果均为阴性；台盼蓝染色检测脐血细胞存活率为98.6％，均合格。

Claims

1.一种脐血细胞分离液，其特征在于，所述的脐血细胞分离液是将40％聚蔗糖液或粉状Fi-coll-400以Hank＇s液配制成浓度为9％聚蔗糖液；再将60％复方泛影葡胺注射液以Hank’s液配制成浓度为34％的复方泛影葡胺溶液，最后将聚蔗糖液和复方泛影葡胺溶液按体积比50：19.11的比例混合，0.22μm过滤除菌制成脐血细胞分离液。

2.如权利要求1所述的脐血细胞分离液，其特征在于，所述的分离液的质量浓度为1.075±0.001g/ml。

3.权利要求1或2所述的脐血细胞分离液在制备用于脐带血分离的试剂盒中的应用。

4.一种用于脐带血分离的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有A号稀释液、B号分离液和C号液为洗涤液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的A号稀释液为PBS溶液，其pH7.4±0.1。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的A号稀释液添加有人血白蛋白，其中人血白蛋白添加的浓度为1-3％。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的C号液为0.9％生理盐水或pH为7.4±0.1的PBS溶液。

8.权利要求4-7任一项所述的试剂盒还包含有耗材。

9.一种使用权利要求8所述的试剂盒制备脐血血浆的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：

1)血浆初分离：

2)脐血细胞初分离：

3)血浆二次纯化：

4)脐血PRP的浓缩：

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)制备的脐血细胞进行二次纯化，是向步骤2)中获得的脐血细胞的离心管d中加入A号稀释液，吸管吹打均匀后沿管壁加入到事先加有B号液的离心管中，2000-2500rpm离心20-30分钟后使溶液分成四层，收集第二层细胞放入离心管中，加入C号液充分混匀，以1800-2000rpm离心5-10分钟，弃去上清留沉淀重新悬起，重复洗涤既得所需二次纯化脐血细胞。