NO323849B1 - Hepatitt G virus, polynukleotid, vektor, antistoff, antigen, anvendelse av nevnte antigen samt fremgangsmate for fremstilling av et hepatitt G virus polypeptid. - Google Patents

Abstract

Polypeptid antigener som er immunreaktive med sera fra individer med ikke-A, ikke-B, ikke-C, ikke-D, ikke-E. hepatitt, heri betegnet hepatitt G virus (HGV), er beskrevet. Tilsvarende genomisk-fragment kloner inneholdende polynukleotider kodende for åpen leseramme sekvenser for antigene polypeptider er beskrevet. Antigenene er nyttige for diagnostisering av fremgangsmåter for detektering av tilstedeværelse av HGV i testindivider. Antigenene er også nyttige i vaksiner og antistoff fremstillinger. Hele kodende sekvenser til to HGV isolater er beskrevet. Fremgangsmåter er presentert for nukleinsyre-basert deteksjon av HGV i prøver og også fremgangsmåter for isolering av ytterligere genomiske sekvenser som tilsvarer. HGV.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt-assosiert viralt middel (HGV), HGV polynukleotider, vektor, antistoff samt antigen. Oppfinnelsen vedrører også et diagnostisk sett for screening av kroppsfluid eller vevsprøve samt fremgangsmåte for screening av nevnte kroppsfluid eller vevsprøve. Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av nevnte antigen samt en vaksine sammensetning. Fremgangsmåte for fremstilling av et HGV polypeptid er også en del av foreliggende oppfinnelse.

REFERANSER

Abstracts, The 1992 San DiagofConf. : Ganatic

Recognition, Cl in. Chem. 29(4):705 (1993).

Alexander, W. A., et al., J. Virol. ££:2934-2942

(1992).

Alter, H.J., at al., New Eng. J. Mad. 32l;l494-isoo

(1989a).

Alter. M.J., et al., N. Engl. J. Med. 327:1899

(1989b).

Alter, H.J., Abstracts ot Int. Symp. on Viral

Hepatitis and Liver Dis., p. 47 (1993).

Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-10

(1990) .

Ascadi, G., et al., Nature 152:815 (1991).

Ausubel, F.M., et al., Corrctt Pr otocols^ ih Molecular

&IS14SX, John Wiley and Sons, Inc., Media PA.

Barany, F., PCR Matbods Appl. 1:5 (1991).

Bar han, w. B., et al., J. Mad. Virol. 12:129-132

(1994).

Baron, S., et al., JAMA 2ifi:1375 (1991).

Bazan, J. F., at al., Vlrology 171:637-639 (1989). Beaaes, et al., Biotechnigues 11:378 (1991).

Belyavsky, A., et al., Nuc. Aeids Ras. 12:2919-2932

(1989). v

Blackburn, G.F., et al., Clin. Chen. 37:1534-1539

(1991) . Bradley, O.W., et al., J. Znfec. Diéjtf148:2 (1983). Bradley, ■ D.W., et al., J Gan. virol., f9:1 (1988). Bradley, D.W. et al..', Proe. Nat. <*>£cå4* Sei., USA, 84:6277 (1987). *

Briand, J.-P., et al., J. Immunol. Heth. 156;255

(1992).

Cahill, P., et al., Cl in, Chem. 27:1482 (1991)* Carter, J.H., et ai., Methods Mol. Biol. 36:207-223

(1994).

Chambers, T.J., et al., Ann. Rev. Microbiol. il:649

(1990a).

Chambers, T.J., et al., PNAS fi7:8898 (1990b). Chomczynski et al, Anal. Biocham./162:159 (1987). Christian, R.B., et al., J. Mol. Biol. 227:771

(1992) .

Commandaeur, et al., Virology 12&:282-287 (1994).

Crea, R., U.S. Patent No. 4,888,286, issued December 19, 1989.

DeGraaf, M.E., et al., Gane 12&:l3 (1993). DiBisceglie, A.M., et al., Hepatology 649 (1992). DiBisceglie, A.H., et al., NEJM 321:1506 (1989). OiCesare, J., et al., Biotechniques 15:152-157

(1993) .

Dienstag, J.L., at al, Sam Livar Disaasa £:67 (1986).

Earl, P. L., et al., "Eacpression of proteins in nammalian cells using^vaccinia" In Currant Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. Eds.), Greene Publishing Associates * Wiley Interscience, New York

(1991).

Eaton, M. A. W., et al., U.S. Patent Ho. 4,719,180, issued Jan. 12, 1988.

Egholm, et al., Såtara 255.:366 (1993).

Elroy-Stein, 0., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 2£:6126-6130 (1989).

EPO patent application 88310922.5, filed 11/18/88. Falkner, F.G., et al., J. Virol. £2:1849-1854

(1988). * - V~- '<->

Farci, P., at al. jlMS^ H 32k.' BB^ 199i^.

Felgner and Rh ode a, Nature 212:551,(1991). Fickstt, J.W., Nuc. Acid& Jles. £& i5303^-5318 (1982). Fling, S. P., et al., Analytical Biocham. 155:83-88

(1986). ■

Folgori, A., et al., EMBO J. 11:2236 (1994). Francki, R.I.B., et al., Arch. Virol. Su<pp>l2:223

(1991).

Frank, R., and Doring, R., Tetrahedron 44:6031-6040

(1988).

Frohman, M.A., et al., Proe. Nati. Acaå. Sei. USA

£5:8998-9002 (1988).

Fuerst, T. R., et al., Proe. Nati. Acad./Sci. OSA

81:8122-8126 (1986).

Gel lissen, G., et al., Antanie Van Leeuvenftoe/c, £2(1-2):79-93 (1992).

Geysen, M., et al., Proe. Nati. Aoad. Sei. OSA

£1:3998-4002 (1984).

Gingeras, T.R., et al., Ann. Biol. clin. 48:498

(1990) .

Gingeras,.T.R., et ai., j. inf. Dis. 3, 64:1066 (1991). Goeddel, D.V,, Methods in Enzymology i£5 (1990). Grakoui, A., et al., J. Virol, £2:2832 (1993). Grakoui, A., et al., J". virol. £2:1385-1395 (1993). Guatelli, J.C., et al., Proe. Nati. Acad. Sel. i USA

£2:1874 (1990).

Gubler, U., et ai, Gene, 25:263 (1983).

Guthrie, C., and G.R. Fink, Methods in Enzymology 194

(1991) .

Gutteman, J.U., PNAS 21:1198 (1994).

Harlow» E., et al., ahtibodies: A Iaborm<q>r<y> mxotal. Cold

Spring Harbor Laboratory Press (1988).

Kaynes, J., et al., Nuc. Acid. Res. H:687-706

(1983).

Hieter, P.A., et ai., Cell 22:197-207 (1980). HijJJcata, M., et al., PNAS ££: 5547 (1991). Hocnuli, E., in Gamrie ewoiitraTMO-. Pife«eiML<g> *nd;

Practice. Vol. 12 (J. stelow Id.) Plenum, pp. 87-98

(1990).. • "' V* Holodniy, M., etVai., Biotøchnigims 12:36 (1992).^ Hopp, T.P., et al.; Proe. Nati. Acad. Sei. ØSA

22:3824-3828 (1981). 3

Horn, T., and Urdea, M.S., Nuc. Acids. Res. 11:6959

(1989) .

Houghten, R. A., Proe. Nati. Acad. sei. USA £2:5131

(1985).

Hudson, 0., J. Org. Chem. £1:617 (1988).

Irwin, M.J., at al., J. Virol. ££:5036 (1994).

Jacob, J.R., et al., in Tm molkchiah bioloo<y>/o<p> Hev. Section 4, pages 387-392 (1991).

Jacob, J.R., et al., Hepatology lfl:921-927 (1989). Jacob, J.R., et ai., J. Infect. Dis. 1£1:1121-1127

(1990) .

Janknacht, R., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA ££••8972-8976 (1991).

Kaufman, R. J., "Selection and coamplification of heterologous genes in manmalian cells," in Methods ln Enzymology, vol. 185, pp537-566. Academic Press, Inc., San Diego CA (1991).

Kakumu, S., et al. 4 Gastroenterol. 1££:507 (1993). Katz, E.D., and Dong, M., Biotechniques £:546 (1990).

Kawasaki, E.S., et al., in <p>cr Tbchkoloqy; P»iMciw.tts mto APPt-toTiows ar DNA AHPLi<g>reiTio» (H.A. Erlich, ed.) Stockton Press (1989).

King, L. A., et ai., The Jbaculovirus expression system. A laboratory guide, Chapman li Hall, London, New York, Tokyo, Melbourne, Madras, 1992.

■ Kyte, J., & Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. 1£Z:105-132 (1982).

Koohin, E.V., and Dolja, V.v., Critieal Raviaws in/ Bioche*. & Mol. Biol. 1£:375-430 (1993).

Krausslich, H.G., et al., Viral PRor<g>iaAsis as Takoets for cwemojhbrapy (Cold Spring Harbor Press, Plainyille, NY)

(1989).

Kumar, R., et al*, AIDS Res<*>. Human Retroviruses £(3) :34S-354 (1989).. * ^ v^i*". *

Lanford, R.E., et al.. Jn Vi tro CåhLlJ Dav. Biol. 2£:174-182 (1989). - * *

Larder, B.A., and Keap, S.D., Science 2i£:ll55

(1989).

Lau, Y.F., et al., Mol. Cell. Biol. 4:1469-1475

(1984).

Lomell, H., et al., Clin. Cheia/lfi:492 (1990).

Haniatis, T., et al., Holecular clohinq: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

Marshall, H.S., and Caruthers, M.H., Science 259:1564

(1993).

Messing, J., Methods in Enzymol. 101:20 (1983).

Michelle, et al., International Symposium on Viral Hepatitls.

Miller, J. H., EiwaiMEWTS in Moucuiah <g>ewbtics. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1972).

Morrissey, D.V., et al., Anal. Biochem. 121:345

(1989).

Moss, B.,/et al., CoRBiiWT Pbotocols im Molecplar Biology (Saction IV, Unit 16} (1991).

Moss, B.,'et al., U.S. Patent Number 5,135,855, . issued 4 August 1992.

Mullis, K.B., U.S. Patent No. 4,683,202, issued 28 July 1987.

Mullis, K.B., et al., U.S. Patent No. 4,683,195, issued 28 July 1987.

Obeid, O.E., et al., Virus Research 22/.69-84 (1994). Osikovicz, 6., et al., Clin* Chem. 2fi.:1586 (1990).

Patterson, J.L., and Fernandez-Larsson, R., Rev. Jnfect. Dis. 12:1139 (1990).

Pearson, W.R. and Lipaan,/D. J., PNAS B£:2444-2448

(1988).

Pearson, w.R., Methods in Enzymology 122:63-

98 (1990).

Pitha, Biochem Biophys Acta, 2flA:39 (1970a).

Pitha, Biopolymera, 2:965 (1970b).

Porath, J., Protein Exp. and Burifr 2:263 (1992).

Pritchard, C.G., and Stefano, J.E.iAnn. Biol. Chem. 42:492 (1990). *•* .'"^ . • <*>

Reichard, 0.,,eé al., Lancet ^:lo58 (1991).

Reilly, P.R., et al., BAfebLOvra<p>a <gyp>a<gg>sTow VxcraUs: A IAHORATOBY MAWOAL (1992) ,#

Reyes, 6., et al, Science, 247:1335 (1990)./'

Reyes, G., et al., Holecular and Cellular Probes 5_:473-481 (1991).

Rice, C.M., et al., New Biol. 1:285-296 (1989). Roberts, N.A., et al., Science 241:358 (1990). Romanos, K.A., et al., Yeast 1(6)-.423-488 (1992). Sanger, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74:5463

(1977).

Sambrook, J., et al., In Molecular cloking: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2 (1989).

Saiki, R.K., et al., Science 112:487-491 (1988). Schagger, H., et al. J Anal. Biochem. 166,:368-379

(1987).

Scharf, S. J., et al.. Science 233:1076 (1986).

Schuler, G.O., et al.. Proteinet Struc, Func. and Genet. £:180 (1989).

Scott, J.K., and Smith, G.P., Science 142:386 (1990).

Scott, J.K., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. VSA 22:5398 (1992).

Smith, D.B., et al., Gene £7:31 (1988).

Smith, J.P., Curr. Opin. Biotechnol. 2:668 (1991). Sreenivasan, M.A., et al., J. Gen. Virol. ££:1005

(1984).

Sumiyoshi, H., et al., J. Virol. ££«5425-5431 (1992).

Summerton, J., et al.J U.S. Patent Mo. 5,142,047, issued 08/25/92.

Summer ton, J., et al., U.S. Patent No. 5,185,444 issued 02/09/93.

Tam, A., et al., Virology 1££:120 (1991).

Tam, J.P., Proe. Nati. Acad. Sei. USA ££:5409 (1988). Tessier, 0. C, Gene ££: 177-183 (1991).

Tonkinson, J.L., and Stein, CA., Antiviral Chem. and Chemother. 4(4): 193-200 (1993).

Ulmer, et al., Scien. ee 222:1745 (1993).

Urdea, M., Clinx~ Ghem. l£:72S%*W9l).

Urdea, M., et;*!.., AIDS 2:Sll i<1993).

wages, J.M., et al., Amplifications^10:1-6 (1993). Walker, G.T., PCR Methods Appl. 2:1-6 (1993).

Wang, A.M., et al. in PCR Pr<q>t<p>cols; A gu tde to Mstho<p>s

and A<pp>liottohs (M.A. Innis, et ai., eds.) Acad em i c Press

(1990).

Wang, B., et ai., Proe. Nati, Acad. Sei. OSA 9£:4156

(1993).

Whetsell, A.J., et al., J. Clin. Micro. 30:845

(1992) .

Wolf, J.A., et al.. Nature 217:1465 (1990).

Vacca, J.P., et al., PNAS fili 4096 (1994).

VanGemen, B., et ai., J". Virol. Nethods 4Ji,;177

(1993) .

Valenzuela^ P., et al., Nature 2211344 (1982). Valenzuela, F., et al., in He<p>atitts b. eds. I.

Millman, et al., Plenum Press, pages 225-236 (1984).

Yarbrough, et al., J. Virol. 65:5790 (1991).

Yoo, B.J., et al., J. Virol. 61:32-38 (1995).

Yoshio, T., et al., U.Sv Påtent No. 4,849,350, issued

July 18, 1989.

Zhang, Y., et ai., J. Virol. £5.:6101-6110 (1991).

Viralt hepatitt som er et resultat av et virus forskjellig fra hepatitt A virus (HAV) og hepatitt B virus (HB V) er blitt referert til som ikke-A, ikke-B hepatitt (NANBH). NANBH kan bli ytterligere definert basert på overføringsmetoden til en individuell type, for eksempel, enterisk mot parenteral.

En form for NANBH, kjent som enterisk overført NANBH eller ET-NANBH, blir oppnådd fortrinnsvis i områder med dårlige sanitære forhold hvor mat og drikkevann er blitt kontaminert av avføringsstoffer. Molekylær kloning av forårsakende middel, referert til som hepatitt E virus (HEV), er nylig blitt beskrevet (Reyes et al., 1990; Tam et al.).

En annen form for NANB, kjent som parenteralt overført NANBH, eller PT-NANBH, er overført ved parenterale veier, vanligvis ved eksponering for blod eller blodprodukter. Raten til denne hepatitten har variert med (i) lokal, (ii) om ALT testing ble utført i blodblanker, og (iii) eliminering av pasienter med høy risiko for ATDS. Omtrent 10% av transfusjonene forårsaket PT-NANBH infeksjon og omtrent halvparten av disse gikk over til en kronisk sykdomstilstand (Dienstag). Etter implementering av anti-HCV testing, ble seroomdanning pr enhet transfusert redusert til mindre enn 1% blant hjertekirurgipasienter (Alter).

Humane plasmaprøver dokumentert å ha produsert post-transfusjons NANBH i humane mottagere er blitt anvendt med hell når det gjelder å produsere PT-NANBH infeksjon i sjimpanser (Bardley). RNA isolert fra infisert sjimpanseplasma er blitt anvendt for å konstruere cDNA bibliotek i en ekspresjonsvektor for immunscreening med serum fra humane individer med kronisk PT-NANBH infeksjon. Denne prosedyren identifiserer en PT-NANBH spesifikk cDNA klon og den virale sekvensen er blitt anvendt som en probe for å identifisere et sett av overlappende fragmenter som danner 7300 ved siden av liggende basepar av et PT-NANBH viralt middel. Det sekvenserte virale middelet er blitt betegnet hepatitt C virus (HCV) (for eksempel er sekvensen til HCV blitt presentert i EPO patentsøknad 88310922.5, inngitt 11/18/88). Full-lengde-sekvensen av (~ 9.500 nt) HCV er nå tilgjengelig.

Overføringsstudier i primater utført ved Centers for Disease Control (CDC; Phoenix, AZ, 1973-1975; 1978-1983) ga opprinnelig vesentlig bevis for eksistensen av multiple midler av ikke-A, ikke-B hepatitt (NANBH): primære midler assosiert med de fleste tilfellene av NANBH er nå bestemt til å være HCV og HEV (se ovenfor), for PT-NANBH ig ET-NANBH. Senere epidemiologiske studier utført ved CDC (Atlanta, GA, 1989-present) ved anvendelse av både forskning (prototype) og kommersielle tester for anti-HCV antistoffer viste at omtrent 20% av alle "NANBH" var også ikke-C. Ytterligere testing av disse prøvene for tilstedeværelse av HEV (Reyes, et al., WO A 9115603 (Genelabs, Inc) 17. oktober 1991) har indikert at disse tilfellene av "community-acquired" ikke-A, ikke-B, ikke-C hepatitt også var ikke-E.

Leverbiopsi prøver, sera og plasma fra Sentinel County pasienter (studie til Drs. Miriam Alter and Kris Krawczynski) viste også at mange bona fide tilfeller av NANBH var også ikke-C hepatitt (serologisk og revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR; Kawasaki, et al., Wang, et al., 1990) negative for alle markører av HCV infeksjon (utviklet deretter til kronisk hepatitt med presentasjon av kronisk vedvarende hepatitt (CPH) eller kronisk aktiv hepatitt (CAH) i samsvar med en viral infeksjon.

WO9000597 omhandler HCV sekvenser og peptider utledet derav. Nevnte sekvenser og peptider har liten grad av likhet med HGV sekvensene ifølge foreliggende oppinnelse.

Det er i W09521922 beskrevet tre ulike hepatitt virus, omtalt som HGBV-A, HGBV-B og HGBV-C, hvorav kun HGBV-A og HGBV-B kan regnes som kjent teknikk i forhold til foreliggende søknad.

Oppfinnelsen vedrører karakterisering og isolering av et nylig oppdaget ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E (N-(ABVDE)) hepatitt-assosiert viralt middel, heri betegnet hepatitt G virus (HGV). Videre innbefatter foreliggende oppfinnelse HGV polynukleotider i isolert form, inkludert de som er nyttig ved PCR deteksjon av et HGV. Oppfinnelsen vedrører også vektorer som omfatter hvilken som helst av de ovennevnte polynykleotider.

Studier av naturen til genomet til HGV, ved anvendelse av sekvensinformasjon for å sammenligne HGV med andre virale sekvenser, tyder på at HGV er et medlem av Flaviviridae familien av vimser.

Deler av HGV-avledede cDNA sekvenser er effektive som prober for å isolere varianter av viruset som oppstår naturlig, eller for å bestemme tilstedeværelse av virus i prøvene. Disse cDNA gjør også HGV-kodede polypeptidsekvenser tilgjengelige, inkludert HGV-spesifikke polypeptidantigener. Disse kodende sekvensene muliggjør produksjon av polypeptider som er nyttige som reagenser i diagnostiske tester og/eller som komponenter til vaksiner, eller som standarder. Det er videre mulig å isolere og sekvensere andre deler av HGV genomet ved anvendelse av prober avledet fra disse cDNA og som derfor gir opphav til ytterligere prober og polypeptider nyttige i profylaktiske, terapeutiske og diagnostiske applikasjoner.

Andre aspekter av oppfinnelsen innbefatter: et rekombinant ekspresjonssystem som innkorporerer en åpen leseramme (ORF) avledet fra HGV cDNA eller komplementer derav, hvori ORF er koblet operativt til en kontroll sekvens som er kompatibel med en ønsket vert.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er rensede HGV partikler; en vaksine sammensetning omfattende polypeptider fra renset HGV; et renset HGV polypeptid; et renset HGV peptid; og et renset polypeptid som omfatter en epitope immunologisk identifiserbar med en epitope innbefattet i HGV eller en HGV variant.

Innbefattende aspekter ifølge oppfinnelsen er et HGV polypeptid; et rekombinant polypeptid bestående av en sekvens avledet fra et HGV genom, HGV cDNA eller komplementer derav; et rekombinant polypeptid dannet av en HGV epitope; og et fusjonspolypeptid omfattende et HGV polypeptid.

Både polyklonale og monoklonale antistoffer rettet mot HGV epitoper innbefattet i polypeptidsekvensene er også nyttige som terapeutiske midler, for diagnostiske tester, for isolering av HGV middelet som er avledet fra nevnte cDNA og for screening av antivirale midler.

Også innbefattet i oppfinnelsen er et renset preparat av polyklonale antistoffer rettet mot en HGV epitope og monoklonale antistoffer rettet mot HGV epitoper.

Et videre aspekt ved oppfinnelsen vedrører et diagnostisk sett for screening av kroppsfluid eller vevsprøve for antistoffer spesifikke mot nevnte HGV.

Andre aspekter av oppfinnelsen er: en teknikk for produksjon av et HGV polypeptid som innbefatter inkubering av vertsceller som blir transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende en sekvens kodende for et HGV polypeptid under betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte polypeptid; og et polypeptid som er blitt produsert ifølge denne metoden (inneholdende for eksempel en HGV epitope).

Det er videre mulig å detektere HGV nukleinsyrer i prøver ved at nukleinsyrene i prøven blandes med en probe for et HGV polynukleotid under betingelser som muliggjør dannelse av en polynukleotiddupleks mellom proben og HGV nukleinsyren fra prøven. Det dannede polynukleotiddupleks inneholdende proben kan så detekteres. Eksempler på hybridiseringsbaserte deteksjonsmetoder er: reportermerking; polymerasekjedereaksjon; selv-vedvarende sekvensreplikasjon; ligase kjedereaksjon; og tråderstatningsamplifikasjon. Ytterligere deteksjonsmetoder innbefatter singal amplifikasjon (for eksempel gren-kjede DNA prober og Q-beta replikasemetoden.

Andre analysemetoder er immunanalyser, inkludert en immunoanalyse for detektering av HGV, omfattende inkubering av en prøve (som antas å være infisert med HGV) med et probeantistoff rettet mot en antigen/epitope av HGV, som skal bli detektert under betingelser som muliggjør dannelse av et antigen-antistoff kompleks; og detektering av antigen-antistoff komplekset som inneholder probeantistoffet. En immunoanalyse for detektering av antistoffer som er rettet mot et HGV antigen omfattende inkubering av en prøve antatt å inneholde HGV med et probepolypeptid innbefattende en epitope av HGV, under betingelser som muliggjør dannelse av et antistoff-antigenkompleks; og skjelning av antistoff-antigen komplekset som inneholder probeantigenet.

HGV vaksiner, for behandling og/eller forhindring av HGV infeksjon, omfattende et immunogent peptid inneholdende en HGV epitope, eller et inaktivert preparat av HGV, eller et redusert preparat av HGV, eller et redusert preparat av HGV, omfatter også en del av oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også et HGV mosaikk polypeptid hvor mosaikk polypeptidet inneholder minst to epitoper av HGV og hvor polypeptidet vesentlig mangler aminosyrer som normalt er i mellom epitopene i nativ HGV kodende sekvens. Slike mosaikk polypeptider er nyttige i anvendelser og fremgangsmåtene angitt ovenfor.

En tilfeldig peptidepitope (mimitope) er en epitop som etterligner en naturlig HGV antigen epitop i løpet av epitope presentasjonen. Slike mimitoper kan være nyttige i anvendelser og metodene diskutert ovenfor. I en fremgangsmåte for identifisering av en tilfeldig peptid HGV epitope blir et bibliotek av tilfeldige peptidepitoper dannet eller selektert. Biblioteket blir kontaktet med et anti-HGV antistoff. Mimitoper blir identifisert og disse er spesifikt immunreaktive med antistoffet. Sera (inneholdende anti-HGV antistoffer) eller antistoffer dannet ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt. Tilfeldige peptidbibliotek kan, for eksempel, bli utvist på fag eller dannet som kombinatoriske bibliotek.

Disse og andre hensikter og trekk ifølge oppfinnelsen vil fremkomme når følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen blir lest i sammenheng med vedlagte tegninger.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: forholdet mellom SEQ ID NO: 14 åpne leserammen og 470-20-1 klonen. Figur 2: viser et eksempel på protein profilen fra gradientfraksjoner eluert fra en glutation affinitetskolonne. Figur 3: viser et eksempel på natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforeseanalyse av fraksjonsprøver fra figur 2. Figur 4A: viser et eksempel på proteinprofilen fra gradi entfraksj oner eluert fra en anionbytte kolonne. Figurene 4B og 4C: viser eksempler på natriumdodecyl sulfat

polyakrylamidgelelektroforeseanalyse av fraksjonsprøver fra figur 4A.

Figurene 5 A og 5B: aminosyreoppstillinger av HGV med to andre medlemmer av Flaviviridae familien .. Hog Cholera Virus og Hepatitis C Virus. Figur 6 viser et kart av en del av vektoren pGEX-Hisb-GE3-2, et bakterielt ekspresjonsplasmid inneholdende en HGV epitope. Figurene 7A til 7D viser resultater av Western blot analyser av renset HGV GE3-2 protein. Figurene 8A til 8D viser resultater av Western blot analyser av renset HGV Y5-10 antigen. Figurene 9A til 9D viser resultater av Western blot analyser av følgende antigener: Y5-5, GE3-2 og Y5-10. Figurene 10A til 10F viser resultater av Western blot analyser av antigenene GE-NS2b og GE-NS5a. Figur 11 presenterer et Kyte-Doolittle hydrofobisitetsplott av den kodende sekvensen til

HGV.

Figur 12 viser resultater av Western blot analyser av HGV pET kloner med anti-T7.Tag monoklonalt antistoff. Figurene 13 A til 13D viser resultater av Western blot analyser av HGV pET klonen GE-NS5b. Figur 13E viser en korresponderende coomassie farvet gel. Figurene 14A til 14C viser resultater av Western blot analyser av HGV pET klon GE-E2. Figur 14D viser en korresponderende coomassie farvet gel. Figurene 15A til 15C viser resultater av Western blot analyser HGV pET klon GE-NS5b. Figur 15D viser en korresponderende coomassie farvet gel.

Figur 16 viser en skjematisk representasjon av de kodende regionene til HGV.

I. Definisjoner

Betegnelsen definert nedenfor har følgende betydning heri:

1. ikkeA/ikkeB/ikkeC/ikkeD/ikkeE hepatitt viralt middel {N-)ABCDE)} heri betegnet HGV, betyr et virus, en virustype eller en virus klasse som (i) overførbar i noen primater, inkludert mystaks, sjimpanser eller mennesker, (ii) er serologisk forskjellig fra hepatitt A virus (HAV), hepatitt B virus (HBV), hepatitt C virus (HCV), hepatitt D virus og hepatitt E (HEV) (til tross for at HGV også kan infisere et individ med disse virusene) og (iii) er et medlem av virusfamilien Flaviviridae. 2. "HGV varianter" er definert som virale isolater som har minst omtrent 40%, fortrinnsvis 55 eller 65%, eller fortrinnsvis 80% global sekvenshomologi, dvs. sekvensidentitet over en lengde av den virale genom polynukleotidsekvensen, til HGV polynukleotidsekvensene beskrevet heri (for eksempel SEQ ID NO: 14).

"Sekvenshomologi" blir vesentlig bestemt som følger. To nukleotidsekvenser med lignende lengde (fortrinnsvis hele det virale genomet) antas å være homolog med hverandre hvis, når de er oppstilt ved anvendelse av ALIGN programmet, og i 40%, fortrinnsvis 55 eller 65%, eller fortrinnsvis 80% av nukleinsyrene i høyest scorende oppstilling eller identisk oppstilt ved anvendelse av en ktup på 1, forsømmelsesparametere og forsømmelses PAM matrise.

ALIGN programmet finnes i FASTA versjon 1.7 suite of sequence comparison programs (Pearson, et al., 1988; Pearson, 1990; programmet er tilgjengelig fra William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville,

VA).

Ved bestemmelse av om to vimser er "sterkt homologe" med hverandre er den fullstendige sekvensen til alle virale proteiner (eller polyproteinet) for et et vims optimalt, globalt oppstilt med virale proteiner eller polyproteinet til det andre vimset ved anvendelse av ALIGN programmet av ovennenvnte type ved anvendelse av en ktup på 1 forsømmelses (default) parametere og forsømmelses PAM matrise. Regioner uten likhet eller med likhet blir ikke ekskludert fra analysen. Forskjeller i lengde mellom de to sekvensene blir betraktet som feilparringer. Alternativt blir virale strukturelle proteinregioner vanligvis anvendt for å bestemme forholdet mellom virale isolater. Sterkt homologe vimser har over 40%, eller fortrinnsvis 55 eller 65%, eller mere foretrukket 80% global polypeptidsekvens identitet. 3. To nukleinsyrefragmenter er betraktet å være "selektivt hybridiserbare" med et HGV polynukleotid dersom de har evne til å spesifikt hybridisere til HGV eller en variant derav (for eksempel en probe som hybridiserer til HGV nukleinsyren, men ikke til polynukleotider fra andre medlemmer av vimsfamilien Flaviviridae) eller spesifikk priming av en polymerasekjedereaksjon: (i) under typiske hybridiserings- og vaskebetingelser, som beskrevet for eksempel i Maniatis, et al., sidene 320-328, og 382-389, (ii) ved anvendelse av redusert stringens vaskebetingelser som muliggjør at ikke mer enn omtrent 25-30% basepar feilparringer, for eksempel: 2 x SSC, 0,1% SDS, romtemperatur to ganger, 30 minutter hver; deretter 2 x SSC, 0,1% SDS, 37°C. En gang, 30 minutter; deretter 2 x SSC romtemperatur to ganger, 10 minutter hver, eller (iii) selektering av primere for anvendelse i typiske polymerasekjedereaksjoner (PCR) under standardbetingelser (for eksempel i Saiki, R.K., et al.), som resulterer i spesifikk amplifikasjon av HGV sekvenser eller varianter derav.

Det er foretrukket at sterkt homologe nukleinsyretråder inneholder mindre enn 20-30% basepar feilparringer, mer sannsynlig mindre enn 5-20% basepar feilparringer. Denne homologigraden kan bli valgt ved anvendelse av vaskebetingelser med hensiktsmessig stringens for identifikasjon av kloner fra genbibliotek (eller andre kilder av genetisk materiale), som er velkjent innenfor dette fagområdet. 4. Et "HGV polynukleotid", som anvendt heri, er definert som følger: for polynukleotider som er større enn omtrent 100 nukleotider omfatter HGV polynukleotider polynukleotidsekvenser som blir kodet av HGV varianter og homologe sekvenser som definert i "2" ovenfor. For polynukleotider mindre enn omtrent 100 nukleotider i lengde omfatter HGV polynukleotidet sekvenser som selektivt hybridiserer til sekvenser av HGV eller varianter derav. HGV polynukleotider innbefatter polynukleotider kodende for HGV polynukleotider (se nedenfor). Betegnelsen "polynukleotid" som anvendt heri refererer til et polymerisk molekyl som har et skjelett som understøtter baser som har evne til hydrogenbinding til typiske nukleinsyrer, hvor polymerskj el ertet presenterer basene på en måte som muliggjør en slik hydrogenbinding i en sekvens spesifikk måte mellom det polymeriske molekylet og en typisk nukleinsyre (for eksempel enkel-trådet DNA). Slike baser omfatter vanligvis inosin, adenosin, guanosin, cytosin, uracil og thymidin. Mange polynukleotid modifikasjoner er kjent innenfor fagområdet, for eksempel, markører, metylering og substitusjon av en eller flere av naturlig forekommende nukleotider med en analog. Polymeriske molekyler innbefatter dobbelt og enkelt trådet RNA og DNA, og skjelettmodifikasjoner derav, for eksempel, metylfosfonat bindinger. Slike polymeriske molekyler innbefatter videre alternative polymerskj elettstrukturer så som, men ikke begrenset til, polyvinyl skjelett (Pitha, 1970a/b), morfolino skjelett (Summerton, et al., 1992, 1993). Forskjellige andre ladede og uladede polynukleotidanaloger er blitt rapportert. En mengde skjelett modifikasjoner er kjent innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til, uladede bindinger (for eksempel metylfosfonater, fosfotriestere, fosfoamiditer og karbamater) og ladede bindinger (for eksempel fosforotioater og fosforoditioater). I tillegg kan bindingene inneholde følgende eksempelvise modifikasjoner: utragende deler, så som proteiner (inkludert, for eksempel, nukleaser, toksiner, antistoffer, signalpeptider og poly-L-lysin); interkalerende forbindelser (for eksempel akridin og psoralen), chelatorer (for eksempel metaller, radioaktive metaller, bor og oksidative metaller), alkylatorer og andre modifiserte bindinger (for eksempel alfa anomeriske nukleinsyrer). 5. Et "HGV polypeptid" blir definert heri som et hvilket som helst polypeptid som er homologt med et HGV polypeptid. "Homologj", som anvendt heri, er definert som følger. I en utførelsesform er et polypeptid homologt med et HGV polypeptid dersom det blir kodet av nukleinsyren som selektivt hybridiserer til sekvensene av HGV eller dets varianter.

I en annen utførelsesform er et polypeptid homologt med et HGV polypeptid dersom det blir kodet av HGV eller dets varianter, som definert ovenfor, og polypeptider fra denne gruppen er vanligvis større enn 15, fortrinnsvis 25, eller mere foretrukket 35, kontinuerlige aminosyrer. For polypeptider som er lengre enn 60 aminosyrer blir sekvenssammenligninger for å bestemme "polypeptidhomologi" utført ved anvendelse av lokalt oppstillingsprogram LALIGN. Polypeptidsekvensen blir sammenlignet mot HGV aminosyresekvensen eller hvilke som helst av dets varianter, som definert ovenfor, ved anvendelse av LALIGN programmet med et ktup på 1, feilparametere og feil PAM.

Et hvilket som helst polypeptid (vanligvis et polypeptid som ikke er spesifikt immunreaktivt med HGV antistoffer) med en optimal oppstilling som er lengre enn 60 aminosyrer og større enn 65%, fortrinnsvis 70%, eller mere foretrukket 80% av identiske oppstillingsaminosyrer blir betraktet å være et "homologt polypeptid". LALIGN programmet finnes i FASTA versjon 1,7 suite of sequence comparison programs (Pearson, et al., 1988; Pearson, 1990; programmet er tilgjengelig fra William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville.

VA).

6. Et polynukleotid er "avledet fra" HGV dersom det har samme eller vesentlig samme baseparsekvens som en region av et HGV genom, cDNA av HGV eller komplementer derav, eller dersom det utviser homologi som angitt under "2", "3" eller "4" ovenfor.

Et polypeptid eller polypeptid "fragment" er "avledet fra" HGV dersom det er (i) kodet av en åpen leseramme av et HGV polynukleotid eller (ii) utviser homologi med HGV polypeptider som angitt under "2" og "5" ovenfor, eller (iii) er spesifikt immunreaktivt med HGV positivt sera. 7. "Vesentlig isolert" og "renset" blir anvendt i flere sammenhenger og refererer vanligvis til minst en delvis rensing av en HGV virus partikkel, komponent (for eksempel polynukleotid eller polypeptid), eller beslektet forbindelse (for eksempel anti-HGV antistoffer) bort fra urelaterte eller kontaminerende komponenter (for eksempel serumceller, protein, ikke-HGV polynukleotider og ikke-anti-HGV antistoffer). Fremgangsmåter og prosedyrer for isolering eller rensing av forbindelser eller komponenter av interesse er beskrevet nedenfor (for eksempel affinitetsrensing av fusjonsproteiner og rekombinant produksjon av HGV polypeptider). 8.1 foreliggende oppfinnelse angir betegnelsen "nukleinsyre sekvenser", når det refereres til sekvenser som koder for et protein, polypeptid eller peptid, degenerative nukleinsyresekvenser som koder for homologt protein, polypeptid eller peptidsekvenser samt den beskrevne sekvensen. 9. En "epitope" er den antigene determinanten definert som den spesifikke delen av et antigen som den antigenbindende delen av et spesifikt antistoff reagerer med. 10. Et antigen eller en epitope er "spesifikt immunreaktivt" med HGV positivt sera når epitopen/antigenet bindes til antistoffene tilstede i HGV infisert sera, men ikke bindes til antistoffer tilstede i det meste (mer enn omtrent 90%, fortrinnsvis mer enn 95%) av sera fra individer som ikke er eller ikke er blitt infisert med HGV. "Spesifikt immunreaktive" antigener eller epitoper kan også være immunreaktive med monoklonale eller polyklonale antistoffer dannet mot spesifikke HGV epitoper eller antigener.

Et antistoff eller en antistoff sammensetning (for eksempel polyklonale antistoffer) er "spesifikt immunreaktive" med HGV når antistoffet eller antistoffsammensetningen er immunreaktiv med et HGV antigen, men ikke med HAV, HB V, HCV, HDV eller HEV antigener. Videre er "spesifikke immunreaktive antistoffer" ikke immunreaktive med antigener som vanligvis er tilstede i normalt sera oppnådd fra individer som ikke er infisert med eller eksponert for HGV, HAV, HBV, HCV, HDV eller HEV.

n. N-( ABCDE^ SERA

Tilgjengeligheten av serologisk test for anti-HCV og utvikling av en RT-PCR analyse for HCV-RNA (Kawasaki, et al.; Wang, et al., 1990) muliggjorde identifikasjon av flere tilfeller med både post-transfusjon og community acquired ikke-HCV hepatitt. Det humane hepatitt tilfellet, PNF 2161, ble opprinnelig identifisert å haNANB hepatitt (NANBH) gjennom "Sentinel Counties Study of community acquired hepatitt, sponset av Centers for Disease Control and Prevention (Alter, et al., 1989b). PNF 2161 var en prøve oppnådd fra en eldre kaukasisk hannkjønnspasient som utviklet akutt hepatitt omtrent 8 uker etter en blodtransfusjon med et topp serum ALT nivå på 1141IU (normal <45 IU). Etter resolusjon av episoden med akutt hepatitt hadde han varierende, men vedvarende forhøyede ALT nivåer i løpet av de neste 7 årene, i samsvar med kronisk hepatitt, til tross for at histopatologisk bekreftelse av denne diagnosen ikke ble oppnådd.

Plasma prøvene anvendt for å klone HGV (som beskrevet heri) ble oppnådd juni 1989, omtrent 4 1/2 år etter episoden med akutt hepatitt, og kryokonservert. Pasient PNF 2161 ble opprinnelig antatt ikke å være infisert med HCV, basert på vedvarende negative resultater med en første generasjons immunoanalysetest (Ortho HCV ELISA Test System; Ortho Diagnostics, Raritan, NJ). Påfølgende testing ved anvendelse av en andre generasjon HCV immunoanalyse (Ortho) og PCR med HCV 5'-ikke-kodende region primere demonstrerte at pasienten var infisert med HCV.

Ul. Isolering av HGV assosierte sekvenser

Som en metode mot å identifisere kloner inneholdende HGV sekvenser ble et cDNA bibliotek dannet fra infisert HGV sera i ekspresjonsvektor lambda gtl 1 (eksempel 1). Polynukleotidsekvensene ble deretter selektert for ekspresjon av peptider som er immunreaktive med serum PNF 2161. Første runde screeningen ble vanligvis utført ved anvendelse av PNF 2161 serum (anvendt for å danne fagbibliotek). Det er også mulig å screene med andre antatte N-(ABCDE) sera.

Rekombinante proteiner identifisert i denne metoden angir kandidater for peptider som kan virke som substrater i diagnostiske tester. Nukleinsyrekodende sekvenser identifisert i denne metoden er nyttige hybridiseringsprober for identifikasjon av ytterligere HGV kodende sekvenser.

Sera beskrevet ovenfor ble anvendt for å danne cDNA bibliotek i lambda gtl 1 (eksempel 1). I fremgangsmåten illustrert i eksempel 1 ble infisert serum presipitert i 8% PEG uten fortynning, og bibliotekene ble dannet fra resulterende pelleterte virus. Sera fra infiserte humane kilder ble behandlet på samme måte.

Som et fordelaktig alternativ til PEG presipitering kan ultrasentrifugering bli anvendt for å pelletere partikkelformige midler fra infiserte sera eller andre biologiske prøver. For å isolere virale partikler hvorfra nukleinsyrer kan bli ekstrahert blir serum, varierende opp til 2 ml, fortynnet til omtrent 10 ml med PBS, sentrifugert ved 3K i 10 minutter og supernatanten sentrifugert maksimalt 2 timer ved 40.000 rpm (omtrent 110.000 x g) i en Ti70.1 rotor (Beckman Instruments, Fullerton, CA) ved 4°C. Supernatanten blir deretter utsugd og pelleten ekstrahert ved standard nukleinsyreekstraheringsteknikker.

cDNA bibliotek ble dannet ved en anvendelse av tilfeldige primere i revers transkripsjonsreaksjoner med RNA ekstrahert fra pelletert sera som utgangsmateriale. Resulterende molekyler ble ligert til Sequence Independent Single Primer Amplification (SISPA; Reyes, et al., 1991) linkerprimere og ekspandert på en ikke-selektiv måte, og

deretter klonet inn i en egnet vektor, for eksempel, lambda gtl 1, for ekspresjon og screening av peptidantigener. Alternativt kan lambda gtlO vektoren også bli anvendt.

Lambda gtl 1 er en spesielt nyttig ekspresjonsvektor som inneholder et unikt EcoRI innskuddssete 53 basepar oppstrøms for translasjons-termineringskodonettil 13-galaktosidasegenet. En innskutt sekvens blir følgelig uttrykt som et J3-galaktosidase fusjonsprotein som inneholder den N-terminale delen av 13-galaktosidasegenproduktet, det heterologe peptidet, og eventuelt den C-terminale regionen til 13-galaktosidasepeptidet (den C-terminale delen blir uttrykt når den heterologe peptidkodende sekvensen ikke inneholder et translasjons-termineringskodon).

Denne vektoren produserer også en temperatur-sensitiv repressor (cI857) som forårsaker viral lysogeni ved permissive temperaturer, for eksempel 32°C og fører til viral ly sering ved forhøy ete temperaturer, for eksempel 42°C. Fordelene med denne vektoren innbefatter: (1) sterk effektiv rekombinant klondannelse, (2) evne til å selektere lysogeniserte vertsceller på grunnlag av verts-celleveksten ved permissiv, men ikke ikke-permissive, temperaturer og (3) produksjon av rekombinant fusjonsprotein. På grunn av at fagen inneholdende et heterologt innskudd produserer et inaktivt 13-galaktosidaseenzym blir fag med innskudd vanligvis identifisert ved anvendelse av en kolorimetrisk substratomdanningsreaksjon som anvender J3-galaktosidase.

Eksempel 1 beskriver preparering av et cDNA bibliotek for N-(ABCDE) hepatitt sera PNF 2161. Biblioteket ble immunscreenet ved anvendelse av PNF 2161 (eksempel 3). Et antall lambda gtl 1 kloner ble identifisert og var immunreaktive. Immunpositive kloner ble plakk-renset og deres immunreaktivitet testet på ny. Immunreaktiviteten til klonene med normalt humant sera ble også testet.

Disse klonene ble også undersøkt for "eksogen" natur av den klonede innskuddssekvensen. Denne grunnleggende testen har ført til at det klonede fragmentet ikke representerer en del av humane eller andre potensielt kontaminerende nukleinsyrer (for eksempel E. coli, S. cerevisiae og mitochondria). Klon inskuddene ble isolert ved EcoRI spaltning etter polymerasekjede reaksjonamplifikasjon. Inskuddene ble renset, deretter radiomerket og anvendt som hybridiseringsprober mot membranbundet normalt humant DNA, normalt mystax DNA og bakterielt DNA (kontroll DNA) (eksempel 4A).

Klon 470-20-1 (PNF2161 cDNA kilder) var en av klonene isolert ved immunscreening med PNF 2161 serum. Klonen var ikke reaktiv med normalt humant sera. Klonen hadde en stor åpen leseramme (203 basepar; SEQ ID NO: 3), i ramme med 13-galaktosidasegenet til lambda gtl 1 vektoren. Klonen er eksogen ifølge genomisk DNA hybridiseringsanalyser og genomisk PCR analyser, ved anvendelse av humant, gjær og E. coli genomisk DNA (eksempel 4B).

Sekvensen var tilstede i PNF2161 serum som bestemt ifølge RT-PCR (eksempel 4C). RT-PCR av seriefortynnet PNF 2161 RNA tydet på at minst omtrent 10^ kopier av 470-20-1 spesifikk sekvens pr ml. Sekvensen ble også detektert i sukrose tetthetsgradi entfraksj oner i tettheter i samsvar med sekvensbindingen i assosiasjon med en virus-lignende partikkel (eksempel 5).

Bakterielle ly sater av E. coli som uttrykker en andre klon, klon 470-expl, (SEQ ID NO: 37) ble også vist å være spesifikt immunreaktiv med PNF 2161 serum med sammenlignbare nivåer med klon 470-20-1. Den kodende sekvensen til 470-expl var flankert av termineringskodoner (basert på sekvenssammenligninger med SEQ ID NO: 14, se også figur 1) og hadde en indre methionin.

Ytterligere sekvenser innbefattet i SEQ ID NO: 14, ved siden av klon 470-20-1, ble oppnådd ved anker polymerasekjede reaksjon (Anchor PCR) ved anvendelse av primere fra klon 470-20-1 (eksempel 6). I dette tilfellet ble et PNF 2161 2-cDNA kilde bibliotek anvendt som templat hvor cDNA/komplement dobbelt-trådede DNA produkter ble ligert til lambda armer, men blandingen ble ikke pakket.

470-20-1 spesifikke primere ble anvendt i amplifikasjonsreaksj onene med SISPA-amplifisert PNF 2161 cDNA som en templat (eksempel 4). Identiteten til amplifiserte DNA fragmenter ble bekreftet ved (i) størrelse og (ii) hybridisering med en 470-20-1 spesifikk oligonukleotidprobe (SEQ ID NO: 16). 470-20-1 spesifikt signal ble detektert i cDNA amplifisert ved PCR fra SISPA-amplifisert PNF 2161, som demonstrerer tilstedeværelse av 470-20-1 sekvenser i kildematerialet.

470-20-1 spesifikke primere ble også anvendt i amplifikasjonsreaksj oner med følgende RNA kilder som substrat: normal mystax lever RNA, normal tamarin (Sanguins laboratoris) lever RNA, og MYI31 lever RNA og MYI 31 lever RNA (eksempel 4). Resultatene fra disse eksperimentene demonstrerer at 470-20-1 sekvensene er tilstede i opphavsserumprøven (PNF 2161) og i RNA leverprøven fra et dyr eksponert for PNF 2161 prøven (MY131). Begge normale kontroll RNA var negative for tilstedeværelse av 470-20-1 sekvensene.

PNF 2161 serum og andre kloningskilder eller relaterte kildematerialer ble direkte testet ved PCR ved anvendelse av primere fra selekterte klonede sekvenser. Spesifikke amplifikasjonsprodukter ble detektert ved hybridisering til en spesifikk oligonukleotid probe 470-20-1-152F (SEQ ID NO: 16). Et spesifikt signal ble reproduserbart detektert i flere ekstrakter av PNF 2161, med 470-20-1 spesifikke primere.

Sykdoms assosiasjonen mellom HGV og leversykdommen er ytterligere understøttet av data presentert i eksempel 4F. Sera fra hepatittpasientene og fra bloddonorer med unormal leverfunksjon ble vurdert for tilstedeværelse av HGV ved RT-PCR screening ved anvendelse av HGV spesifikke primere. HGV spesifikke sekvenser ble detektert i 6/152 av disse seraprøvene. Ingen HGV positiver ble detektert blant kontrollprøvene (n = 11).

Resultatene presentert ovenfor indikerer isolering av et viralt middel assosiert med N-(ABCDE) viralinfeksjon av leveren (dvs. hepatitt) og/eller infeksjon, og resulterende sykdom, fra annet vev eller celletyper.

IV. YTTERLIGERE KARAKTERISERING AV HGV REKOMBINANTE

ANTIGENER.

A. Screening av rekombinante bibliotek.

Ytterligere kandidat HGV antigener kan bli oppnådd fra bibliotekene ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av screeningsmetodene beskrevet ovenfor. cDNA biblioteket beskrevet ovenfor er blitt deponert til American Type Culture Collection, 21301 Parklawn Dr., Rockville, MD, 20852, og er blitt tildelt følgende betegnelse: PNF 2161 cDNA kilder, ATCC 75268.

Et andre PNF 2161 cDNA bibliotek er blitt dannet vesentlig som beskrevet for førstePNF 2161 cDNA bibliotek med unntagelse av at andre PNF 2161 cDNA kildebibliotek ble ligert til lambda gtl 1 armene, men ikke pakket. Dette ikke-pakkede biblioteket ble anvendt for å oppnå ekstensjonsklonene beskrevet nedenfor. En pakkende versjon av dette andre biblioteket (PNF 2161 2-cDNA kildebiblioteket) er blitt deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 og er blitt tildelt følgende betegnelser: PNF 2161 2-cDNA kilde, ATCC 75837.

I tillegg til rekombinante bibliotek dannet ovenfor kan andre rekombinante bibliotek fra N-(ABCDE) hepatitt sera likeledes bli dannet og screenet som beskrevet heri.

B. EPITOPEKARTLEGGING, KRYSSHYBRIDISERING OG ISOLERING AV

GENOMISKE SEKVENSER.

Antigen kodende DNA fragmenter kan bli identifisert ved (i) immunscreening, som beskrevet ovenfor, eller (ii) dataanalyser av kodende sekvenser (for eksempel SEQ ID NO: 14) ved anvendelse av en algorithme (så som "ANTIGEN", Intelligenetics, Mountain View, CA) for å identifisere potensielle antigene regioner. Et antigen-kodende DNA fragment kan bli subklonet. Det subklonede innskuddet kan deretter bli fragmentert ved delvis DNase I spaltning for å danne tilfeldige fragmenter eller ved spesifikk restriksjonsendonuklease spaltning for å produsere spesifikke subfragmenter. De resulterende DNA fragmentene kan bli skutt inn i lambda gtl 1 vektoren og utsatt for immunscreening for å tilveiebringe et epitopekart av det klonede innskuddet.

I tillegg kan DNA fragmenter bli anvendt som prober i hybridiseringseksperimenter for å identifisere overlappende HGV sekvenser og disse kan igjen bli ytterligere anvendt som prober for å identifisere et sett av ved siden av liggende kloner. Dannelse av sett av ved siden av liggende kloner muliggjør bestemmelse av sekvensen til HGV genomet.

Hvilke som helst av ovennevnte klon sekvenser (for eksempel avledet fra SEQ ID NO: 14 eller klon 470-20-1) kan bli anvendt for å probe cDNA og DNA bibliotek, dannet i en vektor så som lambda gtlO eller "LAMBDA ZAPII" (Stratagene, San Diego, CA). Spesifikke subfragmenter av kjent sekvens kan bli isolert ved polymerasekjedereaksjonen eller etter restriksjonsendonukleasespaltning av vektorer inneholdende slike sekvenser. Resulterende DNA fragmenter kan bli anvendt som radiomerkede prober overfor et hvilket som helst selektert bibliotek. Spesielt er 5' og 3' terminale sekvenser av klon innskuddene nyttige som prober for å identifisere ytterligere kloner.

Sekvenser angitt ved 5-enden til klonede innskudd er nyttige som sekvens spesifikke primere i første-tråd cDNA eller DNA syntese reaksjoner (Maniatis et al.; Scharf et al.). Spesifikt primet PNF 2161 cDNA og DNA bibliotek kan bli dannet ved anvendelse av spesifikke primere avledet fra SEQ ID NO: 14 på PNF 2161 nukleinsyrene som et templat. Den andre tråden til ny cDNA blir syntetisert ved anvendelse av RNase H og DNA polymerase I. Ovennevnte prosedyrer identifiserer eller produserer DNA/cDNA molekyler som tilsvarer nukleinsyreregioner som er 5'ved siden av kjente klon innskuddssekvenser. Disse nye isolerte sekvensene kan igjen bli anvendt for å identifisere ytterligere flankerende sekvenser for å identifisere sekvenser bestående av hele genomet for HGV. Som beskrevet ovenfor kan, etter nye HGV sekvenser er blitt isolert, polynukleotider bli klonet og immunscreenet for å identifisere spesifikke sekvenser kodende for HGV antigener.

Ekstensjons klonsekvenser (SEQ ID NO: 14), inneholdende ytterligere sekvenser av interesse, er blitt oppnådd for klon PNF 470-20-1 (SEQ ID NO: 3) ved anvendelse av "Anchor PCR" metoden beskrevet i eksempel 6. Strategien består av ligering av PNF 2161 SISPA cDNA til lambda gtl 1 armer og amplifisering av ligeringsreaksjonen med en gtl 1-spesifikk primer og en av to 470-20-1 spesifikke primere.

Amplifikasjonsproduktene blir elektroforetisk separert, overført til filteret og DNA bundet til filtrene blir probet med en 470-20-1 spesifikk probe. Bånd som tilsvarer hybridiserings positive bånd signaler ble gelrenset, klonet og sekvensert.

C. PREPARERING AV ANTIGENE POLYPEPTIDER OG ANTISTOFFER

Rekombinante peptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli renset ved standard protein rensningsprosedyrer som kan innbefatte differensial presipitering, molekylær siktkromatografi, ione-bytte kromatografi, isoelektrisk fokusering, gelelektroforese og affinitetskromatografi.

Polynukleotidsekvenser som koder for antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være klonet i plasmid p-GEX (eksempel 7A) eller forskjellige derivater derav (pGEX-GLI). Plasmid pGEX (Smith et al., 1988) og derivatene derav uttrykker polypeptidsekvenser til et klonet innskudd koblet i-ramme til proteinet glutation-S-transferase (sj26). I en vektorkonstruksjon blir plasmid pGEX-hisB, en aminosyresekvens av 6 histidiner, innført ved karboksyterminusen til fusjonsproteinet.

De forskjellige rekombinante pGEX plasmidene kan bli transformert til hensiktsmessige stammer av E. coli og fusjonsprotein produksjonen kan bli indusert ved tilsetning av IPTG (isopropyl-tio-galaktopyranosid) som beskrevet i eksempel 7A. Solubilisert rekombinant fusjonsprotein kan deretter bli renset fra cellelysatene til induserte kulturer ved anvendelse av glutation agarose affinitetskromatografi (eksempel 7A).

Uoppløselig fusjonsprotein uttrykt av plasmid pGEX-hisB kan bli renset ved hjelp av immobilisert metallion affinitetskromatografi (Porath) i buffere inneholdende 6M urea eller 6M guanidiniumisotiocyanat og begge er nyttige for solubilisering av proteinene.

Alternativt uoppløselige proteiner uttrykt i pGEX-GLI eller derivater derav kan bli renset ved anvendelse av kombinasjoner av sentrifugering for å fjerne oppløselige proteiner etterfulgt av solubulisering av uoppløselige proteiner og standardkromatografiske metoder, så som ionebytte eller størrelseseksklusjonskromatografi, og andre slike metoder som er kjent innenfor fagområdet.

Når det gjelder J3-galaktosidase fusjonsproteiner (som de som blir produsert av lambda gtl 1 kloner) kan det fusjonerte proteinet lett bli isolert ved affinitetskromatografi, ved å sende cellelyseringsmaterialet over en fast bærer som har overflate-bundet anti-J3-galaktosidase antistoff. For eksempel er rensing av et J3-galaktosidase/fusjonsprotein, avledet fra 470-20-1 kodende sekvenser, ved affinitetskromatografi beskrevet i eksempel 7B.

Også innbefattet i oppfinnelsen er en ekspresjonsvektor, så som lanbda gtl 1 eller pGEX vektorer beskrevet ovenfor, inneholdende HGV kodende sekvenser og ekspresjonskontrollelementer som muliggjør ekspresjon av de kodende regionene i en egnet vert. Kontrollelementene innbefatter generelt en promoter, translasjonsinitieringskodon og translasjons- og transkripsjons-termineringssekvenser, og et innskuddssete for innføring av innskuddet i vektoren.

DNA kodende for ønsket antigent polypeptid kan bli klonet i et antall kommersielt tilgjengelige vektorer for å danne ekspresjon av polypeptidet i hensiktsmessig vertssystem. Disse systemer innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende: bakulovirus ekspresjon (Reilly, et al.; Beames, et al., Pharmingen; Clontech, Palo Alto, CA), vaksinia ekspresjon (Earl, 1991; Moss, et al.), ekspresjon i bakterier (Ausubel, et al.; Clontech), ekspresjon i gjær (Gellissen, 1992; Romanos, 1992M Goeddel; Guthrie and Fink), ekspresjon i pattedyrceller (Clontech; Gibco-BRL, Ground Island, NY) for eksempel kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinjer (Haynes, 1983, Lau, 1984, Kaufman, 1990). Disse rekombinante polypeptid antigenene kan bli uttrykt direkte eller som fusjonsproteiner. Et antall trekk kan bli omkonstruert inn i ekspresjonsvektorene, så som ledersekvenser som fremmer sekresjon av de uttrykte sekvensene i kulturmediet.

Ekspresjon av store HGV polypeptider ved anvendelse av flere av disse systemene er beskrevet i eksempel 16.

Ekspresjon i gjærsystemer har fordel ved kommersiell produksjon. Rekombinant proteinproduksjon ved vaksinia og CHO cellelinjen har fordelen av å være pattedyr ekspresjonssystemer. Vaksinia virus ekspresjon har flere fordeler som innbefatter følgende: (i) stort vertsområde; (ii) trygg post-transkripsjonell modifikasjon, prosessering, folding, transport, sekresjon og oppstilling av rekombinante proteiner; (iii) ekspresjon i høyt nivå av relativt oppløselige rekombinante proteiner; og (iv) en stor kapasitet til å huse fremmed DNA.

Rekombinant uttrykt polypeptid produsert HGV polypeptid antigener og blir vanligvis isolert fra lyserte celler eller kulturmedium. Rensingen kan bli utført ifølge fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet og omfatter saltfraksjonering, ionebytte kromatografi og affinitetskromatografi. Immunoaffinitetskromatografi kan bli anvendt ved anvendelse av antistoffer dannet basert på HGV antigener identifisert ifølge fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse.

HGV polypeptid antigener kan også bli isolert fra HGV partikler (se nedenfor).

Kontinuerlige antigene determinanter av polypeptider er generelt relativt små, vanligvis 6 til 10 aminosyrer i lengde. Mindre fragmenter er blitt identifisert som antigene regioner, for eksempel, i konformasjonelle epitoper. HGV polypeptid antigener blir identifisert som beskrevet ovenfor. Resulterende DNA kodende regioner til en av trådene kan bli uttrykt rekombinant enten som fusjonsproteiner eller isolerte polypeptider. I tillegg kan aminosyresekvenser hensiktsmessig bli kjemisk syntetisert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige syntetisatorer (Applied Biosystems, Foster City, CA) eller "PIN" technology (Applied Biosystems).

I en annen utførelsesform innbefatter foreliggende oppfinnelse mosaikk proteiner som består av multiple epitoper. Et HGV mosaikk polypeptid inneholder vanligvis minst to epitoper av HGV, hvor polypeptidet vanligvis mangler aminosyrer som normalt står i mellom epitopene i den native HGV kodende sekvensen. Syntetiske gener (Crea; Yoshio et al.; Eaton et al.) kodende for multiple, tandem epitoper kan bli konstruert og vil produsere mosaikk proteiner ved anvendelse av standard rekombinant DNA teknologi ved anvendelse av polypeptid ekspresjonsvektor/vertssystemer beskrevet ovenfor.

Multiple antigenpeptider kan bli syntetisert kjemisk ifølge fremgangsmåtene tidligere beskrevet (Tam, J.P., 1988; Briand et al.). For eksempel kan en liten immunologisk inert kjernematrise av lysinresidier med a- og e-aminogrupper bli anvendt for å forankre multiple kopier av samme eller forskjellige syntetiske peptider (vanligvis 6-15 residier i lengde) som representerer epitopene av interesse. Mosaikk proteinene eller multiple antigenpeptid antigener tilveiebringer høyere sensitivitet og spesifisitet i immunoanalyser på grunn av signal amplifikasjonen som er et resultat av fordeling av multiple epitoper.

Antigener oppnådd ifølge hvilke som helst av disse metodene kan bli anvendt for dannelse av antistoff, diagnostiske tester og vaksineutvikling.

I et annet aspekt innbefatter oppfinnelsen spesifikke antistoffer rettet mot polypeptidantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse. Antigener oppnådd ifølge hvilke som helst av disse metodene kan bli direkte anvendt for dannelse av antistoffer eller kan bli koblet til hensiktsmessige bærermolekyler. Mange slike bærere er kjent innenfor fagområdet og er kommersielt tilgjengelige (for eksempel Pierce, Rockford IL). Vanligvis, for å danne antistoffer blir et vertsdyr, så som en kanin, immunisert med renset antigen eller fusjonert protein antigen. Hybrider, eller fusjonerte, proteiner kan bli dannet ved anvendelse av forskjellige kodende sekvenser avledet fra andre proteiner, så som glutation-S-transferase eller J3-galaktosidase. Vertsserum eller plasma blir samlet etter et hensiktsmessig tidsintervall, og dette serumet blir testet for antistoffer spesifikke for antigenet. Eksempel 8 beskriver produksjon av kanin serum antistoffer som er spesifikke mot 470-20-1 antigenet i Sj26/470-20-l hybridproteinet. Disse teknikkene er like anvendbare for alle immunogene sekvenser avledet fra HGV, inkludert, men ikke begrenset til, de som er avledet fra den kodende sekvensen presentert som SEQ ID: 14.

Gammaglobulin fraksjonen eller IgG antistoffene til immuniserte dyr kan bli oppnådd, for eksempel, ved anvendelse av mettet ammoniumsulfat presipitering eller DEAE Sephadex kromatografi, affinitetskromatografi eller andre teknikker kjent for fagfolk innenfor dette området for å produsere polyklonale antistoffer.

Alternativt kan renset antigen eller koblet antigen protein bli anvendt for produksjon av monoklonale antistoffer. Her blir milten eller lymfocyter fra et immunisert dyr fjernet og udødeliggjort eller anvendt for å danne hybridomer ifølge fremgangsmåter kjent for fagfolk innenfor dette området. For å produsere et human-avledet hybridom blir en human lymfocytdonor valgt. En donor kjent for å være infisert med en HGV kan virke som en egnet lymfocytdonor. Lymfocytene kan bli isolert fra en perifer blodprøve. Epstein-Barr virus (EBV) kan bli anvendt for å udødeliggjøre humane lymfocyter eller en egnet fusjonspartner kan bli anvendt for å produsere human-avledede hybri domer. Primær in vitro sensibilisering med virale spesifikke polypeptider kan også bli anvendt for dannelse av humane monoklonale antistoffer.

Antistoffer utskilt av udødeliggjorte celler blir screenet for å bestemme kloner som utskiller antistoffer med ønsket spesifisitet, for eksempel, ved anvendelse av ELISA eller Western blot metoden (eksempel 10; Ausubel et al.).

Ved anvendelse av HGV-positivt serum eller plasma, eller antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan andre antigene peptider og epitoper bli isolert. For eksempel er det blitt utviklet et antall forskjellige teknikker for samtidig syntese av mange peptider (Geysen, et al.; Houghten; Frank and Doring; Hudson). Fremgangsmåten utviklet av Geysen, et al., er spesielt nyttig på grunn av den relative spesifisiteten hvorved store antall forskjellige peptidsekvenser kan bli dannet og testet for antigenisitet. I metoden til Geysen (også referert til som MULTI-PIN peptid syntesen) blir peptidene syntetisert på polyakrylamidsyre podede polyetylenstaver koblet til en mikro-titerskål. MULTI-PIN strategien muliggjør at et stort antall synteser (96 peptider pr skål) blir immunologisk screenet ved anvendelse av de polyklonale eller monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse og kommersielt tilgjengelige reagenser og instrumentering. Immunoreaktive peptider blir her identifisert og karakterisert.

Det er blitt rapportert at opp til 6000 oligopeptider kan bli syntetisert i løpet av 2 uker og gjør det følgelig praktisk (ved størrelsesbestemmelse av alle mulige overlappende aminosyresekvenser til et bestemt antigen) å screene virale antigensekvenser for epitoper for bestemmelse av en enkelt aminosyre (Geysen, et al.).

En alternativ metode for scanning av immunodominante peptider er å syntetisere lengre peptider (for eksempel 10 til 30 aminosyrer) som tilsvarer HGV kodende sekvenser ved anvendelse av konvensjonell automatisert peptidsyntese (Carter et al., 1994; Obeid, et al., 1994; Commandeur, et al., 1994). Denne metoden har den fordelen at lengre peptider kan bli foldet til former som etterligner konformasjonsepitoper.

HGV antistoffer, spesielt, monoklonale antistoffer, kan bli anvendt for å identifisere tilfeldige polypeptider som etterligner deres virus-kodede målpolypeptider (Scott and Smith, 1990; Smith, 1991). For eksempel kan tilfeldige peptidbiblioteker utvist på fag (RPL) (Scott and Smith, 1990) bli anvendt som en kilde for peptidligander for antistoffdannelse eller for utvikling av vaksiner. RPL metoden muliggjør ekspresjon av peptid-ligand inneholdende fusjonsproteiner på fagoverflaten og anrikning av disse ligand kodende fagene ved affinitetsseleksjon ved anvendelse av antistoffene (Smith, J.P., 1991; Christian, et al.; Scott, et al., 1992; Folgori, et al.). Disse tilfeldige peptidepitopene detektert av spesifikke antistoffer etterligner de naturlige antigene epitopene (mimotoper) i løpet av epitope presentasjonen. HGV antigener etterligninger (mimotoper) kan bli isolert fra RPL. Heksa- til dekapeptid fagotop (mimotope utvist på fag) uttrykkende RPL kan bli dannet ifølge publiserte metoder (Scott and Smith; Smith, J.P, 1991; Christian, et al,; Scott, et al.; DeGraaf, et al.; Folgori, et al.) og screenet ved HGV-assosiert human sera eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse.

Et eksempel på anvendelse av RPL for isolering av 470-20-1 mimotoper er som følger. Tilfeldig dekapeptid-pIU fusjonsfag visningsbibliotek blir konstruert ifølge fremgangsmåtene som er tidligere beskrevet (DeGraaf, et al., 1993). Et kjemisk syntetisert enkelt-trådet degenerert innskudd blir sammensmeltet til kortere oligonukleotider som danner Sfil-restriksjonsoverheng. Sammensmeltet DNA blir ligert inn i Sfil-spaltet fUSE-5 vektor DNA.

E. coli MC 1061 blir transformert med ligert DNA. Biblioteket blir amplifisert gjennom omtrent 10 populasjonsdoblinger i LB medium med 20 mg/ml tetracyklin. Dette biblioteket blir affinitetsselektert ved anvendelse av en eller flere 470-20-1 immunreaktive sera (eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse). Polystyrenkuler (Precision Plastic Ball Company, Chicago, II) blir belagt med ammoniumsulfat fraksjonert positivt serum (for eksempel PNF 2161) i 50 mM NaHC03, pH 9,6 over natt ved 4°C. Antistoff belagte kuler blir grundig vasket med PBS og blokkert med

BSA.

Disse serumbelagte, blokkerte kulene blir preinkubert med et overskudd av M13K07-UV drepte fag i 4 timer ved 4°C. Bibliotekfagene blir deretter tilsatt til ovennevnte preinkubasjonsblanding og inkubert i 12 timer ved 4°C. Ubundet fag blir fjernet og kulene vasket omfattende med TTB (50 mM tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% "TWEEN 20" (v/v), 1 mg/ml BSA) buffer. Bundet fag blir eluert med elueringsbufferen (0,1 M HC1 justert til pH 2,2 med 2M tris-HCl, pH 9,0). Eluert, anriket fag blir screenet med et andre positivt serum (for eksempel Mys 136 sera) ved plakk immunscreening.

Ytterligere screening av selekterte fagotoper kan bli utført ved anvendelse av store paneler av positive og negative sera eller spesifikke HGV monoklonale antistoffer. Selekterte fagotoper kan bli direkte i ELISA analyse eller antistoff dannelse. Alternativt kan sekvensene til fagotopen som koder for nukleotidene bli bestemt og uttrykt i konvensjonelle vektor/vertssystem og anvendt som antigen.

Etterlignende polypeptider identifisert som beskrevet ovenfor kan deretter virke som antigener i deteksjonsanalyser eller kan bli anvendt for dannelse av antigen-spesifikke antistoffer.

D. ELISA OG PROTEIN BLOT SCREENING

Når HGV antigener blir identifisert, vanligvis gjennom plakk immunscreening som beskrevet ovenfor, kan antigenene bli uttrykt og renset. Antigenene kan deretter bli hurtig screenet mot et stort antall antatte HGV hepatittsera ved anvendelse av alternative immunoanalyser, så som, ELISA eller proteinblot analyser (Western blots) ved anvendelse av det isolerte antigenpeptidet. Antigenpolypeptidets fusjon kan bli isolert som beskrevet ovenfor, vanligvis ved affinitetskromatografi til fusjonspartneren så som J3-galaktosidase eller glutation-S-transferase. Alternativt kan selve antigenet bli renset ved anvendelse av antistoffer dannet mot det (se nedenfor).

Et generelt ELISA analyseformat er presentert i eksempel 10. HArlow et al. beskriver et antall nyttige teknikker for immunoanalyser og antistoff/antigen screening.

Renset antigenpolypeptid eller fusjonspolypeptid inneholdende antigenet av interesse blir koblet til en fast bærer, for eksempel, en polystyrenplate med mange brønner. Sera som skal bli testet blir fortynnet og tilsatt til brønnene. Etter en tidsperiode som er tilstrekkelig for binding av antistoffene til de bundede antigenene blir sera vasket ut av brønnene. Et merket reporter antistoff blir tilsatt til hver brønn sammen med et hensiktsmessig substrat: brønner inneholdende antistoffer bundet til det rensede antigen polypeptidet eller fusjonspolypeptidet inneholdende antigenet blir detektert ved et positivt signal.

Et typisk format for protein blot analyse ved anvendelse av polypeptidantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse er presentert i eksempel 10. Generelle protein blot metoder er beskrevet av Ausubel et al. I eksempel 10 ble 470-20-l/sj26 fusjonsproteinet anvendt for å screene et antall sera prøver. Resultatene presentert i eksempel 10 demonstrerer at flere forskjellige kilder av N-(ABCDE) hepatitt sera er immunreaktive med polypeptidantigenet.

Resultatene presentert ovenfor demonstrerer at polypeptidantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan, ifølge disse metodene, bli hurtig screenet mot paneler av antatte HGV infiserte serumprøver for deteksjon av HGV.

E. CELLEKULTUR SYSTEMER, DYREMODELLER OG ISOLERING AV

HGV.

HGV infektivitetsstudier er blitt utført i sjimpanser, cynomolgus aper og fire mystax individer (eksempel 4H). Disse studiene har gitt ytterligere informasjon angående HGV infiserbarheten i disse dyremodellene. HGV beskrevet i foreliggende beskrivelse har den fordelen av at de har evne til å infisere tamariner, cynomologe aper og sjimpanser.

Primære hepatocyter oppnådd fra infiserte dyr (sjimpanser, aper eller mennesker) kan bli dyrket in vitro. Et serum-fritt medium, supplementert med vekstfaktorer og hormoner, er blitt beskrevet og muliggjør langtidsopperttholdelse av differensierte primat hepatocyter (Lanford, et al.; Jacob, et al., 1989, 1990, 1991). I tillegg til primære hepatocytkulturer kan udødeliggjorte kulturer av infiserte celler også bli dannet. For eksempel kan primære leverkulturer bli fusjonert til forskjellige celler (som HepG2) for å tilveiebringe stabile udødeliggjorte cellelinjer. Primære hepatocyt cellekulturer kan også bli udødeliggjort ved introduksjon av onkogener eller gener som forårsaker en transformert fenotype. Slike onkogener eller gener kan bli avledet fra et antall kilder kjent innenfor fagområdet og inkluderer SV40, humane cellulære onkogener og Epstein-Barr virus.

Uinfiserte hepatocyter (for eksempel primære eller kontinuerlig hepatom cellelinje) kan bli infisert ved eksponering av cellene i kultur overfor HGV enten som delvis rensede

partikkelpreparater (dannet for eksempel fra infisert sera ved differensial sentrifugering og/eller molekylær sikting) eller i infeksiøse sera. Disse infiserte cellene kan deretter bli propagert og virus ført ifølge fremgangsmåtene kjent innenfor fagområdet. I tillegg kan andre celletyper, så som lymfoidcellelinjer, være nyttige for propagering av HGV.

Proteinlikhets studier av HGV har detekterte aminosyreregioner som ligner andre vimser i familien Flaviviridae. Det er kjent at medlemmer av denne familien av vimser kan bli propagert i forskjellige vevskultursystemer (ATCC-Vimses catalogue, 1990). Ved analogi er det mulig at HGV kan bli propagert i en eller flere av følgende vevskultursystemer: Hela celler, primære hamster nyreceller, ape nyreceller, vero celler, LLC-MK2 (rhesus apenyreceller), KB celler (humane orale epidermoid carcinoma celler), and embryo celler, primære saue leptomeningeal celler, primære saue choroid pleksus celler, grise nyreceller, bovine embryoniske nyreceller, bovine turbinat celler, kylling embryo celler, primære kanin nyreceller, BHD-21 celler eller PK-13 celler.

I tillegg for å uttrykke HGV kan regioner av HGV polynukleotidsekvenser, cDNA eller in vitro transkribert RNA bli introdusert ved rekombinante metoder inn i vevskulturceller. Slike rekombinante manipuleringer muliggjør individuell ekspresjon av individuelle komponenter av HGV.

RNA prøver kan bli dannet fra infisert vev eller, spesielt, fra infiserte cellekulturer. DNA prøvene kan bli separert på geler og overført til membraner for hybridiseringsanalyser ved anvendelse av prober avledet fra klonede HGV sekvenser.

HGV partikler kan bli isolert fra infiserte sera, infisert vev, ovennevnte cellekultur medier eller dyrkede infiserte celler ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet. Slike fremgangsmåter innbefatter teknikker basert på størrelsesfraksjonering (dvs. ultrafiltrering, presipitering, sedimentering), ved anvendelse av anioniske og/eller kationiske utviklingsmaterialer, separasjon på gmnnlag av tetthet, hydrofilisitetsegenskaper og affinitetskromatografi. I løpet av isoleringsprosedyren kan HGV bli identifisert (i) ved anvendelse av anti-HGV hepatitt assosierte middel antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, (ii) ved anvendelse av hybridiseringsprober basert på identifiserte HGV nukleinsyresekvenser (for eksempel eksempel 5) eller (iii) ved RT-PCR.

Antistoffer rettet mot HGV kan bli anvendt for rensing av HGV partikler gjennom immunoaffinitetskromatografi (Harlow, et al.; Pierce). Antistoffer rettet mot HGV polypeptider eller fusjonspolypeptider (så som 470-20-1) er fiksert på faste bærere på en slik måte at antistoffene opprettholder deres immunselektivitet. For å oppnå slik kobling av antistoffer til fast bærer blir bifunksjonelle koblingsmidler (Pierce; Pharmacia, Piscataway, NJ) inneholdende spacergrupper ofte anvendt for å beholde tilgang på antigen bindende sete til antistoffet.

HGV partikler kan bli ytterligere karakterisert ved standardprosedyrer inkludert, men ikke begrenset til, immunfluorescens mikroskopi, elektronmikroskopi, Western blot analyser av proteiner som omfattes av partiklene, infeksjonsstudier i dyr og/eller cellesystemer ved anvendelse av delvis rensede partikler og

sedimenteringskaraktertrekk.

Resultatene presentert i eksempel 5 tuder på at de virale partiklene ifølge foreliggende oppfinnelse er mere like enn et innesluttet viralt partikkel enn et ikke-innesluttet viralt partikkel.

HGV partikler kan bli åpnet for å oppnå HGV genomer. Åpning av partiklene kan for eksempel bli oppnådd ved behandling med detergenter i nærvær av gelateringsmidler. Genomisk nukleinsyre kan deretter bli ytterligere karakterisert. Karakteriseringen kan innbefatte analysering av DNase og RNase sensitiviteten. Trådtypen (eksempel 41) og konformasjon (for eksempel sirkulær) til genomet kan bli bestemt ved teknikker kjent innenfor fagområdet, inkludert visualisering ved elektronmikroskopi og sedimenterings karaktertrekk.

De isolerte genomene gjør det også mulig å sekvensere hele genomet enten det er segmentert eller ikke, og om det er et RNA eller DNA genom (ved anvendelse av for eksempel RT-PCR, kromosom vandringsteknikker eller PCR som anvender primere fra ved siden av liggende klonede sekvenser). Bestemmelse av hele sekvensen til HGV muliggjør genomiske organiseringsstudier og sammenligning av HGV sekvensene til kodende og regulatoriske sekvenser til kjente virale midler.

F. SCREENING FOR MIDLER MED ANTI-HGV HEPATITT AKTIVITET

Anvendelse av cellekultur og dyremodell systemer for propagering av HGV gir evne til å screene for anti-hepatittmidler som inhiberer produksjon av infeksiøs HGV: spesielt medikamenter som inhiberer replikasjon av HGV. Cellekultur og dyremodeller muliggjør vurdering av effekten av slike anti-hepatitt medikamenter på normale cellulære funksjoner og levedyktighet. Potensielle anti-virale midler (inkludert naturlige produkter eller syntetiske forbindelser; for eksempel små molekyler, omfattende blandinger så som soppekstrakter og anti-sens oligonukleotider) som blir vanligvis screenet for anti-viral aktivitet over forskjellige konsentrasjoner. Effekten på HGV replikasjon og/eller antigen produksjon blir deretter vurdert, vanligvis ved registrering av viral makromolekylær syntese eller akkumulering av makromolekyler (for eksempel DNA, RNA eller protein). Denne vurderingen blir ofte utført i forhold til effekten av det anti-virale middelet på normal cellulær funksjon (DNA replikasjon, RNA transkripsjon, generell protein translasjon osv.).

Deteksjon av HGV kan bli oppnådd ved hjelp av mange metoder, inkludert de som er beskrevet i foreliggende beskrivelse. For eksempel kan antistoffer bli dannet mot antigener ifølge foreliggende oppfinnelse og disse antistoffene kan bli anvendt i antistoff-baserte analyser (Harlow et al.) for å identifisere og kvantifisere HGV antigener i cellekulturen. HGV antigenene kan bli kvantifisert i kulturen ved anvendelse av konkurrerende analyser: polypeptider kodet av klonede HGV sekvenser kan bli anvendt i slike analyser. Vanligvis blir rekombinant produsert HGV antigenisk polypeptid produsert og anvendt for å danne et monoklonalt eller polyklonalt antistoff. Rekombinant HGV polypeptid blir merket ved anvendelse av et reportermolekyl. Inhibisjon av bindingen av dette merkede polypeptidet til dets kognat antistoff blir deretter vurdert i nærvær av prøver (for eksempel cellekulturmedium eller sera) som inneholder HGV antigener. Nivået av HGV antigener i prøven blir bestemt ved sammenligning av inhibisjonsnivåene med en standardkurve dannet ved anvendelse av umerkede rekombinante proteiner ved kjente konsentrasjoner.

HGV sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttige for dannelse av polynukleotidprober/primere som kan bli anvendt for å kvantifisere mengden av HGV nukleinsyresekvenser produsert i et cellekultur system. Slik kvantifisering kan bli oppnådd på forskjellige måter. For eksempel kan prober merket med reportermolekyl er bli anvendt i standard dot-blot hybridiseringer eller konkurreringsanalyser av merkede prober med infiserte cellenukleinsyrer. Det er et antall metoder som anvender polymerasekjedereaksjonen for å kvantifisere målnukleinsyrenivåene i en prøve (Osikowicz, et al.).

Beskyttende antistoffer kan også bli identifisert ved anvendelse av cellekultur og dyremodellsystemer beskrevet ovenfor. For eksempel blir polyklonale eller monoklonale antistoffer dannet mot antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse antistoffene blir deretter anvendt for å forbehandle et infeksiøst HGV-inneholdende inokulum (for eksempel serum) før infeksjon av cellekulturer eller dyr. Evnen som et enkelt antistoff eller blandinger av antistoffer har til å beskytte cellekulturen eller dyr fra infeksjon blir vurdert. For eksempel i cellekultur og dyr virker fravær av viralt antigen og/eller nukleinsyreproduksjon som en screening. I dyr er fravær av HGV hepatitt sykdomssymptomer, for eksempel forhøyede ALT verdier, også tegn på tilstedeværelse av beskyttende antistoffer.

Alternativt kan konvalesent sera bli screenet for tilstedeværelse av beskyttende antistoffer og deretter kan de bli anvendt for å identifisere HGV hepatitt assosiert middel antigener som blir bundet til antistoffene. Identifisert HGV antigen blir deretter produsert rekombinant eller syntetisk. Evnen som antigenet har til å danne beskyttende antistoffer blir testet som ovenfor.

Etter innledende screening blir antigenet eller antigenene identifisert å kunne danne beskyttende antistoffer, enten enkeltvis eller i kombinasjon, anvendt som en vaksine for å inokulere testdyrene. Dyrene blir deretter eksponert for infeksiøst HGV. Beskyttelse mot infeksjon indikerer evnen som dyrene har til å danne antistoffer som beskytter dem fra infeksjon. Anvendelse av dyremodeller muliggjør identifikasjon av antigener som aktiverer cellulær immunitet.

I dyremodell studiene beskytter en beskyttende immunrespons i respons til eksponering for et viral preparat (for eksempel infisert serum) (i) beskytte dyret for infeksjon eller (ii) forhindrer manifistering av sykdommen.

G. VAKSINER OG DANNELSE AV BESKYTTENDE IMMUNITET

Vaksiner kan bli dannet fra en eller flere immunogene polypeptider identifisert ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse. Genomisk organiserings likheter mellom isolerte sekvenser fra HGV og andre kjente virale proteiner kan gi informasjon som vedrører polypeptidene som er sannsynlige kandidater for effektive vaksiner. I tillegg kan et antall dataprogrammer bli anvendt for å identifisere sannsynlige regioner av isolerte sekvenser som koder for proteinantigene determinant regioner (for eksempel Hopp, et al.; "ANTIGEN", Intelligenetics, Mountain View CA).

Vaksiner inneholdende immunogene polypeptider som aktive ingredienser blir vanligvis dannet som injiserbare former enten som oppløsninger eller suspensjoner. Immunogene polypeptider kan bli dannet i en fast eller lyofilisert tilstand som er egnet for resuspensjon, før injeksjon, i en vandig form. Immunogene polypeptider kan også bli emulgert eller innkapslet i liposomer. Polypeptider blir ofte blandet med farmasøytiske akseptable eksipienter som er kompatible med polypeptidene. Slike eksipienter innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende og kombinasjoner av følgende: saltvann, vann, sukkerforbindelse (så som dekstrose og sorbitol), glycerol, alkoholer (så som etanol [EtOH]), og andre som er kjent innenfor fagområdet. Vaksinepreparater kan videre inneholde mindre mengder av andre hjelpeforbindelser så som fuktmidler, emulgeringsmidler (for eksempel detergenter) og pH buffrende midler. I tillegg er et antall adj uvants tilgjengelige og disse kan forsterke effektiviteten til vaksinepreparatene. Eksempler på slike adjuvants innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende: gruppen av relaterte forbindelser inkludert N-acetyl-muranyl-L-threonyl-D-isoglutamin og N-acetyl-nor-muranyl-L-alanyl-D-isoglutamin og aluminiumhydroksid. Immunogene polypeptider anvendt i vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være rekombinante, syntetiske eller isolert fra, for eksempel, attenuerte HGV partikler. Polypeptidene blir vanligvis formulert til vaksiner i nøytral eller saltformer. Farmasøytiske akseptable organiske og uorganiske salter er velkjente innenfor fagområdet.

HGV hepatitt assosierte middelvaksiner blir administrert parenteralt, vanligvis ved subkutan eller intramuskulær injeksjon. Andre mulige formuleringer innbefatter orale og suppositorieformuleringer. Orale formuleringer anvender vanligvis eksipienter (for eksempel sukker med farmasøytisk kvalitet, sakkarin, cellulose og lignende) og inneholder vanligvis 10-98% immunogene polypeptider. Orale sammensetninger har form av piller, kapsler, tabletter, oppløsninger, suspensjoner, pulvere osv., og kan bli formulert for å muliggjøre vedvarende eller lang-tids frigjøring. Suppositorie formuleringer anvender vanligvis bindemidler og bærere og inneholder vanligvis mellom 0,1% og 10% immunogent polypeptid.

I lys av ovennevnte informasjon kan multivalente vaksiner mot HGV hepatitt assosierte midler bli dannet bestående av en eller flere strukturelle eller ikke-strukturelle viral-middel polypeptider. Disse vaksinene kan for eksempel inneholde rekombinante uttrykte HGV polypeptider, polypeptider isolert fra HGV vimser, syntetiske polypeptider eller sammenstilte epitoper i form av mosaikk polypeptider. I tillegg kan det være mulig å danne vaksiner som utviser beskyttelse overfor HGV hepatitt infeksjon gjennom anvendelse av inaktivert HGV. En slik inaktivering kan bli oppnådd ved dannelse av virale lysater etterfulgt av behandling av lysatene med hensiktsmessige organiske oppløsningsmidler, detergenter eller formalin.

Vaksiner kan også bli dannet fra attenuerte HGV stammer. Slik attenuert HGV kan bli oppnådd ved anvendelse av ovennevnte cellekultur og/eller dyremodell systemer. Vanligvis blir attenuerte stammer isolert etter flere føringer in vitro eller in vivo. Deteksjon av attenuerte stammer blir oppnådd ifølge fremgangsmåtene kjent innenfor dette fagområdet. En fremgangsmåte for detektering av attenuert HGV er anvendelse av antistoff prober mot HGV antigener, sekvens-spesifikke hybridiseringsprober eller amplifikasjon med sekvens-spesifikke primere for infiserte dyr eller analyser av HGV-infiserte in vitro kulturer.

Alternativt, eller i tillegg til ovennevnte metoder, kan attenuerte HGV stammer bli konstruert basert på den genomiske informasjonen som kan bli oppnådd fra informasjonen presentert i foreliggende beskrivelse. Vanligvis kan en region av infeksiøst middel genom som koder for for eksempel et polypeptid som er relatert til viral patogenese blir deletert. Delesjonen bør ikke interferere med den virale replikasjonen. Rekombinant attenuert HGV konstruksjon muliggjør ekspresjon av en epitope eller epitoper som har evne til å gi opphav til beskyttende immunresponser overfor HGV. Ønsket immunrespons kan innbefatte både humeral og cellulær immunitet. Genomet til attenuert HGV blir deretter anvendt for å transformere celler og cellene dyrket under betingelser som muliggjør viral replikasjon. Slike attenuerte stammer er nyttige ikke bare som vaksiner, men også som produksjonskilder for virale antigener og/eller HGV partikler.

Hybride partikkel immunogener som inneholder HGV epitoper kan også bli dannet. Immunogenisiteten til HGV epitopene kan bli forsterket ved å uttrykke epitopen i eukaryote systemer (for eksempel pattedyr eller gjærsystemer) hvor epitopen er fusjonert eller stilt sammen med kjente partikkeldannende proteiner. Et slikt protein er hepatitt B overflate antigen. Rekombinante konstruksjoner hvor HGV epitopen er direkte koblet til den kodende sekvensen for det partikkeldannende proteinet vil produsere hybrid proteiner som er immunogene med hensyn på HGV epitopen og det partikkeldannende proteinet. Alternativt kan selekterte deler av den partikkel-dannende protein kodende sekvensen, som er involvert i partikkeldannelse, bli erstattet med kodende sekvenser som tilsvarer HGV epitoper. For eksempel kan regioner med spesifikk immunreaktivitet til det partikkel-dannende proteinet bli erstattet med HGV epitope sekvenser.

Hepatitt B overflate antigen er blitt vist å bli uttrykt og sammenstilt til partikler i gjær Saccharomyces cerevisiae og i pattedyr celler (Valenzuela, et al., 1982 og 1984; Michelle, et al.). Disse partiklene er blitt vist å ha forsterket immunreaktivitet. Dannelse av disse partiklene ved anvendelse av hybridproteiner, dvs. rekombinante konstruksjoner med heterologe virale sekvenser, er tidligere blitt beskrevet (EPO 175.261, publisert 26. mars 1986). Slike hybridpartikler inneholdende HGV epitoper kan også være nyttige i vaksine applikasjoner.

Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert i doseringer som er kompatible med fremgangsmåten til formuleringen, og i slike mengder som vil være farmakologisk effektive for profylaktiske eller terapeutiske behandlinger. Kvantiteten av immunogenet som blir administrert avhenger av individer som blir behandlet, kapasiteten til det behandlende individets immunsystem for dannelse av beskyttende immunrespons og ønsket beskyttelsesgrad.

HGV vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert i enkelt eller flere doser. Doseringsregimene blir også bestemt i forhold til individets behov og toleranse. I tillegg HGV immunogene polypeptider kan vaksineformuleringer bli administrert sammen med andre immunregulatoriske midler.

I en ytterligere metode for HGV vaksinering blir DNA konstruksjoner kodende for HGV proteiner under hensiktsmessig regulatorisk kontroll introdusert direkte i pattedyr vev, in vivo. Introduksjon av slike konstruksjoner produserer "genetisk immunisering". Lignende DNA konstruksjoner er blitt vist å bli tatt opp av celler og de kodede proteinene uttrykt (Wolf, et al.; Ascadi, et al.). Injisert DNA ser ikke ut til å integrere i vertscellenes kromatin eller blir replikert. Denne ekspresjonen gir opphav til vesentlige humorale og cellulære immunresponser, inkludert beskyttelse overfor in vivo viral eksponering i dyresystemet (Wang, et al., 1993; Ulmer, et al.). I en utførelsesform blir DNA konstruksjonen injisert i skjelettmuskelen etter forbehandling med lokal anestesi, så som, bupivikain hydroklorid med metylparaben i isotonisk saltvann, for å lette cellulært DNA opptak. Den injiserte DNA konstruksjonen blir tatt opp av muskel cellene og kodede proteiner uttrykt.

Sammenlignet med vaksinering med oppløselige virale subenhetproteiner har den genetiske immuniseringen fordelen av autentisk in vivo ekspresjon av virale proteiner. Disse virale proteinene blir uttrykt i assosiasjon med vertscellens histokompatibilitetsantigener, og andre proteiner, som ved naturlig viral infeksjon. Denne immuniseirngstypen har evne til å indusere både humorale og cellulære immunresponser i kontrast til mange oppløselige subenhet proteinvaksiner. Denne typen av immunisering har mange fordelaktige trekk omfattende levende attenuerte vaksiner uten anvendelse av infeksiøse midler for vaksinering og ledsagende trygghets betraktninger.

Direkte injeksjon av plasmid eller andre DNA konstruksjoner kodende for ønskede vaksine antigener inn i in vivo vev er en leveringsmetode. Andre metoder for levering av DNA konstruksjonene kan også bli anvendt. Disse innbefatter forskjellige lipid-baserte metoder hvor DNA blir pakket ved anvendelse av liposomer, kationiske lipidreagenser eller cytofektiner (så som lipofektin). Disse metodene letter in vivo opptaket og ekspresjonen, som oppsummert av Felgner og Rhodes (1991). Forskjellige modifikasjoner til disse grunnleggende metodene innbefatter følgende: inkorporering av peptider, eller andre deler, for å lette (i) målsøking til bestemte celler, (ii) intracellulær disposisjon for DNA konstruksjonen etter opptak eller (iii) å lette ekspresjonen. Alternativt kan sekvenser kodende for ønskede vaksine antigener bli skutt inn i en egnet retroviral vektor. Den resulterende rekombinante retrovirale vektoren inokulert inn i individet for in vivo ekspresjonen av vaksine antigenet. Antigenet induserer deretter immunresponsene. Som angitt ovenfor er denne metoden blitt vist å indusere både humoral og cellulær immunitet til virale antigener (Irwin, et al.).

HGV vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert i kombinasjon med andre vaksinemidler, for eksempel med andre hepatittvaksiner.

H. SYNTETISKE PEPTIDER

Ved anvendelse av de kodende sekvensene til HGV polypeptidet kan syntetiske peptider bli dannet som tilsvarer disse polypeptidene. Syntetiske peptider kan bli syntetisert kommersielt eller dannet ved anvendelse av standardmetoder og apparatur innenfor fagområdet (Applied Biosystems, Foster City CA).

Alternativt kan oligonukleotidsekvenser kodende for peptider bli enten syntetisert direkte ved standardmetoder for oligonukleotidsyntese, eller, når det gjelder større kodende sekvenser, syntetisert ved hjelp av en serie kloningstrinn som innbefatter en i tandem oppstilling av multiple oligonukleotidfragmenter som tilsvarer den kodende ^TT"? !°Shi0 " ^ Ea,°n Ct a -kvensar kan bli uttrykt ved standard rekombinante prosedyrer (Maniatis et al, Ausubel et al.).

V. KARAKTERISERING AV VIRALT GENOM

Som vist i eksempel 4 ser HGV genomet ut til å være et RNA molekyl og har nærest sekvenslikhet med virale sekvenser som er katagorisert i Flaviviridae familien av vimser. Denne familien innbefatter Flavivimser, Pestivimser og en ikke-klassifisert slekt dannet av et medlem, hepatitt C vims. HGV vimset har ikke signifikant global (dvs. over lengden av vimset) sekvens identitet med andre anerkjente medlemmer av Flaviviridae, med unntagelse av proteindelene diskutert nedenfor.

Generelt er medlemmer av Flaviviridae vimser med kapper som har tettheter i sukrose gradienter mellom 1,1 og 1,23 mg/ml og som er følsomme for varme, organiske oppløsningsmidler og detergenter. Som vist i eksempel 5 har HGV tetthets karaktertrekk som ligner de som blir anvendt for Flaviviridae vims (HCV). Integriteten til HGV vimset ser også ut til å være følsomt for organiske oppløsningsmidler (eksempel 5).

Flaviviridae vimser inneholder et enkelt molekyl av lineært enkelt-trådet (ss) RNA som også virker som eneste mRNA som koder for virale proteiner. ssRNA molekylet er vanligvis mellom en størrelse på 9 og 12 kilobaser i lengde.

Virale proteiner er avledet fra en polyprotein forløper som deretter blir prosessert til modne virale proteiner. De fleste medlemmene av Flaviviridae inneholder ikke poly(A) haler ved deres 3' ender. Vimser har en vekt på omtrent 15-20% lipid.

Medlemmene i Flaviviridae familien har et kjerne protein og to eller tre membran-assosierte proteiner. Analoge strukturelle proteiner til medlemmer i tre slekt Flavivims familien viser små likheter med hverandre på sekvensnivå. Ikke-stmkturelle proteiner inneholder konserverte motiver for RNA avhengig RNA polymerase (RDRP), helicase og en serie proteaser. Disse korte blokkene av konserverte aminosyrer eller deler kan bli detektert ved anvendelse av data algoritmer kjent innenfor fagområdet så som

"MACAW" (Schuler, et al.). Disse delene er sannsynligvis relatert til begrensninger gitt av substrater som blir prosessert ved disse proteinene (Koonin and Dolja). Rekkefølgen av disse motivene er konservert i alle medlemmer av Flaviviridae familien. Genomet til HGV inneholder proteindeler som er tilstede i medlemmer av Flaviviridae familien, for eksempel (i) helikase genet, (ii) serin-lignende proteasedomene og (iii) RNA avhengig RNA polymerase (RDRP) (se figur 5, "GDD" sekvenser);

sekvensinformasjonen er beskrevet heri angående flere forskjellige stammer/isolater av HGV. Denne informasjonen kan bli anvendt av fagfolk innenfor dette området for å isolere nye stammer/isolater ved anvendelse av teknikker for hybridisering, primerekstensjon og RT-PCR som beskrevet heri (for eksempel ved anvendelse av degenererte primere basert på beskrivelsen av HGV variant sekvensene).

I foreliggende tilfelle er HGV et nytt isolat antatt å være et medlem av familien Flaviviridae. Innenfor denne virusfamilien muliggjør undersøkelse av de strukturelle proteinene som blir kodet av et virus den mest definitive bestemmelsen av om et viralt isolat er et medlem av en bestemt virusart. Ikke-strukturelle proteiner er mest konserverte blant forskjellige virusarter innenfor en familie av virusarter. Dette antas å være et resultat av nødvendigheten av å konservere enzymatiske funksjoner, så som følgende: proteolytisk spaltning av et viralt polyprotein og replikasjon av RNA genomet ved viral helikase og RNA avhengig RNA polymerase til viruset.

Undersøkelse av flere arter innenfor en hvilken som helst slekt av Flaviviridae familien, for eksempel flavivirus slekten, demonstrerer at gener for disse konserverte funksjonene er sterkere konservert mellom arter enn strukturelle proteiner. En av de viktigste bestemmelsesfaktorene når det gjelder om et virusisolat representerer en ny art i forhold til et "variant isolat" av en kjent art, er en bestemmelse av den globale homologi en til de strukturelle proteinene mellom kjente virale arter og det nye virusisolatet.

Lokale homologier som er tilstede innenfor regionene omtrent 200 aminosyrer eller mindre som finnes i ikke-strukturelle proteiner er ubestemte indikatorer på om et isolat er en variant eller en ny art. Virusisolater med globale strukturelle proteinhomologier på mindre enn eller omtrent 40% er klassifisert som enten forskjellige arter (vimser) eller forskjellige slekter. De strukturelle regionene til HGV har hver homologier som er lavere enn 40% sammenlignet med vims beskrevet i "GENBANK" (sammenligninger utført ifølge metoder som er standard innenfor dette fagområdet). HGV er følgelig betraktet å være en ny art og muligens en ny slekt av positiv tråd RNA vims.

En annen viktig region som er undersøkt når det gjelder å bestemme fylogenetisk plassering av et viralt isolat er de 5' og 3'utranslaterte regionene (UTR). Disse regionene er sammenlignet mellom virale isolater. Alle medlemmer av HCV, en ikke-klassifisert slekt av Flaviviridae, har 5'utranslaterte regioner som er større enn omtrent 90% konservert ved alle andre medlemmer i slekten. Medlemmer av HCV har til felles 3'utranslaterte regioner mellom omtrent 24 og omtrent 50 nukleotider i lengde.

Ingen signifikante oppstillinger finnes ved virusene i "GENBANK" (Ver. 86) når den 5-utranslaterte regionen blir anvendt som en vurderingssekvens med FASTA på BLASTN. HGV inneholder en 3' utranslatert region som er minst omtrent 250 nukleotider i lengde og som også inneholder liten homologi med eventuelt andre kjente virus.

Medlemmer av Flaviviridae familien er kjent for å replikere i mange forskjellige dyr varierende fra (i) hematofagus artropod vektorer (biller og moskitoser), hvor de ikke forårsaker sykdom, til (ii) et stort antall vertebrat verter (mennesker, primater, andre pattedyr, marsupiales og fugler). Over 30 medlemmer av Flaviviridae familien forårsaker sykdommer i mennesket og varierer fra febril sykdom, eller utslett, til potensielle fatale sykdommer så som hemoragisk feber, encefalitt eller hepatitt. Minst 10 medlemmer av Flaviviridae familien forårsaker alvorlige og økonomiske viktige sykdommer i husdyr.

VI. ANVENDELSE

A. OPPFINNELSE

Et første aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse vedrører et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) i isolert form, kjennetegnet ved at HGV er som følger: (i) er overførbar i primater, (ii) er serologisk forskjellig fra hepatitt A virus (HAV), hepatitt B virus (HBV), hepatitt C virus (HCV), hepatitt D virus og hepatitt E virus (HEV), (iii) er et medlem av virusfamilien Flaviviridae og (iv) inneholder polynukleotider med minst 55% sekvenshomologi med et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 37 eller SEQ ID NO: 19 og deres komplementer.

Et andre aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse vedrører et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) polypeptid i isolert form, kjennetegnet ved at HGV har: (i) karaktertrekkene til HGV viruset ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse, og (ii) er ytterligere karakterisert ved polypeptider hvor aminosyresekvensene har minst 40% sekvenshomologi med aminosyresekvensene valgt fra gruppen bestående av 190 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 38 og 67 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 20.

I en uførelsesform er polypeptidet ifølge det andre aspekt av foreliggende oppfinnelse ytterligere kjennetegnet ved at det omfatter et antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff, som vist ved evnen som antigenet har til å immunreagere spesifikt med et kroppsfluid eller en vevsprøve fra et HGV-positivt individ.

I en annen utførelsesform er polypeptidet ifølge det andre aspekt av foreliggende oppfinnelse ytterligere kjennetegnet ved at det er et rekombinant fusjonspolypeptid sammensatt av et HGV polypeptid og et andre polypeptid, hvor nevnte andre polypeptid velges fra gruppen bestående av J3-galaktosidaseproteiner, glutation-S-transferase proteiner og partikkel-dannende proteiner.

I nok en utførelsesform er polypeptidet ifølge det andre aspekt av foreliggende oppfinnelse ytterligere kjennetegnet ved at det omfatter en sekvens med minst 15 sammenhengende aminosyrer som blir kodet av et HGV genom, cDNA eller komplementer derav, hvori nevnte aminosyresekvens velges fra gruppen bestående av (i) 190 aminosyresekvensen til SEQ JD NO: 38 eller fragmenter derav, (ii) 67 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 20 eller fragmentet derav, og (iii) en aminosyresekvens kodet av PNF 2161 cDNA kilde lambda gtl 1 biblioteket.

Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et diagnostisk sett for screening av kroppsfluid eller vevsprøve for antistoffer spesifikke mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved at det omfatter polypeptidet ifølge det andre aspekt ved oppfinnelsen, hvor dette polypeptid videre er kjennetegnet ved at det er et antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff og midler for detektering av et immunologisk kompleks dannet ved spesifikk immunreaksjon av nevnte antigen med antistoffer i nevnte prøve.

I en videre utførelsesform, er det diagnostiske sett ifølge det tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse videre kjennetegnet ved at det er for anvendelse ved screening av serum.

Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff som er kjennetegnet ved at det er spesifikt immunreaktivt med et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff.

Et femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert preparat av polyklonale antistoffer, kjennetegnet ved at de er spesifikt immunreaktive med et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff.

Et sjette aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for screening av et kroppsfluid eller en vevsprøve inneholdende antistoffer spesifikke mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved å bringe nevnte prøve i kontakt med et polypeptid ifølge det andre aspekt ved oppfinnelsen, hvor dette polypeptid videre er kjennetegnet ved at det er et antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff

Et syvende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av det isolerte HGV polypeptid ifølge det andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfattende et antigen inneholdende en epitope som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff, for induksjon av en immunrespons, for fremstilling av en sammensetning for produksjon av antistoff mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse.

Et åttende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et mosaikkpolypeptid kjennetegnet ved at det omfatter minst to forskjellige antigener som begge er spesifikt immunreaktive med minst et anti-HGV antistoff, hvor nevnte mosaikkpolypeptid mangler aminosyrene som normalt er mellom nevnte antigener i et nativt HGV polypeptid.

Et niende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) vaksine sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter et antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff, hvor nevnte antigen foreligger i en farmakologisk effektiv dose i en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et tiende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) polynukleotid i isolert form, kjennetegnet ved at nevnte HGV har karaktertrekkene til HGV viruset ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen.

I en utførelsesform er polynukleotidet ifølge det tiende aspekt ved foreliggende oppfinnelse ytterligere kjennetegnet ved at det har minst 55% sekvenshomologi med et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 37 eller SEQ ID NO: 19 eller deres komplementer.

I nok en utførelsesform er polynukleotidet ifølge det tiende aspekt ved foreliggende oppfinnelse ytterligere kjennetegnet ved at det er nyttig for PCR deteksjon av et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV).

Et ellevte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en kloningsvektor, kjennetegnet ved at den kan uttrykke under egnede betingelser, en åpen leseramme (ORF) av cDNA avledet fra et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) genom, eller komplementer derav, hvor nevnte virus har karaktertrekkene ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse, og ORF er operabelt koblet til en kontroll sekvens som er kompatibel med en ønsket vert.

Et tolvte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å danne et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) polypeptid, kjennetegnet ved å dyrke en celle transformert med en vektor ifølge det ellevte aspekt ved foreliggende oppfinnelse, under betingelser som resulterer i ekspresjon av åpen leseramme (ORF) sekvens.

B. IMMUNOANALYSER FOR HGV.

En anvendelse av antigenene oppnådd ifølge fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse er deres anvendelse som diagnostiske reagenser for deteksjon av antistoffer tilstede i serum til testindivider infisert med HGV hepatitt virus, og som derved indikerer infeksjon i individet; for eksempel, 470-20-1 antigenet, antigener kodet av SEQ ID NO: 14 eller komplementer derav, og antigener kodet av deler av en av trådene til den fullstendige virale sekvensen. Antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt enkeltvis, eller i kombinasjon med hverandre, for å detektere HGV. Antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli koblet med diagnostiske analyser for andre heptaitt midler så som HAV, HB V, HCV og HEV.

I en diagnostisk konfigurasjon blir testserumet omsatt med et fast fase reagens som har et overflate-bundet antigen oppnådd ifølge fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse, for eksempel 470-20-1 antigenet. Etter binding med anti-HGV antistoff til reagenset og fjerning av ubundede serumkomponenter ved vasking blir reagenset omsatt med reporter-merket anti-humant antistoff for å binde reporteren til reagenset i en proporsjon i forhold til mengden av bundet anti-HGV antistoff på den faste bæreren. Reagenset blir på ny vasket for å fjerne ubundet merket antistoff, og mengden av reporter assosiert med reagenset blir bestemt. Vanligvis er reporteren et enzym som blir detektert ved inkubering av den faste fasen i nærvær av et egnet fluorimetrisk eller kolorimetrisk substrat (Sigma, St. Louis, MO).

Det faste overflate reagenset i ovennevnte analyse blir dannet ved hjelp av kjente teknikker for kobling av proteinmaterialet til fast bærermateriale, så som polymeriske kuler, dyppepinner, 96-brønn skål eller filtermateriale. Disse koblingsmetodene innbefatter generelt uspesfikk adsorpsjon av proteinet til bæreren eller kovalent kobling av proteinet, vanligvis gjennom en fri amingruppe, til en kjemisk reaktiv gruppe på den faste bæreren, så som en aktivert karboksyl, hydroksyl eller aldehyd gruppe. Alternativt kan streptavidin belagte skåler blir anvendt sammen med biotinylerte antigener.

Et analysesystem eller sett for å utføre denne diagnostiske metoden utgjør også en del av oppfinnelsen. Settet innbefatter generelt en bærer med overflate-bundet rekombinant HGV antigen (for eksempel 470-20-1 antigen, som ovenfor), og et reporter-merket anti-humant antistoff for detektering av overflate-bundet anti-HGV antigen antistoff.

I en annen diagnostisk konfigurasjon, kjent som en homogen analyse, danner antistoff som blir bundet til en fast bærer visse forandringer i reaksjonsmediet som kan bli direkte detektert i mediet. Kjente generelle typer av homogene analyser foreslått ovenfor innbefatter (a) spin-merkede reportere, hvor anti-stoff bindingen til antigenet blir detektert ved en forandring i rapportert mobilitet (bredere spin splittende topper), (b) fluorescens reportere, hvor bindingen blir detektert ved en forandring i fluorescens effektiviteten eller polariseringen, (c) enzymreportere, hvor antistoffbindingen forårsaker enzym/substrat interaksjoner, og (d) liposom-bundede reportere, hvor bindingen fører til liposomlysering og frigjøring av innkapslet reporter. Tilpasning av disse metodene til proteinantigenet ifølge foreliggende oppfinnelse følger konvensjonelle metoder for dannelse av homogene analyse reagenser.

I hver av analysene beskrevet ovenfor innbefatter analysemetoden omsetning av serumet fra et forsøks individ med proteinantigenet og undersøkelse av antigenet for tilstedeværelse av bundet antistoff. Undersøkelsen kan innbefatte kobling av et merket anti-humant antistoff til antistoffet som blir undersøkt (for eksempel fra akutt, kronisk eller kovalesens fase) og måling av mengden av reporter bundet til den faste bæreren, som i den første metoden, eller kan innbefatte observering av effekten av antistoff som blir bundet til et homogent analysereagens, som i den andre metoden.

I en tredje diagnostisk konfigurasjon innbefatter anvendelse av HGV antistoffer med evne til å detektere HGV-spesifikke antigener. HGV antigener kan bli detektert, for eksempel, ved anvendelse av en antigen oppfangings analyse hvor HGV antigener tilstede i kandidatserumprøver omsettes med et HGV spesifikt monoklonalt eller polyklonalt antistoff. Antistoffet er bundet til et fast substrat og antigenet ble deretter detektert ifølge et andre, annet merket anti-HGV antistoff. Antistoffer kan bli dannet ved anvendelse av peptidene ifølge oppfinnelsen ifølge standardmetoder. Vesentlige isolerte antistoffer (vesentlig fri for serumproteiner som kan påvirke reaktiviteten) kan bli dannet (for eksempel affinitetsrensing (Harlow et al.)).

C. HYBRIDISERINGSANALYSE FOR HGV.

En anvendelse av nukleinsyresekvensene oppnådd ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er anvendelse derav som diagnostiske midler for HGV sekvenser tilstede i sera som derved indikerer infeksjon i individet. Primere og/eller prober avledet fra de kodende sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt, klon 470-20-1 og SEQ ID NO: 14 kan bli anvendt enkeltvis, eller i kombinasjon med hverandre, for å detektere

HGV.

I en diagnostisk konfigurasjon blir testserumet omsatt under PCR eller RT-PCR betingelser ved anvendelse av primere avledet fra for eksempel 470-20-1 sekvenser. Tilstedeværelse av HGV, i serum anvendt i amplifikasjonsreaksj oner, kan bli detektert ved spesifikk amplifikasjon av sekvenser målsøkt av primerene. Eksempel 4 beskriver anvendelse av polymerasekjede amplifikasjonsreaksj oner ved anvendelse av primere avledet fra klonene ifølge foreliggende oppfinnelse, for å screene forskjellige kildematerialer. Resultatene av disse amplifikasjonsreaksj onene demonstrerer evnen som primere avledet fra kloner ifølge foreliggende oppfinnelse har (for eksempel 470-20-1), for å detektere homologe sekvenser ved amplifikasjonsreaksj oner som anvender forskjellige kilder av templater. Amplifikasjonsreaksj onene i eksempel 4 innbefatter anvendelse av nukleinsyrer oppnådd direkte fra serum som templat materiale.

Prober kan alternativt bli avledet fra HGV sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse probene kan deretter bli merket og anvendt som hybridiseringsprober mot nukleinsyrer oppnådd fra testserum eller vevsprøver. Probene kan bli merket ved anvendelse av forskjellige reporter molekyler og detektert: for eksempel radioaktiv isotopisk merking og kjemiluminescens deteksjonsreportersystemer (Tropix, Bedford, Mass).

Målamplifikasjonsmetoder, innbefattet i polymerasekjedereaksjonen, selv-opprettholdende sekvens replikasjonsteknikk ["3SR", (Guatelli, et al.; Gingeras, et al., 1990) også kjent som "NASBA" (VanGenen, et al.)], ligasekjedereaksjon (Barany), tråd-erstatningsamplifikasjon ["SDA", (Walker)] og andre teknikker, multipliserer antall kopier av målsekvensen. Signalamplifikasjonsteknikker, eksemplifisert ved forgrenet-kjede DNA prober (Horn and Urdea; Urdea; Urdea, et al.) og Q-beta replikasemetoden (Cahill, et al.; Lomell, et al.), binder først en spesifikk molekylær probe og replikerer deretter alle eller deler av denne proben eller amplifiserer deretter probesignalet.

For deteksjon av spesifikke nukleinsyresekvenser beskrevet i foreliggende oppfinnelse eller ved siden av liggende sekvenser i samme eller lignende (relatert) viralt genom, kan amplifikasjons og deteksjonsmetoder bli anvendt, som alternativer til amplifikasjon ved PCR. Et antall slike teknikker er kjent innenfor fagområdet nukleinsyre diagnostikk (The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition, Clin. Chem. 39(4):705 (1993)). 1. SELV-OPPRETTHOLDENDE SEKVENS REPLIKASJON.

Selv-opprettholdende sekvens replikasjon (3 SR) teknikken resulterer i amplifikasjon i lik grad som PCR, men isotermisk. I stedenfor termisk syklus-drevet PCR trives 3 SR som en samtidig tre-enzym reaksjon av a) cDNA syntese ved revers transkriptase, b) RNA tråd degradering ved RNase H og c) RNA transkripsjon til T7 RNA polymerase.

Fordi hele reaksjonsekvensen oppstår isotermisk (vanligvis ved 42°C) er omfattende temperatur-sykliserings instrumentering ikke nødvendig. I fravær av dupleks denaturering via oppvarming, organiske oppløsningsmidler eller andre mekanismer blir bare enkelt-trådede templater (dvs. hovedsakelig RNA) amplifisert.

Egnede primere som anvendes i 3 SR amplifikasjon kan bli selektert fra virale sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse av fagfolk innenfor dette området. For eksempel for isotermisk amplifikasjon av virale sekvenser ved 3 SR teknikken, blir primer 470-20-1-77F (SEQ ID NO: 9) modifisert ved tilsetning av T7 promoter sekvensen og et foretrukket T7 transkripsjons-initieringssete til 5-enden av oligonukleotidet. Denne modifikasjonen resulterer i en egnet 3SR primer T7-470-20-1-77F (SEQ ID NO: 9). Primeren 470-20-1-21 IR (SEQ ID NO: 10) kan bli anvendt i disse reaksjonene enten uten modifikasjon eller T7 promoter.

RNA ekstrahert fra PNF 2161 blir inkubert med AMW revers transkriptase (30 U), RNase H (3 U), T7 RNA polymerase (100 U), i 100 ul reaksjoner inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 8,1 (ved romtemperatur), 15 mM MgCl2, 10 mM KC1, 2 mM spermidin HC1, 5 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og TTP, 7 mM hver av ATP, CTP, GTP og UTP, og 0,15 uM av hver primer. Amplifikasjonen foregår i løpet av inkubasjon ved 42°C i 1-2 timer.

Innledningsvis blir primeren T7-470-20-1-77F sammensmeltet til mål RNA og blir utvidet ved AMV revers transkriptase for å danne cDNA som er komplementær med utgangs RNA tråden. Etter degradering av RNA tråden ved RNase H katalyserer revers transkriptase syntesen av andre tråd DNA og resulterer i et dobbelt-trådet templat inneholdende (dobbelt-trådet) T7 promotersekvens. RNA transkripsjon resulterer i produksjon av enkelt-trådet RNA. Denne RNA går igjen inn i sykelen i ytterligere amplifikasjonsrunder og resulterer til slutt i en blanding av produkt RNA i høy konsentrasjon. Produktet er hovedsakelig enkelt-trådet RNA av samme tråd som primeren inneholdende T7 promoteren (T7-470-20-1-77F), med mye mindre mengder cDNA.

Alternativt kan den andre primeren (470-20-1-21 IR) inneholde T7 promoteren, eller så kan begge primerene inneholde promoteren og resultere i produksjon av begge trådene av RNA som produkter av reaksjonen. Produkter av 3SR reaksjonen kan bli detektert, karakterisert eller kvantifisert ved standardteknikker for analysering av RNA (for eksempel Northern blot, RNA slot eller dot blot, direkte gelelektroforese med RNA-farvende farvestoffer). Produktene kan videre bli detektert ifølge fremgangsmåter som drar nytte av biotion-avidin affinitets interaksjoner eller spesifikke hybridiseringer av nukleinsyre prober.

I en teknikke for hurtig og spesifikk analysering av 3 SR produktene blir oppløsningshybridisering av produktet til radiomerket oligonukleotid 470-20-1-152R (SEQ ID NO: 21) etterfulgt av ikke-denaturerende polyakrylamid gelelektroforese. Denne analysen (en gel mobilitetsskifts-type analyse) resulterer i deteksjon av spesifikt probe-produkt hybrid som et saktere bevegende bånd enn båndet som tilsvarer ikke-hybridisert oligonukleotid.

2. LIGASE KJEDE REAKSJON (LCR)

Som et annet eksempel på et deteksjonssystem kan HGV sekvensen danne grunnlaget for konstruksjon av ligase kjedereaksjon (LCR) primere. LCR drar nytte av nick-lukkings aktiviteten til DNA ligase for å koble to rett ved siden av stående oligonukleotider med ved siden av stående 5-fosfat ("donor" oligo) og 3-hydroksyl ("akseptor" oligo) termini. Egenskapene til DNA ligase som omfatter bare kobling av fullstendige komplementære ender på en templat-avhengig måte fører til en høy spesifisitetsgrad ved at ligeringen ikke vil oppstå hvis ikke de terminale endene som skal bli koblet er perfekt parret i sekvens med måltråden.

Som et alternativ til PCR, med noen fordeler med hensyn på spesifisitet for diskriminering av enkelt base feilparringer mellom primer og målnukleinsyre, kan LCR bli anvendt for å detektere eller "type" stammer av virus med homologi for HGV sekvensene. Disse teknikkene er egnede for å vurdere tilstedeværelse av spesifikke mutasjoner når slike baseforandringer er kjent for å utvise medikamentresistens (for eksempel Larder and Kemp; Gingeras, et al., 1991).

I nærvær av templat-komplementær donor og akseptor oligonukleotider og oligonukleotider som er komplementære med donor og akseptor, er eksponentiell amplifikasjon ved LCR mulig. I denne utførelsesformer danner hver ligeringsrunde ytterligere templat for påfølgende runder, i en syklisk reaksjon.

For eksempel kan primeren 470-20-1-21 IR (SEQ JD NO: 10), et ved siden av liggende oligonukleotid (B, SEQ JD NO: 22) og kognat oligoer (21 IR', SEQ JD NO: 23, og B', SEQ JD NO: 24) bli anvendt for å utføre LCR amplifikasjon av sekvensen ifølge oppfinnelsen. Revers transkripsjon blir først utført ifølge standardmetoder for å danne cDNA som deretter blir amplifisert i reaksjoner inneholdende 0,1-1 uM av hver av 4 LCR primere, 20 mM Tris-HCl, pH 8,3 (romtemperatur), 25 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM NAD+, 0,01% Triton X-100 og 5 enheter DNA ligase (Ampligase, Epicentre Technologies, Madison, WI or other commercial supplier of thermostable DNA ligase), i 25 ul reaksjoner.

Termisk syklisering blir utført ved 94°C i 1 min., 30 s; 94°C i 1 min., 65°C i 2 min., gjentatt i 25-40 sykluser. Spesifisiteten til produktsyntesen avhenger av primer-templat parringen ved den 3-terminale posisjonen. Produktet blir detektert ved polyakrylamin gelelektroforese etterfulgt av etidiumbromid farving. Alternativt blir en av akseptor oligoene (21 IR' eller B) 5'-radiomerket for visualisering ved autoradiografi etter gelelektroforese.

Alternativt blir en donoroligo 3'-ende-merket med en spesifikk bindbar del (for eksempel biotin) og akseptoren blir 5-merket med en spesifikk detekterbar gruppe (for eksempel et fluorescensfarvestoff) for fast fase oppfanging og deteksjon.

3. FREMGANGSMÅTER FOR ANALYSERING AV AMPLIFISERT DNA

Mange teknikker er blitt beskrevet for analysering av amplifisert DNA. Flere slike teknikker er fordelaktige for høye gjennomføringsapplikasjoner, hvor gelelektroforese er upraktisk, for eksempel, hurtig og høy-resolusjons HPLC teknikker (Katz and Dong). Fremgangsmåter for infeksiøs sykdomsorganisme screening ved anvendelse av nukleinsyreprober innbefatter et separat post-amplifikasjonshybridiseringstrinn for å forsikre nødvendig spesifisitet for patogen deteksjon.

En slik deteksjonsmetode er en affinitets-basert hybrid oppfaningsteknikk (Holodniy, et al.). I denne utførelsesformen blir PCR utført med en biotinylert primer. Etter amplifikasjon blir dobbelt-trådet produkt denaturert og deretter hybridisert til en peroksidase-merket probe som er komplementær med tråden ved innkorporert biotinylert primer. Det hybridiserte produktet blir deretter inkubert i en buffer som er i kontakt med en avidin (eller streptavidin) belagt overflate (for eksempel membranfilter, mikrobrønn, lateks eller paramagnetiske kuler).

Massen av belagt fast fase som kontakter volumet til PCR produkter som skal bli analysert ifølge denne metoden må inneholde tilstrekkelige biotin-bindingsseter for å oppfange vesentlig alle frie biotinylerte primere, samt den mye lavere konsentrasjonen av biotinylert PCR produkt. Etter 3 til 4 vaskinger av den faste fasen blir bundet hybridisert produkt detektert ved inkubering med o-fenylendiamin i citrat buffer inneholdende hydrogenperoksid.

Alternativt kan oppfangingen bli formidlet ved probe-belagte overflater etterfulgt av affinitets-basert deteksjon via biotinylert primer og et avidin-reporter enzym konjugat (Whetsell, et al.).

4. YTTERLIGERE METODER

Virale sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også danne grunnlaget for en enkelt amplifikasjonsmetode for deteksjon ved anvendelse av forgrenet-kjede DNA prober. Forgrenet-kjede prober (Horn and Urdea; Urdea) er blitt beskrevet for deteksjon og kvantifisering av sjelden RNA og DNA sekvenser (Urdea, et al.). I denne metoden blir en oligonukleotid probe (RNA, DNA eller nukleinsyre analog) syntetisert med en sekvens komplementær med mål RNA eller DNA. Proben inneholder også en unik forgreningssekvens eller sekvenser som ikke er komplementære med mål RNA eller

DNA.

Denne unike sekvensen utgjør et mål for hybridisering av forgrenede sekundære detektorprober som hver inneholder en eller flere andre unike sekvenser som virker som mål for tertiære prober. Ved hvert forgreningspunkt i signal amplifikasjonsreaksjonsveien leder en annen unik sekvens hybridisering av sekundære, tertiære osv. deteksjonsprober. Den siste proben i serien er vanligvis koblet til et enzym som er nyttig for deteksjon (for eksempel alkalisk fosfatase). Sekvensiell hybridisering av primere resulterer deretter til dannelse av sterk forgrenet struktur og armene terminerer i enzym-koblede prober.

Enzymatisk omdanning tilveiebringer en endelig amplifikasjon, og valg av meget sensitive kjemoluminescens substrater (for eksempel LumiPhos, Lumigen, Detroit, MI, som et substrat for alkalisk fosfatase markører) resulterer i omfattende sensitivtet i størrelsesorden 10.000 molekyler eller mindre av opprinnelig målsekvens pr analyse. I en slik deteksjonsmetode avhenger amplifikasjonen bare av molekylær hybridisering, og ikke av enzymatiske mekanismer, og er følgelig mindre mottagelig for inhibitoriske forbindelser i kliniske prøver enn for eksempel PCR. Denne deteksjonsmetoden muliggjør følgelig anvendelse av råteknikker for nukleinsyrefrigjøring i testprøver uten omfattende rensing før analysering.

Amplifikasjon for sensitiv deteksjon av virale sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli oppnådd ved Q-J3 replikase teknikk (Cahill et al.; Lomell, et al., Pritchard, et al.). I denne metoden blir den spesifikke proben konstruert slik at den er komplementær med målsekvensen. Denne proben blir deretter innskutt ved standardmolekylære kloningsteknikker i sekvensen til replikerbar RNA fra Q-J3 fag. Innskudd inn i en spesifikk region av replikonet forhindrer ikke replikasjon ved Q-J3 replikase.

Etter molekylær hybridisering, og flere sykluser med vasking, blir replikasen tilsatt og amplifikasjon av probe RNA oppnås. "Reversibel mål oppfanging" er en kjent teknikk for redusering av den potensielle bakgrunnen for replikasjon av ikke-hybridiserte prober (Morrissey, et al.).

Amplifiserte replikoner kan detekteres ved standardmolekylære hybridiseringsteknikker ved anvendelse av DNA, RNA eller nukleinsyre analogprober.

Ytterligere metoder for amplifikasjon og deteksjon av sjeldne DNA eller RNA sekvenser er kjent i litteraturen og foretrukket for PCR i noen anvendelser innenfor molekylær diagnostikk. Disse alternative teknikkene kan danne grunnlaget for deteksjon, karakterisering (for eksempel sekvens diversitet som eksisterer som flere relaterte stammer av sekvenser beskrevet heri, genotypiske forandringer som er karakteristiske for medikamentresistens) eller kvantifisering av sekvensen beskrevet i foreliggende oppfinnelse.

Analysesystemer eller sett for å utføre amplifikasjons/hybridiseringsanalysemetoder som nettopp er beskrevet danner også deler av oppfinnelsen. Slike sett innbefatter generelt enten spesifikke primere for anvendelse i amplifikasjonsreaksj onene eller hybri diseringsprober.

D. TERAPEUTISKE ANVENDELSER

Som diskutert ovenfor kan HGV antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse bli anvendt for preparering av vaksiner.

Antistoffer dannet mot polypeptidantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre bli anvendt for passiv immunterapi eller passiv immunprofylakse. Antistoffene kan bli administrert i mengder som ligner de som blir anvendt for andre terapeutiske administreringer av antistoff. For eksempel blir blandet gammaglobulin administrert ved 0,02-0,1 ml/lb kroppsvekt i løpet av tidlig inkubasjon av andre virale sykdommer så som rabies, meslinger og hepatitt B for å interferere med den etablerte infeksjonen. Antistoffer reaktive med HGV antigenene kan følgelig bli passivt administrert alene eller sammen med et annet anti-viralt middel til en vert infisert med HGV for å forsterke evnen som verten har til å bekjempe infeksjon.

HGV sekvenser beskrevet heri identifiserer HGV som et medlem av Flaviviridae familien (se ovenfor). Flaviviridae er klassifisert i tre slekter, flaviviruser, petstiviruser og hepatitt C virus slekten (Francki, et al.). Alle Flaviviridae har et positivt tråd RNA genom med 9,0-12 kb i lengde som koder for et enkelt langt polypeptid med 3000-4000 aminosyrer. Dette polypeptidet blir proteolytisk spaltet til omtrent 10 proteiner, inkludert et viralt kapsid protein, virale kappeproteiner og et minimum av 5 ikke-strukturelle proteiner (NS). De ikke-strukturelle proteinene innbefatter en chymotrypsin lignende serin protease, RNA helikase (NS3) og en RNA-avhengjg RNA polymerase (NS5). NS3 proteinet til Flaviviridae er nødvendig for proteolytisk spaltning av det virale polypeptidet. NS5 proteinet er nødvendig for replikasjon av det virale genomet (Chambers, et al., 1990a).

I tillegg er flere cellulære proteiner blitt identifisert og mer involvert i replikasjon av Flaviviridae. For eksempel kan cellulært signalpeptidase enzym være nødvendig for å spalte det virale polypeptidet ved flere spaltningsseter for å muliggjøre ekspresjon av den virale proteasen (Hijikata, et al.).

Inhibitorer som forhindrer disse proteinene fra å utføre deres nødvendige funksjoner i Flavivirus replikasjonen kan også ha terapeutisk verdi når det gjelder behandling av infeksjonen med HGV. Cytokiner eller andre polypeptider som er kjente for å ha antiviral aktivitet og/eller modulere det humane immunsystemet kan være effektivt når det gjelder å behandle HGV infeksjonen.

En forbindelse kjent for å inhibere Flaviviridae RNA avhengig RNA polymerase, som ved analogi kan ventes å inhibere aktiviteten til NS5 proteinet til HGV, er nukleotid analogen l-B-D-ribofuranosyl-l-2,4-triazol, 3-karboksamid, også kjent som ribavirin (Patterson, et al.). Virkningsmekanismen til ribavirin antas å involvere tapping av intercellulære guanin blandinger og interferens med capping av viralt RNA (Patterson et al.).

I individer infisert med HCV ble betydelige reduksjoner i virale titere og i serumnivåer av alanin aminotransferase (ALT ~ et indikatorenzym for leverfeilfunksjon) ble observert) mens ribavirin ble administrert (Reichard, et al.; Di Bisceglie, et al., 1992). Ribavirin ser ut til å ha bred effektivitet for behandling av Flaviviridae infeksjoner og fordelaktige resultater er ventet etter administrering av ribavirin til individer som lider av HGV avledet leversykdom.

En klasse forbindelser kjent for å være effektive for behandling av Flaviviridae infeksjoner innbefatter cytokiner interferon a, interferon 13 og interferon y (Baron, et al.; Gutterman). Interferoner antas å virke som antivirale ved både (i) indusering av ekspresjon av cellulære proteiner som interfererer med replikasjonen og translasjonen av viral RNA og (ii) ved aktivering av komponentene fra det humane cellulære immunsystemet (Baron, et al.). Interferoner har bred anvendbarhet ved behandling av virale infeksjoner inkludert infeksjoner med HB V, HDV og HCV (Gutterman; Farci, et al.). Spesielt har flere studier indikert at interferoner, enten alene eller i kombinasjon med andre antivirale terapier, er effektive for behandling av infeksjon med hepatitt C virus (Di Bisceglie, et al., 1989; Kakumu, et al.). På grunn av både tilsynelatende hepatotrofisk natur til HGV og dets klassifisering i familien Flaviviridae kan HGV infeksjon være ventet å reagere overfor lignende interferonterapi.

En annen klasse forbindelser med potent anti-viral aktivitet er inhibitorer av virale proteaser (Krausslich, et al.). Alle Flaviviridae koder for en chymotrypsin-lignende serin protease som er nødvendig for å spalte multiple seter av genompolypeptider ved flere seter i den ikke-strukturelle regionen. Aminosyreresidiene som danner det katalytiske setet til denne proteasen er godt beskrevet og innbefatter et histidin, et asparaginsyre og et serinresidie (Grakoui, et al.). Ytterligere studier av Flavivirus, gul febervirus har indikert at mutasjon av serin resi di et til det aktive setet inhiberer viral replikasjon (Chambers, et al., 1990b).

Inhibitorer av HGV NS3 proteinet kan bli konstruert for å etterligne overgangstilstanden ved enzymatisk spaltning. Slike inhibitorer kan bli isolert ved massescreening av tidligere syntetiserte forbindelser. Aktiviteten til antatte HGV NS3 proteinase inhibitorer kan bli bestemt ved anvendelse av in vitro transkripsjons-/translasjonssystemer som blir anvendt innen Flaviviridae forskning (Hijikata, et al.; Grakoui, et al.).

HGV genomet kan alternativt bli klonet inn i en egnet vektor for euakryot protein ekspresjon, så som bakuluvirus eller vaksinia, og effektiviteten til forbindelsene kan bli bestemt i vevskultur systemer (Grakoui, et al.). Lignende metoder er blitt utviklet for å oppnå potente inhibitorer av HIV protease (Vacca, et al.; Roberts, et al.).

En annen metode for å behandle sykdom forårsaket av infeksjon med HGV bygger på syntesen av antisens oligonukleotider (Tonkinson and Stein) eller oligonukleotidanaloger som koder for deler av sekvenser av HGV beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Som tilfellet er med alle Flaviviridae er det ventet at genomet til HGV er et positivt tråd RNA molekyl med størrelse på 9-12 kb. Den enkelt-trådede naturen til det virale genomet gjør HGV meget følsom overfor antisens oligonukleotider. Mulige målsekvenser som kan bli anvendt for å inhibere viral replikasjon innbefatter 5' utranslatert region til HGV, ribosom bindingssetet til HGV eller andre sekvenser som vil interferere med translasjonen av HGV genomet.

Antisens oligonukleotider kan bli syntetisert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige syntetisatorer. Oligonukleotidene blir fortrinnsvis syntetisert ved anvendelse av fosforoditioat skjelettet som har den fordelen av å være resistent overfor nukleasespaltning (Marshall & Caruthers). Ytterligere andre oligonukleotidanaloger, som de som har et uladet eller amidtype skjelett (Egholm, et al.) kan bli anvendt. Disse oligonukleotidene er kommersielt tilgjengelige (Biosearch, Millipore, Bedford, MA) og fordelaktige på grunn av at deres mangel på ladning muliggjør at de kan krysse biologiske membraner som vanligvis motstår passering av ladede makromolekyler.

Oligonukleotider (eller analoger derav) for antisens applikasjoner er vanligvis større enn 8 nukleotider i lengde for å lette hybridisering til en målsekvens innenfor HGV genomet. Ved hybridisering av for eksempel DNA oligomerer til virale RNA målsekvenser kan hybridiseringskomplekset bli degradert av et cellulært enzym så som RNAse H. Reduksjonen i HGV templater minsker deretter alvorligheten av HGV assosiert sykdom.

Nyttigheten og effektiviteten til ovennevnte terapeutiske metoder kan bli vurdert in vitro ved anvendelse av cellesystemene beskrevet ovenfor, og in vivo, ved anvendelse av dyremodell sy stemene beskrevet ovenfor.

MATERIALER OG METODER

Syntetiske oligonukleotid linkere og primere ble dannet ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige automatiserte oligonukleotidsyntetisatorer. Alternativt kan vanlige konstruerte syntetiske oligonukleotider bli oppnådd fra kommersielle forhandlere.

Standardmolekylær biologi og kloningsteknikker ble utført vesentlig som tidligere beskrevet i Ausubel et al., Sambrook et al., og Maniatis et al.

Vanlige manipuleringer som er relevante for anvendelse av antisera og/eller antistoffer for screening og deteksjon av immunreaktive proteinantigener ble utført vesentlig som beskrevet (Harlow, et al.). Likeledes ble ELISA og Western blot analyser for deteksjon av antivirale antistoffer utført enten som beskrevet av forhandlerene (Abboott, N. Chicago, IL, Genelabs Diagnostics, Singapore) eller anvendelse av standardteknikker kjent innenfor fagområdet (Harlow, et al.).

EKSEMPLER

Eksempel 1

Konstruksjon av PNF2161 cDNA bibliotek

A. ISOLERING AV RNA FRA SERA.

En milliliter ufortynnet PNF 2161 serum ble presipitert ved tilsetning av PEG (MW 6.000) til 8% og sentrifugering ved 12K i 15 minutter i en mikrosentrifuge ved 4°C. RNA ble ekstrahert fra den resulterende serumpelleten vesentlig som beskrevet av Chomczynski.

Pelleten ble behandlet med en oppløsning inneholdende 4 M guanidinium isotiocyanat, 0,18% 2-merkaptoetanol og 0,5% sarkosyl. Den behandlede pelleten ble ekstrahert flere ganger med sur fenol-kloroform og RNA ble presipitert med etanol. Denne oppløsningen ble oppbevart ved -70°C i omtrent 10 min. og ble deretter sentrifugert i en mikrosentrifuge ved 4°C i 10 min. Den resulterende pelleten ble resuspendert i 100 ml DEPC-behandlet (dietylpyrokarbonat) vann og 10 ul 3M NaOAc, pH = 5,2, to volum 100% etanol og et volum 100% isopropanol ble tilsatt til oppløsningen. Oppløsningen ble oppbevart ved -70°C i minst 10 min. RNA pelleten ble isolert ved sentrifugering i en mikrosentrifuge ved 12.000 x g i 15 min. ved 5°C. Pelleten ble vasket i 70% etanol og tørket under vakuum.

B. SYNTESE AV cDNA

(i) SYNTESE AV FØRSTE TRÅD

Syntese av cDNA molekyler ble oppnådd som følger. Ovennvente DNA preparater ble transkribert til cDNA ifølge metoden til Gubler et al. ved anvendelse av tilfeldige nukleotid heksamer primere (cDNA Synthesis Kit, BMB, Indianapolis, IN eller

GIBCO/BRL).

Etter andre-tråd cDNA syntesen ble T4 DNA polymerase tilsatt til blandingen for å maksimalisere antall butt-ender av cDNA molekylene. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol/kloroform og kloroform isoamylalkohol.

cDNA ble presipitert ved tilsetning av 2 volum 100% etanol og avkjøling ved -70°C i 15 minutter. cDNA ble samlet ved sentrifugering og pelleten vasket med 70% etanol og tørket under vakuum.

C. AMPLIFIKASJON AV DOBBELT TRÅDEDE cDNA MOLEKYLER.

cDNA pelleten ble resuspendert i 12 ul destillert vann. Til resuspenderte cDNA molekyler ble følgende komponenter tilsatt: 5 ul fosforylerte linkere (Linker AB, en dobbelttrådet linker som omfatter SEQ JD NO: 1 og SEQ JD NO: 2, hvor SEQ JD NO: 2 er i en 3' til 5' orientering i forhold til SEQ JD NO: 1 ~ som en delvis komplementær sekvens til SEQ JD NO: 1), 2 ul 10x ligeringsbuffer (0,66 M Tris.Cl pH=7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10 mM ATP) og 1 ul T4 DNA ligase (0,3 til 0,6 Weiss Units). cDNA og linkeren ble blandet i et 1:100 forhold. Reaksjonen ble inkubert ved 14°C over natt. Neste morgen ble reaksjonen inkubert ved 70°C i 3 minutter for å inaktivere ligasen.

Til 100 ul 10 mM Tris-Cl buffer, pH 8,3 inneholdende 1,5 mM MgCl2 og 50 mM KC1 (buffer A) ble det tilsatt omtrent 1 ul linker-ligert cDNA preparat, 2 uM av en primer som har sekvensen vist som SEQ JD NO: 1, 200 uM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 2,5 enheter Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq polymerase). Reksjonsblandingen ble oppvarmet til 94°C i 30 sek. for denaturering, avkjølt til 50°C i 30 sek. for primersammensmeltning og deretter oppvarmet til 72°C i 0,5-3 minutter for å muliggjøre primer ekstensjon ved Taq polymerase. Amplifikasjonsreaksj onen som omfatter suksessiv oppvarming, avkjøling og polymerasereaksjon ble gjentatt ytterligere 25-40 ganger ved hjelp av en Perkin-Elmer Cetus DNA thermal cycler (Mullis; Mullis, et al.; Reyes, et al., 1991; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT).

Etter amplifikasjonsreaksj onene ble oppløsningen deretter fenol/kloroform, kloroform/isoamylalkohol ekstrahert og presipitert med to volum etanol. Resulterende amplifiserte cDNA pelleter ble resuspendert i 20 ul TE (pH = 7,5).

D. KLONING AV cDNA INN I LAMBDA VEKTORER

Linkerene anvendt for konstruksjon av cDNA inneholdt et EcoRI sete som muliggjorde direkte innskudd av amplifiserte cDNA inn i lambda gtl 1 vektorer (Promega, Madison WI eller Stratagene, La Jolla, CA). Lambda vektorer ble oppnådd fra forhandleren (Promega) som allerede var spaltet med EcoRI og behandlet med alkalisk fosfatase for å fjerne 5'fosfat og forhindre selv-ligering av vektoren.

EcoRI-spaltede cDNA preparater ble ligert inn i lambda gtl 1 (Promega). Betingelsene

for ligeringsblande reaksjonene var som følger: 1 ul vektor DNA (Promega, 0,5 mg/ml); 0,5 eller 3 ul PCR amplifisert innskudds cDNA; 0,5 ul 10 x ligeringsbuffer (0,5 M tris-HC1, pH=7,8; 0,1 M MgCl2; 0,2 M DTT; 10 mM ATP; 0,5 mg/ml bovin serum albumin (BSA)), 0,5 ul T4 DNA ligase (0,3 til 0,6 Weiss enheter) og destillert vann til et endelig reaksjonsvolum på 5 ul.

Ligeringsreaksjonene ble inkubert ved 14°C over natt (12-18 timer). Ligert cDNA ble pakket ved standard prosedyrer ved anvendelse av et lambda DNA pakkesystem ("GIGAPAK", Stratagene, LaJolla, CA), og deretter sådd utved forskjellige fortynninger for å bestemme titere. En standard X-gal blå/hvit analyse ble anvendt for å bestemme rekombinant frekvens til bibliotekene (Miller; Maniatis et al.).

Prosent rekombinasjon i hvert bibliotek ble også bestemt som følger. Et antall tilfeldige kloner ble selektert og korresponderende fag DNA isolert. Polymerase kjedereaksjon (Mullis; Mullis, et al.) ble deretter utført ved anvendelse av isolert fag DNA som templat og lambda DNA sekvenser, avledet fra lambda sekvenser som flankerer EcoRI innskuddssetet for cDNA molekylene, som primere. Tilstedeværelse eller fravær av innskudd fremkom fra gelanalyser av polymerasekjedereaksjonsproduktene. cDNA-innskudds fag bibliotek dannet fra serumprøve PNF 2161 ble deponert til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MS 20852, og ble tildelt deponeringsbetegnelse ATCC 75268 (PNF 2161 cDNA kilde).

EKSEMPEL 2

IMMUNSCREENING AV REKOMBINANTE BIBLIOTEK

Lambda gtl 1 bibliotek dannet i eksempel 1 ble immunscreenet for produksjon av antigener som kan gjenkjennes av PNF 2161 serum som bibliotekene ble dannet fra. Fagen ble sådd ut for plakk dannelse ved anvendelse av Escherichia coli bakteriell utsåingsstamme E. coli KM392. Alternativt kan E. coli Y1090R (Promega, Madison WI) bli anvendt.

Fusjonsproteiner uttrykt fra lambda gtl 1 kloner ble screenet med serumantistoffer vesentlig som beskrevet av Ausubel, et al.

Hvert bibliotek ble sådd ut med omtrent 2x10^ fag pr 150 mm skål. Skålene ble belagt med nitrocellulosefiltere over natt. Filtrene ble vasket med TBS (10 mM, Tris pH 7,5; 150 mM NaCl), blokkert med AIB (TBS buffer med 1% gelatin) og inkubert med et primært antistoff fortynnet 100 ganger i AIB.

Etter vasking med TBS ble filtrene inkubert med et andre antistoff, geite-anti-humant IgG konjugert til alkalisk fosfatase (Promega). Reaktive plakk ble utviklet med et substrat (for eksempel BCIP, 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat), med NBT (nitro blå tetrazoliumsalt (Sigma)). Positive områder fra den primære screeningen ble på ny utsådd og immunscreenet helt til rene plakk ble oppnådd.

EKSEMPEL 3

SCREENING AV PNF 2161 BIBLIOTEKET

cDNA bibliotek av PNF 2161 i lambda gtl 1 ble screenet, som beskrevet i eksempel 2, med PNF 2161 sera. Resultatene av screeningen er presentert i tabell 1.

1. cDNA bibliotek konstruert fra den indikerte humane kilden.

2. Prosent rekombinante kloner i angitte gtl 1 bibliotek bestemt ved blå/hvit plakk analyse og bekreftet ved PCR amplifikasjon av tilfeldige selekterte kloner.

3. Antisera kilde anvendt for immunscreening av hvert indikerte bibliotek.

En av klonene isolert ved ovennevnte screening (PNF 2161 klon 470-20-1, SEQ ID NO: 3; J3-galaktosidase i-ramme fusjons translatert sekvens, SEQ ID NO: 4), ble anvendt for å danne ekstensjonskloner, som beskrevet i eksempel 6. Klon 470-20-1 nukleinsyresekvensen er presentert som SEQ ID NO: 3 (proteinsekvens SEQ ID NO: 4). Isolert nukleinsyresekvens uten SISPA kloningslinkere er presentert som SEQ ID NO: 19 (protein SEQ ID NO: 20).

EKSEMPEL 4

KARAKTERISERING AV IMMUNREAKTIV 470- 20- 1 KLON

A. SOUTHERN BLOT ANALYSER AV IMMUNREAKTIVE KLONER

Innskuddene av immunreaktive kloner ble screenet for deres evne til å hybridisere til følgende kontroll DNA kilder: normal human perifer blodlymfocyt (oppnådd fra Stanforf University Blood Bank, Stanford, California) DNA, og Escherischia coli KM392 genomisk DNA (Ausubel, et al.; Maniatis, et al.; Sambrook, et al.). Ti mikrogram human lymfocyt DNA og 2 ug E. coli genomisk DNA ble spaltet med EcoRI og HindUI. Restriksjonsspaltede produkter ble separert elektroforetisk på en agarosegel (Ausubel, et al.) og overført til nylon eller nitrocellulose membraner (Schleicher and Schuell, Keene, NH) ifølge forhandlerens instruksjoner.

Prober fra immunreaktive kloner ble dannet som følger. Hver klon ble amplifisert ved anvendelse av primere som tilsvarer lambda gtl 1 sekvenser som flankerer EcoRI kloningssetet til gtl 1 vektoren. Amplifikasjon ble utført ved polymerasekjede reaksjoner ved anvendelse av hver immunreaktive klon som templat. Resulterende amplifikasjonsprodukter ble spaltet med EcoRI, amplifiserte fragmenter gelrenset og eluert fra gelen (Ausubel, et al.). Resulterende amplifiserte fragmenter, oppnådd fra immunreaktive kloner, ble deretter tilfeldig primermerket ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett (BMB) som anvender <32p_>dNTP.

Tilfeldige primede prober blir deretter hybridisert til ovennevnte nylonmembran for å teste hybridisering av innskuddssekvensene til kontroll DNA. 470-20-1 innskuddet hybridiserte ikke med noen av kontroll DNA.

Som positive hybridiseringskontroller ble et probederivat fra et humant C-kappa genfragment (Hieter) anvendt som enkel gen kopikontroll for human DNA og et E. coli polymeras genfragment ble likeledes anvendt for E. coli DNA.

B. GENOMISK PCR

PCR deteksjon ble utviklet først for å verifisere eksogenisiteten med hensyn på flere genomiske DNA som kunne ha blitt uventet klonet i løpet av bibliotekskonstruksjonen og deretter testet for tilstedeværelse av den klonede sekvensen i kloningskilden og relaterte prøvematerialer. Flere forskjellige typer av prøver, inkludert SISPA-amplifiserte nukleinsyrer og nukleinsyre ekstrahert fra den primære kilden, og nukleinsyrer ekstrahert fra beslektede kildematerialer (for eksempel fra dyreføringsstudier), ble testet.

Betegnelsen "genomisk PCR" refererer til testing for tilstedeværelse av spesifikke sekvenser i genomisk DNA fra relevante organismer. For eksempel vil et genomisk PCR for Mystax-avledet klon innbefatte genomisk DNA som følger:

1. humant DNA (1 ug/rxn.)

2. Myslax DNA (0,1 -1 ug/rxn.)

3. E. coli (10-100 ng(rxn.)

4. gjær (10-100 ng/rxn.)

Humant og Mystax DNA ble testet, som øyeblikkelige og ultimat kilde for middelet. E. coli genomisk DNA, som en hyppig kontaminant av kommersielle enzympreparater, blir testet. Gjær blir også testet, som en allesteds nærværende organisme, hvor DNA kan kontaminere reagenser og følgelig bli klonet.

I tillegg blir en negativ kontroll (dvs. buffer eller bare vann), og positive kontroller for å innbefatte omtrent 10^c/rxn. også amplifisert.

Amplifikasjonsbetingelsene varierer og kan bli bestemt for individuelle sekvenser, men følger følgende standard PCR protokoll: PCR ble utført i reaksjoner inneholdende 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,75 mM MgCl2, 1,0 uM hver primer, 200 uM hver av dATP, dCTP og dGTP og 300 uM dUTP, 2,5 enheter Taq DNA polymerase, og 0,2 enheter uracil-N-glykosylase pr 100 ul reaksjon. Sykliseringen varte i minst 1 minutt ved 94°C, etterfulgt av 30 til 40 denatureringsrepetisjoner (92-94°C i 15 sekunder), sammensmeltning (55-56°C i 30 sekunder) og ekstensjon (72°C i 30 sekunder). PCR reagensene ble oppstilt, og amplifikasjonsreaksj onene ble utført, i et spesifikt-konstruert laboratorie opprettholdt fri for amplifisert DNA.

Som ytterligere barriere for kontaminasjon ved amplifiserte sekvenser og følgelig kompromittering av testen ved "falske positiver" ble PCR utført med dUTP som erstatter TTP, for å gjøre amplifiserte sekvenser biokjemisk skjelnbare i forhold til nativt DNA. For enzymatisk å gjøre eventuelt kontaminerende PCR produkt ikke amplifiserbart ble enzymet uracil-N-glykosylase inkludert i alle genomiske PCR reaksjoner. Ved endt termisk syklisering ble reaksjonene oppbevart ved 72°C for å forhindre renaturering av uracil-N-glykosylase og mulig degradering av amplifiserte U-inneholdende sekvenser.

En "HOT START PCR" ble utført ved anvendelse av standardteknikker ("AMPLTWAX", Perkin-Elmer Biotechnology; og alternativt ble manuelle teknikker anvendt, for å gjøre ovennevnte generelle protokoll mere robust for amplifikasjon av diverse sekvenser som ideelt sett krever forskjellige amplifikasjonsbetingelser for maksimal sensitivitet og spesifisitet.

Deteksjon av amplifisert DNA ble utført ved hybridisering til spesifikke oligonukleotidprober beliggende i det indre av to PCR primersekvenser og som ikke har eller har minimal overlapping med primerene. I noen tilfeller ble direkte visualisering av elektroforerte PCR produkter utført ved anvendelse av etidiumbromid fluorescens, men probehybirdisering ble i hvert tilfelle også utført for å forsikre diskriminering mellom spesifikke og uspesifikke amplifikasjonsprodukter. Hybridisering til radiomerkede prober i oppløsningen ble fulgt ved elektroforese i 8-15% polyakrylamidgeler (som hensiktsmessige i forhold til størrelsen av den amplifiserte sekvensen) og autoradiografi.

Klonen 470-20-1 ble testet ved genomisk PCR overfor huamnt, E. coli og gjær DNA. Ingen spesifikk sekvens ble detektert i negative kontrollreaksjoner og heller ikke i genomisk DNA som ble testet og 10^ kopier av DNA/reaksjon resulterte i et lett detekterbart signal. Denne sensitiviteten (dvs. lO^/reaksjon) er tilstrekkelig for deteksjon av enkel-kopi humane sekvenser i reaksjoner inneholdende 1 ug totalt DNA som representerer DNA fra omtrent 1,5 x 10^ celler.

C. DIREKTE SERUM PCR

Serum eller annen kloningskilde eller beslektede kildematerialer ble direkte testet ved PCR ved anvendelse av primere fra selekterte klonede sekvenser. I disse eksperimentene ble HGV virale partikler presipitert fra sera med polyetylenglykol (PEG), eller, når det gjelder PNF og visse andre sera, ble disse pelletert ved ultrasentrifugering. For rensing av RNA ble pelleterte materialer oppløst i guanidintiocyanat og ekstrahert ved sur guanidiniumfenol teknikk (Chomczynski, et al.).

En modifikasjon av denne metoden oppnådd og implementert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser, for eksempel "TRJREAGENT" (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) eller "TRIZOL" (Life Technologies, Gaithersburg, MD), og assosierte protokoller ble anvendt for å isolere RNA. I tillegg ble RNA egnet for PCR analyser isolert direkte fra serum eller andre fluider inneholdende virus, uten tidligere konsentrering eller pelletering av viruspartikler, gjennom anvendelse av "PURESCRJPT" reagenser og protokoller (Gentra Systems, Minneapolis, MN).

Isolert DNA ble anvendt direkte som en templat for PCR. RNA ble revers transkribert ved anvendelse av revers transkriptase (Gibco/BRL) og cDNA produktet ble deretter anvendt som en templat for påfølgende PCR amplifikasjon.

Når det gjelder 470-20-1 ble nukleinsyren fra ekvivalent 20-50 ul PNF serum anvendt som input templat for hver RT-PCR eller PCR reaksjon. Primere ble konstruert basert på 470-20-1 sekvensen, som følger: 470-20-1-77F (SEQ ID NO: 9) og 470-20-1-21 IR (SEQ ID NO: 10). Revers transkripsjon ble anvendt ved anvendelse av MMLV-RT (Gibco/BRL) og tilfeldige heksamerer (Promega) ved inkubering ved romtemperatur i omtrent 10 minutter, 42°C i 15 minutter og 99°C i 5 minutter med hurtig avkjøling til 4°C. Syntetisert cDNA ble amplifisert direkte, uten rensing, ved PCR, i reaksjoner inneholdende 1,75 mM MgCl2, 0,2-1 uM av hver primer, 200 uM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 2,5-5,0 enheter Taq DNA polymerase. ("AMPLITAQ", Perkin-Elmer) pr 100 ul reaksjon. Sykliseringen var i minst 1 minutt ved 94°C, etterfulgt av 40-45 repetisjoner av denatureringen (94°C) i 15 sekunder i 10 sykluser; 92°C eller 94°C i 15 sekunder i påfølgende sykluser), sammensmeltning (55°C i 30 sekunder) og ekstensjon (72°C i 30 sekunder), i "GENEAMP SYSTEM 9600" termisk syklus (Perkin-Elmer) eller sammenlignbare cykliseringsbetingelser i andre termiske cykliseringsinnretninger (Perkin-Elmer; MJ Research, Watertown, MA).

Positive kontroller besto av (i) tidligere amplifisert PCR produkt hvor konsentrasjonen ble vurdert ved anvendelse av Hoechst 33258 fluorescensanalyse, (ii) renset plasmid DNA inneholdende DNA sekvensen av interesse, eller (iii) rensede RNA transkripter avledet fra plasmidkloner hvor DNA sekvensen av interesse er forflyttet under transkripsjonen kontroll av fag RNA promotere så som T7, T3 eller SP6 og RNA dannet ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig in vitro transkripsjonssete. I tillegg kan en alikvot av positivt kontroll DNA tilsvarende omtrent 10-100 kopier/rxn., bli anvendt i reaksjoner inneholdende nukleinsyrer ekstrahert fra kloningskildeprøven, som en kontroll for tilstedeværelse av inhibitorer av DNA amplifikasjonsreaksj onene. Hvert separate ekstrakt ble testet med minst en positiv kontroll.

Spesifikke produkter ble detektert ved hybridisering til en spesifikk oligonukleotidprobe 470-20-1-152F (SEQ ID NO: 16) for bekreftelse av spesifisiteten. Hybridisering av 10 ul PCR produkt ble utført i oppløsning i 20 ul reaksjoner inneholdende omtrent 1 x 10^ cpm <32>P-merket 470-20-1-152F. Spesifikke hybrider ble detektert etterfulgt av

elektroforetisk separasjon fra uhybridisert oligo i polyakrylamidgeler og autoradiografi.

I tillegg til PNF, ble ekstraherte nukleinsyrer fra normalt serum også revers transkribert og amplifisert, ved anvendelse av "serum PCR" protokollsekvensen. Ikke noe signal ble detektert i normalt humant serum. Det spesifikke signalet i PNF serum ble detektert reproduserbart i flere ekstrakter med 470-20-1 spesifikke primere.

D. AMPLIFIKASJON FRA SISPA UKLONEDE NUKLEINSYRER

SISPA (sekvens-uavhengig enkelt-primer amplifikasjon) amplifisert cDNA ble anvendt som templat (eksempel 1). Sekvens-spesifikke primere konstruert fra selekterte klonede sekvenser ble anvendt for å amplifisere DNA fragmentene av interesse fra templatene.

Templatene var vanligvis SISPA-amplifiserte prøver anvendt i kloningsmanipuleringer. For eksempel ble amplifikasjonsprimerene 470-20-1-77F (SEQ JD NO: 9) og 470-20-1-21 IR (SEQ ID NO: 10) selektert fra klonen 470-20-1 sekvensen (SEQ ID NO: 3). Disse primerene ble anvendt i amplifikasjonsreaksj oner med SISPA-amplifisert PNF2161 cDNA som et templat.

Identiteten til amplifiserte DNA fragmenter ble bekreftet ved (i) hybridisering med spesifikk oligonukleotidprobe 470-20-1-152F (SEQ ID NO: 16), konstruert basert på 470-20-1 sekvensen (SEQ ID NO: 3) og/eller (ii) størrelsen. Proben anvendt for DNA blot deteksjonen ble merket med digoksygenin ved anvendelse av terminal transferase ifølge forhandlerens anbefalinger (BMB). Hybridisering til amplifisert DNA ble deretter utført ved anvendelse av enten Southern blot eller væskehybridiserings- (Kumar, et al., 1989) analyser.

Positiv kontroll DNA anvendt i amplifikasjonsreaksj onene var tidligere amplifisert PCR produkt hvor konsentrasjonen ble vurdert ifølge Hoechst 33258 fluorescensanalysen, eller alternativt, renset plasmid DNA inneholdende det klonede innskuddet av interesse.

470-20-1 spesifikt signal ble detektert i cDNA amplifisert ved PCR fra SISPA-amplifisert PNF2161. Negative kontrollreaksjoner var ikke-reaktive, og positive kontroll DNA templater ble detektert.

E. AMPLIFIKASJON FRA LEVER RNA PRØVER.

RNA ble dannet fra leverbiopsi materialet ifølge metodene til Cathal, et al., hvor vevet ble ekstrahert i 5M guanidin tiocyanat etterfulgt av direkte presipitering av RNA med 4M Li Cl. Etter vasking av RNA pelleten med 2M Li Cl, ble gjenværende kontaminerende protein fjernet ved ekstrahering med fenol:kloroform og RNA isolert ved etanolpresipitering.

470-20-1 spesifikke primere ble også anvendt i amplifikasjonsreaksj onene med følgende RNA kilder som substrat: normal mystax lever RNA, normal tamarin (Sanguinus labiatus) lever RNA og MYI31 lever RNA. MYI31 er en mystax som ble inokulert intravenøst med 1 ml PNF2161 plasma. Det var synlige forhøyninger i et leverenzym (SCJD) og histologiske tegn på en tilsynelatende viral infeksjon. Den histologiske korrelasjonen var mest tydelig i leveren til MYI31 og leveren ble oppnådd ved eller nære ved toppen av SCJD aktiviteten. Mystax 131 lever RNA ga ikke

amplifiserte produkter med ikke-kodende primere (SEQ ID NO: 7 og SEQ ID NO: 8) av

HCV.

Amplifikasjonsreaksj onene ble utført i duplikat i to eksperimenter. Resultatene av disse amplifikasjonsreaksj onene er presentert i tabell 2.

Disse resultatene demonstrerer at 470-20-1 sekvensene er tilstede i foreldreserum prøven (PNF 2161) og i en lever RNA prøve fra et førende dyr av PNF 2161 prøven (MY131). Begge kontroll RNA var negative for tilstedeværelse av 470-20-1 sekvenser.

F. SCREENING AV ET SERUMPANEL FOR HGV SEKVENSER VED

POLYMERASEKJEDE REAKSJON VED ANVENDELSE AV RNA

TEMPLATER

1. HØ Y-ALT DONORER

Sykdomsassosiasjonen mellom HGV og leversykdommen ble vurdert ved polymerasekjedereaksjonsscreening ved anvendelse av HGV spesifikke primere av sera fra hepatitt pasienter og fra bloddonorer med unormal leverfunksjon. Sistnevnte besto av serum fra blod donasjoner med serum ALT nivåer høyere enn 45 internasjonale enheter pr ml.

Et serumpanel bestående av 152 total sera ble selektert. Følgende sera ble selektert fra serumpanelet: 104 høy-ALT sera fra screenende blod donasjoner ved Stanford University Blood Bank (SUBB); 34 N-(ABCDE) hepatitt sera fra nord California, Egypt og Peru; og 14 sera fra andre donorer antatt å ha leversykdom og/eller hepatitt virus infeksjon. Negative kontroller for panelet var som følger: 9 høyt-screenede blod donorer (SUBB) merkbare for fravær av risikofaktorer for virale infeksjoner ("supernormalt" sera, for eksempel o-negative, Rh-negative; negative for HIV, kjente hepatittmidler og CMV; hvor flere tidligere blod donasjoner var blitt transfusert uten å forårsake sykdom); og to tilfeldige blod donorer. Disse sera ble analysert for tilstedeværelse av HGV spesifikke sekvenser ved RT-PCR ved anvendelse av 470-20-1 primerene 77F (SEQ ID NO: 9) og 21 IR (SEQ ID NO: 10).

RNA ekstraksjon og RT-PCR ble utført vesentlig som beskrevet i eksempel 4C med unntagelse av at primeren 470-20-1-21 IR ble 5-biotinylert for å lette hurtig screening av amplifiserte produkter ifølge en fremgangsmåte som innbefatter hybridisering i oppløsning, etterfulgt av affinitetsoppfanging av hybridisert probe ved anvendelse av streptavidin-belagte paramagnetiske kuler. Fremgangsmåte for analysering av nukleinsyrer ved hybridsering til spesifikke merkede prober med oppfanging av hybridiserte sekvenser gjennom affinitetsinteraksjoner er velkjent innenfor området nukleinsyreanalysering.

Avhengig av mengden serum tilgjengelig for testing ble RNA fra 30 til 50 ul serum anvendt pr RT/PCR reaksjon. Hvert serum ble testet i duplikat, i det positive kontroller tilsvarer 10, 100 eller 1000 kopier RNA transkript pr reaksjon og med hensiktsmessige negativ (buffer) kontroller. Ingen negative kontroller var reaktive, og minst 10 kopier pr reaksjon var detekterbare i hver PCR kjøring. Ubestemte resultater ble definert som spesifikt hybridiseringssignal som er tilstede i bare en av to duplikate reaksjoner.

Effektiv, meget sensitiv analyse av produkter fra amplifikasjonsanalysen av dette serumpanelet ble utført ved anvendelse av et instrument spesifikt konstruert for affinitets-baser hybridoppfanging ved anvendelse av elektrokjemiluminescens oligonukleotid prober (QPCR System 5000TM, Perkin-Elmer). Analyser som anvender QPCR 5000™ er blitt beskrevet tidligere (DiCesare, et al; Wages, et al.).

Produkter fra hver reaksjon ble analysert ved hybridisering til probe 470-20-1-152F (5-ende-merket med et elektrokjemiluminescens ruthenium chelat) og måling ved anvendelse av "QPCR 5000". Basert på en avspaltning av summen av gjennomsnittet og tre ganger standardavviket til negative kontroller i en gitt amplifikasjonskj øring, ble totalt 34 mulige positive prøver selektert for bekreftende testing. 34 prøver ble analysert ved oppløsningshybridisering og elektroforese (eksempel 4C). Av disse 34 prøvene ble 6 sera (dvs. 6/152) vist å ha spesifikke hybridiserende sekvenser i duplikate reaksjoner. Av disse 6 prøvene var 3 sterkt reaktive sammenlignet med positive kontroller: et høy-ALT serum fra SUBB og to N-(ABCDE) fra Egypt.

En andre blodprøve ble oppnådd fra sterkt positiv SUBB serumdonor et år etter at den opprinnelige prøven ble tatt. Den andre serumprøven ble bekreftet å være HGV positiv ifølge PCR metodene beskrevet ovenfor. Dette resultatet bekrefter vedvarende infeksjon ved HGV i et menneske. Serumet ble betegnet "JC". Serumdonoren var HCV negativ (bestemt ved serumreaktivitetstester og PCR) og antistoffnegativ for HAV og HBV.

I tillegg ble et tredje (N-(ABCDE) serum fra Egypt, en nord California blod donor med N-(ABCDE) hepatittserum, ble også vist å være svakt positiv ifølge denne metoden. To andre sera ga mellomliggende resultater definert som tilstedeværelse av spesifikke sekvenser i en av to amplifikasjonsreaksj oner.

Påfølgende PCR analyser av replikate serumalikvoter fra disse HGV-positivene og ubestemte sera resulterte i HGV-positive resultater i 6 av 8 sera testet og ubestemte resultater i gjenværende to sera.

Et andre primer sett ble anvendt for bekreftelse av HGV positive prøver. Dette primersettet (GV57-4512MF, SEQ ID NO: 121, og GV57-4657MR, SEQ ID NO: 122) for diagnostisering av amplifikasjon ble selektert fra en konservert region av HGV avledet fra antatt NS5 kodende region. Et omtrent 2,2 kb fragment ble amplifisert fra hver av 5 separate HGV isolater. Primerene anvendt for amplifikasjonsreaksj onene var 470EXT4-2189R (SEQ ID NO: 119) og 470EXT4-29F (SEQ ID NO: 120). Amplifiserte DNA fragmenter ble sekvensert og sekvenser oppstilt. Sterkt konserverte regioner ble identifisert fra oppstillingen og optimale primersekvenser ble konstruert ved inkorporering av blandet basesyntese ved de posisjonene som fortsatt var divergente i de 5 sekvensene. De resulterende NS5 primerene var som følger: GV57-4512MF, SEQ ID NO: 121, og GV57-4657MR, SEQ ID NO: 122. Disse primerene ble anvendt for å amplifisere et diagnostisk fragment på 165 bp fra testprøvene.

En indre probesekvens, GV22dc-89MF (SEQ ID NO: 123) ble oppnådd fra en annen sterkt konservert region for deteksjon av spesifikt amplifisert produkt. Proben har også tilstrekkelig lengde for å muliggjøre deteksjon av minimalt divergente HGV sekvenser under reduserte divergensbetingelser.

Analysering av prøver for tilstedeværelse av diagnostisk NS5 sekvens fulgte samme betingelser for prøvepreparering, amplifikasjon og væske hybridisering som beskrevet for 470-20-1 primerene (eksempel 4C). Samsvar av resultater for seraprøver analysert ved PCR ved anvendelse av både 470-20-1 og NS5 primer pairene er vist i tabell 3.

Ytterligere PCR analyser av ytterligere alikvoter oppnådd fra 8 sera identifisert ovenfor å være HGV-positive ble utført ved anvendelse av 470-20-1 primersettet (SEQ ID NO: 9 og SEQ ID NO: 10) og NS5 primersettet. I disse analysene ga HGV PCR analyser vedvarende positive resultater i 5 av 8 sera. Disse resultatene er presentert i tabell 4.

I kontrast til dette var ingen av de to tilfeldige donorene eller ni høyt-screenede "supernormale" sera positive i et hviket som helst sett av PCR analyser.

Disse resultatene gjenoppretter sykdomsassosiasjonen mellom HGV og leversykdommen.

Ytterligere testing av sera fra høy-ALT donorer har gitt følgende resultater. Totalt 495 sera er blitt testet, i tillegg til det opprinnelige panelet på 104 sera beskrevet ovenfor. Av disse 495 prøvene ble 6 identifisert som HGV positive ved anvendelse av primer parret 470-20-1 77F (SEQ ID NO: 9) og 470-20-1-21 IR (SEQ ID NO: 10). Disse seks seraene har følgende HCV profiler: R25342, HCV negative; RI7749, HCV positive; J53171, HCV positive, HB V positive; J54406, HCV negative; R08074, HCV negative; og X31049, HCV negative. Positive registreringer er basert på gjentatt reaktivitet i minst to separate reaksjoner. R25342 ble testet og bekreftet positive ved PCR ved anvendelse av NS5 primerparret. Følgelig er en deteksjonsrate på omtrent 1,2% blitt observert (7 av 599 testet).

Friskt-oppnådde plasmaprøver fra bloddonorer med forhøyet ALT ble også oppnådd fra SUBB, Peninsula Blood Bank (Burlingame, CA) og New York Blood Center (New York, NY), for testing for HGV RNA ved PCR (470-20-1 primerparret). 214 totale donasjoner ble testet og totalt 5 (omtrent 2,3%) var HGV RNA positive. Disse fem sera har følgende HCV profiler: T55806, HCV positive; T55875, HCV negative; T56633, HCV negative; R38730, HCV negative; og 3831781, HCV negative. Påfølgende donasjoner fra to av disse donorene T55806 og T55875, er også HGV RNA positive. T55806, T55875 og T56633 ble testet og bekreftet positive ved PCR ved anvendelse av NS 5 primerparret.

2. SCREENING AV AKSEPTERTE BLOD DONORER

For å vurdere forekomst av HGV i normal blod donor populasjon ble serum samlet fra screenede blod donorer fra transfusjon ved SUBB. Totalt 960 prøver som representerer 769 unike donorer, ble testet for HGV RNA. Prøvene ble screenet ved PCR ved anvendelse av 470-20-1 primerparret.

Totalt 16 sera ble identifisert å ha detekterbar HGV RNA. Av disse representerer 6 duplikater fra 3 donorer slik at totalt 13 unike donorer av 769 testet var HGV positive ifølge RNA PCR. Alle de positive prøvene ble testet og bekreftet positive ved PCR ved anvendelse av NS5 primerparret. Disse donorene ble karakterisert ved normale ALT nivåer samt ellers normal serologi. Omtrent 1,7% av sera som ble testet i den normale blod donor populasjonen er HGV positive. Tilstedeværelse av HGV ble følgelig detektert i både aksepterte og ikke aksepterte blod donorer. 3. PRØVER FRA FORSKJELLIGE GEOGRAFISKE LOKALITETER.

Tilstedeværelse av HGV infeksjon i populasjoner av hepatitt pasienter fra geografiske spredte kilder ble vurdert ved PCR. PCR reaksjonene ble utført vesentlig som beskrevet i eksempel 4C ved anvendelse av 470-20-1 PCR primer pairene. Serumprøver fra Egypt, Grekenland, Australia (se eksempel 4F-4), Peru, England, Italia, Tyskland, Sør-Korea, USA og Japan ble testet. HGV RNA var detekterbar i undergrupper av alle populasjoner som er blitt testet.

4. POST-TRANSFUSJONS ASSOSIERT HGV INFEKSJON OG PARENTERAL TRANSMISJON

HGV RNA ble detektert i flere post-transfusjons hepatitt tilfeller (de med Japansk og europeisk opprinnelse ble innbefattet i eksempel 4F-3). Ved totalt 4 tilfeller, et fra Japan, to fra USA og et fra Australia, ble multiple tidspunkter analysert for tilstedeværelse av HGV RNA. For tre av disse tilfellene var (i) pre-transfusjonsprøvene tilgjengelige for å etablere tidligere HGV status til pasienten, og (ii) prøvene var tilgjengelige fra individuelle blod donorer i de tre tilfellene, for å etablere donor HGV status.

Dette første tilfellet var en japansk pasient transfusert 12/2/80. Etter transfusjonen utviklet pasienten Non-B, Non-C hepatitt. Totalt 5 sera fra denne pasienten ble testet for HGV RNA ved PCR ved anvendelse av 470-20-1 primerparret. HGV RNA var detekterbar fra omtrent 2 uker til omtrent 8 måneder etter transfusjonen. En prøve tatt mer enn et år etter transfusjonen var ikke bestembar (dvs. positiv i bare en duplikatreaksjon). Ingen pre-transfusjonsprøve var tilgjengelig for testing.

Tilfellene BIZ og STO (tabellene 5 og 6) var fra en prospektivt-fulgt hjertekirurgi studie (Alter, et al., 1989), utført ved NTH. For hver av disse pasientene var pre-transfusjonssera tilgjengelig og ble bestemt å være negative for HGV RNA ved PCR ved anvendelse av 470-20-1 primerparret. BIZ testet positivt for HGV RNA fra dag 1 etter transfusjonen til uke 198 etter transfusjon. Av 9 totale blod donorer av BIZ ble 2 av 8 som ble testet funnet å være HGV positive. STO testet positivt for HGV RNA fra uke 5 etter transfusjonen gjennom uke 92 etter transfusjon.

Det fjerde tilfellet også definert prospektivt var en hjertekirurgipasient som var deltager i en post-transfusjonshepatitt studie utført i Sydney, Australia. Pasienten (PA-124), uten noen andre identifiserbare risikofaktorer mottok 14 enheter blod i løpet av kirurgi (4 enheter pakkede røde blodceller, 10 enheter blodplater). Av disse 14 enhetene var en HGV positiv og andre 13 var HGV negative. HB V og HCV serologier til 14 blod donorer var negative med unntagelse av en reaktiv HCV EIA (første generasjonstest). Ingen annen HCV test bekreftet det positive funnet.

I pasient PA-124 (tabell 7) var serum ALT forhøyet begynnende med en prøve som ble tatt 2 uker etter operasjonen og ble observert og være minst 10 ganger pre-operasjonsnivået i en periode på 14 uker. PCR resultater for HCV utført på pre-transfusjons-, 4 uker og 8 uker sera fra PA-124, var alle negative. Serum fra denne pasienten ble testet for HGV RNA ved anvendelse av 470-20-1 primere. En pre-transfusjonsprøve var negativ for HGV RNA. Positive resultater ble demonstrert etter transfusjon og var i samsvar med og fulgte etter ALT forhøyningen. Tilstedeværelse av HGV RNA ble detektert frem til et år etter transfusjonen. Disse data understøtter konklusjonen som omfatter at HGV kan bli overført parenteralt.

I tillegg prospektivt-definert post-transfusjons transmisjonstilfeller ble ytterligere tilfeller med HGV infeksjon identifisert i risikogrupper definert ved multiple transfusjons- og intravenøs medikamentforbruk (TVDU) (tabell 8).

Blant 100 multippel-transfusert sykcelle anemi og thalassemi pasienter ble 19 (19%) funnet å ha detekterbart serum HGV RNA. 9 av 49 hemafili pasienter (18%) var HGV positive med 470-20-1 og NS5 primere. 15 av 54 (28%) IVDU ble funnet å være PCR positive for HGV RNA. Infeksjonsratene i disse parenterale risikogruppene (18-28%) så ut til å være høyere enn ratene i blod donorer med forhøyet ALT (1-2%). Disse resultatene beskriver betydeligheten av den parenterale veien for HGV transmisjon.

5. PCR SCREENING AV SELEKTERTE HEPATITT SYKDOMSGRUPPER

Sera fra pasienter med akutt og kronisk hepatitt, hepatocellulært carcinoma, HBV infeksjon eller HCV infeksjon ble testet for tilstedeværelse av HGV ved anvendelse av polymerasekjede reaksjon (data presentert i tabell 8). I hver av prøvesettene fra pasienter med leversykdom ble HGV positive prøver demonstrert (med unntagelse av prøver fra pasienter med autoimmun hepatitt og primær biliær chirrose, i det begge tilstandene antas ikke å være eksklusivt assosiert med et infeksiøst middel).

Som vist i sera samlingene fra post-transfusjons hepatitt pasienter (eksempel 4F-4) blir HGV infeksjon etablert i løpet av akutt hepatitt, men sirkulerende viralt RNA fortsetter å bli detektert i løpet av den kroniske infeksjonen i tidsperioder målt i måneder til år.

Omtrent 10-20% koinfeksjonsrater ble observert i pasienter med HBV og HCV infeksjon. HGV infeksjon er følgelig vist å være assosiert med hepatitt med eller uten koinfeksjon med andre hepatitt vimser. Koinfeksjon kan reflektere lignende risikofaktorer og transmisjonsveier for disse hepatitt vimsene. Som angitt ovenfor er det en høyere forekomst av HGV i parenterale risikogrupper, så som hemofili tilfeller, IVDU og "multiply transfused" anemi pasienter (sammenlignet med andre hepatitt risikogrupper).

6. VEDVARENDE INFEKSJON MED HGV I MENNESKER

Post-transfusjons hepatitt tilfeller BIZ, STO og PA-124 ble vist å ha PCR-detekterbart viralt RNA opp til 3,8, 1,8 og 1,0 år etter transfusjon og akutt infeksjon. Ytterligere serumprøver ble oppnådd fra donor JC (eksempel 4F-1) et år og 1,5 år etter den opprinnelige positive prøven. Disse oppfølgingsserumsprøvene var også HGV positive. Ytterligere sera fra andre høt-ALT donorer (T55806, T55875, R25342), oppnådd flere måneder etter at serumprøven hvor HGV infeksjon ble opprinnelig detektert, var også positive. Når HGV infeksjon var etablert i en eksperimentell primat (CH1356, eksempel 4H) ble HGV RNA detektert over 1,5 år etter inokulasjon. Disse data viser vedvarende HGV viremi i mennesker og eksperimentelle primater.

G. AMPLIFIKASJON AV LANGE FRAGMENTER FRA PASIENT RNA FOR

SEKVENSERING

PCR primere ble konstruert for å amplifisere flere informative regioner av HGV genomet for å oppnå sekvensinformasjon på varierte HGV isolater. Primerene 470EXT4-2189R (SEQ JD NO: 119) og 470EXT4-29F (SEQ JD NO: 120) ble konstruert for å amplifisere et 2,2 kb fragment som inneholdt den opprinnelige 470-20-1 sekvensen. RNA fra prøver ble revers-transkribert ved anvendelse av "SUPERSCRIPT JJ" revers transkriptase (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). Resulterende cDNA ble amplifisert ved anvendelse av reagenser for effektiv omfattende PCR ("XL PCR BUFFERS" og "rTth-XL", Perkin-Elmer/Applied Biosystems Div., Foster City, CA). Amplifikasjonsreaksj onen ble betraktet å være positiv dersom et bånd med korrekt størrelse på agarosegel elektroforesen ble detektert. Prøven ble bekreftet som positiv ved preliminær DNA sekvensering av amplifikasjonsproduktet. Følgende seraprøver testet positive for HGV RNA ifølge denne amplifikasjonsmetoden: PNF2161; R10291 (JC); og prøver fra hver av gruppene fra Nord-Amerika, Egypt og Japan. Ingen positive prøver ble derimot detektert fra peruisk sera.

Vellykket amplifikasjon fra forskjellige HGV-positive prøver bekrefter resultatene oppnådd ifølge PCR amplifikasjon ved anvendelse av 470-20-1 primerparet diskutert ovenfor. Mangelen på oppnåelse av amplifikasjon kan derimot reflektere dårlig RNA kvalitet eller lavt kopiantall eller lokale sekvensforskjeller blant isolater slik at selekterte primersett ikke vil virke universelt.

For å oppnå sekvensinformasjon fra antatt 5'-utranslatert region av HGV genomet ble primere konstruert for å amplifisere fragmenter fra den 5'-utranslaterte regionen (basert på HGV PNF 2161-varianten). To fragmenter ble definert ved følgende primersett: FV94-22F (SEQ ID NO: 124) og FV94724R (SEQ ID NO: 125), og tilveiebringer et 728 basepar fragment; og FV94-94F (SEQ JD NO: 126) og FV94-912R (SEQ JD NO: 127) som tilveiebringer et 847 basepar fragment.

Betingelsene som nettopp er blitt beskrevet er blitt anvendt for å fremme effektiv "long-range" PCR. Produkter ble oppnådd fra de fleste av de testede prøvene og tilveiebringer ytterligere bekreftelse på tilstedeværelse av HGV RNA i prøvene.

H. INFEKTIVITETEN AV HGV I PRIMATER

To sjimpanser (betegnet CH1323 og CH1356), seks cynomolgus aper (CY143, CY8904, CY8908, CY8912, CY8917 og CH8918) og seks Mystax (MY29, MY131, MY98, MYI 87, MY229, MY254) individer ble inokulert med PNF 2161. Pre-inokulering og post-inokuleringssera ble registrert for ALT og for tilstedeværelse av HGV RNA sekvenser (som bestemt ved PCR screening - beskrevet ovenfor).

En cynomologous ape (CY8904) viste et positivt RNA PCR resultat (39 dager post-inokulasjon) og et ubestemt resultat fra totalt 17 separate blodtappinger. I en sjimpanse, betegnet CH1356, ble vedvarende viremi observert ved RT-PCR. Som vist i tabell 9 ble ingen betydelig ALT forhøyning observert og sirkulerende virus ble bare detektert ved tidspunkter betraktelig etter inokulasjon. Viremi ble observert ved og etter 118 dagers post-inokulering. Antydende reaktivitet ble også observert ved det første post-inokuleringstidspunktet (8 dager), som kan indikere gjenværende inokulum.

Data angitt ovenfor indikerer at HGV infeksjonen vedvarte opp til 1,7 år i en eksperimentell primat.

I. KARAKTERISERING AV DET VIRALE GENOMET.

Isolering av 470-20-1 fra et cDNA bibliotek (eksempel 1) tyder på at det virale genomet detektert i PNF 2161 er RNA. Ytterligere eksperimenter for å bekrefte identiteten til HGV viralt genom som RNA innbefatter følgende.

Selektiv degradering av enten RNA eller DNA (for eksempel ved DNase-fri RNase eller RNase-fri DNase) i den opprinnelige kloningskilden etterfulgt av amplifikasjon med HGV spesifikke primere og deteksjon av amplifikasjonsproduktene sjeiner RNA fra DNA templatene.

En alternativ metode anvender amplifikasjonsreaksj oner (nukleinsyrer fra opprinnelige kloningskilder som templat og HGV spesifikke primere) som anvender (i) en DNA-avhengig DNA polymerase, i fravær av RNA-avhengig DNA polymerase (dvs. revers transkriptase) i reaksjonene og (ii) en DNA-avhengig DNA polymerase og en RNA-avhengig DNA polymerase i reaksjonene. I denne metoden blir det amplifiserte produktet detektert i begge typer av amplifikasjonsreaksj oner dersom HGV genomet er DNA eller har et DNA mellomprodukt. Dersom HGV genomet bare er RNA blir det amplifiserte produktet bare detektert i revers transkriptase-inneholdende reaksjoner.

Total nukleinsyre (dvs. DNA eller RNA) ble ekstrahert fra PNF 2161 ved anvendelse av proteinase K og SDS etterfulgt av fenolekstrahering, som beskrevet i eksempel 4C. Renset nukleinsyre ble deretter amplifisert ved anvendelse av polymerasekjede reaksjon (PCR) hvor enten (i) PCR kom etter revers transkripsjonstrinn eller (ii) det reverse transkripsjonstrinnet ble utelatt. Amplifikasjonen ble reproduserbart oppnådd bare når PCR reaksjonene kom etter revers transkripsjon. Som en kontroll ble DNA templatene vellykket amplifisert i separate reaksjoner. Disse resultatene demonstrerer at naturen til HGV viralt genom er RNA.

Tråden til klonet dobbelt-trådet DNA sekvens som opprinnelig var tilstede i PNF 2161 kan bli avledet ved forskjellige metoder, inkludert følgende. Northern eller dot blotting av ikke-amplifisert genomisk RNA fra et infisert kildeserum kan bli utført, etterfulgt av hybridisering av duplikate blot til prober som tilsvarer hver tråd av den klonede sekvensen. Alternativt blir enkelt-trådede cDNA prober isolert fra Ml3 vektorer (Messing) eller multippeltråd-spesifikke oligonukleotidprober blir anvendt for øket sensitivitet. Dersom serumkilden inneholder enkelt-trådet RNA gir bare en probe (dvs. sekvenser fra en tråd av 470-20-1 klonene) et signal under hensiktsmessige betingelser for hybridiseringsstringens. Dersom serumkilden inneholder dobbelt-trådet RNA vil begge tråd-probene tilveiebringe et signal.

Polymerasekjedereaksjonen, med revers transkripsjon ved anvendelse av en eller annen spesifikk primer på forhånd, representerer et mye mere sensitivt alternativ til Northern blotting. Genomisk RNA ekstrahert fra rensede vimser til stede i PNF 2161 semm blir anvendt som input templat inn i hver R17PCR. I stedenfor cDNA syntese med tilfeldige heksamerer ble HGV sekvens-spesifikke primere anvendt. En cDNA syntese reaksjon ble utført med en primer som er komplementær med en tråd fra den klonede sekvensen (for eksempel 470-20-1-77F); en andre cDNA syntese reaksjon ble også utført ved anvendelse av en primer avledet fra den positive tråden (for eksempel 470-20-1-21 IR).

Resulterende første tråd cDNA ble amplifisert ved anvendelse av to HGV spesifikke primere. Kontroller ble innbefattet for vellykket amplifikasjon ved PCR (for eksempel DNA kontroller). RNA transkripter fra hver tråd av den klonede sekvensen ble også anvendt og for kontroll også for revers transkripsjonseffektivitet oppnådd ved anvendelse av spesifikke primere som er beskrevet.

Spesifikke produkter ble detektert ved agarose gelelektroforese med etidiumbromid farving. DNA kontrollene (dvs. dobbelt-trådede DNA kontroller for PCR amplifikasjon) ble vellykket amplifisert uansett primer anvendt for revers transkripsjon. Enkelt-trådet RNA transkriptet (dvs. kontroll for revers transkripsjonseffektivitet og trådspesifisitet) ble bare amplifisert når motsatt-trådprimer ble anvendt for cDNA syntese.

PNF-avledet HGV polynukleotid ga opphav til et spesifikt amplifisert produkt bare når primeren 470-20-1-21 IR ble anvendt for revers transkripsjon og indikerer dermed at den opprinnelige HGV polynukleotidsekvensen tilstede i semmet er komplementær med 470-20-1-21 IR og er sannsynligvis enkelt-trådet RNA.

EKSEMPEL 5

SUKROSE TETTHETSGRADIENT SEPARERING AV PNF2161

A. BINDING AV PNF-2161 MIDDEL.

En kontinuerlig gradient av 10-60% kilde ("ULTRAPURE", Gibco/BRL) i TNE (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) ble dannet ved anvendelse av en gradientmarkør fra Hoefer Scientific (San Francisco, CA). Omtrent 12,5 ml av gradienten ble belagt med 0,4 ml PNF serum som var blitt lagret ved -70°C, hurtig tint ved 37°C og deretter fortynnet i TNE.

Gradienten ble deretter sentrifugert i SV40 rotoren (Beckman Instruments) ved 40.000 rpm (omtrent 200.000 x g ved rav) ved 4°C i omtrent 18 timer. Fraksjoner med volum på omtrent 0,6 ml ble samlet fra bunnen av røret, og 0,5 ml ble veid direkte inn i ultrasentrifugerøret, for beregning av tettheten.

Antatte virale partikler ble deretter pelletert ved sentrifugering ved 40.000 rpm i Ti70,l rotoren (omtrent 110.000 x g) ved 4°C i 2 timer, og RNA ble ekstrahert ved anvendelse av sur guanidinium fenolteknikken ("TRI REAGENT", Molecular Research Center, Cincinnati, OH) og alkohol-presipitert ved anvendelse av glykogen som en bærer for å forbedre isoleringen. Renset nukleinsyre ble løst opp i RNase-fri buffer inneholdende 2 mM DTT og 1 U/ul rekombinant RNasin.

Analyser av gradientfraksjonene ved RNA PCR (eksempel 4C) viste en bestemt topp i 470-20-1 spesifikt signal lokalisert i fraksjoner med tetthet som varierer fra 1,126 til 1,068 g/ml (tabell 10). 470-20-1 signalet ble følgelig under disse betingelsene vist å danne et diskret bånd som er i samsvar med den ventede atferden til en viral partikkel i en sukrosegradient.

B. RELATIVE VIRALE PARTIKKEL TETTHETER.

PNF 2161 er blitt demonstrert å bli ko-infisert med HCV (se ovenfor). For å sammenligne egenskapene til 470-20-1 viral partikkel med andre kjente hepatitt virale partikler blir serum PNF 2161 og en prøve av renset hepatitt A virus belagt på en sukrose gradient (som beskrevet ovenfor). Fraksjonene (0,6 ml) ble samlet, pelletert og RNA ekstrahert. Isolert RNA fra hver fraksjon ble utsatt for amplifikasjonsreaksj oner (PCR) ved anvendelse av HAV (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6), HCV (SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8) og 470-20-1 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10) spesifikke primere.

Produktbåndet ble identifisert ved elektroforetisk separering av amplifikasjonsreaksj onene på agarosegeler etterfulgt av ethidiumbromid farving. Resultatene fra denne analysen er presentert i tabell 11.

Disse resultatene tyder på at 470-20-1 partiklene er mere like HCV partiklene enn

HAV.

Serum PNF 2161 og HAV partiklene ble behandlet med kloroform før sukrosegradient sentrifugeringen. Resultatene av disse eksperimentene tyder på at 470-20-1 middelet kan være et kappevirus på grunn av at det har de egenskaper som er mere like et Flaviviridae medlem (HCV) med kappe enn et ikke-kappevirus (HAV).

EKSEMPEL 6

DANNELSE AV 470- 20- 1 EKSTENSJONSKLONER

A. ANKER PCR.

RNA ble ekstrahert direkte fra PNF2161 serum som beskrevet i eksempel 1. RNA ble ført gjennom en "CHROMA SPIN" 100 gelfiltreringskolonne (Clontech) for å fjerne urenheter med liten molekylvekt. cDNA ble syntetisert ved anvendelse av et BMB cDNA syntese sett. Etter cDNA syntesen ble PNF cDNA ligert til et 50-100 ganger overskudd av KL-l/KL-2 SISPA eller JML-A/JML-B linkere (SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12) og SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 18) og amplifisert i 35 sykluser ved anvendelse av enten primer KL-1 eller primer JML-A.

470 ekstensjonskloner ble dannet av ankret PCR av en 1 ul alikvot fra en 10 ul ligeringsreaksjon inneholdende EcoRI spaltet (defosforylert) lambda gtl 1 armer (1 ug) og EcoRI spaltet PNF cDNA (0,2 ug). PCR amplifikasjon (40 sykluser) av ligeringsreaksjonen ble utført ved anvendelse av lambda gtl 1 revers primer (SEQ ID NO: 13) i kombinasjon med enten 470-20-77F (SEQ ID NO: 9) eller 470-20-1-21 IR (SEQ ID NO: 10). Alle primerkonsentrasjonene for PCR var på 0,2 uM.

Amplifikasjonsproduktene (9 ul/100 ul) ble separert på en 1,5% agarosegel, blottet til "NYTRAN" (Schleicher and Schuell, Keene, NH), og probet med en digoksygenin merket oligonukleotidprobe spesifikk for 470-20-1. Digoksygenin merkingen ble utført ifølge forhandlerens anbefalinger ved anvendelse av terminal transferase (BMB). Bånd som hybridiserte ble gel-renset, klonet inn i "TA CLONING VECTOR pCR II"

(Invitrogen) og sekvensert.

Mange kloner med både 5' og 3' ekstensjoner til 470-20-1 ble identifisert. Alle sekvensene er basert på en konsensus sekvens fra sekvenseringen av minst to uavhengige isolater. Denne ankerfestemetoden ble gjentatt på lignende måte for å oppnå ytterligere 5' og 3' ekstensjonssekvenser. Disse PCR amplifikasjonsreaksj onene ble utført ved anvendelse av lambda gtl 1 revers primer (SEQ ID NO: 13) i kombinasjon med HGV spesifikke primere avledet fra sekvenser oppnådd fra tidligere ekstensjonskloner. Substratet for disse reaksjonene var upakketPNF 2161 2-cDNA kilde

DNA.

Sekvensering ble utført ved anvendelse av "DYEDEOXY TERMINATOR CYCLE SEQUENCING" (en modifikasjon av prosedyren til Sanger, et al.) på et Applied Biosystems modell 373A DNA sekvenseringssystem ifølge forhandlerens anbefalinger

(Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvensdata er presentert i sekvenslisten. Sekvensene ble sammenlignet med "GENBANK", EMBL, databasen og dbEST (National Library of Medicine) sekvensene ved både nukleinsyre og aminosyrenivåer. Granskningsprogrammene FASTA, BLASTP, BLASTN og BLASTX (Alyschul, et al.) indikerte at disse sekvensene var nye som både nukleinsyre og aminosyresekvenser.

Individuelle kloner oppnådd ved anvendelse av et selektert primerpar ble oppstilt for å gi en konsensus sekvens. Seriene med konsensussekvenser anvendt for å konstruere sekvensen for HGV-PNF 2161 varianten var som følger: 4E3, SEQ ID NO: 26; 3E3, SEQ ID NO: 27; 2E5, SEQ ID NO: 28; 1E5, SEQ ID NO: 29; 4E5, SEQ ID NO: 30; 3E5, SEQ ID NO: 31; 2E3, SEQ ID NO: 32; 1E3, SEQ ID NO: 33; 4E5-20, SEQ ID NO: 34; 5E3, SEQ ID NO: 39; 6E3, SEQ ID NO: 40; 7E3, SEQ ID NO: 42; 5E5. SEQ ID NO: 43; 6E5 (44F), SEQ ID NO: 44; 8E3, SEQ ID NO: 98; 9E3, SEQ ID NO: 109; 10E3, SEQ ID NO: 110; 11E3, SEQ ID NO: 116; 12E3, SEQ ID NO: 118; 5'-ende, SEQ ID NO: 175; og 3'-ende, SEQ ID NO: 167.

Individuelle konsensus sekvenser ble oppstilt, overlappende sekvenser identifisert og en konsensus sekvens for HGV-PNF 2161 varianten ble bestemt. Denne konsensussekvensen ble sammenlignet med sekvensene oppnådd for fire andre HGV varianter. JC (SEQ ID NO: 182), BG34 (SEQ ID NO: 176), T55806 (SEQ ID NO: 78) og EB20-2 (SEQ ID NO: 180).

Konsensussekvensen til HGV-PNF 2161 varianten består av 9391 basepar tilstede som SEQ ID NO: 14. Denne sekvensen representerer en kontinuerlig åpen leseramme (SEQ ID NO: 15). Et Kyte-Doolittle hydrofobisitetsplot av polyproteinet er presentert som figur 11.

Forholdet mellom opprinnelig 470-20-1 klon og sekvensene oppnådd ved ekstensjon er vist skjematisk i figur 1. Som det fremgår av figuren omfatter DNA tråden som har motsatt polaritet med den proteinkodende sekvensen til 470-20-1 en lang kontinuerlig åpen leseramme.

Aminosyresekvensen til HGV ble sammenlignet med sekvensene til hele den virale sekvensen i PIR databasen (IntelliGenetics, Inc., Moutain View, CA) av proteinsekvenser. Sammenligningen ble utført ved anvendelse "SSEARCH" programmet til "FASTA" programversjon 1,7 (Pearson, et al.). Regioner ble lokal sekvenslikhet ble funnet mellom HGV sekvensene og to vimser i Flaviviridae familien av vimser. Likhetsoppstillinger er presentert i figurene 5 A og 5B.

Tilstede i disse oppstillingene er motiver for RNA avhengig RNA polymerase (RDRP) til disse vimsene. Konserverte RDRP aminosyremotiver er vist i figurene 5A og 5B med stjerner og store, uthevede bokstaver (Koonin and Dolja). Disse oppstillingene demonstrerer at denne delen av HGV kodende sekvens korresponderer med RDRP. Disse oppstillingsdata kombinert med data vedrørende RNA genomet til HGV understøtter plassering av HGV som et medlem av Flaviviridae familien.

Global sekvens identiteter av HGV polyproteinet (SEQ ID NO: 15) med HoCV (Hog Cholera Vims) og HCV er på henholdsvis 17,1% og 25,5%. Slike nivåer med global sekvensidentitet demonstrerer at HGV er en separat viral del fra både HoCV og HCV. For å illustrere dette kan to medlemmer av Flaviviridae familien av vimsene BVDV (bovin diaré vims) og HCV, 16,2% av aminosyrene bli globalt oppstilt med HGV.

Medlemmene innenfor en slekt viser generelt høy homologi med oppstillingen globalt, for eksempel, BVDV vs. HoCV viser 71,2% identitet. Forskjellige medlemmer (varianter) av slekten uten navn som HCV er et medlem av er mellom 65% og 100% identisk når oppstilt globalt.

B. RACE PCR: 5, ENDE KLONING.

Kloner som representerer 5' enden av HGV genomet ble oppnådd ifølge en modifisert anker PCR metode som anvendte RACE (hurtig amplifikasjon av cDNA ender) teknologi. RACE metoden ble opprinnelig beskrevet av Frohman, et al., (1988) og Belyausky, et al., (1989). 5-ende klonene til HGV ble oppnådd som følger.

Første-tråd cDNA syntesen ble primet ved anvendelse av tilfeldige heksamerer og syntesen ble utført ved anvendelse av enten "SUPERSCRJPTII" eller "rTth" revers transkriptase (GIBCO/BRL). Etter første-tråd syntesen ble RNA templatet degradert ved base hydrolysering (NaOH). cDNA prøven ble nøytralisert ved tilsetning av eddiksyre og renset ved absorpsjon til en glassmatrise bærer ("GENOBIND", Clontech, Palo Alto, CA). Etter rensingen ble cDNA konsentrert ved etanol presipitering og vasket to ganger med 80% etanol.

Den opprinnelig beskrevne RACE metoden ble modifisert som følger. Et enkelt-trådet oligonukleotid anker (SEQ ID NO: 174) (Clontech) ble ligert til 3' enden av første-tråd cDNA ved anvendelse av T4 RNA ligase i nærvær av kobolt klorid. Oligonukleotid ankeret ble oppnådd fra forhandleren med to modifikasjoner: (i) 3-enden av ankeret ble modifisert med en aminogruppe som forhindrer konkatamer dannelse, og (ii) 5-enden inneholder en fosfatgruppe som muliggjør ligering til første-tråd cDNA.

Etter ligering av ankeret ble cDNA anvendt som et templat for PCR amplifikasjon ved anvendelse av flere HGV-spesifikke primere i kombinasjon med en primer som er komplementær med ankersekvensen (AP primer, SEQ ID NO: 134). De resulterende amplifikasjonsproduktene ble separert ved agarose gelelektroforese, overført til filteret og hybridisert med en sammenstilt, HGV-spesifikk oligonukleotidprobe. Bånd som hybridiserte til HGV-proben ble isolert, klonet inn i "pCR-II" (Invitrogen, San Diego, CA) og sekvensert.

C. HGV 3' ENDE KLONING

Kloner som representerer 3-enden av HGV genomet ble oppnådd ved en modifisert ankret RT-PCR metode. Poly A polymerase (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) ble anvendt for å katalysere addisjon av en poly(A) hale til PNF 2161 RNA før cDNA syntesen. Poly(A) addisjonen ble utført ifølge forhandlerens anbefalninger. Etter rensing av poly(A) modifisert RNA ble revers transkripsjon med "SUPERSCRJPT II"

(GIBCO/BRL) utført ved anvendelse av primer GV-54461RT (SEQ ID NO: 184). Resulterende cDNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av følgende primersett: GV59-5446F (SEQ ID NO: 171) og GV-54461R (SEQ ID NO: 172).

Etter amplifikasjon ble produktene separert ved agarose gelelektroforese, overført til filtrene og hybridisert med en digoksigenin-merket oligonukleotidprobe (E5-7-PRB, SEQ ID NO: 173). Produkter som hybridiserte med oligonukleotidet ble isolert, renset, klonet inn i "pCR-II" og sekvensert. To kloner isolert ifølge denne metoden var MP3-3 (SEQ ID NO: 168) og MP3-7 (SEQ ID NO: 169).

EKSEMPEL 7

ISOLERING AV 470- 20- 1 FUSJONSPROTEIN

A. EKSPRESJON OG RENSING AV 470-20-1 GLUTATION-S-TRANSFERASE

FUSJONSPROTEIN

Ekspresjon av et glutation-S-transferase (sj26) fusjonert protein inneholdende 470-20-1 peptidet ble oppnådd som følger. Et 237 basepar innskudd (inneholdende 17 nukleotider av SISPA linkerene på begge sider) tilsvarende opprinnelig lambda gtl 1 470-20-1 klonen ble isolert fra lambda gtl 1 470-20-1 klonen ved polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av primerene gtl 1 F (SEQ JD NO: 25) og gtl 1 R (SEQ JD NO: 13) etterfulgt av EcoRI spaltning.

Innskuddet ble klonet inn i en modifisert pGEX vektor, pGEX MOV. pGEX MOV koder for sj26 proteinet fusjonert med seks histidiner ved den karboksyterminale enden (sj26his). 470-20-1 polypeptid kodende sekvenser ble ført inn i vektoren ved et kloningssete beliggende nedstrøms for sj26his kodende sekvens i vektoren. 470-20-1 polypeptidet blir uttrykt som sj26his/470-20-l fusjonsproteinet. sj26 proteinet og 6 histidin regionen til fusjonsproteinet muliggjør affinitetsrensing av fusjonsproteinet ved dobbel kromatografiske metoder som anvender glutation-konjugerte kuler (Smith, D.B., et al.) og immobiliserte metallionkuler (Hochula; Porath).

E. coli stamme W3110 (ATCC katalognummer 27352) ble transformert med pGEX MOV og pGEX MOV inneholdende 470-20-1 innskuddet. Sj26his proteinet og 470-20-1 fusjonsproteinet ble indusert ved tilsetning av 2 mM isopropyl-J3-tiogalaktopyranosid (TPTG). Fusjonsproteinene ble renset enten ved glutation-affinitetskromatografi eller ved immobilisert metallion kromatografi (JMAC) ifølge de publiserte metodene (Smith, D.B., et al.; Porath) sammen med konvensjonell ione-bytte kromatografi.

Renset 470-20-1 fusjonsproteinet var immunreaktivt med PNF 2161. Renset sj26his protein var ikke immunoreaktivt med PNF 2161 og indikerer tilstedeværelse av spesifikk immunoreaksjon mellom 470-20-1 peptid og PNF 2161.

B. ISOLERING AV 470-20-1/B-GALAKTOSJDASE FUSJONSPROTEIN

KM392 lysogener infisert med lambda fag gtl 1 eller med gtl 1/470-20-1 blir inkubert i 32°C helt til kulturen når en OD. på 0,4. Kulturen ble deretter inkubert i et 43°C vannbad i 15 minutter for å indusere gtl 1 peptidsyntese, og ytterligere inkubert ved 37°C i 1 time. Bakterielle celler blir pelletert og lysert i lyseringsbufferen (10 mM Tris, pH 7,4, 2% "TRITON X-100" og 1% aprotinin). Bakterielle lysater blir gjort klare ved sentrifugering (10K, i 10 minutter, Sorvall JA20 rotor) og klargjorte lysater blir inkubert med Sepharose 4B kuler konjugert med anti-J3-galaktosidase (Promega).

Binding og eluering av J3-galaktosidase fusjonsproteinene blir utført ifølge forehandlerens instruksjoner. Typis binding av proteiner og vasking av kolonnen blir utført ved lyseringsbufferen. Bundede proteiner blir eluert med 0,1 M karbonat/bikarbonatbuffer, pH 10. Renset 470-20-1 protein er immunoreaktivt med både PNF2161 og anti-b-galaktosidase antistoff. J3-galaktosidase, uttrykt fra gtl 1 lysogenet og renset, er ikke immunoreaktivt med PNF 2161, men immunreaktivt med anti-J3-galaktosidase antistoffet.

EKSEMPEL 8

RENSING AV 470- 20- 1 FUSJONSPROTEIN OG PREPARERING AV ANTI- 470- 20-1 ANTISTOFF

A. GLUTATION AFFINITETS RENSING

Materialer innbefattet 50 ml glutation affinitetsmatrise redusert form (Sigma), XK 26/30 Pharmacia column, 2m5 x 10 cm Bio-Rad "ECONO-COLUMN" (Richmond, CA), Gilson (Middleton, WI) HPLC, DTT (Sigma), glutation redusert form (Sigma), urea og natriumfosfat dibasisk.

Følgende oppløsninger ble anvendt for rensing av fusjonsproteinet:

buffer A: fosfatbuffret saltvann, pH 7,4 og

buffer B: 50 mM tris pH 8,5, 8 mM glutation, (redusert form glutation) stripbuffer: 8 M urea, 100 mM Tris pH 8,8, 10 mM glutation, 1,5 NaCl.

E. coli inneholdende plasmid pGEX MOV inneholdende 470-20-1 innskudd, ble dyrket i en fermentor (20 liter). Bakteriene ble samlet og lysert i fosfat buffret saltvann (PBS) inneholdende 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) ved anvendelse av en mikrofluidisator. Dersom ikke annet er angitt ble alle prosedyrene utført ved 4°C.

Rålysatet ble dannet for applisering ved plassering av lyserte bakterier inn i "OAKRIDGE" rør og sentrifugering ved 20K rpms (40k x g) i en Beckman modell JA-20 rotor. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,4 um filter og deretter gjennom et 0,2 um filter.

2,5 x 10 cm "ECONO-COLUMN" ble pakket med glutation affinitetsmatrisen som ble svellet i PBS i 2 timer ved romtemperatur. Kolonnen ble bragt i likevekt ved vasking med 4 sjikt volum PBS.

Kolonnen ble applisert med rålysat ved en strømningsrate på 8 ml pr minutt. Deretter ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolum PBS ved samme strømningsrate.

Kolonnen ble eluert ved innstilling av strømningsraten til 0,75-1 ml/min. og innføring av buffer B. Buffer B ble pumpet gjennom kolonnen i 5 kolonnevolum og 2-minutt fraksjoner ble samlet. Et eksempel på en elueringsprofil er vist i figur 2. Innholdet og renheten til proteinene tilstede i fraksjonene ble analysert ved standard SDS PAGE (figur 3). 470-20-l/sj26his fusjonsproteinet ble identifisert basert på antatt molekylvekt og immunreaktivitet overfor PNF 2161 serum. For ytterligere manipuleringer kan proteinet bli isolert fra fraksjoner inneholdende fusjonsprotein eller fra gelen ved ekstrahering av gelregioner inneholdende fusjonsproteinet.

B. RENSING AV KLON 470-20-1 FUSJONSPROTEINET VED

ANIONUT VEK SLING

Oppløsningene innbefatter følgende:

buffer A (10 mM natriumfosfat pH 8,0, 4 M urea, 10 mM DTT);

buffer B (10 mM natriumfosfat pH 8,0, 4 M urea, 10 mM DTT, 2,0 M NaCl); og strippebuffer (8 M urea, 100 mM Tris pH 8,8, 10 mM glutation, 1,5 NaCl).

Rålysåtet (eller annen proteinkilde, så som sammenslåtte fraksjoner fra ovenfor fra ovennevnte) ble applisert på "HIGH-Q-50" (Biorad, Richmond, CA) kolonnen ved en strømningsrate på 4,0 ml/min. Kolonnen ble deretter vasket med buffer A i 5 kolonnevolum ved en strømningsrate på 4,0 ml/min.

Etter disse vaskingene ble en gradient påbegynt og kjørt fra buffer A til buffer B i 15 kolonnevolum. Gradienten ble deretter skiftet til 100% buffer B i et kolonnevolum. Eksempel på en gradient er vist i figur 4A. Fraksjoner ble samlet hver 10. minutt. Renheten til 470-20-l/sj26his fusjonsproteinet ble vurdert ved standard SDS-PAGE

(figurene 4B og 4C) og relevante fraksjoner ble slått sammen (omtrent fraksjonene 34 til og med 77, figur 4C).

C. PREPARERING AV ANTI-470-20-1 ANTISTOFF

Renset 470-20-1 sj26his fusjonsprotein blir injisert samtidig i Freunds adjuvant i en kanin. Omtrent 1 mg fusjonsprotein blir injisert på dagene 0 og 21, og kaninserum blir vanligvis samlet etter 6 og 8 uker.

En annen kanin blir likeledes immunisert med renset sj26his protein.

Minilysater blir dannet fra bakterier som uttrykker 470-20-l/sj26his fusjonsprotein, sj26his protein og J3-galaktosidase/470-20-1 fusjonsprotein. Lysatene blir fraksjonert på en gel og overført til en membran. Separate Western blot blir utført ved anvendelse av sera fra to kaniner.

Serum fra dyr immunisert med 470-20-1 fusjonsproteinet er immunoreaktivt med hele sj26his fusjonsproteinet i minilysater av IPTG indusert E. coli W3110 som blir transformert enten ved pGEX MOV eller med pGEX MOV inneholdende 470-20-1 innskudd. Dette serumet er også immunreaktivt med fusjonsproteinet i minilysater fra 470-20-1 lambda gtl 1 konstruksjonen.

Det andre kaninserumet er immunreaktivt med både sj26his og 470-20-l/sj26his fusjonsproteinene i minilysatene. Dette serumet er ikke ventet å være immunreaktivt med 470-20-l/J3-galaktosidase fusjonsproteinet i minilysatet fra 470-20-1 lambda gtl 1 konstruksjonen. Ingen av seraene er ventet å være immunreaktive med J3-galaktosidase.

Anti-470-20-1 antistoff tilstede i sera fra dyr immunisert med fusjonsproteinet blir renset ved affinitetskromatografi (ved anvendelse av 470-20-1 ligand).

Fusjonsproteinet kan alternativt bli spaltet for å tilveiebringe 470-20-1 antigen fri for sj-26 proteinsekvenser. 470-20-1 antigenet blir deretter alene anvendt for å danne antistoffer som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 9

KANIN ANTIPEPTXD SERA

Peptider ble konstruert for å dekke hele HGV sekvensen, spesielt for å dekke hver av de funksjonelle gruppene i ikke-strukturelle og strukturelle gener. Peptider ble syntetisert kommersielt ved konvensjonelle teknikker. Representative peptider er presentert i tabell 12.

Peptidene ble koblet til KLH. Ved anvendelse av kaniner som vert ble konjugerte peptider injisert subkutant ved multiple seter. Anti-peptid kaninserum ble dannet kommersielt. En 2-uker immuniseringsprotokoll ble anvendt og tappingene ble tatt i alternerende uker.

Kanin anti-peptid sera ble vist å være peptid spesifikke og ha høye titere. Kanin anti-peptid sera gjenkjenner også tilsvarende rekombinante proteiner uttrykt i E. coli og bakulovirus. Antistoff sluttpunkt titere varierte fra 1:50.000 fortynning til 1:625.000 fortynning. Kanin anti-peptid 7 (NS4a) hadde lave sluttpunkttitere på bare 1:1000. Kanin anti-serum mot NS4a protein uttrykt i for eksempel bakulovirus systemet kan være et mere nyttig reagens.

Kanin anti-peptid sera var nyttig for immunpresipitering av tilsvarende HGV proteiner uttrykt for eksempel i bakulovirus og vaccinia. Kanin anti-peptid sera var også nyttig som oppfangings antistoff i EIA for å detektere HGV antigen. Kanin anti-peptid sera er videre nyttig for karakterisering av HGV proteiner.

EKSEMPEL 10

SEROLOGI

A. WESTERN BLOT ANALYSER AV SERA PANELER

470-20-1 fusjonsantigen (beskrevet ovenfor) ble anvendt for å screene paneler av sera. Mange av panelene var av human sera avledet både fra individer som lider av hepatitt og uinfiserte kontroller.

Affinitetsrenset 470-20-1 fusjonsantigen (eksempel 8) ble applisert på en 12% SDS-PAGE ved 2 ug/cm. Gelen ble kjørt i 2 timer ved 200V. Antigenet ble overført fra gelen til et nitrocellulosefilter.

Membranen ble deretter blokkert i 2 timer ved anvendelse av en oppløsning av 1% bovint serumalbumin, 3% normalt geiteserum, 0,25% gelatin, 100 mM MaP04, 100 mM NaCl og 1% fettfri tørrmelk. Membranen ble deretter tørket og spaltet i 1-2 mM strimler og hver strimmel inneholdt 470-20-1 fusjonsantigen. Strimmelen ble vanligvis rehydrert med TBS (150 mM NaCl; 20 mM Tris HC1, pH 7,5) og inkubert i panelsera (1:100) over natt med risting ved romtemperatur.

Strimlene ble vasket to ganger i 5 minutter hver gang i TBS pluss "TWEEN 20"

(0,05%) og deretter vasket to ganger i 5 minutter hver gang i TBS. Strimlene ble deretter inkubert i sekundært antistoff (Promega anti-humant IgG-alkalisk fosfatase konjugat, 1:7500) i 1 time med risting ved romtemperatur. Strimlene ble deretter vasket to ganger x 5 minutter i TBS + "TWEEN 20", og deretter to ganger x 5 minutter i TBS.

Bundet antistoff ble detektert ved inkubering av strimlene i en substratoppløsning inneholdende BCIP (eksempel 2) og NBT (eksempel 2) i pH 9,5 buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2). Farve utviklingen ble latt gå i omtrent 15 minutter og ved dette tidspunktet ble farveutviklingen stoppet ved tre vaskinger i destillert H2O.

Testsera ble oppnådd fra følgende grupper av individer: (i) blod donorer, negative for HBV Ab, overflate Ag, negative for HCV, HIV, HTLV-1 Abs; (ii) HBV sera fra individer som er infisert med hepatitt B virus (iii) HCV, sera fra individer infisert med hepatitt C virus i kraft av å være reaktive i en annen-generasjon HCV ELISA analyse; og (iv) HXV, individer serologisk negative for HAV, HBV, HCV eller HEV.

Resultatene fra disse screeningene er presentert i tabell 13.

Disse resultatene tyder på tilstedeværelse av 470-20-1 antigen i et antall forskjellige seraprøver. Antigenet er ikke immunreaktivt med normalt humant sera.

B. GENERELL ELISA PROTOKOLL FOR DETEKSJON AV ANTISTOFFER

Polystyren 96 brønn skåler ("IMMULONII" (PGC) blir belagt med 5 ug/ml (100 ul pr brønn) antigen i 0,1 M natriumbikarbonat buffer, pH 9,5. Skålene blir forseglet med "PARAFJLM" og lagret ved 4°C over natt.

Skålene blir sugd ut og blokkert med 300 ul 10% normalt geiteserum og inkubert ved 37°C i 1 time.

Skålene blir vasket 5 ganger med PBS 0,5% "TWEEN-20".

Antisera blir fortynnet i 1 x PBS, pH 7,2. Ønskede fortynninger av antisera (0,1 ml) blir tilsatt til hver brønn og skålen inkubert i 1 time ved 37°C. Skålene blir deretter vasket 5 ganger med PBS 0,5% "TWEEN-20".

Pepperrotperoksidase (HRP) konjugert geite anti-humant antiserum (Cappel) blir fortynnet 1/5.000 i PBS. 0,1 ml av denne oppløsningen blir tilsatt til hver brønn. Skålen blir inkubert i 30 minutter ved 37°C og deretter vasket 5 ganger med PBS.

Sigma ABTS (substrat) blir dannet like før tilsetning til skålen.

Reagenset består av 50 ml 0,05 M sitronsyre, pH 4,2, 0,078 ml 30% hydrogenperoksid oppløsning og 15 mg ABTS. 0,1 ml av substratet blir tilsatt til hver brønn og deretter inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 0,050 ml 5% SDS (w/v). Relativ absorbanse blir bestemt ved 410 nm.

EKSEMPEL 11

Ekspresjon av selekterte HGV anti<g>ener

Hele den kodende sekvensen av HGV ble subklonet inn i mer enn 50 bestemte overlappende cDNA fragmenter. Lengden til de fleste cDNA fragmentene varierte fra omtrent 200 bp til omtrent 500 bp. cDNA fragmentene ble klonet separat inn i ekspresjonsvektor pGEX-HisB. Denne vektoren er lik pGEX-MOV, beskrevet ovenfor.

pGEX-hisB er en modifikasjon av pGEX-2T (Genbank aksesjonsnr. A01438; en kommersielt tilgjengelig ekspresjonsvektor). Vektoren pEX-2T er blitt modifisert ved innskudd av et Ncol sete direkte nedstrøms fra trombin spaltningssetet. Dette setet blir etterfulgt av et BamHI sete som blir etterfulgt av en poly-histidin (seks histidiner) kodende sekvens, etterfulgt av EcoRI setet tilstede i pGEX-2T. Kodende sekvenser av interesse blir vanligvis skutt inn mellom Ncol setet og BamHI setet. I figur 6 (SEQ ID NO: 115), koder den innskutte sekvensen for GE3-2 antigenet. Resten av

vektorsekvensen er identisk med pGEX-2T. Ekspresjon av fusjonsproteinet blir utført vesentlig som beskrevet ovenfor med andre pGEX-avledede ekspresjonsvektorer.

Kloning av alle 50 fragmenter ble utført vesentlig som beskrevet nedenfor, hvor spesifikke primere ble selektert for hver av de 50 kodende regionene. Hver HGV innskutt DNA er PCR amplifisert fra RNA ekstrahert fra PNF 2161 eller andre HGV(+) sera ved anvendelse av et spesifikt sett av primere som beskrevet i eksempel 4C. Vanligvis inneholder 5' primerene et Ncol restriksjonssete og 3' primeren et BamHI restriksjonssete. Ncol primere i amplifiserte fragmenter muliggjør i-ramme fusjon av amplifiserte kodende sekvenser til GST-Sj26 kodende sekvens i ekspresjonsvektorene pGEX-Hisb eller pGEX MOV.

Amplifisert HGV innskutt DNA blir spaltet med restriksjonsenzymene Ncol og BamHI. Spaltet innskudds DNA blir gelrenset og ligert med Ncol og BamHI spaltet pGEX hisB eller pGEX MOV. E. coli stamme W3110 (ATCC nr. 27325, American Type Culture Collection, Rockville, MD) ble transformert med ligeringsproduktet. Ampicillin resistente kolonier ble selektert. Tilstedeværelse av innskuddet ble bekreftet ved PCR amplifikasjon av innskuddet fra ampicillin resistent koloni ved anvendelse av primere homologe med pGEX vektorsekvenser som flankerer innskuddsmolekylene (primerene GLI F (SEQ ID NO: 235) og GLI R (SEQ ID NO: 236).

Størrelsen på PCR amplifikasjonsproduktet er innskuddsstørrelsen pluss omtrent 160 bp avledet fra vektoren. Transformanter med hensiktsmessig innskudd ble selektert og utsatt for proteininduksjon ved IPTG som beskrevet i eksempel 7. Uttrykte rekombinante proteiner ble analysert for spesifikk immunreaktivitet overfor antatt HGV-infisert humant sera ved Western blot. 8 fragmenter betegnet GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, EXP3, GE1-N og GE-57 koder for antigener som ga en klar immunogen respons når omsatt med antatt HGV-infisert humant sera.

A. KLONING AV GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, EXP3, GE1-N OG GE57. Kodende sekvensinnskudd for klonene GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, EXP3, GE1-N og GE57 ble dannet ved polymerasekjedereaksjonen fra SISPA-amplifisert dobbelt-trådet cDNA eller RNA oppnådd fra PNF 2161 eller T55806 ved anvendelse av PCR primere spesifikke for hvert fragment. Ifølge tabell 14 blir det oppført koordinater for hver klon i forhold til SEQ ID NO: 14 og primersettene dannet for anvendelse av hvert kloninnskudd.

Aminosyresekvensen til GE57 er presentert som SEQ ID NO: 241.

IGE3-5' primer (GE-3F, SEQ ID NO: 46) ble en stille punktmutasjon introdusert for å modifisere et naturlig Ncol restriksjonssete. Ved anvendelse av ovennevnte primere ble PCR amplifikasjonsprodukter dannet. Amplifikasjonsproduktene ble gelrenset, spaltet med Ncol og BamHI og gelrenset på ny. Renset NcoI/BamHI GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, GE1-N og GE57 fragmenter ble uavhengig ligert inn i defosforylerte NcoI/BamHI pGEX-HisB vektorer. Renset NcoI/BamHI EXP3 fragment ble ligert inn i defosforyleit, NcoI/BamHI spaltet pGEX-MOV vektor.

Hver ligeringsblanding ble transformert inn i E. coli W3110 stamme og ampicillin resistente kolonier ble selektert. Ampicillin resistente kolonier ble resuspendert i en Tris/EDTA buffer og analysert ved PCR ved anvendelse av primerene GLI F (SEQ ID NO: 235) og GLI R (SEQ ID NO: 36) for å bekrefte tilstedeværelse av innskuddsekvenser. Hver kandidatklon ble betegnet GE3-2, GE9-2, GE15-1, GE17-2. GE4-8, EXP3-7, GE1-N og GE57.

B. EKSPRESJON AV GE3-2, GE9-2, GE15-1, GEI7-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-N

og GE57 fusjonsproteinene.

Kolonier av ampicillinresistente bakterier inneholdende GE3-2, GE9-2, GE15-1 og GE17-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-N og GE57 inneholdende-vektorer ble individuelt inokulert inn i LB medium inneholdende ampicillin. Kulturene ble dyrket til OD på 0,8 til 0,9 og deretter ble IPTG (isopropyltio-beat-galaktosid; Gibco-BRL) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,3 til 1 mM for induksjon av proteinekspresjon. Inkubasjon i nærvær av IPTG ble fortsatt i 3 til 4 timer.

Bakterielle celler ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i SDS prøvebuffer (0,0625 M tris, pH 6,8, 10% glycerol, 5% merkaptoetanol, 2,3% SDS). Den resuspenderte pelleten ble kokt i 5 min. og deretter klaret for uoppløsleig cellulært debris ved sentrifugering. Supernatantene oppnådd fra IPTG-induserte kulturer av GE3-2, GE9-2, GE15-1, GEI7-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-M og GE57 ble analysert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) sammen med uinduserte lysater. Proteinene fra disse gelene ble deretter overført til nitrocellulose filtere (dvs. ved Western blotting).

Filtrene ble først inkubert med kanin polyklonalt antistoff eller muse monoklonalt antistoff (RMOOl fra Sierra Biosource, CA) rettet mot GST proteinet for å detektere ekspresjon av GST-fusjonsproteinekspresjon med hensiktsmessig størrelse. Ventede proteinstørrelse til ovennevnte kloner er 40, 38, 39, 32, 42, 64, 42 og 33 KDa. Immunoreaktiviteten til RM001 med bånd ved hensiktsmessig molekylvekt for fusjonsproteiner demonstrerer vellykket ekspresjon av fusjonsproteinene til ovennevnte kloner ved bakterielle celler. Ekspresjon av klonproteinene ble også registrert ved fremkomst av overuttrykte proteiner med hensiktsmessige størrelser ved IPTG induksjon på Coomassie brilliant blåfarvet gel.

C. WESTERN BLOT ANALYSER AV HGV PROTEINER.

Når ekspresjon av HGV klonproteinet ble bekreftet ved Western blot analyser med anti-GST antistoff ble et andre sett av filtere, dannet som ovenfor, deretter eksponert for flere HGV(+) og HGV(-) humane sera. Humant sera anvendt for Western blot analyser av totale cellelysater ble pre-absorbert med lambda-gtl 1-nitrocellulosefiltere. Lambda-gtl 1-nitrocellulosefiltere ble dannet som følger. En over natt kultur av KM392 kulturen ble dannet i LB. Kulturen ble fortynnet 10 ganger i frisk LB inneholdende 0,2% maltose og inkubert i 1 time ved 37°C med risting.

Etter 1 time ble kulturen blandet med et likt volum MgCa oppløsning (0,0IM MgCl2). Til denne blandingen ble det tilsatt lambda gtl 1 til et titer på 2 x 10^ PFU/ml og inkubert i 30 min. uten risting. Etter 30 min. (pr hver ml av denne fag/E. coli blandingen) ble 15 ml av smeltet (55°C) LB toppagar (LB med 0,8% agar) tilsatt: 8 ml av denne blandingen ble spredd på hver 15 cm LB agarskål. Etter at toppagaren stivnet ble skålene inkubert ved 37°C i 3-5 timer.

Etter plakkutviklingen ble et nitrocellulosefilter plassert på skålen og skålen ble ytterligere inkubert ved 37°C over natt. Nitrocellulose filteret ble fjernet og vasket grundig med TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) pluss 0,05% "TWEEN 20". Vaskede filtere ble deretter blokkert med 1% gelatin i TBS over natt. Filteret ble vasket tre ganger (5 minutter med hver vask) med TBS.

For pre-absorpsjon av humant sera ble hvert serum fortynnet 100 ganger i blokkeringsbuffer (beskrevet i eksempel 10). 10 ml fortynnet serum ble deretter inkubert over natt med to lambda gtl 1 filtere dannet som ovenfor. Lambda gtl 1 filtrene ble fjernet og pre-absorbert serum anvendt for Western blot analysering.

Western blot analyser demonstrerte at klonene GE3-2, GE9-2, GEI 5-1, GEI7-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-N og GE57 viste spesifikk immunoreaktivitet overfor HGV(+) sera. GE-4-8 proteinet var immunoreaktivt med J21689 serum. J21689 er HGV (+) bestemt ved HGV PCR (eksempel 4) og HCV (+) bestemt ved HCV PCR og serologiske analyser. EXP3-7 proteinet var immunoreaktivt med JC og T55806. JC er HGV-positivt serum identifisert i eksempel 4F og som ble nektet av blodbanken i det det var høy ALT. En annen JC prøve, tatt 1 år etter den opprinnelige serumprøven, var også positiv for HGV ifølge PCR analysen. T55806 er også HGV-positivt serum identifisert i eksempel 4F som ble nektet av blodbanken i det den var høy ALT. Dette serumet er ko-positivt med

HCV.

GEI 5-1 og GE 17 viste svak, men spesifikk immunreaktivitet overfor PNF 2161 og T55086. GE1-N var immunreaktivt med PNF2161, JC, T55806, T56633, T27034 og R0001. T56633, T27034 og R0001 er HGV(+) sera identifisert i eksempel 4F. GE57var immunreaktivt med E57963 og R0001. E57963 er HGV og HCV ko-positivt serum. GE3-2 og GE9-2 var også immunreaktivt med HGV sera spesifikt. Ingen av de 8 antigenene var derimot immunreaktive med HGV negativt sera T43608 og R05072.

GE3-2 og GE9-2 fusjonsproteinene ble renset fra bakterielle cellelysater vesentlig som i eksempel 7 ved anvendelse av dobbelt kromatografiske metoder som anvender glutation-konjugerte kuler (Smithm D.B. et al.) og immobiliserte metallionkuler (Hochuli; Porath). Rensede proteiner ble utsatt for Western blot analyser som følger.

Forskjellige mengder av rensede HGV proteiner (for eksempel GE3-2 og GE9-2 proteiner) ble applisert på 12% akrylamidgeler. Etter PAGE ble proteinene overført fra gelene til nitrocellulosemembraner ved anvendelse av standardprosedyrer. Individuelle membraner ble inkubert med en med et av et antall humane eller musesera. Sera i overskudd ble fjernet ved vasking av membranene.

Disse membranene ble inkubert med alkalisk fosfatase-konjugerte geite anti-humant antistoff (Promega) eller alkaliske fosfatase-konjugerte geite anti-muse antistoffer (Sigma), avhengig av serum som blir anvendt for screening. Membranene ble på ny vasket for å fjerne overskudd geite anti-humant IgG antistoff og eksponert for NBT/BCIP. Fotografier av eksempelvise farvede membraner med GE3 fusjonsprotein er vist i figurene 7A til 7D.

Figurene viser resultater av Western blot analyser av renset GE3-2 protein ved anvendelse av følgende sera: N-(ABCDE) humant (JC) serum (figur 7A)m N-(ABDE) humant (PNF 2161) serum (figur 7B), et supernormalt (SN2) serum (figur 7C) og musemonoklonalt antistoff (RMOOl) rettet mot GST-Sj26 protein (figur 7D).

I hver av figurene inneholder kolonne 1 på forhånd farvet molekylvekt standarder (Bio-Rad) og kolonnene 2-5 inneholder følgende mengder av GE3-2 fusjonsprotein: 4 ug, 2 ug, 1 ug og 0,5 ug. Nummerene representerer appliseringsmengder i mikrogram pr 0,6 centimeter gel (brønnstørrelse). Fortynninger av humant JC, PNF 2161 og Super Normal 2 sera var 1:100. Anti-sj26 fortynning var 1:1000. Båndet som fremkommer ved omtrent 97 K i JC blottet er reaktivitet overfor en mindre kontaminant i GE3,2 fusjonsproteinpreparatet. Proteinmarkør størrelser utgjør 142,9, 97,2, 50, 35,1, 29,7 og 21,9 kD.

Som vist i figurene 7A til 7D viste GE3-2 spesifikk immunreaktivitet med JC serum. GE3-2 reagerte svakt med PNF 2161 serum og er blitt registrert som et avvik eller en negativ.

I parallelle eksperimenter viste GE9-2 svak, men spesifikk immunreaktivitet overfor PNF 2161 serum.

EKSEMPEL 12

KONSTRUKSJON AV EKSEMPELVISE EPITOPE BIBLIOTEK

A. Y5 BIBLIOTEK

Polymerasekjedereaksjoner ble anvendt for å amplifisere 3 overlappende DNA fragmenter fra PNF 2161 SISPA-amplifisert cDNA. PNF 2161 SISPA-amplifisert cDNA ble dannet ved anvendelse av JML-A/B linkere (SEQ JD NO: 54 og SEQ JD NO: 55). En mikroliter av dette materialet ble på ny amplifisert i 30 sykluser (1 minutt ved 94°C, 1,5 minutter ved 55°C og 2 minutter ved 72°C) ved anvendelse av 1 uM JML-A primere. Totalt reaksjonsvokum var 100 ul. Produkter fra 3 av disse amplifikasjonene ble kombinert og separert fra overskudd PCR primere ved enkel føring gjennom en "WIZARD PCR COLUMN" (Promega) ifølge forhandlerens instruksjoner. "WIZARD PCR COLUMN" er en silikabasert harpiks som binder DNA i høy ionestyrkebuffere og som vil frigjøre DNA i buffere med lav ionestyrke. Amplifisert DNA ble eluert fra kolonnen med 100 ul destillert H2O.

Eluert DNA ble separert på en 1,5% agarose TBE gel (Maniatis, et al.) og visualisert med UV lys etter ethidiumbromid farving. Et sterkt utstryk av DNA fragmenter mellom 150 og 1000 bp ble observert. En mikroliter av re-amplifisert cDNA ble anvendt for templat i PCR reaksjoner med hvert primerpar presentert i tabell 15.

Primerene ble konstruert for å gi amplifikasjon av HGV spesifikke DNA fragmenter med størrelser indikert i tabell 15.1 amplifikasjonsreaksj onene ble primerparrene anvendt ved en konsentrasjon på 1 uM. Amplifikasjonene ble utført i 30 sykluser i 1 minutt ved 94, 1,5 minutt ved 54°C og 3 minutter ved 72°C i et toalt reaksjonsvolum på 100 ul. Hver av de tre forskjellige primerpar PCR reaksjonene resulterte i spesifikk amplifikasjon av produkter som har ventede størrelser. For hver primerpar reaksjon ble amplifikasjonsproduktene fra 3 uavhengige PCR reaksjoner kombinert og renset ved anvendelse av en "WIZARD PCR COLUMN" som beskrevet ovenfor. Rensede produkter ble fortynnet i 50 ul dH20.

Prøver fra hvert renset produkt (14 ul, inneholdende omtrent 1-2 ug av hvert primer-par amplifisert DNA fragment) ble kombinert. Kombinert prøve av alle tre forskjellige amplifiserte fragmenter ble tilsatt til 5 ul 10X DNAse spaltningsbuffer (500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MnCl2) og 2 ul dH20. Fra denne spaltede blandingen ble en 10 ul prøve fjernet og plassert i et rør inneholdende 5 ul stoppoppløsning (100 mM EDTA, pH 8,0). Denne prøven var 0 "spaltningsminutter" tidspunktet. Resten av spaltningsreaksjonen ble plassert ved 25°C. Til spaltningsblandingen ble 1 ul 1/25 fortynnet RNAse-fri DNAse I (Strategene) tilsatt. Ved forskjellige tidspunkter ble 10 ul alikvoter tatt ut og blandet med 5 ul stoppoppløsning. DNAse I spaltede DNA produkter ble analysert på en 1,5% agarose TBE gel.

Resultatene av flere spaltningseksperimenter viste at 40 minutters spaltning ga en god fordeling av DNA fragmenter i størrelsesområdet 100-300 bp. En DNAse I spaltning ble deretter gjentatt, i det hele spaltningen ble latt stå i 40 minutter ved romtemperatur. Spaltningen ble stoppet ved tilsetning av 18 ul stoppbuffer og spaltede DNA produkter ble renset ved anvendelse av en "WIZARD PCR COLUMN". "WIZARD PCR COLUMN" ble fortynnet med 50 ul dH20 og eluert DNA tilsatt til følgende reaksjonsblanding: 7 ul restriksjonsenzymbuffer C (Promega, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,9, IX konsentrasjon); 11 ul 1,25 mM dNTP; og 2 ul T4 DNA Polymerase (Boehringer-Mannheim). Denne reaksjonsblandingen ble oppbevart ved 37°C i 30 minutter og deretter ble 70 ul pH 8,0 fenol/CHCl3 tilsatt og blandet. Fenol/CHCl3 ble fjernet og ekstrahert en gang for å tilveiebringe et totalt vandig volum på 150 ul inneholdende DNA prøven. DNA ble etanolpresipitert ved anvendelse av 2 volum absolutt etanol og 0,5 volum 7,5 M NH4-acetat. DNA ble pelletert ved sentrifugering i 15 minutter ved 14.000 rpm i en "EPPENDORF MICROFUGE", tørket i 5 minutter ved 42°C og resuspendert i 25 ul dH20.

DNA ble ligert til 5' fosforylert SISPA linkere KLI (SEQ ID NO: 62) og KL2 (SEQ ID NO: 63). Flere forskjellige konsentrasjoner av SISPA linkere og DNA ble testet. Høye ligeringsnivåer (vurdert som beskrevet nedenfor) oppsto under følgende ligeringsreaksjonsbetingelser: 6 ul DNA, 2 ul 5,0 x 10-12 M KL1/KL2 linkere, 1 ul 10X ligasebuffer (New England Biolabs) og 1 ul 400 enheter/ul T4 DNA ligase (New England Biolabs) i et totalt reaksjonsvolum på 10 ul. Ligeringene ble utført over natt ved 16°C.

To reaksjoner ble kjørt parallelt som følger. En 2 ul prøve av det ligerte materialet ble amplifisert ved anvendelse av KLI SISPA primeren i et totalt reaksjonsvolum på 100 ul (25 sykluser på 1 minutt ved 94°C, 1,5 minutter ved 55°C og 2 minutter ved 72°C). Ligeringsgraden ble vurdert ved separering av 1/5 av PCR reaksjonsamplifiserte produkter ved elektroforese ved anvendelse av en 1,5% agarose TBE gel. Gelen ble farvet med ethidiumbromid og båndene ble visualisert med UV lys.

Amplifikasjonsproduktene fra duplikate reaksjoner ble renset ved anvendelse av "WIZARD PCR COLUMNS" og renset DNA eluert i 50 ul dH20. En 25 ul alikvot av PCR KL1/KL2 amplifisert DNA ble spaltet med 36 enheter EcoRI (Promga) i et totalvolum på 30 ul. Reaksjonen ble utført over natt ved 37°C. Spaltet DNA ble renset ved anvendelse av en "SEPHADEX G25" spinkolonne.

EcoRI spaltet DNA ble ligert i over natt reaksjoner til Xgtl 1 armer som på forhånd var spaltet med EcoRI og behandlet med kalvetarm alkalisk fosfatase (Stratagene, La Jolla, CA). Ligeringsblandingen ble pakket ved anvendelse av et "GIGAPACK GOLD PACKAGING EXTRACT" (Stratagene) ifølge forhandlerens instruksjoner. Titrering av mengden av rekombinant fag oppnådd ble utført ved utsåing av en 1/10 fortynning av pakket fag på et teppe av KM-392, hvor skålen inneholdt 20 ul av en 100 mg/ml oppløsning av x-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-J3-D-galaktosidase; Sigma) og 20 ul av en 0,1 M oppløsning av IPTG (isopropyl-l-tio-J3-D-galaktosidase; Sigma). En titer ble oppnådd på 1,2 x 10^ fag/ml inneholdende over 75% rekombinante fag.

Prosentandel rekombinante plakk ble bekreftet ved PCR analyser av 8 tilfeldige plukkede plakk ved anvendelse av primerene 11F (SEQ ID N=: 25) og 1 IR (SEQ ID NO: 13). Dette pakkede biblioteket inneholdende DNA fragmenter avledet fra spaltning av amplifiserte DNA Fl/Rl, F2/R3 og F4/R4 amplifiserte DNA og ble betegnet Y5 biblioteket.

B. ENV BIBLIOTEK.

Et ekspresjonsbibliotek, betegnet ENV bibliotek, ble dannet som følger. En mikroliter PNF 2161 SISPA amplifisert DNA ble anvendt som templat i polymerasekjede amplifikasjonsreaksj oner ved anvendelse av følgende primerpar: GEP-F15 (SEQ ID NO: 128) og GEP-R15 (SEQ ID NO: 129), som dannet et 525 nukleotid HGV fragment; og GEP-F17 (SEQ ID NO: 130) og GEP-R16 (SEQ ID NO: 131) som dannet et 765 nukleotid HGV fragment.

PCR amplifikasjon ble utført i 35 sykluser ved 94°C i 1 minutt, 52°C i 1,5 minutter og 72°C i 3 minutter. Amplifiserte produkter ble renset og spaltet med DNAse I. Ligering av KLI og KL2 linkerene til cDNA, amplifikasjon av DNA fragmenter og konstruksjon av bibliotek i lambda gtl 1 ble utført vesentlig som beskrevet i eksempel 12A. Rekombinant frekvensen til biblioteket var større enn 70%. Analyser av innskuddene ved polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av primere avledet fra den flankerende regionen til lambda gtl 1 bekreftet rekombinant frekvensen og indikerte at størrelsesområdet til innskuddet var 150-500 nukleotider.

C. NS3 BIBLIOTEK.

Et ekspresjonsbibliotek betegnet NS3 ble konstruert som følger. Et første fragment ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av primerene 470ep-F9 (SEQ ID NO: 132) og 470ep-R9 (SEQ ID NO: 133) og som templat, PNF 2161 SISPA amplifiserte nukleinsyrer. Antatt produkt av denne amplifikasjonsreaksj onen var 777 basepar. Amplifisert fragment ble gelrenset ved separering på en TAE gel. Fragmentet ble ytterligere renset ved anvendelse av "GENECLEAN" (BIo 101, La Jolla, CA).

Fragmentet F9/R9 ble også amplifisert ved anvendelse av ekstensjonsklonen GE3L-11 (SEQ JD NO: 41) som kildemateriale. Omtrent 25 ng GE3L-11 ble anvendt som templat med F9 og R9 primere i amplifikasjonsreaksj onene.

Begge F9/R9 amplifikasj onene var i 30 sykluser ved 94°C, i 1 minutt, 52°C i 2 minutter og 72°C i 3 minutter ved anvendelse av "TAQ START" (Clonetech, Palo Alto, CA). Amplfikasjonsproduktene fra begge reaksjonene ble kombinert. Produktene ble spaltet med DNAse I (10 ul GE3L produktet og 25 ul PNF SISPA produktet). GE3L-basert amplifikasj onsprodukt representerte det meste av amplifikasj onsprodukt utgangsmaterialet. Ligering av KLI og KL2 linkerene til cDNA, amplifikasjon av DNA fragmenter og konstruksjon av bibliotek i lambda gtl 1 ble utført vesentlig som beskrevet i eksempel 12A.

Titere oppnådd var 2,5 x 10^ fag/ml og prosent rekombinant fag ble bestemt å være større enn 99%. Polymerasekjedereaksjonsanalyser av innskuddsstørrelsene bekreftet den rekombinante frekvensen og indikerte et innskuddsstørrelsesområde på 150 til 550 nukleotider.

I tillegg ble også et andre fragment amplifisert ved anvendelse av GEP-F10/GEP-R10 primere (SEQ JD NO: 135 og SEQ JD NO: 136). En mikroliter PNF 2161 SISPA amplifisert nukleinsyre ble anvendt som templat. Antatt fragmentstørrelse på 570 nukleotider ble oppnådd. Resulterende amplifikasj onsprodukter ble manipulert som beskrevet for F9/R9 amplifikasj onene. Titere oppnådd for dette fragmentet når skutt inn i lambda gtl 1 var 1,47 x 10^ fag/ml, med en rekombinant frekvens på 90%.

D. NS2 BIBLIOTEK.

NS2 epitopebiblioteket ble konstruert ved anvendelse av metodene beskrevet i eksempel 12A. 4 DNA fragmenter inneholdende alle eller en del av HGV proteinene NS2, NS3 og NS5b ble amplifisert fra 1 ul PNF 2161 SISPA DNA (dannet vesentlig som beskrevet i eksempel 12A). Biblioteket ble dannet ved anvendelse av primerene gitt i tabell 16 og SISPA amplifisert PNF 2161 DNA som templat.

Alle amplifikasj onene var i 35 sykluser med 94°C/1 min., 48°C/2 min. og 73°C/3 min. Alle amplifikasj onene ga minst et fragment med ventet størrelse. Amplifiserte produkter ble blandet og i et omtrentlig 1:1:1:1 forhold og delvis spaltet med DNase I. Som ovenfor ble de spaltede produktene ligert til KLI SISPA linkerene, amplifisert og EcoRI spaltet. Spaltede fragmenter ble ligert inn i lambda gtl 1. Ligeringsreaksjonene ble pakket.

Pakkede ligeringsprodukter ble sådd ut. Det resulterende biblioteket ble bestemt å inneholde ca 70% rekombinante fag med en observert innskuddsstørrelse på 150 til 500 nukleotider.

E. VNS5A BIBLIOTEK.

Primerene 470EXT4-2189R (SEQ ID NO: 119) og 470EXT4-29F (SEQ ID NO: 120) ble anvendt for å isolere et 2,1 kb DNA fragment som inneholder hele de kodende sekvensene til HGV proteinene NS4b og NS5a, samt 3' enden til NS4a og 5-enden til NS5b. PCR amplifikasj onene ved anvendelse av disse primerene ble utført som beskrevet i eksempel 4G. Vellykket amplifikasjon ble observert med multiple HGV-infiserte sera inkludert følgende: T56633 var fra en bloddonor hvor donasjonen ble nektet på grunn av en ALT verdi over grensen; prøvene E21-A og E20 var fra individer fra Egypt som lider av hepatitt; og prøve AH0591 var fra et individ fra Australia som utviklet voldsom hepatitt.

Amplifiserte produkter av E21-A og E20 ble klonet inn i T overhengende sete til vektoren T/A (oppnådd fra InVitrogen, San Diego, CA) vesentlig som beskrevet i eksempel 6. 2,1 kb HGV innskuddene fra disse to plasmidene ble deretter isolert ved spaltning av omtrent 20 ug plasmid DNA med omtrent 150 enheter restriksjonsenzym EcoRI. Etter inkubasjon over natt ved 37°C ble produktene av spaltningen separert ved TAE agarose gelelektroforese. Produktene ble spaltet ut fra delen av agarosegelen inneholdende fragmentet av interesse. Agarosen ble smeltet og ekstraksjon av frigjort DNA ble utført ved anvendelse av "GENECLEANII" settet ifølge forhandlerens instruksjoner (Bio 101, La Jolla, CA).

Rensede 2,1 kb fragmenter avledet fra E21-A og E20 prøvene, samt DNA fragmenter oppnådd fra PCR amplifikasjon av prøvene T56633 og AH0591, ble spaltet separat med DNasel som beskrevet i eksempel 12A. For alle fire prøvene ble spaltningsbetingelsene bestemt og resulterte i isolering av fragmenter med størrelser mellom 100 til 1000 nts. Etter rensing og trimming (eksempel 12A) ble fragmentene avledet fra hver av 4 HGV infiserte prøver ligert separat til forskjellige sett av SISPA linkere. Etter ligering ble DNA SISPA amplifisert.

Amplifisert DNA ble separat spaltet over natt ved 37°C med omtrent 100 enheter

EcoRI. Spaltet DNA ble deretter renset ved spinn kolonne kromatografi ved anvendelse av G25 harpiks (53' Inc., Boulder, CO). Spaltet DNA fra prøvene T56633, AH0591 og E21-A ble kombinert i et forhold på 1:1:1 og blandingen av DNA ble ligert inn i EcoRI setene til lambda gtl 1 som beskrevet i eksempel 12A. Etter pakkingen ved anvendelse av "GIGAPACK JJI XL" ekstrakt (Stratagene, LaJolla, CA) ble det resulterende biblioteket sådd ut i nærvær av IPTG og XGAL og bestemt å ha en titer på omtrent 1,0 x IO<6> fag/ml og en rekombinant frekvens på omtrent 70%.

EKSEMPEL 13

Immunscreening av epitopebibliotek

A. ISOLERING AV IMMUNREAKTIVE Y5 KLONER.

To HGV positive sera, PNF2161 og JC, ble anvendt for immunscreening av Y5 biblioteket, vesentlig som beskrevet i eksempel 2. Y5 fagbiblioteket ble sådd ut på 20 skåler med omtrent 15000 fag pr skål. Skålene ble inkubert i omtrent 5 timer og ble belagt med nitrocellulosefiltere (Schleicher and Schuell) over natt. Filtrene ble blokkert ved inkubasjon i AIB (1% gelatin pluss 0,02% Na azid) i omtrent 6 timer. Blokkerte filtere ble vasket en gang med TBS.

Ti Y5 bibliotekfiltere ble inkubert over natt, med agitering, med PNF2161 serum og 10 filtere med JC serum. Begge sera ble fortynnet 1:10 i AIB. For å redusere uspesifikk antistoffbinding ble fortynnet sera på forhånd behandlet ved inkubasjon over natt med nitrocellulosefiltere hvortil villtype lambda gtl 1 ble adsorbert.

Filtrene ble fjernet fra sera, vasket 3 ganger med TBS og inkubert med geite anti-humant alkalisk fosfatase-konjugert sekundært antistoff (Promega); fortynnet 1/7500 i AIB) i 1 time. Filtrene ble vasket 4 ganger med TBS. Bundet sekundært antistoff ble detektert ved inkubering av filtrene i AP buffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris pH 9,5) inneholdende NBT og BCIP.

Plakk som testet positive i den opprinnelige screeningen ble plukket og eluert i 500 ul PDB (100 mM NaCl, 8,1 mM MgSC>4, 50 mM Tris pH 7,5, 0,02% gelatin). Den immunrekative fagen ble renset ved ny utsåing av eluert fag ved en total tetthet på 100-500 plakk pr 100 mM skål. Skålene ble på ny immunscreenet med hensiktsmessig HGV-positivt sera, vesentlig som beskrevet ovenfor. Etter farveutviklingen ble flere isolerte, positive plakk plukket og bragt inn i 500 ul PDB. Etter 1 times inkubasjon ble 2 ul på forhånd renset fag PDB oppløsning anvendt som templat i en PCR reaksjon inneholdende 11F (SEQ JD NO: 25) og 1 IR (SEQ JD NO: 13) PCR primere. Disse primerene er homologe med sekvenser beliggende 70 nukleotider (nt) 5' og 90 nt 3' for EcoRI setene til lambda gtl 1. PCR reaksjonene ble amplifisert gjennom 30 sykluser ved 94°C i 1 minutt, 55°C i 1,5 minutter og 72°C i 2 minutter.

PCR amplifikasjonsreaksj onene ble størrelsesfraksjonert på agarosegeler. PCR amplifikajson av rensede plakk resulterte i et enkelt bånd hvor hver enkel-plakk amplifikasjonsreaksj on hvor amplifisert fragment inneholdende DNA innskuddet pluss omtrent 140 bp 5' og 3' fag flankerende sekvenser. Amplifiserte produkter fra PCR reaksjonene resulterte i enkelt bånd og ble renset ved anvendelse av en "S-300-HR" spinn kolonne (Pharmacia), ifølge forhandlerens instruksjoner. DNA ble kvantifisert og DNA sekvensert ved anvendelse av Applied Biosystems automatiserte sekvenser 373A og hensiktsmessige protokoller.

Ovennevnte screening av Y5 biblioteket med JC sera resulterte i rensing og DNA sekvensering av kloner med positiv tråd presentert i tabell 17. Kloner med positiv tråd korreponderer med 5'til 3'translasjon av HGV sekvensen tilstede i SEQ ID NO: 14 ~ polyprotein leserammen.

Disse klonene angir 2 immunogene regioner innenfor antatt NS5 protein til HGV. Disse to regionene, i forhold til sekvensen presentert som SEQ ID NO: 14 er posisjonene 6636 til 6821 og 7278 til 7385.

Screening av Y5 biblioteket med PNF 2161 sera resulterte i rensing og DNA sekvensering av følgende negativ-trådede kloner presentert i tabell 18. Negativ-tråd kloner tilsvarer 5'til 3'translasjonen av sekvensen som er komplementær med HGV sekvensen presentert i SEQ ID NO: 14.

Alle disse sekvensene inneholder deler av opprinnelig HGV klon 470-20-1 isolert ved anvendelse av PNF 2161 serumet.

Ytterligere epitopekloner fra Y5 biblioteket ble isolert som følger. Y5 biblioteket ble screenet med HGV infisert sera J21689 og T56633 ved anvendelse av metoder beskrevet i eksempel 13. Mer enn 400 positive plakk ble oppnådd og indikerer tilstedeværelse av en sterk immunogen sekvens gjenkjent ved begge disse HGV infiserte sera. 10 av disse positive plakkene ble renset og DNA sekvensert. Resultatene oppnådd fra DNA sekvenseringen er angitt i tabell 19.

Sammenligning av disse sekvensene med de som tidligere ble oppnådd fra screening av dette biblioteket indikerer at disse klonene alle inneholder samme epitoper som er innbefattet i tidligere isolert epitopeklon Y5-10. To av klonene, Y5-114-2B og Y5-121-19A kan skjelnes ved et faktum at deres 5' ender er beliggende 14 aminosyrer nærmere karboksyterminalen til NS5a enn tidligere observert start til klonene Y5-10, Y5-12 og Y5-26. Ingen av ovennevnte kloner har 3' enden i det indre i forhold til det som blir observert i klon Y5-10. En minimal sekvens av denne epitopen blir følgelig bekreftet innenfor aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 272).

B. ANTIGENE KLONER FRA ENV BIBLIOTEK.

ENV bibliotek ble screenet med HGV serum J21094. Dette serumet (J21094) ble identifisert som HCV positive basert på første generasjon (c-100) HCV test. Den påfølgende testen av opprinnelig J21094 serumprøve, og av påfølgende oppnådd J21094 prøver, ved PCR og med andre HCV antigener bekreftet at kilden individuelt for serumet var HCV infisert. Bevis for tilstedeværelse av HGV nukleinsyre ble oppnådd via PCR analyser ved anvendelse av 470-20-1 og NS5 primersettene.

Et antall fagkloner ble identifisert som immunreaktive med J21094 serum. Fagen ble plakkrenset og sekvensert. 7 av klonene (Q7-12-1, Q7-16-2-2, Q7-15-2, Q7-17-2-1, Q7-19-1 og Q7-19-2-1) inneholdt det samme innskuddet. Nukleotidsekvensen for Q7-12-1 er presentert som SEQ ID NO: 143 (polypeptidsekvens, SEQ ID NO: 144).

En ytterliger klon, Q7-16-1, oppnådd ifølge metoden som nettopp er blitt beskrevet, har samme 5' ende som Q7-12-1, men er 26 aminosyrer kortere ved 3-enden.

C. ANTIGENE KLONER FRA NS3 BIBLIOTEKET

En en til en blanding av F9/R9 fag og F10/R10 fagen ble screenet ved anvendelse av følgende sera: PNF 2161, J21689 og E57963. Både J21689 og E57963 er sera som tester ko-positiv for HCV og HGV ved PCR (ved anvendelse av multiple primere). Hver immunscreening var av 10 skåler eller omtrent 150.000 fag. Noen av de immunpositive klonene identifisert i disse screeningene er som følger.

Klon Y12-10-3 (polynukleotidsekvens, SEQ ID NO: 145; polypeptidsekvens, SEQ ID NO: 146) ble identifisert ved dets immunreaktivitet med J21689 serum. Klonen uttrykker et 88 aminosyreinnskudd fra HGV NS3.

Klon Y12-15-1 (polynukleotidsekvens, SEQ ID NO: 147; (polypeptidsekvens, SEQ ID NO: 148) ble identifisert ved dets immunreaktivitet med E57963 serum. Klonen uttrykker et 64 aminosyreinnskudd fra NS3 proteinet til HGV. Denne sekvensen er beliggende omtrent 70 aminosyrer 5'for klon Yl2-10-3.

D. ANTIGENE KLONER FRA NS2 BIBLIOTEKET.

Flere positive plakk ble isolert ved screening av NS2 biblioteket med HGV-positivt serum T56633. Elleve av disse plakkene ble deretter renset og DNA sekvensert. Beliggenhetene til innskuddene innbefattet i disse plakkene (i forhold til SEQ ID NO: 14) er angitt i tabell 20.

Alle immunokloner uttrykker deler av den samme åpne leserammen (ORF). Denne leserammen blir kodet av HGV polynukleotidtråden som er komplementær med sekvensen kodende for polyproteinet. Denne ORF rager mellom nts 6322 og 6865 i sekvensen komplementær med SEQ ID NO: 14. Det er en metionin som kan virke som et sete for translasjonsinitiering beliggende ved nt 6388 til den komplementære tråden som vil muliggjøre produksjon av et 159 aminosyreprotein.

Den minste aminosyresekvensen som er felles for alle 11 sekvenserte kloner er beliggende mellom nts 6342 og 6606 (i forhold til den komplementære tråden til SEQ ID NO: 14). Aminosyresekvensen som blir kodet av denne regionen av negative tråden til HGV-PNF 2161 er presentert som SEQ ID NO: 273.

Subkloning og påfølgende Western blot analyser av immunreaktive negative tråd regioner er beskrevet nedenfor.

E. ANTIGENE KLONER FRA VNS5A BIBLIOTEKET.

Omtrent 1,5 x 10^ fag fra VNS5a biblioteket ble sådd ut og deretter screenet med HGV-positivt serum J29374 ved anvendelse av prosedyrene beskrevet i eksempel 13. Immunscreening av VNS5a biblioteket med J29374 resulterte i isolering av multiple positive plakk. Seks av disse plakkene ble renset og deretter DNA sekvensert. Den opprinnelige stammen av DNA sekvensen oppnådd kunne bli bestemt utfra hvilke SISPA linkersekvenser var tilstede ved 5' og 3' endene til klonene. Beliggenhetene til start og stopp av oppnådd kloner (i forhold til SEQ ID NO: 14) og deres kildesera er oppsummert i tabell 21.

Alle disse klonene inneholder sekvensen av klon Ql 1-22-1 felles (SEQ ID NO: 274). Denne aminosyresekvensen er beliggende rett 5' for den minimale sekvensen til Y5-10 epitopen. Den definerer følgelig en ytterligere unik epitope i HGV NS5a (sammen med Y5-10 og Y5-5). Sammenligning av den observerte aminosyresekvensen til disse tre HGV variantene med sekvensen til PNF-2161 og JC isolater viser færre aminosub stitusj oner.

EKSEMPEL 14

Ytterligere karakterisering av immunreaktive kloner

A. SUBKLOMNG

1. Y5 KLONER

Klonene Y5-10, Y5-16 og Y5-5 ble selektert for sub-kloning inn i ekspresjonsvektor pGEX-HisB). PCR primerene ble konstruert og ytre linkersekvenser ble fjernet i enden av disse klonene. Disse primerene innførte også (I) et Ncol sete ved 5' enden (i forhold til den kodende sekvensen) til hvert innskudd, og (ii) et BamHI sete ved 3' enden av hvert innskudd. Ved anvendelse av disse primerene (se tabell 22) ble DNA fragmentene amplifisert fra 2 ul av den rene plakkstokken.

Amplifikasj onene ble utfør som følger: 30 sykluser ved 94°C i 1 minutt, 50°C i 1,5 minutter og 72°C i 2 minutter. Etter amplifikasjon ble resulterende DNA renset ved anvendelse av "WIZARS PCR", spinnkolonner, prøvene ble eluert i 50 ul og spaltet over natt med Ncol og BamHI. Et minimum av 30 enheter av hvert enzym ble anvendt i restriksjonsendonukleasespaltningen (Ncol, Boehringer Mannheim; BamHI, Promega).

Spaltede PCR fragmenter ble ligert over natt til ekspresjonsvektor pGEX-HisB som var blitt spaltet med Ncol og BamHI. Hvert sett av ligerte plasmider ble uavhengig anvendt for å transformere E. coli stammen W3110, ved anvendelse av en varmesjokk protokoll (Ausubel, et al.; Maniatis, et al.). Transformanter ble selektert på LB skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin og resistente kolonier ble anvendt for å inokulere 2 ml LB inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Kulturer som uttrykker ikke-rekombinant sj26/his protein ble også dannet.

Etter inkubasjon over natt ved 37°C ble kulturene fortynnet 1/10 i 2 ml frisk LB pluss ampicillin og dyrket i ytterligere 1 time ved 37°C. IPTG ble tilsatt til en sluttkosentrasjon på 0,2 mM og kulturene ble dyrket i ytterligere 3 timer ved 37°C. Bakteriene ble pelletert ved sentrifugering og den bakterielle pelleten ble resuspendert i 100 ul PBS. Til pelleten ble 100 ul 2X SDS prøvebuffer (0,125 M Tris, pH 6,8, 10% glycin, 5% J3-merkaptoetanol, 2,3% SDS) tilsatt. De resulterende lysatene ble vortex behandlet og varmet til 100°C i 5 min. Alikvoter (15 ul) av hvert lysat ble applisert på en 12% akrylamid SDS-PAGE gel.

Uttrykte proteiner ble størrelsesseparert ved elektroforese. Separerte proteiner ble overført fra gelen til nitrocellulosefilteret ved anvendelse av standardteknikker (Harlow, et al.). En ytterligere gel inneholdende uttrykte proteiner ble farvet ved anvendelse av coomassie blå proteinfarving.

Transformanter inneholdende plasmidene Y5-10, Y5-5 og Y5-16 uttrykte betydelige mengder av rekombinante fusjonsproteiner med riktig størrelse. Identiteten til de rekombinante fusjonene ble bekreftet ved inkubering av et Western blot (dannet ovenfor) med et murint monoklonalt antistoff som er spesifikt immunreaktiv med sj26 (Sierra BioSource, Gilroy, CA).

Ytterligere bekreftelse på at de plukkede koloniene inneholdt hensiktsmessige innskudd ble oppnådd som følger. En fagoppløsning for hver koloni ble dannet ved inokulering av 40 ul TE oppløsning med en tannpirker inneholdende en liten mengde bakterier som er antatt å uttrykke en rekombinant klon var blitt inokulert. En 5 ul prøve ble tatt fra hver oppløsning og separat PCR amplifisert.

Amplifikasj onene anvendte den hensiktsmessige forover primeren, (for eksempel Y5-10 F for en koloni som uttrykker Y5-10 (og en revers primer (SEQ ID NO: 104) homolog med en sekvens beliggende 3'for kloningssetene til plasmid pGEX-HisB. PCR amplifikajsonene ble utført i 25 sykluser som følger: 94°C i 1 min., 50°C i 1,5 min. og 72°C i 2 min. Alle koloniene selektert for ytterligere analysering produserte DNA bånd med korrekt størrelse uten andre synlige bånd under disse betingelsene.

Immunreaktiviteten til antigenene uttrykt fra Y5-10, Y5-16, & Y5-5 innskuddene (uttrykt som sj26-his fusjonsproteinene) ble bestemt som følger. Alikvoter (15 ul) av rålysatene dannet ovenfor ble størrelsesseparert ved SDS-PAGE ved anvendelse av en 12% akrylamidgel. Proteinene ble elektro-blottet ("NOVEX MINICELL MINIBLOT II", San Diego, CA) på nitrocellulosefiltrene. Filtrene ble deretter individuelt inkubert med en av følgende sera: JC, PNF 2161 og supernormalt serum 4 (SN4) (R05072) som en negativ kontroll. I tillegg ble et filter inkubert med anti-sj26 monoklonale antistoffer (RMOOl; Sierra BioSource).

Som ventet reagerte det rekombinante proteinet produsert av bakteriene som uttrykker antigenene kodet av Y5-10, Y5-5 og Y5-16 innskuddene med JC sera. Ingen reaktivitet ble observert med hverken PNF 2161 eller SN4 sera. Alle proteinene så ut til å bli uttrykt i lignende grad som bestemt ved deres reaktivitet overfor anti-sj26 monoklonalt antistoff. Y5-5 og Y5-10 kodede proteiner ble selektert for ytterligere rensing.

E. coli inneholdende Y5-5- og Y5-10- inneholdende pGEX-HisB vektorer ble dyrket og ekspresjon av fusjonsproteinet indusert som beskrevet ovenfor. Cellene ble ly sert i PBS, inneholdende 2 mM PMSF, ved anvendelse av en French Press ved 1500 psi. Rålysatet ble sentrifugert for å fjerne cellulært debris. Supernatanten ble applisert på glutation affinitetskolonen med en høy strømningsrate og kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolum PBS. Y5-5 og Y5-10 fusjonsproteinene ble eluert med 10 mM Tris pH 8,8 inneholdende 10 mM glutation.

Hver av fusjonsproteinprøvene ble fortynnet 1/10 med buffer A (10 mM Tris pH 8,8, inneholdende 8 M urea) og applisert på en nikkellade-gelaterende "Sepharose" fast flow kolonne. Hver kolonne ble gjentatte ganger vasket med buffer A helt til ingen ytterligere kontaminanter ble eluert. Fusjonsproteinene ble eluert ved anvendelse av en gradient av imidazol i buffer A. En imidazolgradient ble kjørt fra 0 til 0,5 M imidazol i 20 kolonnevolumer. Fraksjonene ble samlet.

Hvert sett av fraksjonene ble analysert ved standard SDS-PAGE ved anvendelse av 12% polyakrylamidgeler. Blandinger av Y5-5 og Y5-10 fusjonsprotein-inneholdende fraksjoner ble separat dannet. Figurene 8A til 8D viser resultatene av Western blot analyser av følgende prøver (ug/kolonne): kolonne 1, Y5-10 antigen 1,6 ug; kolonne 2, Y5-10 antigen 0,8 ug; kolonne 3, Y5-10 antigen 0,4 ug; og kolonne 4, Y5-19 antigen 0,2 ug. Humant serum JC (figur 8A) og super normal 2 serum (figur 8B) ble fortynnet 1:100. Anti-GST muse monoklonalt antistoff RMOOl (figur 8C) ble fortynnet 1:1000. Figur 8D viser Y5-10 antigen vist ved SDS-PAGE, overført på nitrocellulose membran og farvet med Ponceau S protein farving (Kodak, Rochester, NY; Sigma). Pilen indikerer beliggenheten av Y5.10 antigenet. Disse resultatene demonstrerer at Y5-10 er spesifikt immunreaktivt med N-(ABCDE) humant serum JC. Figurene 9A til 9D viser resultatene av Western blot analyser av følgende prøver: kolonne 1, Y5-5 antigen 3,2 ug; kolonne 2, Y5-5 antigen 1,6 ug; kolonne 3, Y5-5 antigen 0,8 ug; kolonne 4, Y5-5 antigen 0,4 ug; kolonne 5, Y5-5 antigen 0,2 ug; kolonne 6, GE3-2 antigen 0,4 ug; og kolonne 7, Y5-10 antigen 0,4 ug. Humant serum JC (figur 9A), T55806 (figur 9B) og super normalt 2 serum (figur 9C) ble fortynnet

1:100. RM001, anti-GST musemonoklonalt antistoff, (figur 9D) ble fortynnet 1:1000. Pilene indikerer beliggenhetene til antigenene Y5.5, GE3,2 og Y5.10. Disse resultatene viser spesifikk immunreaktivitet av Y5-5 antigener med JC serumet. Antigenene GE3-2 og Y5-10 var reaktive med T55806. Y5-5 antigenet var derimot ikke reaktivt med HGV-positivt sera T55806.

Y5-10 antigenet ble også størrelses-fraksjonert ved SDS polyakrylamid gelelektroforese. Gelen ble farvet ved anvendelse av coomassie blå proteinfarving. Gelen ble scannet for renhet med et laser densitometer. Renheten til Y5-10 fusjonsproteinet var på omtrent 95%.

2. ENV KLONER.

Immunklon Q7-12-1 ble opprinnelig isolert ved screening av ENV epitope biblioteket med HGV positiv sera J21094. Sekvensspesifikke primere ble anvendt for å isolere HGV innskuddet innbefattet i Q7-12-1 Xgtl 1 klonen. Q7-12-1 innskuddet ble tatt ut og klonet inn i pGEV-Nde. Sekvensen til innskuddet ble bekreftet ved DNA sekvensering (SEQ JD NO: 275).

3. NS3 KLONER.

Immunklon Y12-15-1 ble opprinnelig isolert ved screening avNS3 epitopebiblioteket med HGV positiv sera E57963. Sekvensspesifikke primere ble anvendt for å isolere HGV innskuddet innbefattet i Y12-15-1 Xgtl 1 klonen. Y12-15-1 innskuddet ble tatt ut og klonet inn i pGEX-Nde. Sekvensen til innskuddet ble bekreftet ved DNA sekvensering (SEQ JD NO: 276).

Immunklon Y12-10-3 ble opprinnelig isolert ved screening avNS3 epitopebiblioteket med HGV positivt sera J21689. Sekvensspesifikke primere ble anvendt for å isolere HGV innskuddet innbefattet i Y12-10-3 Xgtl 1 klonen. Y12-10-3 innskuddet ble tatt ut og klonet inn i pGEX-Nde. Produksjon av fusjonsproteinene til selektert klon ble vurdert ved Western blot analyser. Sekvensen til innskuddet ble bekreftet ved DNA sekvensering (SEQ JD NO: 277).

4. NS2 KLONER.

Multiple negative tråd immunkloner oppnådd fra sekvenser komplementære med sekvensene til NS2 regionen til SEQ ID NO: 14 ble isolert. Det er minst to signifikante ORF kodet av den negative tråden til HGV. Den første av disse ORF, representert ved Q9 seriene til klonene ble beskrevet ovenfor. Den andre av disse ORF er beliggende mellom nts 6723 og 7259 av komplementet til SEQ ID NO: 14 og har også en 5' metionin ved nts 6774. Andre ORF koder for et 162 aminosyreprotein.

Selekterte deler av sekvensene til begge disse negativt tråd ORF ble klonet inn i ekspresjonsvektor pGEX-Nde. Alle disse subklonene ble oppnådd ved PCR amplifikasjon av PNF 2161 SISPA materiale ved anvendelse av hensiktsmessige oligonukleotidprimere og inneholder følgelig sekvensen til HGV-PNF 2161 varianten. Tabell 23 indikerer navn, størrelsen av ORF og beliggenhetene i forhold til komplementet til SEQ ID NO: 14.

De første to linjene av denne tabellene identifiserer beliggenhetene av NS2 regionen 5' og 3' negativ tråd ORF i forhold til komplementet av SEQ ID NO: 14. De gjenværende linjene indikerer de spesifikke nukleotidsekvensene uttrykt av alle ni klonene. Flere av klonene uttrykker aminosyrer beliggende 5' for hypotetisk HGV initieringsmetionin til ORF. Det er å bemerke at den siste klonen som er oppført, K3p-KF2/KR1, er en chimera som uttrykker de indikerte delene av 5' ORF etterfulgt av de indikerte delene av 3'ORF.

Alle DNA fragmentene ble deretter klonet inn i pGEV-Nde. Innskuddet inneholdende klonene ble også identifisert og bekreftet.

5. NS5A KLONER.

Tabell 24 har oppført et antall NS5a kloner og regionene til SEQ ID NO: 14 som de tilsvarer.

Disse sekvensene ble klonet inn i vektoren pGEX-Nde for ekspresjon av kodede proteinantigener.

B. WESTERN BLOT ANALYSER AV SELEKTERTE HGV SUBKLONER.

For å bestemme reaktiviteten til både negative og positive trådkonstruksjoner beskrevet ovenfor ble hele cellelysater fra bakterier som uttrykker forskjellige HGV subkloner dannet vesentlig som beskrevet i eksempel 13B. Alikvoter av uttrykte proteiner ble deretter separert ved SDS-PAGE, proteinene ble overført til nitrocellulosefiltere og filtrene probet med HGV-positive eller kontroll sera (for eksempel anti-SJ26 MAB RM01). Blottene ble inkubert med et hensiktsmessig reporter antistoff.

Med hensyn til HGV proteinene som er blitt testet ble klar immunreaktivitet med proteinet NORF-F3/F2 detektert med HGV sera J21689 og T56633. NORF-F3/R2 subklonen uttrykker aminosyresekvensene som også ble kodet av Q9 seriene til negativ tråd epitopeklonene. Observert sterk reaktivitet med HGV sera T56633 bekrefter immunreaktiviteten til denne regionen av negativ tråd HGV. Reaktiviteten til NORF-F3/R2 proteinet ble ikke observert med sera fra HGV negativt individ R04316 eller noen av de 5 andre HGV negative subnormale sera som er blitt testet.

Ytterligere blott indikerer at andre hoved 5' ORF klon NORF KF2-R4, som uttrykker aminosyrene til den karboksyterminale halvdelen av 5'negativ tråd ORF reagerer ikke med HGV-positivt sera T56633. Denne observasjonen i sammenheng med beliggenhetene til Q9 epitopeklonene beskrevet ovenfor tyder på at den immunogene epitopen til denen delen av den negative tråden er innbefattet i 55 aminosyrene angitt ovenfor (SEQ ID NO: 273). Det faktumet at denne sekvensen blir gjenkjent av andre HGV antisera, inkludert J21689, indikerer at immunreaktiviteten overfor denne sekvensen er relativt spredt blandt HGV infiserte individer.

Klar immunreaktivitet med Y12-10-3 proteinet ble observert med HGV-infisert sera J21689, J29374 og E57963. Spesifisiteten til denne reaktiviteten er ytterligere understøttet ved svikten av å observere immunreaktivitet med HGV antisera J29374 eller E57963 i fravær av induksjon ab Y12-10-3 proteinekspresjon av IPTG. Ingen reaktivitet med Y12-10-3 ble observert med noen av de 7 supernormale sera som er blitt testet.

EKSEMPEL 15

En multi- antigen HGV diagnostisk analyse

Til tross for at epitopekloner beskrevet ovenfor ikke ser ut til å være reaktive med alle HGV PCR-positive sera reagerer mange av disse klonene med en vesentlig fraksjon av HGV infisert sera som de er blitt testet mot. Disse proteinene har i tillegg ikke utvist vesentlig kryssreaktivitet med HGV-negativt sera. Det er følgelig mulig å konstruere en diagnostisk analyse hvor flere av disse proteinene blir kombinert slik at de individuelle reaktivitetene til proteinet blir oppsummert. En slik analyse er ventet å ha en relativ høy sensitivitet for deteksjon av HGV-positivt sera og en relativt lav bakgrunnsreaktivitet med HGV-negativt sera.

Eksempler på epitoper/antigener nyttige i en slik analyse innbefatter, men er ikke begrenset til, NORF-F3/R2 (NS2-Neg tråd), Y12-10-3 (NS3), Ql 1-F2-R1 (NS5a), Y5-10 (NS5a), Y5-5 (NS5a), Ql 1-F2-R2 (kombinerer 2 epitoper av NS5a).

For denne analysen blir individuelle antigener inneholdende forskjellige unike epitoper som gjenkjenner forskjellige undergrupper av HGV-positivt sera selektert. Slike antigener reagerer vanligvis ikke signifikant med HGV-negativt sera. Ifølge retningslinjene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ytterligere nyttige immunogene kloner bli isolert.

En multi-antigen diagnostisk analyse kan innta mange formater. I en utførelsesform kan analysen innbefatte immobilisering av hver av 5 HGV proteiner og kontrollproteiner ved separate beliggenheter på en nitrocellulosestrimmel eller annet hensiktsmessig fast format. Alternativt kan ikke-virale deler av for eksempel et HGV-fusjonsprotein bli modifisert, enten ved innskudd eller delesjoner slik at de naturlig kan migrere for lettere å skjelne beliggenhetene ved SDS-PAGE og påfølgende Western blot analyser. Strimler blir deretter inkubert i testsera. Etter deteksjon av bundet antistoff kan et serum deretter bli registrert basert på (i) antall antigener som det er immunreaktivt med og (ii) styrken på immunologiske reaksjoner. Reaktiviteten til et ikke-HGV kontrollprotein kan gjøre et serum vanskelig å type bestemme. Manglende reaktivitet med HGV protein kan klassifisere et serum som HGV-negativt.

ELISA-baserte screeningsanalyser kan bli utført ved kombinering av rensede antigenproteiner i en enkel reaksjonssone eller ved å danne proteinkonstruksjoner som uttrykker to eller flere reaktive epitoper som et enkelt protein (for eksempel, et HGV mosaikk polypeptid). Fremgangsmåter for å konstruere mosaikk polypeptider er beskrevet heri. Ql 1-F2-R2 konstruksjonen beskrevet ovenfor representerer et "matriseprotein" som koder for 2 individuelle epitoper i en enkelt polypeptidkjede. Westernblot analyser kan virke som en bekreftende analyse for en slik ELISA screeningstest.

Alternativt eller i tillegg kan full-lengde HGV proteiner, så som E2, NS5a og NS3 bli plassert i en enkelt reaksjonssone. Sera reaktive med slike proteiner kan også bli bekreftet som HGV positive ved Western blot analyse.

EKSEMPEL 16

Ekspresjon av store HGV pol<y>peptider

A. Ekspresjon av større HGV anti<g>ener i E. coli

1. Kloning og ekspresi on

For å identifisere konformasjons HGV epitoper (ikke dekket av små overlappende HGV konstruksjoner eller ved fagbibliotek screening) ble større HGV proteinkonstruksjoner dannet i pET-21a(+) vektoren (Novagen, WI) basert på antagelsen om spaltningsseter (Bazan, et al., 1989; Chambers, et al., 1990b; Grakoui, et al., 1993; Kyte and Doolittle, 1982). Individuelle HGV proteinkonstruksjoner ble dannet på lignende måte for HGV sekvenser klonet i pGEX vektorer.

Selekterte HGV sekvenser ble RT-PCR amplifisert fra en HGV(+) human serakilde ved anvendelse av HGV sekvens spesifikke primere. Primerene ble omkonstruert slik at de inneholder hensiktsmessige restriksjonsseter for kloningsmanipuleringer i pET vektoren. Kodende sekvenser av interesse ble vanligvis skutt inn mellom EcoRI setet og HindUI setene i vektoren for å produsere 5' i-ramme fusjoner med T7.Taq ledersekvensen og 3'i-ramme fusjon med en heksamerhistidin sekvens. T7.taq (en 11 aminosyresekvens) muliggjør deteksjon av fusjonsproteinene ved anvendelse av et anti-T7.Taq monoklonalt antistoff (Novagen, WI). Histidinheksameren ved karboksylenden av fusjonsproteinet muliggjør rensing av proteinet ved anvendelse av immobilisert metallion affinitetskromatografi.

HGV fragmenter ble ligert inn i hensiktsmessige spaltede pET-21a(+) vektorer. Ligerte produkter ble transformert inn i kompetent E. coli (HMS 174; Novagen, WI). Plasmid DNA fra transformert HMS 174 ble analysert for tilstedeværelse av HGV sekvenser ved PCR, ved anvendelse av primerene T7F(SEQ ID NO: 157) og T7R(SEQ ID NO: 58), som er homologe med pET-21a(+) vektorsekvenser som flankerer det innskutte molekylet. Størrelsen til PCR produktet var innskuddsstørrelsen pluss omtrent 260 bp avledet fra vektoren.

For hver konstruksjon bekreftet PCR resultatene tilstedeværelse av innskuddssekvensene. Transformanter med hensiktsmessige innskudd ble selektert, plasmid DNA med HGV innskudd dannet og ført inn i HMS 174 (DE3) kompetent E. coli (Novagen, WI) for uttrykking av HGV proteiner.

Ekspresjon av HGV proteinene ble indusert med 1 mM IPTG. Ekspresjon av T7.taq fusjonsproteinene ble registrert ved fremkomst av proteiner med antatt størrelse på coomassie blå farvet gel. Ekspresjon av fusjonsproteinene ble bekreftet ved Western blot analysering ved anvendelse av anti-T7-Taq antistoff (Novagen, WI). HGV proteinene uttrykt i pET-21a(+) vektoren er vist i tabell 25. Start og ende punktene til uttrykte sekvenser er gitt i forhold til SEQ ID NO: 14. Aminosyresekvensen til GE-Cap er vist i SEQ ID NO: 185.

Figur 12 viser ekspresjon av hvert HGV protein demonstrert ved Western blot analysering med T7.Taq monoklonalt antistoff. Kolonnene i figur 12 er som følger: kolonne 1, på forhånd farvet molekylvektsmarkør (Bio-Rad); kolonne 2, uindusert GE-Cap lysat; kolonnene 3-11, IPTG induserte lysater av GE-Cap, Ela, E2, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS4 og NS5b lysat. Kolonne 12 inneholdt 1 ug renset NS5a. Beliggenhetene til hvert antigen er merket med piler. Som vist i figur 12 ble alle HGV proteinene uttrykt i E. coli.

2. Western blot analyser av HGV proteiner uttrykt i pET vektoren

Western blot analyser av HGV proteinet uttrykt i pET vektoren ble utført som beskrevet i eksempel 11C ved anvendelse av E. coli hele cellelysater og pre-absorbert sera. Resultatene av disse analysene demonstrerte at flere av pET HGV proteinene er spesifikt immunreaktive med HGV-positive humane sera, men ikke med HGV-negative humane sera. GE-NS2b-l protein var immunreaktive med J21689 serum. GE-NS5a-3 proteinet var immunreaktivt med flere HGV(+) sera på Western blot analyser, inkludert JC, T55806, T56633, J21689, E57963 og R0001. Blant disse seraene er T55806, J21689 og E57963 HCV ko-positive (ifølge PCR analyser). Hverken GE-NS2b-l eller GE-NS5a-3 var immunreaktive med flere HGV negative sera som er blitt testet.

Figurene 10A til 10F viser eksempelvise resultater av en serie Western blot eksperimenter som undersøker reaktiviteten av antigenene GE-NS2b og GE-NS5a3. Kolonnene i hvert plott i figurene 10A til 10F er som følger: kolonne 1, uindusert GE-NS2b lysat; kolonne 2, IPTG indusert GE-NS2b lysat; kolonne 3, uindusert GE-NS5a lysat; og kolonne 4, IPTG indusert GE-NS5a lysat. Hvert blot ble inkubert med et humant serum eller musemonoklonalt antistoff: figur 10A, J29374; figur 10B, J21689; figur 10C, T56633; figur 10D, T43608 (super normalt serum); figur 10E, anti-T7.Taq; og figur 10F, coomassie farvet gel. Serumet eller monoklonale antistoff som ble anvendt er indikert over hvert blot. Humant sera ble fortynnet 1:100 og anti-T7.Taq muse monoklonalt antistoff ble fortynnet 1:1000.

I tillegg til sera angitt ovenfor er ytterligere HGV-PCR positive sera blitt screenet ved anvendelse av GE-NS5a. Resultatene av alle disse analysene har demonstrert reaktiviteten til GE-NS5a antigen med multiple HGV-infiserte sera.

GE-NS5b var immunreaktive med HGV(+) sera JC og T55806, men var ikke immunreaktive med HGV(-) negativt sera testet. Figurene 13 A til 13E viser resultatene av en serie Western blot eksperimenter som undersøker reaktiviteten til antigen GE-NS5b. I figurene er kolonnene som følger: kolonne 1, på forhånd farvet molekylvektsmarkør (BioRad); kolonne 2, uindusert GE-NS5b lysat; kolonne 3, IPTG indusert GE-NS5b lysat.

Hvert blot ble inkubert med et humant serum eller muse monoklonalt antistoff: figur 13A, anti-T7.Taq monoklonalt antistoff; figur 13B, JC; figur 13C, T55806; og figur 13D, T43608 (super normalt serum). Figur 13E er en coomassie farving.

Figurene 14A til 14D viser resultatene av en serie av Western blot eksperimenter som undersøker reaktiviteten til antigenet GE-E2. Kolonnene i hver av figurene 14A til 14D er som følger: kolonne 1, på forhånd farvet molekylvektsmarkør (BioRad); kolonne 2, uindusert GE-E2 lysat; kolonne 3, IPTG indusert GE-E2 lysat. Hvert blot ble inkubert med et humant serum eller muse monoklonalt antistoff: figur 14A, anti-T7.Taq monoklonalt antistoff; figur 14B, 3831781; og figur 14C, T43608 (super normalt serum). Figur 14D er coomassie farving. Serumet eller monoklonale antistoff som ble anvendt er angitt over hver blot. GE-E2 proteinet var immunreaktivt med HGV-positivt serum 3831781, men var ikke immunreaktivt med subnormalt serum T43608 (figurene 14B og 14C).

Antigenene GE-Cap og GE-NS4a var også spesifikt immunreaktive med HGV(+) serum J21689.

B. Ekspresjon av større HGV antigener i insektsceller

Ekspresjon av proteiner ved anvendelse av rekombinante bakuloviruser gir følgende fordeler (i) høyt nivå av rekombinant proteinekspresjon, og (ii) fordelene av et høyere eukaryotisk system, inkludert effektiv proteintranslokasjon og modifikasjon. Dette systemet er spesielt nyttig for ekspresjon av translokerte proteiner, for eksempel HGV El,E2ogNS2a.

1. Kloning og ekspresjon

Spodoptera frugiperda insektscellekultur sf21 og et derivat av Autografa claifornica nukleær polyhedrosevirus "BACULOGOLD" (Pharmingen, San Diego, CA) ble anvendt for ekspresjon av HGV polypeptider. Etablerte protokoller ble anvendt for insektscelledyrking og for dannelse av rekombinante bakuloviruser ved ko-transfeksjon av bakulovirus plasmid overføringsvektorer med linearisert bakulovirus DNA (King, 1992). Konvensjonelle teknikker ble anvendt for konstruksjon av bakulovirus plasmid overføringsvektorene (Maniatis, et 1., Sambrook, et al.).

Bakulovirus overføringsvektor pAcYMl (King, et al., 1992) ble modifisert ved ligering av et dobbelt-trådet oligonukleotid kodende for en histidin heksamer inn i vektorens

BamHI kloningssete (vektor betegnet pAcYMIH). Et stoppkodon (TAA) var plassert etter histidinheksamersekvensen. Dette gir en histidinheksamer på den karboksyterminale enden til uttrykte proteiner. BamHI kloningssetet til pAcYMI opphavsvektoren forble intakt i pAcYMIH og kunne bli anvendt for kloning av forskjellige gener i ramme med histidin heksameren. Histidinheksameren tilveiebringer en fremgangsmåte for hurtig og effektiv rensing av det uttrykte proteinet (Janknecht, et al., 1991).

En annen bakulovirus overføringsvektor, pVT-Bac, ble også modifisert på lignende måte for å tilveiebringe en histidinheksamer på karboksy-termini til uttrykte proteiner. pCT-Bac inneholder som pAcYMI vektoren en sterk sen polyhedrin promoter. I tillegg tilveiebringer pVT-Bac også en sterk insektstranslokasjonssignalsekvens for å forsikre effektiv translokasjon av uttrykte proteiner (Tessier, et al., 1991). pVT-Bac vektoren ble modifisert ved ligering av et dobbelt-trådet oligonukleotid kodende for en histidinheksamer inn i vektorens BamHI kloningssete (som gir pVT-BacH vektoren). BamHI kloningssetet til pVT-Bac opphavsvektoren forblir intakt i den oppnådd pVT-BacH vektoren og kan bli anvendt for kloning av gener i-ramme med insektsledersekvens og histidinheksamersekvens.

DNA fragmenter kodende for forskjellige HGV gener ble oppnådd ved revers transkripsjons PCR. Regioner av HGV genomet ble selektert ifølge antatte spaltningsseter (Bazan, et al., 1989; Chambers, et al., 1990b; Grakoui, et al., 1993; Kyte and Doolittle, 1982). Følgende primerpar ble anvendt i RT-PCR amplifikasjonsreaksj onene ved anvendelse av PNF 2161 kildenukleinsyre: El, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243; E2B (HGV signalsekvens); SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245; E2C (insektssignalsekvens), SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247M NS2a, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249; NS2b, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251; NS3, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253; NS4a, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255; Ns4b, SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO; 257; NS5a, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259; NS5b, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261; og El-E2-NS2a, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263.

Amplifiserte DNA fragmenter ble spaltet med BamHI eller Bglll endonukleaser og klonet inn i BamHI spaltet pAcYMI, pAcYMIH, pVT-Bac eller pVT-BacH vektorer. Sekvenser kodende for El og E2 karboksy-terminal ankeret samt en hydrofob sekvens ved karboksy-terminusen til NS5b ble deletert for å lette påfølgende proteinrensning. Rekombinante bakulovirus plasmid transfer vektorer inneholdende HGV sekvenser ble ko-transfektert med linearisert bakulovirus DNA og rekombinante vimser ble selektert som hvite foki i nærvær av X-gal (King, et al., 1992). Rekombinante vimser ble to ganger plakk-renset og propagert. Monolag av Sf21 cellene ble infisert med rekombinante bakuloviruser ved en multiplisitet på 5 p.f.u. pr celle og inkubert ved 27°C i 601. Cellene ble vasket med PBS og lysert i TNN buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% "NONTDET-P40"). Inklusjonslegemene ble isolert ved spinning av celleprøvene ved 14k i 5 minutter. Inklusjonslegemene ble resuspendert i protein dissosiasjonsbuffer (10% 2-merkaptoetanol, 10% SDS, 25% glycerol, 10 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,02% bromfenol blå) og inkubert ved 100°C i 10 minutter.

Proteinekspresjonsmønstrene ble analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble separert på 0,1% SDS-18% PAGE og farvet med coomassie brilliant blå. Hoveddelen av HGV proteinene ble uttrykt i høy grad og kunne lett bli detektert på coomassie blå farvede geler. NS5a og NS2a polypeptider ble detektert ved 35S metioninproteinmerking (King, et al., 1992).

HGV E2 protein glykosylering ble undersøkt som følger. Sf21 cellene ble infisert med rekombinante bakuloviruser og bearbeidet som beskrevet ovenfor. Proteinene ble separert ved 0,1% SDS-12% PAGE, elektroblottet på en "IMMOBILON-P" membran (Millipore, Bedford, MA) og omsatt med Galanthus nivalis agglutinin (Boehringer Mannheim DIG Glycan differentiation kit) som er spesifikk for mannose residier. HGV E2 proteinet som ble uttrykt med dets egen signalsekvens ble omfattende glykosylert og indikerer at den antatte E2 signal sekvensen kan virke på denne måten.

2. Immunfluorescens analyse.

SF21 insektscellene ble infisert med bakulovirus HGV konstmksjoner beskrevet ovenfor. Cellene ble høstet, sentrifugert ved 1,5K rpm i 3 minutter, vasket i IX PBS, og på ny sentrifugert.

For immunfluorescens analyse (IFA) (King, et al., 1992) ble cellene resuspendert i PBS og lagt i brønnene til objektglass slik at cellene dannet et sub-konfluent lag i brønnene på objektglassene. Objektglassene ble luft-tørket. Cellene ble fiksert med pre-avkjølt-70°C aceton i 10 minutter og rehydreit med PBS i 5 minutter. PBS i overskudd ble fjernet ved blotting. Fikserte celler ble behandlet i 1 time med følgende "blokkeringsbuffer": 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 3% geiteserum, 1% BSA, 1% fettfri melk og 0,1% gelatin.

Primært antistoff ble deretter tilsatt til de fikserte cellene. Primære antistoffer innbefattet en serie av humane HGV-positive sera og et positivt kontroll monoklonalt antistoff. Før anvendelsen ble sera pre-absorbert for uspesifikke proteiner ved anvendelse av insektscellelysat. Pre-absorpsjon ble utført over natt ved 4°C. Uinfiserte SF21 celler ble anvendt som en negativ kontroll. Etter addisjon av et selektert primært antistoff (sera) ble objektglassene inkubert i 2 timer og deretter vasket flere ganger med PBS og overskudd buffer ble fjernet. Et sekundært antistoff konjugert med fluorescein (0,5 ug/ml kons.) ble deretter tilsatt til prøvene på objektglassene. Inkubasjonstiden og temperaturen til sekundært antistoff var det samme som for primært antistoff. Etter inkubasjon ble objektglassene vasket i PBS og belagt med et dekke. Fluorescens til cellene ble deretter bestemt ved anvendelse av et fluorescens mikroskop.

Resultatene av denne analysen var som følger. Celler som uttrykker HGV antigen El-E2-NS2a var immunreaktive med 4/10 HGV-positive sera og svakt immunreaktive med et ytterligere 2/10 sera. Celler som uttrykker El var svakt immunreaktive med 1/10 sera. Celler som uttrykker E2 var immunreaktive med 3/10 sera og svakt immunreaktive med 1/10 sera. Ingen av cellene inneholdende HGV antigener var immunreaktive med supernormale kontroll sera.

3. Western blot analyser av HGV proteiner uttrykt i bakulovektor

Western blot analyser av HGV proteinene uttrykt i rekombinante bakulovirus infiserte Sf21 insektsceller ble også utført. Inklusjonslegemene ble dannet som beskrevet ovenfor og utsatt for Western blot analyser. Western blot analyser ble utført ved anvendelse av pre-absorbert sera. Resultatene av analysene demonstrerte at E2 proteinene (en variant med endogen HGV signal sekvens, E2B, og en andre variant inneholdende en insektssignalsekvens, E2C) var spesifikt immunreaktive med HGV(+) serum 3831781.

Figurene 15A til 15D viser resultater av en serie Western blot eksperimenter for undersøking av reaktiviteten til bakuloantigenene E2B og E2C. Kolonnen i hver blot i figurene 15A til 15D var som følger: kolonne 1, pre-farvet molekylvektsmarkør (Bio-Rad), kolonne 2, E2B lysat; kolonne 3, E2C lysat; kolonne 4, J3-galaktosidaselysat.

Hvert blot ble inkubert med et humant eller kaninserum: figur 15A kanin anti-E2 antistoff; figur 15B, 3831781 (et HGV-PCR-positivt serum); figur 15C, 3838857 (et HGV-negativt serum). Figur 15D et coomassie farving. Serum eller kaninantistoff som ble anvendt er indikert ovenfor hver blot. Humant sera ble fortynnet 1:100 og kaninserum ble fortynnet 1:1000.

HGV antigen NS2b protein uttrykt i insektscellene var immunreaktive med J21689. Disse resultatene er i samsvar med resultatene oppnådd med pET uttrykte HGV proteiner.

C. Ekspresjon av større anti<g>ener i vaksinia.

1. Kloning og ekspresjon.

Forskjellige regioner av HGV genomet ble integrert i vaksiniavirus genomet for ekspresjon. En eksempelvis HGV polypeptid ekspresjonsstrategi er gitt i figur 16. HGV (PNF 2161 variant) proteiner uttrykt i vaksiniavirus ble skjematisk illustrert i figur 16. Polyprotein med full lengde er vist (ikke i riktig skala) ved en åpen boks som indikerer regioner med antatte proteiner: C=sterkt basisk protein, 4A=NS4A, 4B=NS4B, 5a=NS5A, 5b=NS5B. Individuelle bokser med nukleotid beliggenheter (nedenfor polyproteinet) representerer eksempelvise regioner av HGV for ekspresjon i vaksiniavirus. Nummeret i boksen står for rekombinant virus nomenklatur. Virus nr. 1 ble oppnådd fra den sterkt basiske proteinregionen til HGV stamme T55806 (SEQ ID NO: 185).

To sett med rekombinante vimser ble dannet. Det første settet inneholdt HGV sekvenser som tilsvarer individuelle proteindomener basert på sekvensanalyser av HGV cDNA (figur 16, fragmentene nr. 1 til nr. 9). Det andre settet inneholdt HGV sekvenser som dekket multiple proteindomener, opp til full lengde av HGV genomet (figur 16, nr. 10, nr. 11, nr. 14).

Forskjellige regioner av HGV genomet ble klonet inn i multikloningssetet til vaksinia ekspresjonsvektoren. Et rekombinant vaksiniavirus ekspresjonssystem ble anvendt og som innbefattet det bakterielle fag T7 systemet og E. coli lac repressor for induserbar ekspresjon i høyt nivå (Fuerst, 1986; Elroy-Stein, 1989; Alexander, 1992; Moss, et al.). Rekombinant protein blir bare uttrykt i nærvær av en induser, så som isopropyl beta-D-tiogalaktosid (TPTG). Både direkte kloning og PCR ble anvendt for plasmidkonstruksjon. I sistnevnte tilfelle ble restriksjonsendonukleaseseter egnede for kloning inn i vaksiniavektoren innkorporert i primere anvendt for å amplifisere individuelle DNA fragmenter.

En polyhistidin taq ble også innkorporert i hver klon som dekker de individuelle domenene til HGV for anvendelse ved rensing av uttrykte proteiner. HGV-PCR amplifikasj onsprodukter ble spaltet med hensiktsmessige restriksjonsenzymer og ligert inn i vaksiniavektoren. Måle HGV cDNA fragmentet blir integrert inn i vaksiniavirus genomet gjennom homolog rekombinasjon og medikament (myofenolisk syre) seleksjon (Falkner, 1988, Earl, 1991). Rekombinante virus ble plakkrenset 4 ganger før en viral stokk ble dannet.

Lengden til hver klon i nukleotidene er vist i figur 16. Gruppen med mindre kloner (nr 1 til nr 9) er nyttige for HGV epitopekartlegging. De større klonene (for eksempel nr. 10, nr. 11 og nr. 14) er også nyttige for kartlegging av HGV polyproteinspaltningssetene eksperimentelt. I tillegg til klonene vist i figur 16 kan ytterligere rekombinante vimser som dekker flere domener fra NS3 til NS5b bli konstruert.

Ekspresjonsplasmider ble transfektert inn i pattedyrceller som er blitt infisert med vaksiniavirus opphav. CV-1 og BS-C-1 celler ble opprettholdt i minimum essensielt medium (MEM) supplementert med 10% føtalt bovint semm. Cellene ble anvendt for transfeksjon (CV-1) og rekombinant vimsseleksjon og propagering (BS-C-1).

2. Vurdering av rekombinant proteinekspresion.

BS-C-1 cellene ble infisert med rekombinant vims i nærvær eller fravær av IPTG i 7 timer hvoretter cellene ble merket med <35>s-metionin i ytterligere 1 time (Zhang, 1991). 1 x 10^ BS-C-1 cellene ble infisert med rekombinant vims ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 10 plakk dannende enheter (PFU) pr celle i 1 time og deretter supplementert med medium i nærvær eller fravær av 5 mM IPTG i ytterligere 6 timer. Cellene ble puls-merket med 600 ul metionin-fritt medium supplementert med 2,5% dialysert føtalt bovint semm pluss 60 uCi 35S-metionin ("TRAN <35>S-LABEL", ICN, Costa Mesa, CA) i nærvær eller fravær av 5 mM IPTG i ytterligere 60 min. Merkede celler ble deretter lysert på is i 10 min. i nærvær av 100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl og 1% "TRITON X-100". Kjernene ble spunnet ned og supernatanten ble samlet for analysering.

Cellelysåtet ble analysert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (Fling, 1986; Schagger, 1987). Gelene ble fiksert med 50% metanol og 10% eddiksyre før de ble behandlet med en fluorograf oppløsning "AMPLIFY" (Amersham, Arlington Heights, IL). Gelene ble tørket og eksponert for røntgenfilm.

Ved anvendelse av denne metoden er ekspresjon av HGV polypeptidene til virusene inneholdende innskuddet nr. 4 til nr. 11 og nr. 14 (figur 16) blitt bekreftet. Ekspresjon av polypeptider som tilsvarer andre regioner er bekreftet på lignende måte. For eksempel, i en NS5a konstruksjon ble det ved illusjon med IPTG produsert et unikt polypeptid som migrerte like nedenfor et 46 kDa proteinstandard. Dette proteinet fremkom ikke ved infeksjon i fravær av IPTG induksjon og etablerer identiteten av proteinet som NS5a rekombinant protein.

Begrensede immunpresipiteringer ved anvendelse HGV region-spesifikt antisera (for eksempel kanin anti-sera dannet mot et isolert HGV polypeptid fra regionen av interesse) overfor <3>^S-Met merket cellely sat fra individuelle virusinfeksjoner ble utført for å vurdere proteinekspresjonen fra rekombinante vimser. For eksempel er ekspresjon av NS2, NS3, NS4B og NS5B blitt bekreftet. Ved en alternativ metode, for å vurdere rekombinant proteinekspresjon kan det utføres Western blot analyser med HGV-region-spesifikke antisera.

Når full-lengde HGV polyproteinet ble uttrykt i nr. 14 vims (figur 16) ble produserte produkter av NS2, NS3 og NS5a detektert ved anvendelse av immunpresipitering med HGV region-spesifikke antisera som demonstrerer nyttigheten av full-lengde HGV klonen for å vurdere polyprotein prosessering.

Ved anvendelse av en ekspresjonsstrategi som er lik den som er vist i figur 16 kan kandidat HGV proteiner/antigener bli uttrykt i gjær eller CHO celler. Gjær gir høy ekspresjonsgrad, økonomisk drift og enkel oppskalering for kommersiell produksjon. CHO cellelinjene muliggjør sekresjons av rekombinante proteiner inn i vekstmedium for proteinproduksjon i stor skala og rensing som for eksempel er nyttig for utvikling av vaksiner.

EKSEMPEL 17

HGV koder for sterkt basiske proteiner

A. BESTEMMELSE AV METIONIN ANVENDT FOR INITIERING VED

TRANSLASJON AV HGV FRA PNF OG T55806.

Metion beliggende ved nukleotid (nt) 459 (i forhold til SEQ JD NO: 14) i HGV-PNF 2161 varianten er i ramme med polyproteinet. "Kapsid" regionen ser ut til å være 32 aminosyrer i lengde. I andre HGV isolater, så som T55806, er denne regionen lengre (for eksempel omtrent 83 aminosyrer). Metioninet beliggende ved nt 349 (i forhold til SEQ JD NO: 14) i HGV-PNF 2161 varianten er ikke i-ramme med polyproteinsekvensen, men en metionin i samme posisjon i HGV-T55806 varianten er i ramme med polyproteinet. For å undersøke om det er gjennomlesbart eller et ribosomalt rammeskift i denne posisjonen i HGV-PNF 2161 ble følgende eksperimenter utført.

Konstruksjoner ble dannet inneholdende (i) HGV genomiske sekvenser med alle MET kodoner oppstrøms for HGV El regionen (for eksempel i HGV-PNF 2161 er det seks slike MET og fem slike i T55806), (ii) to forskjellige 3-ender for hver konstruksjon for å muliggjøre bestemmelse av om et ribosomskift ved gjennomlesningen oppstår. For et gitt genomisk DNA, dersom begge translaterte produktene har samme størrelse, tyder dette på at de blir terminert prematurt ved stoppkodonet. Dersom derimot gjennomlesningen eller rammeskiftet oppstår er det ventet to produkter som er forskjellige når det gjelder 55 aminosyrer.

Totalt 21 konstruksjoner inneholdende sekvenser fra variantene HGV-PNF 2161 ble subklonet i en pGEX vektor og tilsvarende proteiner uttrykt i E. coli. Størrelser på resulterende translasjonsprodukter ble bestemt ved både coomassie farvede geler og Western blot som ble blottet med monoklonalt anti-GST antistoff. Induserte og ikke-induserte prøver ble dannet for hver konstruksjon.

Resultatene demonstrerte at størrelsen på proteinproduktene tilsvarte det som var ventet ved translasjonsinitering ved første MET i-ramme med polyproteinet. Det var ingen spor etter rammeskift og gjennomlesning.

B. ALTERNATIVT KODEDE STERKT BASISKE PROTEINER.

Fremgangsmåten til Fickett (1982) ble anvendt for å scanne de genomiske sekvensene HGV-PNF 2161 og HGV-JC for sekvenser som potensielt koder for proteinet (i) alternativt for tidligere beskrevet polyprotein, (ii) som viser konservering mellom HGV-PNF 2161 og HGV-JC og (iii) som er antatte isoelektriske punkter over pH 10. To slike potensielle proteiner ble identifisert.

Det første proteinet blir kodet av residiene 628 til og med 882 (i forhold til SEQ JD NO: 14) i HGV-PNF 2161 og med residiene 556 til og med 810 (i forhold til SEQ JD NO: 182) i HGV-JC. Dette proteinet har en lengde på 85 aminosyrer, har høyere homologi enn 75% mellom HFV94.1 og JC9B og har en antatt pl på 11,6-12,3.

Det andre proteinet blir kodet av residiene 6844 til og med 7125 i HGV-PNF 2161 (i forhold til SEQ JD NO: 14) og med 6772 til 7053 i HGV-JC (i forhold til SEQ JD NO: 182). Dette proteinet har en lengde på 94 aminosyrer, har større enn 88% homologi mellom HGV-PNF 2161 og HGV-JC, og har en antatt pl på 12,4-12,7.

Disse eksempelvise to proteinene representerer potensielt uttrykt sterkt basiske proteiner av HGV.

EKSEMPEL 18

Kloning av ytterligere HGV isolater oe konstruksjon av diagnostiske primere

A. KONSTRUKSJON AV EN cDNA KLON AV HGV-PNF 2161.

En cDNA klon til omtrent full-lengde HGV genomet fra PNF 2161 ble konstruert ved kloning av tre overlappende PCR produkter inn i plasmidvektor pGEM3Z (Promega, Madison, WI). PCR produktene anvendt i denne konstruksjonen ble oppnådd ved revers transkripsjon med "SUPERSCRJPT JJ" (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) etterfulgt av PCR ved anvendelse av reaksjonsbetingelsene som muliggjorde amplifikasjon av lange målsekvenser ("rTth-XL" polymerase og "XL PCR BUFFERS", Applied Biosystems, Foster City, CA). rTth enzymet anvendt i disse "long-range" PCR reaksjonene har "proof-reading" aktivitet (dvs. 3'til 5' eksonuklease aktivitet) som korrigerer feilinkorporerte nukleotider og som dermed tilveiebringer PCR med høy sikkerhet.

Tre produkter anvendt for å konstruere HGV genomet innbefattet (i) et indre 6,7 kb produkt (nt 2101 til 8834 SEQ ID NO: 14) amplifisert ved anvendelse av primerene GV75-36FE (SEQ ID NO: 228) og GV75-7064RLE (SEQ ID NO: 229), (ii) et 2,8 kb 5-ende produkt (nt 38 til 2899 SEQ ID NO: 14) amplifisert ved anvendelse av 28F (SEQ ID NO: 230) og FV94-2864R (SEQ ID NO: 231) og (iii) et 2,9 kb 3'-ende produkt (nt 6449 til 9366 SEQ ID NO: 14) amplifisert ved anvendelse av FV94-6439F (SEQ ID NO: 232) og FV94-9331R (SEQ ID NO: 233).

Opprinnelig ble 6,7 kb indre fragmentet klonet inn i "TA-vektor" pCRII for å danne klon HGV7. Deretter ble et 6,1 kb Kpnl/EcoRI fragment fjernet fra HGV7 og kombinert med Kpnl/Xbal spaltet 2,8 kb 5-ende produkt (primerene 28F inneholder et kunstig Xbal sete) klonet inn i Xbal/EcoRI spaltet pGEM3Z. Denne 8,8 kb klonen, som mangler omtrent 0,6 kb av 3' delen av HGV genomet, ble betegnet HGV-KEX-2. For å konstruere nesten full-lengde HGV genomet ble 3-ende HGV produktet spaltet med Nhel og EcoRI (primeren FV94-933 IR inneholder et kunstig EcoRI sete) og er klonet inn i NhelÆcoRI spaltet HGV-KEX-2 plasmid som danner en klon HGV-PNF2161 sekvens på 9329 nt (nt 38 til 9366 av SEQ ID NO: 14) som er betegnet 3Z-HGV94-6. Hele sekvensen av 3Z-HGV94-6 kan er presentert som SEQ ID NO: 234.

Klonen 3Z-HGV94-6 kan bli anvendt for å danne in vitro-transkribert full-lengde HGV RNA eller deler derav (for eksempel ved anvendelse av SP6 polymerase). RNA molekyler kan bli anvendt for å transfektere humane cellelinjer. Denne metoden kan bli anvendt for å kartlegge de forskjellige regionene av det virale genomet, studere replikasjonen derav og oppnå forståelse av mekanismene til HGV patogenisiteten i humane celler (Rice, et al., 1989; Sumiyoshi, et al., 1992; Yoo, et al., 1995).

B. KLONING AV JC VARIANTEN.

En milliliter JC serum ble sentrifugert ved 40.000 rpm (Beckman, Spinco Rotor 70. lTi) i 2 timer. Den resulterende pelleten ble ekstrahert ved anvendelse av "TRTREAGENT"

(MRC, Cincinnati, OH), og resulterer i dannelsen av tre faser. Den øvre fasen inneholdt bare RNA. Denne fasen ble tatt opp og RNA isolert ved etanolpresipitering.

HGV cDNA molekyler ble dannet fra JC prøven ifølge to metoder. Den første metoden var amplifikasjon (RT-PCR) av JC nukleinsyreprøven ved anvendelse av spesifikke og "nested" primere. Primersekvensene var basert på HGV sekvensen oppnådd fra PNF 2161 serum. Kriteriene anvendt for å selektere primere var (i) regioner med et høyt G/C innhold og (ii) ingen repeterende sekvenser.

Den andre metoden anvendt for å danne HGV cDNA molekyler var amplifikasjon ved anvendelse av HGV (PNF 2161) spesifikke primere etterfulgt av identifikasjon av HGV spesifikke sekvenser med <32>p<->merkede oligonukleotidprober. Slike DNA hybridiseringer ble utført vesentlig som beskrevet av Sambrook, et al. (1989). PCR avledede kloner ble enten (i) klonet inn i "TA" vektoren (Invitrogen, San Diego, CA) og sekvensert med vektorprimere (TAR og TAF), eller (ii) sekvensert direkte etter PCR amplifikasjon. Både proben og primersekvensene var basert på HGV varianten oppnådd fra PNF 2161 serum.

Disse to metodene ga multiplisitets-overlappende HGV fragmenter fra JC serumet. Hver av disse fragmentene ble klonet og sekvensert. Sekvensene ble oppstilt for å oppnå HGV (JC-variant) konsensussekvensen presentert som SEQ JD NO: 182 (polypeptidsekvens, SEQ JD NO: 183). Sekvensen til hver region av HGV (JC-varianten) viruset var basert på en konsensus fra minst tre forskjellige, overlappende, uavhengige kloner.

C. ANDRE HGV VARIANTER

I tillegg til HGV PNF 2161-varianten og JC-variantsekvenser er tre partielle HGV isolater blitt oppnådd fra sera BG34, T55806 og EB20 ifølge fremgangsmåter som ligner de som er beskrevet ovenfor. Delsekvensene til disse isolatene er presentert som SEQ JD NO: 176 (BG34 nukleinsyre), SEQ JD NO: 177 (BG34 polypeptid), SEQ JD NO: 178 (T55806 nukleinsyre), SEQ JD NO: 179 (T55806 polypeptid), SEQ JD NO: 180 (EB20-2 nukleinsyre) og SEQ JD NO: 181 (EB20-2 polypeptid).

D. ALTERNATIVE PRIMERE FOR DIAGNOSTISK PCR.

PCR primere og tilsvarende analyseutvikling kan bli oppnådd fra regioner av HGV genomet vanligvis basert på analyser av konserverte regioner. Basert på sammenligninger av HGV-JC varianten og HGV-PNF 2161 varianten ble den 5' utranslaterte regionen til HGV selektert som en slik region for utvikling av en ytterligere PCR-basert diagnostisk test for deteksjon av HGV isolatene. To eksempelvise primere er FV-94-22F (SEQ ID NO: 124) og FV94-724R (SEQ ID NO: 125). Disse primerene amplifiserer et omtrent 728 bp fragment av HGV genomet.

Sekvensanalyser ble utført på amplifikasjonsprodukter fra reaksjoner som anvender disse to primerene for 36 isolater av HGV (inkludert PNF 2161 og JC, se tabell 26). En omtrent 400 bp region (nt 69 til 469 SEQ ID NO: 14) med omtrent 728 bp amplifikasj onsprodukt ble anvendt for multippel sekvensoppstilling (tabell 26) og ytterligere bestemmelse av konserverte regioner (se nedenfor).

Utvikling av en amplifikasj ons-basert (for eksempel PCR) eller probe-basert metode/analyse for deteksjon av HGV isolatene i prøvene innbefatter seleksjon av hensiktsmessige primer/probe sekvenser. To kriterier for en slik analyse er lav kopi sensitivitet og spesifisitet for HGV sekvenser. Oppstillinger av sekvenser (som nettopp er blitt beskrevet) kan hjelp med å lede primer/probe seleksjon og konstruksjon.

Flere kriterier for selektering av primere er som følger: (i) forover og revers primere av et par bør ikke være signifikant komplementær i sekvens, og (ii) primere bør ikke ha betydelig selvkomplementaritet eller potensiale for å danne sekundære strukturer. Disse forholdene minimaliserer potensialet for dannelse av primerdimerer eller oligomerer.

Primere kan eventuelt bli konstruert fra sekvensregioner som ikke viser variasjon blant forskjellige isolater, men kan også bli konstruert fra regioner med mindre homologi ved innkorporering av blandet basesyntese eller nøytrale baser, så som inosin, ved disse posisjonene for å ta hensyn til kjente isolatdivergenser. Følgende to grupper av primere er eksempler på primere som kan bli anvendt for utvikling av en PCR-basert analyse for deteksjon av HGV genomer: forover primerene SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 og SEQ ID NO: 224 og reversprimerene SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226 og SEQ ID NO: 227.

Forskjellige kombinasjoner av primere kan bli anvendt for utvikling av en HGV diagnostisk analyse. Optimale kombinasjoner av primere blir bestemt eksperimentelt og omfatter vanligvis betraktninger for analysesensitivitet og spesifisitet. Slike betraktninger innbefatter følgende: (i) et PCR produkt med lengde på 100-300 bp for effektiv amplifikasjon og enkel produkt deteksjon; (ii) en evne til å på reproduserbar måte detektere minst 10 kopier av mål HGV og (iii) en evne til å detektere reproduserbart en mengde HGV varianter.

Probesekvenser kan i tillegg likeledes bli konstruert med blandet base eller nøytral basesyntese og/eller kan bli anvendt ved redusert stringens for å detektere en mengde HGV varianter.

Claims (18)

1. Ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) i isolert form, karakterisert ved at HGV er som følger: (i) er overførbar i primater, (ii) er serologisk forskjellig fra hepatitt A virus (HAV), hepatitt B virus (HBV), hepatitt C virus (HCV), hepatitt D virus og hepatitt E virus (HEV), (iii) er et medlem av virusfamilien Flaviviridae og (iv) inneholder polynukleotider med minst 55% sekvenshomologi med et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 37 eller SEQ ID NO: 19 og deres komplementer.

2. Ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) polypeptid i isolert form, karakterisert ved at HGV har: (i) karaktertrekkene til HGV viruset ifølge krav 1, og (ii) er ytterligere karakterisert ved polypeptider hvor aminosyresekvensene har minst 40% sekvenshomologi med aminosyresekvensene valgt fra gruppen bestående av 190 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 38 og 67 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 20.

3. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter et antigen som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff, som vist ved evnen som antigenet har til å immunreagere spesifikt med et kroppsfluid eller en vevsprøve fra et HGV-positivt individ.

4. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det er et rekombinant fusjonspolypeptid sammensatt av et HGV polypeptid og et andre polypeptid, hvor nevnte andre polypeptid velges fra gruppen bestående av 13-galaktosidaseproteiner, glutation-S-transferase proteiner og partikkel-dannende proteiner.

5. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det er omfatter en sekvens med minst 15 sammenhengende aminosyrer som blir kodet av et HGV genom, cDNA eller komplementer derav, hvori nevnte aminosyresekvens velges fra gruppen bestående av (i) 190 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 38 eller fragmenter derav, (ii) 67 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 20 eller fragmentet derav, og (iii) en aminosyresekvens kodet av PNF 2161 cDNA kilde lambda gtl 1 biblioteket.

6. Diagnostisk sett for screening av kroppsfluid eller vevsprøve for antistoffer spesifikke mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatitt virus (HGV) ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter polypeptidantigenet ifølge krav 3 og midler for detektering av et immunologisk kompleks dannet ved spesifikk immunreaksjon av nevnte antigen med antistoffer i nevnte prøve.

7. Diagnostisk sett ifølge krav 6, karakterisert ved at det er for anvendelse ved screening av serum.

8. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er spesifikt immunreaktivt med ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) antigen ifølge krav 3.

9. Isolert preparat av polyklonale antistoffer, karakterisert ved at de er spesifikt immunreaktive med ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) antigen ifølge krav 3.

10. Fremgangsmåte for screening av et kroppsfluid eller en vevsprøve inneholdende antistoffer spesifikke mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) ifølge kravl, karakterisert ved å bringe nevnte prøve i kontakt med polypeptidantigenet ifølge krav 3 og detektere et immunologisk kompleks dannet ved spesifikk immunreaksjon mellom nevnte antigen med antistoffene i nevnte serum.

11. Anvendelse av isolert HGV polypeptid ifølge krav 2, omfattende et antigen inneholdende en epitope som er spesifikt immunreaktivt med minst et anti-HGV antistoff for induksjon av en immunrespons til fremstilling av en sammensetning for produksjon av antistoff mot ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) ifølge krav 1.

12. Mosaikkpolypeptid, karakterisert ved at det omfatter minst to forskjellige antigener ifølge krav 3, hvor nevnte mosaikkpolypeptid mangler aminosyrene som normalt er mellom nevnte antigener i et nativt HGV polypeptid.

13. Ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) vaksine sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et isolert HGV polypeptid ifølge krav 3, tilstede i en farmakologisk effektiv dose i en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) polynukleotid i isolert form, karakterisert ved at nevnte HGV har karaktertrekkene til HGV viruset ifølge krav 1.

15. Polynukleotid ifølge krav 14, karakterisert ved at det har minst 55% sekvenshomologi med et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 37 eller SEQ ID NO: 19 eller deres komplementer.

16. Polynukleotid ifølge krav 14, karakterisert ved at det er nyttig for PCR deteksjon av et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV).

17. Kloningsvektor, karakterisert ved at den kan uttrykke under egnede betingelser, en åpen leseramme (ORF) av cDNA avledet fra et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) genom, eller komplementer derav, hvor nevnte virus har karaktertrekkene ifølge krav 1, og ORF er operabelt koblet til en kontroll sekvens som er kompatibel med en ønsket vert.

18. Fremgangsmåte for å danne et ikke-A ikke-B ikke-C ikke-D ikke-E hepatittvirus (HGV) polypeptid, karakterisert ved å dyrke en celle transformert med en vektor ifølge krav 17, under betingelser som resulterer i ekspresjon av åpen leseramme (ORF) sekvens.