FI112249B - Hepatitis G virus ja sen molekyylikloonaus - Google Patents

Description

Hepatitis G virus ja sen molekyylikloonaus “j 2 2 4 9

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee nukleiinihappoa, polypeptidiä, 5 antigeeniä, epitooppia, rokotetta ja vasta-ainekoostumuksia, jotka liittyvät EiA/EiB/EiC/EiD/EiE (N-(ABCDE)) hepa-titikseen liittyvään virusaineeseen (HGV). Keksintö koskee myös diagnostisia menetelmiä.

Viitteet 10 Abstracts, The 1992 San Diego Conf.: Genetic Recog nition, Clin. Chem. 39(4):705 (1993).

Alexander, W. A., et ai., J. Virol. 66:2934-2942 (1992) .

Alter, H.J., et ai., New Eng. J. Med. 321:1494-1500 15 (1989a).

Alter. M.J., et ai., N. Engl. J. Med. 327:1899 (1989b).

Alter, H.J., Abstracts of Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver Dis., s. 47 (1993) .

20 Altschul, S., et ai., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990) .

Ascadi, G., et al., Nature 352:815 (1991).

Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media PA. h: .1 25 Barany, F., PCR Methods Appi. 1:5 (1991) .

·...· Barham, W. B., et al., J. Med. Virol. 42:129-132 (1994) .

·· Baron, S., et al., JAMA 266:1375 (1991).

: Bazan, J. F., et al., Virology 171:637-639 (1989).

I 1 · 30 Beames, et al., Biotechniques 13.:378 (1991).

Belyavsky, A., et al., Nuc. Acids Res. 17:2919-2932 ;v> (1989) .

Blackburn, G.F., et al., Clin. Chem. 37:1534-1539 (1991) .

j 35 Bradley, D.W., et al., J. Infec. Dis., 148:2 J (1983) .

. Bradley, D.W., et al., J Gen. Virol., 69:1 (1988).

Bradley, D.W. et al. , Proc. Nat. Acad. Sci., USA, * » '1··’ 84:6277 (1987) .

40 2 112249

Briand, J.-P., et al., J. Immunol. Meth. 156:255 (1992) .

Cahill, P., et al., Clin. Chem. 37:1482 (1991). Carter, J.M., et al., Methods Mol. Biol. 36:207-223 5 (1994).

Chambers, T.J., et al., Ann. Rev. Microbiol. 44:649 (1990a).

Chambers, T.J., et al., PNAS 87:8898 (1990b). Chomczynski et al, Anal. Biochem. 162:159 (1987).

10 Christian, R.B., et al., J. Mol. Biol. 227:771 (1992) .

Commandaeur, et al., Virology 198:282-287 (1994). Crea, R., US-patentti nro 4 888 286, myönnetty 19.12.1989.

15 DeGraaf, M.E., et al., Gene 128:13 (1993).

DiBisceglie, A.M., et al. , Hepatology 16:649 (1992) .

DiBisceglie, A.M., et al., MEJM 321:1506 (1989). DiCesare, J. , et al., Biotechniques 15:152-157 20 (1993).

Dienstag, J.L., et al, Sem Liver Disease 6:67 (1986).

Earl, P. L. , et al. , "Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia" In Current Protocols in • . 25 Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. toim.), Greene

Publishing Associates & Wiley Interscience, New York • · *··;' (1991).

Eaton, M. A. W., et al. , US-patent nro 4 719 180, myönnetty 12.1.1988.

30 Egholm, et al., Nature 365:566 (1993).

' Elroy-Stein, 0., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 86:6126-6130 (1989).

EPO patenttihakemus 88310922.5, jätetty 18.11.1988 . Falkner, F.G. , et al. , J. Virol. 62:1849-1854 35 (1988).

Farci, P., et al. , NEJM 330:88 (1994).

* · ·

Feigner ja Rhodes, Nature 349:251 (1991).

; ;·: Fickett, J.W., Nuc. Acids Res. 10:5303-5318 (1982).

• I · · 1 · 3 112249

Fling, S. P., et al., Analytical Biochem. 155:83-88 (1986) .

Folgori, A., et al., EMBOJ. 13:2236 (1994). Francki, R.I.B., et al., Arch. Virol. Supp12:223 5 (1991).

Frank, R., ja Doring, R., Tetrahedron 44:6031-6040 (1988) .

Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

85:8998-9002 (1988).

10 Fuerst, T. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

83:8122-8126 (1986).

Gellissen, G., et al., Antonie Van Leeuwenhoek, 62(1-2):79-93 (1992).

Geysen, M. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 JLl :3998-4002 (1984).

Gingeras, T.R., et al., Ann. Biol. Clin. 48:498 (1990) .

Gingeras, T.R., et al., J. Inf. Dis. 164:1066 (1991) .

20 Goeddel, D.V., Methods in Enzymology 185 (1990).

Grakoui, A., et al., J. Virol. 67:2832 (1993). Grakoui, A., et al. , J. Virol. 62:1385-1395 (1993). Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990).

. f., 25 Gubler, U. , et al, Gene, 25:263 (1983).

Guthrie, C., ja G.R. Fink, Methods in Enzymology 194 (1991).

·'·' Gutterman, J.U., PNAS 91:1198 (1994).

Harlow, E., et al. , Antibodies: a Laboratory Manual. 30 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) .

::: Haynes, J. , et al. , Nuc. Acid. Res. 11:687-706 (1983) .

Hieter, P.A. , et al. , Cell 22:197-207 (1980). Hijikata, M. , et al. , PNAS 88:5547 (1991).

• _ 35 Hochuli, E., in Genetic Engineering. Principals and Prac- ‘ ‘ tice, Vol. 12 (J. Stelow toim.) Plenum, NY, ss. 87-98 (1990).

: Holodniy, M. , et al. , Biotechniques 12.:36 (1992).

4 112249

Hopp, T.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824-3828 (1981).

Horn, T., ja Urdea, M.S., Nuc. Acids. Res. 17:6959 (1989) .

5 Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5131 (1985).

Hudson, D., J. Org. Chem. 53:617 (1988).

Irwin, M.J., et ai., J. Virol. 58:5036 (1994). Jacob, J.R., et ai., in The Molecular Biology of HCV. 10 Kappale 4, sivut 387-392 (1991).

Jacob, J.R., et ai., Hepatology 10:921-927 (1989). Jacob, J.R., et ai., J. Infect. Dis. 161:1121-1127 (1990) .

Janknecht, R. , et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 15 88.: 8972-8976 (1991).

Kaufman, R. J., "Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells," in Methods in En-zymology, vol. 185, ss. 537-566. Academic Press, Inc., San Diego CA (1991).

20 Kakumu, S., et al., Gastroenterol. 105:507 (1993).

Katz, E.D., ja Dong, M., Biotechniques 8:546 (1990).

Kawasaki, E.S., et al., in PCR Technology: Principles and Applications of DNA Amplification (H.A. Erlich, toim.) . '.m 25 Stockton Press (1989) .

King, L. A., et al., The baculovirus expression system. A laboratory guide, Chapman & Hall, London, New York, Tokyo, Melbourne, Madras, 1992.

Kyte, J. , & Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. ‘•.I/ 30 157:105-132 (1982).

•/· ·1 Koonin, E.V., ja Dolja, V.V. , Critical Reviews in

Biochem. & Mol. Biol. 28:375-430 (1993).

··,. Krausslich, H.G., et al., Viral Proteinases as Targets .'j·. for Chemotherapy (Cold Spring Harbor Press, Plainville, NY) ’· t 35 (1989) .

»»1»»

Kumar, R. , et al. , AIDS Res. Human Retroviruses l,,,: 5(3):345-354 (1989).

I i i I I I » » » « 1 5 112249

Lanford, R.E., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:174-182 (1989).

Larder, B.A., ja Kemp, S.D., Science 246:1155 (1989) .

5 Lau, Y.F., et al., Mol. Cell. Biol. 4:1469-1475 (1984) .

Lomell, H. , et al. , Clin. Chem. 48.:492 (1990). Maniatis, T., et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

10 Marshall, W.S., ja Caruthers, M.H., Science 259:1564 (1993).

Messing, J., Methods in Enzymol. 101:20 (1983). Michelle, et al., International Symposium on Viral Hepatitis.

15 Miller, J. H., Experiments in molecular Genetics. Cold

Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1972) .

Morrissey, D.V., et al., Anal. Biochem. 181:345 (1989) .

Moss, B., et al., Current Protocols in Molecular Biology 20 (Kappale IV, Osa 16) (1991).

Moss, B. , et al. , US-patentti numero 5 135 855, myönnetty 4.8.1992.

Mullis, K.B., US-patent nro 4 683 202, myönnetty 28.7.1987.

25 Mullis, K.B., et al. , US-patentti nro 4 683 195, ; · myönnetty 28.7.1987.

···' Obeid, O.E., et al., Virus Research 32:69-84 V.: (1994) .

Osikowicz, G., et al. , Clin. Chem. 36:1586 (1990).

: 30 Patterson, J.L., ja Fernandez-Larsson, R., Rev. Ini'·': feet. Dis. 12:1139 (1990).

Pearson, W.R. ja Lipman, D.J., PNAS 85:2444-2448 (1988).

/:·. Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183:63- 35 98 (1990).

’ : Pitha, Biochem Biophys Acta, 204:39 (1970a).

! Pitha, Biopolymers, 9:965 (1970b).

; Porath, J. , Protein Exp. and Pur if. 3:263 (1992).

6 112249

Pritchard, C.G., ja Stefano, J.E., Ann. Biol. Chem. 48:492 (1990).

Reichard, O., et al., Lancet 337:1058 (1991).

Reilly, P.R., et al., Baculqvirus Expression Vectors: A 5 Laboratory Manual (1992) .

Reyes, G., et al, Science, 247:1335 (1990).

Reyes, G. , et al., Molecular and Cellular Probes 5:473-481 (1991).

Rice, C.M., et al., New Biol. 1:285-296 (1989).

10 Roberts, N.A., et al., Science 248:358 (1990).

Romanos, M.A., et al., Yeast 8(6):423-488 (1992). Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463 (1977).

Sambrook, J., et al., In Molecular Cloning: A Laboratory 15 Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2 (1989) .

Saiki, R.K., et al. , Science 239:487-491 (1988). Schagger, H. , et al., Anal. Biochem. 166:368-379 (1987) .

Scharf, S. J., et al., Science 233:1076 (1986).

20 Schuler, G.D., et al., Proteins: Struc., Func. and

Genet. 9:180 (1989).

Scott, J.K., ja Smith, G.P., Science 249:386 (1990) .

Scott, J.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

. . 25 89:5398 (1992).

• ·

Smith, D.B., et al., Gene 67:31 (1988).

··’* Smith, J.P., Curr. Opin. Biotechnol. 2:668 (1991).

;.V Sreenivasan, M.A., et al., J. Gen. Virol. 65:1005 (1984).

30 Sumiyoshi, H. , et al. , J. Virol. 66:5425-5431 :T: (1992).

Summerton, J. , et al., US-patentti nro 5 142 047, myönnetty 25.8.1992.

Summerton, J., et al., US-patentti nro 5 185 444, 35 myönnetty 9.2.1993.

* Tam, A., et al., Virology 185:120 (1991).

Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409 I,\ (1988).

. it » · 7 112249

Tessier, D. C., Gene 98:177-183 (1991).

Tonkinson, J.L., ja Stein, C.A., Antiviral Chem. and Chemother. 4(4):193-200 (1993).

Ulmer, et al., Science 259:1745 (1993).

5 Urdea, M. , Clin. Chem. .39:725 (1993).

Urdea, M., et al., AIDS 2:Sll (1993).

Wages, J.M., et al., Amplifications 10:1-6 (1993). Walker, G.T., PCR Methods Appi. 3:1-6 (1993).

Wang, A.M. , et al. in PCR Protocols: A Guide to Methods 10 and Applications (M.A. Innis, et al. , toim.) Academic Press (1990).

Wang, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156 (1993).

Whetsell, A.J., et al. , J. Clin. Micro. 30:845 15 (1992).

Wolf, J.A., et al., Nature 247:1465 (1990).

Vacca, J.P., et al., PNAS 91:4096 (1994).

VanGemen, B. , et al. , J. Virol. Methods 43:177 (1993) .

20 Valenzuela, P., et al., Nature 298:344 (1982).

Valenzuela, P., et al., in Hepatitis B. toim. I. Mill- man, et al., Plenum Press, sivut 225-236 (1984).

Yarbrough, et al., J. Virol. 65:5790 (1991).

Yoo, B.J., et al., J. Virol. 69:32-38 (1995).

, , 25 Yoshio, T. , et al. , US-patentti nro 4 849 350, * · · * myönnetty 18.7.1989.

» I ·

Zhang, Y., et al., J. Virol. 65:6101-6110 (1991).

V,; Keksinnön taustaa

Virushepatiittiin, joka johtuu muusta viruksesta 30 kuin hepatitis A viruksesta (HAV) ja hepatitis B virukses-\‘l'\ ta (HBV) , on viitattu ei-A, ei-B hepatitiksena (NANBH) .

NANBH voidaan määritellä edelleen perustuen yksittäisen <, tyypin siirtymismalliin, esimerkiksi enteerinen vastaan ' ...t par enteraa linen.

t > i 35 Yksi NANBH:n muoto, joka tunnetaan enteerisesti ; "· siirtyvänä NANBH:na tai ET-NANBH: na, saadaan pääasiassa • » i heikon hygienian alueilla, jossa ruoka ja juomavesi on ; ,·, kontaminoitunut fekaalisella aineella. Kausatiivisen ai- ♦ i i , ! * H • « 8 112249 neen, johon viitataan hepatitis E viruksena (HEV), mole-kyylikloonaus on kuvattu äskettäin (Reyes et ai. , 1990;

Tam et ai.).

Toinen NANBH:n muoto, joka tunnetaan parenteraali-5 sesti siirtyvänä NANBH:na, tai PT-NANBH:na, siirtyy paren-teraalisia reittejä, tyypillisesti altistukselle verelle tai verituotteille. Tämän hepatiitin määrä vaihtelee (i) paikallisesti, (ii) josko ALT-testaus tehtiin veripankeissa, ja (iii) AIDS:n suuren riskin potilaiden eliminoinnil-10 la. Noin 10 % verensiirroista aiheutti PT-NANBH-infektion ja näistä noin puolet etenivät krooniseen sairaustilaan (Dienstag). Anti-HCV testauksen toteuttamisen jälkeen HCV serokonversio siirrettyä yksikköä kohti vähennettiin alle l-%:iin sydänleikkauspotilaiden joukossa (Alter).

15 Ihmisen plasmanäytteitä, joiden on dokumentoitu tuottaneen verensiirron jälkeisen NANBH:n ihmisvastaanot-tajissa, on käytetty onnistuneesti tuottamaan PT-NANBH-infektio simpansseissa (Bradley). Infektoituneen simpanssin plasmasta eristettyä RNA:ta on käytetty laatimaan 20 cDNA-kokoelmat ilmentymisvektorissa immunoseulontaa varten ihmiskohteista, joilla on krooninen PT-NANBH, saaduilla seerumilla. Tätä menetelmää, joka identifioi PT-NANBH-spe-sifisen cDNA-kloonin ja sitten virussekvenssin, käytettiin • ,·. koettimena identifioimaan limittyvien fragmenttien sarja, 25 joka muodostuu viereisestä PT-NANBH-virusaineen emäsparis-ta. Sekvensoitu virusaine on nimetty hepatitis C viruksek- ’ ; si (HCV) (esimerkiksi, HCV:n sekvenssi esitetään EPO-pa- * * » *·· tenttihakemuksessa 88310922.5, jätetty 18.11.1988). HCV:n ’:·* täysimittainen sekvenssi (-9500 nt) on nyt saatavissa.

V ’ 30 Kädellisten tartunnan kulkeutumistutkimukset, jotka suoritettiin Centers for Disease Controllissa (CDC; Phoe-: nix, AZ, 1973-1975; 1978-1983), alunperin tarjosivat oleellisen todisteen monien ei-A, ei-B hepatitis (NANBH) * . aineiden olemassa olosta: alkuperäiset aineet, jotka liit- ... 35 tyvät suurimpaan osaan NANBH:n tapauksia tunnistetaan nyt *·;·' olevan HCV ja HEV (katso edellä), PT-NANBH: lie ja vastaa- vasti ΕΤ-NANBH: lie. Myöhemmät epidemiologiset tutkimukset, jotka suoritettiin CDC:ssä (Atlanta, GA, 1989-) käyttäen 9 112249 sekä tutkimus- (prototyyppi) että kaupallisia kokeita an-ti-HCV vasta-ainetta varten, osoittivat, että noin 20 % kaikista yhteisöstä hankitusta NANBH:sta oli myös ei-C. HEV:n läsnäolon lisätestaus näistä näytteistä (Reyes, et 5 ai., WO A 9115603 (Genelabs Inc.) 17.10.1991) on osoittanut, että nämä yhteisöstä hankitut ei-A, ei-B, ei-C hepa-titikset olivat myös ei-E.

Maksabiopsianäytteet, seerumit ja plasma Sentinel County potilaista (lääkäreiden Miriam Alter ja Kris Krawc-10 zynski tutkimus) osoittivat myös, että monet NANBH:n bona fide tapaukset olivat myös ei-C hepatiitti (serologisesti ja käänteistranskriptaasi polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR; Kawasaki, et ai.; Wang, et ai., 1990) negatiivinen kaikille HCV-infektion leimoille), joka kehittyi myöhemmin 15 krooniseksi hepatiitiksi kroonisen pysyvän hepatiitin (CPH) tai kroonisen aktiivisen hepatiitin (CAH) tarjonnalla, joka on virusinfektiota vastaava.

Keksinnön yhteenveto

Keksintö koskee äskettäin löydettyä 20 EiA/EiB/EiC/EiD/EiE (N-(ABCDE)) hepatiittiin liittyvän virusaineen, joka tässä merkitään Hepatitis G virukseksi (HGV), karakterisointia ja eristystä. Tässä esitetään HGV-genomin osien cDNA-kopioiden suku. Lisäksi esitetään menetelmiä HGV:n lisäsekvenssien ja HGV-varianttien sekvenssi-25 en eristämiseksi ja karakterisoimiseksi.

Tämä keksintö käsittää HGV genoraipolynukleotidit, *·"; sen lisäksi cDNArt ja niiden komplementit. Mitä tulee po- lynukleotideihin, jotkut keksinnön aspektit käsittävät: puhdistetun Hepatitis G viruksen genomisen polynukleoti-V · 30 din; HGV-johdetut RNA- ja DNA-polynukleotidit; rekom- binantti HGV polynukleotidit; rekombinantti polynukleoti-·*·,. din, joka muodostaa sekvenssin, joka johdetaan HGV:stä tai HGV-varlantista cDNA tai niiden komplementaarisista sek-’ , vensseistä; rekombinanttipolynukleotidi, joka koodaa HGV:n 35 epitoopin; rekombinanttivektori, joka käsittää kaikki edellä olevat rekombinanttipolynukleotidit, ja isän-• täsolun, joka on muutettu millä tahansa näistä vektoreis- » * 10 112249 ta. Keksinnön toinen aspekti on polynukleotidikoetin HGV:tä ja/tai sen variantteja varten.

Nykyiset HGV:n genomin luonteen tutkimukset, käyttäen sekvenssi-informaatiota vertaamaan HGV:tä muihin vi-5 russekvensseihin, ehdottavat, että HGV on virusten Flavi-viridae-heimon jäsen.

Osat HGV-johdetuista cDNA-sekvensseistä ovat tehokkaita koettimina, jolloin eristetään viruksen variantteja, jotka esiintyvät luonnollisesti, tai jolloin määritetään 10 viruksen läsnäolo näytteissä. Nämä cDNA:t tekevät käyttökelpoisiksi myös HGV-koodatut polypeptidisekvenssit, mukaan lukien HGV-spesifiset polypeptidiantigeenit. Nämä koodaussekvenssit sallivat polypeptidien tuotannon, jotka ovat käyttökelpoisia reagensseina diagnostisissa kokeissa 15 ja/tai rokotteiden komponentteina, tai standardeina. Lisäksi on mahdollista eristää ja sekvensoida muita HGV-ge-nomin osia käyttäen koettimia, jotka johdetaan näistä cDNA:ista, saaden siis aikaan lisäkoettimia ja polypeptide jä, jotka ovat käyttökelpoisia ehkäisevissä, terapeutti-20 sissa ja diagnoosisovelluksissa.

Keksinnön muihin aspekteihin kuuluvat: rekombinan-tin ilmentymissysteemi, joka käsittää avoimen lukukehyksen (ORF), joka on johdettu HGV cDNA:sta tai sen komplementeista, joissa ORF liittyy käyttökelpoisesti kontrollisek- i* * ,*··, 25 venssiin, joka on yhteensopiva halutun isännän kanssa, solun, joka on muutettu rekombinantin ilmentymissysteemil-' ; lä, ja polypeptidin, joka on tuotettu muutetulla solulla.

'·; Vielä yksi keksinnön aspekti on puhdistetut HGV- partikkelit; polypeptidien valmistus puhdistetusta v : 30 HGVistä; puhdistettu HGV-polypeptidi; puhdistettu HGV-pep- tidi; ja puhdistettu polypeptidi, joka käsittää epitoopin, joka on immunologisesti identifioitava epitoopilla, joka sisältyy HGV teen tai HGV-var lanttiin.

‘ , Keksinnön sisällytettyjä aspekteja ovat HGV-poly- 35 peptidi; rekombinanttipolypeptidi, joka koostuu sekvens-'·;·* sistä, joka on johdettu HGV-genomista, HGV cDNA:sta tai : niiden komplementeista; rekombinanttipolypeptidi, joka on 11 112249 tehty HGV-epitoopista; ja fuusiopolypeptidi, joka koostuu HGV-polypeptidistä.

Sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta-aineet, jotka johdetaan HGV-epitooppeja vastaan, jotka 5 sisältyvät polypeptidisekvensseihin, ovat myös käyttökelpoisia terapeuttisina aineina, diagnostisia kokeita varten, HGV-aineen eristämiseksi, joista nämä cDNA:t johdetaan, ja antivirusaineiden seulomista varten.

Keksintöön kuuluvat lisäksi polyklonaalisten vasta-10 aineiden puhdistettu valmiste, joka on suunnattu HGV-epi-tooppia vastaan; ja monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on suunnattu HGV-epitooppeja vastaan.

Joitakin keksinnön aspekteja, jotka koskevat pakkauksia, ovat: polynukleotidien, jotka on johdettu 15 HGV:stä, joka käsittää polynukleotidikoettimen, mukaan lukien nukleotidisekvenssin HGVrstä, jossa on noin 8 tai useampi nukleotidiä, läsnäolon tutkiminen näytteistä sopivassa säiliössä; vasta-aineiden, jotka on suunnattu HGV-antigeeniä vastaan, joka koostuu polypeptidistä, joka si-20 sältää HGV-epitoopin, joka on läsnä HGV-antigeenissä, läsnäolon analysointi näytteistä sopivassa säiliössä; HGV-antigeenien, jotka koostuvat anti-HGV vasta-aineesta, analysointi näytteistä sopivassa säiliössä.

• ,·, Vielä muihin keksinnön aspekteihin kuuluu polypep- ’!!/ 25 tidi, joka koostuu HGV-epitoopista, joka on liittynyt kiinteään substraattiin.

• ; Muita keksinnön aspekteja ovat: tekniikka HGV-poly- peptidin tuottamiseksi, joka käsittää isäntäsolujen inku-boinnin, jotka muutetaan ilmentymisvektorilla, joka sisäl- V : 30 tää sekvenssin, joka koodaa HGV-polypeptidin, olosuhteis sa, jotka sallivat mainitun polypeptidin ilmentymisen; ja polypeptidi, jota on tuotettu tällä menetelmällä (sisältä-en esimerkiksi HGV-epitoopin) .

• , Keksintöön kuuluvat myös menetelmä HGV nukle- 35 iinihappojen havaitsemiseksi näytteissä, joka menetelmä *···’ näytteen nukleiinihappojen saattamisen reagoimaan koetti- » • men kanssa HGV polynukleotidia varten, olosuhteissa, jotka sallivat polynukleotididupleksin luomisen koettimen ja ,ζ 112249 näytteen HGV nukleiinihapon välille; samoin kuin polynuk-leotididupleksin, joka sisältää koettimen, havaitsemisen. Keksintö käsittää seuraavat hybridisaatiopohjaiset havait-5 semismenetelmät: reportterin leimaus; polymeraasiketju reaktio; itsejatkuva sekvenssin replikaatio; ligaasin ketjureaktio; ja säikeen korvausamplifikaatio. Lisäksi, ha-vaitsemismenetelmiin kuuluvat signaaliamplifikaatio (esim. haarautuneen ketjun DNA-koettimet ja Q-beta repli-10 kaasimenetelmä).

Keksintö käsittää myös immunoanalyysit, mukaan lukien immuunianalyysin HGV:n havaitsemiseksi, joka käsittää näytteen (jonka epäillään olevan infektoitunut HGVrllä) inkuboinnin koetinvasta-aineen kanssa, joka on suunnattu 15 HGV:n antigeeni/epitooppia vastaan, joka on havaittava olosuhteissa, jotka sallivat antigeeni-vasta-aine-komplek-sin muodostumisen; ja antigeeni-vasta-ainekompleksin havaitsemisen, joka sisältää koetinvasta-aineen. Im-muunianalyysi vasta-aineiden havaitsemiseksi, jotka on 20 suunnattu HGV antigeeniä vastaan, joka menetelmä käsittää näytteen, jonka epäillään sisältävän HGV:a, inkuboinnin koetinpolypeptidin kanssa, mukaan lukien HGV:n epitoopin, j olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-antigeeni-komplek- sin muodostumisen; ja vasta-aine-antigeeni-kompleksin, jo- : :: 25 ka sisältää koetinanatigeenin, erottamisen.

;· Lisäksi keksinnön osan muodostavat HGV-rokotteet

t f i I

; HGV-infektion hoitamiseksi ja/tai ehkäisemiseksi, jotka rokotteet käsittävät immunogeenipeptidin, joka sisältää HGV-epitoopin, tai HGV-.n inaktivoitu valmiste, tai HGV-.n 30 vähentynyt valmistus.

* »

Vielä yhdessä aspektissa keksintö käsittää kudos-

I » I

. *, viljelmässä kasvatetun solun, joka on infektoitunut HGV:llä. Yhdessä toteutusmuodossa kudosviljelmässä kasva- ·;·* neet solut ovat kädellisten maksasoluja.

35 13 1 12249 Tämä keksintö käsittää myös HGV mosaiikki- polypeptidin, jossa mosaiikkipolypeptidi sisältää ainakin kaksi HGV:n epitooppia ja jossa polypeptidistä oleellisesti puuttuvat aminohapot, jotka normaalisti ovat epitooppi-5 en välissä luontaisessa HGV:n koodaussekvenssissä. Tällaiset mosaiikkipolypeptidit ovat käyttökelpoisia edellä keskustelluissa sovelluksissa ja menetelmissä.

Tämä keksintö käsittää edelleen satunnaisen pepti-diepitoopin (mimitooppi), joka matkii luonnollista HGV an-10 tigeeniepitooppia epitooppiesittämisen aikana. Tällaiset mimitoopit ovat käyttökelpoisia edellä keskustelluissa sovelluksissa ja menetelmissä. Lisäksi tähän keksintöön kuuluvat menetelmä satunnaisen peptidi HGV-epitoopin identifioimiseksi. Menetelmässä satunnaisten peptidiepitooppi-15 en kokoelma muodostetaan tai valitaan. Kokoelma saatetaan kosketuksiin anti-HGV vasta-aineen kanssa. Identifioidaan mimitoopit, jotka ovat spesifisesti immunoreaktiivisia vasta-aineen kanssa. Tämän keksinnön menetelmillä muodostuneita seerumeja (sisältävät anti-HGV vasta-aineita) tai 20 vasta-aineita voidaan käyttää. Satunnaiset peptidikokoel-mat voidaan esittää esimerkiksi faagilla tai muodostaa kombinaatiokokoelmina.

1 Toisessa aspektissa tämä keksintö käsittää tera- peuttiset yhdisteet HGV-infektion ehkäisemiseksi ja/tai 25 hoitamiseksi.

Nämä ja muut keksinnön kohteet ja piirteet ymmärre-tään paremmin, kun seuraava yksityiskohtainen keksinnön v * kuvaus luetaan yhdessä mukana olevien piirrosten kanssa.

Kuvien lyhyt kuvaus ' : 30 Kuva 1: Sekvenssin nro 14 avoimen lukukehyksen suh- de 470-20-1 klooniin.

Kuva 2: Esittää tyypillisen proteiiniprofiilin gra- i · dienttifraktioista, jotka on eluoitu glutationiaffiniteet-tikolonnista.

35 Kuva 3: Esittää tyypillisen kuvan 2 fraktionäyttei- . * den natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidin geelielekt- roforeesianalyysin.

14 1 12249

Kuva 4A: Esittää tyypillisen proteiiniprofiilin gradienttifraktioista, jotka on eluoitu anionivaihtokolon-nista.

Kuvat 4B ja 4C: Esittää tyypillisen kuvan 4A frak-5 tionäytteiden natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidin gee1ielektroforees ianalyys in.

Kuvat 5A ja 5B: HGV:n aminohapporivit kahden muun Flaviviridae-heimon jäsenen kanssa — Hog Cholera virus ja Hepatitis C virus.

10 Kuva 6 esittää kartan osasta vektoria pGEX-Hisb- GE3-2, bakteeri-ilmentymisplasmidi, jossa on HGV-epitoop-pi.

Kuvat 7A - 7D esittävät puhdistetun HGV GE3-2 proteiinin Western blot -analyysin tulokset.

15 Kuvat 8A - 8D esittävät puhdistetun HGV Y5-10 anti geenin Western blot -analyysin tulokset.

Kuvat 9A - 9D esittävät seuraavien antigeenien Western blot -analyysin tulokset: Y5-5, GE3-2 ja Y5-10.

Kuvat 10A - 10D esittävät antigeenien GE-NS2b ja 20 GE-NS5a Western blot -analyysin tulokset.

Kuva 11 esittää HGV:n koodaussekvenssin Kyte-Doo-little hydrofobisuuskäyrän.

Kuva 12 esittää HGV pET kloonien Western blot -ana- lyysin tulokset anti-T7.Tag monoklonaalisen vasta-aineen • * l!.' 25 kanssa.

Kuvat 13A - 13D esittävät HGV pET kloonin GE-NS5b Western blot -analyysin tulokset. Kuva 13E esittää vastaa-van coomassie-värjätyn geelin.

t ’\i,: Kuvat 14A - 14C esittävät HGV pET kloonin GE-E2 t/ · 30 Western blot -analyysin tulokset. Kuva 14D esittää vastaa van coomassie-värjätyn geelin.

Kuvat 15A - 15C esittävät HGV pET kloonin GE-NS5b t

Western blot -analyysin tulokset. Kuva 15D esittää vastaa-• > van coomassie-värjätyn geelin.

M M i 35 Kuva 16 esittää HGV:n koodausalueiden skemaattisen t i i !...‘ esityksen.

» » » » · i · t II» · IM»' » · 15 1 12249

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus I. Määritelmät

Alla määritellyillä termeillä on tässä seuraavat merkitykset: 5 1. "eiA/eiB/eie/eiD/eiE hepatitis virusaine {N- (ABCDE)}", jota on tässä väliaikaisesti merkitty HGV, merkitsee virusta, virustyyppiä tai virusluokkaa, joka (i) on joidenkin kädellisten mukana siirtyvä, mukaan lukien viikset, simpanssit tai ihmiset, (ii) on seriologisesti eri-10 lainen kuin hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus ja hepatitis E (HEV) (vaika HGV voi infektoida yhdessä kohteen näiden virusten kanssa), ja (iii) on Flaviviridae vi-rusheimon jäsen.

15 2. "HGV-variantit" määritellään virusisolaatteina, joilla on ainakin noin 40-%:n, edullisesti 55-%:n tai 65-%:n, tai vielä edullisemmin 80-%:n globaali sekvenssihomo-logia, siis sekvenssi-identiteetti virusgenomin polynukle-otidisekvenssin suhteen, tässä esitettyihin HGV polynukle-20 otidisekvensseihin (esim. sekvenssi nro 14).

"Sekvenssihomologia" määritetään olennaisesti seuraavasti. Kahta samanpituista polynukleotidisekvenssiä (edullisesti koko virusgenomi) pidetään homologisina toistensa kanssa, jos, kun ne ryhmitetään käyttäen ALIGN-oh- • · '!*.* 25 jelmaa, yli 40 % , edullisesti 55 % tai 65 %, tai vielä

« I

edullisemmin 80 % nukleiinihapoista korkeimmin rekiste-'’·* röidyssä rivissä on identtisesti rivissä käyttäen l:n ktup:a, virheparametrejä ja virhe PAM-matriisia.

ALIGN-ohjelma löytyy FASTA versiossa 1.7, sarja ; 30 sekvenssin vertailuohjelmia (Pearson, et ai., 1988; Pear son, 1990; ohjelma saatavissa William R Pearsonilta, De-Γ’.. partment of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall,

Charlottesville, VA) .

> • t Määritettäessä onko kaksi virusta "erittäin homolo- 35 gista" toistensa kanssa, kaikkien virusproteiinien (tai *.<·* polyproteiinin) koko sekvenssi yhtä virusta varten on op- rusproteiinien tai polyproteiinin kanssa käyttäen edellä • timaalisesti, globaalisti ryhmitetty toisen viruksen vi-

li» I

i6 112249 olevan sarjan ALIGN-ohjelmaa käyttäen l:n ktup:a virhepa-rametrejä ja virhe PAM-matriisia. Erilaisuuden tai samanlaisuuden alueita ei suljeta pois analyysistä. Erilaisuuksia pituuksissa kahden sekvenssin välillä pidetään huonos-5 ti yhteen sopivina. Vaihtoehtoisesti, virusrakenteellisia proteiinin alueita käytetään tyypillisesti määrittämään läheisesti yhteen kuuluvuutta virusisolaattien välillä. Erittäin homologisilla viruksilla on yli 40-%:n, tai edullisesti 55-%:n tai 65-%:n, tai vielä edullisemmin 80-%:n 10 globaalinen polypeptidisekvenssin identiteetti.

3. Kahta nukleiinihappofragmenttia pidetään "selektiivisesti hybridisoituvana" HGV-polynukleotideihin, jos ne pystyvät spesifisesti hybridisoitumaan HGV:hen tai sen variantteihin (esim. koetin, joka hybridisoituu HGV-nukle-15 iinihappoihin, mutta ei polynukleotideihin, jotka ovat muista virusheimon Flaviviridae jäsenistä) tai spesifisesti alustamaan polymeraasin ketjureaktion: (i) tyypillisissä hybridisaatio- ja pesuolosuhteissa, kuten kuvataan esimerkiksi julkaisussa Maniatis, et ai., sivut 320-328 ja 20 382-389, (ii) käyttäen alennetun ankaruuden pesuolosuhtei-

ta, jotka sallivat enintään noin 25- - 30-%:n emäsparin yhteen sopimattomuuden, esimerkiksi: 2 x SSC, 0,1 % SDS, huoneenlämpötila kahdesti, 30 minuuttia kumkin; sitten 2 x SSC, 0,1 % SDS, 37 °C kerran, 30 minuuttia; sitten 2 x SSC

Γ · · 25 huoneenlämpötila kahdesti, 10 minuuttia kumpikin, tai t · (iii) valiten alukkeet käytettäväksi tyypillisissä t · · polymeraasin ketjureaktioissa (PCR) käyttäen k I ( ·.; standardiolosuhteita (esimerkiksi julkaisussa Saiki, R.K., et ai.), jotka johtavat HGV: n tai sen varianttien ’ I 4 !/* ·’ 30 sekvenssien spesifiseen amplifikaatioon.

Edullisesti, erittäin homologiset nukleiinihap-posäikeet sisältävät alle 20 - 30 % emäsparin yhteen sopi- t mattomuuksia, jopa vielä edullisemmin alle 5 - 20 % emäs- f f parin yhteen sopimattomuuksia. Nämä homologian asteet voi- , * * > i 35 daan valita käyttäen sopivan ankaruuden pesuolosuhteita f » kloonien identifioimiseksi geenikokoelmista (tai muista t t * i » » t t I f i » * « 1 | I · I » * 17 1 12249 geneettisen materiaalin lähteistä), kuten alalla hyvin tiedetään.

4. "HGV-polynukleotidi", kuten tässä on käytetty, määritellään seuraavasti. Polynukleotideille, jotka ovat suurempia kuin noin 100 nukleotidia, HGV-polynukleotidit 5 käsittävät polynukleotidisekvenssit, jotka koodataan HGV-varianteilla ja homologisilla sekvensseillä, kuten edellä kohdassa 2 on määritelty. Polynukleotideille, jotka ovat alle noin 100 nukleotidia pituudeltaan, HGV-polynukleotidi käsittää sekvenssit, jotka selektiivisesti hybridisoituvat 10 HGV:n tai sen varianttien sekvenssehin. Lisäksi, HGV-po-lynukleotideihin kuuluvat polynukleotidit, jotka koodaavat HGV-polypeptideistä (katso alla).

Termi "polynukleotidi", kuten tässä on käytetty, viittaa polymeeriseen molekyyliin, jossa on runko, joka 15 tukee emäksiä, jotka kykenevät vetysidokseen tyypillisiin nukleiinihappoihin, joissa polymeerirunko esittää emäkset tavalla, jolloin sallitaan tällainen vetysidonta sekvens-sispesifisellä tavalla polymeerimolekyylin ja tyypillisen nukleiinihapon välillä (esim. yksisäikeinen DNA). Tällai-20 siä emäksiä ovat tyypillisesti inosiini, adenosiini, gua-nosiini, sytosiini, urasiili ja tymidiini. Alalla tunnetaan lukuisia polynukleotidimodifikaatioita, esimerkiksi leimat, metylaatio ja yhden tai useamman luonnollisesti | esiintyvän nukleotidin korvaaminen analogilla.

» « · · .···. 25 Polymeerimolekyyleihin kuuluvat kaksi- ja yk sisäikeinen RNA ja DNA, ja niiden runkomodifikaatiot, esimerkiksi metyylifosfonaattisidokset. Lisäksi, tällaisiin polymeerimolekyyleihin kuuluvat vaihtoehtoiset polymeeri-rungon rakenteet, kuten, näihin kuitenkaan rajoittumatta, ’·’ ’ 30 polyvinyylirungot (Pitha, 1970a/b) , morfolinorungot (Sum- merton, et ai., 1992, 1993). Lukuisia muita varauksellisia t · • *·· ja varauksettomia polynukleotidianalogeja on raportoitu.

: : : Alalla tunnetaan lukuisia runkomodifikaatioita, mukaan lukien, näihin kuitenkaan rajoittumatta, varauksettomat ... 35 sidokset (esim. metyylifosfonaatit, fosfotriesterit, fos- ·;' foamidaatit ja karbamaatit) ja varaukselliset sidokset ;,· · (esim. fosforotioaatit ja fosforoditioaatit) . Lisäksi si- ·;··: dokset voivat sisältää seuraavia tyypillisiä modifikaati- 18 1 12249 oita: sivuryhxniä, kuten proteiineja (mukaan lukien esimerkiksi nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipepti-dit ja poly-L-lysiini); interkalaattorit (esim. akridiini ja psoralen), kelaattorit (esim. metallit, radioaktiiviset 5 metallit, boori ja hapettavat metallit), alkylaattorit ja muut modifioidut sidokset (esim. alfaanomeeriset nukleiinihapot) .

5. "HGV-polypeptidi" määritellään tässä minä tahansa polypeptidinä, joka on homologinen HGV-polypeptidille.

10 "Homologia", kuten tässä on käytetty, määritellään seuraavasti. Yhdessä toteutusmuodossa polypeptidi on homologinen HGV-polypeptidille, jos se koodataan nukleiinihapolla, joka hybridisoituu selektiivisesti HGV:n tai sen varianttien sekvensseihin.

15 Toisessa toteutusmuodossa polypeptidi on homologi nen HGV-polypeptidille, jos se koodataan HGV:llä tai sen varianteilla, kuten edellä on määritelty, tämän ryhmän polypeptidit ovat tyypillisesti suurempia kuin 15, edullisesti 25, tai vielä edullisemmin 35, viereistä aminohap- 20 poa. Lisäksi, polypeptideille, jotka ovat pidempiä kuin noin 60 aminohappoa, sekvenssivertailut "polypeptidin ho-mologian" määrittämistarkoitusta varten suoritetaan käyttäen paikallisen tarkituksen ohjelmaa LALIGN. Polypepti-’ disekvenssiä verrataan HGV:n aminohapposekvenssiä tai mitä ,*«·. 25 tahansa sen variantteja vastaan, kuten edellä on määritel- '** ty, käyttäen LALIGN-ohjelmaa l:n ktup:n, virheparametrien * ja virhe-PAM:n kanssa.

"** Mitä tahansa polypeptidiä (tyypillisesti polypepti- di, joka ei ole spesifisesti immunoreaktiivinen HGV-vasta-' 3 0 aineiden kanssa) , jolla on optimi rivi pidempi kuin 60 aminohappoa ja enemmän kuin 65 %, edullisesti 70 %, tai j vielä edullisemmin 80 % identtisesti ryhmitetyistä amino- hapoista, pidetään "homologisena polypeptidinä". LALIGN-ohjelma löytyy FASTA versiossa 1.7, sarja sekvenssin ver-... 35 tailuohjelmia (Pearson, et ai., 1988; Pearson, 1990; oh- ·” jelma saatavissa William R Pearsonilta, Department of Βίοι : \ logical Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, ·:··: VA) .

19 112249 6. Polynukleotidi "johdetaan" HGVrstä, jos sillä on sama tai oleellisesti sama emäsparisekvenssi kuin HGV-ge-nomin, HGV:n cDNA:n tai sen komplementtien alueella, tai jos se esittää homologian, kuten mainitaan kohdissa 2, 3 5 tai 4 edellä.

Polypeptidi tai polypeptin "fragmentti" "johdetaan" HGV:stä, jos se (i) koodataan HGV-polynukleotidin avoimella lukukehyksellä, tai (ii) esittää homologian HGV-poly-peptideille, kuten mainitaan kohdissa 2 ja 5 edellä, tai 10 (iii) on spesifisesti immunoreaktiivinen HGV-positiivisten seerumien kanssa.

7. "Oleellisesti eristettyä" ja "puhdistettua" käytetään useissa yhteyksissä ja ne viittaavat tyypillisesti HGV viruspartikkelin, komponentin (esim. polynukleotidi 15 tai polypeptidi) tai niiden kaltaisen yhdisteen (esim. anti-HGV vasta-aineiden) ainakin osittaiseen puhdistukseen yhteen kuulumattomista tai kontaminoivista komponenteista (esim. seerumisolut, proteiinit, ei-HGV polynukleotidit ja ei-anti-HGV vasta-aineet). Menetelmiä ja menettelyjä kiin-20 nostavien yhdisteiden tai komponenttien eristämiseksi tai puhdistamiseksi kuvataan alla (esim. fuusioproteiinien affiniteettipuhdistus ja HGV-polypeptidien rekombinantti-tuotanto.

8. Tämän keksinnön yhteydessä fraasin "nukle- . > » · 25 iinihapposekvenssit", kun viitataan sekvensseihin, jotka koodaavat proteiinin, polypeptidin tai peptidin, tarkoitetaan käsittävän degeneratiiviset nukleiinihapposekvenssit, jotka koodaavat homologiset proteiini-, polypeptidi- tai *;*·'* peptidisekvenssit, samoin kuin esitetyn sekvenssin.

'.* * 30 9. "Epitooppi" on antigeenideterminantti, joka on määritelty spesifisenä osana antigeeniä, jonka kanssa spe-• *·· sifisen vasta-aineen antigeenin sitova osa on vuorovaiku- : ‘: tuksessa.

_ 10. Antigeeni tai epitooppi on "spesifisesti im- ... 35 munoreaktiivinen" HGV-positiivisten seerumien kanssa, kun *;· epitooppi/antigeeni sitoutuu vasta-aineisiin, jotka ovat : : : läsnä HGV-infektoituneissa seerumeissa, mutta ei sitoudu ·;··· vasta-aineisiin, jotka ovat läsnä pääosassa (enemmän kuin n 112249 20 noin 90 %, edullisesti enemmän kuin 95 %) seerumeita yksilöiltä, jotka eivät ole infektoituneet HGVrllä. "Spesifisesti immunoreaktiiviset" antigeenit tai epitoopit voivat olla myös immunoreaktiivisia monoklonaalisten tai poly-5 klonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka muodostuvat spesifisiä HGV-epitooppeja tai antigeenejä vastaan.

Vasta-aine tai vasta-ainekoostumus (esim. poly-klonaaliset vasta-aineet) on "spesifisesti immunoreaktii-vinen" HGV:n kanssa, kun vasta-aine tai vasta-ainekoostu-10 mus on immunoreaktiivinen HGV-antigeenin kanssa, mutta ei HAV, HBV, HCV, HDV tai HEV antigeenin kanssa. Lisäksi, "speisifisesti immunoreaktiiviset vasta-aineet" eivät ole immunoreaktiivisia antigeenien kanssa, jotka tyypillisesti ovat läsnä normaaleissa seerumeissa, jotka saadaan koh-15 teista, jotka eivät ole infektoituneita tai altistuneita HGV:lie, HAV:lie, HBV:lie, HCV:lie, HDV:lie tai HEV:lie.

II. N-(ABODE) seerumit

Serologisen kokeen käyttökelpoisuus anti-HCV:tä varten ja RT-PCR-analyysin kehittäminen HCV-RNA:ta varten 20 (Kawasaki, et ai.; Wang, et ai., 1990) salli sekä verensiirron jälkeisen että yhteisössä hankitun ei-HCV hepati-tiksen useiden tapausten identifikaation. Ihmisen hepatiitin tapauksella, PNF 2161, identifioitiin alunperin olevan • .·. NANB hepatiitti (NANBH) yhteisössä hankitun hepatiitin « I I · 25 Sentinel Counties Studyn avulla, jota sponsoroi Centers for Disease Control and Prevention (Alter, et ai., 1989b).

‘ \ PNF 2161 oli näyte, joka saatiin vanhahkolta kaukasialai- • · * •\ seita miespotilaalta, jolle kehittyi akuutti hepatiitti * · · “···’ noin 8 viikkoa verensiirron jälkeen, seerumin huippu ALT- ' 30 tason ollessa 1141 IU (normaali <45 IU) . Akuutin hepatii tin episodin häviämisen jälkeen hänellä oli vaihtelevat, : ·.· mutta jatkuvasti kohonneet ALT-tasot seuraavan seitsemän :T: vuoden aikana, jotka vastaavat kroonista hepatiittia, vaikka tämän diagnoosin histopatologista vahvistusta ei • · ... 35 saatu.

··/' Plasmanäyte, jotka käytettiin kloonaamaan HGV (ku- : ten tässä on kuvattu), saatiin kesäkuussa 1989, noin 4 1/2 ·;··: vuotta akuutin hepatiitin episodin jälkeen, ja kylmäsäi- 21 1Ί2249 lottiin. Potilaan PNF 2161 ei uskottu aluksi olevan infektoitunut HCV:llä, perustuen jatkuvasti negatiivisiin tuloksiin ensimmäisen sukupolven immunoanalyysikoe (Ortho HCV ELISA Test System; Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) .

5 Myöhempi testaus käyttäen toisen sukupolven HCV im- munoanalyysiä (Ortho) ja PCR:a HCV 5'-ei-koodaavan alueen alukkeiden kanssa osoitti, että potilas oli infektoitunut HCV:llä.

III. HGV:hen liittyvien sekvenssien eristäminen 10 Yhtenä lähestymisenä HGV-sekvenssejä sisältävien kloonien identifioimista kohti cDNA-kokoelma valmistettiin infektoituneen HGV:n seerumeista ilmentymisvektorissa lambda gtll (esimerkki 1) . Polynukleotidisekvenssit valittiin sitten peptidien ilmentämiseksi, jotka ovat im-15 munoreaktiivisia seerumin PNF 2161 kanssa. Ensimmäisen kierroksen seulonta suoritettiin tyypillisesti käyttäen PNF 2161 seerumia (käytettiin muodostaman faagikokoelma). On myös mahdollista seuloa muilla epäillyillä N-(ABCDE) seerumeilla.

20 Rekombinanttiproteiinit, jotka identifioitiin tällä lähestymisellä, tarjoavat ehdokkaita peptideille, jotka voivat toimia substraatteina diagnostisissa kokeissa. Lisäksi, tällä lähestymisellä identifioidut nukleiinihapon ' koodaussekvenssit toimivat käyttökelpoisina hybridisaa- , 25 tiokoettimina lisä HGV-koodaussekvenssien identifioimista /*/·. varten.

Edellä kuvattuja seerumeja käytettiin muodostamaan cDNA-kokoelmia lambda gtll:ssä (esimerkki 1). Esimerkissä 1 havainnollistetussa menetelmässä infektoitunut seerumi '·’ 30 saostettiin 8-%:isessa PEGrssä ilman laimennusta, ja ko koelmat mudostettiin saaduista pelletoiduista viruksista.

,· '·· Infektoituneista ihmislähteistä saatuja seerumeja käsitel- : tiin samalla tavalla.

‘ : Edullisena vaihtoehtona PEG-saostukselle voidaan 35 käyttää ultrasentrifugointia pelletoimaan hiukkasaineet ! : infektoituneista seerumeista tai muista biologisista näyt-: : : teistä. Viruspartikkelien, josta nukleiinihapot voitaisiin ·;·: uuttaa, eristämiseksi seerumi, joka vaihtelee jopa 2 22 112249 ml:aan, laimennetaan noin 10 ml:aan PBS:llä, pyöritetään 3K:ssa 10 minuutin ajan, ja supernatanttia sentrifugoidaan minimissään 2 tunnin ajan kierrosnopeudella 40 000 rpm (noin 110 000 x g) Ti70.1 roottorilla (Beckman Instru-5 ments, Fullerton, CA) 4 °C:ssa. Supernatantti aspiroidaan sitten ja pellettiä uutetaan standardi nukleiinihapon uut-totekniikoilla.

cDNA-kokoelmat muodostettiin käyttäen satunnaisia alukkeita käänteiskopiointireaktioissa RNA:n kanssa, joka 10 on uutettu pelletoiduista seerumeista lähtöaineena. Saadut molekyylit ligatoitiin Sequence Independent Single Primer Amplification (SISPA; Reyes, et ai. , 1991) linkkerialuk- keisiin ja laajennettiin ei-selektiivisellä tavalla ja sitten kloonattiin sopivaan vektoriin, esimerkiksi lambda 15 gtll, peptidiantigeenien ilmentymistä ja seulontaa varten. Vaihtoehtoisesti, myös lambda gtll vektoria voidaan käyttää .

Lambda gtll on erityisen käyttökelpoinen ilmenty-misvektori, joka sisältää ainutlaatuisen EcoRI insertti-20 kohdan 53 emäsparia ylöspäin β-galaktosidaasigeenin translaation päätekodonia. Siten, insertoitu sekvenssi ilmennetään B-galaktosidaasin fuusioproteiinina, joka sisältää B-galaktosidaasin geenituotteen N-pääteosan, heterologisen ; peptidin, ja mahdollisesti B-galaktosidaasipeptidin C-pää- ,···. 25 tealueen (C-pääteosa ilmentyy, kun heterologinen peptidin koodaussekvenssi ei sisällä translaation päätekodonia) .

’ j Tämä vektori tuottaa myös lämpötilaherkän represso- # rin (cI857) , joka aiheuttaa viruslysogenian sallituissa » · · ';·/ lämpötiloissa, esim. 32 °C, ja johtaa viruksen hajoamiseen '·’ 30 kohotetuissa lämpötiloissa, esim. 42 °C. Tämän vektorin etuihin kuuluvat: (1) erittäin tehokas rekombinanttikloo- 4 · • *·· nin muodostuminen, (2) kyky valita lysogenosoituja isän- ; : : täsoluja isäntäsolun kasvun pohjalta sallituissa, mutta ei >t’.; ei-sallituissa, lämpötiloissa, ja (3) rekombinantti-

• I

... 35 fuusioproteiinin tuotanto. Lisäksi, koska faagi, joka si- sältää heterologisen insertin, tuottaa inaktiivisen B-ga- laktosidaasientsyymin, faagi inserttien kanssa identifioi- 23 112249 daan tyypillisesti käyttäen kolorimetristä substraatin konversioreaktiota, joka käyttää β-galaktosidaasia.

Esimerkki 1 kuvaa cDNA kokoelman valmistuksen N-(ABCDE) hepatiitin seerumeja PNF 2161 varten. Kokoelma 5 immunoseulottiin käyttäen PNF 2161 (esimerkki 3). Lukuisia lambda gtll klooneja identifioitiin, jotka olivat im-munoreaktiivisia. Immunopositiiviset kloonit olivat täplä-puhdistettuja ja niiden immunoreaktiivisuus testattiin uudelleen. Lisäksi, kloonien immunoreaktiivisuus normaa-10 leiliä ihmisen seerumeilla testattiin myös.

Näistä klooneista tutkittiin myös kloonattujen in-serttisekvenssien "eksogeeninen" luonne. Tämä perustesti todistaa, että kloonattu fragmentti ei edusta osuutta ihmisen tai muista mahdollisesti kontaminoivista nukle-15 iinihapoista (esim. E. coli, S. cerevisiea ja mitokondri-aalinen). Klooni-insertit eristettiin EcoRI digestoinnilla polymeraasiketjureaktioamplifikaation jälkeen. Insertit puhdistettiin, sitten radioleimattiin hybridisaatiokoetti-mina membraaniin sitoutunutta normaalia ihmisen DNA:ta, 20 normaalia mystax DNA:ta ja bakteeri-DNA:ta (kontrolli-DNA:t) vastaan (esimerkki 4A).

Klooni 470-20-1 (PNF2161 cDNA lähde) oli yksi klooneista, jotka eristettiin immunoseulonnalla PNF 2161 see-’ rumilla. Klooni ei ollut reaktiivinen normaalien ihmisen ,··. 25 seerumien kanssa. Kloonissa on suuri avoin lukukehys (203 emäsparia; sekvenssi nro 3), kehyksessä lambda gtll vekto-‘ rin β-galaktosidaasigeenin kanssa. Klooni on eksogeeninen genomi-DNA:n hybridisaatioanalyysillä ja genomi-PCR ana-lyysillä käyttäen ihmisen, hiivan ja E. colin genomi-DNA:-’·* 30 itä (esimerkki 4B) .

Sekvenssi oli läsnä PNF2161 seerumissa, kuten mää-• '·· ritettiin RT-PCR:llä (esimerkki 4C) . Sarjalaimennetun PNF

: i : 2161 RNA:n RT-PCR ehdotti ainakin noin 105 470-20-1 spesi- fisen sekvenssin kopiota ml:aa kohti. Sekvenssi havaittiin ... 35 myös sakkaroosin tiheysgradienttifraktioissa tiheyksissä, ’*.* jotka ovat yhdenmukaisia sekvenssin kanssa, jotka sidotaan .· - yhdessä viruksen kaltaisen partikkelin kanssa (esimerkki ·:··; 5).

i 24 1 12249 E. colin bakteerilysaattien, jotka ilmentävät toisen kloonin, klooni 470-expl, (sekvenssi nro 37) osoitettiin myös olevan spesifisesti immunoreaktiivisia PNF 2161 seerumin kanssa verrattavissa olevilla tasoilla klooniin 5 470-20-1. 470-expl:n koodaussekvenssi reunustettiin pääte- kodoneilla (perustuen sekvenssivertailuihin sekvenssiin nro 14, katso myös kuva 1) ja sillä oli sisäinen metionii-ni.

Lisäksi sekvenssit, jotka sisältyivät sekvenssiin 10 nro 14, joka on kloonin 470-20-1 viereinen, saatiin ankku-ripolymeraasin ketjureaktiolla (Anchor PCR) käyttäen alukkeita kloonista 470-20-1 (esimerkki 6). Tässä tapauksessa PNF 2161 2-cDNA lähdekokoelmaa käytettiin mallina, jossa cDNA/komplementti kaksisäikeiset DNA-tuotteet liga-15 toitiin lambda-varsiin, mutta seosta ei pakattu.

470-20-1 spesifisiä alukkeita käytettiin amplifi-kaatioreaktioissa SISPA-amplifioidun PNF 2161 cDNA:n ollessa mallina (esimerkki 4) . Amplifioitujen DNA-frag-menttien identiteetti vahvistettiin (i) koolla ja (ii) 20 hybridisaatiolla 470-20-1 spesifisen oligonukleotidi-koettimen (sekvenssi nro 16) kanssa. 470-20-1 spesifinen signaali havaittiin cDNA:ssa, joka on amplifioitu PCRrllä SISPA-amplifioidusta PNF 2161:stä, osoittaen 470-20-1 sek- .·. venssien läsnäolon lähdemateriaalissa.

I I I · ,···, 25 470-20-1 spesifisiä alukkeita käytettiin myös amp- * · lifikaatioreaktioissa seuraavien RNA-lähteiden ollessa > I » substraattina: normaali mystax maksan RNA, normaali silk-kiapinan (Sanguins laboriatis) maksan RNA ja MY131 maksan RNA (esimerkki 4). Tulokset näistä kokeista osoittavat, ‘ 30 että 470-20-1 sekvenssit ovat läsnä kantaseeruminäytteessä (PNF 2161) ja RNA maksanäytteessä eläimestä, jota on ärsy-• '·· tetty PNF 2161 näytteellä (MY131) . Molemmat normaalit kontrolli-RNA:t olivat negatiivisia 470-20-1 sekvenssien ’ ; läsnäoloa varten.

... 35 Lisäksi, PNF 2161 seerumi ja muu kloonauslähde- tai i niiden kaltaiset lähdemateriaalit testattiin suoraan · PCR:llä käyttäen alukkeita valituista kloonatuista sek- *: · *: vensseistä. Spesifiset amplifikaatiotuotteet havaittiin 25 1 12249 hybridisaatiolla spesifisiin oligonukleotidikoettimiin 470-20-1-152F (sekvenssi nro 16). Spesifinen signaali havaittiin toistettavasti PNF 2161:n moninaisissa uutteissa, 470-20-1 spesifisten alukkeiden kanssa.

5 Sairauden yhteyttä HGV:n ja maksasairauden välillä tuetaan lisäksi tiedoilla, jotka esitetään esimerkissä 4F. Seerumeista hepatiittipotilailta ja verenluovuttajilta, joilla on epänormaali maksan toiminta, analysoitiin HGV:n läsnäolo RT-PCR seulonnalla käyttäen HGV-spesifisiä aluk-10 keitä. HGV-spesifinen sekvenssi havaittiin 6/152:sta näistä seeruminäytteistä. HGV-positiivisia ei havaittu kont-rollinäytteiden joukossa (n = 11).

Edellä esitetyt tulokset osoittavat virusaineen eristämisen, joka liittyy maksan N-(ABCDE) virusinfektioon 15 (so. hepatiittiin) ja/tai muiden kudos- ja solutyyppien infektioon ja tästä seuraavaan sairauteen.

IV. HGV rekombinanttiantigeenien lisäkarakterisoin-ti Ά. Rekombinanttikokoelmien seulonta 20 HGV-antigeenien lisäehdokkaat voidaan saada tämän keksinnön kokoelmista käyttäen edellä kuvattuja seulontamenetelmiä. Edellä kuvattu cDNA-kokoelma on talletettu American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Dr. , • Rockville, MD, 20852, ja se on siirretty seuraavaan nimik-25 keeseen: PNF 2161 cDNA lähde, ATCC 75268.

Toinen PNF 2161 cDNA kokoelma on muodostettu olen- • · · « · * ' naisesti kuten kuvataan ensimmäiselle PNF 2161 cDNA ko- 4 i a * * * koelmalle, paitsi että toinen PNF 2161 cDNA lähdekokoelma 1 ·'·*' ligatoitiin lambda gtll varsiin, mutta ei pakattu. Tätä 1: 30 ei-pakattua kokoelmaa käytettiin, jolloin saatiin alla kuvatut laajennuskloonit. Tämän toisen kokoelman pakattu : ·.· versio (PNF 2161 2-cDNA lähdekokoelma) on tallennettu Ame- rican Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, ja se on siirretty seuraavaan nimik-35 keeseen: PNF 2161 2-cDNA lähde, ATCC 75837.

I ...

Edellä muodostettujen rekombinanttikokoelmien li-i : : säksi muita rekombinanttikokoelmia N-(ABCDE) hepatiit- 112249 26 tiseerumeista voidaan muodostaa samalla tavalla ja seuloa, kuten tässä on kuvattu.

B. Epitooppikartoitus, ristihybridisaatio ja geno-misekvenssien eristäminen 5 Antigeenin koodaavat DNA-fragment it voidaan identi fioida (i) immunoseulonnalla, kuten edellä kuvataan, tai (ii) koodaussekvenssien (esim. sekvenssin nro 14) tietokoneanalyysi käyttäen algoritmia (kuten "ANTIGEN", Intel-ligenetics, Mountain View, CA), jolloin identifioidaan 10 mahdolliset antigeenialueet. Antigeeniä koodaava DNA-frag- mentti voidaan subkloonata. Subkloonattu insertti voidaan sitten fragmentoida osittaisella DNase I digestoinnilla, jolloin muodostetaan satunnaisia fragmentteja, tai spesifisellä restriktioendonukleaasidigestoinnilla, jolloin 15 muodostetaan spesifiset alifragmentit. Saadut DNA-fragmen tit voidaan insertoida lambda gtll vektoriin ja altistaa immunoseulonnalle, jolloin saadaan kloonatun insetin epi-tooppikartta.

Lisäksi, DNA-fragmentteja voidaan käyttää koettimi-20 na hybridisaatiokokeissa identifioimaan limittyvät HGV- sekvenssit, ja näitä puolestaan voidaan edelleen käyttää koettimina identifioimaan sarja viereisiä klooneja. Viereisten kloonien sarjan muodostuminen sallii HGV:n genomin • ,·. sekvenssin selvityksen.

··. 25 Mitä tahansa edellä kuvattua kloonisekvenssiä * (esim. johdettu sekvenssistä nro 14 tai kloonista 470-20- ι * ·

1) voidaan käyttää tutkimaan cDNA- ja DNA-kokoelmia, jotka **·· muodostuvat vektorissa, kuten lambda gtlO tai "LAMBDA ZAP

‘*ί·* II" (Stratagene, San Diego, CA) . Tunnetun sekvenssin spe- V · 30 sifiset fragmentit voidaan eristää polymeraasin ketjureak tiolla tai vektorien, joissa on tällaisia sekvenssejä, : restriktioendonukleaasin pilkkomisen jälkeen. Saatuja DNA- fragmentteja voidaan käyttää radioleimattuina koettimina mitä tahansa valittua kokoelmaa vastaan. Erityisesti, ,,, 35 klooni-inserttien 5'- ja 3' -päätesekvenssit ovat käyttö- i * *·;·’ kelpoisia koettimina identifioimaan lisäklooneja.

i : : Lisäksi, sekvenssit, jotka tarjotaan kloonattujen ·:· inserttien 5'-päällä, ovat käyttökelpoisia sekvenssis- 112249 27 pesifisiä alukkeita ensimmäisen säikeen cDNA tai DNA syn-teesireaktioissa (Maniatis et ai.; Scharf et ai.)· Esimerkiksi, spesifisesti alustetut PNF 2161 cDNA- ja DNA-ko-koelmat voidaan valmistaa käyttäen spesifisiä alukkeita, 5 jotka johdetaan sekvenssistä nro 14 PNF 2161 nukleiinihapoilla templaattina. Uuden cDNA:n toinen säie syntetisoidaan käyttäen RNase H ja DNA polymeraasia I. Edellä olevat menetelmät identifioivat tai tuottavat DNA/cDNA-molekyyle-jä, jotka vastaavat nukleiinihappoalueita, jotka ovat 5' 10 vieressä tunnettujen klooni-insertin sekvenssien kanssa.

Näitä juuri eristettyjä sekvenssejä puolestaan voidaan käyttää identifioimaan lisää reunustussekvenssejä, ja niin edelleen identifioimaan sekvenssejä, jotka muodostavat koko genomin HGVclle. Kuten edellä kuvataan, kun uusi HGV-15 sekvenssi eristetään, polynukleotidit voidaan kloonata ja immunoseuloa, jolloin identifioidaan spesifiset sekvenssit, jotka koodaavat HGV-antigeenejä.

Laajennuskloonisekvenssit (sekvenssi nro 14) , jotka sisältävät lisää kiinnostavia sekvenssejä, on saatu kloo- 20 nia PNF 470-20-1 (sekvenssi nro 3) varten käyttäen "Anchor PCR" menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 6. Lyhyesti, strategia koostuu PNF 2161 SISPA cDNA:n ligatoimisesta lambda gtll haaroihin ja ligaatioreaktion amplifioimisesta ' gtll-spesifisellä alukkeella ja toisella kahdesta 470-20-1 *··, 25 spesifisestä alukkeesta.

, ·

Amplif ikaatiotuotteet erotetaan elektroforeettises-

, 1 I

'1 ti, siirretään suodattimiin ja suodattimiin sitoutunut DNA

tutkitaan 470-20-1 spesifisellä koettimella. Vyöhykkeet, *1 ·* jotka vastaavat hybridisaation positiivisia vyöhykesignaa- s.’“ * 30 leja, geelipuhdistettiin, kloonattiin ja sekvensoitiin.

C. Antigeenisten polypeptidien ja vasta-aineiden j valmistus Tämän keksinnön rekombinanttipeptidit voidaan puh-distaa standardi proteiinin puhdistusmenetelmillä, joihin ... 35 voivat kuulua differentiaalisaostus, molekyyliseulakroma- ·;*' tografia, ioninvaihtokromatograf ia, isoelektrinen foil : kusointi, geelielektroforeesi ja affiniteettikromatogra- f ia.

28 112 2 4 9

Yhdessä tämän keksinnön toteutusmuodossa tämän keksinnön antigeenien polynukleotidisekvenssit on kloonattu plasmidi p-GEX:ssä (esimerkki 7A) tai sen erilaisissa johdannaisissa (pGEX-GLI). Plasmidi pGEX (Smith, et ai., 5 1988) ja sen johdannaiset ilmentävät kloonatun insertin polypeptidisekvenssit, jotka ovat fuusioituneet kehyksessä olevaan proteiiniin glutationi-S-transferaasi (sj26). Yhdessä vektorikonstruktiossa, plasmidi pGEX-hisB, aminohapposekvenssi, jossa on 6 histidiiniä, liitetään fuusiopro-10 teiinin karboksipäähän.

Erilaiset rekombinantti pGEX-plasmidit voidaan muuttaa sopiviksi E. colin säikeiksi, ja fuusioproteiinin tuotanto voidaan saada aikaan lisäämällä IPTG (isopropyy-litiogalaktopyranosidi), kuten kuvataan esimerkissä 7A.

15 Solubilisoitu rekombinantin fuusioproteiini voidaan sitten puhdistaa indusoitujen viljelmien solulysaateista käyttäen glutationiagaroosin affiniteettikromatografiaa (esimerkki 7A) .

Liukenematon fuusioproteiini, joka ilmennetään 20 plasmidi pGEX-hisB:llä, voidaan puhdistaa immobilisoidun metalli-ionin affiniteettikromatografiän keinoilla (Po-rath) puskureissa, jotka sisältävät 6 M ureaa tai 6 M gua-nidiniumisotiosyanaattia, joista molemmat ovat käyttökel-poisia proteiinien solubilisaatiota varten. Vaihtoehto!- . | t ·, 25 sesti liukenemattomat proteiinit, jotka ilmentyvät pGEX- GLI:ssä tai sen johdannaisissa, voidaan puhdistaa käyttäen » » * sentrifugaation yhdistelmiä liukenevien proteiinien pois-'-·* tamiseksi, minkä jälkeen liukenemattomien proteiinien so- * * f lubilisaatiota ja standardi kromatografisia metodologioi-V : 30 ta, kuten ioninvaihto- tai kokoekskluusiokromatografiaa, ja muut tällaiset menetelmät ovat alalla tunnettuja.

' β-galaktosidaasifuusioproteiinien tapauksessa (ku- ten ne, jotka tuotetaan lambda gtll klooneilla) fuusioitunut proteiini voidaan eristää helposti affiniteettikroma- . s i S * 35 tografialla, viemällä solun hajotusmateriaali kiinteälle 1 ' alustalle, jossa on pintaan sitoutunut anti-B-galak- : ; tosidaasivasta-aine. Esimerkiksi, B-galaktosidaasi/fuu- - · sioproteiinin, joka on johdettu 470-20-1 koodaussekvens- 29 112 2 4 9 sistä, puhdistus affiniteettikromatografiällä kuvataan esimerkissä 7B.

Keksintöön kuuluu lisäksi ilmennysvektori, kuten lambda gtll tai pGEX-vektorit, jotka kuvataan edellä ja 5 jotka sisältävät HGV-koodaussekvenssejä ja ilmentymiskont- rollielementtejä, jotka sallivat koodausalueiden ilmentymisen sopivassa isännässä. Kontrollielementit käsittävät yleensä promoottorin, translaation aloituskodonin ja translaation ja transkription päätesekvenssit, ja inser-10 tiokohdan insertin liittämiseksi vektoriin.

DNA, joka koodaa haluttua antigeenistä polypepti-diä, voidaan kloonata mihin tahansa kaupallisesti saatavilla oleviin vektoreihin muodostamaan polypeptidin ilmentyminen sopivassa isäntäsysteemissä. Näihin systeemeihin 15 kuuluvat, näihin kuitenkaan rajoittumatta, seuraavat: ba-culovirus ilmentyminen (Reilly, et ai.; Beames, et ai.; Pharmingen; Clontech, Palo Alto, CA), lehmänrokon ilmentyminen (Earl, 1991; Moss, et ai.), ilmentyminen bakteereissa (Ausubel, et ai.; Clontech), ilmentyminen hiivassa 20 (Gellissen, 1992; Romanos, 1992; Goeddel; Guthrie ja Fink), ilmentyminen nisäkässoluissa (Clontech; Gibco-BRL, Ground Island, NY), esim. kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO) solulinjat (Hayes, 1983, Lau, 1984, Kaufman, 1990).

‘ Nämä rekombinanttipolypeptidiantigeenit voidaan ilmentää : I · 25 suoraan tai fuusioproteiineina. Lukuisia piirteitä voidaan manipuloida ilmennysvektoreihin, kuten johtosekvensseihin, i » · I jotka edistävät ilmennyssekvenssien erittymistä viljelyvä- « liaineeseen.

) t »

Suurten HGV-polypeptidien ilmentyminen käyttäen t * 30 useita näistä systeemeistä kuvataan esimerkissä 16.

Ilmentymisellä hiivasysteemeissä on kaupallisen < i : ’·* tuotannon etu. Rekombinanttiproteiinin tuotannolla lehmän- rokko- ja CHO-solulinjalla on se etu, että se on nisäkkään ilmentymissysteemi. Lisäksi, lehmänrokkoviruksen ilmenty- f i 35 misellä on useita etuja, mukaan lukien seuraavat: (i) sen laaja isäntäalue; (ii) tarkka transkription jälkeinen mo-I difikaatio, käsittely, poimutus, kuljetus, eritys ja re- ί*·; kombinanttiproteiinien kokoonpano; (iii) suhteellisen liu- 30 112 2 4 9 kenevien rekombinanttiproteiinien suuri ilmentymistaso; ja (iv) suuri kapasiteetti mukauttaa vierasta DNA:ta.

Rekombinantti-ilmentynyt polypeptidillä tuotetut HGV-polypeptidiantigeenit eristetään tyypillisesti hajote-5 tuista soluista tai viljelyväliaineesta. Puhdistus voidaan suorittaa alalla tunnetuilla menetelmillä, mukaan lukien suolan fraktiointi, ioninvaihtokromatografia ja af-finiteettikromatografia. Immunoaffiniteettikromatografiaa voidaan käyttää käyttäen vasta-aineita, jotka muodostuvat 10 perustuen HGV-antigeeneihin, jotka identifioidaan tämän keksinnön menetelmillä.

HGV-polypeptidiantigeenit voidaan eristää myös HGV-partikkelista (katso alla).

Jatkuvat polypeptidien antigeeniset determinantit 15 ovat yleensä suhteellisen pieniä, pituudeltaan tyypillisesti 6-10 aminohappoa. Pienempiä fragmentteja on identifioitu antigeenisinä alueina, esimerkiksi konformaatio-epitoopeissa. HGV-polypeptidiantigeenit identifioidaan kuten edellä kuvataan. Saadut kumman tahansa säikeen DNA-20 koodausalueet voidaan ilmentää rekombinanttisesti joko fuusioproteiineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lisäksi, aminohapposekvenssit voidaan syntetisoida sopivasti kemiallisesti käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa syntetisoi jaa (Applied Biosystems, Foster City, CA) tai . 25 "PINM-teknologiaa (Applied Biosystems).

, Toisessa toteutusmuodossa tämä keksintö käsittää mosaiikkiproteiineja, jotka koostuvat moninaisista epitoo-peistä. HGV-mosaiikkipolypeptidi sisältää tyypillisesti ; ainakin kaksi HGV:n epitooppia, jossa polypeptidistä ' 30 oleellisesti puuttuu aminohapot, jotka normaalisti ovat luontaisen HGV-koodaussekvenssin epitooppien välissä. Voi-: *· daan konstruoida synteettisiä geenejä (Crea; Yoshio et : ai.; Eaton et ai.), jotka koodaavat moninaisia peräkkäisiä epitooppeja ja jotka tuottavat mosaiikkiproteiineja, käyt-··, 35 täen standardi rekombinantti DNA-teknologiaa käyttäen edellä kuvattua polypeptidin ilmentymisvektori/isäntäsys-ί teemiä.

3i 112249

Lisäksi, moninaisia antigeenipeptidejä voidaan syntetisoida kemiallisesti aikaisemmin kuvatuilla menetelmillä (Tam, J.P., 1988; Briand et ai.)· Esimerkiksi, pientä immunologisesti inerttiä lysiinitähteiden ydinmatriisia a-5 ja e-aminoryhmien kanssa voidaan käyttää kiinnittämään samojen tai erilaisten synteettisten peptidien moninaisia kopioita (tyypillisesti 6-15 ryhmää pitkä), jotka edustavat kiinnostavia epitooppeja. Mosaiikkiproteiineista tai moninaisista antigeenipeptidin antigeeneistä saadaan suu-10 rempi herkkyys ja spesifisyys immunoanalyyseissä johtuen signaalivahvistuksesta, joka johtuu moninaisten epitooppi-en jakautumisesta.

Antigeenejä, jotka saadaan millä tahansa näillä menetelmillä, voidaan käyttää vasta-aineen muodostusta, 15 diagnostisia kokeita ja rokotteen kehittämistä varten.

Toisessa aspektissa keksintö käsittää spesifiset vasta-aineet, jotka suunnataan tämän keksinnön polypepti-diantigeenejä vastaan. Antigeenejä, jotka saadaan millä tahansa näistä menetelmistä, voidaan käyttää suoraan vas-20 ta-aineiden muodostamista varten tai ne voidaan kytkeä sopiviin kantajamolekyyleihin. Monet tällaisista kantajista ovat alalla tunnettuja ja kaupallisesti saatavilla (esim. Pierce, Rockford IL) . Tyypillisesti, vasta-aineiden ’ valmistamiseksi isäntäeläin, kuten kani, immunisoidaan 25 puhdistetulla antigeenillä tai fuusioidulla proteiinianti- * i · , geenillä. Hybridi, tai fuusioituja, proteiineja voidaan · muodostaa käyttäen suurta määrää koodaussekvenssejä, jotka johdetaan muista proteiineista, kuten glutationi-S-trans-;;; feraasi tai β-galaktosidaasi. Isäntäseerumi tai plasma '·’ 30 otetaan talteen sopivan aikavälin jälkeen, ja tästä seeru mista testataan spesifiset vasta-aineet antigeeniä vas-taan. Esimerkki 8 kuvaa kanin seerumivasta-aineiden tuo-V · tannon, jotka vasta-aineet ovat spesifisiä 470-20-1 anti- geeniä vastaan Sj26/470-20-l hybridiproteiinissa. Nämä ,·*·. 35 tekniikat ovat yhtä käyttökelpoisia kaikille immunogeeni- * « sille sekvensseille, jotka johdetaan HGV:stä, mukaan luki-: en, näihin kuitenkaan rajoittumatta, ne, jotka johdetaan koodaussekvenssistä, joka esitetään sekvenssinä nro 14.

32 1 12 2 4 9

Gammaglobuliinifraktio tai immunisoitujen eläinten IgG-vasta-aineet voidaan saada esimerkiksi käyttämällä kylläisen ammoniumsulfaatin saostamista tai DEAE Sephadex kromatografiaa, affiniteettikromatografiaa tai muita alan 5 ammattimiehen tuntemia tekniikoita polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi.

Vaihtoehtoisesti, puhdistettua antigeeniä tai fuusioitunutta antigeeniproteiinia voidaan käyttää tuottamaan monoklonaalisia vasta-aineita. Tässä perna tai lymfosyytit 10 immunisoidusta eläimestä poistetaan ja immortalisoidaan tai käytetään valmistamaan hybridomia alan ammattimiehen tuntemilla menetelmillä. Ihmisestä johdetun hybridoman tuottamiseksi valitaan ihmislymfosyytin luovuttaja. Luovuttaja, jonka tiedetään olevan infektoitunut HGV:llä, voi 15 toimia sopivana lymfosyytin luovuttajana. Lymfosyyttejä voidaan eristää perifeerisistä verinäytteistä. Epstein-Barr virusta (EBV) voidaan käyttää immortalisoimaan ihmisen lymfosyyttejä tai sopivaa fuusiopartneria voidaan käyttää tuottamaan ihmisestä johdettuja hybridomia. Ensi-20 sijaista in vitro herkistystä virusspesifisillä polypepti-deillä voidaan myös käyttää ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden muodostuksessa.

Immortalisoitujen solujen erittämät vasta-aineet , j : seulotaan, jolloin määritetään kloonit, jotka erittävät 25 halutun spesifisyyden vasta-aineita, esimerkiksi käyttäen . ELISAa tai Western blot -menetelmää (esimerkki 10; Ausubel et ai.) .

* * * » Käyttäen HGV-positiivista seerumia tai plasmaa, tai !,! tämän keksinnön vasta-aineita, voidaan eristää muut anti- t : : • 30 geeniset peptidit ja epitoopit. Esimerkiksi, lukuisia eri laisia tekniikoita on kehitetty monien peptidien samanai-: ” kaista synteesiä varten (Geysen, et ai.; Houghten; Frank * ja Doring; Hudson) . Geysen et ai. kehittämä menetelmä on erityisen käyttökelpoinen suhteellisen yksinkertaisuuden j*··. 35 vuoksi, jolla suuret määrät erilaisia peptidisekvenssejä • voidaan muodostaa ja testata niistä antigeenisyys. Geysen- menetelmässä (johon viitataan myös MULTI-PIN peptidisyn-teesinä) peptidit syntetisoidaan polyakryyliamidihapolla 33 1 12249 oksastetuilla polyetyleenisauvoilla, jotka on liitetty mikrotiitterilevyyn. MULTI-PIN strategia sallii suurien määrien synteesejä (96 peptidiä levyä kohti) immunologisen seulomisen käyttäen tämän keksinnön polyklonaalisia tai 5 monoklonaalisia vasta-aineita ja kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja ja instrumentaatiota. Imraunoreaktiivi-set peptidit identifioidaan ja karakterisoidaan.

On raportoitu, että jopa 6000 oligopeptidiä voidaan syntetisoida kahden viikon jaksossa tehden siten käytän-10 nölliseksi (syntetisoimalla kaikki mahdolliset tietyn antigeenin limittyneet aminohapposekvenssit) seuloa virusan-tigeenisekvensseistä epitoopit yksittäisen aminohapon erottamiseksi (Geysen, et ai.).

Vaihtoehtoinen menetelmä immunodominoivien peptidi-15 en skannaamiseksi on syntetisoida pidempiä peptidejä (esim. 10 - 30 aminohappoa), jotka vastaavat HGV-koodaus-sekvenssejä, käyttäen tavanomaista automatisoitua pepti-disynteesiä (Carter, et ai., 1994; Obeid, et ai., 1994; Commandaeur, et ai., 1994). Tällä menetelmällä on se etu, 20 että pidemmät peptidit voivat laskostua muodoiksi, jotka matkivat konformaatioepitooppeja.

Lisäksi HGV-vasta-aineita, erityisesti monoklonaalisia, voidaan käyttää identifioimaan satunnaisia polypep-tidejä, jotka matkivat niiden viruskoodattuja kohdepoly-25 peptidejä (Scott ja Smith, 1990; Smith, 1991). Esimerkik-, si, satunnaisia peptidikokoelmia, jotka esitetään faagilla ’ (RPL) (Scott ja Smith, 1990) , voidaan käyttää peptidili- gandien lähteenä vasta-aineen muodostamista varten tai rokotteen kehittämistä varten. RPL lähestyminen sallii '·' 30 peptidiligandin ilmentymisen, joka sisältää fuusioprote- iineja faagin pinnalla, ja näiden ligandin koodaavien faa- *·· gien rikastuttamisen affiniteettivalinnalla käyttäen vas- : : : ta-aineita (Smith, J.P., 1991; Christian, et ai.; Scott, et ai., 1992; Folgori, et ai.). Nämä satunnaiset pepti- ... 35 diepitoopit, jotka havaitaan spesifisillä vasta-aineilla, * * *;* matkivat luonnollisia antigeenisiä epitooppeja (mimotoop- ·.· · pe ja) epitoopin esittämisen aikana. HGV antigeeniset mat- ·:**: kijat (mimotoopit) voidaan eristää RPL:stä. Heksa- - deka- 34 1 12 2 4 9 peptidifagotyypit (mimotooppi esitettynä faagilla), joka ilmentää RPL:n voidaan tehdä julkaistuilla menetelmillä (Scott ja Smith; Smith, J.P., 1991; Christian, et ai.;

Scott, et ai.; DeGraaf, et ai.; Folgori, et ai.) ja seuloa 5 HGV-liittyneillä ihmisen seerumeilla tai tämän keksinnön vasta-aineilla.

Yksi esimerkki RPL:n käytöstä 470-20-1 mimitooppien eristämiseksi on seuraava. Satunnainen dekapeptidi-pIII fuusiofaagin esityskokoelma rakennetaan aikaisemmin kuvat-10 tujen menetelmien mukaisesti (DeGraaf, et ai., 1993). Lyhyesti, kemiallisesti syntetisoitu yksisäikeinen degeneroitunut insertti anneloidaan lyhyempiin oligonukle-otideihin, jotka muodostavat Sf il restriktioulokkeita. Anneloitu DNA ligatoidaan Sfil-jae fUSE-5 vektori DNA:han. 15 E. coli MC1061 muutetäan ligatoidulla DNA:11a. Ko koelmaa amplifioidaan noin 10 populaation kaksinkertaistamisen avulla LB-väliaineessa 20 mg/ml tetrasykliinin kanssa. Tämä kokoelma affiniteettivalitaan käyttäen yhtä tai useampaa 470-20-1 immunoreaktiivista seerumia (tai tämän 20 keksinnön vasta-aineita). Polystyreenihelmet (Precision

Plastic Ball Company, Chicago, II) päällystetään ammoniumsulfaatilla fraktioidulla positiivisella seerumilla (esim. PNF 2161) 50 mM NaHC03:ssa, pH 9,6, yön yli 4 °C:ssa. Vas-; : ta-aineella päällystetyt helmet pestään huolellisesti 25 PBS:llä ja suojataan BSA:lla.

, Näitä seerumilla päällystettyjä, suojattuja helmiä esi-inkuboidaan ylimäärällä M13K07-UV tapetun faagin kans-sa 4 tunnin ajan 4 °C:ssa. Sitten lisätään kokoelmafaagi edellä olevaan esi-inkuboituun seokseen ja inkuboidaan 12 30 tunnin ajan 4 °C:ssa. Sitoutumaton faagi poistetaan ja helmiä pestään laajasti TTB-puskurilla (50 mM Tris, pH : “ 7,5, 150 mM NaCl, 0,5-%:inen "TWEEN 20" (tilavuus/tila- V · vuus), 1 mg/ml BSA). Sitoutunut faagi eluoidaan eluu- tiopuskurilla (0,1 M HCl säädetty pH-arvoon 2,2 2 M Tris-··, 35 HCl:lla, pH 9,0). Eluoitu, rikastettu faagi seulotaan toi- sella positiivisella seerumilla (esim. Mys 136 seerumit) ; täpläimmunoseulonnalla.

35 112249

Valittujen fagotooppien lisäseulonta voidaan suorittaa käyttäen positiivisten ja negatiivisten seerumien suuria levyjä tai spesifisiä HGV monoklonaalisia vasta-aineita. Valittuja fagotooppeja voidaan käyttää suoraan 5 ELISA-analyysissä tai vasta-aineen muodostuksessa. Vaihtoehtoisesti, fagotoopin sekvenssit, jotka koodaavat nukleotidejä, voidaan määrittää ja ilmentää tavanomaisessa vektori/isäntä-systeemissä ja käyttää antigeeninä.

Matkijapolypeptidit, jotka identifioidaan kuten 10 edellä kuvataan, voivat puolestaan toimia antigeeneinä detektioanalyyseissä tai niitä voidaan käyttää antigeenis-pesifisten vasta-aineiden muodostusta varten.

D. ELISA ja proteiinielektroforeesiseulonta

Kun HGV-antigeenit identifioidaan, tyypillisesti 15 täpläimmunoseulonnan avulla kuten edellä kuvataan, anti geenit voidaan ilmentää ja puhdistaa. Antigeenit voidaan sitten seuloa nopeasti suurta määrää epäiltyjä HGV hepatitis seerumeja vastaan käyttäen vaihtoehtoisia im-munoanalyysejä, kuten ELISA tai proteiinielektrofo-20 reesianalyysejä (Western blot) käyttäen eristettyä anti-geenipeptidiä. Antigeenipolypeptidien fuusio voidaan eristää kuten edellä kuvataan, yleensä affiniteettikromatogra-fialla fuusiopartneriin, kuten β-galaktosidaasiin tai glu-i tationi-S-transferaasiin. Vaihtoehtoisesti, antigeeni it- ·,,,*· 25 sessään voidaan puhdistaa käyttäen sitä vastaan muodostet- : tuja vasta-aineita (katso alla) .

··· Yleinen ELISA-analyysin formaatti esitetään esimer- «lii , kissä 10. Harlow, et ai., kuvaavat lukuisia käyttökelpoi- *:·. siä tekniikoita immunoanalyysejä ja vasta-aine/antigeeni- 30 seulontaa varten.

.. Puhdistettu antigeenipolypeptidi tai fuusiopolypep- tidi, joka sisältää kiinnostavan antigeenin, liitetään ’·* ’ kantaja-aineeseen, esimerkiksi monikuoppaiseen polysty- ':·* reeni levyyn. Testattavat seerumit laimennetaan ja lisätään i’”: 35 kuoppiin. Ajanjakson jälkeen, joka on riittävä vasta-ai- . neiden sitoutumista varten sitoutuneisiin antigeeneihin, ··’· ; seerumit pestään kuopista. Leimattu reportterivasta-aine lisätään kuhunkin kuoppaan yhdessä sopivan substraatin 112249 36 kanssa: kuopat, jotka sisältävät vasta-aineita, jotka ovat sitoutuneet puhdistettuun antigeenipolypeptidiin tai fuu-siopolypeptidiin, joka sisältää antigeenin, havaitaan positiivisella signaalilla.

5 Tyypillinen formaatti proteiinielektroforeesi- analyysiä varten käyttäen tämän keksinnön polypeptidianti-geenejä esitetään esimerkissä 10. Ausubel, et ai., kuvaavat yleisiä proteiinielektroforeesimenetelmiä. Esimerkissä 10 470-20-l/sj26 fuusioproteiinia käytettiin seulomaan 10 lukuisia seeruminäytteitä. Esimerkissä 10 esitetyt tulokset osoittavat, että useat erilaisen lähteen N-(ABCDE) hepatitis seerumit ovat immunoreaktiivisia polypeptidian-tigeenin kanssa.

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että tämän 15 keksinnön polypeptidiantigeenit voidaan seuloa nopeasti näillä menetelmillä epäiltyjen HGV-infektoitujen seeruminäytteiden levyjä vastaan HGV:n detektiota varten.

E. Soluviljelmäsysteemit, eläinmallit ja HGV:n eristys 20 HGV:n infektiivisyystutkimuksia on suoritettu sim pansseissa, cynomolgus-apinassa ja neljässä mystax-koh-teessa (esimerkki 4H). Näistä tutkimuksista on saatu lisäinformaatiota HGV-infektiivisyydestä näissä eläinmal-: leissa. Tässä selityksessä kuvatulla HGV:llä on se etu, 25 että se pystyy infektoimaan silkkiapinat, cynomologiset ; : apinat ja simpanssit.

:* Vaihtoehtoisesti, alkuperäisiä hepatosyyttejä, jot- * * « * t ka saadaan infektoituneista eläimistä (simpanssit, paviaa- neista, apinoista tai ihmisistä) , voidaan viljellä in vit- 30 ro. On kuvattu seerumiton väliaine, jota on täydennetty .. kasvutekijöillä ja hormoneilla ja joka sallii erilaistu- • · neiden kädellisten hepatosyyttien pitkäaikaisen säilyttä- T * · misen (Lanford, et ai.; Jacob, et ai., 1989, 1990, 1991). ·:*’: Alkuperäisten hepatosyyttiviljelmien lisäksi voidaan myös i*'*: 35 muodostaa infektoituneiden solujen immortalisoidut viljel- . \ mät. Esimerkiksi, alkuperäiset maksaviljelmät voidaan fuu- * sioida erilaisiin soluihin (kuten HepG2) , jolloin saadaan stabiilit immortalisoidut solulinjat. Alkuperäiset hepa- 37 1 12 2 4 9 tosyyttisoluviljelmät voidaan immortalisoida myös liittämällä onkogeenejä tai geenejä, jotka aiheuttavat muuttuneen fenotyypin. Tällaiset onkogeenit tai geenit voidaan johtaa lukuisista alalla tunnetuista lähteistä, mukaan 5 lukien SV40, ihmisen soluonkogeenit ja Epstein Barr viruksen.

Lisäksi, infektoitumattomat hepatosyytit (esim. alkuperäiset tai jatkuvat hepatomasolulinjat) voidaan in-fektoida altistamalla solut viljelmässä HGV:lle joko osit-10 tain puhdistettuina partikkelivalmisteina (valmistettu esimerkiksi infektoituneista seerumeista differentiaa-lisentrifugoinnilla ja/tai molekyyliseulonnalla) tai tarttuvissa seerumeissa. Näitä infektoituneita soluja voidaan sitten lisätä ja virus viedä alalla tunnetuilla menetel-15 millä. Lisäksi muut solutyypit, kuten imusolulinjat, voivat olla käyttökelpoisia HGV:n etenemistä varten.

HGV:n proteiinisamanlaisuustutkimukset ovat havainneet aminohappoalueita, jotka ovat samanlaisia kuin muut virukset Flaviviridae-heimossa. Tiedetään, että tämän vi-20 rusheimon jäseniä voidaan kasvattaa erilaisissa kudosvil-jelysysteemeissä (ATCC-viruskatalogi, 1990). Analogialla on todennäköistä, että HGV:tä voidaan kasvattaa yhdessä tai useammassa seuraavista kudosviljelysysteemeistä: Hela-i solut, alkuperäiset hamsterin munuaissolut, apinan munu- 25 aissolut, vero-solut, LLC-MK2 (reesusapinan munuaissolut) , ; KB-solut (ihmisen oraalit orvaskesikarsinoomasolut) , ankan ··· alkiosolut, alkuperäiset lampaan leptomeningeaalisolut, t alkuperäiset lampaan suonikalvopunossolut, sian munuaisso- lut, naudan alkiomunuaissolut, naudan kuorikkosolut, ka-30 nanpojan alkiosolut, alkuperäiset kanin munuaissolut, BHD-21 solut tai PK-13 solut.

'HGV:n ilmentymisen lisäksi HGV:n polynukleotidisek- II* ’ venssialueet, cDNA tai in vitro kopioitu RNA voidaan :·*: liittää rekombinanttikeinoilla kudosviljelmäsoluihin. Täl- t *": 35 laiset rekombinanttimanipulaatiot sallivat HGV:n yksit- ,täisten komponenttien yksilöllisen ilmentymisen.

'** ; RNA-näytteet voidaan valmistaa infektoituneesta kudoksesta tai erityisesti infektoituneista soluviljelmis- 112249 38 tä. RNA-näytteet voidaan fraktioida geeleillä ja siirretään membraaneihin hybridisaatioanalyysiä varten käyttäen koettimia, jotka johdetaan kloonatuista HGV-sekvensseistä.

HGV-partikkelit voidaan eristää infektoituneista 5 seerumeista, infektoituneesta kudoksesta, edellä kuvatusta soluviljelyväliaineesta tai viljellyistä infektoituneista soluista alalla tunnetuilla menetelmillä. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat tekniikat, jotka perustuvat kokofrakti-ointiin (so. ultrasuodatus, saostus, sedimentaatio), käyt-10 täen anionisia ja/tai kationisia vaihtomateriaaleja, erotusta tiheyden, hydrofiilisyysominaisuuksien pohjalta ja affiniteettikromatografiaa. Eristysmenetelmän aikana HGV voidaan identifioida (i) käyttäen anti-HGV hepatiittiin liittyviä tämän keksinnön aineen vasta-aineita, (ii) käyt-15 täen hybridisaatiokoettimia, jotka perustuvat identifioituihin HGV-nukleiinihapposekvensseihin (esim. esimerkki 5) tai (iii) RT-PCR:llä.

Vasta-aineita, jotka on suunnattu HGV:tä vastaan, voidaan käyttää HGV-partikkelien puhdistuksessa immunoaf-20 finiteettikromatografiän avulla (Harlow, et ai.; Pierce).

Vasta-aineet, jotka on suunnattu HGV-polypeptideitä tai fuusiopolypeptideitä (kuten 470-20-1) vastaan, kiinnitetään kantaja-aineisiin sillä tavalla, että vasta-aineet · säilyttävät niiden immunoselektiivisyyden. Tällaisen vas- ; 25 ta-aineiden liittymisen kantaja-aineeseen aikaansaamiseksi ; bifunktionaalisia kytkentäaineita (Pierce; Pharmacia, Pis- cataway, NJ) , jotka sisältävät välikeryhmiä, käytetään I it* , usein säilyttämään vasta-aineen antigeenisitomiskohdan t luoksepäästävyyden.

30 HGV-partikkeleita voidaan edelleen karakterisoida standardimenetelmillä, mukaan lukien, näihin kuitenkaan : ’’ rajoittumatta, immunofluoresenssimikroskopia, elektroni- V * mikroskopia, proteiinien, jotka muodostavat partikkelit, ·;··· Western blot -analyysi, infektiotutkimukset eläimessä 35 ja/tai solusysteemeissä, jotka käyttävät osittain puhdistettuja partikkeleita, ja sedimentaatioominaispiirteet.

’·· '· Esimerkissä 5 esitetyt tulokset viittaavat siihen, että * tämän keksinnön viruspartikkeli on enemmän samanlainen 112249 39

Kuorellisen viruspartikkelin kanssa kuin ei-kuorellisen viruspartikkelin kanssa.

HGV-partikkelit voidaan katkaista, jolloin saadaan HGV-genomeja. Partikkelien katkaiseminen voidaan saada ai-5 kaan esimerkiksi käsittelemällä detergenteillä kelatointi-aineiden ollessa läsnä. Genominen nukleiinihappo voidaan sitten karakterisoida edelleen. Karakterisointi voi käsittää DNaasin ja RNaasin herkkyyden analyysin. Genomin säikeisyys (esimerkki 41) ja konformaatio (esim. pyöreä) voi-10 daan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla, mukaan lukien visualisoinnin elektronimikroskopialla ja sedimentaatio-ominaispiirteet .

Eristetyt genomit tekevät myös mahdolliseksi sek-vensoida koko genomi on se sitten segmentoitu tai ei, ja 15 on se sitten RNA- tai DNA-genomi (käyttäen esimerkiksi RT-PCR, kromosomin kuljetustekniikat tai PCR, joka käyttää alukkeita viereisistä kloonatuista sekvensseistä). HGV:n koko sekvenssin määrittäminen sallii genomiset organisaatiotutkimukset ja HGV-sekvenssien vertailun tunnettujen 20 virusaineiden koodaus- ja säätelysekvensseihin.

F. Aineiden seulonta, joilla aineilla on anti-HGV hepatiittiaktiivisuus

Soluviljelmän ja eläinmallisysteemien käyttö HGV:n * lisäämistä varten tarjoaa kyvyn seuloa antihepatiittiai- : 25 neita, jotka inhiboivat tarttuvan HGV:n tuotantoa: erityi- sesti lääkkeet, jotka inhiboivat HGV:n replikaatiota. So-luviljelmä ja eläinmallit sallivat tällaisten antihepa- · tiittilääkkeiden vaikutuksen arvioinnin normaaleihin solu-toimintoihin ja elinkykyisyyteen. Mahdollisista antivirus- ' 30 aineista (mukaan lukien luonnolliset tuotteet tai synteet tiset yhdisteet; esimerkiksi pienet molekyylit, komplek- '* siseokset, kuten sieniuutteet, ja antisense oligonukleoti- * » · V : dit) seulotaan tyypillisesti antivirusaktiivisuus pitoi- ;··· suusalueella. Vaikutus HGV-replikaatioon ja/tai antigeenin 35 tuotantoon arvioidaan sitten tyypillisesti monitoroivalla virusmakromolekulaarisella synteesillä tai makromolekyyli-> en akkumulaatiolla (esim. DNA, RNA tai proteiini). Tämä arviointi tehdään usein suhteessa antivirusaineen vaiku- 112249 40 tukseen normaaliin solutoimintaan (DNA-replikaatio, RNA-transkriptio, yleinen proteiinitranslaatio, jne.)· HGV:n detektio voidaan saada aikaan monilla menetelmillä, mukaan lukien ne, jotka kuvataan tässä selityk-5 sessä. Esimerkiksi vasta-aineet voidaan muodostaa tämän keksinnön antigeenejä vastaan ja näitä vasta-aineita käyttää vasta-ainepohjäisissä analyyseissä (Harlow, et ai.), jolloin identifioidaan ja kvantitoidaan HGV-antigeenit soluviljelmässä. HGV-antigeenit voidaan kvantitoida vil-10 jelmässä käyttäen vertailukokeita: polypeptidejä, jotka on koodattu kloonatuilla HGV-sekvensseillä, voidaan käyttää tällaisissa kokeissa. Tyypillisesti, rekombinanttisesti tuotettu HGV antigeeninen polypeptidi tuotetaan ja sitä käytetään muodostamaan monoklonaalinen tai polyklonaalinen 15 vasta-aine. Rekombinantti HGV-polypeptidi leimataan käyttäen reportterimolekyyliä. Tämän leimatun polypeptidin sitomisen sen sukulaisvasta-aineeseen inhibitiota arvioidaan sitten näytteiden ollessa läsnä (esim. soluviljelyvä-liaineet tai seerumit), jotka sisältävät HGV-antigeenejä.

20 HGV-antigeenien taso näytteessä määritetään vertaamalla inhibition tasoja standardikäyrään, joka muodostetaan käyttäen leimaamattomia rekombinanttiproteiineja tunnetuissa pitoisuuksissa.

: Tämän keksinnön HGV-sekvenssit ovat erityisen käyt- 25 tökelpoisia polynukleotidikoettimien/alukkeiden muodosta- mistä varten, joita voidaan käyttää kvantitoimaan HGV-nuk-**· leiinihapposekvenssien määrä, joka tuotetaan soluvilje- i » I * . lysysteemissä. Tällainen kvantitatiivinen määritys voidaan ,saada aikaan lukuisilla tavoilla. Esimerkiksi koettimia, 30 jotka on leimattu reportterimolekyyleiliä, voidaan käyttää leimattujen koettimien standardi täpläelektroforeesihybri- i · disaatio- tai vertailukokeissa infektoituneen solun nukle- j » » iinihappojen kanssa. Lisäksi, on olemassa lukuisia mene-telmiä, jotka käyttävät polymeraasiketjureaktiota kvanti-35 toimaan kohdenukleiinihapon tasoja näytteessä (Osikowicz, , \ et ai.) .

I I * ; Suojaavat vasta-aineet voidaan identifioida myös I » » » käyttäen edellä kuvattuja soluviljelmää ja eläinmallisys- 4i 112249 teemejä. Esimerkiksi, polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita muodostetaan tämän keksinnön antigeenejä vastaan. Näitä vasta-aineita käytetään sitten esikäsitte-lemään tarttuvaa HGV:n sisältävää siirrostetta (esim. see-5 rumi) ennen soluviljelmien tai eläinten infektiota. Arvioidaan yksittäisen vasta-aineen tai vasta-aineiden seosten kykyä suojata soluviljelmää tai eläintä infektiolta. Esimerkiksi, soluviljelmässä ja eläimissä virusantigeenin ja/tai nukleiinihapon tuotanto toimii seulana. Lisäksi 10 eläimissä HGV hepatiittisairauden oireiden poissaolo, esim. kohonneet ALT-arvot, on myös oire suojäävien vasta-aineiden läsnäolosta.

Vaihtoehtoisesti, toipilaan seerumeista voidaan seuloa suojaavien vasta-aineiden läsnäolo ja sitten näitä 15 seerumeita käytetään identifioimaan HGV-hepatiittin liittyvän aineen antigeenit, jotka sitovat vasta-aineilla. Identifioitu HGV-antigeeni tuotetaan sitten rekombinantti-sesti tai synteettisesti. Antigeenin kyky muodistaa suo-jaavia vasta-aineita testataan kuten edellä.

20 Alkuseulonnan jälkeen antigeeniä tai antigeenejä, jotka on identifioitu kykeneviksi muodostamaan suojaavia vasta-aineita, joko yksittäin tai yhdistelmässä, voidaan käyttää rokotteena siirrostamaan koe-eläimet. Sitten eläi-• miä ärsytetään tarttuvalla HGV:llä. Suojaus infektiolta 25 osoittaa eläinten kykyä muodostaa vasta-aineita, jotka ί : suojaavat niitä infektiolta. Lisäksi, eläinmallien käyttö ;· sallii antigeenien identifikaation, jotka aktivoivat solun » * * · [ immuniteetin.

Eläinmallitutkimukset, suojaava immuunivaste vas-30 teenä ärsytykselle virusvalmisteella (esim. infektoitu seerumi) (i) suojaa eläintä infektiolta tai (ii) ehkäisee , « · *,,, sairauden oireita.

» t * G. Rokotteita ja suojaavan immuniteetin muodostami- nen 3 5 Rokotteet voidaan valmistaa yhdestä tai useammasta » » o- , \ immunogeenisestä polypeptidistä, joka on identifioitu tä- ' ; män keksinnön menetelmällä. Genomiset rakenteen samanlai suudet HGV:stä ja muista tunnetuista virusproteiineista 42 112 2 4 9 eristettyjen sekvenssien välillä voivat tarjota informaatiota, joka koskee polypeptidejä, jotka ovat todennäköisesti ehdokkaita tehokkaita rokotteita varten. Lisäksi, lukuisia tietokoneohjelmia voidaan käyttää identifioimaan 5 eristettyjen sekvenssien todennäköiset alueet, jotka koo-daavat proteiinin antigeeniset determinanttialueet (esimerkiksi, Hopp, et ai.; "ANTIGEN", Intelligenetics, Mountain View CA).

Rokotteet, jotka sisältävät immunogeenisiä polypep-10 tidejä aktiivisina aineosina, valmistetaan tyypillisesti injektoitavina aineina, joko liuoksina tai suspensioina. Lisäksi, immunogeeniset polypeptidit voidaan valmistaa kiinteässä tai lyofilisoidussa tilassa, joka on sopiva uudelleensuspensiota varten ennen injektiota, vesipitoi-15 sessa muodossa. Immunogeeniset polypeptidit voidaan myös emulgoida tai kapseloida liposomeihin. Polypeptidejä sekoitetaan usein farmaseuttisesti hyväksyttävien täyteaineiden kanssa, jotka ovat yhteensopivia polypeptidien kanssa. Tällaisiin täyteaineisiin kuuluvat, näihin kuiten-20 kaan rajoittumatta, seuraavat ja seuraavien yhdistelmät: suolaliuos, vesi, sokerit (kuten dekstroosi ja sorbitoli), glyseroli, alkoholit (kuten etanoli [EtOH]) ja muut alalla , , tunnetut. Lisäksi, rokotevalmisteet voivat sisältää vähäi- siä määriä muita apuaineita, kuten kostutusaineita, emul-'<*· 25 gointiaineita (esim. detergentit) ja pH puskurointiainei- ta. Lisäksi on käytettävissä lukuisia adjuvantteja, jotka t voivat lisätä rokotevalmisteiden tehokkuutta. Esimerkkei-! j : hin tällaisista adjuvanteista kuuluvat, näihin kuitenkaan : Γ; rajoittumatta, seuraavat: ryhmä samankaltaisia yhdisteitä, 30 mukaan lukien N-asetyylimuranyyli-L-treonyyli-D-isogluta-_ miini ja N-asetyyli-nor-muranyyli-L-alanyyli-D-isogluta- >;», miini ja alumiinihydroksidi.

' « » · Tämän keksinnön rokotteissa käytetyt immunogeeniset » polypeptidit voivat olla rekombinantti, synteettisiä tai • i » <t/ 35 eristettyjä esimerkiksi heikennetyistä HGV-partikkeleista.

; *>, Polypeptidit formuloidaan yleensä rokotteiksi neutraaleis- ’ f » j sa tai suolamuodoissa. Farmaseuttisesti hyväksyttävät or- • · 43 1 12249 gaaniset ja epäorgaaniset suolat ovat alalla hyvin tunnettuja.

HGV hepatiittiin liittyvän aineen rokotteet annetaan parenteraalisesti, tyypillisesti ihonalaisella tai 5 lihaksen sisäisellä injektiolla. Muihin mahdollisiin for-mulaatioihin kuuluvat oraaliset ja peräpuikkoformulaatiot. Oraaliset formulaatiot käyttävät yleensä täyteaineita (esim. farmaseuttisen laadun sokerit, sakkariini, selluloosa ja niiden kaltaiset) ja sisältävät yleensä 10 - 98 % 10 immunogeenistä polypeptidiä. Oraaliset koostumukset ovat pillerien, kapselien, tablettien, liuosten, suspensioiden, jauheiden, jne. muodossa, ja ne voidaan formuloida sallimaan jatkuva tai pitkäaikainen vapautuminen. Peräpuikkoformulaatiot käyttävät perinteisiä sideaineita ja kanta-15 jia, ja sisältävät tyypillisesti 0,1 - 10 % immunogeenistä polypeptidiä.

Ottaen huomioon edellä olevan informaation, voidaan muodostaa moniarvoisia rokotteita HGV hepatiittiin liittyviä aineita vastaan, jotka koostuvat yhdestä tai useammas-20 ta rakenteellisesta tai ei-rakenteellisesta virusaine po-lypeptidistä. Nämä rokotteet voivat sisältää esimerkiksi rekombinantti HGV polypeptidejä, polypeptidejä, jotka on eristetty HGV-virioneista, synteettisiä polypeptidejä tai koottuja epitooppeja mosaiikkipolypeptidien muodossa. Li- I · 25 säksi, voi olla mahdollista valmistaa rokotteita, jotka '·; antavat suojan HGV hepatiitti-infektiota vastaan käyttä- t I · mällä inaktivoitua HGV:tä. Tällainen inaktivaatio voitai- « ·*·: siin saada aikaan valmistamalla viruslysaatteja, minkä jälkeen käsittelemällä lysaatteja sopivilla orgaanisilla * φ · V · 30 liuottimilla, detergenteillä tai formaliinilla.

Rokotteet voidaan valmistaa myös heikennetyistä HGV-kannoista. Tällainen heikennetty HGV voidaan saada myös käyttäen edellä kuvattua soluviljelmää ja/tai eläin-• , mallisysteemejä. Tyypillisesti, heikennetyt kannat eriste- 35 tään monien siirtojen jälkeen in vitro tai in vivo. Hei-kennettyjen kantojen detektio saadaan aikaan alalla tunne- : tuilla menetelmillä. Yksi menetelmä heikennetyn HGV:n ha- vaitsemiseksi on vasta-ainekoettimien käyttö HGV-anti- 44 1 12249 geenejä vastaan, sekvenssispesifisten hybridisaa-tiokoettimien käyttö, tai amplifikaatio sekvenssispesifi-sillä alukkeilla infektoituneita eläimiä varten tai HGV-infektoituneiden in vitro viljelmien analyysi.

5 Vaihtoehtoisesti, tai edellä olevien menetelmien lisäksi, heikennetyt HGV-kannat voidaan rakentaa perustuen genomi-informaatioon, joka voidaan saada tässä selityksessä esitetystä informaatiosta. Tyypillisesti, tartunta-aineen genomin alue, joka koodaa esimerkiksi polypeptidin, 10 joka liittyy viruspatogeneesiin, voidaan tuhota. Tuhoami nen ei saisi häiritä virusreplikaatiota. Lisäksi, rekom-binanttiheikennetty HGV-rakenne sallii epitoopin tai epi-tooppien esiintymisen, jotka pystyvät saamaan aikaan suo-jaavat immuunivasteet HGV:tä vastaan. Haluttu immuunivaste 15 voi käsittää sekä olkapään- että soluimmuniteetin. Heikennetyn HGV:n genomia käytetään sitten muuttamaan solut ja solut, joita kasvatettiin olosuhteissa, jotka sallivat virusreplikaation. Tällaiset heikennetyt kannat ovat käyttökelpoisia ei vain rokotteina, vaan myös virusantigeenien 20 ja/tai HGV-partikkelien tuotantolähteinä.

Voidaan myös muodostaa hybridipartikkeli-im-munogeenejä, jotka sisältävät HGV-epitooppeja. HGV-epi-tooppien immunogeenisyyttä voidaan lisätä ilmentämällä epitooppi eukarioottisissä systeemeissä (esim. nisäkäs-25 tai hiivasysteemit), joissa epitooppi fuusioidaan tai kootaan tunnettujen partikkelin muodostavien proteiinien • ; kanssa. Yksi tällainen proteiini on hepatitis B pinta-an- *·· tigeeni. Rekombinanttirakenteet, joissa HGV-epitooppi on liittynyt suoraan koodaussekvenssiin partikkelin muodosta-1 ,· : 30 vaa proteiinia varten, tuottaa hybridiproteiineja, jotka ovat immunogeenisiä mitä tulee HGV-epitooppiin ja partik-kelin muodostavaan proteiiniin. Vaihtoehtoisesti, valitut osat partikkelin muodostavan proteiinin koodaussekvenssis-tä, jotka osat eivät liity partikkelin muodostamiseen, 35 voidaan korvata koodaussekvensseillä, jotka vastaavat HGV- ;·’ epitooppeja. Esimerkiksi, spesifisen immunoreaktiivisuuden :; alueet partikkelin muodostavalle proteiinille voidaan kor- ·· vata HGV-epitooppisekvensseillä.

45 112249

Hepatitis B pinta-antigeenin on osoitettu ilmentyvän ja kokoontuvan partikkeleihin hiivassa Saccharomyces cerevisiea ja nisäkässoluissa (Valenzuela, et ai., 1982 ja 1984; Michelle, et ai.). Näillä partikkeleilla on osoitet-5 tu olevan lisääntynyt immunoreaktiivisuus. Näiden partikkelien muodostaminen käyttäen hybridiproteiineja, so. re-kombinanttirakenteita heterologisten virussekvenssien kanssa, on esitetty aikaisemmin (EPO 175,261, julkaistu 26.3.1986). Tällaisia hybridipartikkeleita, jotka sisältä-10 vät HGV-epitooppeja, voivat myös olla käyttökelpoisia ro-kotesovelluksissa.

Tämän keksinnön rokotteet annetaan annoksissa, jotka ovat yhteensopivia formulaatiomenetelmän kanssa, ja sellaisissa määrissä, jotka ovat farmakologisesti tehok-15 kaita ehkäiseviä tai terapeuttisia hoitoja varten. Annetun immunogeenin määrä riippuu hoidettavasta kohteesta, hoidettavan kohteen immuunisysteemin kapasiteetistä suojaavan immuunivasteen muodostamista varten, ja halutusta suojauksen tasosta.

20 Tämän keksinnön HGV-rokotteet voidaan antaa yksit täisissä tai moniannoksissa. Annosohjeet määritetään myös suhteessa kohteen tarvitsemaan hoitoon ja sietokykyyn. HGV immunogeenisten polypeptidien lisäksi rokoteformulaatiot » ,, · voidaan antaa yhdessä muiden immunosäätelevien aineiden : 25 kanssa.

I · * ; Lisälähestymisessä HGV-rokotukselle DNA-rakenteet, ··· jotka koodaavat HGV-proteiinit sopivassa säätelevässä , kontrollissa, liitetään suoraan nisäkäskudokseen, in vivo.

Tällaisten rakenteiden liittäminen tuottaa "geneettisen 30 rokotuksen". Samanlaisten DNA-rakenteiden on osoitettu tarttuvan soluihin ja koodattujen proteiinien ilmentyvän : " (Wolf, et ai.; Ascadi, et ai.). Injektoitu DNA ei näytä ' ‘ yhdistyvän isäntäsolun kromatiiniin tai kopioon. Tämä- esiintyminen saa aikaan oleelliset humoraaliset ja soluim-35 muunivasteet, mukaan lukien suojauksen in vivo virusärsykkeeltä eläinsysteemeissä (Wang, et ai., 1993; Ulmer, et ai.). Yhdessä toteutusmuodossa DNA-rakenne injektoidaan ' ’ luurankolihakseen, minkä jälkeen esikäsitellään paikallis- 112249 46 puudutuksella, kuten bupivikaiinin vetykloridi metyylipa-rabenin kanssa isotonisessa suolaliuoksessa, jolloin helpotetaan solun DNA:hän pidättymistä. Injektoidut DNA-ra-kenteet otetaan lihassoluihin ja koodatut proteiinit il-5 mennetään.

Verrattuna rokotukseen liukenevilla virusalayksikön proteiineilla, geneettisellä immunisoinnilla on viruspro-teiinien autenttisen in vivo ilmentymisen etu. Nämä virus-proteiinit ilmennetään yhdessä isäntäsolun histoyhteenso-10 pivuusantigeenien kanssa, ja muiden proteiinien, kuten esiintyisi luonnollisessa virusinfektiossa. Tämä im-munisaatiotyyppi pystyy aiheuttamaan sekä humoraaliset että soluimmuunivasteet, verrattuna moniin liukeneviin alayksikön proteiinirokotteisiin. Siis, tämän tyypin im-15 munisointi säilyttää monia elävien heikennettyjen rokot teiden edullisia piirteitä ilman tartunta-aineiden käyttöä rokotusta varten ja osallistujan turvallisuushuolia.

Plasmidin tai muiden DNA-rakeinteiden, jotka koo-daavat haluttuja rokoteantigeenejä, suora injektio in vivo 20 kudoksiin on yksi toimituskeino. Myös muita DNA-rakentei-den toimituskeinoja voidaan käyttää. Näihin kuuluvat lukuisia lipidipohjaisia lähestymisiä, joissa DNA pakataan käyttäen liposomeja, kationisia lipidireagensseja tai sy-· tofektiinejä (kuten lipofektiini) . Nämä lähestymiset hel- ; : 25 pottavat in vivo pidättymistä ja ilmentymistä, kuten Felg- ner ja Rhodes (1991) kokoavat. Erilaisiin modifikaatiihin •j. näille peruslähestymisille kuuluvat seuraavat: peptidien, , . = , tai muiden ryhmien, sisällyttäminen helpottamaan (i) koh- » t ;·, distamista tiettyihin soluihin, (ii) DNA-rakenteen solun- 30 sisäistä järjestelyä seuraavaa pidättymistä, tai (iii) helpottamaan ilmentymistä. Vaihtoehtoisesti sekvenssit, • " jotka koodaavat haluttuja rokoteantigeenejä, voidaan in- sertoida sopivan retrovirusvektoriin. Saatu rekombinantti ;·: retrovirusvektori, joka siirrostetaan kohteeseen rokotean- 35 tigeenin in vivo ilmentymistä varten. Antigeeni aiheuttaa sitten immuunivasteet. Kuten edellä mainitaan, tämän lä-·: hestymisen on osoitettu aiheuttavan sekä humortaalisen ‘ ' että soluimmuniteetin virusantigeeneille (Irwin, et ai.).

112249 47

Lisäksi, tämän keksinnön HGV-rokotteet voidaan antaa yhdistelmässä muiden rokoteaineiden kanssa, esimerkiksi muiden hepatiittirokotteiden kanssa.

H. Synteettisiä peptideitä 5 Käyttäen HGV-polypeptidin koodaussekvenssejä voi daan muodostaa synteettisiä peptidejä, jotka vastaavat näitä polypeptidejä. Synteettisiä peptidejä voidaan syntetisoida kaupallisesti tai valmistaa käyttäen standardi-menetelmiä ja alan laitetta (Applied Biosystems, Foster 10 City CA).

Vaihtoehtoisesti oligonukleotidisekvenssit, jotka koodaavat peptidejä, voidaan joko syntetisoida suoraan oligonukleotidisynteesin standardimenetelmillä tai, suurten koodaussekvenssien tapauksessa, syntetisoida sarjalla 15 kloonausvaiheita, jotka käsittävät moninkertaisten oli- gonukleotidifragmenttien, jotka vastaavat koodaussekvens-siä, peräkkäisen järjestyksen (Crea; Yoshio et ai.; Eaton et ai.). Oligonukleotidin koodaussekvenssit voidaan ilmentää standardi rekombinanttimenetelmillä (Maniatis et ai.; 20 Ausubel et ai.).

V. Virusgenomin karakterisointi

Kuten esimerkissä 4 esitetään, HGV-genomi näyttää olevan RNA-molekyyli ja sillä on lähin sekvenssisamanlai-.·. suus virussekvenssien kanssa, jotka on luetteloitu Flavi- 25 viridae-heimon viruksiin. Tämä heimo käsittää Flaviviruk- set, Pestivirukset ja luokittelemattoman lajin, joka on ‘•’l’ tehty yhdestä jäsenestä, Hepatitis C virus. HGV-viruksella ···* ei ole merkittävää globaalia (so. viruksen pituudelta) sekvenssi-identiteettiä muiden tunnettujen Flaviviridaen » I · : 30 jäsenten kanssa, alla keskusteltujen proteiiniaiheiden poikkeuksella.

Yleensä Flaviviridaen jäsenet ovat kuorellisia vi-ruksia, joiden tiheydet sakkaroosigradienteissa ovat vä-' , Iillä 1,1 - 1,23 g/ml ja jotka ovat herkkiä lämmölle, or- 35 gaanisille liuottimille ja detergenteille. Kuten esimer-kissä 5 esitetään, HGV:n tiheysominaispiirteet ovat saman-j laiset kuin kuorellisen Flaviviridae-viruksen (HCV) . HGV- • I t « · • t 112249 48 virionin kokonaisuus näyttää myös olevan herkkä orgaanisille liuottimille (esimerkki 5).

Flaviviridae-virionit sisältävät lineaarisen yk-sisäikeisen (ss) RNA:n yksittäisen molekyylin, joka toimii 5 myös ainoana mRNA:na, joka koodaa virusproteiinit. ssRNA-molekyyli on kooltaan tyypillisesti välillä 9-12 kiloemästä pitkä.

Virusproteiinit johdetaan yhdestä polyprote-iiniesiasteesta, jota käsitellään myöhemmin kypsiksi vi-10 rusproteiineiksi. Useimmat Flaviviridaen jäsenet eivät sisällä poly(A)-pääteosia niiden 3'-päissä. Virionit ovat noin 15 - 20 % lipidiä painosta laskettuna.

Jäsenillä Flaviviridae-heimossa on ydinproteiini ja kaksi tai kolme membraaniin liittynyttä proteiinia. Jäsen-15 ten analogiset rakenneproteiinit kolmessa suvun Flavivi-rus-heimossa osoittavat vähän samanlaisuutta toistensa kanssa sekvenssitasolla. Ei-rakenteelliset proteiinit sisältävät säilytettyjä aihelmia RNA-riippuvaista RNA-poly-meraasia (RDRP), helikaasia, varten ja seriiniproteaasin.

20 Nämä säilytettyjen aminohappojen tai aihelmien segmentit voidaan havaita käyttäen alalla tunnettuja tietokonealgo-ritmeja, kuten "MACAW" (Schuler, et ai.). Nämä aihelmat liittyvät luultavasti pakkokeinoihin, jotka näillä proteiineilla käsitellyt substraatit määräävät (Koonin ja Dol-··. 25 ja). Näiden aihelmien järjestys säilytetään kaikissa Fla- viviridae-heimon jäsenissä. HGV:n genomi sisältää prote-' ’ iiniaihelmat, jotka ovat Flaviviridae-heimon jäsenissä, • esimerkiksi (i) helikaasigeenin, (ii) seriinin kaltaisen :·’ proteaasialueen, ja (iii) "GDD"-sekvenssin RNA-riippuvai- • ’ 30 sen RNA-polymeraasin (RDRP) (katso kuva 5).

Sekvenssi-informaatio esitetään tässä useilla HGV:n j ·· eri kannoilla/isolaateilla. Tätä informaatiota alan ammat- • timies voi käyttää eristämään uusia kantoja/isolaatteja käyttäen hybridisaatio-, alukelaajennus- ja RT-PCR-teknii- 35 koita, kuten tässä kuvataan (esim. käyttäen rappeutuneita alukkeita, jotka perustuvat esitettyihin HGV-varianttisek-: : : vensseihin).

112249 49 Tässä tapauksessa HGV on uusi isolaatti, jonka uskotaan olevan Flaviviridae-heimon jäsen. Tässä virushei-mossa viruksella koodattujen rakenneproteiinien tutkimus sallii täsmällisimmän määrityksen siitä, onko vi-5 rusisolaatti erilaisen viruslajin jäsen. Ei-rakenteelliset proteiinit säilyvät parhaiten erilaisten viruslajien välillä viruslajien heimossa. Tämän uskotaan olevan tulosta tarpeesta säilyttää entsymaattisia toimintoja, kuten seu-raavat: viruspolyproteiinin proteolyyttinen pilkkominen, 10 ja RNA-genomin replikaatio virushelikaasilla ja viruksen RNA-ri ippuvaisella RNA-polymeraasi11a.

Useiden lajien tutkimus missä tahansa Flaviviridae-heimon suvussa, esim. flavivirus-suku, osoittaa, että geenit näitä säilytettyjä toimintoja varten säilyvät paremmin 15 lajien välillä kuin rakenneproteiinit. Siis, yksi päätekijöistä, joilla määritetään edustaako virusisolaatti uutta lajia, vastaan tunnetun lajin "variantti-isolaattia", on rakenneproteiinien globaalin homologian määritys tunnettujen viruslajien ja uuden virusisolaatin välillä.

20 Paikalliset homologiat, jotka havaitaan noin 200 tai alle aminohapon alueilla, jotka löytyvät ei-rakenteel-lisissa proteiineissa, ovat määrittelemättömiä indikaattoreita siitä onko isolaatti variantti vai uusi laji. Tyy-pillisesti virusisolaatit, joilla on alle tai noin 40-%:n ·. 25 globaalit rakenneproteiinihomologiat, luokitellaan joko eri lajeiksi (virukset) tai eri suvuiksi. HGV:n rakenne-alueilla kullakin on alle noin 40-%:n homologiat verrattuna minkä tahansa "GENBANK:ssa" kuvattuun virukseen (ver-;;; tailut suoritettiin alan standardimenetelmillä) . Siis, ’ 30 HGV:tä pidetään uutena lajina ja mahdollisesti positiivi sen säikeen RNA-viruksen uutena sukuna.

: · Toinen tärkeä alue, jotka tutkitaan määritettäessä : : : virusisolaatin fylogeneettistä korvautumista, on 5' ja 3' translatoimattomat alueet (UTR: t) . Näitä alueita verrataan ... 35 virusisolaattien välillä. Esimerkiksi, kaikilla jäsenillä ; HCV, luokittelematon Flaviviridae-suku, on 5' translatoi- :,· mattomia alueita, jotka ovat suurempia kuin noin 90 % su- vun kaikilla muilla jäsenillä säilyneet. Lisäksi, HCV:n 112249 50 jäsenet jakavat 3' translatoimattomia alueita, jotka ovat noin 24 - 50 nukleotidia pitkiä.

Merkittäviä ryhmittymisiä ei havaita missään viruksessa "GENBANK:ssa" (Ver. 86), kun 5-translatoimatonta 5 aluetta käytetään kyselysekvenssinä FASTA:n kanssa BLASTN:lla. Lisäksi, HGV sisältää 3'-translatoimattoman alueen, joka on ainakin noin 250 nukleotidia pitkä, ja joka sisältää myös vähän homologiaa mihin tahansa muuhun tunnettuun virukseen.

10 Flaviviridae-heimon jäsenten tiedetään toistuvan lukuisissa erilaisissa eläimissä, jotka vaihtelevat (i) hematofagogisista artropodivektoreista (punkit ja moskiitot) , joissa ne eivät aiheuta sairautta, (ii) suureen määrään selkärankaisia isäntiä (ihmiset, kädelliset, muut 15 nisäkkäät, pussieläimet ja linnut). Yli 30 Flaviviridae-heimon jäsentä aiheuttaa sairauksia ihmisessä, jotka sairaudet vaihtelevat kuumesairaudesta, tai ihottumasta, mahdollisesti kohtalokkaisiin sairauksiin, kuten verenvuoto-kuume, aivotulehdus tai maksatulehdus. Ainakin 10 Flavivi-20 ridae-heimon jäsentä aiheuttaa vakavia ja taloudellisesti tärkeitä sairauksia kotieläimissä.

VI. Hyöty Ά. Keksintö ;: Yhdessä aspektissa keksintö koskee polynukleotide- 25 ja, jotka johdetaan Hepatitis G viruksen (HGV) polynukle-; ·1; otidista oleellisesti eristetyssä muodossa. Yhdessä toteu- tusmuodossa HGV-polynukleotidi karakterisoidaan seuraavil- > ·· » · , .·, la (i) transmissio kädellisissä, (ii) seriologisesti ero- * i · tettavissa hepatitis A viruksesta (HAV) , hepatitis B vi-

30 ruksesta (HBV), hepatitis C viruksesta (HCV), hepatitis D

viruksesta (HDV) ja hepatitis E viruksesta (HEV), ja (iii) ! “ Flaviviridae virusheimon jäsenyys. Keksinnön polynukleoti- V ’ dit voivat koostua DNA:sta tai RNArsta (tai niiden analo- geista tai varianteista) ja ne voidaan tuottaa rekom- ,11, 35 binanttisesti, eristää tai syntetisoida alalla tunnetujen * 1 menetelmien mukaisesti.

-·'· · Yleensä keksinnön HGV-polynukleotidit ovat ainakin ’’ · 10 nukleotidia pitkiä. Vaihtoehtoisessa toteutusmuodossa 112249 51 HGV-polynukleotidi on ainakin 15 nukleotidia pitkä. Vielä yhdessä vaihtoehtoisessa toteutusmuodossa HGV-polynukleotidi on ainakin 20 nukleotidia pitkä.

Spesifisemmässä toteutusmuodossa keksinnön polynuk-5 leotidit käsittävät HGV-genomin cDNA:n tai cDNA-komplemen-tit. Spesifisemmässä toteutusmuodossa tällaisella cDNA:lla tai cDNA-komplementilla on ainakin 40-%:n sekvenssihomolo-gia polynukleotidiin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, sekvenssistä nro 37 ja sekvenssistä 10 nro 19, tai niiden komplementeista. Vielä yhdessä toteutusmuodossa tällaiset cDNA:t osoittavat ainakin 55-%:n sekvenssihomologian polynukleotidiin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, sekvenssistä nro 37 ja sekvenssistä nro 19, tai niiden komplementeista.

15 Spesifisemmissä toteutusmuodoissa keksinnön cDNA- tai cDNA-komplementtipolynukleotideissä on sekvenssejä, jotka johdetaan sekvensseistä, jotka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, sekvenssistä nro 37 ja sekvenssistä nro 19, tai niiden komplementeista.

20 Toisessa yleisessä toteutusmuodossa keksinnön po- lynukleotidit ovat polynukleotidikoettimia, jotka spesifisesti hybridisoituvat HGV:n kanssa. Vielä yhdessä yleisessä toteutusmuodossa keksinnön polynukleotidit koodaavat HGV:n epitoopin. Tarkemmin sanottuna, tällaiset epitoopin 25 koodaavat polynukleotidit voivat käsittää sekvenssejä, jotka johdetaan sekvenssistä nro 14, sekvenssistä nro 19 '; ja sekvenssistä nro 37.

* i t · Toisessa yleisessä toteutusmuodossa keksinnön po- ''··' lynukleotidi käsittää nukleotidien viereisen sekvenssin, I I · * 30 joka pystyy hybridisoitumaan selektiivisesti HGV-polynuk- leotidiin. Tässä suhteessa HGV karakterisoidaan genomina, joka käsittää avoimen lukukehyksen (ORF) , joka koodaa ami- !·': nohapposekvenssin, jossa on ainakin 40-%:n sekvenssihomo- » 1 . logia yhteen seuraavista aminohapposekvensseistä: sekvens- < > t 35 sin nro 15 2873 aminohapon sekvenssi, sekvenssin nro 38 ·;·’ 190 aminohapon sekvenssi, tai sekvenssin nro 20 67 amino- , hapon sekvenssi. Tarkemmin sanottuna, polynukleotidikoetin .;··· hybridisoituu spesifisesti HGV:n kanssa. Tällaisissa po- 112249 52 lynukleotidikoettimessa voi olla detektioleimoja tai muita modifikaatioita tai se voidaan kiinnittää kantaja-aineeseen.

DNA-polynukleotidit, kuten edellä kuvataan, voivat 5 koodata myös HGV spesifisesti iramunoreaktiiviset anti-geenideterminantit. Tässä suhteessa HGVrllä karakterisoidaan olevan genomi, cDNA tai sen komplementit, jotka käsittävät avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodaa aminohapposekvenssin. Tällaisella aminohapposekvenssillä on aina-10 kin 40-%:n sekvenssihomologia yhteen seuraavista aminohapposekvensseistä: sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sek venssi, sekvenssin nro 38 190 aminohapon sekvenssi, tai sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssi.

Toisessa spesifisessä toteutusmuodossa HGV-koodaava 15 DNA-polynukleotidi, joka on spesifisesti reaktiivinen HGV-antigeenideterminantin kanssa, käsittää, tämän keksinnön mukaisesti, aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 55-%:n sekvenssihomologia sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sekvenssiin tai sekvenssin nro 38 190 aminohapon sekvenssiin 20 tai sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssiin.

Vielä yhdessä spesifisessä toteutusmuodossa DNA-polynukleotidi voi osoittaa ainakin 40-%:n sekvenssihomo-logiaa polynukleotidille, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, sekvenssistä nro 37, ja sek-25 venssistä nro 19, tai niiden komplementeista.

Vielä yhdessä toteutusmuodossa keksintö käsittää DNA-polynukleotidin, joka koodaa HGV-johdetun polypepti- t * · "·' din. Tarkemmin sanottuna polypeptidi, joka koodataan po- lynukleotidilla, käsittää ainakin 15 - 60 aminohapon vie- t I · V : 30 reisen sekvenssin, jolla on 55-%:n sekvenssihomologia ai nakin 15 - 60 aminohapon viereiseen sekvenssiin, joka koo-: ·.. dataan HGV-genomilla, cDNA:lla tai niiden komplementeilla.

Spesifisessä toteutusmuodossa HGV-polypeptidin koo-* . daavat polynukleotidit voidaan koodata PNF 2161 cDNA-läh- ,,, 35 teen lambda gtll kokoelmaan. Vielä yhdessä spesifisessä f t toteutusmuodossa DNA-polynukleotidi voi koodata HGV:n epi-: : toopin. Vielä yhdessä toteutusmuodossa polynukleotidi voi ·;·· olla koetin, joka hybridisoituu spesifisesti HGV:n kanssa.

112249 53 Läheisessä aspektissa keksintö käsittää rekom-binanttivektorin, joka sisältää DNA-polynukleotidin, joka koodaa HGV-polypeptidin. Toisessa läheisessä aspektissa keksintö käsittää solun, joka muutetaan tällaisella vekto-5 rilla.

Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsittää polynukleotidikoettimen, joka spesifisesti hybridisoi-tuu HGV hepatitisvirusgenomin, cDNA:n tai sen komplementtien kanssa. Spesifisemmässä toteutusmuodossa polynukle-10 otidikoettimen sekvenssillä on ainakin 40-%:n sekvenssi- homologia sekvenssiin, joka johdetaan sekvenssistä nro 19, sekvenssistä nro 37, ja sekvenssistä nro 14, tai niiden komplementeista. Toisessa spesifisessä toteutusmuodossa polynukleotidikoetin johdetaan sekvenssistä nro 19, sek-15 venssistä nro 37, ja sekvenssistä nro 14, tai niiden komplementeista.

Toisessa läheisessä aspektissa keksintö käsittää menetelmän HGV hepatitis-viruksen nukleiinihapon havaitsemisen koekohteessa. Menetelmän mukaisesti nukleiinihappoa 20 sisältävä näyte saadaan kohteesta. Sitten näyte yhdistetään ainakin yhden polynukleotidikoettimen kanssa, joka spesifisesti hybridisoituu HGV hepatitis-virusgenomin kanssa. Sitten havaitaan HGV-nukleiinihappo/koetin-komp- , leksit, jotka muodostuvat HGV-nukleiinihapon hybridisaa- ! * ·, 25 tiolla koettimen kanssa. Tällainen havaitseminen voidaan saada aikaan koettimen, joka sisältää ainakin yhden re-portteriryhmän, hybridisaatiolla HGV-nukleiinihappoihin.

* Spesifisemmässä toteutusmuodossa edellä kuvattu I·' menetelmä käsittää HGV-nukleiinihappospesifisten koettimi- V : 30 en käytön, joissa kaksi koetinta (aluketta) määrittelevät HGV-nukleiinihapon sisäisen alueen. Tässä toteutusmuodossa ; kullakin koettimella on yksi säie, joka sisältää 3'-pään, Γ: joka on sisäinen HGV-nukleiinihapon sisäiselle alueelle.

1 . Nukleiinihappo/koetin hybridisaatiokompleksit muutetaan 35 sitten kaksisäikeiseksi koettimeksi, joka sisältää frag- ;** mentit, alukelaajennusreaktioilla. Koettimen sisältävät : : fragmentit amplifioidaan toistamalla peräkkäin kohdat (i) :·< kaksisäikeisten fragmenttien denaturointi, jolloin tuote- 112249 54 taan yksisäikeiset fragmentit, (ii) yksisäikeiden hybri-disointi koettimilla, jolloin muodostuu säie/koetin-komp-lekseja, (iii) kaksisäikeisten fragmenttien muodostus säie/koetin-komplekseistä DNA-polymeraasin ja kaikkien 5 neljän deoksiribonukleotidin ollessa läsnä, ja (iv) kohtien (i) - (iii) toiston, kunnes haluttu amplifikaatioaste on saavutettu. Amplifikaatiotuotteet identifioidaan sitten luotujen menetelmien mukaisesti. Keksinnön menetelmä voi käsittää edelleen kolmannen polynukleotidikoettimen, joka 10 pystyy selektiivisesti hybridisoitumaan edellä kuvattuun sisäiseen alueeseen, mutta ei spesifisiin koetin/aluke-sekvensseihin, joita käytetään amplifikaatiota varten.

Toisessa spesifisessä toteutusmuodossa HGV-nukle-iinihappo/koetin-kompleksien havaitseminen saadaan aikaan 15 kohteen amplifikaatiomenetelmällä, kuten itsensä ylläpitävällä sekvenssireplikaatiolla, ligaasiketjureaktiolla tai säikeen korvausamplifikaatiolla. Lisäspesifisessä toteutusmuodossa havaitseminen saadaan aikaan käyttäen signaa-liamplifikaatiotekniikkaa, kuten haarautuneen ketjun DNA-20 koettimia, tai Q-beta replikaasimenetelmää.

Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsittää kokoonpanon polynukleotideistä johdetun HGV hepatitis-viruksen läsnäolon analysoimiseksi näytteistä. Yleisessä toteutusmuodossa kokoonpano käsittää ainakin yhden po- ( · ··, 25 lynukleotidikoettimen, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka spesifisesti hybridisoituu HGV-polynukleotidin kanssa, ja sopivan säiliön. Spesifisessä toteutusmuodossa ko-• ; koonpano käsittää kaksi polynukleotidikoetinta, jotka mää- f ♦ * ‘ rittelevät HGV-polynukleotidin sisäisen alueen, jossa kul- » t * v : 30 lakin koettimella on yksi säie, joka sisältää 3'-pään, joka on sisäinen alueelle. Lisätoteutusmuodossa koettimet . voivat olla käyttökelpoisia alukkeina polymeraasiketju- reaktioamplif ikaatiolle.

* . Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsit- 35 tää HGV hepatitisviruspartikkelin oleellisesti eristetyssä 1 ·;* muodossa. Keksintö käsittää myös polypeptidin tai polypep- ; : ; tidien valmistuksen HGV hepatitisviruksesta oleellisesti * t » · ·;·; eristetyssä muodossa. Tässä suhteessa HGV-virus karakte- 112249 55 risoidaan seuraavasti: (i) sen on kädellisten mukana siirtyvä, (ii) se on seriologisesti erotettavissa hepatitis A viruksesta (HAV), hepatitis B viruksesta (HBV), hepatitis C viruksesta (HCV), hepatitis D viruksesta (HDV) ja hepa-5 titis E viruksesta (HEV), ja (iii) se on Flaviviridae vi-rusheimon jäsen. HGV-polypeptidit, kuten edellä on määritelty, voidaan valmistaa tavanomaisilla keinoilla, mukaan lukien kemiallisen synteesin ja rekombinantti-DNA:n ilmentämisen. Tällaiset polypeptidit voidaan myös kiinnittää 10 kiinteään faasiin.

Spesifisessä toteutusmuodossa polypeptidi on spesifisesti immunoreaktiivinen ainakin yhden anti-HGV vasta-aineen kanssa. Vielä yhdessä spesifisessä toteutusmuodossa polypeptidi käsittää antigeenideterminantin, joka on spe-15 sifisesti immunoreaktiivinen HGV:n kanssa. Tässä yhteydes sä HGVrllä karakterisoidaan olevan genomi, joka käsittää avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodaa aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 40-%:n sekvenssihomologia sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sekvenssiin tai sekvenssin nro 38 20 190 aminohapon sekvenssiin tai sekvenssin nro 20 67 amino hapon sekvenssiin. Spesifisemmässä toteutusmuodossa ORF koodaa aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 55-%:n sekvenssihomologia yhteen edellä mainituista aminohapposek-vensseistä. Vielä yhdessä toteutusmuodossa polypeptidi sek- : · * ,··, 25 venssi johdetaan sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sek- venssistä, tai sen fragmenteista, tai sekvenssin nro 38 • * 190 aminohapon sekvenssistä, tai sen fragmenteista, tai • 4 · ’·* sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssistä, tai sen * % * :«* fragmenteista. Toisessa spesifisessä toteutusmuodossa po- V * 30 lypeptidi HGV hepatitisviruksesta käsittää ainakin noin 60 aminohapon viereisen sekvenssin, joka koodataan HGV-geno- *·· millä, cDNA:lla tai sen komplementeilla. Tarkemmin sanot- : V: tuna, tällainen peptidisekvenssi voidaan koodata PNF 2161 cDNA lähde lambda gtll kokoelmalla.

< i » » * ... 35 Rekombinanttisesti ilmentyneet HGV-polypeptidit ’·;·* voivat, spesif isemmässä toteutusmuodossa, käsittää poly- peptidisekvenssin, joka johdetaan sekvenssistä nro 20, ·;·; sekvenssistä nro 38 tai sekvenssistä nro 15. Toisessa to- 112249 56 teutusxnuodossa tällainen polypeptidi voidaan koodata sekvenssillä, joka johdetaan sekvenssitä nro 14 tai sekvenssin nro 14 komplementista.

Läheisessä lisätoteutusmuodossa, keksinnön mukai-5 sesti, HGV hepatitisviruksen polypeptidi voi olla fuu-siopolypeptidi, joka käsittää HGV-polypeptidin ja toisen polypeptidin. Tarkemmin sanottuna tällainen fuusiopolypep-tidi voi käsittää, toisena polypeptidin signaalisekvens-seinä, β-galaktosidaasi- tai glutationi-S-transferaasipro-10 teiinisekvenssit. Vaihtoehtoisesti, toinen polypeptidi voi käsittää partikkelin muodostavan proteiinin.

Edellä kuvatut polypeptidit voidaan johtaa rakenteellisista tai ei-rakenteellisista virusproteiineista.

Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsit-15 tää kloonausvektorin, joka pystyy ilmentämään, sopivissa olosuhteissa, cDNA:n avoimen lukukehyksen (ORF), joka johdetaan HGV hepatitisviruksen genomista, cDNArsta tai sen komplementeista. Tässä keksinnön aspektissa ORF liitetään käyttökelpoisesti kontrollisekvenssiin, joka on yhteenso-20 piva halutun isännän kanssa. Läheisessä aspektissa keksintö käsittää solun, joka on muutettu tällaisella vektorilla. vektorin spesifisessä toteutusmuodossa ORF voidaan johtaa sekvenssistä nro 14 tai sen komplementista. Vielä muissa spesifisissä toteutusmuodoissa ORF voidaan johtaa « 25 sekvenssistä nro 37 tai sekvenssistä nro 19.

Läheisessä aspektissa keksintö käsittää menetelmän HGV hepatitisviruksen polypeptidin tuottamiseksi. Menetel- « * · • · mä käsittää solujen viljelyn, jotka sisältävät edellä ku- i * vattuja vektoreita, olosuhteissa, jotka ovat sopivia saa- » s · : 30 maan aikaan avoimen lukukehyksen (ORF) sekvenssin ilmenty misen. Spesifisemmässä toteutusmuodossa ORF-sekvenssi koo- : ·,, daa polypeptidisekvenssin, joka valitaan polypeptidisek- venssien, tai niiden fragmenttien, ryhmästä, joka koostuu ‘ , sekvenssistä nro 15, sekvenssistä nro 38 ja sekvenssistä r » ft * 35 nro 20. Lisäksi, ORF-sekvenssit voidaan johtaa HGV cDNA:- » '··’* sta tai sen komplementista. Vielä yhdessä spesifisessä ; toteutusmuodossa vektori on lambda gtll faagivektori, joka ilmentyy Escherichia coli soluissa.

57 1 12 2 49 Läheisessä lisäaspektissa keksintö käsittää diagnostisen kokoonpanon käytettäväksi seulottaessa seerumin sisältäviä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä HGV hepa-titisvirusinfektiota vastaan. Tällainen kokoonpano voi 5 käsittää oleellisesti eristetyn HGV polypeptidiantigeenin, joka käsittää epitoopin, joka on spesifisesti immunoreak-tiivinen ainakin yhden anti-HGV vasta-aineen kanssa. Tällainen kokoonpano käsittää myös keinot mainitun vasta-aineen sitoutumisen antigeeniin havaitsemiseksi.

10 Mitä tulee tällaiseen kokoonpanoon, HGV:llä karak terisoidaan olevan genomi, cDNA tai sen kompImenetit, jotka käsittävät avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodaa aminohapposekvenssin. Tällaisella aminohapposekvenssillä on tyypillisesti ainakin 40-%:n sekvenssihomologia sekvenssin 15 nro 15 2873 aminohapon sekvenssiin tai sekvenssin nro 38 190 aminohapon sekvenssiin tai sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssiin. Spesifisissä toteutusmuodoissa kokoonpano voi käsittää rekombinanttisesti tuotetun tai kemiallisesti syntetisoidun polypeptidiantigeenin. Kokoonpanon 20 polypeptidiantigeeni voidaan liittää myös kantaja-aineeseen.

Spesifisemmässä toteutusmuodossa, edellä kuvatun kokoonpanon havaitsemiskeinot käsittävät kantaja-aineet, johon mainittu polypeptidin antigeeni kiinnitetään. Täl-25 lainen kokoonpano voi käsittää myös kiinnittymättömän re- » portteina leimatun anti-ihmisvasta-aineen. Tässä toteutusmuodossa vasta-aineen sitoutuminen HGV-polypeptidin • * · • antigeeniin voidaan havaita reportterillä leimatun vasta- ; * ·* aineen sitomisella.

s * * ,* · 30 Läheisessä aspektissa keksintö käsittää menetelmän HGV hepatitisvirusinfektion havaitsemiseksi koekohteessa. Tämä detektiomenetelmä käsittää vaiheet, joissa saatetaan HGV koekohteesta saatu seerumi reagoimaan oleellisesti ' , eristetyn HGV-polypeptidiantigeenin kanssa ja tutkitaan 35 antigeenistä sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo. Spesifi- , » sessä toteutusmuodossa menetelmä käsittää polypeptidianti-* geenin kiinnittyneenä kantaja-aineeseen, ja seerumi saate- ;· ; taan reagoimaan alustan kanssa. Myöhemmin, alusta saate- 58 1 12249 taan reagoimaan reportterilla leimatun anti-ihmisvasta-aineen kanssa. Kantaja-aineesta tutkitaan sitten reportte-5 rilla leimatun vasta-aineen läsnäolo.

Lisäaspektissa keksintö käsittää HGV hepatitisvi-ruksen rokotekoostumuksen. Koostumus käsittää oleellisesti eristetyn HGV polypeptidiantigeenin, jossa antigeeni käsittää epitoopin, joka on spesifisesti immunoreaktiivinen 10 ainakin yhden anti-HGV vasta-aineen kanssa. Peptidianti-geeni voidaan tuottaa alalla tunnettujen menetelmien mukaisesti, mukaan lukien rekombinanttiilmentymisen tai kemiallisen synteesin. Peptidiantigeeni on edullisesti läsnä farmakologisesti tehokkaassa annoksessa farmaseuttisesti 15 hyväksyttävässä kantajassa.

Vielä yhdessä läheisessä aspeksissa keksintö käsittää monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifisesti immunoreaktiivinen HGV hepatitisviruksen epitoopin kanssa. Toisessa läheisessä aspektissa keksintö käsittää oleelli-20 sesti eristetyn polyklonaalisten vasta-aineiden valmisteen, joka on spesifisesti immunoreaktiivinen HGV:n kanssa. Spesifisemmässä toteutusmuodossa tällaiset polyklonaa- * 9 i liset vasta-aineet valmistetaan affiniteettikromatogra- fiällä.

:,;V 25 Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsit- * tää diagnostisen kokoonpanon käytettäväksi seulottaessa > seerumia, joka sisältää HGV-antigeenejä. Diagnostinen ko-;V; koonpano käsittää oleellisesti eristetyn vasta-aineen, jo ka on spesifisesti immunoreaktiivinen HGV-polypeptidian-:* * ’; 30 tigeenin kanssa, ja keinon polypeptidiantigeenin sitoutu- misen vasta-aineeseen havaitsemiseksi. Yhdessä toteutus-. \ muodossa vasta-aine kiinnitetään kantaja-aineeseen. Spesi- \,Y fisessä toteutusmuodossa vasta-aine voi olla monoklonaali- i >

< I

» ., 112249 oy nen vasta-aine. Kokoonpanon havaitsemiskeinot voivat käsittää toisen, leimatun monoklonaalisen vasta-aineen. Vaihtoehtoisesti, tai lisäksi, havaitsemiskeinoon voi kuulua leimattu, kilpaileva antigeeni.

5 Toisessa, läheisessä aspektissa, keksintö käsittää menetelmän HGV-infektion havaitsemiseksi koekohteessa. Keksinnön tämän aspektin mukaisesti koekohteesta saatu seerumi saatetaan reagoimaan edellä kuvatun kokoonpanon oleellisesti eristetyn HGV-spesifisen vasta-aineen kanssa. 10 HGV-spesifisestä vasta-aineesta tutkitaan sitten sitoutuneen antigeenin läsnäolo.

Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsittää in vitro kasvatetun solun, joka on infektoitunut HGV:llä. Spesifisessä toteutusmuodossa solu on hepatosyyt-15 ti, joka kasvatetaan kudosviljelmässä. Tarkemmin sanottuna, kudosviljelmän solu voi olla immortalisoitu hepa-tosyytti, tai se voi olla solulinjasta, joka johdetaan HGV-infektoituneen kädellisen maksasta.

Läheisessä aspektissa keksintö käsittää menetelmän 20 HGV:n lisäämiseksi. Menetelmä käsittää in vitro kasvatettujen HGV-solujen viljelyn, kuten edellä kuvataan, olosuhteissa, jotka ovat tehokkaita edistämään HGV:n lisääntymistä. Toisessa läheisessä aspektissa keksintö käsittää HGV-partikkelit, jotka tuotetaan tällaisella lisäämis-25 menetelmällä.

Vielä yhdessä aspektissa keksintö käsittää mosaiik-kipolypeptidin. Tällainen polypeptidi voi käsittää ainakin kaksi HGV:n epitooppia, jossa polypeptidistä oleellisesti puuttu aminohappoja, jotka normaalisti ovat epitooppien 30 välissä luontaisessa HGV-koodaussekvenssissä. Spesifisem- '·’ mässä toteutusmuodossa mosaiikkipolypeptidi kiinnitetään kantaja-aineeseen. Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsittää nukleiinihapon, joka koodaa edellä kuva-/ · tun mosaiikkipolypeptidin.

.35 Toisessa läheisessä aspektissa keksintö käsittää menetelmän HGV-infektion havaitsemiseksi koekohteessa. Menetelmä käsittää vasta-aineen sisältävän kohteesta saa-;,· · dun näytteen saattamisen kosketuksiin mosaiikkipolypepti- so 112249 din kanssa, kuten edellä kuvataan, ja sitoutuneen vasta-aineen läsnäolon tutkimisen antigeenistä.

Vielä yhdessä läheisessä aspektissa keksintö käsittää HGV rokotekoostumuksen. Rokotekoostumus käsittää mosa-5 iikkipolypeptidin, joka käsittää useamman kuin yhden HGV-epitoopin. Mosaiikkipolypeptidi on läsnä farmakologisesti tehokkaassa annoksessa farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa.

B. Immunoanalyysit HGV:lie 10 Yksi hyöty tämän keksinnön menetelmillä saaduille antigeeneille on niiden käyttö diagnostisina reagensseina HGV hepatitisviruksella infektoituneiden koekohteiden seerumeissa läsnä olevien vasta-aineiden havaitsemiseksi; esimerkiksi 470-20-1 antigeeni, antigeenit, jotka kooda-15 taan sekvenssillä nro 14 tai sen komplementilla, ja antigeenit, jotka koodataan kumman tahansa täydellisen virus-sekvenssin säikeen osilla. Tämän keksinnön antigeenejä voidaan käyttää yksinään, tai yhdistelmässä toistensa kanssa, HGV:n havaitsemiseksi. Tämän keksinnön antigeenit 20 voidaan myös kytkeä diagnostisten analyysien kanssa muita hepatitis aineita varten, kuten HAV, HBV, HCV ja HEV.

Yhdessä diagnostisessa konfiguraatiossa, koeseerumi saatetaan reagoimaan kiinteän faasin reagenssin kanssa, jossa on pintaan sitoutunut antigeeni, joka saadaan tämän 25 keksinnön menetelmillä, esim. 470-20-1 antigeeni. Kun an-·’, ti-HGV-vasta-aine oli sitoutunut reagenssiin ja sitoutu maton seerumikomponentti poistettu pesemällä, reagenssi saatetaan reagoimaan reportterilla leimatun anti-ihmisvas-ta-aineen kanssa, jolloin reportteri sitoutuu reagenssiin ' 30 suhteessa sitoutuneen anti-HGV vasta-aineen määrään kanta- .‘ · ja-aineella. reagenssi pestään taas sitoutumattoman leima tun vasta-aineen poistamiseksi, ja reportterin määrä, joka ; *.· liitetään reagenssiin, määritetään. Tyypillisesti, report- teri on entsyymi, joka havaitaan inkuboimalla kiinteää ' . 35 faasia sopivan fluorometrisen tai kolorimetrisen aineen ollessa läsnä (Sigma, St. Louis, MO).

Kiinteä pintareagenssi edellä olevassa analyysissä i : : valmistetaan tunnetuilla tekniikoilla proteiinimateriaalin 112249 61 kiinnittämiseksi kantaja-aineeseen, kuten polymeerille Imet, upotustikut, 96-kuoppainen levy tai suodatinmateeriaali. Näihin kiinnittymismenetelmiin kuuluvat yleensä proteiinin ei-spesifinen adsorptio kantajaan tai proteiinin kovalent-5 tinen kiinnittyminen, tyypillisesti vapaan amiiniryhmän kautta, kemiallisesti reaktiiviseen ryhmään kantaja-aineella, kuten aktivoitu karboksyyli-, hydroksyyli- tai aldehydiryhmä. Vaihtoehtoisesti, streptavidiinilla päällystettyjä levyjä voidaan käyttää biotinyloidun antigeenin 10 (antigeenien) yhteydessä.

Osan keksintöä muodostaa myös analyysisysteemi tai kokoonpano tämän diagnostisen menetelmän suorittamiseksi. Kokoonpano käsittää yleensä kantajan pintaan sitoutuneen rekombinantti HGV-antigeenin kanssa (esim. 470-20-1 anti-15 geeni kuten edellä) ja reportterilla leimatun anti-ihmis-vasta-aineen pintaan sitoutuneen anti-HGV-antigeenin vasta-aineen havaitsemiseksi.

Toisessa diagnostisessa konfiguraatiossa, joka tunnetaan homogeenisenä analyysinä, vasta-aine, joka sitoutuu 20 kantaja-aineeseen, tuottaa jonkin verran muutosta reak- tioväliaineessa, joka voidaan suoraan havaita väliaineessa. Aikaisemmin ehdotettujen homogeenisten analyysien tunnettuihin yleisiin tyyppeihin kuuluvat (a) spin-leimatut reportterit, joissa vasta-aine, joka sitoutuu antigeeniin, 25 havaitaan muutoksella raportoidussa liikkuvuudessa (spin-nin jakavien piikkien laajentaminen) , (b) fluoresoivat reportterit, joissa sitoutuminen havaitaan muutoksella fluoresenssitehokkuudessa tai polarisaatiossa, (c) entsyy-’! mireportterit, joissa vasta-aineen sitoutuminen aiheuttaa ;;; 30 entsyymi/substraatti-vuorovaikutuksia, ja (d)liposomiin ·’ ' sitoutuneet reportterit, joissa sitoutuminen johtaa li- posomin hajoamiseen ja kapseloidun reportterin vapautumiseen. Näiden menetelmien sovittaminen tämän keksinnön pro- : teiiniantigeeniin seuraa tavanomaisia menetelmiä homo- 35 geenisten analyysireagenssien valmistamiseksi.

Kussakin edellä kuvatussa analyysissä ana-!' lyysimenetelmä käsittää vaiheet, joissa koeyksilöstä saatu seerumi saatetaan reagoimaan proteiiniantigeenin kanssa ja 112249 62 antigeenistä tutkitaan sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo. Tutkiminen voi käsittää leimatun anti-ihmisvasta-aineen kiinnittämisen tutkittavaan vasta-aineeseen (esimerkiksi akuutista, kroonisesta tai toipilasfaasista) ja kantaja-5 aineeseen, sitoutuneen reportterin määrän mittaamisen, kuten ensimmäisessä menetelmässä, tai se voi käsittää vasta-aineen sitoutumisen vaikutuksen havaitsemisen homogeenisellä analyysireagenssilla, kuten toisessa menetelmässä .

10 Kolmas diagnostinen konfiguraatio käsittää HGV-vas- ta-aineiden käytön, jotka pystyvät havaitsemaan HGV-spesi-fisiä antigeenejä. HGV-antigeenit voidaan havaita, esimerkiksi käyttäen antigeenin kaappausanalyysiä, jossa ehdo-kasseeruminäytteissä läsnä olevat HGV-antigeenit saatetaan 15 reagoimaan HGV-spesifisen monoklonaalisen tai polyklonaa-lisen vasta-aineen kanssa. Vasta-aine sitoutuu kiinteään substraattiin ja antigeeni havaitaan sitten toisella, erilaisella leimatulla anti-HGV-vasta-aineella. Vasta-aineet voidaan valmistaa käyttäen tämän keksinnön peptidejä stan-20 dardimenetelmillä. Lisäksi, oleellisesti eristetyt vasta-aineet (olennaisesti vapaita seerumiproteiineista, jotka voivat vaikuttaa reaktiivisuuteen) voidaan muodostaa (esim. affiniteettipuhdistus (Harlow, et ai.)).

C. Hybridisaatioanalyysit HGV:lle 25 Yksi hyöty tämän keksinnön menetelmillä saaduille ··. nukleiinihapposekvensseille on niiden käyttö diagnostisina aineina HGV-sekvensseille, joka ovat läsnä seerumeissa, ; osoittaen siten infektion yksilössä. Alukkeet ja/tai koet- timet, jotka johdetaan tämän keksinnön koodaussekvenssis-30 tä, erityisesti kloonia 470-20-1 ja sekvenssiä nro 14 voi-V ‘ daan käyttää yksinään, tai yhdistelmässä toistensa kanssa, HGV:n havaitsemiseksi.

; ·.. Yhdessä diagnostisessa konfiguraatiossa, koeseerumi ·/·’: saatetaan reagoimaan PCR- tai RT-PCR-olosuhteissa käyttäen 35 alukkeita, jotka johdetaan esimerkiksi 470-20-1 sekvens-... seistä. HGV:n läsnäolo seerumissa, jota käytetään amplifi- kaatioreaktiossa, voidaan havaita alukkeilla kohdistettu-i : > jen sekvenssien spesifisellä amplifikaatiolla. Esimerkki 4 63 112249 kuvaa polymeraasiketjun amplifikaatioreaktioiden käytön, käyttäen alukkeita, jotka johdetaan tämän keksinnön klooneista, jolloin seulotaan erilaista lähdemateriaalia. Näiden amplifikaatioreaktioiden tulokset osoittavat tämän 5 keksinnön klooneista (esimerkiksi 470-20-1) johdettujen alukkeiden kyvyn havaita homologisia sekvenssejä amplifi-kaatioreaktioilla käyttäen suurta määrää erilaisia lähde-malleja. Amplifikaatioreaktiot esimerkissä 4 käsittävät suoraan seerumeista saatujen nukleiinihappojen käytön mal-10 limateriaalina.

Vaihtoehtoisesti, koettimet voidaan johtaa tämän keksinnön HGV-sekvensseistä. Nämä koettimet voidaan sitten leimata ja käyttää hybridisaatiokoettimina nukleiinihappoja vastaan, jotka saadaan koeseerumista tai kudosnäytteis-15 tä. Koettimet voidaan leimata käyttäen erilaisia reportte-rimolekyylejä ja havaita sen mukaisesti: esimerkiksi, radioaktiivinen isotooppileimaus ja kemiluminointidetektion reportterisysteemit (Tropix, Bedford, Mass.).

Kohdeamplif ikaatiomenetelmät, joita polymeraasiket-20 jureaktio, itsensä ylläpitävä sekvenssireplikaatiotekniik- ka [ '· 3SR", (Guatelli, et ai.; Gingeras, et ai., 1990) tunnetaan myös "NASBA:na" (VanGemen, et ai.)], ligaasiketjureaktio (Barany), säikeen korvausamplifikaatio ["SDA", (Walker)] ja muut tekniikat käyttävät, moninkertaistavat .·. 25 kohdesekvenssin kopioiden lukumäärän. Signaaliamplifikaa- tiotekniikat, joista on esimerkkinä haarautuneen ketjun DNA-koettimet (Horn ja Urdea; Urdea; Urdea, et ai.) ja Q-beta replikaasimenetelmä (Cahill, et ai.; Lomell, et ai.), •*>: ensin sitovat spesifisen molekyylikoettimen, sitten kopi- 30 oivat kaiken tai osan tästä koettimesta tai jollain muulla V : tavalla amplifioivat koetinsignaalin.

Spesifisten tässä keksinnössä esitettyjen nukle-i\. iinihapposekvenssien tai viereisten sekvenssien samassa t*j*; tai samanlaisessa (läheisessä) virusgenomissa havaitsemis- • 35 ta varten voidaan käyttää amplifikaatio- ja havaitsemisme- todologioita, vaihtoehtoina amplifikaatiolle PCRillä. Lu-'···’ kuisia tällaisia tekniikoita tunnetaan nukleiinihappodiag- s , » » 112249 64 nostiikan alalla (The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition, Clin. Chem. 39(4):705 (1993)).

1. Itsensä ylläpitävä sekvenssireplikaatio

Itsensä ylläpitävä sekvenssireplikaatio (3SR) tek-5 nilkka johtaa amplifikaatioon, joka on samanlaista suuruusluokkaa kuin PCR:llä, mutta isotermisesti. Mieluummin kuin terminen sykleissä suoritettu PCR, 3 SR toimii a) cDNA-synteesin käänteistranskriptaasilla, b) RNA-säikeen hajotuksen RNaasi H:11a, ja c) RNA-transkription T7 RNA-10 polymeraasilla, kolmen entsyymin yhteisreaktiona.

Kun koko reaktiojärjestys tapahtuu isotermisesti (tyypillisesti 42 °C:ssa), kallista lämpötilaa kierrättävää instrumentointia ei vaadita. Dupleksidenaturoinnin kuumentamalla, orgaanisten liuottimien tai muun mekanismin 15 ollessa poissa vain yksisäikeiset mallit (so. pääasiassa RNA) amplifioidaan.

Sopivat alukkeet käytettäväksi 3SR-amplifikaatiossa voi alan keskitason ammattimies valita tämän keksinnön virussekvensseistä. Esimerkiksi, virussekvenssin isoter-20 mistä amplifikaatiota varten 3SR-tekniikalla aluke 470-20-1-77F (sekvenssi nro 9) modifioidaan lisäämällä T7-pro-moottorisekvenssi ja edullinen T7 transkription aloitus-kohta oligonukleotidin 5'-päähän. Tämä modifikaatio johtaa sopivaan 3SR-alukkeeseen T7-470-20-1-77F (sekvenssi nro 25 9) . Aluketta 470-20-1-211R (sekvenssi nro 10) voidaan käyttää näissä reaktioissa joko ilman modifikaatiota tai T7-promoottoria.

‘ PNF 2161 :stä uutettua RNA:ta inkuboidaan AMV-kään- teistranskriptaasin (30 U), RNaasin H (3 U), T7 RNA-poly-30 meraasin (100 U) kanssa 100jixl:ssa reaktioseoksia, jotka * sisältävät 20 mM Tris-HCl:a, pH 8,1 (huoneenlämpötilassa), 15 mM MgCl2:a, 10 mM KCl:a, 2 mM spermidiini HCl:a, 5 mM : '> ditiotreitolia (DTT) , 1 mM dATP:tä, dCTP:tä, dGTP:tä ja ;T: TTP:tä kutakin, 7 mM ATP:tä, CTP:tä, GTP:tä ja UTP:tä ku- 35 takin, ja 0,15 μΜ kutakin aluketta. Amplifikaatio tapahtuu t · ... inkuboinnin 42 °C:ssa aikana 1-2 tunnin ajan.

Aluksi aluke T7-470-20-1-77F anneloituu kohde-RNA:-;« · hän ja se laajennetaan AMV-käänteistranskriptaasilla, joi- 65 1 12249 loin muodostuu cDNA, joka on komplementaarinen lähtö RNA-säikeelle. RNA-säikeen hajoamisen jälkeen RNaasi H: 11a käänteistranskriptaasi katalysoi toisen säikeen DNA:n synteesiä, mikä johtaa kaksisäikeiseen malliin, joka sisältää 5 (kaksisäikeisen) T7 promoottorisekvenssin. RNA-transkrip-tio johtaa yksisäikeisen RNA:n tuotantoon. Tätä RNA:ta voidaan sitten käyttää palaamaan sykliin amplifikaation lisäkierroksia varten, joka lopulta johtaa suuren pitoisuuden tuote-RNA:n varastoon. Tuote on pääasiassa yk-10 sisäikeinen RNA, jolla on sama säie kuin alukkeella, joka sisältää T7-promoottorin (T7-470-20-1-77F), paljon pienemmillä määrillä cDNArta.

Vaihtoehtoisesti, muu aluke (470-20-1-211R) voi sisältää T7-promoottorin, tai molemmat alukkeet voivat 15 sisältää promoottorin, mikä johtaa molempien RNa-säikeiden tuotantoon reaktiotuotteina. 3SR-reaktion tuotteet voidaan havaita, karakterisoida tai kvantitoida standarditeknii-koilla RNA:n analyysiä varten (esim. Northern Blot, RNA-slot tai täpläelektroforeesi, suora geelielektroforeesi 20 RNA-värjäävillä väriaineilla) . Lisäksi, tuotteet voidaan havaita menetelmillä, jotka hyödyntävät biotiini-avidiini affiniteettivuorovaikutuksia tai nukleiinihappokoettimien spesifisiä hybridisaatioita.

Yhdessä tekniikassa 3SR-tuotteiden nopeaa ja spesi-,·. 25 fistä analyysiä varten tuotteen liuoshybridisaatiota ra- dioleimattuun oligonukleotidiin 470-20-1-152R (sekvenssi nro 21) seuraa ei-denaturoiva polyakryyligeelielektrofo-

• t I

reesi. Tämä analyysi (geelin liikkuvuussiirtymä -tyyppinen ·’ analyysi) johtaa spesifisen koetin-tuote-hybridin havait- 3 0 semiseen hitaammin liikkuvana vyöhykkeenä kuin vyöhyke, ,· · joka vastaa hybridisoitumatonta oligonukleotidia.

2. Ligaasiketjureaktio (LCR)

Toisena esimerkkinä havaitsemissysteemistä, HGV-Ί'; sekvenssi voi muodostaa pohjan ligaasiketjureaktion (LCR) ' , 35 alukkeiden suunnittelulle. LCR hyödyntää DNA-ligaasin raon sulkemisaktiivisuutta, jolloin yhdistetään kaksi aivan , » 1 ··’ viereistä oligonukleotidiä, jotka omaavat vierekkäiset 5'- fosfaatin ("luovuttaja"-oligo) ja 3'-hydroksyylin ("vas- 66 1 12249 taanottaja"-oligo) päätteet. DNA-ligaasin ominaisuus yhdistää vain täysin komplementaariset päät mallista riippuvalla tavalla, johtaa suuren asteen spesifisyyteen, sillä ligaatio ei tapahdu elleivät yhdistettävät päätteet sek-5 venssissä sovi täydellisesti yhteen kohdesäikeen kanssa. Vaihtoehtona PCRrlle, jossa on joitakin etuja spesifisyyden muodossa yksittäisen emäksen epäsopivuuksia varten alukkeen ja kohdenukleiinihapon välillä, LCR:a voidaan käyttää havaitsemaan tai "tyypittämään" viruksen kannat, 10 jotka omaavat homologian HGV-sekvensseihin. Nämä tekniikat ovat sopivia spesifisten mutaatioiden läsnäolon analysoimiseksi, kun tällaisten emäsmuutosten tiedetään antavan lääkeresistenssi (esim. Larder ja Kemp; Gingeras, et ai., 1991).

15 Mallikomplementaarisen luovuttaja- ja vastaanotta- jaologonukleotidien ja oligonukleotidien, jotka ovat komplementaarisia luovuttajalle ja vastaanottajalle, ollessa läsnä eksponentiaalinen amplifikaatio LCR:llä on mahdollinen. Tässä toteutusmuodossa kukin ligaatiokierros muodos-20 taa lisämallin myöhempiä kierroksia varten syklisessä reaktiossa.

Esimerkiksi, aluketta 470-20-1-211R (sekvenssi nro 10), vierekkäistä oligonukleotidia (B, sekvenssi nro 22) ja sukulaisoligoja (211R', sekvenssi nro 23, ja B', sek-25 venssi nro 24), voidaan käyttää suorittamaan tämän keksin- ···, non sekvenssin LCR-amplif ikaatio. Käänteistranskriptio suoritetaan ensin standardimenetelmillä, jolloin muodoste-; taan cDNA, joka sitten amplifioidaan reaktioissa, jotka ·· sisältävät 0,1 - 1 μΜ kutakin neljästä LCR-alukkeesta, 20 ··’ 30 mM Tris-HCl:a, pH 8,3 (huoneenlämpötila), 25 mM KCl:a, 10 V ’ mM MgCl2:a, 10 mM ditiotreitolia (DTT), 0,5 mM NAD+:a, 0,01-%:ista Triton X-100 ja 5 yksikköä DNA-ligaasia (Amp-j *.. ligase, Epicentre Technologies, Madison, WI, tai muu kau- pallinen lämpöstabiilin DNA-ligaasin toimittaja) 25 ^l:ssa ’ . 35 reaktioseoksia.

Lämpösyklisointi suoritetaan 94 °C:ssa 1 minuutin ;·' 30 sekunnin ajan; 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, 65 °C:ssa 2 : minuutin ajan, toistetaan 25 - 40 sykliä. Tuotesynteesin 67 1 12 2 4 9 spesifisyys riippuu alukemallista sopivuudesta 3'-pääteasemassa. Tuotteet havaitaan polyakryyliamidigeelielekt-roforeesilla, minkä jälkeen etidiumbromidi-värjäyksellä; vaihtoehtoisesti, yksi vastaanottajaoligoista (211R' tai 5 B) on 5'-radioleimattu autoradiografiällä visualisoimista varten, minkä jälkeen geelielektroforeesilla.

Vaihtoehtoisesti, luovuttajaoligo on 3'-pää, joka on leimattu spesifisellä sitovalla ryhmällä (esim. biotii-ni) , ja vastaanottaja on 5'-leimattu spesifisellä havait-10 tavalla ryhmällä (esim. fluoresoiva väriaine) kiinteän faasin kaappausta ja havaitsemista varten.

3. Menetelmiä amplifioidun DNA:n analyysiä varten

Lukuisia tekniikoita on kuvattu amplifioidun DNA:n analyysiä varten. Useat tällaiset tekniikat ovat edullisia 15 suuren tuotannon sovellutuksia varten, joissa geelielekt-roforeesi on epäkäytännöllinen, esimerkiksi, nopeat ja korkean resoluution HPLC-tekniikat (Katz ja Dong). Yleensö kuitenkin menetelmät tartuntataudin organismin seulomiseksi käyttäen nukleiinihappokoettimia käsittävät erillisen 20 amplifikaation jälkeisen hybridisaatiovaiheen, jotta varmistetaan vaadittu spesifisyys patogeenin havaitsemista varten.

Yksi tällainen havaitsemistoteutusmuoto on af-finiteettipohjäinen hybridikaappaustekniikka (Holodniy, et f: 25 ai.). Tässä toteutusmuodossa PCR johdetaan yhdellä bio- ·, tinyloidulla alukkeella. Amplifikaation jälkeen kak- sisäikeinen tuote denaturoidaan, sitten hybridisoidaan I * peroksidaasileimattuun koettimeen, joka on komplementaa-rinen säikeelle, johon sisältyy biotinyloitu aluke. Hybri-30 disoitua tuotetta inkuboidaan sitten puskurissa, joka on ’ kosketuksissa avidiinilla (tai streptavidiinilla) päällys tetyn pinnan kanssa (esim. membraanisuodatin, mikrokuoppa, ; ’· lateksi tai paramagneettiset helmet) .

: : Päällystetyn kiinteän faasin massan, joka yhdistää 35 analysoitavan PCR-tuotteen tilavuuden tällä menetelmällä, täytyy sisältää riittävästi biotiinin sitomiskohtia kaappaamaan olennaisesti kaikki vapaa biotinyloitu aluke, sa-; moin kuin paljon alhaisempi pitoisuus biotinyloitua PCR- 68 112249 tuotetta.Kiinteän faasin kolmen tai neljän pesun jälkeen sitoutunut hybridisoitu tuote havaitaan inkuboinnilla o-fenyleenidiamiinin kanssa sitraattipuskurissa, joka sisältää vetyperoksidia.

5 Vaihtoehtoisesti, kaappaus voidaan välittää koetti- mella päällytetyillä pinnoilla, minkä jälkeen affiniteet-tipohjaisella havaitsemisella biotinyloidun alukkeen ja avidiini-reportterientsyymi-konjugaatin kautta (Whetsell, et ai.).

10 4. Lisämenetelmiä Tämän keksinnön virussekvenssi voi muodostaa pohjan myös signaaliamplifikaatiolähestymistä varten havaitsemiselle käyttäen haarautuneen ketjun DNA-koettimia. Haarautuneen ketjun koettimia (Horn ja Urdea; Urdea) on kuvattu 15 harvinaisten RNA- ja DNA-sekvenssien havaitsemista ja kvantitatiivista määritystä varten (Urdea, et ai.). Tässä menetelmässä oligonukleotidikoetin (RNA, DNA tai nukle-iinihappoanalogi) syntetisoidaan sekvenssillä, joka on komplementaarinen kohde-RNA:lie tai -DNA:lie Koetin sisäl-20 tää myös ainutlaatuisen haarautumissekvenssin tai sekvenssit, jotka eivät ole komplementaarisia kohde-RNA:lie tai -DNA:lie.

Tämä ainutlaatuinen sekvenssi muodostaa kohteen haarautuneen sekundaaristen detektorikoettimien hybri-/. 25 disaatiota varten, joista kukin sisältää yhden tai useam- t *t man muun ainutlaatuisen sekvenssin, jotka toimivat kohtei- » na tertiäärisille koettimille. Kussakin haarautumiskohdas-sa signaaliamplifikaatioreitissä erilainen ainutlaatuinen : sekvenssi ohjaa sekundaaristen, tertiääristen, jne. detek- ·' 30 tiokoettimien hybridisaatiota. Viimeinen koetinsarjassa on ,* * tyypillisesti liittynyt entsyymiin, joka on käyttökelpoi nen havitsemista varten (esim. alkalinen fosfataasi). Alukkeiden peräkkäinen hybridisaatio johtaa lopulta erit-·'; täin haarautuneen rakenteen kehitykseen, jonka rakenteen 35 haarat loppuvat entyymiin liittyneisiin koettimiin.

Entsymaattinen siirto tarjoaa lopullisen amplifi-· ‘ kaation ja erittäin herkkien kemiluminoivien substraattien valinta (esim. LumiPhos, Lumigen, Detroit, MI, substraat- 69 1 12 2 4 9 tina aikalisille fosfataasileimoille) johtaa erinomaiseen herkkyyteen, suunnilleen 10 000 alkuperäisen kohdesekvens-sin molekyyliä analyysiä kohti tai alle. Tällaisessa ha-vaitsemismenetelmässä amplifikaatio riippuu vain molekyy-5 lihybridisaatiosta mieluummin kuin entsymaattisistä mekanismeista, ja on siten paljon vähemmän altis inhibiitto-riaineille kliinisissä näytteissä kuin esimerkiksi PCR. Siten, tämä havaitsemismenetelmä sallii raakatekniikoiden käytön nukleiinihapon vapautumiseksi koenäytteissä, ilman 10 laajaa puhdistusta ennen analyysiä.

Amplifikaatio tämän keksinnön virussekvenssien herkkää havaitsemista varten voidaaan myös saada aikaan Q-β-replikaasitekniikoilla (Cahill, et ai.; Lomell, et ai.; Pritchard, et ai.). Tässä menetelmässä spesifisen koetti-15 men suunnitellaan olevan komplementaarinen kohdesekvens- sille. Tämä koetin insertoidaan sitten standardi molekyy-likloonaustekniikoilla kopioitavan RNA:n sekvenssiin Q-fi-faagista. Insertio replikonin spesifiseen alueeseen ei estä replikaatiota Q-6-replikaasilla.

20 Molekyylihybridisaation, ja useiden pesuvaiheiden, jälkeen replikaasi lisätään ja koetin-RNA:n amplifikaatio seuraa. "Käänteinen kohdekaappaus" on yksi tunnettu tekniikka mahdollisen taustan pienentämiseksi hybrisoimatto-mien koettimien replikaatiosta (Morrissey, et ai.). Ampli-25 fioidut replikonit ovat havaittavia standardi molekyyli-hybridisaatiotekniikoilla, jotka käyttävät DNA-, RNA- tai ' ’ ] nukleiinihappoanalogikoettimia.

<- * < ' ; Lisämenetelmiä harvinaisten DNA- ja RNA-sekvenssien t · t amplifikaatiota ja havaitsemista varten tunnetaan kirjal- ! * » 30 lisuudessa ja PCR:lie suositaan joitakin sovelluksia var- * i · V * ten molekyylidiagnostiikan alalla. Nämä vaihtoehtoiset tekniikat voivat muodostaa pohjan tässä keksinnössä esite-tyn sekvenssin havaitsemiselle, karakterisoinnille (esim. sekvenssierilaisuus, joka esiintyy monenlaisina läheisinä 35 tässä kuvatun sekvenssin kantoina, genotyypin muutokset, » t k * · * ‘ jotka ovat tunnusomaisia lääkeresistenssille) tai kvanti- tatiiviselle määritykselle.

4 » » , f » » • » » * « 70 112249

Keksinnön osan muodostaa myös analyysisysteemit tai kokoonpanot juuri kuvattujen amplifikaatio/hybridisaatio-analyysimenetelmien toteuttamista varten. Tällaisiin kokoonpanoihin kuuluvat yleensä joko spesifiset alukkeet 5 käytettäväksi amplifikaatioreaktioissa tai hybridisaa- tiokoettimissa.

D. Terapeuttisia käyttöjä

Kuten edellä on keskusteltu, tämän keksinnön HGV-antigeenejä voidaan käyttää rokotevalmisteissa.

10 Lisäksi, vasta-aineita, jotka muodostetaan tämän keksinnön polypeptidiantigeenejä vastaan, voidaan käyttää passiivista immunoterapiaa tai passiivista immunoehkäisyä varten. Vasta-aineet voidaan antaa määrissä, jotka ovat samanlaiset kuin ne, joita käytetään vasta-aineen muita 15 terapeuttisia antamisia varten. Esimerkiksi, yhdistetty gammaglobuliini annetaan 0,02 - 0,1 ml/Ib kehon paino (0,04 - 0,22 ml/kg kehon paino) muiden virussairauksien, kuten rabies, tuhkarokko ja hepatitis B, aikaisen inku-boinnin aikana, jolloin häiritään infektion muodostumista.

20 Siten, vasta-aineet, jotka ovat reaktiivisia HGV-antigee-nien kanssa, voidaan antaa passiivisesti yksinään tai yhdistelmässä toisen anti-virusaineen kanssa isäntään, joka on infektoitunut HGV:llä, jolloin lisätään isännän kykyä käsitellä infektiota.

’ 25 Tässä esitetyt HGV-sekvenssit identifioivat HGV:n » t * 'o, Flaviviridae-heimon jäseneksi (katso yllä). Flaviviridae > · luokitellaan kolmeen sukuun, flavivirukset, petstivirukset i t * ‘ I ja hepatitis C virus suvut, (Francki, et ai.). Kaikki Fla- viviridaet omaavat positiivisen säikeen RNA-genomin pituu- t « » '!·* 30 deltaan 9,0 - 12 kb, joka koodaa yksittäisen 3000 - 4000 • i > } ' aminohappoa pitkän polypeptidin. Tämä polypeptidi pilko taan proteolyyttisesti noin 10 proteiiniksi, mukaan lukien viruskapsidiproteiinin, viruskuoriproteiini(t) , ja mini- *i*; missään 5 ei-rakenneproteiinit (NS). Ei-rakenneproteiinit ' , 35 käsittävät kymotrypsiinin kaltaisen seriiniproteaasin, > > i * RNA-helikaasin (NS3) ja RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin . t ';** (NS5) . Flaviviridaen NS3-proteiini vaaditaan virusproteii- ; : : nin proteolyyttistä pilkkomista varten. NS5-proteiini vaa- *1 « J I » * 71 112249 ditaan virusgenomin replikaatiota varten (Chambers, et ai., 1990a).

Lisäksi, useiden soluproteiinien on identifioitu olevan sekaantunut Flaviviridaen replikaatioon. Esimerkik-5 si, solusignaalipeptidaasi entsyymi voidaan vaatia pilkkomaan viruspolypeptidi useissa pilkkomiskohdissa, jolloin otetaan huomioon virusproteaasin ilmentyminen (Hijikata, et ai.).

Inhibiittoreilla, jotka estävät näitä proteiineja 10 suorittamasta niiden vaadittuja toimintoja flavivirusre-plikaatiossa, voi myös olla terapeuttista arvoa hoidettaessa HGV-infektiota.

Yksi yhdiste, jonka tiedetään inhiboivan Flaviviri-dae RNA-riippuvaista RNA-polyproteaasia, jonka analogialla 15 voidaan odottaa inhiboivan HGV:n NS5-proteiinin aktiivisuutta, on nukleotidianalogi l-B-D-ribofuranosyyli-1-2,4-triatsoli, 3-karboksamidi, joka tunnetaan myös ribavi-riinina (Patterson, et ai.). Ribaviriinin toimintamenetelmän uskotaan käsittävän solunsisäisten guaniinivarastojen 20 tyhjentämisen ja sekaantumisen virus-RNA:n peittämiseen (Patterson et ai.).

HCVtllä infektoituneissa yksilöissä merkittäviä vähenemisiä virustiitterissä ja alaniini aminotransferaa-. . sin seerumitasoissa (ALT — indikaattorientsyymi maksan 25 toimintahäiriötä varten) havaittiin, kun ribaviriini an- ··/ nettiin (Reichard, et ai.; Di Bisceglie, et ai., 1992).

Ribaviriinilla näyttää olevan laaja tehokkuus Flaviviri-dae-infektioiden hoitamiseksi, siis, edullisia tuloksia :,i.: odotetaan, kun ribaviriini annetaan yksilöille, jotka kär- : ·* : 30 sivät HGV-johdetusta maksasairaudesta.

Toiseen luokkaan yhdisteitä, joiden tiedetään ole-van tehokkaita Flaviviridae-infektioiden hoitamiseksi, kuuluvat sytokiinit interferoni A, interferoni B ja inter- t feroni γ (Baron, et ai.; Gutterman). Interferonien usko- ’ ’ 35 taan toimivan antiviruksina sekä (i) aiheuttamalla solu- ...· proteiinien ilmentymisen, jotka häiritsevät replikaatiota : ja virus-RNA:iden translaatiota, ja (ii) ihmisen soluim- muunisysteemin komponenttien aktivoinnilla (Baron, et 72 1 12 2 4 9 ai.)· Interferoneilla on laaja käyttökelpoisuus hoitaa virusinfektioita, mukaan lukien infektion HBV:llä, HDVtllä ja HCV:llä (Gutterman; Farci, et ai.). Erityisesti, monenlaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että interferonit, 5 joko yksinään tai yhdistelmässä muiden antivirusterapioi-den kanssa, ovat tehokkaita hoidettaessa infektiota hepatitis C viruksella (Di Bisceglie, et ai., 1989; Kakumu, et ai.). Johtuen sekä selvästä HGV:n hepatotrofisesta luonteesta että sen luokituksesta Flaviviridae-heimossa, HGV-10 infektion voidaan odottaa vastaavan samanlaiseen interfe-roniterapiaan.

Vielä yksi luokka yhdisteitä, joilla on voimakas antivirusaktiivisuus, on virusproteaasi-inhibiittorit (Krausslich, et ai.). Kaikki Flaviviridaet koodaavat ky-15 motrypsiinin kaltaisen seriiniproteaasin, joka vaaditaan pilkkomaan monenlaisia kohtia ei-rakennealueella. Aminohappotähteet, jotka muodostavat tämän proteaasin katalyyttisen kohdan, kuvataan hyvin ja niihin kuuluu histidiini-, asparagiinihappo- ja seriinitähde (Grakoui, et ai.). Lisä-20 tutkimukset flaviviruksesta, keltakuumeviruksesta, ovat osoittaneet, että aktiivisen kohdan seriinitähteen mutaatio inhiboi virusreplikaatiota (Chambers, et ai., 1990b).

HGV NS3-proteiinin inhibiittorit voidaan suunnitel-. la matkimaan entsymaattisen pilkkomisen siirtymätilaa.

'I'..’ 25 Vaihtoehtoisesti, tällaiset inhibiittorit voidaan eristää aikaisemmin syntetisoitujen yhdisteiden massaseulonnalla. Oletetun HGV NS3-proteinaasi-inhibiittoreiden aktiivisuus ··.: voidaan määrittää käyttämällä in vitro transkriptio/trans- laatio-systeemejä, joita käytetään laajasti Flaviviridae-'/· · 30 tutkimuksessa (Hijikata, et ai.; Grakoui, et ai.).

Vaihtoehtoisesti, HGV-genomi voidaan kloonata sopi-”·.. vaan vektoriin eukarioottisen proteiinin ilmentymistä var- ten, kuten bacculovirus tai lehmänrokko, ja yhdisteiden • t tehokkuus voidaan määrittää kudosviljelmäsysteemeissä 35 (Grakoui, et ai.). Samanlaisia lähestymisiä on käytetty onnistuneesti saamaan HIV-proteaasin voimakkaita inhibiit-I toreita (Vacca, et ai.; Roberts, et ai.).

73 1 12 2 4 9

Toinen lähestyminen sairauksien hoitamiseksi, jotka HGV-infektio aiheuttaa, luottaa antisense-oligonukleotidi-en synteesiin (Tonkinson ja Stein) tai oligonukleoti-dianalogeiksi, jotka koodaavat osia tässä keksinnössä esi-5 tetyistä HGV-sekvensseistä. Kuten on totta kaikille Flavi-viridaelle, olisi odotettavissa, että HGV:n genomi on positiivisen säikeen RNA-molekyyli, kooltaan 9-12 kb. Vi-rusgenomin yksisäikeisen luonteen tulisi tehdä HGV erittäin herkiksi antisense-oligonukleotideille. Mahdollisiin 10 kohdesekvensseihin, joita voitaisiin käyttää inhiboimaan virusreplikaatiota, kuuluvat HGV:n 5'-translatoimaton alue, HGV:n ribosomin sitomiskohta tai muut sekvenssit, jotka häiritsisivät HGV-genomin translaatiota.

Antisense-oligonukleotidit voidaan syntetisoida 15 käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia syntetisoijia. Edullisesti oligonukleotidit syntetisoidaan käyttäen fos-foroditioaattirunkoja, joilla on se etu, että ne ovat resistenttejä nukleaasipilkkomiselle (Marshall & Caruthers). Lisäksi voidaan käyttää muita oligonukleotidianalogeja, 20 kuten niitä, joissa on varaukseton tai amidityyppinen runko (Egholm, et ai.). Nämä oligonukleotidit ovat kaupallisesti saatavilla (Biosearch, Millipore, Bedford, MA) ja edullisia siinä, että niiden varauksen puute sallii niiden . . kulkea biologisten membraanien poikki, jotka tyypillisesti • · ’l'.,’ 25 vastustavat varattujen makromolekyylien kulkeutumista.

'···" Oligonukleotidit (tai niiden analogit) antisense- « · · sovelluksia varten ovat pituudeltaan tyypillisesti suurem-pia kuin 8 nukleotidia, jolloin helpotetaan hybridisaatio tiota HGV-genomissa olevaan kohdesekvenssiin. Esimerkiksi ; : : 3 0 DNA-oligomeerien hybridisaation virus-RNA:n kohdesekvens seihin jälkeen hybridisaatiokompleksi voidaan hajottaa soluentsyymillä, kuten RNaasi H: 11a. Pienennys HGV-mallis-sa vähentää siten HGV:hen liittyvän sairauden vakavuutta.

• Edellä kuvattujen terapeuttisten menetelmien käyt- ’ ' 35 tökelpoisuutta ja tehokkuutta voidaan arvioida in vitro käyttäen edellä kuvattuja solusysteemejä, ja in vivo käyt-: täen edellä kuvattuja eläinmallisysteemejä.

• * 74 1 12249

Seuraavat esimerkit havainnollistavat, mutta niiden ei millään tavalla ole tarkoitus rajoittaa tätä keksintöä.

Materiaalit ja menetelmät

Synteettiset oligonukleotidilinkkerit ja alukkeet 5 valmistettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia automatisoituja oligonukleotidisyntetisoijia. Vaihtoehtoisesti, käytäntöön suunnitellut synteettiset oligonukleoti-dit voidaan hankkia kaupallisilta toimittajilta.

Standardi molekyylibiologia ja kloonaustekniikat 10 suoritettiin olennaisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisuissa Ausubel, et ai., Sambrook, et ai., ja Ma-niatis, et ai.

Yleiset manipulaatiot, jotka kuuluvat antiseerumien ja/tai vasta-aineiden käyttöön immunoreaktiivisten prote-15 iiniantigeenien seulomiseksi ja havaitsemiseksi, suoritettiin olennaisesti, kuten kuvataan (Harlow, et ai.). Samalla tavalla ELISA ja Western blot -analyysit antivirusvas-ta-aineiden havaitsemiseksi suoritettiin joko, kuten niiden valmistaja kuvaa (Abbott, N. Chicago, IL, Genelabs 20 Diagnostics, Singapore) tai käyttäen alalla tunnettuja standarditekniikoita (Harlow, et ai.).

Esimerkit

Esimerkki 1 , . PNF2161 cDNA-kokoelmien rakentaminen 25 Ά. RNA:n eristäminen seerumeista ··’ Yksi millilitra laimentamatonta PNF 2161 seerumia ’·*·’ seostettiin lisäämällä PEG (MW 6 000) 8-%:iin ja sentrifu- t goimalla 12K:ssa 15 minuutin ajan mikrofuugissa 4 °C:ssa. RNA uutettiin saadusta seerumipelletistä olennaisesti ku-: i : 30 ten Chomczynski kuvaa.

Pellettiä käsiteltiin liuoksella, joka sisältää 4 M guanidiniumisotiosyanaattia, 0,18-%:ista 2-merkap-toetanolia ja 0,5-%:ista sarkosyyliä. Käsitelty pelletti * > uutettiin useita sertoja happamalla fenoli-kloroformilla, * * 35 ja RNA seostettiin etanolilla. Tätä liuosta pidettiin - » » · 70 °C:ssa noin 10 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin : /. mikrofuugissa 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 100 Miraan DEPC-käsiteltyä (die- * · 75 112249 tyylipyrokarbonaatti) vettä, ja 10 Ml 3 M NaOActa, pH 5,2, kaksi tilavuutta 100-%:ista etanolia ja yksi tilavuus 100-%:ista isopropanolia lisättiin liuokseen. Liuosta pidettiin -70 °C:ssa ainakin 10 minuutin ajan. RNA-pelletti 5 otettiin talteen sentrifugaatiolla mikrofuugissa kierros-nopeudella 12 000 x g 15 minuutin ajan 5 °C:ssa. Pelletti pestiin 70-%:isessa etanolissa ja kuivattiin tyhjössä.

B. cDNA:n synteesi (i) Ensimmäisen säikeen synteesi 10 cDNA-molekyylien synteesi saatiin aikaan seuraavas ti. Edellä kuvattu RNA-valmiste kopioitiin cDNA:hän Gubler et ai. menetelmän mukaisesti käyttäen satunnaisia nukle-otidiheksameerialukkeita (cDNA Synthesis Kit, BMB, Indianapolis, IN tai GIBCO/BRL).

15 Toisen säikeen cDNA-synteesin jälkeen T4 DNA-poly- meraasi lisättiin seokseen maksomoimaan cDNA-molekyylien tylppäpäiden lukumäärä. Reaktioseosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. Reaktioseosta uutettiin fenoli/kloroformilla ja kloroformi-isoamyylialkoholilla.

20 cDNA saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta 100- %:ista etanolia ja jäähdyttämällä -70 °C:ssa 15 minuutin ajan. cDNA otettiin talteen sentrifugoinnilla, pelletti pestiin 70-%:isella etanolilla ja kuivattiin tyhjössä.

. . C. Kaksisäikeisten cDNA-molekyylien amplifikaatio • · t * · ·”/ 25 cDNA-pelletti suspendoitiin uudelleen 12 /xl:aan '···* tislattua vettä. Uudelleensuspendoituihin cDNA-molekyylei- hin lisättiin seuraavat komponentit: 5 μΐ fosforyloituja linkkereitä (Linker AB, kaksisäikeinen linkkeri, joka i · ' koostuu sekvenssistä nro 1 ja sekvenssistä nro 2, jossa 30 sekvenssi nro 2 on 3' -5' orientaatio suhteessa sekvenssiin nro 1 — osittain komplementaarisena sekvenssinä sek-venssille nro 1), 1 μΐ lOx ligaatiopuskuria (0,66 M Tris.-Cl pH 7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10 mM ATP) ja 1 μΐ T4 t · · DNA-ligaasia (0,3 - 0,6 Weiss Units). Tyypillisesti, cDNA : “· 35 ja linkkeri sekoitettiin 1:100 suhteessa. Reaktioseosta ·,,,! inkuboitiin 14 °C:ssa yön yli. Seuraavana aamuna reak- : .·. tioseosta inkuboitiin 70 °C:ssa kolmen minuutin ajan li- gaasin inaktivoimiseksi.

• t 76 112249 100 Miraan 10 mM Tris-Cl puskuria, pH 8,3, joka sisälsi 1,5 mM MgCl2:a ja 50 mM KClra (puskuri A), lisättiin noin 1 μΐ linkkeriligatoitua cDNA-valmistetta, 2 μΜ aluketta, jonka sekvenssi esitetään sekvenssinä nro 1, 200 5 μΜ dATPrtä, dCTPrtä, dGTPrtä ja dTTPrtä kutakin ja 2,5 yksikköä Thermus aquaticus DNA-polymeraasia (Taq-polyme-raasi). Reaktioseosta kuumennettiin 94 °C:seen 30 sekunnin ajan denaturointia varten, annettiin jäähtyä 50 “Crseen 30 sekunnin ajan alukkeen anneloitumista varten, ja sitten 10 kuumennettiin 72 °C:seen 0,5 - 3 minuutin ajan, jolloin sallittiin alukelaajentuminen Taq-polymeraasilla. Amplifi-kaatioreaktio, joka käsittää peräkkäisen kuumennuksen, jäähdytyksen ja polymeraasireaktion, toistettiin vielä 25 - 40 kertaa käyttäen apuna Perkin-Elmer Cetus DNA termistä 15 prosessoria (Mullis; Mullis, et ai.; Reyes, et ai., 1991; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT).

Amplifikaatioreaktioiden jälkeen liuos fenoli/klo-roformi-, kloroformi/isoamyylialkoholiuutettiin ja saos-tettiin kahdella tilavuudella etanolia. Saadut amplifioi-20 dut cDNA-pelletit suspendoitiin uudelleen 20 Miraan TEra (PH = 7,5) .

D. cDNArn kloonaus lambda-vektoreihin cDNAriden rakentamisessa käytetyt linkkerit sisäl-• ,·, sivät EcoRI-kohdan, joka ottaa huomioon suoran amplifioi- '!!.* 25 tujen cDNAriden insertion lambda gtll-vektoreihin (Prome- ga, Madison WI tai Stratagene, La Jolla, CA). Lambda-vek-torit hankittiin valmistajalta (Promega) , jotka vektorit ·.: oli jo digeroitu EcoRIrlla ja käsitelty alkalisella fosfa- taasilla, jolloin poistettiin 5'-fosfaatti ja estettiin : 30 vektorin itseligaatio.

EcoRI-digeroidut cDNA-valmisteet ligatoitiin lambda gtllreen (Promega). Ligatointireaktion olosuhteet olivat seuraavatr 1 μΐ vektoria DNA (Promega, 0,5 mg/ml) ; 0,5 tai 0,3 μΐ PCR-amplifioitua inserttiä cDNA; 0,5 μΐ 10 x ligaa-35 tiopuskuria (0,5 M Tris-HCl, pH=7,8; 0,1 M MgCl2; 0,2 M

1...* DTT; 10 mM ATP; 0,5 mg/ml naudanseerumialbumiinia (BSA)), 0,5 μΐ T4 DNA-ligaasia (0,3 - 0,6 Weiss yksikköä) ja tis-lattua vettä lopulliseen reaktiotilavuuteen 5 μΐ.

77 112249

Ligaatioreaktioseoksia inkuboitiin 14 °C:ssa yön yli (12 - 18 tuntia). Ligatoitu cDNA pakattiin standardimenetelmillä käyttäen lambda DNA pakkaussysteemiä ("GIGA-PAK", Stratagene, LaJolla, CA) ja sitten tehtiin maljavil-5 jelmä erilaisissa laimennoksissa tiitterin määrittämisek si. Standardi X-gal sininen/valkoinen -analyysiä käytettiin määrittämään kokoelmien rekombinanttitiheys (Miller; Maniatis et ai.).

Rekombinaatioprosentti kussakin kokoelmassa määri-10 tettiin myös seuraavasti. Satunnaisten kloonien määrä valittiin ja vastaava faagi-DNA eristettiin. Polymeraasiketjureaktio (Mullis; Mullis, et ai.) suoritettiin sitten käyttäen eristettyä faagi-DNA:ta mallina ja lambda-sek-venssejä, jotka on johdettu lambda-sekvensseistä, joita 15 reunustaa EcoRI-inserttikohta cDNA-molekyyleille, alukkei- na. Insertin läsnä- tai poissaolo oli ilmeistä polyme-raasiketjureaktiotuotteiden geelianalyysistä.

cDNA-insertin faagikokoelmat, jotka muodostuivat seeruminäytteestä PNF 2161, talletettiin American Type 20 Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Dr. , Rockville MD 20852, ja annettiin talletusnimi ATCC 75268 (PNF 2161 cDNA-lähde).

Esimerkki 2 , , Rekombinanttikokoelmien immunoseulonta · 25 Esimerkissä 1 muodostetuista lambda gtll kokoelmis- *···' ta immunoseulottiin PNF 2161 seerumilla tunnistettavan antigeenin tuotanto, josta kokoelmat muodostettiin. Faa- .,*.·* gista tehtiin maljaviljelmä täplän muodostumista varten « ! \ ‘ käyttäen Escherichia coli bakteerin maljaviljelykantaa E.

30 coli KM392. Vaihtoehtoisesti, E. colia Y1090R (promega, Madison WI) voidaan käyttää.

Fuusioproteiinit, jotka ilmennettiin lambda gtll ···, klooneilla, seulottiin seerumivasta-aineilla olennaisesti kuten Ausubel, et ai., kuvaavat.

» *"’· 35 Kustakin kokoelmasta tehtiin maljaviljelmä noin 2 x 104 faagia 150 mm maljaa kohti. Maljat peitettiin nitrosel-: ,·. luloosasuodattimilla yön yli. Suodattimet pestiin TBS:llä (10 mM, Tris pH 7,5; 150 mM NaCl) , suojattiin AIB:llä » · 78 112249 (TBS-puskuri 1-%risen gelatiinin kanssa) ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa, joka laimennettiin 100 kertaa AIBrssä.

TBSrllä pesemisen jälkeen suodttimia inkuboitiin 5 toisella vasta-aineella, vuohi-anti-ihmis-IgG, joka on konjugoitu alkaliseen fosfataasiin (Promega). Reaktiiviset täplät kehittyivät substraatin kanssa (esimerkiksi, BCIP, 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti), NBT:n kanssa (nit-rosininen tetratsoliumsuola (Sigma)). Primaarisesta seulo lonnasta saaduista positiivisista alueista tehtiin malja-viljelmä ja immunoseulottiin, kunnes saatiin puhtaat täplät.

Esimerkki 3 PNF 2161 kokoelman seulonta 15 PNF 2161:n cDNA-kokoelma lambda gtllrssä seulot tiin, kuten esimerkissä 2 kuvataan, PNF 2161 seerumeilla. Seulonnan tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1 PNF2i6l-kokoelmat 20 Kokoelma1 % Vasta- # Seulot- # Kloonit

Rekomb.2 aine3 tu täpläpuh- distettu PNF/RNA 85 PNF 5,5 x 105 4 PNF/RNA 90 PNF 8 X 104 7 f *« I I I - - « i ’· Yhteensä: 11 • ♦ · ....." I I -I·- II·· —""" « > · · 25 1. cDNA-kokoelma, joka on rakennettu osoitetusta ih- mis lähteestä.

* 2. Rekombinanttikloonien prosentti osoitetussa ygtll- kokoelmassa määritettynä sininen/valkoinen-täplä- * * * .... analyysillä ja vahvistettuna satunnaisesti valittu- 30 jen kloonien PCR-amplifikaatiolla.

* : 3. Antiseerumien lähde, jota käytettiin kunkin osoite- tun kokoelman immunoseulontaa varten.

: .·. Yhtä edellä olevalla seulalla eristetyistä kloo- ] ' neista (PNF 2161 klooni 470-20-1, sekvenssi nro 3; B-ga- * > 79 112 2 4 9 laktosidaasi kehyksessä oleva fuusiolla translatoitu sekvenssi, sekvenssi nro 4) käytettiin muodostamaan laajen-nusklooneja, kuten kuvataan esimerkissä 6. Klooni 470-20-1 nukleiinihapposekvenssi esitetään sekvenssinä nro 3 (pro-5 teiinisekvenssi nro 4) . Eristetty nukleiinihapposekvenssi, ilman SISPA kloonauslinkkereitä, esitetään sekvenssinä nro 19 (proteiinisekvenssi nro 20) .

Esimerkki 4

Immunoreaktiivisen 470-20-1 kloonin karakterisointi 10 Ά. Inununoreaktiivisten kloonien Southern blot -ana lyysi

Immunoreaktiivisten kloonien inserteistä seulottiin niiden kyky hybridisoitua seuraaviin kontrolli-DNA:n lähteisiin: normaali ihmisen perifeerisen veren lymfosyytti 15 (hankittu Stanford University Blood Bankista, Stanford,

California) DNA, ja Escherichia coli KM392 genomi-DNA (Au-subel, et ai.; Maniatis, et ai.; Sambrook, et ai.). Kymmenen mikrogrammaa ihmisen lymfosyytti-DNA:ta ja 2 mikro-grammaa E. coli genomi-DNA:ta digeroitiin EcoRI:llä ja 20 HindIII:lla. Restriktiodigerointituotteet fraktioitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä (Ausubel, et ai.) ja siirrettiin nailon- tai nitroselluloosamembraaneihin (Schleicher and Schuell, Keene, NH) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

25 Koettimet immunoreaktiivisista klooneista valmis- t · >·' tettiin seuraavasti. Kukin klooni amplifioitiin käyttäen ‘.V alukkeita, jotka vastaavat lamnda gtll sekvenssejä, jotka reunustavat gtll-vektorin EcoRI-kloonauskohtaa. Amplifi- ί ;ί kaatio suoritettiin polymeraasiketjureaktioilla käyttäen T: 30 kutakin immunoreaktiivista kloonia mallina. Saadut ampli- 4 fikaatiotuotteet digeroitiin EcoRI:lla, amplifioidut fragmentit geelipuhdistettiin ja eluoitiin geelistä (Ausubel, » r · *·;·, et ai.). Saadut amplifioidut fragmentit, jotka johdettiin I * * immunoreaktiivisista klooneista, perusleimattiin sitten > : * 35 satunnaisesti käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa *,,,· kokoonpanoa (BMB) , joka käyttää 32P-dNTP: itä.

; Satunnaisesti pohjustetut koettimet hybridisoitiin sitten edellä valmistettuun nailonmembraaniin inserttisek- t 4 so 112249 venssien hybridisaation kontrolli-DNA:ihin testaamiseksi. 470-20-1 insertti ei hybridisoitunut minkään kontrolli-DNA: n kanssa.

Positiivisina hybridisaatiokontrolleina käytettiin 5 koetinjohdannaista ihmisen C-kappageenifragmentista (Hie-ter) yksittäisenä geenikopiokontrollina ihmisen DNA:ta varten ja E. coli polymeraasin geenifragmenttia käytettiin samalla tavalla E. coli DNA:ta varten.

B. Genominen PCR

10 PCR-havaitseminen kehitettiin ensin varmistamaan eksogeenisyys mitä tulee useisiin genomisiin DNA:ihin, jotka olisi voitu epähuomiossa kloonata kokoelman rakentamisen aikana, sitten testaamaan kloonatun sekvenssin läsnäolo kloonauslähteessä ja läheisissä näytemateriaaleissa.

15 Usean eri tyypin näytteitä testattiin, mukaan lukien SIS-PA-amplifioidut nukleiinihapot ja nukleiinihapot, jotka uutettiin primaarisesta lähteestä, ja nukleiinihapot, jotka uutettiin läheisistä lähdemateriaaleista (esim. eläin-siirtotutkimuksista).

20 Termi "genominen PCR" viittaa spesifisten sekvens sien läsnäolon testaamiseen relevanteista organismeista saadussa genomisessa DNA:ssa. Esimerkiksi, genominen PCR Mystax-johdettua kloonia varten käsittäisi genomiset DNA:t seuraavasti: 25 1. Ihmisen DNA (1 μg/rxn.) "I* 2. Mystax DNA (0,1 - 1 μg/rxn.) 3. E. coli (10 - 100 ng/rxn.) ,,!!* 4. Hiiva (10 - 100 ng/rxn.) ‘ : ϊ Ihmisen ja Mystax DNA:t testataan, välittömänä ja Γ·’; 30 äärimmäisenä lähteenä aineelle. E. coli genominen DNA tes- » tataan, kaupallisten entsyymivalmisteiden yleinen konta-minantti. Myös hiiva testataan, kaikkialla läsnä olevana ' * * ,*, organismina, jonka DNA voi kontaminoida reagenssit ja si ten kloonautua.

« ’ ‘ 35 Lisäksi, negatiivinen kontrolli (so. vain puskuri tai vesi) ja positiiviset kontrollit, jolloin sisältyy ; noin 105c/rxn., amplifioidaan myös.

i ! * ei 112249

Amplifikaatioolosuhteet vaihtelevat, kuten voidaan määrittää yksittäisille sekvensseille, mutta seuraavat läheisesti seuraavaa standardi PCR-menettelyä: PCR suoritettiin reaktioseoksissa, jotka sisälsivät 10 mM Tris, pH 5 8,3, 50 mM KC1, 1,75 mM MgCl2, 1,0 μΜ kutakin aluketta, 200 μΜ dATP:tä, dCTPrtä ja dGTPttä kutakin, ja 300 μΜ dUTP:tä, 2,5 yksikköä Taq DNA-polymeraasia ja 0,2 yksikköä urasii-li-N-glykosylaasia 100 pilaa reaktioseosta kohti. Prosessi oli ainakin 1 minuutin ajan 94 °C:ssa, minkä jälkeen 30 -10 40 denaturoinnin (92 - 94 °C 15 sekunnin ajan), anneloin- nin (55 - 56 °C 30 sekunnin ajan) ja laajennuksen (72 °C 30 sekunnin ajan) toistoa. PCR-reagenssit koottiin ja amplif ikaatioreaktiot muodostettiin erityisesti suunnitellussa laboratoriossa, joka pidettiin vapaana amplifioidusta 15 DNArsta.

Lisäesteenä kontaminaatiolle amplifioiduilla sekvensseillä ja siten kokeen kompromissina "väärillä positiivisilla", PCR suoritettiin dUTPillä korvaten TTP, jotta saadaan amplifioituja sekvenssejä, jotka ovat biokemialli-20 sesti erotettavissa luontaisesta DNArsta. Jotta tehtiin entsymaattisesti amplifioitumattomaksi mikä tahansa konta-minoiva PCR-tuote, entsyymi urasiili-N-glykosylaasi, sisällytettiin kaikkiin genomisiin PCR-reaktioihin. Lämpöni : prosessin lopettamisen jälkeen reaktioseoksia pidettiin 25 72 °C:ssa urasiili-N-glykosylaasin renaturaation ja mah- ; dollisen amplifioitujen U-sisältävien sekvenssien hajoami- sen estämiseksi.

» "HOT START PCR" suoritettiin käyttäen standardi tekniikoita ("AMPLIWAX", Perkin-Elmer Biotechnology; vaih-' ’ 30 toehtoisesti käytettiin manuaalitekniikoita), jotta teh tiin edellä oleva menettely vahvemmaksi erilaisten sekvenssien amplifikaatiota varten, jotka ideaalisesti vaati-· vat erilaisia amplifikaatio-olosuhteita maksimaalista herkkyyttä ja spesifisyyttä varten.

.*·. 35 Amplifioidun DNA:n havaitseminen suoritettiin hyb- '·’ ridisaatiolla spesifisiin oligonukleotidikoettimiin, jotka :.i : sijaitsivat kahden PCR-alukesekvenssin sisällä ja joilla ei ollut lankaan tai minimaalinen limittyminen alukkeiden 82 112249 kanssa. Joissakin tapauksissa elektroforesoitujen PCR-tuotteiden suora visualisointi suoritettiin käyttäen eti-diumbromidifluoresenssia, mutta myös koetinhybridisaatio suoritettiin kussakin tapauksessa, jolloin autettiin var-5 mistamaan ero spesifisten ja ei-spesifisten amplifikaa-tiotuotteiden välillä. Hybridisaatiota radioleimattuihin koettimiin liuoksessa seurasi elektroforeesi 8- - 15- % lisissä polyakryyliamidigeeleissä (kuten sopivaa amplifi-oidun sekvenssin koolle) ja autoradiografia.

10 Klooni 470-20-1 testattiin genomisella PCRillä ih misen, E. colin ja hiivan DNA:itä vastaan. Spesifistä sekvenssiä ei havaittu negatiivisissa kontrollireaktioissa, eikä missään testatussa genomisessa DNA:ssa, ja 105 kopiota DNA/reaktiosta johti helposti havaittavaan signaaliin.

15 Tämä herkkyys (so. 105/reaktio) on riittävä yksittäisen kopion ihmissekvenssien havaitsemiseksi reaktioissa, jotka sisältävät yhteensä 1 μg DNA:ta, joka edustaa DNA:ta noin 1,5 x 105 solusta.

C. Suora seerumi-PCR

20 Seerumi tai muut kloonauslähde- tai läheiset lähde materiaalit testattiin suoraan PCR:llä käyttäen alukkeita valituista kloonatuista sekvensseistä. Näissä kokeissa HGV-viruspartikkelit saostettiin suoraan seerumeista poly-i \ etyleeniglykolilla (PEG) tai, PNF:n ja tiettyjen muiden :25 seerumien tapauksessa, pelletoitiin ultrasentrifugoinnil- * ► · • la. RNA:n puhdistamiseksi pelletoidut materiaalit liuotet- tiin guanidiniumtiosyanaattiin ja uutettiin happogu-’·, anidiniumfenolitekniikalla (Chomczynski, et ai.).

,1! Vaihtoehtoisesti, tämän menetelmän modifikaatio, 30 joka saatiin ja toteutettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja, esim. "TRIREAGENT" (Molecu-: ” lar Research Center, Cincinnati, OH) tai "TRIZOL" (Life

Technologies, Gaithersburg, MD), ja siihen liittyviä me-nettelyjä käytettiin eristämään RNA. Lisäksi, RNA, joka on ,··. 35 sopiva PCR-analyysiä varten, eristettiin suoraan seerumis- ’·' ta ja muista nesteistä, jotka sisälsivät viruksen, ilman : aikasempaa väkevöintiä tai viruspartikkelien pelletointia, „ 112249 83 käyttämällä "PURESCRIPT"-reagensseja ja menettelyjä (Gent-ra Systems, Minneapolis, MN).

Eristettyä DNA:ta käytettiin suoraan mallina PCR:lle. RNA käänteiskopioitiin käyttäen käänteistran-5 skriptaasia (Gibco/BRL), ja cDNA-tuotetta käytettiin sitten mallina myöhemmälle PCR-amplifikaatiolle.

470-20-l:n tapauksessa nukleiinihappoa PNF-seerumin 20 - 50 μ1:η ekvivalentista käytettiin syöttömallina kuhunkin RT-PCR- tao PCR-reaktioon. Alukkeet suunniteltiin 10 perustuen 470-20-1 sekvenssiin seuraavasti: 470-20-1-77F

(sekvenssi nro 9) ja 470-20-1-211R (sekvenssi nro 10). Käänteiskopiointi suoritettiin käyttäen MMLV-RT:tä (Gibco/BRL) ja satunnaisia heksameerejä (Promega) inkuboimalla huoneenlämpötilassa noin 10 minuutin ajan, 42 °C:ssa 15 15 minuutin ajan ja 99 °C:ssa 5 minuutin ajan, jäähdyttäen nopeasti 4 °C:seen. Syntetisoitu cDNA amplifioitiin suoraan, ilman puhdistusta, PCR:llä, reaktioissa, jotka sisälsivät 1,75 mM MgCl2:a, 0,2 - 1 μΜ kutakin aluketta, 200 μΜ dATP:tä, dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä kutakin, ja 2,5 -20 5,0 yksikköä Taq DNA-polymeraasia ("AMPLITAQ", Perkin-El- mer) 100 μΐ reaktiota kohti. Prosessi oli ainakin yksi minuutti 94 °C:ssa, minkä jälkeen 40 - 45 denaturoinnin (94 °C 15 sekunnin ajan 10 sykliä; 92 °C tai 94 °C 15 se-kunnin ajan seuraavien syklien ajan) , anneloinnin (55 °C 25 30 sekunnin ajan) ja laajennuksen (72 °C 30 sekunnin ajan) , ,·, toistoa, "GENEAMP SYSTEM 9600" lämpösyklilaitteessa (Per- ' j kin-Elmer) tai verrattavat prosessiolosuhteet muissa läm- pösyklilaitteissa (Perkin-Elmer; MJ Research, Watertown, MA).

30 Positiiviset kontrollit koostuivat (i) aikaisemmin amplifioidusta PCR-tuotteesta, jonka pitoisuus arvioitiin • ·· käyttäen Hoechst 33258 fluoresenssianalyysiä, (ii) puhdis- : : : tetusta plasmidista, joka sisälsi kiinnostavan DNA-sek- (<*5; venssin, tai (iii) puhdistetuista RNA-kopioista, jotka on ... 35 johdettu plasmidiklooneista, joissa kiinnostava DNA-sek- T venssi järjestetään käyttäen faagin RNA-promoottoreiden, ;,· · kuten T7, T3 tai SP6, transkriptionaalista kontrollia ja :··: RNA:ta, joka on valmistettu käyttäen kaupallisesti saata- 84 112249 villa olevaa in vitro transkriptiokokoonpanoa. Lisäksi, positiivisen kontrolli-DNA:n erä, joka vastaa noin 10 -100 kopiota/rxn., voidaan varustaa reaktioihin, jotka sisältävät nukleiinihappoja, jotka uutetaan kloonausläh-5 denäytteestä, kontrollina DNA-amplifikaatioreaktioiden inhibiittoreiden läsnäololle. Kukin erillinen uute testattiin ainakin yhdellä positiivisella kontrollilla.

Spesifiset tuotteet havaittiin hybridisaatiolla spesifiseen oligonukleotidikoettimeen 470-20-1-152F (sek-10 venssi nro 16) spesifisyyden varmistamiseksi. 10 μ1:η PCR- tuotetta hybridisaatio suoritettiin liuoksessa 20 μ1:η reaktioissa, jotka sisälsivät noin 1 x 106 cpm 32P-leimat-tua 470-20-l-152F:a. Spesifiset hybridit havaittiin elektroforeettisen erotuksen hybridisoimattomasta oligosta 15 polyakryyliamidigeeleissä, ja autoradiografiän jälkeen.

PNF:n lisäksi normaalista seerumista saadut uutetut nukleiinihapot myös käänteiskopioitiin ja amplifioitiin käyttäen ,,seerumi-PCR"-menettelyjärjestystä. Signaalia ei havaittu normaalissa ihmisen seerumissa. Spesifinen sig-20 naali PNF-seerumissa havaittiin toitettavasti monenlaisissa uutteissa 470-20-1 spesifisten alukkeisen kanssa.

D. Amplifikaatio SISPA kloonaamattomista nukleiinihaposta ; SISPA (Sequence-Independent Single Primer Amplifi- : 2 5 cation) amplifioitua cDNA:ta käytettiin malleina (esimerk- : ki 1) . Sekvenssispesifisiä alukkeita, jotka on suunniteltu •j. valituista kloonatuista sekvensseistä, käytettiin amplifi- , .·. oimaan kiinnostavia DNA-fragmentteja malleista. Tyypilli- ;*, sesti, mallit olivat SISPA-amplifioituja näytteitä, joita 30 käytettiin kloonausmanipulaatioissa. Esimerkiksi, amplifi-kaatioalukkeet 470-20-1-77F (sekvenssi nro 9) ja 470-20-1-: ” 211R (sekvenssi nro 10) valittiin kloonin 470-20-1 sek- * venssistä (sekvenssi nro 3). Näitä alukkeita käytettiin :··· amplifikaatioreaktioissa SISPA-amplifioidun PNF2161 cDNA:n 35 kanssa mallina.

Amplifioitujen DNA-fragmenttien identiteetti var-: niistettiin (i) hybridisaatiolla spesifisen oligonukleoti- ' ‘ dikoettimen 470-20-1-152F kanssa (sekvenssi nro 16), joka 85 112 2 4 9 oli suunniteltu perustuen 470-20-1 sekvenssiin (sekvenssi nro 3) ja/tai (ii) koolla. Koetin, jota käytettiin DNA-täplän havaitsemista varten, leimattiin digoksygeniinillä käyttäen päätetransferaasia valmistajan suositusten mukai-5 sesti (BMB). Hybridisaatio amplifioituun DNA:han suoritettiin sitten käyttäen joko Southern blot tai nestehybri-disaatioanalyysejä (Kumar, et ai., 1989).

Positiivisen kontrollin DNA, jota käytettiin ampli-fikaatioreaktioissa, oli aikaisemmin amplifioitu PCR-tuo-10 te, jonka pitoisuus arvioitiin Hoechst 33258 fluoresens-sianalyysillä, tai vaihtoehtoisesti puhdistettu plasmidi-DNA, joka sisälsi kiinnostavat kloonatut insertit.

470-20-1 spesifinen signaali havaittiin cDNAissa, joka oli amplifioitu PCRrllä, SISPA-amplifioidusta 15 PNF2161:stä. Negatiivisen kontrollin reaktiot olivat ei-reaktiivisia, ja positiivisen kontrollin DNA-mallit havaittiin.

E. Amplifikaatio maksan RNA-näytteistä RNA valmistettiin maksan näytemateriaalista seura-20 ten Cathal, et ai., menetelmiä, joissa kudosta uutettiin 5 M guanidiinitiosyanaatissa, minkä jälkeen RNA saostettiin suoraan 4 M LiCl:lla. Kun RNA-pelletti oli pesty 2 M LiCl:lla, jäljelle jäävä kontaminoiva proteiini poistet-tiin uuttamalla fenoli:kloroformilla ja RNA otettiin tal-25 teen etanolisaostuksella.

470-20-1-spesifisiä alukkeita käytettiin myös amp-lifikaatioreaktioissa seuraavien RNA-lähteiden ollessa ’ substraattina: normaali mystax maksan RNA, normaali silk- kiapinan (Sanguinus labiatus) maksan RNA ja MY131 maksan ·’ ’ 30 RNA. MY131 on mystax, joka siirrostettiin laskimonsisäi sesti 1 ml:11a PNF 2161 plasmaa. Oli olemassa ilmeisiä I ’·* maksan entsyymin (SCID) kohoamia ja histologinen todiste v : ilmeisestä virusinfektiosta. Histologinen korrelaatio oli ilmeisin MY131:n maksassa, jonka maksa saatiin SCID-aktii-

< I

>.·, 35 visuuden huipussa tai sen lähellä. Mystax 131 maksan RNA

‘‘ ei antanut amplifioituja tuotteita HCV:n ei-koodaavien ; alukkeiden kanssa (sekvenssi nro 7 ja sekvenssi nro 8) .

86 112249

Amplifikaatioreaktiot suoritettiin duplikaattina kahdelle kokeelle. Näiden amplifikaatioreaktioiden tulokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2 5 PCR 470-20-l-alukkeiden kanssa

Koe 1 Koe 2

AB A B

Normaali My maksan RNA - -

Normaali silkkiapinan mak- - -

san RNA

10 My131 maksan RNA + + + + PNF 2161 ++ ++ ++ ++ Nämä tulokset osoittavat, että 470-20-1 sekvenssit ovat läsnä kantaseeruminäytteessä (PNF 2161) ja maksan 15 RNA-näytteessä PNF 2161 näytteen (MY131) siirtoeläimestä. Kuitenkin molemmat kontrolli-RNA:t olivat negatiivisia 470-20-1 sekvenssien läsnäololle.

F. Seerumipaneelin seulonta HGV-sekvensseille polymeraasiketjureaktiolla käyttäen RNA-malleja 20 1. Suuren ALT:n luovuttajat

Sairausyhteys HGV:n ja maksasairauden välillä arvi-, .·. oitiin hepatiittipotilailta ja verenluovuttajilta, joilla on epänormaali maksan toiminta, saatujen seerumien polyme-raasiket jureaktioseulonnalla, käyttäen HGV-spesif isiä > · » ;;; 25 alukkeita. Jälkimmäinen koostui verilahkjoituksista saa- '·’ dusta seerumista, seerumin ALT-tasojen ollessa suurempia kuin 45 kansainvälistä yksikköä (IU) ml:aa kohti.

; *·· Valittiin seerumipaneeli, joka koostui 152 kokoin ·* naisseerumista. Seuraavat seerumit valittiin seerumipanee- 30 lia varten: 104 suuren ALT:n seerumit seulotuista verilah-... joituksista Stanford University Blood Bankista (SUBB) ; 34 N-(ABCDE) hepatiittiseerumia Pohjois-Kaliforniasta, Egyp-·,· · tistä ja Perusta; ja 14 seerumia muilta luovuttajilta, joilla epäillään olevan maksasairaus ja/tai hepatitisvi- 87 1 12249 rusinfektio. Negatiiviset kontrollit paneelille olivat seuraavat: 9 hyvin seulottua verenluovuttajaa (SUBB), joille on huomattavaa virusinfektioiden riskitekijöiden poissaolo ("supernormaalit" seerumit, esim. O-negatiivi-5 nen, Rh-negatiivinen; negatiivinen HIV:lie, tunnetuille hepatiittiaineille ja CMV:lle; jonka monet aikaisemmat verilahjoitukset on siirretty ilman sairauden aiheutumista) ; ja 2 satunnaista verenluovuttajaa. Näistä seerumeista analysoitiin HGV-spesifisten sekvenssien läsnäolo RT-10 PCRrllä käyttäen 470-20-1 alukkeita 77F (sekvenssi nro 9) ja 211R (sekvenssi nro 10).

RNA-uutto ja RT-PCR suoritettiin olennaisesti kuten esimerkissä 4C kuvataan paitsi, että aluke 470-20-1-211R 5'-biotinyloitiin helpottamaan nopeaa amplifioitujen tuot-15 teiden seulontaa menetelmällä, joka käsittää hybridisaati-on liuoksessa, minkä jälkeen hybridisoidun koettimen af-finiteettikaappauksen käyttäen streptavidiini-päällystet-tyjä paramagneettisia helmiä. Menetelmiä nukleiinihappojen analyysiä varten hybridisaatiolla spesifisiin leimattuihin 20 koettimiin hybridisoitujen sekvenssien sieppauksella af-finiteettivuorovaikutusten kautta tunnetaan hyvin nukle-iinihappoanalyysin alalla.

Riippuen testaukseen käytettävissä olevan seerumin i määrästä RNArta 30 - 50 ^l:sta seerumia käytettiin RT/PCR- 25 reaktiota kohti. Kukin seerumi testattiin duplikaattina, : positiivisten kontrollien kanssa, jotka vastasivat 10, 100 ·;· tai 1000 kopiota RNA-kopiota reaktiota kohti, ja sopivilla • i · « . negatiivisilla (puskuri) kontrolleilla. Mikään negatiivi- • * · nen kontrolli ei ollut reaktiivinen, ja ainakin 10 kopiota 30 reaktiota kohti oli havaittavissa kussakin PCR-ajossa.

,, Epämääräiset tulokset määriteltiin spesifisenä hybri- 't>> disointisignaalina, joka on läsnä vain yhdessä kahdesta • I » ’ suplikaattireaktiosta.

Tämän seerumipaneelin amplifikaatioanalyysistä saa-35 tujen tuotteiden tehokas, erittäin herkkä analyysi suori-,tettiin käyttäen laitetta, joka oli erityisesti suunnitel-; tu af f initeettipoh jäiseen hybridikaappaukseen käyttäen elektrokemiluminenssin oligonukleotidikoettimia (QPCR Sys- 88 112249 tem 5000 ™, Perkin-Elmer). Analyysit käyttäen QPCR 5000 ™:a on kuvattu (DiCesare, et al.; Wages, et al.).

Kunkin reaktion tuotteet analysoitiin hybridisaa-tiolla koettimeen 470-20-1-152F (5'-pääleimattu elektroke-5 miluminensoivalla ruteniumkelaatilla), ja mittauksella käyttäen "QPCR 5000:ta". Perustuen keskiarvon ja kolmen kerran summan rajaan negatiivisten kontrollien keskihajonta annetussa amplifikaatioajossa, yhteensä 34 mahdollista positiivista, valittiin varmistustestausta varten.

10 34 näytettä analysoitiin liuoshybridisaatiolla ja elektroforeesilla (esimerkki 4C) . Näistä 34 näytteestä kuudella seerumilla (so. 6/152) osoitettiin olevan spesifisiä hybridisointisekvenssejä duplikaattireaktioissa. Näistä kuudesta näytteestä kolme oli vahvasti reaktiivisia 15 vertailulla positiivisten kontrollien kanssa: yksi suuren ALT:n seerumi SUBB:stä ja kaksi N-(ABCDE) seerumia Egyptistä.

Toinen verinäyte saatiin erittäin positiiviselta SUBB seeruminluovuttajalta vuoden kuluttua alkunäytteen 20 otosta. Toisen seeruminäytteen vahvistettiin olevan HGV-positiivinen edellä kuvatuilla PCR-menetelmillä. Tämä tulos varmistaa pysyvän infektion HGV:llä ihmsessä. Seerumi merkittiin "JC:ksi". Lisäksi, seerumiluovuttaja oli HCV-: negatiivinen (määritetty seroreaktiivisuuskokeilla ja 25 PCR:llä) ja vasta-aine negatiivinen HAV:lle ja HBV:lle.

: Lisäksi, kolmannen N-(ABCDE) seerumin Egyptistä, ··· Pohjois-Kalifornian verenluovuttajan, jolla oli N-(ABCDE)

IKI

. hepatiitti, ja N-(ABCDE) hepatiittiseerumin osoitettiin myös olevan heikosti positiivisia tällä menetelmällä. Kah-30 desta muusta seerumista saatiin epämääräiset tulokset, jotka määriteltiin spesifisten sekvenssien läsnäolona yhdessä kahdesta amplifikaatioreaktiosta.

* Myöhempi näistä HGV-positiivisista ja epämääräisis- :**! tä seerumeista saatujen replikaattiseerumierien PCR-ana- 35 lyysi johti HGV-positiivisiin tuloksiin kuudessa kahdek- , sasta testatusta seerumista ja epämääräisiin tuloksiin < » · ; kahdessa jäljelle jääneessä seerumissa.

89 112249

Toista alukesarjaa käytettiin HGV-positiivisten näytteiden varmistamiseksi. Tämä alukesarja (GV57-4512MF, sekvenssi nro 121, ja GV57-4657MR, sekvenssi nro 122) diagnostista amplifikaatiota varten valittiin HGV:n säily-5 neestä alueesta, joka johdettiin oletetusta NS5-koodaus-alueesta. Noin 2,2 kb:n fragmentti amplifioitiin kustakin viidestä erillisestä HGV-isolaatista. Amplifikaatioreakti-oita varten käytetyt alukkeet olivat 470EXT4-2189R (sekvenssi nro 119) ja 470EXT4-29F (sekvenssi nro 120). Ampli-10 fioidut DNA-fragmentit sekvensoitiin ja sekvenssit ryhmitettiin. Hyvin säilyneet alueet identifioitiin ryhmittymästä ja suunniteltiin optimaaliset alukesekvenssit, jotka sisälsivät sekaemässynteesin niissä asemissa, jotka säilyivät erilaisina läpi koko viiden sekvenssin. Saadut NS5-15 alukkeet olivat seuraavat: GV57-4512MF, sekvenssi nro 121, ja GV57-4657MR, sekvenssi nro 122. Näitä alukkeita käytettiin amplifioimaan diagnostinen 165 emäsparin fragmentti koenäytteistä.

Sisäinen koetinsekvenssi, GV22dc-89MF (sekvenssi 20 nro 123), johdettiin toisesta hyvin säilyneestä alueesta spesifisesti amplifioidun tuotteen havaitsemista varten. Koetin on myös riittävän pitkä sallimaan minimaalisesti erilaisten HGV-sekvenssien havaitsemisen alennetuissa an- » · : karuusolosuhteissa.

2 5 Näytteiden analyysi mitä tulee diagnostisen NS5- : : : sekvenssin läsnäoloon, minkä jälkeen samat olosuhteet *· näytteen valmistusta, amplif ikaatiota ja nestehybridisaa- ; ;1. tiota varten, kuten on kuvattu 470-20-1 alukkeille (esi- * 1 · j··.·. merkki 4C) . Tulosten yhtäpitävyys PCRrllä analysoiduille 30 seeruminäytteille käyttäen sekä 470-20-1- että NS5-aluke-pareja esitetään taulukossa 3.

• t · » · 90 1 12249

Taulukko 3 NS5-alue 470-20-1 alukepari alukepari + - Epamaa- (GV57) rainen + 71 0 1 6 13 2 epämää- 210 räinen 5

Lisäerien, jotka saatiin kahdeksasta seerumista, jotka identifioitiin edellä HGV-positiivisiksi, lisä PCR-analyysit suoritettiin käyttäen 470-20-1 alukesarjaa (sekvenssi nro 9 ja sekvenssi nro 10) ja NS5-alukesar jaa.

10 Näissä määrityksissä HGV:n PCR-analyyseistä saatiin jatkuvasti positiivisia tuloksia viidessä kahdeksasta seerumista. Nämä tulokset esitetään taulukossa 4.

Vastakohtana, yksikään kahdesta satunnaisluovutta-jasta tai yhdeksästä hyvin seulostusta "supernormaalista" 15 seerumista ei ollut positiivinen kummassakaan PCR-ana-lyysien sarjassa.

Nämä tulokset vahvistavat sairausyhteyttä HGV:n ja I » · maksasairauden välillä.

, Taulukko 4 20 Näyteryhmä Testettujen luku- Positiivisten , ·,: määrä lukumäärä *' ’ Suuren ALT:n 104 1 luovuttaja

Ei-ABCDE, muu 48 4 ? · · _

Normaali luovut- 2 0 ... 25 taja t « . \ "Supernormaali" 9 0 ·;·*:' Yhteensä 163 5 9l 112249

Suuren ALT:n luovuttajilta saatujen seerumien lisä-testauksesta on saatu seuraavat tulokset. Yhteensä 495 seerumia on testattu, edellä kuvatun 104 seerumin alkuperäisen paneelin lisäksi. Näistä 495 näytteestä kuusi iden-5 tifioitiin HGV-positiivisiksi käyttäen alukeparia 470-20-1-77F (sekvenssi nro 9) ja 470-20-1-211R (sekvenssi nro 10). Näillä kuudella seerumilla on seuraavat HCV-profii-lit: R25342, HCV-negatiivinen; R17749, HCV-positiivinen; J53171, HCV-positiivinen, HBV-positiivinen; J54406, HCV-10 negatiivinen; R08074, HCV-negatiivinen; ja X31049, HCV-negatiivinen. Positiiviset pisteet perustuivat toistuvaan reaktiivisuuteen ainkin kahdessa erillisessä reaktiossa. R25342 testattiin ja vahvistettiin positiiviseksi PCRrllä käyttäen NS5-alukeparia. Siis, noin 1,2-%:n havaitsemisas-15 te on havaittu (7 599:stä testatusta).

Verenluovuttajilta, joilla on kohonnut ALT, juuri saadut plasmanäytteet saatiin myös SUBB:stä, Peninsula Blood Bank (Burlingame, CA) ja New York Blood Center (New York, NY), HGV RNA:n testaamiseksi PCR:llä (470-20-1 alu-20 kepari). 214:sta testatusta kokonaislahjoituksesta yhteensä viisi (noin 2,3 %) oli HGV RNA positiivisia. Näillä viidellä seerumilla on seuraavat HCV-profiilit: T55806, HCV-positiivinen; T55875, HCV-negatiivinen; T56633, HCV- .! i negatiivinen; R38730, HCV-negatiivinen; ja 3831781, HCV- « * ♦ ,,,ί 25 negatiivinen. Myöhemmät lahjoitukset kahdelta näistä luo- ; vuttajista, T55806 ja T55875, olivat myös HGV RNA positii- ··· visia. T55806, T55875 ja T56633 testattiin ja varmistet-

< M I

tiin positiivisiksi PCR:llä käyttäen NS5-alukeparia.

2. Hyväksyttyjen verenluovuttajien seulonta * · 30 HGV:n yleisyyden normaalissa verenluovuttajapopu- laatiossa arvioimiseksi seerumi otettiin talteen seulotuista verenluovuttajista verensiirtoa varten SUBB:ssä.

·' ' Yhteensä 968 näytteestä, jotka edustivat 769 ainutlaatuis- :"! ta luovuttajaa, testattiin HGV:n RNA. Näytteet seulottiin s'**: 35 PCR:llä käyttäen 470-20-1 alukeparia.

, Yhteensä 16 seerumilla identifioitiin olevan ha- ; väittävä HGV RNA. Näistä kuusi edustaa duplikaatteja kol melta luovuttajalta, joten yhteensä 13 ainutlaatuista luo- 92 112249 vuttajaa 759:stä testatusta oli HGV-positiivisia RNA PCRrllä. Kaikki positiiviset näytteet testattiin ja vahvistettiin positiivisiksi PCR:llä käyttäen NS5-alukeparia. Näille luovuttajille on tunnusomaista normaalit ALT-tasot, 5 samoin kuin muuten normaali serologia. Siis, noin 1,7 % testatuista seerumeista normaalissa verenluovuttajapopu-laatiossa on HGV-positiivisia. Siksi, HGV:n läsnäolo havaittiin sekä hyväksytyissä että hylätyissä verenluovuttajissa.

10 3. Näytteet lukuisista maantieteellisistä paikoista HGV-infektion läsnäolo hepatiittipotilaiden populaatioissa maantieteellisesti laajalle levinneistä lähteistä analysoitiin PCR:llä. PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti, kuten kuvataan esimerkissä 4C, käyttäen 470-15 20-1 PCR-alukepareja. Testattiin seeruminäytteet Egyptis tä, Kreikasta, Australiasta (katso esimerkki 4F-4), Perusta, Englannista, Italiasta, Saksasta, Etelä-Koreasta, Yhdysvalloista ja Japanista. HGV RNA oli havaittavissa kaikkien testattujen populaatioiden alasarjoissa.

20 4. Verensiirron jälkeen seuraava HGV-infektio ja parenteraalinen kulkeutuminen HGV RNA havaittiin useissa verensiirron jälkeisissä hepatiittitapauksissa (japanilaista ja eurooppalaista ai- *· * * kuperää olevat sisällytettiin esimerkkiin 4F-3) . Yhteensä >"/· 25 neljästä tapauksesta, yksi Japanista, kaksi Yhdysvalloista

; ja yksi Australiasta, analysoitiin monia aikapisteitä HGV

• |* RNA:n läsnäolon vuoksi. Kolmelle näistä tapauksista (i) , ennen verensiirtoa olevat näytteet oli saatavilla, jolloin :·, muodostettiin potilaan aikaisempi HGV-tila, ja (ii) näyt- 30 teet oli saatavilla yksilöllisiltä verenluovuttajilta niille kolmelle tapaukselle, jolloin muodostettiin luovut- ! · • ta jän HGV-tila.

·’ ' Ensimmäinen tapaus oli japanilainen potilas, joka ;· oli saanut verensiirron 2.12.80. Verensiirron jälkeen po- ; 35 tilaalle kehittyi ei-B ei-C hepatiitti. Yhteensä viidestä ,·, seerumista tästä potilaasta testattiin HGV RNA PCRrllä » < * '· ; käyttäen 470-20-1-alukeparia. HGV RNA oli havaittavissa ’ * noin 2 viikosta 8 kuukauteen verensiirron jälkeen. Näyte, 93 1 12249 joka otettiin yli 1 vuoden kuluttua verensiirrosta, oli epämääräinen (so. positiivinen vain toisessa duplikaatti-reaktiossa) . Verensiirtoa edeltävää näytettä ei ollut saatavissa testausta varten.

5 Tapaukset BIZ ja STO (taulukot 5 ja 6, vastaavasti) olivat mahdollisesta sydänleikkaustutkimuksesta (Alter, et ai., 1989), joka johdettiin NIHrssä. Kullekin näistä potilaista verensiirtoa edeltävät seerumit oli saatavissa ja niiden määritettiin olevan negatiivisia HGV RNA:lle 10 PCR:llä käyttäen 470-20-1-alukeparia. BIZ osoittautui positiiviseksi HGVRNA:lie ensimmäisestä päivästä verensiirron jälkeen viikkoon 198 asti verensiirron jälkeen. Yhdeksästä verenluovuttajasta BIZ:lie kahden kahdeksasta testatusta todettiin olevan HGV-positiivisia. STO osoit-15 tautui positiiviseksi HGV RNA:lie viikosta 5 verensiirron jälkeen viikkoon 92 asti verensiirron jälkeen.

Taulukko 5

Verensiirtoon liittyvä HGV:n kulkeutuminen: Tapaus

BIZ

20 Veren otto- Aika ALT (IU/l) 470 PCR tu- päivä los 30.10.78 -4 vrk 23 1.11.78 -1 vrk 31 3.11.78 +1 vrk 29 + i * 25 17.11.78 +2 vko 51 + ;j;r 22.3.79 +20 vko 135 + 28.6.79 +34 vko 133 + 6.4.81 +127 vko 141 + ' t » --------- “ —I.— — - " » 1 ’ 20.8.82 +198 vko 39 + 30 »

‘ * t * t . I ! I

94 112249

Taulukko 6

Verensiirtoon liittyvä HGV:n kulkeutuminen: Tapaus

STO

Veren otto- Aika ALT (IU/1) 470 PCR tu- 5 päivä los 15.6.83 -1 vrk 23 18.7.83 +5 vko 80 + 31.10.83 +20 vko 75 + 31.12.83 +28 vko 30 + 10 2.1.85 +81 vko 90 20.3.85 +92 vko 23 +

Neljäs tapaus, myös mahdolliseksi määritelty, oli sydänleikkauspotilas, joka osallistui verensiirron jälkei-15 seen hepatiittitukimukseen, joka suoritettiin Sydneyssä

Australiassa. Potilas (PA-124), jolla ei ollut muita identifioitavia riskitekijöitä, sai 14 yksikköä verta leikkauksen aikana (4 yksikköä pakattuja punasoluja, 10 yksikköä verihiutaleita). Näistä 14 yksiköstä yksi oli HGV-po- 20 sitiivinen; muut 13 olivat HGV-negatiivisia. 14 veren luovuttajan HBV ja HCV serologiat olivat negatiivisia ·;;/ reaktiivisen HCV EIA:n poikkeuksella (ensimmäisen sukupol- '···" ven koe) . Mikään muu HCV-koe ei vahvistanut positiivista ’.V löydöstä.

,,!·* 25 Potilaassa PA-124 (taulukko 7) , seerumin ALT oli | kohonnut alkaen näytteestä, joka otettiin kaksi viikkoa ·.*:*: leikkauksen jälkeen, ja sen havaittiin olevan ainakin 10 kertaa leikkausta edeltävä taso 14 viikon jakson ajan. PCR-tulokset HCV:lie, jotka suoritettiin verensiirtoa 30 edeltävällä, 4 viikon ja 8 viikon seerumeilla PA-124:stä, olivat kaikki negatiivisia. Seerumista tästä potilaasta •'· testattiin HGV RNA käyttäen 470-20-1 PCR-alukkeita. Veren- siirtoa edeltävä näyte oli negatiivinen HGV RNA: lie. Posi-: .·. tiiviset tulokset osoitettiin verensiirron jälkeen, ne ti» ''',· 3 5 olivat yhtäpitäviä ALT:n kohoamisen kanssa ja seuravivat 95 112249 sitä. HGV RNA:n läsnäolo havaittiin yhteen vuoteen asti verensiirron jälkeen. Nämä tiedot tukevat sitä päätelmää, että HGV voi kulkeutua parenteraalisesti.

Taulukko 7 5 Verensiirtoon liittyvä HGV:n kulkeutuminen: Tapaus PA-124

Viikkoja leikkauksen ALT (IU/1) 470 PCR tulos jälkeen ennen verensiirtoa 7 10 2 74 + 4 86 + 8 135 + 12 179 + 14 78 + 15 18 9 + 24 6 + 36 11 + 52 11 + 64 23 20 84 10 ·· Mahdolliseksi määriteltyjen verensiirron jälkeisten . kulkeutumistapausten lisäksi HGV-infektion lisätapauksia identifioitiin riskiryhmissä, jotka määriteltiin monilla 25 verensiirroilla ja laskimonsisäisen huumeen käytöllä (IV-.. DU) (taulukko 8) .

112249

Taulukko 8

Koodattujen seerumien HGV RT-PCR-testaus: Valitut hepatiitti- ja parenteraalisen riskin ryhmät

Ryhmä Testattujen Positiivisten lukumäärä lukumäärä 5 Autoimmuuni hepatiitti 10 0

Primaarinen sappikirroosi 20 0

Epäilty akuutti eiA-E 24 2 hepatiitti

Krooninen hepatiitti 34 3 10 (eiA-C) (vahvistettu mak- sabiopsialla)

Hepatosellulaarinen kar- 20 2 sinooma

Krooninen HBV 20 2 15 Krooninen HCV 50 6

Verenvuototauti 49 9 IVDU 54 15

Moniverensiirtoanemia 100 19 20 100 moniverensiirron sirppisoluanemia- ja talasse- : : : miapotilaan joukossa 19:llä (19 %) havaittiin olevan ha- ;· väittävä seerumi HGV RNA. Samalla tavalla 9 49:stä veren- ; vuotopotilaasta (18 %) oli HGV-positiivisia 470-20-1 ja NS5 alukkeilla. Merkittävästi 15 54:stä (28 %) IVDU:sta 25 havaittiin olevan PCR-positiivinen HGV RNA:lie. Infek-tiomäärät näissä parenteraalisen riskin ryhmissä (18 - 28 I · ♦ %) näyttävät olevan suuremmat kuin määrät verenluovutta-\ jissa, joilla on kohonnut ALT (l - 2 %) . Nämä tulokset *: * *: vahvistavat parenteraalisen reitin merkityksen HGV:n kul- : 30 keutumiselle.

97 112249 5. Valittujen hepatiittisairausryhmien PCR-seulonta

Seerumeista potilailta, joilla oli akuutti ja krooninen hepatiitti, hepatosellulaarinen karsinooma, HBV-in-fektio tai HCV-infektio, testattiin HGV:n läsnäolo käyttä-5 en polymeraasiketjureaktiota (tiedot esitetään taulukossa 8). Kussakin sarjassa näytteitä potilailta, joilla on maksasairaus, HGV-positiiviset näytteet osoitettiin (poikkeuksena näytteet potilailta, joilla on aut o immuunillepa-tiitti ja primaarinen sappikirroosi, molemmat sairausti-10 lat, joiden ei uskottu olevan yksinomaan liittynyt infek-tiiviseen aineeseen).

Kuten seerumien, jotka ovat verensiirron jälkeisistä hepatiittipotilaista (esimerkki 4F-4), kokoelmassa esitetään HGV-infektio muodostuu akuutin hepatiitin aikana, 15 mutta verenkierrossa oleva virus-RNA havaitaan edelleen kroonisen infektion aikana ajan, joka mitataan kuukausista vuosiin.

Noin 10 - 20 % yhteisinfektiomääriä havaittiin potilailla, joilla on HBV- ja HCV-infektio. HGV-infektio 20 osoitetaan siten olevan liittynyt hepatiittiin yhteisin-fektiolla muiden hepatitisvirusten kanssa tai ilman. Yh-teisinfektio voi heijastaa samanlaisia riskitekijöitä ja kulkeutusmisreittejä näille hepatitisviruksille. Kuten edellä mainitaan, on olemassa suurempi HGV:n yleisyys pa- *

Il 25 renteraalisen riskin ryhmissä, kuten verenvuototautipoti- • ’*: laat, IVDU:t ja moniverensiirtoanemiapotilaat (verrattuna : muihin hepatiitin riskiryhmiin) .

6. HGV:n jatkuva infektio ihmisissä , Verensiirron jälkeisillä hepatiittitapauksilla BIZ,

30 STO ja PA-124 osoitettiin olevan PCR-havaittava virus-RNA

* · · jopa 3,8, 1,8 ja 1,0 vuotta, vastaavasti, verensiirron ja akuutin infektion jälkeen. Lisäseeruminäytteitä saatiin : " luovuttajalta JC (esimerkki 4F-1) yksi vuosi ja 1,5 vuotta V ‘ alkuperäisen positiivisen näytteen jälkeen. Myös nämä see- ;··| 35 ruminäytteet olivat HGV-positiivisia. Lisäseerumit muilta ,**·, suuren ALT:n luovuttajilta (T55806, T55875, R25342) , jotka saatiin useita kuukausia seeruminäytteen jälkeen, jossa :·1 ‘ HGV-infektio alunperin havaittiin, olivat myös positiivi- 98 1 12 2 49 siä. Samalla tavalla, kun HGV-infektio muodostui koekädel-lisessä (CH1356, esimerkki 4H) , HGV RNA havaittiin 1,5 vuoden ajan siirrostuksen jälkeen. Nämä tiedot muodostavat jatkuvan HGV-viremian ihmisissä ja koekädellisissä.

5 G. Potilaan RNA:sta saatujen pitkien fragmenttien amplifikaatio sekvensointia varten PCR-alukkeet suunniteltiin amplifioimaan useita HGV-genomin informatiivisia alueita, jolloin saatiin sekvenssi-informaatio vaihdelluilla HGV-isolaateilla. Aluk- 10 keet 470EXT4-2189R (sekvenssi nro 119) ja 470EXT4-29F (sekvenssi nro 120) suunniteltiin amplifioimaan 2,2 kb fragmentti, joka sisälsi alkuperäisen 470-20-1 sekvenssin.

RNA näytteistä käänteiskopioitiin käyttäen "SUPERSCRIPT II" käänteistranskriptaasia (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD).

15 Saatu cDNA amplifioitiin käyttäen reagensseja tehokasta pitkän alueen PCR:ä varten ("XL PCR BUFFERS" ja "rTth-XL", Perkin Elmer/Applied Biosystems Div., Foster City, CA).

Amplifikaatioreaktiota pidettiin positiivisena, jos oikean kokoinen vyöhyke havaittiin agaroosigeelielektrofo- 20 reesilla. Näyte vahvistettiin positiiviseksi amplifikaa-tiotuotteen alustavalla DNA-sekvensoinnilla. Seuraavista seeruminäytteistä testattiin HGV RNA tällä amplifikaa-tiomenetelmällä: PNF2161; R10291 (JC); ja näytteet kustakin pohjoisamerikkalaisesta, egyptiläisestä ja japanilai-' ; 25 sesta ryhmistä. Positiivisia näytteitä ei kuitenkaan ha- vaittu perulaisista seerumeista.

, ,·; Peräkkäinen amplif ikaatio lukuisista HGV-positiivi- sista näytteistä tarjoaa vahvistuksen tuloksista, jotka saatiin PCR-amplifikaatiolla käyttäen edellä keskusteltua t : : 30 470-20-l-alukeparia. Kykenemättömyys saada amplifikaatio ·’ ’ voi kuitenkin heijastaa huonoa RNA-laatua tai vähäistä kopiomäärää tai paikallisia sekvenssieroja isolaattien • ’·* joukossa niin, että valitut alukesarjat eivät toimisi V : yleispätevästi.

35 Jotta saataisiin sekvenssi-informaatio oletetusta .... HGV-genomin 5' -translatoimattomasta alueesta, alukkeet I · '!* suunniteltiin amplif ioimaan fragmentit 5'-translatoimatto- !,· · masta alueesta (perustuen HGV PNF 2161 varianttiin) . Kaksi 99 1 12249 fragmenttia määriteltiin seuraavilla alukesarjoilla: FV94-22F (sekvenssi nro 124) ja FV94-724R (sekvenssi nro 125), jolloin saatiin 728 emäsparin fragmentti; ja FV94-94F (sekvenssi nro 126) ja FV94-912R (sekvenssi nro 127), jol-5 loin saatiin 847 emäsparin fragmentti.

Käytettiin olosuhteita, jotka juuri kuvattiin edistämään tehokasta pitkän alueen PCR:a. Tuotteet saatiin useimmista testatuista näytteistä, jolloin tarjottiin HGV RNA:n läsnäolon näytteissä lisävahvistus.

10 H. HGV:n infektiivisyys kädellisissä

Kaksi simpanssi- (merkitään CH1323 ja CH1356), kuusi cynomolgus apina- (CY143, CY8904, CY8908, CY8912, CY8917 ja CH8918) ja kuusi Mystax-kohdetta (MY29, MY131, MY98, MY187, MY229, MY254) siirrostettiin PNF 2161:llä.

15 Siirrostusta edeltävistä ja siirrostuksen jälkeisistä seerumeita tarkkailtiin ALT:a ja HGV RNA sekvenssien läsnäoloa (määritettynä PCR-seulonnalla - kuvattu edellä).

Yksi cynomolgus-apina (CY8904) osoitti positiivisen RNA PCR-tuloksen (39 vrk siirrostuksen jälkeen) ja yhden 20 epämääräisen tuloksen yhteensä 17 erillisestä verinäytteestä. Yhdessä simpanssissa, jota merkitään CH1356, oli jatkuva viremia, joka havaittiin RT-PCR:llä. Kuten taulukossa 9 esitetään, merkittävää ALT-kohoamaa ei havaittu, ja verenkierron virus havaittiin vain aikapisteissä huo- j | 25 mattavasti siirrostuksen jälkeen. Viremia havaittiin 118 ; vuorokautta siirrostuksen jälkeen ja myöhemmin. Vaikuttava : reaktiivisuus havaittiin myös ensimmäisessä siirrostuksen jälkeisessä aikapisteessä (8 vrk) , mikä voi osoittaa jäi- t · · · jelle jääneen siirrosteen.

::: 30 » » I I * * » I · I · » » * M · M » * 100 112249

Taulukko 9 ALT ja PCR tulokset CHi356:sta siirrostuksen PNF 2161:llä jälkeen

Vrk siirrostuksen jälkeen ALT1 HGV PCR

5 0 59 8 65 ± 15 85 22 89 29 89 10 36 86 39 31 47 74 54 40 61 57 15 84 65 ± 89 63 + 98 64 118 84 + f · ;···: 125 73 + 9 * 1 1 - ------- i 1 · \\m 20 134 74 + ; ;’: 159 80 + » i 1 " ' V : 610 (ALT ei + saatavissa) 1 1 ^____ ·__ f V · 1 Keksimääräinen ALT peruslinja ennen siirrostusta 25 oli 50.

» 1 ··, Edellä esitetyt tiedot osoittavat, että HGV-infek- tio oli pysyvä jopa 1,7 vuoteen asti koekädellisessä.

t 1

» » I

tl» 1 101 112249 I. Virusgenomin karakterisointi 470-20-l:n eristys cDNA-kokoeIinasta (esimerkki 1) viittaa siihen, että PNF 2161:ssä havaittu virusgenomi on RNA. Lisäkokeisiin HGV-virusgenomin identiteetin vahvista-5 miseksi RNA:ksi kuuluvat seuraavat.

Joko RNA:n tai DNA:n (esim. DNaasittomalla RNaasil-la tai RNaasittomalla DNaasilla) selektiivinen hajotus alkuperäisessä kloonauslähteessä, minkä jälkeen amplifi-kaatio HGV-spesifisillä alukkeilla ja amplifikaatiotuot-10 teiden havaitsemista voidaan käyttää erottamaan RNA DNA-malleista.

Vaihtoehtoinen menetelmä hyödyntää amplifikaa-tioreaktioita (nukleiinihapot alkuperäisestä kloonausläh-teestä mallina ja HGV-spesifiset alukkeet), jotka käyttä-15 vät (i) DNA-riippuvaista DNA-polymeraasia, kaikkien RNA-riippuvaisten DNA-polymeraasien ollessa poissa (so. kään-teistranskripaasi) reaktioissa, ja (ii) DNA-riippuvainen DNA-polymeraasi ja RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi reaktioissa. Tässä menetelmässä, jos HGV-genomi on DNA tai 20 sillä on DNA-välituote, niin amplifioitu tuote havaitaan molemmissa amplifikaatioreaktioiden tyypeissä. Jos HGV-genomi on vain RNA, amplifioitu tuote havaitaan vain kään-teistranskriptaasin sisältävissä reaktioissa.

Kokonaisnukleiinihappo (so. DNA tai RNA) uutettiin Il 25 PNF 2161:stä käyttäen proteinaasi K:ta ja SDS:ä, minkä *ί jälkeen fenoliuuttoa, kuten kuvataan esimerkissä 4C. Puh- < » · ; distettu nukleiinihappo amplifioitiin sitten käyttäen po- lymeraasiketjureaktiota, jossa joko (i) PCR:ä edelsi kään-

IKI

teiskopiointivaihe, tai (ii) käänteiskopiointivaihe jätet- V » * 30 tiin pois. Amplifikaatio saatiin toistettavasti vain, kun ' PCR-reaktiooita edelsi käänteiskopiointi. Kontrollina, DNA-mallit amplifioitiin peräkkäin erillisissä reaktiois-1 " sa. Nämä tulokset osoittavat, että HGV-virusgenomin laji

I I

V ** on RNA.

35 Kloonatun, kaksisäikeisen DNA-sekvenssin säie, joka ,>·, oli alunperin läsnä PNF 2161:ssä, voidaan johtaa lukuisil- ’·' la keinoilla, mukaan lukien seuraavat. Amplifioimattoman : genomisen RNA:n, joka on infektoituneesta lähdeseerumista, i

4 i · * I

102 112249

Northern tai täpläelektroforeesi voidaan suorittaa, minkä jälkeen duplikaattitäplien hybridisaatio koettimiin, jotka vastaavat kloonatun sekvenssinkutakin säiettä. Vaihtoehtoisesti, yksisäikeisiä cDNA-koettimia, jotka eristettiin 5 M13-vektoreista (Messing), tai monisäiespesifisiä oli-gonukleotidikoettimia käytetään lisättyä herkkyyttä varten. Jos lähdeseerumi sisältää yksisäikeisen RNA:n, vain yhdestä koettimesta (so. sekvenssit 470-20-1-kloonien yhdestä säikeestä) saadaan signaali käyttäen sopivia hybri-10 disaation ankaruuden olosuhteita. Jos lähdeseerumi sisältää kaksisäikeisen RNA:n, molemmista säiekoettimista saadaan signaali.

Polymeraasiketjureaktio, joka aloitetaan käänteis-kopioinnilla käyttäen yhtä tai toista spesifistä aluketta, 15 edustaa paljon herkempää vaihtoehtoa Northern blot -analyysille. Genomista RNA:ta, joka uutetaan PNF 2161 seerumissa läsnä olevissa puhdistetuista virioineista, käytetään syöttömallina kuhunkin RT/PCR:ään. Mieluummin kuin cDNA-synteesiä satunnaisten heksameerien kanssa, käytet-20 tiin HGV sekvenssispesifisiä alukkeita. Yksi cDNA-syntee-sin reaktio suoritettiin alukkeella, joka on komplementaarinen kloonatun sekvenssin yhteen säikeeseen (esim. 470-20-1-77F); toinen cDNA-synteesireaktio suoritettiin myös käyttäen aluketta, joka johdettiin vastakkaisesta säikees- ♦ * V..‘ 25 tä (esim. 470-20-1-211R) .

Saatu ensimmäisen säikeen cDNA amplifioitiin käyt-täen kahta HGV-spesifistä aluketta. Kontrollit sisällytet-tiin peräkkäisestä amplifikaatiota varten PCR:llä (esim. DNA-kontrollit) . RNA-kopioita kloonatun sekvenssin kusta-· 30 kin säikeestä käytettiin myös kontrolloimaan myös kään- teiskopioinnin tehokkuutta, joka saatiin, kun käytettiin speisifisä alukkeita, jotka kuvataan.

Spesifiset tuotteet havaittiin agaroosigeelielekt-1 . roforeesilla etidiumbromidi-värjäyksellä. DNA-kontrollit 35 (so. kaksisäikeiset DNA-kontrollit PCR-amplifikaatiota varten) amplif ioitiin peräkkäin huolimatta käänteiskopi-• :*: ointia varten käytetystä alukkeesta. Yksisäikeiset RNA- kopiot (so. kontrollit käänteiskopioinnin tehokkuutta ja 103 112249 säiespesifisyyttä varten) amplifioitiin vain, kun vastakkaisen säikeen aluketta käytettiin cDNA-synteesiä varten.

PNF-johdettu HGV-polynukleotidi sai aikaan spesifisen amplifioidun tuotteen vain, kun aluketta 470-20-1-211R 5 käytettiin käänteiskopiointia varten, osoittaen siten, että alkuperäinen HGV-polynukleotidisekvenssi, joka on läsnä tässä seerumissa, on komplementaarinen 470-20-1-211R:lle ja on todennäköisesti yksisäikeinen RNA.

Esimerkki 5 10 PNF2161:n sakkaroositiheysgradienttierotus Ά. PNF-2161 aineen juovitus 10- - 60-%risen sakkaroosin ("ULTRAPURE", Gib- co/BRL) jatkuva gradientti TNE:ssä (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) valmistettiin käyttäen gradientin-15 tekijää Hoefer Scientificista (San Francisco, CA) . Noin 12,5 ml gradienttia päällystettiin 0,4 ml:11a PNF-seeru-mia, joka oli ollut varastoituna -70 °C:ssa, sulatettiin nopeasti 37 °C:ssa, sitten laimennettiin TNE:ssä.

Gradienttia sentrifugoitiin sitten SW40-roottorissa 20 (Beckman Instruments) kierrosnopeudella 40 000 rpm (noin 200 000 x g rAV:ssä) 4 °C:ssa noin 18 tunnin ajan. Fraktiot, tilavuudeltaa noin 0,6 ml, otettiin talteen putken pohjalta ja 0,5 ml punnittiin suoraan ultrasentrifuugiput-] keen tiheyden laskemista varten.

25 ♦ · · > · ·

Hill » »

I I

» t « I I * » t · · 104 112249

Taulukko 10 PNF-fraktioiden mitatut tiheydet ja 470-20-1: n läsnäolo

Fraktio Tiheys 470-20-1 havaittu* 5 1 1,274 2 1,274 3 1,266 4 1,266 5 1,260 10 6 1,254 7 1.248 + 8 1,206 + 9 1,146 + 10 1,126 +++ 15 11 1,098 ++++ 12 1,068 +++ 13 1,050 + / 14 1,034 + : 15 1,036 + 20 16 1,018 17 1,008 + 18 1,020 + * "+" ja pisteet perustuivat aluksi 40-kierroksen 25 PCR:ään. ·'+", "++", "+++" ja ,,++++,, erottamiseksi ♦ t * * * fraktiot, joista saatiin aluksi positiiviset pis-teet (7 - 18) , ampplifioitiin 30 kierroksella

Lii PCR:a.

105 112249

Oletetut viruspartikkelit pelletoitiin sitten sent-rifugaatiolla kierrosnopeudella 40 000 rpm ΤΪ70.1 roottorissa (noin 110 000 x g) 4 °C:ssa 2 tunnin ajan, ja RNA uutettiin käyttäen happoguanidiniumfenolitekniikkaa ("TRI 5 REAGENT", Molecular Research Center, Cincinnati, OH), ja alkoholi saostettiin käyttäen glykogeeniä kantajana parantamaan talteenottoa. Puhdistettu nukleiinihappo liuotettiin RNaasittomaan puskuriin, joka sisälsi 2 mM DTT:a ja l U/μΙ rekombinantti RNasiinia.

10 Gradienttifraktioiden analyysi RNA PCRrllä (esi merkki 4C) osoitti erillisen piikin 470-20-1 spesifisessä signaalissa, joka sijaitsi fraktioissa, joiden tiheys vaihteli välillä 1,126 - 1,069 g/ml (taulukko 10). 470-20-1 signaalin osoitettiin siten, näissä olosuhteissa, muo-15 dostavan erillisen vyöhykkeen, joka on yhdenmukainen vi-ruspartikkelin odotetun käyttäytymisen kanssa sakkaroosig-radientissa.

B. Suhteelliset viruspartikkelitiheydet PNF 2161 on osoitettu olevan yhteisinfektoitunut 20 HCV:n kanssa (katso yllä). 470-20-1 viruspartikkelin ominaisuuksien vertaamiseksi muihin tunnetuihin hepatitis vi-ruspartikkeleihin, seerumi PNF 2161 ja puhdistetun hepatitis A viruksen näyte kerrostettiin sakkaroosigradientille ; (kuten edellä kuvataan). Fraktiot (0,6 ml) otettiin tal- ,25 teen, pelletoitiin ja RNA uutettiin. Eristetty RNA kusta-•t kin fraktiosta saatettiin alttiiksi amplifikaatioreakti- ' oi lie (PCR) käyttäen HAV (sekvenssi nro 5; sekvenssi nro t 6), HCV (sekvenssi nro 7, sekvenssi nro 8) ja 470-20-1 (sekvenssi nro 9, sekvenssi nro 10) spesifisiä alukkeita.

30 Tuotevyöhykkeet identifioitiin amplifikaatioreakti- oiden elektroforeettisella erotuksella agaroosigeelillä, minkä jälkeen etidiumbromidi-värjäyksellä. Tämän analyysin ; tulokset esitetään taulukossa 11.

• I

106 112249

Taulukko li

Keskimääräinen tiheys HAV HCV 470-20-1 1,269 - - 1,263 + - 5 1,260 + 1,246 ++ 1,238 ++ - 1,240 + - 1,207 + - 10 1,193 + 1,172 + ± 1,150 + ± ± 1,134 + + ± 1,118 + + + 15 1,103 + + + 1,118 + + + i 1,103 + + + 1,088 ± + + ··· 1,084 + + V,.: 20 1,080 + + s : : 1,070 - + + ; *. 1,057 + ± : 1,035 ± 1,017 - \ . ' ' ' 1 1 ————— — i · 25 1,009 - 107 112249 Nämä tulokset viittaavat siihen, että 470-20-1 partikkelit ovat enemmän samanlaisia HCV-sekvenssien kanssa kuin HAV:n.

Lisäksi, seerumia PNF 2161 ja HAV-partikkeleita 5 käsiteltiin kloroformilla ennen sakkaroosigradientin sent-rifugointia. Näiden kokeiden tulokset viittaavat siihen, että 470-20-1 aine voi olla kuorellinen virus, koska sillä on enemmän samanlaisia ominaisuuksia kuorellisen Flavivi-ridae-jäsenen (HCV) kanssa kuin ei-kuorellisen viruksen 10 (HAV).

Esimerkki 6 470-20-1 laajennuskloonien muodostus

A. Anchor-PCR

RNA uutettiin suoraan PNF2161 seerumista, kuten 15 esimerkissä 1 kuvataan. RNA vietiin "CHROMA SPIN" 100 gee-lisuodatuskolonnin (Clontech) läpi, jolloin poistettiin pienen moolimassan epäpuhtaudet. cDNA syntetisoitiin käyttäen BMB cDNA-synteesikokoonpanoa. cDNA-synteesin jälkeen PNF cDNA ligatoitiin 50 - 100 kertaiseen ylimäärään KL-20 l/KL-2 SISPAa tai JML-A/JML-B linkkreitä (sekvenssi nro 11/sekvenssi nro 12 ja sekvenssi nro 17/sekvenssi nro 18, vastaavasti) ja amplifioitiin 35 kirroksen ajan käyttäen joko äluketta KL-1 tai aluketta JML-A.

470 laajennuskloonit muodostettiin 1 μΐ erän ankku- 1 ♦ · 25 ri-PCR:llä 10 μl:sta ligaatioreaktiota, joka sisälsi Eco-, .·. RI-digeroituja (defosforyloituja) lambda gtll haaroja (1 μg) ja EcoRI-digeroidun PNF cDNA:n (0,2 μg) . Ligaatioreak-tion PCR-amplifikaatio (40 sykliä) suoritettiin käyttäen ;;; lambda gtll käänteisaluketta (sekvenssi nro 13) yhdistel- i * · * 30 mässä joko 470-20-77F:n (sekvenssi nro 9) tai 470-20-1- 211R (sekvenssi nro 10) kanssa. Kaikki alukepitoisuudet ! ’·’ PCRille olivat 0,2 μΜ.

V : Amplifikaatiotuotteet (9 μ1/100 μΐ) erotettiin 1,5- %:isella agaroosigeelillä, josta suoritettiin elektrofo- ··, 35 reesi "NYTRAN: lie" (Schleicher ja Schuell, Keene, NH) ja i * tutkittiin digoksygeniinillä leimatulla oligonukleotidi-: koettimella, joka on speisifnen 470-20-1: lie. Digoksy- geniinileimaus suoritettiin valmistajan suositusten mukai- 108 112249 sesti käyttäen päätetransferaasia (BMB). Vyöhykkeet, jotka hybridisoituivat, geelipuhdistettiin, kloonattiin "TA CLONING VECTOR pCR II:een" (Invitrogen) ja sekvensoitiin.

Lukuisia klooneja, joissa on sekä 5'- että 3'-laa-5 jennukset 470-20-1:lie identifioitiin. Kaikki sekvenssit perustuvat konsensussekvenssiin ainakin kahden itsenäisen isolaatin sekvensoinnista. Tämä Anchor-PCR lähestyminen toistettiin samanlaisella tavalla, jolloin saatiin lisää 5'- ja 3' laajennussekvenssejä. Nämä PCR-amplifikaa-10 tioreaktiot suoritettiin käyttäen lambda gtll käänteisalu-ketta (sekvenssi nro 13) yhdistelmässä HGV-spesifisten alukkeiden kanssa, jotka on johdettu aikaisemmista laajen-nusklooneista saaduista sekvensseistä. Substraatti näille reaktioille oli pakkaamaton PNF 2161 2-cDNA lähde DNA.

15 Sekvensointi suoritettiin käyttäen "DYEDEOXY TER

MINATOR CYCLE SEQUENCING:a" (modifikaatio Sanger, et ai. menetelmästä) Applied Biosystems mallin 373A DNA sekven-sointisysteemiä valmistajan suositusten mukaan (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Sekvenssitiedot esitetään 20 sekvenssilistauksessa. Sekvenssejä verrattiin "GENBANK:n", EMBL-tietokannan ja dbEST:n (National Library of Medicine) sekvenssien kanssa sekä nukleiinihappo- että aminohappo-tasoilla. Hakuohjelmat PASTA, BLASTP, BLASTN ja BLASTX (Altschul, et ai.) osoittivat, että nämä sekvenssit olivat 25 uusia sekä nukleiinihappo- että aminohapposekvensseinä.

, .·. Yksittäiset kloonit, jotka saatiin käyttäen valit- t;m tua alukeparia, ryhmitettiin, jolloin saatiin konsensusse- * kvenssi. Konsensussekvenssien sarja, jota käytettiin ra-kentamaan sekvenssi HGV-PNF 2161 variantille, oli seuraa- i * * ’ 30 va: 4E3, sekvenssi nro 26; 3E3, sekvenssi nro 27; 2E5, sekvenssi nro 28; 1E5, sekvenssi nro 29; 4E5, sekvenssi : ’·· nro 30; 3E5, sekvenssi nro 31; 2E3, sekvenssi nro 32; 1E3, v : sekvenssi nro 33; 4E5-20, sekvenssi nro 34; 5E3, sekvenssi nro 39; 6E3, sekvenssi nro 40; 7E3, sekvenssi nro 42; 5E5, ...# 35 sekvenssi nro 43; 6E5(44F), sekvenssi nro 44; 8E3, sek- i · venssi nro 98; 9E3, sekvenssi nro 109; 10E3, sekvenssi nro :.· : 110; 11E3, sekvenssi nro 116; 12E3, sekvenssi nro 118; 5'- pää, sekvenssi nro 175; ja 3'-pää, sekvenssi nro 167.

109 112249

Yksittäiset konsensussekvenssit ryhmitettiin, limittyneet sekvenssit identifioitiin ja konsensussekvenssi HGV-PNF 2161 variantille määritettiin. Tätä konsensusse-kvenssiä verrattiin sekvenssien kanssa, jotka saatiin nel-5 jää muuta HGV-varlanttia varten: JC (sekvenssi nro 182) , BG34 (sekvenssi nro 176), T55806 (sekvenssi nro 178) ja EB2 0-2 (sekvenssi nro 180) .

HGV-PNF 2161 variantin konsensussekvenssi koostuu 9391 emäsparista, jotka esitetään sekvenssinä nro 14. Tämä 10 sekvenssi vastaa avointa lukukehystä (sekvenssi nro 15) . Proteiinin Kyte-Doolittle hydrofobisuuspiirros esitetään kuvassa 11.

Suhde alkuperäisen 470-20-1 kloonin ja laajennuksella saatujen sekvenssien välillä esitetään skemaattises-15 ti kuvassa 1. Kuten kuvassa nähdään, DNA-säie, jolla on vastakkainen polaarisuus 470-20-1 proteiinin koodausse-kvenssiin , joka käsittää pitkän jatkuvan avoimen lukukehyksen.

HGV:n aminohapposekvenssiä verrattiin kaikkien vi-20 russekvenssien sekvenssejä vastaan proteiinisekvenssien PIR-tietokannassa (IntelliGenetics, INc., Mountain View, CA). Vertailu suoritettiin käyttäen "FASTA" ohjelmasarjan "SSEARCH"-ohjelman versiota 1.7 (Pearson, et ai.). Paikal-' ·/; listen sekvenssisamanlaisuuksien alueet havaittiin HGV- 25 sekvenssien ja kahden Flaviviridae-virusheimon viruksen I t "/·. välillä. Samanlaisuusryhmittymät esitetään kuvissa 5A ja 5B.

* · *

*Näissä ryhmittymissä läsnä ovat aihelmat näiden virusten RNA-riippuvalle RNA-polymeraasille (RDRP) . Säily-' 3 0 neet RDRP aminohappoaihelmat esitetään kuvissa 5A ja 5B

tähdillä ja isoilla kirjaimilla, lihavoiduilla kirjaimilla k < ; “· (Koonin ja Dolja) . Nämä ryhmittymäy osoittavat, että tämä : ί osa HGV-koodaussekvenssiä vastaa RDRPrtä. Nämä ryhmittymä- tiedot yhdistettynä tietojen kanssa, jotka koskevat HGV:n » · 35 RNA-genomia, tukevat HGV:n sijoittamista Flaviviridae-hei- » » '·/ mon jäseneksi.

:t; · Globaaliset HGV-polyproteiinin aminohapposekvenssin *;·: (sekvenssi nro 15) identtisyydet HoCV:n (Hog Cholera vi- 110 112249 rus) ja HCV:n kanssa ovat 17,1 % ja 25,5 %, vastaavasti. Tällaiset globaalin sekvenssi-identtisyyden tasot osoittavat, että HGV on erillinen viruskokonaisuus sekä HoCVrstä että HCV:stä. Havainnolistamista varten, Flaviviridae-vi-5 rusheimon kahdessa jäsenessä BVDV (naudan ripulivirus) ja HCV, 16,2 % aminohapoista voidaan ryhmittää globaalisesti HGV:n kanssa.

Jäsenet luokassa osoittavat yleisesti suuren homo-logian, kun ne ryhmitetään globaalisti, esimerkiksi BVDV 10 vs. HoCV osoittavat 71,2-%:n identtisyyden. Nimeämättömän luokan erilaiset jäsenet (variantit), jonka jäsen HCV on, ovat välillä 65 - 100 % identtisiä, kun ne ryhmitetään globaalisesti.

B. RACE-PCR: 5'-pään kloonaus 15 Kloonit, jotka edustavat HGV-genomin 5'-päätä, saa tiin modifioidulla Anchor PCR lähestymisellä, joka käytti RACE-teknologiaa (nopea cDNA-päätteiden amplifikaatio). RACE-menetelmän kuvasi alunperin Frohman, et ai., (1988) ja Belyausky, et ai., (1989). Lyhyesti, HGV:n 5'-pään 20 kloonit saatiin seuraavasti.

Ensimmäisen säikeen cDNA-synteesi pohjustettiin käyttäen satunnaisia heksameerejä, ja synteesi suoritettiin käyttäen joko "SUPERSCRIPT II" tai "rTth" käänteis-transkriptaasia (Gibco/BRL). Ensimmäisen säikeen synteesin k * „ 25 jälkeen RNA-malli hajotettiin emäshydrolyysillä (NaOH).

cDNA-näyte neutraloitiin lisäämällä etikkahappoa ja puh- * · · ’ 1 distettiin absorptiolla lasimatriisialustaan ("GENOBIND", « « · * ·; Clontech, Palo Alto, CA). Puhdistuksen jälkeen cDNA väke- vöitiin etanolisaostuksella ja pestiin kahdesti 80-%:isel-1 * 30 la etanolilla.

Alunperin kuvattua RACE-menetelmää modifioitiin ... seuraavasti. Yksisäikeinen oligonukleotidiankkuri (sek- , ; : venssi nro 174) (Clontech) ligatoitiin ensimmäisen säikeen ' . cDNA:n 3'-päähän käyttäen T4 RNA-ligaasia kobolttikloridin 35 ollessa läsnä. Oligonukleotidiankkuri saatiin valmistajal- ;·* ta kahden modifikaation kanssa: (i) ankkurin 3'-pää modi- ! : : fioitiin aminoryhmällä, joka estää konkatameerin muodostu- 111 112249 misen, ja (ii) 5'-pää sisältää fosfaattiryhmän, joka sallii ligaation ensimmäisen säikeen cDNAihan.

Ankkurin ligaation jälkeen cDNA:ta käytettiin mallina PCR-amplifikaatiolle käyttäen useita HGV-spesifisiä 5 alukkeita yhdistelmässä alukkeen kanssa, joka on komplementaarinen ankkurisekvenssiin (AP-aluke, sekvenssi nro 134). Saadut amplifikaatiotuotteet erotettiin agaroosigee-lielektroforeesilla, siirrettiin suodattimiin ja hybri-disoitiin sisäkkäisellä, HGV-spesifisellä oligonukleotidi-10 koettimella. Vyöhykkeet, jotka hybridisoituvat HGV-koetti-meen, eristettiin, kloonattiin "pCR-II:iin" (Invitrogen, San Diego, CA) ja sekvensoitiin.

C. HGV 3'-pään kloonaus

Kloonit, jotka edustavat HGV-genomin 3'-päätä, saa-15 tiin modifioidulla ankkuroidulla RT-PCR-menetelmällä. Lyhyesti, poly A polymeraasia (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) käytettiin katalysoimaan poly(A)-pääteosan lisäystä PNF 2161 RNArhan ennen cDNA-synteesiä. Poly(A):n lisäys suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Poly(A)-modi-20 fioidun RNA:n puhdistuksen jälkeen käänteiskopiointi "SUPERSCRIPT II:11a" (GIBCO/BRL) suoritettiin käyttäen alu-ketta GV-5446IRT (sekvenssi nro 184). Saatu cDNA amplifi-oitiin PCRrllä käyttäen seuraavaa alukesarjaa: GV59-5446F (sekvenssi nro 171) ja GV-5446IR (sekvenssi nro 172) .

j 25 Amplifikaation jälkeen tuotteet erotettiin aga- , roosigeelielektroforeesilla, siirrettiin suodattimiin ja » * * ’.jt hybridisoitiin digoksigeniinillä leimatulla oligonukleoti- t dikoettimella (E5-7-PRB, sekvenssi nro 173). Tuotteet, jotka hybridisoituvat oligonukleotidin kanssa, eristet- i * 30 tiin, puhdistettiin, kloonattiin "pCR-II:iin" ja sekvensoitiin. Kaksi kloonia, jotka eristettiin tällä menetel- : mällä olivat MP3-3 (sekvenssi nro 168) ja MP3-7 (sekvenssi • 1 nro 169) .

? i * if* i » 112 112249

Esimerkki 7 470-20-1 fuusioproteiinin eristys A. 470-20-l/glutationi-S-transferaasi-fuusioprote-iinin ilmentyminen ja puhdistus 5 Glutationi-S-transferaasi (sj26) fuusioidun prote iinin, joka sisälsi 470-20-1 peptidin, ilmentyminen saatiin aikaan seuraavasti. 237 emäsparin insertti (sisälsi 17 SISPA-linkkerin nukleotidia molemmilla puolilla), joka vastasi alkuperäistä lambda gtll 470-20-1 kloonia, eris-10 tettiin lambda gtll 470-20-1 kloonista polymeraasiketjureaktiolla käyttäen alukkeita gtll F (sekvenssi nro 25) ja gtll R (sekvenssi nro 13), minkä jälkeen Eco Rl digestoin-tia.

Insertti kloonattiin modifioituun pGEX-vektoriin, 15 pGEX MOV. pGEX MOV koodaa sj26 proteiinin, joka on fuusioitunut kuudella histidiinillä karboksipäähän (sj26his). 470-20-1 polypeptidin koodaussekvenssit liitettiin vektoriin kloonauskohdassa, joka sijaitsi alaspäin sj26his koo-daussekvenssistä vektorissa. Siten, 470-20-1 polypeptidi 20 ilmennetään sj26his/470-20-l fuusioproteiinina. Sj26-pro- teiini ja kuusi fuusioproteiinin histidiinialuetta sallivat fuusioproteiinin affiniteettipuhdistuksen kaksoiskro-matograf isillä menetelmillä käyttäen glutationikonjugoitu-! ja helmiä (Smith, D.B., et ai.) ja immobilisoituja metal- 25 li-ionihelmiä (Hochula; Porath) .

. .·. E. coli kanta W3110 (ATCC kataloginumero 27352) muutettiin pGEX MOV:11a ja pGEX MOV sisältävillä 470-20-1 * '*·. insertillä. Sj26his-proteiini ja 470-20-1 fuusioproteiini • · * !!! indusoitiin lisäämällä 2 mM isopropyyli-B-tiogalaktopy- *'* ’ 30 ranosidia (IPTG) . Fuusioproteiinit puhdistettiin joko glu- tationiaffiniteettikromatografiällä tai immobilisoidulla i '*· metalli-ionikromatografiällä (IMAC) julkaistujen menetel- v : mien mukaisesti (Smith, D.B., et ai.; Porath) tavanomaisen ioninvaihtokromatografiän yhteydessä.

,···, 35 Puhdistettu 470-20-1 fuusioproteiini oli im- '·* munoreaktiivinen PNF 2161:n kanssa. Puhdistettu sj26his-

; proteiini ei kuitenkaan ollut immunoreaktiivinen PNF

113 1 12249 2161:n kanssa, mikä osoittaa spesifisen immunoreaktion läsnäolon 470-20-1 peptidin ja PNF 2161:n välillä.

B. 470-20-1/B-galaktosidaasi fuusioproteiinin eristys 5 KM393 lysogeenejä, jotka ovat infektoituneet

lambdafaagilla gtll tai gtll/470-20-1:llä, inkuboidaan 32 °C:ssa kunnes viljelmä saavuttaa O.D:n 0,4. Sitten viljelmää inkuboidaan 43 °C:isessa vesihauteessa 15 minuuutin ajan, jolloin aiheutetaan gtll peptidisynteesi, ja inku-10 boidaaan edelleen 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Bakteerisolut pelletoidaan ja hajotetaan lyysipuskurissa (10 mM Tris, pH

7,4, 2-%:inen "TRITON X-100" ja l-%:inen aprotiniini). Bakteerilysaatit selkeytetään sentrifugoinnilla (10K, 10 minuutin ajan, Sorvali JA20 roottori) ja selkeytettyjä ly-15 saatteja inkuboidaan Sepharose 4B helmien kanssa, jotka on konjugoitu anti-B-galaktosidaasin kanssa (Promega).

β-galaktosidaasifuusioproteiinien sitominen ja elu-ointi suoritetaan valmistajan ohjeen mukaisesti. Tyypillisesti proteiinien sitominen ja kolonnin peseminen tehdään 20 lyysipuskurilla. Sitoutuneet proteiinit eluoidaan 0,1 M karbonaatti/bikarbonaatti-puskurilla, pH 10. Puhdistettu 470-20-1/b-galaktosidaasiproteiini on immunoreaktiivinen sekä PNF2161:n että anti-b-galaktosidaasin vasta-aineen kanssa.

25 Esimerkki 8 > · · 470-20-1 fuusioproteiinin puhdistus ja anti-470-20-1 vasta-aineen valmistus A. Glutationiaffiniteettipuhdistus

Materiaaleihin kuuluivat 50 ml glutationiaf-’ 30 finiteettimatriisin pelkistettyä muotoa (Sigma) , XK 26/30

Pharmacia-kolonni, 2,5 x 10 cm Bio-Rad "ECONO-COLUMN" ; '·· (Richmond, CA) , Gilson (Liddleton, WI) HPLC, DTT (Sigma) , ; : : glutationin pelkistetty muoto (Sigma), urea ja natriumfos- faatti kaksiemäksinen.

... 35 Seuraavia liuoksia käytettiin fuusioproteiinin puh- T distuksessa: · · : Puskuri A: fosfaattipuskurisuolaliuos, pH 7,4, ja 114 112249

Puskuri B: 50 mM Tris pH 8,5, 8 mM glutationi, (pelkistetyn muodon glutationi)

Puhdistuspuskuri: 8 M urea, 100 mM Tris pH 8,0, 10 mM glutationi, 1,5 NaCl.

5 E. coli, jossa on plasmidi pGEX MOV:n sisältämä 470-20-1 insertti, kasvatettiin fermentorissa (20 litraa). Bakteerit otettiin talteen ja hajotettiin fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisälsi 2 mM fenyyli-metyylisulfonyylifluoridia (PMSF), käyttäen mikrojuoksu-10 tetta. Ellei toisin mainita, kaikki seuraavat menetelmisät suoritettiin 4 °C:ssa.

Raaka lysaatti valmistettiin panostamista varten asettamalla hajotetut bakteerit "OAKRIDGE"-putkiin ja sentrifugoimalla 20K rpm (40k x g) Beckman malli JA-20 15 roottorissa. Supernatantti suodatettiin 0,4 μιη suodattimen ja sitten 0,2 μιη suodattimen läpi.

2,5 x 10 cm "ECONO-COLUMN" pakattiin glutationiaf-finiteettimatriisilla, jota turvotettiin PBS:ssä kahden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolonni vietiin tasapai-20 noon pesemällä neljällä pakatun kolonnin tilavuudella PBS:a.

Kolonni panostettiin raakalysaatilla virtausnopeudella 8 ml minuutissa. Myöhemmin, kolonnin pestiin 5 ; kolonnitilavuudella PBS:a samalla virtausnopeudella.

,25 Kolonnia eluoitiin asettamalla virtausnopeus 0,75 - . ,·. 1 ml/min:iin ja viemällä puskuri B. Puskuria B pumpattiin

kolonnin läpi viiden kolonnitilavuuden ajan ja kahden mi-nuutin fraktiot otettiin talteen. Tyypillinen eluutiopro-fiili esitetään kuvassa 2. Fraktioissa läsnä olevien pro-*’ 30 teiinien pitoisuus ja puhtaus analysoitiin standardi SDS

PAGE:11a (kuva 3). 470-20-l/sj26his fuusioproteiini iden-; ’·· tifioitiin perustuen sen ennustettuun moolimassaan ja sen '· %· · immunoreaktiivisuuteen PNF 2161 seerumille. Lisämanipulaa- tioita varten proteiini voidaan eristää fraktioista, jotka 35 sisältävät fuusioproteiinin tai geelistä fuusioproteiinia I · *Γ sisältävien geelialueiden uutolla.

B. Kloonin 470-20-1 fuusioproteiinin puhdistus anionivaihdolla 115 112249

Liuoksiin kuuluvat seuraavat:

Puskuri A (10 mM natriumfosfaatti pH 8,0, 4 M urea, 10 mM DTT);

Puskuri B (10 mM natriumfosfaatti pH 8,0, 4 M urea, 5 10 mM DTT, 2,0 M NaCl); ja

Puhdistuspuskuri (8 M urea, 100 mM Tris pH 8,8, 10 mM glutationi, 1,5 NaCl).

Raakalysaatti (tai muu proteiinilähde, kuten yhdistetyt fraktiot edeltä) panostettiin "HIGH-Q-50" (Biorad, 10 Richmond, CA) kolonniin virtausnopeudella 4,0 ml/min. Kolonnia pestiin sitten puskurilla A viiden kolonnitilavuu-den ajan virtausnopeudella 4,0 ml/min.

Näiden pesujen jälkeen gradientti aloitettiin ja ajettiin puskurista A puskuriin B 15 kolonnitilavuudessa.

15 Gradienttiporrastettiin sitten 100-%:iin puskuria B yhden kolonnitilavuuden ajan. Tyypillinen gradientti esitetään kuvassa 4A. Fraktiot otettiin talteen joka 10 minuutti. 470-20—l/sj26his fuusioproteiinin puhtaus analysoitiin standardi SDS-PAGE:lla (kuvat 4B ja 4C) ja relevantit 20 fraktiot yhdistettiin (noin fraktiot 34 - 37, kuva 4C).

C. Anti-470-20-1 vasta-aineen valmistus

Puhdistettu 470-20-l/sj26his fuusioproteiini injektoidaan ihonalaisesti Freundin adjuvanttiin kanissa. Noin . :: 1 mg fuusioproteiinia injektoidaan vuorokausina 0 ja 21, i25 ja kanin seerumi otetaan tyypillisesti talteen 6 ja 8 . viikkona.

Toinen kani immunisoidaan samalla tavalla puhdiste-tulla sj26his-proteiinilla.

!!! Minilysaatit valmistetaan bakteereista, jotka il- ·’ 30 mentävät 470-20-l/sj26his fuusioproteiinin, sj26his-prote- iinin ja B-galaktosidaasi/470-20-l-fuusioproteiinin. Ly-i “ saatit fraktioidaan geelillä ja siirretään membraaniin.

·,· : Erilliset Western blotit suoritetaan käyttäen seerumeja kahdesta kanista.

···. 35 Seerumi eläimestä, joka on immunisoitu 470-20-1 fuusioproteiinilla, on immunoreaktiivinen kaiken sj26his- t · i.i fuusioproteiinin kanssa IPTG-indusoidun E. coli W3110:n minilysaateissa, jotka muutetaan joko pGEX MOV: 11a tai 116 112249 pGEX MOV:n sisältävällä 470-20-1 insertillä. Tämä seerumi on myös immunoreaktiivinen fuusioproteiinin kanssa mini-lysaatissa 470-20-1 lambda gtll rakenteesta.

Toinen kanain seerumi on immunoreaktiivinen sekä 5 sj26his- että 470-20-l/sj26his-fuusioproteiinien kanssa minilysaateissa. Tämän seerumin ei odoteta immunoreagoivan 470-20-l/3-galaktosidaasin fuusioproteiinin kanssa mini-lysaatissa 470-20-1 lambda gtll rakenteesta. Minkään seerumin ei odoteta olevan immunoreaktiivinen β-galaktosidaa-10 sin kanssa.

Anti-470-20-1 vasta-aine, joka on läsnä seerumeissa eläimestä, joka on immunisoitu fuusioproteiinilla, puhdistetaan affiniteettikromatografiällä (käyttäen 470-20-1 li-gandia).

15 Vaihtoehtoisesti, fuusioproteiini voidaan pilkkoa, jolloin saadaan 470-20-1 antigeeni, joka on vapaa sj26-proteiinisekvensseistä. 470-20-1 antigeeniä yksinään käytetään sitten muodostamaan vasta-aineet, kuten edellä kuvataan.

20 Esimerkki 9

Kanin antipeptidiseerumit

Peptidit suunniteltiin peittämään koko HGV-sekvens-si, erityisesti peittämään kukin funktionaalinen ryhmä ei-rakenne- ja rakennegeeneissä. Peptidit syntetisoitiin kau-25 pallisesti tavanomaisilla tekniikoilla. Tyypillisiä pepti-dejä esitetään taulukossa 12.

• * · t » · » · · • i · • I ·

Mill » · · > t · » · 117 112249

Taulukko 12

Nimitys Peptidin koko Loppupisteet (aa) suhteessa sek venssiin nro 14 PEPl/NS2a 30 2674/2763 PEP2/E1 16 733/780 5 PEP3/E2 18 1219/1272 PEP4/NS2B 18 3061/3114 PEP5/NS3 21 3571/3633 PEP6/NS3** 18 4909/4959 PEP7/NS4A 18 5275/5328 10 PEP8/NS4B 16 6097/6144 PEP9/NS5A 16 7033/7080 PEP10/NS5B 18 7783/7836 ** NS3-peptidillä on vieras kysteiini C-päässä, joka 15 ei ola HGV-PNF 2161 variantin polypeptidisekvens- sissä; todellinen sekvenssi oli Q.

: Peptidit kytkettiin KLH:hon. Käyttäen kaneja isän- tinä konjugoidut peptidit injektoitiin ihonalaisesti rao-: niin kohtiin. Anti-peptidi kanin seerumi muodostettiin ··· 20 kaupallisella laitteella. Kahden viikon immunisaatiomenet- i ·/; telyä käytettiin, ottaen verinäytteitä joka toinen viikko.

Kanin anti-peptidiseerumien osoitettiin olevan pep-tidispesifisiä ja niillä olevan korkea tiitteri. Kanin anti-peptidiseerumit myös tunnistavat vastaavat rekom-25 binanttiproteiinit, jotka ilmennetään E. coli: ssa ja bacu-’ loviruksessa. Vasta-aineen päätepistetiitterit vaihtelevat alueella 1:50 000 laimennos - 1:625 000 laimennos. Kanin Γ”: anti-peptidi 7:llä (NS4a) oli alhaiset päätepistetiitte- . rit, vain 1:1000. Siis, kanin anti-seerumi NS4a-prote- *" I 30 iinille, joka ilmennetään esimerkiksi baculovirussystee-missä, voi olla käyttökelpoisempi reagenssi.

118 112249

Kanin anti-peptidiseerumit ovat käyttökelpoisia vastaavien HGV-proteiinien immunosaostusta varten, jotka ilmennetään esimerkiksi baculoviruksessa tai lehmänrokos-sa. Kanin anti-peptidiseerumit ovat myös käyttökepoisia 5 kaapaamaan vasta-aine EIA:issa, jolloin havaitaan HGV-an-tigeeni. Kanin anti-peptidiseerumit ovat lisäksi käyttökelpoisia HGV-proteiinien karakterisoinnissa.

Esimerkki 10

Serologia 10 Ά. Seerumipaneelien Western blot -analyysi 470-20-1 fuusioantigeeniä (kuvattu yllä) käytettiin seulomaan seerumien paneeleja. Monet paneeleista olivat ihmisen seerumeista, jotka johdettiin sekä yksilöistä, jotka kärsivät hepatiitista, että infektoitumattomista 15 kontrolleista.

Affiniteettipuhdistettu 470-20-1 fuusioantigeeni (esimerkki 8) panostettiin 12-%:iseen SDS-PAGE:en 2 /xg/cm. Geeliä ajettiin kahden tunnin ajan 200V:ssa. Antigeeni siirrettiin geelistä nitroselluloosasuodattimelle.

20 Memebraania suojattiin sitten kahden tunnin ajan käyttäen liuosta, jonka muodostivat l-%:inen naudan seeru-mialbumiini, 3-%:inen normaali vuohen seerumi, 0,25-%:inen gelatiini, 100 mM NaP04, 100 mM NaCl ja l-%:inen rasvaton : kuivamaito. Membraani kuivattiin sitten ja leikattiin 1 - 25 2 mm suikaleisiin; kukin suikale sisälsi 470-20-1 fuusio- 1/-/- antigeenin. Suikale rehydratoitiin tyypillisesti TBS:llä ·:· (150 mM NaCl; 20 mM Tris HC1, pH 7,5) ja inkuboitiin pa- iti» i neeliseerumeissa (1:100) yön yli ravistaen huoneenlämpöti- . lassa.

30 Suikaleita pestiin kahdesti viiden minuutin ajan molemmilla kerroilla TBS:ssä plus "TWEEN 20:ssä" (0,05 %) ja sitten pestiin kahdesti viiden minuutin ajan molemmilla ·" kerroilla TBStssä. Suikaleita inkuboitiin sitten sekundaa- risessa vasta-aineessa (Promega anti-ihmis IgG-alkalinen Γ": 35 fosfataasikonjugaatti, 1:7500) yhden tunnin ajan ravistaen , huoneenlämpötilassa. Suikaleet pestiin sitten 2x5 mi- I nuuttia TBS:ssä + "TWEEN 20:ssä", sitten 2x5 minuutin ajan TBS:ssä.

112249 119

Sitoutunut vasta-aine havaittiin inkuboimalla suikaleita substraattiliuoksessa, joka sisälsi BCIP:a (esimerkki 2) ja NBT:tä (esimerkki 2) pH 9,5 puskurissa (100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) . Värin kehittymisen an-5 nettiin edetä noin 15 mnuutin ajan, jolloin värin kehitys pysäytettiin kolmella pesulla tislatussa vedessä.

Koeseerumit johdettiin seuraavista yksilöiden ryhmistä: (i) verenluovuttajat, negatiivinen HBV Ab:lie, pinta Ag:lle, negatiivinen HCV:lle, HIV:lie, HTLV-1 Abs:lie; 10 (ii) HBV-seerumit yksilöiltä, jotka ovat infektoituneet hepatitis B viruksella; (iii) HCV, seerumit yksilöiltä, jotka ovat infektoituneet hepatitis C viruksella sen nojalla, että ne ovat reaktiivisia toisen sukupolven HCV ELISA -analyysissä; ja (iv) HXV, yksilöt, jotka ovat sero- 15 logisesti negatiivisia HAV:lle, HBV:lie, HCV:lie tai HEV:-lle.

Tulokset näistä seulonnoista esitetään taulukossa 13 .

Taulukko 13 20 470-20-1 seerumien panelointitulosten yhteenveto Näyte Testattu- + IND* jen ihmisen* seerumien lukumäärä f';> veren- 3 0 1 2 27 luovuttaja (3,3 %) (6,7 %) (90,0 %) s ; ;______ HBV 40 7 4 29 (17,5 %) (10,0 %) (72,5 %) 25 HCV 38 11 11 16 : * (28,95%) (28,95%) (42,1 %) *:··: HXV 122 20 12 90 l’’*: (16,4 %) (9,8 %) (73,8 %) ! * Määrittelemätön, heikko reaktiivisuus.

i > > 120 112249 Nämä tulokset viittaavat 470-20-1 antigeenin läsnäoloon lukuisissa erilaisissa seeruminäytteissä. Antigeeni ei ole immunoreaktiivinen normaalin ihmisen seerumien kanssa.

5 B. Yleinen ELlSA-menetelmäkuvaus vasta-aineiden havaitsemiseksi

Polystyreeni 96-kuoppaiset levyt ("IMMULON II" (PGC)) päällystetään 5 Mg/ml (100 μΐ kuoppaa kohti) antigeenillä 0,1 M natriumbikarbonaattipuskurissa, pH 9,5.

10 Levyt suljetaan "PARAFILM:llä" ja varastoidaan 4 °C:ssa yön yli.

Levyt aspiroidaan ja suojataan 3 00 piillä. 10-%:ista normaalia vuohen seerumia ja inkuboidaan 37 °C:ssa 1 tunnin ajan.

15 Levyt pestään viisi kertaa PBS 0,5-%:isella "TWEEN- 20: llä".

Antiseerumit laimennetaan 1 x PBS:ssä, pH 7,2. Haluttu antiseerumien (0,1 ml) laimennos (laimennokset) lisätään kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboidaan 1 tunnin 20 ajan 37 °C:ssa. Levyt pestään sitten viisi kertaa PBS 0,5-% :isella "TWEEN-20:llä".

Piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitu vuohi-anti-ihmis-antiseerumi (Cappel) laimennetaan 1/5000 PBSrssä. 0,1 ml tätä liuosta lisätään kuhunkin kuoppaan. Levyä in- 25 kuboidaan 30 minuuttia 37 °C:ssa, sitten pestään viisi kertaa PBS:llä.

! Sigma ABTS (substraatti) valmistetaan juuri ennen "1 lisäystä levylle.

Reagenssi koostuu 50 ml:sta 0,05 M sitruunahappoa, V 30 pH 4,2, 0,078 ml:sta 30-%:ista vetyperoksidiliuosta ja 15 mg:sta ABTS:a. 0,1 ml substraattia lisätään kuhunkin kuop- 1.· paan, sitten inkuboidaan 30 mnuutin ajan huoneenlämpöti- lassa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 0,050 ml 5-%:ista f SDS:a (paino/tilavuus). Suhteellinen absorbanssi määrite- I · 35 tään 410 nm:ssä.

i : I t t t · 1 f 1 I * > a · · «1 112249

Esimerkki 11

Valittujen HGV-antigeenien ilmentyminen HGV:n koko koodaussekvenssi subkloonattiin yli 50 erilliseen limittyneeseen cDNA-fragmenttiin. Useimpien 5 cDNA-fragmenttien pituus vaihteli noin 200 - 500 emäspa-ria. cDNA-fragmentit kloonattiin erikseen ilmennysvektoriin, pGEX-HisB. Tämä vektori on samalainen kuin pGEX-MOV, joka on kuvattu edellä.

pGEX-hisB on modifikaatio pGEX-2T:stä (Genbank tallo lennusnumero A01438; kaupallisesti saatavilla oleva ilmen-nysvektori). Vektoria pGEX-2T on modifioitu insertoimalla Ncol-kohta suoraan alaspäin trombiinin pilkkomiskohdasta. Tätä kohtaa seuraa BamHI-kohta, jota seuraa poly-histidii-nin (kuusi histidiiniä) koodaussekvenssi, minkä jälkeen 15 EcoRI-kohta, joka löytyy pGEX-2T:stä. Kiinnostavat koo-daussekvenssit insertoidaan tyypillisesti Ncol-kohdan ja BamHI-kohdan väliin. Kuvassa 6 (sekvenssi nro 115), inser-toitu sekvenssi koodaa GE3-2 antigeenin. Loppuosa vekto-risekvenssistä on identtinen pGEX-2T:n kanssa. Fuusiopro-20 teiinin ilmentyminen suoritetaan olennaisesti, kuten edellä kuvataan muilla pGEX-johdetuilla ilmennysvektoreilla.

Kaikkien 50 fragmentin kloonaus suoritettiin olennaisesti kuten alla kuvataan, jolloin spesifiset alukkeet valittiin kullekin 50 koodausalueelle. Kukin HGV-insertin , *. 25 DNA on PCR-amplifioitu RNA:sta, joka on uutettu PNF

2161:stä tai muusta HGV(+)-seerumista käyttäen spesifistä ! alukkeiden sarjaa, kuten esimerkissä 4C kuvataan. Tyypil lisesti, 5'-aluke, joka sisälsi Ncol-restriktiokohdan, ja 3'-aluke, joka sisälsi BamHI-restriktiokohdan. Ncol-aluk- ·' 30 keet amplifioiduissa fragmenteissa sallivat amplifioitujen koodaussekvenssien kehysfuusion GST-Sj26 koodaussekvens- ; « ; '·· siin ilmennysvektoreissa pGEX-Hisb tai pGEX MOV.

* · » ί Amplif ioitu HGV-insertin DNA digeroidaan restrik- tioentsyymien Ncol ja Bam HI kanssa. Digeroitu insertti- I · 35 DNA geelipuhdistetaan ja ligatoidaan Ncol- BamHI-dige- t s roidun pGEX hisB:n tai pGEX MOV:n kanssa. E. coli kanta ·,· · W3110 (ATCC #27325, American Type Culture Collection, *;··: Rockville, MD) muutettiin ligaatiotuotteella. Ampisil- 122 112249 liiniresisitentit pesäkkeet valittiin. Insetin läsnäolo varmistettiin insertin PCR-amplifikaatiolla ampisil- liiniresistentistä pesäkkeestä käyttäen alukkeita, jotka ovat homologisia pGEX vektorisekvenssien kanssa, jotka 5 reunustavat insertoituja molekyylejä (alukkeet GLI F (sekvenssi nro 235) ja GLI R (sekvenssi nro 236).

PCR-amplifikaatiotuotteen koko insertin koko plus noin 160 emäsparia, jotka johdetaan vektorista. Tranfor-mantit, joissa on sopivia inserttejä, valittiin ja saatet- 10 tiin alttiiksi proteiini-induktiolle IPTG:llä, kuten kuvataan esimerkissä 7. Ilmennetyistä rekombinanttiproteii-neista analysoitiin spesifinen immunoreaktiivisuus oletettuja HGV-infektoituneita ihmisen seerumeita vastaan Western blotilla.

15 Kahdeksan fragmenttia, joita merkitään GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, EXP3, GEl-N ja GE-57, koodasivat antigeenit, joista saatiin selvä immunogeeninen vaste, kun ne saatettiin reagoimaan oletettujen HGV-infektoitujen ihmisen seerumien kanssa.

20 Ά. GE3:n, GE9:n, GE15:n, GE17:n, GE4:n, EXP3:n, GE1-N:n ja GE-57:n kloonaus

Koodaussekvenssi-insertit klooneille GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, EXP3, GEl-N ja GE-57 muodostettiin poly-j* meraasiketjureaktiolla SISPA-amplifioidusta kaksisäikei- ‘ 25 sestä cDNArsta tai RNA:sta, joka saatiin PNF 2161:stä tai v’.: T55806:sta käyttäen PCR-alukkeita, jotka ovat spesifisiä .kullekin fragmentille. Seuraava taulukko 14 listaa kunkin I kloonin koordinaatit suhteessa sekvenssiin nro 14 ja kun- ;kin klooni-insertin muodostumiseen käytetyt alukesarjat.

i 30 Γ ‘: < » » ) t * I » 123 112249

Taulukko 14

Klooni Seerumi- Koor- P-aluke R-aluke lähde dinaatti (sekvens- (sekvens- sekvenssil- si nro) si nro) lä nro 14

GE3 PNF 2161 6615-6977 GE-3F GE-3R

(sekv. (sekv.

nro 46) nro 47)

GE9 PNF 2161 8154-8441 GE-9F GE-9R

(sekv. (sekv.

nro 48) nro 49)

5 GE15 PNF 2161 3615-3935 GE-15F GE-15R

(sekv. (sekv.

nro 111) nro 112)

GE17 PNF 2161 3168-3305 GE-17F GE-17R

(sekv. (sekv.

nro 113) nro 114)

GE4 PNF 2161 6825-7226 GE4F GE4R

(sekv. (sekv.

nro 149) nro 150)

; : · EXP3 PNF 2161 6648-7658 470EXP3F 470EXP3R

: (sekv. (sekv.

; nro 151) nro 152)

,!!’ GE1-N PNF 2161 5850-6239 GE1-NF GE1-NR

t ; (sekv. (sekv.

!j’: nro 237) nro 238)

10 GE57 T55806 271*-456* GE57F GE57R

^ ' * (sekv. (sekv.

V : nro 239) nro 240)

( ) * t I

* Nämä sekvenssit annetaan suhteessa sekvenssiin nro 178.

1 ' i GE57:n aminohapposekvenssi esitetään sekvenssinä 15 nro 241.

124 1 12249 GE3-5'-alukkeessa (GE-3F, sekvenssi nro 46) hiljainen pistemutaatio (silent point mutation) liitettiin modifioimaan luonnollista Ncol-restriktiokohtaa. Käyttäen edellä kuvattuja alukkeita muodostettiin PCR-amplifikaa-5 tiotuotteet. Amplifikaatiotuotteet geelipuhdistettiin, digeroitiin NcoI:n ja BamHI:n kanssa ja geelipuhdistettiin uudelleen. Puhdistetut NcoI/BamHI GE3, GE9, GE15, GE17, GE4, GE1-N ja GE-57 fragmentit ligatoitiin itsenäisesti defosforyloituihin, NcoI/BamHI-leikattuihin pGEX-HisB-vek-10 toreihin. Puhdistettu NcoI/BamHI EXP3 fragmentti ligatoi tiin defosforyloituun, NcoI/BamHI-leikattuun pGEX-MOV-vek-toriin.

Kukin ligaatioseos muutettiin E. coli W3110 kannaksi ja ampisilliiniresistentit pesäkkeet valittiin. Amp-15 lisilliiniresistentit pesäkkeet suspendoitiin uudelleen

Tris/EDTA-puskuriin ja analysoitiin PCR:llä käyttäen alukkeita GLI F (sekvenssi nro 235) ja GLI R (sekvenssi nro 236), jolloin varmistettiin inserttisekvenssien läsnäolo. Kahdeksaa ehdokaskloonia merkittiin GE3-2, GE9-2, GE15-1, 20 GE17-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-N ja GE57, vastaavasti.

B. GE3-2/ GE9-2, GE15-1, GE17-2, GE4-8, EXP3-7, GEl-N ja GE57 fuusioproteiinien ilmentyminen

Ampisilliiniresistenttien bakteerien pesäkkeet, ! joissa on GE3-2:n, GE9-2:n, GE15-l:n, ja GE17-2:n, GE4- 25 8:n, EXP3-7:n, GE1-N:n ja GE57:n sisältävät vektorit, . .·. siirrostettiin yksitellen LB-väliaineeseen, joka sisälsi ampisilliinia. Viljelmiä kasvatettiin OD:hen 0,8 - 0,9, jolloin IPTG (isopropyylitiobeta-galaktosidaasi; Gibco-;*.! BRL) lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0,3 - 1 mM prote- • 30 iinin ilmentymisen aiheuttamista varten. Inkubointia IPTG:n ollessa läsnä jatkettiin 3-4 tunnin ajan.

: ’·' Bakteerisolut otettiin talteen sentrifugoinnilla ja V * suspendoitiin uudelleen SDS-näytepuskuriin (0,0625 M Tris, pH 6,8, 10-%:inen glyseroli, 5-%:inen merkaptoetanoli, » · 35 2,3-%:inen SDS). Uudelleensuspendoitua pellettiä keitet- tiin 5 minuutin ajan ja sitten puhdistettiin liukenematto-: masta solujätteestä sentrifugoinnilla. GE3-2, GE9-2, GE15- 1, GE17-2, GE4-8, EXP3-7, GEl-N ja GE57 IPTG-indusoiduista 125 112249 viljelmistä saadut supernatantit analysoitiin SDS-polyak-ryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) yhdessä indusoi-mattomien lysaattien kanssa. Proteiinit näistä geeleistä siirrettiin sitten nitroselluloosasuodattimiin (so. Wes-5 tern blot).

Suodattimia inkuboitiin ensin kanin polyklonaalisen vasta-aineen tai hiiren monoklonaalisen vasta-aineen (RM001 Sierra Biosourcesta, CA) kanssa, joka on suunnattu GST-proteiiniin, jolloin havaitaan sopivan kokoisen GST-10 fuusioproteiinin ilmentyminen. Edellä olevien kloonien odotetut proteiinikoot ovat 40, 38, 39, 32, 42, 64, 42 ja 33 KDa, vastaavasti. RM001:n immunoreaktiivisuus vyöhykkeiden kanssa sopivassa moolimassassa fuusioproteiineille osoitti edellä olevien kloonien fuusioproteiinien onnistu-15 neen ilmentymisen bakteerisoluilla. Klooniproteiinien il mentymistä tarkkailtiin myös sopivan kokoisten yli-ilmen-tyneiden proteiinien ilmaantumisella IPTG-induktion jälkeen Coomassie brilliant -sinisellä värjätyllä geelillä.

C. HGV-proteiinien Western blot -analyysi 20 Kun HGV-klooniproteiinin ilmentyminen oli vahvis tettu Western blot -analyysillä anti-GST-vasta-aineen kanssa, toinen sarja suodattimia, valmistettu kuten edellä, saatettiin sitten alttiiksi useille HGV(+) ja HGV(-) ihmisen seerumeille. Ihmisen seerumit, joita käytettiin 25 kokosolulysaattien Western blot -analyysejä varten, esiab- I · · , .·. sorboitiin lambda-gtll-nitroselluloosasuodattimilla. Lamb- da-gtll-nitroselluloosasuodattimet valmistettiin seuraa-vasti. Lyhyesti, KM392-viljelmän yön yli viljelmä valmis- » S · tettiin LBrssä. Viljelmä laimennettiin 10-kertaiseksi tuo-’ 30 reessä LB:ssä, joka sisälsi 0,2-%:isen maltoosin, ja inku boitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ravistaen.

; ’·· Yhden tunnin kuluttua viljelmää sekoitettiin yh- * » * V · täsuuren tilavuuden kanssa MgCa-liuosta (0,01 M MgCl2 ja 0,01 M CaCl2) . Tähän seokseen lambda gtll lisättiin tiitte-35 riin 2 x 104 PFU/ml ja inkuboitiin 30 minuutin ajan ilman » » *!' ravistelua. 30 minuutin kuluttua (tämän faagi/E.coli-seok- : sen kutakin ml:aa kohti) 15 ml sulaa (55 °C) LB-päälisaga- ria (LB, jossa 0,8 % agaria) lisättiin: 8 ml tätä seosta 12. 1 12249 levitettiin kullekin 15 cm LB-agarmaljalle. Kun pääliagar oli kiinteytynyt, maljaa inkuboitiin 37 °C:ssa 3-5 tunnin ajan.

Täplien kehittymisen jälkeen nitroselluloosasuoda-5 tin asetettiin maljalle ja maljaa inkuboitiin edelleen 37 °C:ssa yön yli. Nitroselluloosasuodatin poistettiin ja pestiin huolellisesti TBS:llä (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) plus 0,05-%:inen "TWEEN 20:llä". Pesty suodatin suojattiin sitten l-%:isella gelatiinilla TBSrssä yön yli.

10 Suodatin pestiin kolme kertaa (5 minuuttia kukin pesu) TBS:llä.

Ihmisen seerumien esiabsorptiota varten kukin seerumi laimennettiin 100-kertaiseksi suojausliuoksessa (kuvattu esimerkissä 10). Kymmentä ml:aa laimennettua seeru-15 mia inkuboitiin yön yli kahden edellä valmistetun lambda gtll suodattimen kanssa. Lambda gtll suodattimet poistettiin ja esi-absorboitua seerumia käytettiin Wertern blot -analyysiä varten.

Western blot -analyysit osoittivat, että kloonit 20 GE3-2, GE9-2, GE15-1, GE17-2, GE4-8, EXP3-7, GE1-N ja GE57 osoittivat spesifistä immunoreaktiivisuutta HGV(+)-seerumeja kohtaan. GE-4-8 proteiini oli immunoreaktiivinen J21689-seerumin kanssa. J21689 on HGV(+)-seerumi, kuten j määritetään HGV PCR:llä (esimerkki 4), ja HCV(+) , kuten : 25 määritetään HCV PCRtllä ja serologisilla analyyseillä.

rt· ; EXP3-7 proteiini oli immunoreaktiivinen JC:n ja T55806:n kanssa. JC on se HGV-positiivinen seerumi, joka identifi-, .·. oidaan esimerkissä 4F ja jonka veripankki hylkäsi korkean • ^ ALT:n vuoksi. Toinen JC-näyte, joka otettiin yhden vuoden t · · ' 30 kuluttua alkuperäisestä seeruminäytteestä, oli myös posi

tiivinen HGV:lie PCR-analyysillä. T55806 on myös se HGV-: “ positiivinen seerumi, joka identifioidaan esimerkissä 4F

v * ja jonka veripankki hylkäsi korkean ALT:n vuoksi. Tämä •:··; seerumi on yhteispositiivinen HCV:n kanssa.

,···. 35 Lisäksi, GE15-1 ja GE-17 osoitti heikon, mutta mer kittävän spesifisen immunoreaktiivisuuden PNF 2161:tä ja M · T55806:ta kohtaan. GE1-N oli immunoreaktiivinen PNF2161:n, '*"· JC:n, T55806:n, T56633:n, T27034:n ja R0001:n kanssa.

127 112249 T56633, T27034 ja R0001 ovat HGV(+) seerumeja, jotka identifioidaan esimerkissä 4F. GE57 oli immunoreaktiivinen E57963:n ja ROOOltn kanssa. E57963 on HGV- ja HCV-yhteis-positiivinen seerumi. GE3-2 ja GE9-2 olivat myös im-5 munoreaktiivisia HGV-seerumien kanssa spesifisesti. Mikään kahdeksasta antigeenistä ei kuitenkaan ollut immunoreaktiivinen HGV-negatiivisten seerumien T43608 ja R05072 kanssa.

10 GE3-2 ja GE9-2 fuusioproteiinit puhdistettiin bak- teerisolulysaateista olennaisesti, kuten esimerkissä 7, käyttäen kaksoiskromatografisiä menetelmiä, jotka käyttävät glutationikonjugoituja helmiä (Smith, D.B, et ai.) ja immobilisoituja metalli-ionihelmiä (Hochuli; Porath). Puh-15 distetut proteiinit saatettiin alttiiksi Western blot -analyysille seuraavasti.

Erilaisia määriä puhdistettuja HGV-proteiineja (esim. GE3-2 ja GE9-2 proteiinit) panostettiin 12-%:isille akryyliaminogeeleille. PAGE:n jälkeen proteiinit siirret-20 tiin geeleistä nitroselluloosamembraaneihin käyttäen standardimenetelmiä. Yksittäisiä membraaneja inkuboitiin yhden lukuisista ihmisen tai hiiren seerumeista kanssa. Ylimää-räseerumit poistettiin pesemällä mebraaneja.

Näitä membraaneja inkuboitiin alkalisen fosfataasi-

Ti- » .··. 25 konjugoidun vuohi-anti-ihmis-vasta-aineen (Promega) tai alkalisten fosfataasi-konjugoitujen vuohi-anti-hiiri-vas-! ta-aineiden kanssa (Sigma), riippuen seulontaa varten käy- "* tetystä seerumista. Memebraanit pestiin taas, jolloin poistettiin ylimäärä vuohi-anti-ihmis-IgG-vasta-ainetta, *·' ‘ 30 ja saatettiin alttiiksi NBT/BCIP: lie. Valokuvat tyypilli sistä värjätyistä membraaneista, joissa on GE3-fuusiopro-'·· teiini, esitetään kuvissa 7A - 7D.

: Kuvat osoittavat tulokset puhdistetun GE3-2 prote- _ iinin Western blot -analyyseistä käyttäen seuraavia seeru- ... 35 meja: N-(ABCDE) ihmisen (JC) seerumi (kuva 7A) , N-(ABCDE) i : ’;· ihmisen (PNF 2161) seerumi (kuva 7B) , supernormaali (SN2) : seerumi (kuva 7C) ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine 128 1 12249 (RM001), joka on suunnattu GST-Sj26-proteiinia vastaan (kuva 7D).

Kussakin kuvassa kaista 1 sisältää esivärjätyt moo-limassastandardit (Bio-Rad), ja kaistat 2-5 sisältävät, 5 vastaavasti, seuraavat määrät GE3-2 fuusioproteiinia: 4 μq, 2 μq, 1 μq ja 0,5 μq. Luvut edustavat panostusmääriä mikrogrammoina 0,6 geelin senttimetriä kohti (kuopan koko) . Ihmisen JC, PNF 2161 ja Supernormaali 2 seerumien laimennokset olivat 1:100. Anti-sj26:n laimennos oli 10 1:1000. Vyöhyke, joka nähdään noin 97K:ssa JC-elektrofo- reesissa, on reaktiivisuus vähäistä kontaminanttia vastaan GE3.2 fuusioproteiinivalmisteessa. Proteiinileiman koot olivat 142,9, 97,2, 50, 35,1, 29,7 ja 21,9 KD.

Kuten esitetään kuvissa 7A - 7D, GE3-2 osoitti spe-15 sifistä immunoreaktiivisuutta JC-seerumin kanssa. GE3-2 reagoi heikosti PNF 2161 seerumin kanssa ja pisteyttää epämääräisenä tai negatiivisena.

Rinnakkaiskokeissa GE9-2 osoitti heikon, mutta spesifisen immunoreaktiivisuuden PNF 2161 seerumia kohtaan.

20 Esimerkki 12

Tyypillisten epitooppikokoelmien rakentaminen A. Y5-kokoelma

Polymeraasiketjureaktioita käytettiin amplifioimaan j kolme limittynyttä DNA-fragmentti a PNF 2161 SISPA-amplifi- ,··. 25 oidusta cDNA: sta. PNF 2161 SISPA-amplif ioitu cDNA valmis- tettiin käyttäen JML-A/B-linnereitä (sekvenssi nro 54 ja ’ I sekvenssi nro 55) . Yksi mikrolitra tätä materiaalia ampli- *; fioitiin uudelleen 30 kierroksen ajan (1 minuutti • * · ’ 94 °C:ssa, 1,5 minuuttia 55 °C:ssa ja 2 minuuttia : 30 72 °C:ssa) käyttäen l/iM:a JML-A-alukkeita. Kokonaisreak- tiotilavuus oli 100 μΐ. Tuotteet kolmesta näistä amplifi-; ’·· kaatioista yhdistettiin ja erotettiin ylimäärästä PCR- alukkeita yhdellä viennillä "WIZARD PCR COLUMN:n" (Prome-. ga) läpi seuraten valmistajan ohjeita. "WIZARD PCR COLUMN" 35 on silikapohjainen hartsi, joka sitoo DNA:n suuren ioni- i : . ...

·;· vahvuuden puskureissa ja vapauttaa DNA:n alhaisen lonivah- j vuuden puskureissa. Amplif ioitu DNA eluoitiin kolonnista ·;·' 100 μ1:η kanssa tislattua vettä.

129 112249

Eluoitu DNA fraktioitiin l,5-%:isella Agarose TBE -geelillä (Maniatis, et ai.) ja visualisoitiin UV-valolla etidiumbroinidi-vär jäyksen jälkeen. Havaittiin voimakas DNA-fragmenttien tahra 150 - 100 emäsparin välillä. Yhtä 5 mikrolitraa uudelleenamplifioitua cDNAita käytettiin mallina PCR-reaktioissa kunkin taulukossa 15 esitetyn aluke-parin kanssa.

Taulukko 15

Alukkeet Sekvenssi nro Amplifioidun fragmentin koko 10 470ep-Fl sekvenssi nro 56 810 470ep-Rl sekvenssi nro 57 470ep-F2 sekvenssi nro 58 750 470ep-R3 sekvenssi nro 59 470ep-F4 sekvenssi nro 60 669 15 470ep-R4 sekvenssi nro 61

Alukkeet suunniteltiin johtamaan taulukossa 15 esitetyn kokoisten HGV-spesifisten DNA-fragmenttien amplifi-kaatioon. Amplifikaatioreaktioissa alukepareja käytettiin 20 pitoisuudessa 1 μΜ. Amplifikaatiot olivat 30 kierroksen ! ajan 1 minuutti 94 °C:ssa, 1,5 minuuttia 54 °C:ssa ja 3 minuuttia 72 °C:ssa kokonaisreaktiotilavuudessa 100 μΐ.

. ,·. Kukin kolmesta erilaisesta alukeparin PCR-reaktioista joh- ti tuotteiden, joilla on odotetut koot, spesifiseen ampli-25 fikaatioon. Kullekin alukeparireaktiolle amplifikaa- ;;; tiotuotteet kolmesta itsenäisestä PCR-reaktiosta yhdistet- ’·* ' tiin ja puhdistettiin käyttäen "WIZARD PCR COLUMN:a", ku ten edellä kuvataan. Puhdistetut tuotteet eluoitiin 50 : μΙ'.ΒεΆ dH20:a.

V · 3 0 Näytteet kustakin puhdistetusta tuotteesta (14 μΐ,

sisälsi noin 1 - 2 jug kutakin alukeparilla amplifioitua DNA-fragmenttia) yhdistettiin. Kaikien kolmen eri amplifi-oidun fragmentin yhdistetty näyte lisättiin 5 pl:aan 10X i DNaasi digerointipuskuria (500 mM Tris pH 7,5, 100 mM

35 MnCl2) ja 2 μΐ dH20:a. Tästä digerointiseoksesta poistet- 130 112249 tiin 10 μ1:η näyte ja asetettiin putkeen, joka sisälsi 5 μΐ pysäytysliuosta (100 mM EDTA, pH 8,0). Tämä näyte oli digeroinnin 0 minuutin aikapiste. Loput digerointireak-tiosta asetettiin 25 °C:seen. Digerointiseokseen lisättiin 5 1 μΐ 1/25 laimennettua RNaasitonta DNaasi I:tä (Stratage- ne). Eri aikapisteissä 10 μΐ erät otettiin pois ja sekoitettiin 5 μ1:η kanssa pysäytysliuosta. DNaasi I digeroidut DNA-tuotteet analysoitiin l,5-%:isella Agarose TBE -geelillä.

10 Tulokset useista digerointikokeista osoittivat, että 40 minuutin digerointi tarjosi hyvän DNA-fragmenttien jakautumisen kokoalueella 100 - 300 emäsparia. DNaasi I digestointi toistettiin sitten jättäen kokodigestointi 40 minuutin ajaksi huoneenlämpötilaan. Digestointi pysäytet-15 tiin lisäämällä 18 μΐ pysäytyspuskuria ja digestoidut DNA-tuotteet puhdistettiin käyttäen "WIZARD PCR COLUMN:a". "WIZARD PCR COLUMN:a" eluoitiin 50 μ1:1ΐ3 dH20:a ja eluoi-tu DNA lisättiin seuraavaan reaktioseokseen: 7 μΐ restrik-tioentsyymipuskuria C (Promega, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 20 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,9, lx pitoisuus); 11 μΐ 1,25 mM dNTP:itä; ja 2 μΐ T4 DNA polymeraasia (Boehringer-Mann-heim). Tätä reaktioseosta pidettiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, jolloin 70 μΐ pH 8,0 fenoli/CHCl3:a lisättiin ja sekoitettiin. Fenoli/CHCl3 poistettiin ja uutettiin kerran, 25 jolloin saatiin 150 μ1:η vesipitoinen kokonaistilavuus, ···/ joka sisälsi DNA-näytteen. DNA etanolisaostettiin käyttäen '·*·' kahta tilavuutta absoluuttista etanolia ja 0,5 tilavuutta * 7,5 M NH4-asetaattia. DNA pelletoitiin sentrifugoimalla 15 minuutin ajan kierrosnopeudella 14 000 rpm "EPPENDORF MIC-‘ ‘ '· 30 ROFUGE:ssa", kuivattiin 5 minuutin ajan 42 °C:ssa ja sus- pendoitiin uudelleen 25 nl:aan dH20:a.

DNA ligatoitiin 5'-fosforyloituihin SISPA-linkke-,··,·. reihin KL1 (sekvenssi nro 62) ja KL2 (sekvenssi nro 63) .

• t Useita eri pitoisuuksia SISPA-linkkereitä ja DNA:ta tes- ‘ ‘ 35 tattiin. Suurin ligaation taso (arvioituna kuten alla ku- vataan) tapahtui seuraavissa ligaatioreaktion olosuhteis-: sa: 6 μΐ DNA:ta, 2 μΐ 5,0 x 10-12 M KLl/KL2-linkkereitä, 1 μΐ 10X ligaasipuskuria (New England Biolabs) ja 1 μΐ 400 • · 131 112249 yksikköä/μΐ T4 DNA ligaasia (New England Biolabs) koko-naisreaktiotilavuudessa 10 μΐ. Ligatoinnit suoritettiin yön yli 16 °C:ssa.

Kaksi reaktiota suoritettiin rinnakkain seuraavas-5 ti. 2 μΐ näyte ligatoitua materiaalia amplifioitiin käyttäen KL1 SISPA aluketta kokonaisreaktiotilavuudessa 100 μΐ (25 sykliä, 1 minuutti 94 °C:ssa, 1,5 minuuttia 55 °C:ssa ja 2 minuuttia 72 °C:ssa). Ligaatioaste arvioitiin erottamalla 1/5 PCR-reaktiolla amplifioiduista tuotteista elekt-10 roforeesilla käyttäen l,5-%:ista agaroosi TBE -geeliä.

Geeli värjättiin etidiumbromidilla ja vyöhykkeet visualisoitiin UV-valolla.

Amplifikaatiotuotteet duplikaattireaktioista puhdistettiin käyttäen "WIZARD PCR COLUMNS:a" ja puhdistettu 15 DNA eluoitiin 50 μΙιβΒΒ dH20:a. 25 μ1:η erä PCR KL1/KL2-amplifioitua DNA:ta digeroitiin 36 yksiköllä EcoRI:a (Pro-mega) kokonaistilavuudessa 30 μΐ. Reaktio suoritettiin yön yli 37 °C:ssa. Digeroitu DNA puhdistettiin käyttäen "SEPHADEX G25" spinnikolonnia.

20 EcoRI-digeroitu DNA ligatoitiin yön yli reaktioilla

Agtll-haaroihin, jotka oli esidigeroitu EcoRI:llä, ja käsiteltiin vasikan suolen alkasella fosfataasilla (Strata-gene, La Jolla, CA). Ligaatioseos pakattiin käyttäen "GI-GAPACK GOLD PACKING EXTRACT:a" (Stratagene) seuraten val-: ' 25 mistäjän ohjeita. Saadun rekombinanttifaagin määrän tit- raus suoritettiin tekemällä maljaviljelmä pakatun faagin : 1/10 laimennoksesta KM392 seulalle, jossa malja sisälsi 20 # μΐ 100 mg/ml x-gal liuosta (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli- : ;*: β-D-galaktosidi; Sigma) ja 20 μΐ 0,1 M IPTG:n liuosta 30 (isopropyyli-l-tio-B-D-galaktosidi; Sigma) . Saatiin tiit- teri 1,2 x 106 faagia/ml, joka sisälsi yli 75 % rekom-binanttifaagia.

*... Rekombinanttitäplien prosenttiosuus vahvistettiin 8 satunnaisesti valitun täplän PCR-analyysillä käyttäen 35 alukkeita 11F (sekvenssi nro 25) ja 11R (sekvenssi nro i : 13) . Tämä pakattu kokoelma, joka sisälsi DNA-fragmentit, ; johdettiin amplifioitujen DNA:iden Fl/Rl, F2/R3 ja F4/R4 digestoinnista ja sitä merkittiin kokoelmaksi Y5.

132 1 12 2 4 9 B. ENV-kokoelma

Ilmennyskokoelma, jota merkitään ENV-kokoelma, muodostettiin seuraavasti. Yhtä mikrolitraa PNF 2161 SISPA amplifioitua DNA:ta käytettiin mallina polymeraasiketjuam-5 plifikaatioreaktioissa käyttäen seuraavia alukepareja: GEP-F15 (sekvenssi nro 128) ja GEP-R15 (sekvenssi nro 129), jotka muodostavat 525 nukleotidin HGV-fragmentin; ja GEP-F17 (sekvenssi nro 130) ja GEP-R16 (sekvenssi nro 131), jotka muodostavat 765 nukleotidin HGV-fragmentin.

10 PCR-amplifikaatio oli 35 syklille, 94 °C 1 minuutin ajan, 52 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 3 minuutin ajan. Amplifioidut tuotteet puhdistettiin ja digeroitiin DNaasi I:llä. KL1- ja KL2-linkkerien ligaatio cDNA:han, DNA-frag-menttien amplifikaatio ja kokoelmien rakentaminen lambda 15 gtllrssä suoritettiin olennaisesti kuten esimerkissä 12A kuvataan. Kokoelman rekombinanttifrekvenssi oli suurempi kuin 70 %. Insertin analyysi polymeraasiketjureaktiolla käyttäen alukkeita, jotka johdettiin lambda gtll reunustavista alueista, vahvisti rekombinanttifrekvenssin ja 20 osoitti, että insertin kokoalue oli 150 - 500 nukleotidia.

C. NS3-kokoelma

Ilmennyskokoelma, jota merkitään NS3, rakennettiin seuraavasti. Ensimmäinen fragmentti amplifioitiin polymeraasiketjureaktiolla käyttäen alukkeita 470epF9 (sekvenssi 25 nro 132) ja 470ep-R9 (sekvenssi nro 133) ja mallina PNF 2161 SISPA-amplifioituja nukleiinihappoja. Tämän amplifi-' kaatioreaktion ennustettu tuote oli 777 emäsparia. Ampli- fioitu fragmentti geelipuhdistettiin erottamalla TAE-gee-; Iillä. Fragmenttia puhdistettiin edelleen käyttäen "GENE- 30 CLEAN:a" (Bio 101, La Jolla, CA) .

Fragmentti F9/R9 amplifioitiin myös käyttäen laa-j\t jennuskloonia GE3L-11 (sekvenssi nro 41) lähdemateriaali- . na. Noin 25 ng GE3L-ll:a käytettiin mallina F9 ja R9 aluk- keiden kanssa amplifikaatioreaktioissa.

35 Kumpikin F9/R9-amplifikaatioista oli 30 sykliä, 94 °C 1 minuutin ajan, 52 °C 2 minuutin ajan ja 72 °C 3 minuutin ajan, käyttäen "TAQ START: a” (Clonetech, Palo Aito, CA) . Amplifikaatiotuotteet molemmista reaktiosta X33 1 12249 yhdistettiin. Tuotteet digeroitiin DNaasi I:llä (10 μΐ GE3L-tuotetta ja 25 μΐ PNF SISPA tuotetta). GE3L-pohjäinen amplifikaatiotuote edusti pääosaa amplifikaatiotuotelähtö-aineesta. KL1- ja KL2-linkkerien ligaatio cDNA:han, DNA-5 fragmenttien amplifikaatio ja kokoelmien rakentaminen lambda gtllrssä suoritettiin olennaisesti kuten esimerkissä 12A kuvataan. Saatu tiitteri oli 2,5 x 106 faagia/ml ja rekombinanttifaagin prosenttiosuuden määritettiin olevan yli 99 %. Inserttikokojen polymeraasiketjureaktioanalyysi 10 vahvisti rekombinanttifrekvenssin ja osoitti inserttikoko-alueen 150 - 550 nukleotidia.

Lisäksi, myös toinen fragmentti amplifioitiin käyttäen GEP—F10/GEP-R10 alukkeita (sekvenssi nro 135 ja sekvenssi nro 136, vastaavasti) . Yhtä mikrolitraa PNF 2161 15 SISPA amplifioituja nukleiinihappoja käytettiin mallina. Saatiin ennustettu fragmenttikoko 570 nukleotidia. Saatuja amplifikaatiotuotteita manipuloitiin kuten juuri kuvattiin F9/R9-amplifikaatioille. Tiitteri, joka saatiin tätä fragmenttia varten, kun insertoitiin lambda gtll:een, oli 1,47 20 x 106 faagia/ml, rekombinanttifrekvenssillä 90 %.

D. NS2-kokoelma NS2-epitooppikokoelma rakennettiin käyttäen esimerkissä 12A kuvattuja metodologioita. Neljä DNA-fragmenttia, jotka sisälsivät koko tai osan HGV-proteiineista NS2, NS3 25 ja NS5b, amplifioitiin 1 pirsta PNF 2161 SISPA DNA:ta (valmistettu olennaisesti kuten esimerkissä 12A kuvataan). Kokoelma muodostettiin käyttäen alukkeita, jotka annettiin taulukossa 16, ja SISPA amplifioitua PNF 2162 DNA:ta mal-1 i,: Iina.

i':‘: 30 r 1 »

Taulukko 16 134 1 12249

Fragmentit nt 9E3-REV 592 E2:n aa 358 (389:stä) (sekvenssi nro 264) NS2:n aa 166:een

5 E394-R

(sekvenssi nro 265) GEP-F12 663 NS-2:n aa 144 (313:sta) (sekvenssi nro 266) NS-3:n aa 51:een GEP-R12 10 (sekvenssi nro 267) GEP-F14 715 NS3:n aa 357 - 594 (sekvenssi nro 268) GEP-R13 (sekvenssi nro 269) 15 470epF8 648 NS-5:n aa 716 - 847 (716 (sekvenssi nro 270) loppuun) GEP-R14 (sekvenssi nro 271) 20 Kaikki amplifikaatiot olivat 35 syklille, 94 °C/l minuutti, 48 °C/2 minuuttia ja 73 °C/3 minuuttia. Kaikista amplifikaatioista saatiin ainkin odotetun kokoinen frag- ; » » mentti. Amplifioidut tuotteet sekoitettiin ja noin 1:1:1:1 ; suhteessa ja osittain digeroitiin DNaasi I:llä. Kuten ··♦ 25 edellä, digestointituotteet ligatoitiin KL1 SISPA linkke- . reihin, amplifioitiin ja EcoRI-digeroitiin. Digeroidut , fragmentit ligatoitiin lambda gtll:een. Ligaatioreaktiot pakattiin.

Pakatuista ligaatiotuotteista tehtiin maljaviljel-30 mä. Saatu kokoelma määritettiin sisältämään ~70 % rekom-binanttifaagia havaitun inserttikoon ollessa 150 - 500 nukleotidia.

E. VNS5a-kokoelma

Alukkeita 470EXT4-2189R (sekvenssi nro 119) ja 35 470EXT4-29F (sekvenssi nro 120) käytettiin eristämään 2,1 kb DNA-fragmentti, joka sisälsi koko koodaussekvenssit 135 112249 HGV-proteiineille NS4b ja NS5a, samoin kuin NS4a:n 3'-pää ja NS5b:n 5'-pää. PCR-amplifikaatiot käyttäen näitä aluk-keita suoritettiin kuten esimerkissä 4G kuvataan. Onnistunut amplifikaatio havaittiin moninkertaisesti HGV-infek-5 toituneilla seerumeilla, mukaan lukien seuraavat: T56633 oli verenluovuttajalta, jonka lahjoitus hylättiin johtuen ALT-arvosta, joka on yli rajan; näytteet E21-A ja E20 johdettiin egyptiläisiltä yksilöiltä, jotka kärsivät hepatiitista; ja näyte AH0591 johdetaan australialaiselta yksilö löltä, jolle kehittyi nopeasti kehittyvä hepatiitti. E21-A:n ja E20:n amplifioidut tuotteet kloonattiin vektorin T/A T-ulokekohtaan (saatu InVitrogen:sta, San Diego, CA) olennaisesti kuten esimerkissä 6 on kuvattu. 2,1 kb HGV-insertit näistä kahdesta plasmidista eristettiin sitten 15 noin 20 μ9ζη plasmidi-DNArta digestoinnilla noin 150 yksikön kanssa restriktioentsyymiä EcoRI. Yön yli 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen digestoinnin tuotteet erotettiin TAE-agaroosigeelieletroforeesilla. Tuotteet poistettiin aga-roosigeelin osasta, joka sisälsi kiinnostavan fragmentin.

20 Agaroosi sulatettiin ja vapautetun DNA:n uuttaminen suoritettiin käyttäen "GENECLEAN II" kokoonpanoa valmistajan ohjeiden mukaisesti (Bio 101, La Jolla, CA).

Puhdistetut 2,1 kb fragmentit, jotka johdettiin E21-A ja E20 näytteistä, samoin kuin DNA-fragmentit, jotka r » 25 saatiin näytteiden T56633 ja AH0591 PCR-amplifikaatiosta, digeroitiin erikseen Dnaasi l:n kanssa, kuten esimerkissä * '.V 12A on kuvattu. Kaikille neljälle näytteelle määritettiin digestointiolosuhteet, jotka johtivat kooltaan 100 - 1000 ’ ] · nukleotidin fragmenttien eristämiseen. Puhdistuksen ja ; 30 siistimisen (esimerkki 12A) jälkeen fragmentit, jotka joh dettiin kustakin neljästä HGV-infektoituneesta näytteestä, ligatoitiin erikseen SlSPA-linkkerien eri sarjoihin. Li-gaation jälkeen DNA:t SISPA-amplifioitiin.

Amplifioidut DNA:t digeroitiin erikseen yön yli '· ‘ 35 37 °C:ssa noin 100 yksikön kanssa EcoRI:a. Digeroidut ä..,* DNA:t puhdistettiin sitten spinnikolonnikromatografiällä DNA näytteistä T56633, AH0591 ja E21-A yhdistettiin suh- ; käyttäen G25-hartsia (5'3' Inc., Boulder, CO). Digeroitu » » » 136 1 12249 teessä 1:1:1 ja DNA:iden seos ligatoitiin lgtll:n EcoRI-kohtaan, kuten esimerkissä 12A on kuvattu. Pakkauksen jälkeen käyttäen "GIGAPACK III XL" uutetta (Stratagene, La-Jolla, CA) saadusta kokoelmasta tehtiin maljaviljelmä 5 IPTG:n ja XGAL:n ollessa läsnä, ja tiitterin määritettiin olevan noin 1,0 x 106 faagia/ml ja rekombinanttifrekvenssin noin 70 %.

Esimerkki 13

Epitooppikokoelmien immunoseulonta 10 A. Immunoreaktiivisten Y5-kloonien eristys

Kahta HGV-positiivista seerumia, PNF2161 ja JC, käytettiin Y5-kokoelman immunoseulontaa varten, oleellisesti kuten kuvataan esimerkissä 2. Y5-faagikokoelmasta tehtiin maljaviljelmä 20 levylle noin 15 000 faagia levyä 15 kohti. Levyjä inkuboitiin noin 5 tunnin ajan ja ne päällystettiin nitroselluloosasuodattimilla (Schleiter ja Schuell) yön yli. Suodattimet tukittiin inkubaatiolla AIB:ssä (l-%:inen gelatiini sekä 0,02-%:inen Na-atsidi) noin 6 tunnin ajan. Tukitut suodattimet pestiin kerran 20 TBS:llä.

Kymmentä Y5-kokoelmasuodatinta inkuboitiin yön yli, sekoittaen, PNF2161-seerumin kanssa ja kymmentä suodatinta JC-seerumin kanssa. Molemmat seerumit laimennettiin 1:10 .·. AIB:ssa. Ei-spesifisen vasta-aineen sitoutumisen vähentä- 15» # 25 miseksi laimennettuja seerumeja oli esikäsitelty inkuboi-

I I

‘maila yön yli nitroselluloosasuodattimien kanssa, joihin t * ♦ 1 ) villin tyypin Agtll absorboitiin.

: · t

Suodattimet poistettiin seerumeista, pestiin kolme t * · ' kertaa TBS: llä ja inkuboitiin vuohi-anti-ihmis-alkalisen * *« ; t a V * 30 fosfataasikonjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa (Promega; laimennettu 1/7500 AIB:ssä) yhden tunnin ajan. j Suodattimet pestiin neljä kertaa TBS: llä. Sitoutunut βει kundaarinen vasta-aine havaittiin inkuboimalla suodattimia i

‘ , AP-puskurissa (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris pH

1(, 35 9,5), joka sisälsi NBT:tä ja BCIP:tä.

*;·' Täplät, jotka osoittautuivat positiivisiksi alkupe- j ;*} räisessä seulonnassa, poimittiin ja eluoitiin 500 μl:ssa ;·: PDB: a (100 mM NaCl, 8,1 mM MgS04, 50 mM Tris pH 7,5, 0,02- 137 1 12 2 4 9 %:inen gelatiini). Immunoreaktiivinen faagi puhdistettiin tekemällä uudelleen maljaviljelmä eluoidusta faagista ko-konaistiheydessä 100 - 500 täplää 100 mm maljaa kohti. Maljat immunoseulottiin uudelleen sopivien HGV-positiivis-5 ten seerumien kanssa, oleellisesti kuten edellä kuvataan. Värin kehittymisen jälkeen useita eristettyjä, positiivisia täpliä poimittiin ja laitettiin 500 μl:aan PDB:tä. Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen 2 jul uudelleenpuhdistet-tua faagin PDB-liuosta käytettiin mallina PCR-reaktiossa, 10 joka sisälsi 11F (sekvenssi nro 25) ja 11R (sekvenssi nro 13) PCR-alukkeet. Nämä alukkeet ovat homologisia sekvensseille, jotka sijaitsevat 70 nukleotidia (nt) 5' ja 90 nt 3' Agtll:n EcoRI-kohdasta. PCR-reaktiot amplifioitiin 30 kierroksen avulla 94 °C 1 minuutin ajan, 55 °C 1,5 minuu-15 tin ajan ja 72 °C 2 minuutin ajan.

PCR-amplifikaatioreaktiot kokofraktioitiin aga-roosigeeleillä. Puhdistettujen täplien PCR-amplifikaatio johti yhteen vyöhykkeeseen kullekin yksitäpläamplifikaa-tioreaktiolle, jossa amplifioitu fragmentti sisälsi DNA-2 0 insert in sekä noin 140 emäsparin 5' ja 3' faaginreunustus-sekvenssejä. Amplifioidut tuotteet, PCR-reaktioista, jotka johtivat yksittäisiin vyöhykkeisiin, puhdistettiin käyttäen "S—300 HR" spinkolonnia (Pharmacia), seuraten valmistajien ohjeita. DNA kvantitoitiin ja DNA sekvensoitiin käyt-. · · 25 täen Applied Biosystemsin automatisoitua sekvensseriä . 373A ja sopivia menettelyjä.

: Y5-kokoelman edellä kuvattu seulonta JC-seerumien kanssa johti taulukossa 17 esitettyjen positiivisen säi-, keen kloonien puhdistukseen ja DNA-sekvensointiin. Posi- J·, 30 tiivisen säikeen kloonit, jotka vastaavat sekvenssissä nro 14 esitetyn HGV-sekvenssin, polyproteiinin lukukehys, 5' -3' translaatiota.

138 1 12249

Taulukko 17

Klooni Seulon- Insert- Insert- Nukle- Koodattu tasee- tikoko tikoko iini- proteiiniini (emäs- (amino- happo ni sekv.

paria) happoa) sekv. nro nro Y5-10 JC 210 62 64 65 Y5-12 JC 333 94 66 67 5 Y5-26 JC 303 93 68 69 Y5-5 JC 153 36 70 71 Y5-3 JC 162 44 72 73 Y5-27 JC 288 86 74 75 Y5-25 JC 165 36 76 77 10 Y5-20 JC 165 191 78 79 Y5-16 JC 234 56 80 81 1 Klooni sisälsi kaksoisinsertin, klooni-insertin nukleotidit 69 - 126 vastaavat HGV-sekvenssejä.

15 Nämä kloonit kuvasivat kaksi immunogeenistä aluetta , : : HGV:n oletetussa NS5-proteiinissa. Nämä kaksi aluetta, suhteessa sekvenssiin, joka esitetään sekvenssinä nro 14, . ovat asemat 6636 - 6821 ja 7278 - 7385.

Lisäksi, Y5-kokoelman seulonta PNF 2161 seerumeilla 20 johti seuraavien taulukossa 18 esitettyjen negatiivisen !!'. säikeen kloonien puhdistukseen ja DNA-sekvensointiin. Ne- * · · ’ gatiivisen säikeen kloonit vastaavat sekvenssin, joka on komplementaarinen sekvenssille, joka esitetään sekvenssis-‘ sä nro 14, 5' - 3' translaatiota.

V : 25

I t * t I

I ( · i : I ·

Taulukko 18 139 112249

Klooni Seulon- Insert- Insert- Nukle- Koodat- tasee- tikoko tikoko iini- tu pro- rumit (emäs- (amino- happo teiini paria) happoa) sekv. sekv.

nro nro Y5-50 PNF 2161 349 104 82 83 Y5-52 PNF 2161 119 201 84 85 5 Y5-53 PNF 2161 250 332 86 87 Y5-55 PNF 2161 143 203 88 89 Y5-56 PNF 2161 366 110 90 91 Y5-57 PNF 2161 231 65 92 93 Y5-60 PNF 2161 151 38 94 95 10 Y5-63 PNF 2161 1254 25 96 97

Klooni sisälsi kaksoisinsertin, klooni-insertin nukleotidit 46 - 105 vastaavat HGV-sekvenssejä.

2

Klooni sisälsi kaksoisinsertin, klooni-insertin 15 nukleotidit 19 - 118 vastaavat HGV-sekvenssejä.

3

Klooni sisälsi kaksoisinsertin, klooni-insertin .··, nukleotidit 70 - 126 vastaavat HGV-sekvenssejä.

4

Insertti sisältää ylimääräisen, ei-HGV-sekvenssin I nukleotidien 19 ja 35 välillä.

20 Kaikki nämä sekvenssit sisältävät alkuperäisen HGV-

’··’ kloonin 470-20-1 osia, jotka on eristetty käyttäen PNF

· 2161 seerumia.

Lisäepitooppikloonit Y5-kokoelmasta eristettiin . ; *.· seuraavasti. Y5-kokoelma seulottiin HGV-infektoituneilla 25 seerumeilla J21689 ja T56633 käyttäen esimerkissä 13 ku-’. vattuja menetelmiä. Saatiin yli 400 positiivista täplää, ,,, mikä osoittaa vahvasti immunogeenisen sekvenssin läsnä- i : *;· olon, joka tunnistetaan molemmilla näistä HGV-infektoitu- : : : neista seerumeista. Kymmenen näistä positiivisista täplis- i i i i i » » 112249 140 tä puhdistettiin ja DNA sekvensoitiin. DNA sekvensoinnista saadut tulokset kuvataan taulukossa 19.

Taulukko 19 5 Klooni HGV VAR Seerumit Alku* Loppu Y5-114-1A PNF J21689 6636 6827 Y5-114-2B PNF J21689 6678 6935 Y5-121-19A PNF T56633 6678 7063 Y5-121—11A PNF T56633 6636 6917 10 Y5-121-12A PNF T56633 6636 6959 Y5-121-15A PNF T56633 6636 6917 Y5-121-16A PNF T56633 6636 6989 Y5-121-17A PNF T56633 6636 7082 Y5-121-20A PNF T56633 6636 6929 15 Y5-121-18A PNF T56633 6636 6896 * alku/loppu-kohdat annetaan suhteessa sekvenssiin nro 14.

Näiden sekvenssien vertailu niiden kanssa, jotka 20 saatiin aikaisemmin tämän kokoelman seulonnasta, osoittivat, että nämä kloonit kaikki sisälsivät saman epitoopin (epitoopit) , jotka sisältyvät aikaisemmin eristettyyn epi- ··.: tooppiklooniin Y5-10. Kaksi klooneista, Y5-114-2B ja Y5- > :121-19A, erotetaan sillä tosiasialla, että niiden 5'-päät i : : 25 sijaitsevat 14 aminohappoa lähempänä NS5a:n karboksipää- tettä kuin aikaisemmin havaittu kloonien Y5-10, Y5-12 ja |··#> Y5-26 alku. Millään edellä olevista klooneista ei ole sen ,·;·. 3'-pää sisäpuolella kloonissa Y5-10 havaitun kanssa. Siten • _ tämän epitoopin minimisekvenssi sisällytetään aminohap- 30 posekvenssiin (sekvenssi nro 272).

* · * B. Antigeenikloonit ENV-kokoelmasta : .·. ENV-kokoelma seulottiin HGV-seerumilla J21094. Tämä seerumi (J21094) identifioitiin HCV-positiiviseksi perus- 141 112249 tuen ensimmäisen sukupolven (c-100) HCV-testiin. Alkuperäisen J21094 seeruminäytteen myöhempi testaus, ja myöhemmin saatujen J21094-näytteiden, PCR:llä ja muilla HCV-an-tigeeneillä varmisti, että lähdeyksilö seerumia varten oli 5 HCV-infektoitunut. Todisteet HGV-nukleiinihapon läsnäoloa varten saatiin PCR-analyysin kautta käyttäen 470-20-1 ja NS5 alukesarjoja.

Lukuisat faagikloonit identifioitiin immunoreaktii-visiksi J21094-seerumin kanssa. Faagi täpläpuhdistettiin 10 ja sekvensoitiin. Seitsemän klooneista (Q7-12-1, Q7-16-2-2, Q7-15-2, Q7-17-2-1, Q7-19-1 ja Q7-19-2-1) sisälsi saman insertin. Nukleotidisekvenssi Q7-12-1 varten esitetään sekvenssinä nro 143 (polypeptidisekvenssi, sekvenssi nro 144) .

15 Yhdellä lisäkloonilla, Q7-16-1, joka saatiin juuri kuvatulla menetelmällä, on sama 5'-pää kuin Q7-12-l:llä, mutta se on 26 aminohappoa lyhyempi 3'-päässä.

C. Antigeenikloonit NS3-kokoelmasta

Yhden suhde yhteen seos F9/R9-faagia ja F10/R10-20 faagia seulottiin käyttäen seuraavia seerumeja: PNF 2161, J21689 ja E57963. Sekä J21689 että E57963 ovat seerumeja, jotka osoittautuvat yhteispositiivisiksi HCV:lie ja HGV:lle PCR:llä (käyttäen moninaisia alukkeita). Kukin immunoseulonta oli 10 maljaa tai noin 150 000 faagia. Joi-: · · 25 takin näissä seulonnoissa identifioituja immunopositiivi- : siä klooneja ovat seuraavat.

; Klooni Y12-10-3 (polynukleotidisekvenssi, sekvenssi nro 145; polypeptidisekvenssi, sekvenssi nro 146) identi-, fioitiin sen immunoreaktiivisuudella J21689-seerumin kans- ·';·. 30 sa. Klooni ilmentää 88 aminohapon insertin HGV NS3:sta.

Klooni Y12-15-1 (polynukleotidisekvenssi, sekvenssi nro 147; polypeptidisekvenssi, sekvenssi nro 148) identi-·' ” fioitiin sen immunoreaktiivisuudella E57963-seerumin kans- '·* sa. Klooni ilmentää 64 aminohapon insertin HGV:n NS3-pro- ;·*· 35 teiinista. Tämä sekvenssi sijaitsee noin 70 aminohappoa 5' ,···. klooniin Y12-10-3.

D. Antigeenikloonit NS2-kokoelmasta 112249 142

Monenlaisia positiivisia täpliä eristettiin seulomalla NS2-kokoelma HGV-positiivisella seerumilla T56633. yksitoista näistä täplistä puhdistettiin ja DNA-sekvensoi-tiin myöhemmin. Näiden täplien sisältämien inserttien si-5 jainnit (suhteessa sekvenssiin nro 14) kuvataan taulukossa 20.

Taulukko 20

Klooni HGV VAR Seerumit Alku* Loppu Q9-18-5 PNF T56633 3071 2778 10 Q9-18-3 PNF T56633 2951 2745 Q9-20-4 PNF T56633 3002 2745 Q9-18-2 PNF T56633 2990 2745 Q9-20-8 PNF T56633 3062 2745 Q9-20-5 PNF T56633 2972 2787 15 Q9-17-1 PNF T56633 2990 2745 Q9-19-3 PNF T56633 2982 2745 Q9-19-1 PNF T56633 2982 2745 Q9-19-5 PNF T56633 2984 2745 ; Q9-20-2 PNF T56633 3027 2745 . ·; 20 . * Tässä taulukossa sijainnit annetaan suhteessa sek- venssiin nro 14. Kloonien todellinen sekvenssi on mainitun fragmentin komplementti.

11! Kaikki immunokloonit ilmentävät osia samasta avoi- i : : 25 mesta lukukehyksestä (ORF). Tämä lukukehys koodataan HGV-polynukleotidisäikeellä, joka on komplementaarinen sek-• *’ venssille, joka koodaa polyproteiinin. Tämä ORF laajenee V · sekvenssin, joka on komplementaarinen sekvenssille nro 14, —·. nukleotidien 6322 ja 6865 välille. Siellä on metioniini, ···. 30 joka voisi toimia translaation aloituskohtana, joka si jaitsee komplementaarisen säikeen nukleotidissä 6388, joka : sallisi 159 aminohapon proteiinin tuotannon.

» » * f · I » 112249 143

Pienin aminohapposekvenssi, joka on yleinen kaikille 11 sekvensoidulle kloonille, sijaitsee nukleotidien 6342 - 6606 välillä (suhteessa sekvenssin nro 14 komplementaariseen säikeeseen). Aminohapposekvenssi, joka kooda-5 taan tällä HGV-PNF 2161:n negatiivisen säikeen alueella, esitetään sekvenssinä nro 273.

Immunoreaktiivisten negatiivisen säikeen alueiden subkloonaus ja myöhempi Western blot -analyysi kuvataan alla.

10 E. Antigeenikloonit VNS5a-kokoelmasta

Noin 1,5 x 105 faagista VNS5a-kokoelmasta tehtiin maljaviljelmä ja myöhemmin seulottiin HGV-positiivisella seerumilla J29374 käyttäen esimerkissä 13 kuvattuja menetelmiä. VNS5a-kokoelman immunoseulonta J29374:n kanssa 15 johti monenlaisten positiivisten täplien eristämiseen.

Kuusi näistä täplistä puhdistettiin ja myöhemmin DNA-sek-vensoitiin. Saadun DNA-sekvenssin alkuperäinen kanta voitiin määrittää, sillä mikä SISPA-linkkerisekvensseistä oli läsnä kloonien 5'- ja 3'-päässä. Saatujen kloonien alku-20 ja loppuasemat (suhteessa sekvenssiin nro 14) ja niiden lähdeseerumit kootaan taulukkoon 21.

Taulukko 21

Klooni HGV varianttilähde seerumit Alku Loppu *

Qll-14-2 AH0591 J29374 6525 6749 ,V 25 Qll-16-1 E21-A J29374 6432 6935

Qll-10-2 T56633 J29374 6579 6710

Qll-18-2 T56633 J29374 6579 6758

Qll-22-1 T56633 J29374 6576 6680

Qll-9-1 T56633 J29374 6531 6851 30 " * Kaikki nämä kloonit sisältävät kloonin Qll-22-1 ',.,*· sekvenssin yhteisesti (sekvenssi nro 274) . Tämä aminohap- ; ,·. posekvenssi sijaitsee heti 5' Y5-10 epitoopin minimise- kvenssiin. Siten se määrittelee lisänä ainutlaatuisen epi- 144 1 12249 toopin HGV NS5a:ssa (yhdessä Y5-10 ja Y5-5 kanssa). Näiden kolmen HGV-variantin havaitun aminohapposekvenssin vertailu PNF-2161- ja JC-isolaattien sekvenssin kanssa paljastaa muutamia aminohapposubstituutioita.

5 Esimerkki 14

Immunoreaktiivisten kloonien lisäkarakterisointi A. Subkloonaus 1. Y5-kloonit

Kloonit Y5-10, Y5-16 *ja Y5-5 valittiin ilmennysvek-10 toriin pGEX-HisB subkloonausta varten. Suunniteltiin PCR-alukkeet, jotka poistivat vieraat linkkerisekvenssit näiden kloonien päässä. Nämä alukkeet liittivät myös (i) Ncol-kohdan kunkin insertin 5'-päähän (koodaussekvenssiin liittyvä), ja (ii) BamHI-kohdan kunkin insertin 3'-päähän.

15 Käyttäen näitä alukkeita (katso taulukko 22) DNA-fragmen-tit amplifioitiin 2 ^l:sta täpläpuhdasvarastoa.

Taulukko 22

Klooni Alukesarja Y5-10 Y5-10-F1 sekvenssi nro 99 Y5-10-R1 sekvenssi nro 100 20 Y5-16 Y5-16F1 sekvenssi nro 101 470ep-R3 sekvenssi nro 102 ;,j | Y5-5 Y5-5-F1 sekvenssi nro 103 ;470ep-R3 sekvenssi nro 102 ·;· Amplifikaatiot suoritettiin seuraavasti: 30 sykliä s 94 °C 1 minuutin ajan, 50 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 2 ,‘j'. 25 minuutin ajan. Amplifikaation jälkeen saadut DNA:t puhdis tettiin käyttäen "WIZARD PCR" kiertokolonneja, näytteet .. eluoitiin 50 μΙιεεΆ ja digeroitiin yön yli NcoI:lla ja t | t

BamHI:lla. Minimiä 3 0 yksikköä kutakin entsyymiä käytet- I » · '' tiin restriktioendonukleaasidigestoinnissa (Ncol, Boehrin- *:·*: 30 ger Mannheim, BamHI, Pr omega) .

Γ": Digeroidut PCR-fragmentit ligatoitiin yön yli il- , mennysvektoriin pGEX-HisB, joita oli digeroitu Ncol:n ja ) BamHI:n kanssa. Kutakin ligatoitujen plasmidien sarjaa 145 1 12 2 4 9 käytettiin itsenäisesti muuttamaan E. coli kanta W3110 käyttäen lämpöshokkimenettelyä (Ausubel, et ai.; Maniatis, et ai.). Transformantit valittiin LB-levyillä, jotka sisälsivät 100 /zg/ml ampisilliiniä, ja resistenttejä pesäk-5 keitä käytettiin siirrostamaan 2 ml LB:tä, joka sisälsi 100 μ9/ιη1 ampisilliiniä. Valmistettiin myös viljelmiä, jotka ilmensivät ei-rekombinantti sj26/his-proteiinin.

Yön yli 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen viljelmät laimennettiin 1/10 2 ml:aan tuoretta LB:tä sekä ampisil-10 liiniä ja kasvatettiin vielä 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. IPTG lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0,2 mM ja viljelmiä kasvatettiin vielä 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Bakteerit pel-letoitiin sentrifugoinnilla ja bakteeripelletti suspendoi-tiin uudelleen 100 /iltaan PBSta. Pellettiin lisättiin 100 15 /xl 2x SDS-näytepuskuria (0,125 M Tris, pH 6,8, 10-%:inen glysiini, 5-%:inen β-merkaptoetanoli, 2,3-%:inen SDS) . Saatuja lysaatteja käsiteltiin vortexilla ja kuumennettiin 100 °C:seen 5 minuutin ajan. Kunkin lysaatin erät panostettiin 12-%:iseen akryyliamidi SDS-PAGE-geeliin.

20 Ilmennetyt proteiinit kokofraktioitiin elektrofo reesilla. Erotetut proteiinit siirrettiin geelistä nit-roselluloosasuodattimiin käyttäen standarditekniikoita (Harlow, et ai.). Lisägeeli, joka sisälsi ilmennetyt proteiinit, värjättiin käyttäen coomassie-sinistä prote-5 25 iinitahraa.

Transformantit, joissa on plasmidit Y5-10, Y5-5 ja ; Y5-16, ilmensivät merkittäviä määriä koon mukaan oikein lajiteltuja rekombinanttifuusioproteiineja. Rekombinantti-f ,·. fuusioiden identiteetti vahvistettiin inkuboimalla Western ;*t 30 blot (valmistettu edellä) hiiren monoklonaalisen vasta- t « · aineen kanssa, joka on spesifisesti immunoreaktiivinen sj26:n kanssa (Sierra BioSource, Gilroy, CA) .

: ” Lisävahvistus, että valitut pesäkkeet sisälsivät V ' sopivan insertin, saatiin seuraavasti. Faagiliuos kullekin ·;··· 35 pesäkkeelle valmistettiin siirrostamalla 40 μΐ TE-liuosta ,·*·. hammastikulla, joka sisälsi pienen määrän bakteereja, jot ka oletetusti ilmensivät rekombinanttikloonin, joka oli I t * · * 146 1 12249 siirrostettu. 5 μ1:η näyte otettiin kustakin liuoksesta ja PCR-amplifioitiin erikseen.

Amplifikaatiot käyttivät sopivaa etualuketta (esim. Y5-10 F pesäkkeelle, joka oletettavasti ilmentää Y5-10:n) 5 ja käänteisaluketta (sekvenssi nro 14) , joka on homologinen sekvenssiin, joka sijaitsee 3' plasmidin pGEX-HisB kloonauskohtiin. PCR-amplifikaatiot olivat 25 sykliä varten seuraavat: 94 °C 1 minuutin ajan, 50 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 2 minuutin ajan. Kaikki pesäkkeet, jotka 10 valittiin lisäanalyysiä varten, tuottivat koon mukaan oikein lajitellun DNA-vyöhykkeen, jossa ei ollut muita ilmeisiä vyöhykkeitä näissä olosuhteissa.

Y5-10, Y5-16 & Y5-5 inserteistä ilmentyneiden antigeenien immunoreaktiivisuus (ilmennettynä sj26-his fuu-15 sioproteiineina) määritettiin seuraavasti. Edellä valmistettujen raakalysaattien erät (15 μΐ) kokofraktioitiin SDS-PAGE:lla käyttäen 12-%:ista akryyliamidigeeliä. Proteiineista suoritettiin elektroforeesi ("NOVEX MINICELL MI-NIBLOT II", San Diego, CA) nitroselluloosasuodattimille. 20 Suodattimia inkuboitiin sitten yksitellen yhden seuraavis-ta seerumeista kanssa: JC, PNF 2161 ja supernormaali seerumi 4 (SN4) (R05072) negatiivisena kontrollina. Lisäksi, yhtä suodatinta inkuboitiin anti-sj26 monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (RM001; Sierra BioSource).

» : 25 Kuten odotettua, rekombinanttiproteiini, joka tuo- ,it: tettiin bakteereilla, jotka ilmentävät antigeenejä, joita : Y5-10, Y5-5 ja Y5-16 insertit koodaavat, kaikki reagoivat ··· JC-seerumien kanssa. Reaktiivisuutta ei havaittu PNF 2161- . eikä SN4-seerumeilla. Kaikki proteiinit näyttivät ilmenty- t 9 ;·, 30 vän samanlaisilla tasoilla kuin määritettiin niiden reak- 1 · · tiivisuudella anti-sj26 monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Y5-5 ja Y5-10 koodatut proteiinit valittiin lisäpuhdistus-ta varten.

' E. coli, jossa on Y5-5- ja Y5-10- sisältävät pGEX- *:*": 35 HisB-vektorit viljeltiin ja fuusioproteiinin ilmentyminen t*’‘: aiheutettiin, kuten edellä on kuvattu. Solut hajotettiin , *. PBS:ssä, joka sisälsi 2 mM PMSF:n, käyttäen French Pressiä ··· ΐ paineessa 1500 psi (10,3 MPa) . Raakaa lysaattia sentrifu- t » 112249 147 goitiin, jolloin solujätteet poistettiin. Supernatantti panostettiin glutationiaffiniteettikolonniin suurella virtausnopeudella ja kolonni pestiin 10 PBS:n kolonnitilavuu-della. Y5-5 ja Y5-10 fuusioproteiineja eluoitiin 10 mM 5 Trisrllä pH 8,8, joka sisälsi 10 mM glutationia.

Kukin fuusioproteiininäytteistä laimennettiin 1/10 puskurilla A (10 mM Tris pH 8,8, joka sisältää 8 M ureaa) ja panostettiin nikkelillä varattuun kelatoivaan "SEPHARO-SE" nopean virtauksen kolonniin. Kutakin kolonnia pestiin 10 toistuvasti puskurilla A, kunnes lisää kontaminantteja ei eluoitunut. Fuusioproteiinit eluoitiin käyttäen imidatso-lin gradienttia puskurissa A. Imidatsoligradientti ajettiin 0 - 0,5 M imidatsoli 20 kolonnitilavuudessa. Fraktiot otettiin talteen.

15 Kukin fraktiosarja analysoitiin standardi SDS-PA- GE:lla käyttäen 12-%:isiä polyakryyliamidigeelejä. Y5-5 ja Y5-10 fuusioproteiinin sisältävien fraktioiden varastot tehtiin erikseen.

Kuvat 8A - 8D osoittavat tulokset seuraavien näyt-20 teiden Western blot -analyysistä ^g/kaista): Kaista 1, Y5-10 antigeeni 1,6 μg; kaista 2, Y5-10 antigeeni 0,8 μg; kaista 3, Y5-10 antigeeni 0,4 μg; ja kaista 4, Y5-10 antigeeni 0,2 μg. Ihmisen seerumi JC (kuva 8A) ja Super Normal 2 seerumi (kuva 8B) laimennettiin 1:100. Anti-GST hiiren ;.· i 25 monoklonaalinen vasta-aine RM001 (kuva 8C) laimennettiin ί : 1:1000. Kuva 8D osoittaa Y5-10 antigeenin, joka erottuu : SDS-PAGE:lla ja joka siirretään nitroselluloosamembraaniin * » ··· ja värjätään Ponceau S proteiinitahralla (Kodak, Roches-

> M I

, /. ter, NY; Sigma). Nuoli osoittaa Y5.10 antigeenin sijain- » · » ·;·, 30 nin. Nämä tulokset osoittavat, että Y5-10 on spesifisesti ' · · immunoreaktiivinen N-(ABCDE) ihmisen seerumin JC kanssa.

Kuvat 9A - 9D osoittavat tulokset seuraavien näyt- * ’* teiden Western blot -analyysistä: kaista 1, Y5-5 antigeeni • * * 3,2 μg; kaista 2, Y5-5 antigeeni 1,6 μg; kaista 3, Y5-5 ·;♦*· 35 antigeeni 0,8 μg; kaista 4, Y5-5 antigeeni 0,4 μg; kaista 5, Y5-5 antigeeni 0,2 μg, kaista 6, GE3-2 antigeeni 0,4 i * ♦ μg; ja kaista 7, Y5-10 antigeeni 0,4 μg. Ihmisen seerumi 1 * » ·’’· | JC (kuva 9A) , T55806 (kuva 9B) ja Super Normal 2 seerumi # » » > » i » 148 1 12249 (kuva 9C) laimennettiin 1:100. RMOOl, anti-GST hiiren mo-noklonaalinen vasta-aine (kuva 9D) laimennettiin 1:1000. Nuoli osoittaa antigeenien Y5.5, GE3.2 ja Y5.10 sijainnit. Nämä tulokset osoittavat Y5-5 antigeenin spesifisen im-5 munoreaktiivisuuden JC-seerumin kanssa. Lisäksi, antigeenit GE3-2 ja Y5-10 olivat reaktiivisia T55806:n kanssa. Kuitenkin Y5-5 antigeeni ei ollut reaktiivinen HGV-posi-tiivisten seerumien T55806 kanssa.

Myös Y5-10 antigeeni kokofraktioitiin SDS-polyak-10 ryyliamidigeelielektroforeesilla. Geeli värjättiin käyttä en coomassie-sinistä proteiinitahraa. Geelistä skannattiin puhtaus laserdensitometrillä. Y5-10 fuusioproteiinin puhtaus oli noin 95 %.

2. ENV-kloonit 15 Immunoklooni Q7-12-1 eristettiin alunperin seulo malla ENV-epitooppikokoelmaa HGV-positiivisilla seerumeilla J21094. Sekvenssispesifisiä alukkeita käytettiin eristämään HGV-insertti, joka sisältyi Q7-12-1 Igtll klooniin. Q7-12-1 insertti poistettiin ja kloonattiin pGEX-Nde:iin.

20 Insertin sekvenssi vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla (sek venssi nro 275).

3. NS3-kloonit

Immunoklooni Y12-15-1 eristettiin alunperin seulomalla NS3-epitooppikokoelmaa HGV-positiivisilla seerumeil- i ; : 25 la E57963 . Sekvenssispesif isiä alukkeita käytettiin eris- tämään HGV-insertti, joka sisältyi Y12-15-1 Igtll kloo-V,· niin. Y12-15-1 insertti poistettiin ja kloonattiin pGEX- ';· Nde:iin. Insertin sekvenssi vahvistettiin DNA-sekvensoin- • nilla (sekvenssi nro 276) .

, ’r. 30 Immunoklooni Y12-10-3 eristettiin alunperin seulo malla NS3-epitooppikokoelmaa HGV-positiivisilla seerumeilla J21689. Sekvenssispesifisiä alukkeita käytettiin eris-

* » I

tämään HGV-insertti, joka sisältyi Y12-10-3 Igtll klooniin. Y12-10-3 insertti poistettiin ja kloonattiin pGEX-35 Nde:iin. Fuusioproteiinien tuotanto valitulla kloonilla t’“: arvioitiin Western blot -analyysillä. Insertin sekvenssi vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla (sekvenssi nro 277) .

4. NS2-kloonit 112249 149

Eristettiin moninkertaisen negatiivisen säikeen immunokloonit, jotka johdettiin sekvensseistä, jotka ovat komplementaarisia sekvenssin nro 14 NS2-alueen sekvensseille. On olemassa ainakin 2 merkittävää ORF:ia, jotka 5 koodataan HGV:n negatiivisella säikeellä. Ensimmäinen näistä ORF:ista, joka esitetään kloonien Q9-sarjalla, kuvattiin edellä. Toinen näistä ORF:ista sijaitsee sekvenssin nro 14 komplementin nukleotidien 6723 ja 7259 välillä ja omaa myös 5' metioniinin nukleotidissa 6774. Toinen ORF 10 koodaa 162 aminohapon proteiinin.

Molempien näiden negatiivisen säikeen ORF:ien sekvenssien valitut osat kloonattiin ilmennysvektoriin pGEX-Nde. Kaikki näistä subklooneista saatiin PNF 2161 SISPA materiaalin PCR-amplifikaatiolla käyttäen sopivia oli-15 gonukleotidialukkeita, siten ne sisältävät HGV-PNF 2161 variantin sekvenssin. Taulukko 23 esittää nimet, ORF: n koon ja sijainnit koskien sekvenssin nro 14 komplementtia.

Taulukko 23

Nimi/ORF ORF Nukleotidis- Nukleotidiin tä (ATG) 20 5' NEG ORF 159 AA 6388 6865 3' NEG ORF 162 AA 6722 7258 * _ ~~ ” ;,! ; NORF-F1/R1 3' 7107 7259 ·' NORF-F4/R1 3' 6900 7259 > « i NORF-F4/KR2 3' 6901 7172 • ;*! 25 NORF-F2/R1 3' 6744 7259 NORF-KF2/R4 5' 6684 6865 NORF-KF1/R2 5' 6881 6742 - > f .

! NORF-F3/R2 5' 6389 6742 NORF-F2/R3 3' 6744 6899 » 11 _______ _. _ -_______ _ ^^ t * ’’I*' 30 K3P-KF2/KR1 5' 6684 6772 i 3' 6744 6791 t . I t

i - - — * - - I

1ΙΪ»! “ iso 112249 Tämän taulukon ensimmäiset kaksi riviä identifioivat NS2-alueen 5' ja 3' negatiivisen säikeen ORF:ien sijainnit koskien sekvenssin nro 14 komplementtia. Jäljelle jäävät rivit esittävät spesifiset nukleotidisekvenssit, 5 jotka ilmentyvät kaikilla yhdeksästä kloonista. Huomaa, että useat klooneista ilmentävät aminohappoja, jotka sijaitsevat 5' hypoteettiseen HGV:n aloittavaan ORF:n me-tioniiniin. Huomaa myös, että viimeinen listattu klooni, K3p-KF2/KR1, on kimeeri, joka ilmentää 5' ORF:n osoitetut 10 osat, joita seuraavat 3' ORF:n osoitetut osat.

Kaikki DNA-fragmentit kloonattiin myöhemmin pGEX-Nde:iin. Insertti, joka sisältää kloonit, myös identifioitiin ja vahvistettiin.

5. NS5a-kloonit 15 Taulukko 24 listaa lukuisia NS5a-klooneja ja sek venssin nro 14 alueita, joita ne vastaavat.

Taulukko 24

Nimi HGV-lähde Alku Loppu EXY10-F2 PNF 6416 6827 20 EXY10-F3 PNF 6537 6827 Q11-F1-R1 T56633 6537 6680 ; · Q11-F1-R2 T56633 6537 6827 Q11-F2-R1 T56633 6576 6680 Q11-F2-R2 T56633 6576 6827 25 Y5-12 PNF 6633 6917 EXY12 PNF 6918 6977 _ EXY10F14 PNF 6822 6977 t i * * • # Nämä sekvenssit kloonattiin vektoriin pGEX-Nde koo- 30 dattujen proteiiniantigeenien ilmentymistä varten.

B. Valittujen HGV-subkloonien Western blot -analyysi : Sekä negatiivisten että positiivisten edellä kuvat- tujen säierakenteiden reaktiivisuuden määrittämiseksi ko- 151 112249 kosolulysaatit bakteereista, jotka ilmentävät erilaisia HGV-subklooneja, valmistettiin olennaisesti kuten esimerkissä 13B kuvataan. Ilmennettyjen proteiinien erät fraktioitiin SDS-PAGE:11a, proteiinit siirrettiin nitrosellu-5 loosasuodattimille ja suodattimet tutkittiin HGV-positii- visilla tai kontrolliseerumeilla (esim. anti-SJ26 MAB RM01). Näytelevyjä inkuboitiin sopivan reportterivasta-aineen kanssa.

Mitä tulee testattuihin HGV-proteiineihin, selvä 10 immunoreaktiivisuus proteiinille NORF-F3/R2 havaittiin HGV-seerumien J21689 ja T56633 kanssa. N0RF-F3/R2-subkloo-ni ilmentää aminohapposekvenssejä, jotka koodattiin myös Q9 sarjalla negatiivisen säikeen epitooppiklooneja. Havaittu voimakas reaktiivisuus HGV-seerumien T56633 kanssa 15 vahvistaa HGV:n negatiivisen säikeen tämän alueen im- munoreaktiivisuuden. Reaktiivisuutta NORF-F3/R2-proteiinille ei havaittu seerumeilla, jotka ovat HGV-negatiivi-sesta R04316:sta, tai millään viidestä muusta HGV-negatii-visesta supernormaalista seerumista, jotka testattiin.

20 Lisänäytelevyt, jotka osoittivat, että toinen pää 5'-ORF-klooni NORF KF2-R4, joka ilmentää 5' negatiivisen säikeen 0RF:ssä sijaitsevan karboksipäätepuolen aminohappoja, ei reagoi HGV-positiivisten seerumien T56633 kanssa. Tämä havainto yhdessä edellä kuvattujen Q9-epitooppikloo-t>··, 25 nien sijaintien kanssa viittaa siihen, että negatiivisen säikeen tämän osan immunogeeninen epitooppi sisältyy 55 ’ ; aminohappoon, jotka kuvataan edellä (sekvenssi nro 273) .

··*; Se tosiasia, että tämä sekvenssi tunnistetaan muilla HGV- l:·' antiseerumeilla, mukaan lukien J21689, osoittaa, että im- *.· ' 30 munoreaktiivisuus tätä sekvenssiä kohtaan on suhteellisen laajalle levinnyt HGV-infektoituneiden yksilöiden joukos-sa.

Lisäksi, selvä immunoreaktiivisuus Y12-10-3 prote-’ . iinin kanssa havaittiin HGV-infektoituneulla seerumeilla

* I · I I

35 J21689, J29374 ja E57963. Tämän reaktiivisuuden spesifi- syyttä tuetaan lisäksi kykenemättömyydellä havaita im-: munoreaktiivisuus HGV-antiseerumeilla J29374 tai E57963 » * > i ·;·· Y12-10-3 proteiini-ilmentymisen induktion IPTGtllä ollessa

S

152 1 12249 poissa. Reaktiivisuutta Y12-10-3:een ei havaittu millään seitsemästä testatusta supernormaalista seerumista.

Esimerkki 15

Multiantigeeni HGV:n diagnostinen analyysi 5 Vaikka edellä kuvatut epitooppikloonit eivät näytä olevan reaktiivisia kaikkien HGV PCR-positiivisten seerumien kanssa, monet näistä klooneista reagoivat HGV:llä infektoituneiden seerumien oleellisen fraktion kanssa, joita vastaan ne on testattu. Lisäksi nämä proteiinit ei-10 vät ole osoittaneet oleellista ristireaktiivisyyttä HGV-negatiivisten seerumien kanssa. Siksi on mahdollista suunnitella diagnostinen analyysi, jossa useat näistä proteiineista yhdistetään niin, että proteiinin yksittäiset reaktiivisuudet summataan. Tällaisella analyysillä odotetaan 15 olevan suhteellisen suuri herkkyys HGV-positiivisten seerumien detektiota varten ja suhteellisen alhainen tausta-reaktiivisuus HGV-negatiivisten seerumien kanssa.

Tyypillisiin epitooppeihin/antigeeneihin, jotka ovat käyttökelpoisia tällaisessa analyysissä, kuuluvat, 20 näihin kuitenkaan rajoittumatta, NORF-F3/R2 (NS2-Neg säie), Y12-10-3 (NS3), Q11-F2-R1 (NS5a), Y5-10 (NS5a), Y5-5 (NS5a), Q11-F2-R2 (yhdistää kaksi NS5a:n epitooppia).

Tätä analyysiä varten valitaan tyypillisesti yksit-, . täiset antigeenit, jotka sisältävät erilaisia ainutlaatui- ,··. 25 siä epitooppeja, jotka tunnistivat erilaisen HGV-positii- visten seerumien osajoukon. Lisäksi tällaiset antigeenit ! eivät tyypillisesti reagoi merkittävästi HGV-negatiivisten ’··; seerumien kanssa. Seuraten tämän keksinnön opastusta lisää käyttökelpoisia immunogeenisiä klooneja voidaan eristää.

’ 30 Multiantigeenin diagnostinen analyysi voi olla mo nissa muodoissa. Yhdessä toteutusmuodossa analyysi saattaa t · j tuoda mukanaan kunkin, et ai., 5 HGV-proteiinin ja kont- rolliproteiinien immobilisoinnin erillisissä paikoissa nitroselluloosasuikaletta, tai muun sopivan kiinteäfaasi-... 35 muodon. Vaihtoehtoisesti, esimerkiksi HGV-fuusioproteiinin ei-virusosia voitaisiin modifioida joko insertioilla tai | : : deleetioilla niin, että ne voisivat kulkeutua luonnolli- ·;··· sesti helposti erotettaviin kohtiin SDS PAGE: 11a ja myö- 153 1 12 2 4 9 hemmin Western blot -analyysillä. Suikaleita inkuboidaan sitten koeseerumeissa. Sitoutuneen vasta-aineen detektion jälkeen seerumia voidaan sitten arvioida perustuen (i) antigeenien lukumäärään, joiden kanssa se on immunoreak-5 tiivinen, ja (ii) immunologisten reaktioiden vahvuuteen. Reaktiivisuus ei-HGV kontrolliproteiinille tekisi seerumin tyypittymättömäksi. Reaktiivisuus ei-HGV-proteiinin kanssa luokittelisi seerumin HGV-negatiiviseksi.

ELISA-pohjäinen seulonta-analyysi voidaan muodostaa 10 yhdistämällä puhdistetut antigeeniproteiinit yksittäisessä reaktiovyöhykkeessä tai luomalla proteiinirakenteet, jotka ilmentävät kahta tai useampaa reaktiivsta epitooppia yksittäisenä proteiinina (esim. HGV-mosaiikkipolypeptidi). Menetelmiä mosaiikkipolypeptidien rakentamiseksi kuvataan 15 tässä. Q11-F2-R2 rakenne, joka on kuvattu edellä, itse asiassa, edustaa "matriisiproteiinia", joka koodaa kaksi yksittäistä epitooppia yhdessä polypeptidiketjussa. Western blot -analyysi voi toimia varmistavana analyysinä tällaista ELISA-selontakoetta varten.

20 Vaihtoehtoisesti tai lisäksi, täysipituiset HGV- proteiinit, kuten E2, NS5a ja NS3, voitaisiin asettaa yksittäiseen reaktioalueeseen. Seerumit, jotka ovat reaktiivisia tällaisten proteiinien kanssa, voidaan myös varmis-taa HGV-positiivisiksi Western blot -analyysillä.

25 Esimerkki 16

Suurten HGV-polypeptidien ilmentyminen A. Suurempien HGV-antigeenien ilmentyminen E. co- ' lissa i : : ;;; l. Kloonaus ja ilmentäminen i : : • 30 Konformaatio-HGV:n epitooppien identifioimiseksi (ei peitetty pienillä limittyvillä HGV-rakenteilla tai :faagikokoelman seulonnalla) pET-21a(+) vektorissa (Nova-V : gen, WI) muodostettiin suurempia HGV-proteiinirakenteita perustuen pilkkomiskohdan ennustamiseen (Bazan, et ai., ···. 35 1989; Chambers, et ai., 1990b; Grakoui, et ai., 1993; kyte ja Doolittle, 1982) . Yksittäiset HGV-proteiinirakenteet : muodostettiin samanlaisella tavalla kuin HGV-sekvenssit kloonattiin pGEX-vektoreihin.

112249 154

Lyhyesti, valitut HGV-sekvenssit RT-PCR amplifioi-tiin HGV(+) ihmisen seerumilähteestä käyttäen HGV-sekvens-sispesifisiä alukkeita. Alukkeet valmistettiin sisältämään sopivat restriktiokohdat kloonausmanipulaatioita varten 5 pET-vektorissa. Kiinnostavat koodaussekvenssit insertoi-tiin tyypillisesti EcoRI-kohdan ja Hindlll-kohtien välille vektorissa, jolloin tuotettiin 5' kehysfuusiot T7.Tag joh-tosekvenssin kanssa ja 3' kehysfuusio heksameerihisti-diinisekvenssin kanssa. T7.Tag (11 aminohapon sekvenssi) 10 sallii fuusioproteiinien detektion käyttäen anti-T7.Tag monoklonaalista vasta-ainetta (Novagen, WI) . Histi-diiniheksameeri fuusioproteiinin karboksyylipäässä sallii proteiinin puhdistuksen käyttäen immobilisoidun metalli-ionin aff initeettikromatograf iaa.

15 HGV-fragmentit ligatoitiin sopivasti digeroituihin pET-21a(+) vektoreihin. Ligatoidut tuotteet muutettiin vaadituksi E. coliksi (HMS174; Novagen, WI) . Plasmidi DNA:sta muutetusta HMS174:stä analysoitiin HGV-sekvenssien läsnäolo PCR:llä käyttäen alukkeita T7F (sekvenssi nro 20 157) ja T7R (sekvenssi nro 158), jotka ovat homologisia pET-21a(+) vektorisekvensseille, jotka reunustavat inser-toitua molekyyliä. PCR-tuotteen koko oli insertin koko plus noin 260 emäsparia, jotka on johdettu vektorista.

: ; Kullekin rakenteelle PCR-tulokset vahvistivat in i’'25 serttisekvenssien läsnäolon. Valittiin transformantit, . joissa on sopivat insertit, plasmidi DNA:t, joissa on HGV- insertit, valmistettiin ja liitettiin HMS174(DE3) vaadit-tuun E. coliin (Novagen, WI) HGV-proteiinien ilmentämistä varten.

t : :

30 HGV-proteiinien ilmentyminen saatiin aikaan 1 mM

IPTG:llä. T7.Tag fuusioproteiinien ilmentymistä tarkkail-: ’· tiin ennustetun koon proteiinien esiintymisellä Coomassie v : sinisellä värjätyllä geelillä. Fuusioproteiinien ilmenty- minen vahvistettiin Western blot -analyysillä käyttäen ··, 35 anti-T7.Tag vasta-ainetta (Novagen, WI) . HGV-proteiinit, joka ilmentyi pET-21a(+) vektorissa, esitetään taulukossa i 25. Ilmentyneiden sekvenssien alku- ja loppukohdat anne- 155 1 12249 taan koskien sekvenssiä nro 14. GE-Cap:n aminohapposekvenssi esitetään sekvenssissä nro 185.

Taulukko 25

Nimi Ala Seeru- Alku Loppu HGV aa Koko miläh- (KDa) de 5 GE-Cap kapsi- T55806 271* 480* 70 11 di GE-Ela El PNF 594 1148 185 24 GE-E2 E2/NS1 PNF 1149 2183 345 41 GE- NS2b PNF 2904 3254 117 16 NS2b 10 GE-NS3 NS3 PNF 3255 5081 609 70 GE- NS4a PNF 5082 6083 334 40 NS4a GE- NS4b PNF 6084 6536 151 20 NS4b 15 GE-NS4 NS4 PNF 5082 6536 485 57 GE- NS5a PNF 6537 7529 331 39 » » NS5a . .·. GE- NS5b PNF 7530 9044 505 59 NS5b

• · · · I l m I I . . . ... \ —I

( ,·. 20 Nama sekvenssit annetaan koskien sekvenssiä nro 178.

'1^ Kuva 12 esittää kunkin HGV-proteiinin ilmentymisen esitettynä Western blot -analyysillä T7.Tag monoklonaali-sen vasta-aineen kanssa. Kaistat kuvassa 12 ovat seuraa- t t : “ vat: Kaista 1, esivärjätty moolimassaleima (Bio-Rad); V ‘ 25 Kaista 2, indusoimaton GE-Cap lysaatti; Kaistat 3 - 11, GE-Cap, Elä, E2, NS2b, NS3 NS4a, NS4b, NS4 ja vastaavasti ,···, NS5b lysaatin IPTG-indusoidut lysaatit. Kaista 12 sisälsi » · • 1 Mg puhdistettua NS5a:ta. Kunkin antigeenin sijainnit ’ ·’. *. merkitään nuolenpäillä. Kuten kuvassa 12 esitetään kaikki 30 HGV-proteiinit ilmennetään E. colissa.

112249 156 2. pET-vektorissa ilmennettyjen HGV-proteiinien Western blot -analyysit pET-vektorissa ilmennetyn HGV-proteiinin Western blot -analyysi suoritettiin kuten esimerkissä 11C kuvataan 5 käyttäen E. colin kokosolulysaatteja ja esiabsorboituja seerumeja. Näiden analyysien tulokset osoittivat, että useat pET HGV-proteiinit ovat spesifisesti immunoreaktii-visia HGV-positiivisten ihmisseerumien kanssa, mutta eivät HGV-negatiivisten ihmisseerumien kanssa. GE-NS2b-l prote-10 iini oli immunoreaktiivinen J21689 seerumin kanssa. GE-NS5a-3 proteiini oli immunoreaktiivinen useiden HGV (+) seerumien kanssa Western blot -analyysillä, mukaan lukien JC:n, T55806:n, T56633:n, J21689:n, E57963:n ja ROOOlrn.

Näiden seerumien joukossa T55806, J21689 ja E57963 ovat 15 HCV yhteispositiivisia (PCR-analyysillä). Ei GE-NS2b-l eikä GE-NS5a-3 ollut immunoreaktiivinen useiden testattujen HGV-negatiivisten seerumien kanssa.

Kuvat 10A - 10F esittävät tulokset sarjasta Western blot -kokeita, jotka tutkivat antigeenien GE-NS2b ja GE-20 NS5a3 reaktiivisuutta. Kaistat kussakin kuvien 10A - 10F näytelevyssä ovat seuraavat: Kaista 1, indusoimaton GE-NS2b lysaatti; Kaista 2, IPTG-indusoitu GE-NS2b lysaatti; Kaista 3, indusoimaton GE-NS5a lysaatti; ja Kaista 4, IPTG-indusoitu GE-NS5a lysaatti. Kutakin näytelevyä inku-·, 25 boitiin ihmisen seerumin tai hiiren monoklonaalisen vasta- i aineen kanssa: Kuva 10A, J29374; Kuva 10B, J21689; Kuva '; 10C, T56633; Kuva 10D, T43608 (supernormaali seerumi); ·*' Kuva 10E, anti-T7.Tag; ja Kuva 10F, coomassie-vär jätty l * * geeli. Seerumi tai monoklonaalinen vasta-aine, jota käy-f.· ’ 30 tettiin, osoitetaan edellä kussakin näytelevyssä. Ihmisen seerumit laimennettiin 1:100 ja anti-T7.Tag hiiren mono-: klonaalinen vasta-aine laimennettiin 1:1000.

Edellä listattujen seerumien lisäksi HGV-PCR posi-‘ . tiivisia lisäseerumeita on seulottu käyttäen GE-NS5a:a.

> I I t | ,,, 35 Kaikkien näiden analyysien tulokset ovat osoittaneet GE- ·' NS5a antigeenin reaktiivisuuden moninkertaisten HGV-infek- toituneiden seerumien kanssa.

112249 157 GE-NS5b oli immunoreaktiivinen HGV(+) seerumien JC ja T55806 kanssa, mutta ei ollut immunoreaktiivinen testattujen HGV(-) negatiivisten seerumien kanssa. Kuvat 13A - 13E osoittavat tulokset sarjasta Western blot -kokeita, 5 jotka tutkivat antigeenin GE-NS5b reaktiivisuutta. Kaistat kussakin kuvien näytelevyssä ovat seuraavat: Kaista 1, esivärjätty moolimassaleima (Bio-Rad); Kaista 2, indusoi-maton GE-NS5b lysaatti; Kaista 3, IPTG-indusoitu GE-NS5b lysaatti.

10 Kutakin näytelevyä inkuboitiin ihmisen seerumin tai hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa: Kuva 13A, anti-T7.Tag monoklonaalinen vasta-aine; Kuva 13B, JC; Kuva 13C, T55806; ja Kuva 13D, T43608 (supernormaali seerumi). Kuva 13E on coomassie-tahra.

15 Kuvat 14A - 14D osoittavat tulokset sarjasta Wes tern blot -kokeita, jotka tutkivat antigeenin GE-E2 reaktiivisuutta. Kaistat kussakin kuvassa 14A - 14D ovat seuraavat: Kaista 1, esivärjätty moolimassaleima (Bio-

Rad); Kaista 2, indusoimaton GE-E2 lysaatti; Kaista 3, 20 IPTG-indusoitu GE-E2 lysaatti. Kutakin näytelevyä inkuboitiin ihmisen seerumin tai hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa: Kuva 14A, anti-T7.Tag monoklonaalinen vasta-aine; Kuva 14B, 3831781; ja Kuva 14C, T43608 (supernor-maali seerumi). Kuva 14D on coomassie-tahra. Seerumi tai 25 monoklonaalinen vasta-aine, jota käytettiin, osoitetaan edellä kussakin näytelevyssä. GE-E2 proteiini oli im-*· ;' munoreaktiivinen HGV-positiivisen seerumin 3831781 kanssa, <·: mutta ei ollut immunoreaktiivinen supernormaali seerumin ι.;.' T43608 kanssa (Kuvat 14B ja 14C, vastaavasti) .

* 30 Antigeenit GE-Cap ja GE-NS4a olivat myös spesifi sesti immunoreaktiivisia HGV(+) seerumin J21689 kanssa.

B. Suurempien HGV-antigeenien ilmentyminen hyön- teissoluissa • t Proteiinien ilmentyminen käyttäen rekombinantti » » · * » 35 baculoviruksia tarjoaa seuraavat edut (i) korkean tason rekombinanttiproteiinin ilmentymisen, ja (ii) suuremman : eukarioottisen systeemin edut, mukaan lukien tehokkaan proteiinin kuljetuksen ja modifikaation. Tämä systeemi on 112249 158 erityisen käyttökelpoinen kuljetettujen proteiinien, esim. HGV El, E2 ja NS2a, ilmentymistä varten.

1. Kloonaus ja ilmentyminen

Spodoptera frugiperda hyönteissoluviljelmää Sf21 ja 5 Autografa californica nukleaarisen polyhedroosiviruksen "BACULOGOLD" johdannaista (Pharmingen, San Diego, CA) käytettiin HGV-polypeptidien ilmentämistä varten. Vakiintuneita menettelyjä käytettiin hyönteissoluviljelyä varten ja rekombinantti baculoviruksien muodostamista varten ba-10 culoviruksen plasmidinsiirtovektorien yhteistransfektiolla linearisoidun baculovirus DNA:n kanssa (King, 1992). Tavanomaisia menetelmiä käytettiin baculoviruksen plasmi-disiirtovektorien rakentamiseksi (Maniatis, et ai.; Sam-brook, et ai.).

15 Baculoviruksen siirtovektori pAcYMl (King, et ai., 1992) modifioitiin ligatoimalla kaksisäikeinen oligonukle-otidi, joka koodaa histidiiniheksameerin, vektorin BamHI kloonauskohtaan (vektoria merkitää pAcYMIH). Pysäytyskodo-ni (TAA) asetettiin histidiiniheksameerisekvenssin jäl-20 keen. Tämä tarjoaa histidiiniheksameerin ilmentyneiden proteiinien karboksipäässä. pAcYMl kantavektorin BamHI kloonauskohta säilyi koskemattomana pAcYMIH:ssä ja sitä voitiin käyttää erilaisten geenien kloonaukseen kehyksessä olevan histidiiniheksameerin kanssa. Histidiiniheksameeri 25 tarjoaa nopean ja tehokkaan ilmentyneen proteiinin puhdis-tusmenetelmän (Janknecht, et ai., 1991).

I > I

Toinen baculoviruksen siirtovektori, pVT-Bac, modi- i · · ’>·· fioitiin myös samanlaisella tavalla, jolloin saatiin his- tidiiniheksameeri ilmennettyjen proteiinien karboksipää-1 .· · 30 hän. pVT-Bac, kuten pAcYMl-vektori, sisältää vahvan myö häisen polyhedriinipromoottorin. Lisäksi, pVT-Bac tarjoaa myös vahvan hyönteisen kuljetussignaalisekvenssin varmis-tamaan ilmentyneiden proteiinien tehokas siirtyminen (Tes- » • , sier, et ai., 1991). pVT-Bac vektoria modifioitiin liga- » * » » » 35 toimalla kaksisäikeinen oligonukleotidi, joka koodaa his-tidiiniheksameerin, vektorin BamHI kloonauskohtaan (saa-: ·'; daan pVT-BacH vektori) . pVT-Bac kantavektorin BamHI kloo- nauskohta säilyy koskemattomana saadussa pVT-BacH vekto- 112249 159 rissa ja sitä voidaan käyttää geenien kloonaamiseksi kehyksessä olevan hyönteisen johtosekvenssin ja histi-diiniheksameerisekvenssin kanssa.

DNA-fragmentit, jotka koodaavat erilaisia HGV-gee-5 nejä, saatiin käänteistranskriptio PCRillä. HGV-genomin alueet valittiin ennustettujen pilkkomiskohtien mukaisesti (Bazan, et ai., 1989; Chambers, et ai., 1990b; Grakoui, et ai., 1993; Kyte ja Doolittle, 1982). Seuraavia alukepareja käytettiin RT-PCR amplifikaatioreaktioissa käyttäen PNF 10 2161 lähdenukleiinihappoa: El, sekvenssi nro 242, sekvens si nro 243; E2B (HGV signaalisekvenssi), sekvenssi nro 244, sekvenssi nro 245; E2C (hyönteisen signaalisekvenssi), sekvenssi nro 246, sekvenssi nro 247; NS2a, sekvenssi nro 248, sekvenssi nro 249; NS2b, sekvenssi nro 250, sek-15 venssi nro 251; NS3, sekvenssi nro 252, sekvenssi nro 253; NS4a, sekvenssi nro 254, sekvenssi nro 255; NS4b, sekvenssi nro 256, sekvenssi nro 257; NS5a, sekvenssi nro 258, sekvenssi nro 259; NS5b, sekvenssi nro 260, sekvenssi nro 261; ja El-E2-NS2a, sekvenssi nro 262, sekvenssi nro 263.

20 Amplifioituja DNA-fragmentteja digeroitiin Bam HI

tai Bglll endonukleaasien kanssa ja kloonattiin BamHI leikattuun pAcYMI, pAcYMIH, pVT-Bac tai pVT-BacH vektoreihin. Sekvenssit, jotka koodaavat hydrofobista sekvenssiä NS5b:n karboksipäässä, tuhottiin myöhempien proteiinipuhdistusten I ♦ ' · 25 helpottamiseksi.

•( Rekombinantti baculoviruksen plasmidisiirtovekto- » l · ’ rit, jotka sisältävät HGV-sekvenssejä, yhteistransfektoi- tiin linearisoidun baculoviruksen DNA:n kanssa ja rekom- i : : ;;; bmanttivirukset valittiin valkoisina pesäkkeinä X-gal:n * 30 ollessa läsnä (King, et ai., 1992). Rekombinanttivirukset täpläpuhdistettiin kahdesti ja kasvatettiin. Sf21-solujen I * ; '·· yksinkertaiset kerrokset infektoitiin rekombinantti bacu- ;*:*: loviruksilla multiplisiteetillä 5 p.f.u solua kohti ja , inkuboitiin 27 °C:ssa 60 tunnin ajan. Solut pestiin

.35 PBS:llä ja liuotettiin TNN-puskuriin (50 mM Tris-HCl pH

8,0, 150 mM NaCl, 0,5-%:inen "NONIDET-P40") . Inkluusio- » · * osat eristettiin pyörittämällä solunäytteitä 14k 5 minuu- *.·**: tin ajan. Inkluusio-osat suspendoitiin uudelleen prote- 112249 160 iinidissosiaatiopuskuriin (l0-%:inen 2-merkaptoetanoli, 10-%:inen SDS, 25-%:inen glyseroli, 10 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,02-%:inen bromifenoli-sininen) ja inkuboitiin 100 °C:ssa 10 minuutin ajan.

5 Proteiinin ilmentymismallit analysoitiin SDS-PAGE:- 11a. Proteiinit erotettiin 0,l-%:isella SDS-18-%:isella PAGE:11a ja värjättiin Coomassie loistavan sinisellä. Pääosa HGV-proteiineista ilmennettiin korkealle tasolle ja voitiin havaita helposti Coomassie sinisellä värjätyillä 10 geeleillä. NS5a ja NS2a polypeptidit havaittiin 3BS-me-tioniinin proteiinileimauksella (King, et ai., 1992).

HGV E2 proteiinin glykosylaatiota tutkittiin seuraavasti. Sf2l-solut infektoitiin rekombinantti baculovi-ruksilla ja käsiteltiin kuten edellä kuvataan. Proteiinit 15 erotettiin 0,1-%:isella SDS-12-%:isella PAGE:11a, suoritettiin elektroforeesi "IMMOBILON-P" membraanilla (Milli-pore, Bedford, MA) ja saatettiin reagoimaan Galanthus nivalis agglutiniinin kanssa (Boehringer Mannheim DIG Glycan erilaistumiskokoonpano), joka on spesifinen mannoosiryh-20 mille. HGV E2 proteiini, joka esiintyi oman signaalisek-venssinsä kanssa, glykosyloitiin laajasti, mikä osoitti, että ennustettu E2 signaalisekvenssi voi toimia sellaisenaan.

2. Immunofluoresenssimääritysanalyysi 25 SF21 hyönteisen solut infektoitiin edellä kuvatuil- la baculovirus-HGV-rakenteilla. Solut otettiin talteen * > * ’’ ; pyörittämällä kierrosnopeudella 1,5 K rpm 3 minuutin ajan, pestiin lx PBS:ssa ja pyöritettiin uudelleen.

1. i. * Immunofluoresenssianalyysiä (IFA) (King, et ai., V : 30 1992) varten solut suspendoitiin uudelleen PBS:iin ja ker rostettiin lasilevyjen kuoppiin siten, että solut muodos-tivat puoliyhtyvän kerroksen lasilevyjen kuopissa. Lasile- .’j\ vyt kuivattiin ilmassa. Solut kiinnitettiin esijäähdyte- ' , tyllä -70 °C:lla asetonilla 10 minuutin ajan ja rehydra- »tili ‘ ' 35 toitiin PBS:llä 5 minuutin ajan. Ylimäärä PBS:a poistet- i · *’*' tiin suorittamalla elektroforeesi. Kiinnitettyjä soluja ’ käsiteltiin yhden tunnin ajan seuraavalla "suojauspusku- rilla": 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 3-%:inen vuohen seerumi, 1- 112249 161 %:inen BSA, l-%:inen rasvaton maito ja 0,l-%:inen gelatiini.

Primaarinen vasta-aine lisättiin sitten kiinnitettyihin soluihin. Primaarisiin vasta-aineisiin kuuluvat 5 sarja ihmisen HGV-positiivisia seerumeja ja positiivinen kontrolli monoklonaalinen vasta-aine. Ennen käyttöä seerumit esiabsorboitiin mitä tulee ei-spesifisiin proteiineihin käyttäen hyönteissolulysaattia. Esiabsorptio suoritettiin yön yli 4 °C:ssa. Infektoimattomia SF21-soluja käy-10 tettiin negatiivisena konrtollina. Valitun primaarisen vasta-aineen (seerumien) lisäyksen jälkeen lasilevyjä in-kuboitiin 2 tunnin ajan, sitten pestiin useita kertoja PBS:llä ja ylimäärä puskuria poistettiin. Sekundaarinen vasta-aine, joka oli konjugoitu fluoreseiinilla (0,5 μg/ml 15 väk.), lisättiin sitten lasilevyillä oleviin näytteisiin.

Inkubointiaika ja lämpötila sekundaariselle vasta-aineelle oli sama kuin primaariselle vasta-aineelle. Inkuboinnin jälkeen lasilevyt pestiin PBSrllä ja varustettiin peitela-silla. Sitten määritettiin solujen fluoresenssi käyttäen 20 fluoresenssimikroskooppia.

Tämän analyysin tulokset olivat seuraavat. Solut, jotka ilmensivät HGV-antigeenin El-E2-NS2a, olivat im-munoreaktiivisia 4/10 HGV-positiivisten seerumien kanssa ' ja heikosti immunoreaktiivisia vielä 2/10 seerumien kans- 25 sa. Solut, jotka ilmensivät El: n, olivat heikosti im- f » munoreaktiivisia 1/10 seerumien kanssa. Solut, jotka il- * * * mensivät E2:n, olivat immunoreaktiivisia 3/10 seerumien f I f ’* *. kanssa ja heikosti immunoreaktiivisia 1/10 seerumien kans- i » sa. Mikään soluista, joissa oli HGV-antigeenejä, ei ollut * 30 immunoreaktiivinen supernormaalien kontrolliseerumien kanssa.

! t • ·· 3. Baculovektorissa ilmentyneiden HGV-proteiinien

Western blot -analyysejä

Rekombinantti baculoviruksella infektoituneissa - * » » i 35 Sf21 hyönteissoluissa ilmentyneiden HGV-proteiinien Wes- i » ;** tern blot -analyysit suoritettiin myös. Inkluusio-osat ; : ! valmistettiin kuten edellä on kuvattu ja saatettiin alt- ;‘*i tiiksi Western blot -analyysille. Western blot -analyysi 112249 162 suoritettiin käyttäen esiabsorboituja seerumeita. Analyysien tulokset osoittivat, että E2-proteiinit (yksi variantti, jossa on endogeeninen HGV-signaalisekvenssi, E2B, ja toinen variantti, jossa on hyönteisen signaalisekvens-5 si, E2C) olivat spesifisesti immunoreaktiivisia HGV(+) seerumin 3831781 kanssa.

Kuvat 15A - 15D esittävät tulokset sarjasta Western blot -kokeita, jotka tutkivat baculoantigeenin E2B ja E2C reaktiivisuutta. Kaistat kuvien 15A - 15D kussakin näyte-10 levyssä ovat seuraavat: Kaista 1, esivärjätty moolimassa-leima (Bio-Rad); Kaista 2, E2B-lysaatti; Kaista 3, E2C-lysaatti; Kaista 4, β-galaktosidaasilysaatti. Kutakin näy-televyä inkuboitiin ihmisen tai kanin seerumin kanssa: Kuva 15A, kanin anti-E2 vasta-aine; Kuva 15B, 3831781 15 (HGV-PCR-positiivinen seerumi); Kuva 15C, 3838857 (HGV- negatiivinen seerumi). Kuva 15D coomassie-tahra. Seerumi tai kanin vasta-aine, jota käytetään, osoitetaan edellä kussakin näytelevyssä. Ihmisen seerumit laimennettiin 1:100 ja kanin seerumi laimennettiin 1:1000.

20 Lisäksi, HGV-antigeeni NS2b proteiini, joka esiin tyi hyönteissoluissa, oli immunoreaktiivinen J21689:n kanssa. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä tulosten kanssa, jotka saatiin pET-ilmennetyillä HGV-proteiineilla.

C. Suurempien antigeenien ilmentyminen lehmänrokos- 25 sa 1. Kloonaus ja ilmentyminen

Erilaisia HGV-genomin alueita yhdistettiin lehmän-rokkoviruksen genomiin ilmentymistä varten. Tyypillinen HGV-polypeptidin ilmentymisstrategia annetaan kuvassa 16.

: 30 HGV (PNF 2161 variantti) proteiinit, jotka ilmentyi leh- mänrokkoviruksessa, havainnollistetaan skemaattisesti ku-_ vassa 16. Täysipituinen polyproteiini vedetään (ei mitoi- teta) avoimella laatikolla, joka osoittaa ennustettujen > ^ proteiinien alueet: C = erittäin emäksinen proteiini, 4A = 35 NS4A, 4B = NS4B, 5a = NS5A, 5b = ND5B. Yksittäiset laati- kot, joissa on nukleotidiasemat (polyproteiinin alla) , ; .·, esittävät tyypillisiä HGV:n alueita lehmänrokkoviruksessa ilmentymistä varten. Numero laatikossa merkitsee rekom- 112249 163 binanttiviruksen nimeä. Virus #1 johdettiin erittäin emäksisestä HGV-tahran T55806 (sekvenssi nro 185) proteiini-alueesta .

Kaksi rekombinanttivirusten sarjaa muodostettiin.

5 Ensimmäinen sarja sisälsi HGV-sekvenssit, jotka vastaavat yksittäisiä proteiinialueita, jotka perustuvat HGV cDNA:n sekvenssianalyysiin (Kuva 16, fragmentit #1 - #9) . Toinen sarja sisälsi HGV-sekvenssit, jotka käsittivät monenlaisia proteiinialueita, jopa täysipituisen HGV-genomin (Kuva 16, 10 #10, #11, #14).

Erilaisia HGV-genomin alueita kloonattiin lehmänro-kon ilmennysvektorin monikloonauskohtaan. Käytettiin re-kombinantti lehmänrokkoviruksen ilmennyssysteemiä, joka käsitti bakteerifaagin T7-systeemin ja E. coli lac repres-15 sorin korkean tason indusoivaa ilmentymistä varten (Fuerst, 1986; Elroy-Stein, 1989; Alexander, 1992; Moss, et ai.). Siksi rekombinanttiproteiini ilmennetään vain indusoijän ollessa läsnä, kuten isopropyyli-beta-D-tioga-laktosidin (IPTG). Sekä suoraa kloonausta että PCR:a käy-20 tettiin plasmidin rakentamista varten. Jälkimmäisessä restriktioendonukleaasikohdat, jotka ovat sopivia lehmän-rokkovektoriin kloonausta varten, sisällytettiin alukkei-siin, joita käytettiin almpifioimaan yksittäistä DNA-frag-, , menttia.

‘II.’ 25 Myös polyhistidiini-tag sisällytettiin jokaiseen '*··* klooniin, joka kattoi HGV:n yksittäiset alueet ilmentynei- den proteiinien puhdistuksessa käytettäväksi. HGV-PCR amp-lifikaatiotuotteita digeroitiin sopivien restriktioentsyy-mien kanssa ja ligatoitiin lehmänrokkovektoriin. Kohde-i ! : 3 0 HGV:n cDNA-fragmentit yhdistettiin lehmänrokkoviruksen genomiin homologisen rekombinaation ja lääkkeen (myko-fenolihappo) valinnan avulla (Falkner, 1988, Earl, 1991) . Rekombinanttivirus täpläpuhdistettiin 4 kertaa ennen kuin > » · virusvarasto muodostettiin.

* ' 35 Kunkin kloonin pituus nukleotideissä osoitetaan !,,,: kuvassa 16. Ryhmä pienempiä klooneja (#1 - #9) on käyttö- ; kelpoinen HGV-epitoopin kartoitusta varten. Suuremmat kloonit (esim. #10, #11 ja #14) ovat myös käyttökelpoisia 164 1Ί2249 HGV-polyproteiinin pilkkomiskohtien kartoittamiseksi kokeellisesti. Kuvassa 16 esitettyjen kloonien lisäksi lisä-rekombinanttiviruksia, jotka kattavat monenlaisia alueita NS3:sta NS5B:hen, voidaan rakentaa.

5 Ilmennysplasmidit transfektoitiin nisäkässoluihin, jotka on infektoitu kantalehmänrokkoviruksella. CV-1 ja BS-C-1 soluja pidettiin Minimum Essential Mediumissa (MEM), jota täydennettiin 10-%:isella naudansikiöseerumil-la. Soluja käytettiin transfektiota (CV-1) ja rekombinant-10 tiviruksen valintaa ja lisääntymistä varten.

2. Rekombinanttiproteiinin ilmentymisen arviointi BS-C-1 solut infektoitiin rekombinanttiviruksella IPTG:n ollessa läsnä tai poissa 7 tunnin ajan, minkä jälkeen soluj leimattiin 35S-metioniinilla vielä toisen tunnin 15 ajan (Zhang, 1991). Lyhyesti, 1 x 106 BS-C-1 solut infektoitiin rekombinanttiviruksella moninkertaisinfektiossa (MOI) 10 täplän muodostavaa yksikköä (PFU) solua kohti 1 tunnin ajan ja sitten täydennettiin väliaineella 5 mM IPTGrn ollessa läsnä tai poissa vielä 6 tunnin ajan. Solut 20 pulssileimattiin (pulse-label) 600 μ1:1ΐΒ metioniinitonta väliainetta, jota täydennettiin 2,5-%:isella dialysoidulla naudansikiöseerumilla sekä 60 ^Ciilla. (2,2 MBq) 35S-me-tioniinia ("TRAN 35S-LABEL", ICN, Costa Mesa, CA) 5 mM IPTG:n ollessa läsnä tai poissa toisen 60 minuutin ajan. 25 Leimatut solut hajotettiin sitten jäällä 10 minuutin ajan < « ··;’ 100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl:n ja l-%:isen "TRIton X- 100":n ollessa läsnä. Ytimiä pyöritettiin ja supernatantti ·.: otettiin talteen analyysiä varten.

‘Solulysaatti analysoitiin SDS-polyakryyliamidigee-• < · : 30 lielektroforeesilla (Fling, 1986; Schagger, 1987) . Geelit kiinnitettiin 50-%:isella metanolilla ja 10-%:isella etik-kahapolla ennen kuin niitä käsiteltiin fluorografialiuok-sella "AMPLIFY" (Amersham, Arlington Heights, IL) . Geelit • t kuivattiin ja altistettiin röntgenfilmille.

35 Käyttäen tätä menetelmää HGV-polypeptidien ilmenty- 1..." minen viruksilla, jotka sisältävät insertit #4 - #11 ja • #14 (kuva 16) , on vahvistettu. Polypeptidin, joka vastaa muita alueita, ilmentyminen vahvistetaan samanlaisella 112249 165 tavalla. Esimerkiksi NS5a-rakenteessa IPTG:n induktion jälkeen tuotettiin ainutlaatuinen polypeptidi, joka kulkeutui juuri 46 KDa proteiinistandardin alle. Tätä proteiinia ei nähty infektiossa IPTG-induktion ollessa poissa, 5 jolloin luotiin proteiinin identiteetti NS5a rekombinant-tiproteiinina.

Lisäksi, rajoitettuja immunosaostuksia käyttäen HGV aluespesifisiä antiseerumeja (esimerkiksi kanin antiseerumit, jotka kasvatettiin eristettyä HGV-polypeptidiä vas-10 taan kiinnistavalta alueelta) yksittäisistä virusinfekti oista saatua 35S-Met-leimattua solulysaattia vastaan suoritettiin arvioimaan proteiinin ilmentymistä rekombinantti-viruksista. Esimerkiksi, NS2:n, NS3:n, NS4B:n, NS5A:n ja NS5B:n ilmentyminen on vahvistettu. Vaihtoehtoinen mene-15 telmä rekombinanttiproteiinin ilmentymisen arvioimiseksi on suorittaa Western blot -analyysi HGV-aluespesifisillä antiseerumeilla.

Kun täysipituinen HGV-polyproteiini ilmennetään #14 viruksessa (kuva 16), NS2:n, NS3:n ja NS5A:n käsitellyt 20 tuotteet havaittiin käyttäen immunosaostusta HGV aluespesif isten antiseerumien kanssa, mikä osoittaa täysipitui-sen HGV-kloonin käyttökelpoisuuden arvioimaan polyproteii-nin käsittelyä.

Käyttäen ilmentymisstrategiaa, joka on samanlainen 25 kuin kuvassa 16 esitetty, HGV-proteiinien/antigeenien eh- ··' dokkaat voidaan ilmentää hiiva- tai CHO-soluissa. Hiiva tarjoaa suuren ilmenemisasteen, taloudellisen operaation ja kaupalliseen tuotantoon skaalauksen helppouden. CHO-'/;/· solulinjat sallivat rekombinanttiproteiinien erittymisen ; : : 30 kasvuväliaineeseen suuren mittakaavan proteiinituotantoa varten ja puhdistuksen, joka on käyttökelpoinen esimerkiksi rokotteen kehittämistä varten.

··· Esimerkki 17 HGV-koodattuja erittäin emäksisiä proteiineja 35 A. Metioniinin, jota käytetään aloitusta varten HGV:n translaatiossa, määrittäminen PNF:stä ja T55806:sta ; .·. Metioniini, joka sijaitsee nukleotidissa (nt) 459 ti; (sekvenssiin nro 14 liittyvä) HGV-PNF 2161 variantissa, on 166 112249 kehyksessä polyproteiinin kanssa. "Kapsidi"-alue näyttää olevan 32 aminohappoa pitkä. Toisissa HGV-isolaateissa, kuten T55806, tämä alue on pidempi (esim. noin 83 aminohappoa). Metioniini, joka sijaitsee nt:ssä 349 (sek-5 venssiin nro 14 liittyvä) HGV-PNF 2161 variantissa, ei ole kehyksessä polyproteiinisekvenssin kanssa, mutta metioniini samassa asemassa HGV-T55806 variantissa on kehyksessä polyproteiinin kanssa. Sen tarkastamiseksi onko siinä lä-pilukua tai ribosomaalista rakennemuutosta tässä asemassa 10 HGV-PNF 2161:ssä suoritettiin seuraavat kokeet.

Tehtiin rakenteita, jotka sisältävät (i) HGV geno-misekvenssejä, joissa kaikki MET-kodonit ovat HGV El alueesta ylöspäin (esim. HGV-PNF 2161:ssä on kuusi tällaista MET:a ja viisi tällaista T55806:ssa), (ii) kaksi erilaista 15 3'-päätä kullekin rakenteelle, jolloin sallitaan sen mää rittäminen tapahtuuko läpiluvun ribosomimuutosta. Annetulle genomi-DNA:lie, jos molemmat translatoidut tuotteet ovat samankokoisia, se viittaa siihen, että ne päätetään ennen aikojaan pysäytyskodonissa. Toisaalta, jos läpiluku 20 tai rakennemuutos tapahtuu, odotetaan kahta tuotetta, jot ka eroavat 55 aminohapolla.

Yhteensä 21 rakennetta, jotka sisältävät sekvenssejä varianteista HGV-PNF 2161 ja HGV-T55806, subkloonattiin pGEX-vektorissa ja vastaavat proteiinit ovat E. colissa.

- · 25 Saatujen translaatiotuotteiden koot määritettiin sekä Coo- massie värjätyillä geeleillä että Westerneillä, jotka tah-V.: rattiin monoklonaalisella anti-GST vasta-aineella. In- dusoidut ja ei-indusoidut näytteet valmistettiin kullekin , rakenteelle.

j':’. 30 Tulokset osoittivat, että proteiinituotteiden koko vastasi sitä, jota odotettiin translaatiolla aloittaen .. polyproteiinin ensimmäisessä MET kehyksessä. Rakennemuu- » 4 · toksesta tai läpiluvusta ei ollut todisteita.

ί : : * > · · · > · · » · · > 1*7 112249 B. Vaihtoehtoisesti koodatut erittäin emäksiset proteiinit

Fickettin (1982) menetelmää käytettiin skannaamaan genomisista sekvensseistä HGV-PNF 2161 ja HGV-JC sekvens-5 sit, jotka mahdollisesti koodaavat proteiineja, (i) jotka ovat vaihtoehtoja aikaisemmin kuvatulle polyproteiinille, (ii) jotka osoittavat suojelua HGV-PNF 2161:n ja HGV-JC:n välillä, ja (iii) joilla on ennustetut isoelektriset kohdat pH-arvossa yli 10. Kaksi tällaista mahdollista prote-10 iinia identifioitiin.

Ensimmäinen proteiini koodataan ryhmillä 628 - 882 (sekvenssiin nro 14 liittyvä) HGV-PNF 2161:ssä ja ryhmillä 556 - 810 (sekvenssiin nro 182 liittyvä) HGV-JC:ssä. Tämä proteiini on 85 aminohappoa pitkä, sillä on yli 75-%:n 15 homologisuus HFV94-l:n ja JC9B:n välillä, ja sillä on ennustettu pl 11,6 - 12,3.

Toinen proteiini koodataan ryhmillä 6844 - 7125 HGV-PNF 2161:ssä (sekvenssiin nro 14 liittyvä) ja 6772 -7053 HGV-JC:ssä (sekvenssiin nro 182 liittyvä). Tämä pro-20 teiini on 94 aminohappoa pitkä, sillä on yli 88-%:n homologisuus HGV-PNF 2161:n ja HGV-JC:n välillä, ja ennustettu pl 12,4 - 12,7.

Nämä tyypilliset kaksi proteiinia edustavat mahdol-, . lisesti esiintyviä erittäin emäksisiä HGV:n proteiineja.

25 Esimerkki 18 HGV-isolaattien lisäkloonaus ja diagnostisten aluk-keiden suunnittelu Ά. HGV-PNF 2161:n cDNA-kloonin rakentaminen Lähes täysipituisen HGV-genomin cDNA-klooni PNF 30 216l:stä rakennettiin kloonaamalla kolme limittynyttä PCR-tuotetta plasmidivektoriin pGEM3Z (Promega, Madison, WI).

:Tässä rakentamisessa käytetyt PCR-tuotteet saatiin käänsi*. teistranskriptiolla "SUPERSCRIPT II:11a" (Gibco/BRL, Gait hersburg, MD), minkä jälkeen PCR:llä käyttäen reaktio-olo-35 suhteita, jotka sallivat pitkien kohdesekvenssien amplifi-kaation ("rTth-XL" polymeraasi ja "XL" PCR BUFFERS", Ap-.·. plied Biosystems, Foster City, CA) . rTth-entsyymillä, jota käytettiin näitä "pitkäalueisia" PCR-reaktioita varten, on 112249 168 oikolukuaktiivisuus (so. 3' - 5' eksonukleaasiaktiivi- suus), joka korjaa väärin sisällytetyt nukleotidit huolehtien siten suuren tarkkuuden PCR:stä.

Kolmeen tuotteeseen, joita käytettiin rakentamaan 5 HGV-genomia, kuuluivat (i) sisäinen 6,7 kb tuote (sekvenssin nro 14 nt 2101 - 8834) , joka amplifioitiin käyttäen alukkeita GV75-36FE (sekvenssi nro 228) ja GV75-7064RLE (sekvenssi nro 229), (ii) 2,8 kb 5'-pään tuote (sekvenssin nro 14 nt 38 - 2899), joka amplif ioitiin käyttäen 28F:a 10 (sekvenssi nro 230) ja FV94-2864R:a (sekvenssi nro 231), ja (iii) 2,9 kb 3'-pään tuotetta (sekvenssin nro 14 nt 6449 - 9366), joka amplifioitiin käyttäen FV94-6439F:a (sekvenssi nro 232) ja FV94-9331R:a (sekvenssi nro 233).

Alunperin 6,7 kb sisäinen fragmentti kloonattiin 15 "TA-vektoriin" pCRII luomaan klooni HGV7. Myöhemmin 6,1 kb Kpnl/EcoRI fragmentti poistettiin HGV7:stä ja yhdistettiin Kpnl/Xbal digeroidun 2,8 kb 5'-pään tuotteen kanssa (aluke 28F sisältää keinotekoisen Xbal-kohdan) ja kloonattiin Xbal/EcoRI digeroituun pGEM3Z:aan. Tämä 8,8 kb klooni, 20 josta puuttuu noin 0,6 kb HGV-genomin 3/ osasta, merkittiin HGV-KEX-2:ksi. Lähes täysipituisen HGV-genomin rakentamiseksi 3'-pään HGV-tuote digeroitiin NheUllä ja Eco-Rlrllä (aluke FV94-9331R sisältää keinotekoisen EcoRI-kohdan) ja kloonattiin Nhel/EcoRI digeroituun HGV-KEX-2 plas-: 25 midiin luoden kloonatun 9329 nt (sekvenssin nro 14 nt 38 - '...· 9366) HGV-PNF2161 sekvenssin, jota merkitään 3Z-HGV94-6.

V,: 3Z-HGV94-6:n täydellinen sekvenssi esitetään sekvenssinä , nro 2 34.

I Kloonia 3Z-HGV94-6 voidaan käyttää muodostamaan in 30 vitro transkriboitu täysipituinen HGV RNA tai sen osia (esim. käyttäen SP6 polymeraasia). RNA-molekyylejä voidaan käyttää transfektoimaan ihmisen solulinjoja. Tätä lähesty-mistä voitaisiin käyttää kartoittamaan virusgenomin eri- • · * laisia alueita, tutkimaan sen replikaatiota ja ymmärtämään ' 3 5 HGV-patogeenisyyden mekanisemeja ihmissoluissa (Rice, et s ] : ai., 1989; Sumiyoshi, et ai., 1992; Yoo, et ai., 1995).

169 1 12 2 4 9 B. JC-variantin kloonaus

Yhtä millilitraa JC-seerumia pyöritettiin kierros-nopeudella 40 000 rpm (Beckman, Spinco Rotor 70.1ΤΪ) 2 tunnin ajan. Saatua pellettiä uutettiin käyttäen "TRI-5 REAGENT:a" (MRC, Cincinnati, OH), mikä johti 3 faasin muodostumiseen. Yläfaasi sisälsi vain RNA:ta. Tämä faasi otettiin ja RNA otettiin talteen etanolisaostuksella.

HGV cDNA-molekyylit muodostettiin JC-näytteestä kahdella menetelmällä. Ensimmäinen menetelmä oli JC-nukle-10 iinihapponäytteen amplifikaatio käyttäen spesifisiä ja sisäkkäisiä alukkeita. Alukesekvenssit perustuivat HGV-sekvenssiin, joka saatiin PNF 2161 seerumista. Kriteerit, joita käytettiin valitsemaan alukkeita, olivat (i) alueet, joissa on suuri G/C-pitoisuus, ja (ii) ei toituvia sek-15 venssejä.

Toinen menetelmä, jota käytettiin muodostamaan HGV cDNA-molekyylejä, oli amplifikaatio käyttäen HGV (PNF 2161) spesifisiä alukkeita, minkä jälkeen HGV-spesifisten sekvenssien identifiointi 32P-leimatuilla oligonukleotidi-20 koettimilla. Tällaiset DNA-hybridisaatiot toteutettiin olennaisesti kuten kuvataan julkaisussa Sambrook, et ai. (1989). PCR-johdetut kloonit joko (i) kloonattiin "TA"-vektoriin (Invitrogen, San Diego, CA) ja sekvensoitiin vektorialukkeilla (TAR ja TAF), tai (ii) sekvensoitiin 25 suoraan PCR-amplifikaation jälkeen. Sekä koetin- että alu-

'··’ kesekvenssit perustuivat HGV-varianttiin, joka saatiin PNF

2161 seerumista.

Näistä kahdesta lähestymisestä saatiin moninkertai->/;/· sesti limittyneitä HGV-fragmentteja JC-seerumista. Kukin i : : 3 0 näistä fragmenteista kloonattiin ja sekvensoitiin. Sek venssit ryhmitettiin, jolloin saatiin HGV:n (JC-variantti) ; . _ konsensussekvenssi, joka esitetään sekvenssinä nro 182 (polypeptidisekvenssi nro 183) . HGV-viruksen (JC-variantti) kunkin alueen sekvenssi perustui ainakin kolmen eri-35 laisen, limittyneen, itsenäisen kloonin yhtäpitävyyteen.

C. Muita HGV-variantteja HGV PNF 2161 -variantti- ja JC-varianttisekvenssien lisäksi on saatu kolme osittaista HGV-isolaattia seeru- 112249 170 meistä BG34, T55806 ja EB20 menetelmillä, jotka ovat samanlaisia kuin edellä on kuvattu. Näiden isolaattien osittaiset sekvenssit esitetään sekvenssinä nro 176 (BG34 nukleiinihappo) , sekvenssinä nro 177 (BG34 polypeptidi), sek-5 venssinä nro 178 (T55806 nukleiinihappo), sekvenssinä nro 179 (T55806 polypeptidi), sekvenssinä nro 180 (EB20-2 nukleiinihappo) ja sekvenssinä nro 181 (EB20-2 polypeptidi).

D. Vaihtoehtoisia alukkeita diagnostista PCR:a varten 10 PCR-alukkeet ja vastaava analyysikehitys voidaan johtaa HGV:n genomin (genomien) alueista perustuen tyypillisesti säilyneiden alueiden analyysiin. Perustuen HGV-JC-variantin ja HGV-PNF 2161 variantin vertailuihin HGV:n 5' translatoimaton alue valittiin yhtenä tällaisena alueena 15 lisä PCR-pohjaisen diagnostisen kokeen kehittämiseksi HGV-isolaattien detektiota varten. Kaksi tyypillistä aluketta on FV-94-22F (sekvenssi nro 124) ja FV94-724R (sekvenssi nro 125). Nämä alukkeet amplifioivat noin 728 bp HGV-geno-min fragmentin.

20 Sekvenssianalyysi suoritettiin amplifikaatiotuot- teilla reaktioista, jotka käyttivät näitä kahta aluketta HGV:n 36 isolaattia varten (mukaan lukien PNF 2161 ja JC, katso taulukko 26) . Noin 400 emäsparin aluetta (sekvenssin . t·. nro 14 nt 69 - 469) noin 728 emäsparin amplifikaatiotuot- 25 teestä käytettiin moninaisia sekvenssiryhmityksiä varten ·; (taulukko 26) ja säilyneiden alueiden lisämääritystä var- ’·’·* ten (katso alla) .

* ♦ ♦ 1 * * t ·

MM

171 112249

Taulukko 2 6

Sekvenssi Seerumikoodi Valtio % ID PNF

nro 2161 186 S59 Englanti 96,8 5 187 S368 Englanti 98,8 188 S3 09 Englanti 95,5 189 FZ Australia 96 190 G21 Kreikka 97,8 191 G23 Kreikka 94,3 10 192 G59 Kreikka 93,6 193 E36 Egypti 94 194 R38730 USA 94,8 195 G281 Kreikka 97,8 196 G157 Kreikka 94,3 15 197 G154 Kreikka 96 198 G213 Kreikka 94,8 199 G204 Kreikka 98,3 200 G191 Kreikka 94,8 ·. 201 G299 Kreikka 94,8 , Γ 20 202 T56957 USA 95,3 203 C01698 USA 98,8 i : :____ 204 T27034 USA 93,5 j '· 205 E57963 USA 98,5 206 R37166 USA 97,5 25 207 B5 Saksa 95,5 208 B33 Saksa 95,5 112249 172 209 FH010 Australia 95 210 PNF2161 USA 100 211 JC USA 96,3 212 7155 Peru 89,8 5 213 7244 Peru 89 214 K27 Korea 89,5 215 K30 Korea 89,5 216 T55875 USA 97,3 217 T56633 USA 93,5 10 218 EB20 Egypti 94,1 219 T55806 USA 95,6 220 BG34 Kreikka 94,8 221 BE12 Egypti 95 15 Amplifikaatiopohjäisen (esim. PCR) tai koetinpoh- jaisen menetelmä/analyysin kehittäminen HGV-isolaattien detektiota varten näytteissä käsittää sopivien aluke/koe-tin-sekvenssien valinnan. Kaksi kriteeriä tällaiselle ana-: lyysille on alhainen kopioherkkyys ja spesifisyys HGV-sek- 20 vensseille. Sekvenssien ryhmittymiset (kuten juuri on ku-: vattu) voivat auttaa ohjaamaan aluke/koetin-valintaa ja ·· suunnittelua.

5 Useat kriteerit alukkeiden valitsemiseksi ovat seu- i ;·. raavat: (i) parin etu- ja käänteisalukkeiden ei tulisi 25 olla merkittävästi täydentäviä sekvenssissä, ja (ii) aluk-keilla ei tulisi olla merkittävää itsetäydentävyyttä tai mahdollisuutta muodostaa sekundaarisia rakenteita. Nämä varokeinot minimoivat mahdollisuuden muodostaa alukedimee-. rejä tai oligomeerejä.

30 Alukkeet voidaan optimaalisesti suunnitella sek- venssialueista, jotka eivät osoita variaatiota erilaisten ' ! isolaattien joukossa, mutta ne voidaan suunnitella myös ! I » 173 1 12249 alueista, joissa on vähemmän homologiaa, sisällyttämällä sekoitettu emässynteesi tai neutraalit emäkset, kuten inosiini, niissä asemissa selittämään tunnettu isolaatti-eroavuus. Alukkeiden seuraavat kaksi ryhmää ovat esimerk-5 kejä alukkeista, joita voidaan käyttää PCR-pohjäisen analyysin kehityksessä HGV-genomien detektiota varten: etu-alukkeet sekvenssi nro 222, sekvenssi nro 223 ja sekvenssi nro 224; ja käänteisalukkeet sekvenssi nro 225, sekvenssi nro 226 ja sekvenssi nro 227.

10 Erilaisia alukkeuden yhdistelmiä voidaan käyttää HGV diagnostisen analyysin kehityksessä. Optimaaliset alukkeiden yhdistelmät määritetään kokeellisesti ja tyypillisesti kohdistetaan huomio analyysiherkkyyteen ja spesifisyyteen. Tällaisiin näkökohtiin kuuluvat seuraavat: 15 (i) PCR-tuote pituudeltaan 100 - 300 emäsparia tehokasta amplifikaatiota ja tuotteen detektion helpoutta varten; (ii) kyky toistettavasti havaita ainakin 10 kopiota kohde-HGV:stä, ja (iii) kyky toistettavasti havaita pääosa HGV-varlanteista.

20 Lisäksi, koetinsekvenssit voidaan suunnitella sa malla tavalla sekaemäs- tai neutraaliemässynteeseillä ja/tai niitä voidaan käyttää alennetussa ankaruudessa, jotta havaitaan pääosa HGV-variantteja.

Koska keksintöä on kuvattu viittauksella spesifi- ; : 25 siin menetelmiin ja toteutusmuotoihin, on ymmärrettävä, / että erilaisia modifikaatioita ja muutoksia voidaan tehdä ; ilman, että erotaan keksinnöstä.

» « · » · · i · · » t · » * * · '1**·

SEKVENSSILISTAUS

112249 174 (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: Genelabs Technologies, Inc.

(B) KATU: 505 Penobscot Drive (C) KAUPUNKI: Redwood City

(D) OSAVALTIO: CA

(E) MAA: USA

(F) POSTIMUNERO: 94063 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Hepatitis G virus ja sen mole- kyylikloonaus (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 277 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE : (A) VASTAANOTTAJA: Dehlinger & Associates (B) KATU: 350 Cambridge Ave., Suite 250 (C) KAUPUNKI: Palo Alto

(D) OSAVALTIO: CA

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 94306 (V) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patenln Release #1.0, Version #1.25 (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: (B) JÄTTÖPÄIVÄ: (C) LUOKITUS: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/389,886 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 15.2.1995 (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201.35 (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/357,509 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 16.12.1994 (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201.34 4 (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/329,729 ; (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 26.10.1994 (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201.33 * · I I * ’ (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: ; (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/344,271 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 23.11.1994 [T: (C) LUETTELONUMERO: 4600-0202 (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/285,558 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 3.8.1994 ’ (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201.30 (Vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/285,543 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 3.8.1994 >·*, (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201.32 « t * (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: 1 (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/246,985 ’, (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 20.5.1994 '!**: (C) LUETTELONUMERO: 4600-0201 175 1 12249 (viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: (A) NIMI: Fabian, Gary R.

(B) REKISTERINUMERO: 33,875 (C) VIITE-/LUETTELONUMERO: 4600-

0201.41/G100PCT

(ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: (415) 324-0880 (B) TELEFAX: (415) 324-0960 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: SISPA-aluke, yläjuoste Linker AB

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: GGAATTCGCG GCCGCTCG 18 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: : : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Linker AB, pohjajuoste * * t "··’* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2: > · · CGAGCGGCCG CGAATTCCTT 20 « * · | (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: l * · '·’ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • (A) PITUUS: 237 emäsparia ‘ (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

: " (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

» · ·’ * (iii) HYPOTEETTINEN: ei » :“· (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: PNF 2161 klooni 470-20-1 (ix) OMINAISPIIRRE:

; (A) NIMI/SELITYS: CDS

’* * (B) ASEMA: 1..237 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: 17. 112249 GAA TTC GCG GCC GCT CGG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT 48

Glu Phe Ala Ala Ala Arg Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn 15 10 15 GAG TCA GAG GAC GGG GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC GGC GGG GTC 96

Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Gly Gly Vai 20 25 30 TTC TCA TCT GAG CTG CTC TCA GTA ACC GAG ATA AGT GCT GGC GAT GGA 144

Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly 35 40 45 GTA CGG GGG ATG TCT TCT CCC CAT ACA GGC ATC TCT CGG CTA CTA CCA 192

Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg Leu Leu Pro 50 55 60 CAA AGA GAG GGT GTA CTG CAG TCC TCC ACG AGC GGC CGC GAA TTC 237

Gin Arg Glu Gly Vai Leu Gin Ser Ser Thr Ser Gly Arg Glu Phe 65 70 75 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 79 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:

Glu Phe Ala Ala Ala Arg Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn 15 10 15

Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Gly Gly Vai 20 25 30

Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly 35 40 45 . Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg Leu Leu Pro ; ! 50 55 60 ί Gin Arg Glu Gly Vai Leu Gin Ser Ser Thr Ser Gly Arg Glu Phe ' ! 65 70 75

* I

* » (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: il! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia ί '< ί (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

/· ' (iii) HYPOTEETTINEN: ei ...ί (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HAV-R1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: . < GTTGACCAAC TGAGTCTGAA GC 22 t . , * » i (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: 177 112249 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HAV-F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 6: GATTGGAAAT CTGATCCGTC CC 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HCV-LANR (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: TCGCGACCCA ACACTACTC 19 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo • * · (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei , (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HCV 1532 ‘ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: GGGGGCGACA CTCCACCA 18 j‘: (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • ” · (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

: ’· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

178 1 12249 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470-20-1-77F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9: CTCTTTGTGG TAGTAGCCGA GAGAT 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470-20-1-211R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10: CGAATGAGTC AGAGGACGGG GTAT 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ,V (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke KL-1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11: GCAGGATCCG AATTCGCATC TAGAGAT 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: ·, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia ;·, (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen • (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ’ I « » · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA ·;·' (iii) HYPOTEETTINEN: ei ,i (iv) ANTI-SENSE: ei • ♦ 112249 179 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke KL-2 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:12: ATCTCTAGAT GCGAATTCGG ATCCTGCGA 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: LAMBDA GT11, käänteisaluke <xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:13: GGCAGACATG GCCTGCCCGG 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 9392 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-PNF 2161 variantti (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

• '· (B) ASEMA: 459..9077 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:14: ACGTGGGGGA GTTGATCCCC CCCCCCCGGC ACTGGGTGCA AGCCCCAGAA ACCGACGCCT 60 ··· ATCTAAGTAG ACGCAATGAC TCGGCGCCGA CTCGGCGACC GGCCAAAAGG TGGTGGATGG 120 ···* GTGATGACAG GGTTGGTAGG TCGTAAATCC CGGTCACCTT GGTAGCCACT ATAGGTGGGT 180 ' CTTAAGAGAA GGTTAAGATT CCTCTTGTGC CTGCGGCGAG ACCGCGCACG GTCCACAGGT 240 GTTGGCCCTA CCGGTGGGAA TAAGGGCCCG ACGTCAGGCT CGTCGTTAAA CCGAGCCCGT 300 TACCCACCTG GGCAAACGAC GCCCACGTAC GGTCCACGTC GCCCTTCAAT GTCTCTCTTG 360 ‘ ACCAATAGGC GTAGCCGGCG AGTTGACAAG GACCAGTGGG GGCCGGGGGC TTGGAGAGGG 420 I": ACTCCAAGTC CCGCCCTTCC CGGTGGGCCG GGAAATGC ATG GGG CCA CCC AGC 473 ... Met Gly Pro Pro Ser !...: 1 5 .*. TCC GCG GCG GCC TGC AGC CGG GGT AGC CCA AGA ATC CTT CGG GTG AGG 521 ·· · Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg Vai Arg 10 15 20 180 112249 GCG GGT GGC ATT TCC TTT TTC TAT ACC ATC ATG GCA GTC CTT CTG CTC 569

Ala Gly Gly lie Ser Phe Phe Tyr Thr lie Met Ala Val Leu Leu Leu 25 30 35 CTT CTC GTG GTT GAG GCC GGG GCC ATT CTG GCC CCG GCC ACC CAC GCT 617

Leu Leu Vai Vai Glu Ala Gly Ala He Leu Ala Pro Ala Thr His Ala 40 45 50 TGT CGA GCG AAT GGG CAA TAT TTC CTC ACA AAT TGT TGT GCC CCG GAG 665

Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala Pro Glu 55 60 65 GAC ATC GGG TTC TGC CTG GAG GGT GGA TGC CTG GTG GCC CTG GGG TGC 713

Asp He Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu Val Ala Leu Gly Cys 70 75 80 85 ACG ATT TGC ACT GAC CAA TGC TGG CCA CTG TAT CAG GCG GGT TTG GCT 761

Thr He Cys Thr Asp Gin Cys Trp Pro Leu Tyr Gin Ala Gly Leu Ala 90 95 100 GTG CGG CCT GGC AAG TCC GCG GCC CAA CTG GTG GGG GAG CTG GGT AGC 809

Val Arg Pro Gly Lys Ser Ala Ala Gin Leu Val Gly Glu Leu Gly Ser 105 110 115 CTA TAC GGG CCC CTG TCG GTC TCG GCC TAT GTG GCT GGG ATC CTG GGC 857

Leu Tyr Gly Pro Leu Ser Val Ser Ala Tyr Val Ala Gly He Leu Gly 120 125 130 CTG GGT GAG GTG TAC TCG GGT GTC CTA ACG GTG GGA GTC GCG TTG ACG 905

Leu Gly Glu Val Tyr Ser Gly Val Leu Thr Val Gly Val Ala Leu Thr 135 140 145 CGC CGG GTC TAC CCG GTG CCT AAC CTG ACG TGT GCA GTC GCG TGT GAG 953

Arg Arg Val Tyr Pro Val Pro Asn Leu Thr Cys Ala Val Ala Cys Glu 150 155 160 165 CTA AAG TGG GAA AGT GAG TTT TGG AGA TGG ACT GAA CAG CTG GCC TCC 1001

Leu Lys Trp Glu Ser Glu Phe Trp Arg Trp Thr Glu Gin Leu Ala Ser 170 175 180 AAC TAC TGG ATT CTG GAA TAC CTC TGG AAG GTC CCA TTT GAT TTC TGG 1049

Asn Tyr Trp He Leu Glu Tyr Leu Trp Lys Val Pro Phe Asp Phe Trp 185 190 195 AGA GGC GTG ATA AGC CTG ACC CCC TTG TTG GTT TGC GTG GCC GCA TTG 1097 • · Arg Gly Val He Ser Leu Thr Pro Leu Leu Val Cys Val Ala Ala Leu 200 205 210 » .1. CTG CTG CTT GAG CAA CGG ATT GTC ATG GTC TTC CTG TTG GTG ACG ATG 1145 ’·1 Leu Leu Leu Glu Gin Arg He Val Met Val Phe Leu Leu Val Thr Met .:. 215 220 225 GCC GGG ATG TCG CAA GGC GCC CCT GCC TCC GTT TTG GGG TCA CGC CCC 1193 ··1 Ala Gly Met Ser Gin Gly Ala Pro Ala Ser Val Leu Gly Ser Arg Pro :·. 230 235 240 245 * · TTT GAC TAC GGG TTG ACT TGG CAG ACC TGC TCT TGC AGG GCC AAC GGT 1241

Phe Asp Tyr Gly Leu Thr Trp Gin Thr Cys Ser Cys Arg Ala Asn Gly ‘. 250 255 260 H1. TCG CGT TTT TCG ACT GGG GAG AAG GTG TGG GAC CGT GGG AAC GTT ACG 1289 ·" 1 Ser Arg Phe Ser Thr Gly Glu Lys Val Trp Asp Arg Gly Asn Val Thr * . 265 270 275 CTT CAG TGT GAC TGC CCT AAC GGC CCC TGG GTG TGG TTG CCA GCC TTT 1337 • Leu Gin Cys Asp Cys Pro Asn Gly Pro Trp Val Trp Leu Pro Ala Phe 280 285 290 · · TGC CAA GCA ATC GGC TGG GGT GAC CCC ATC ACT TAT TGG AGC CAC GGG 1385 .,..: Cys Gin Ala He Gly Trp Gly Asp Pro He Thr Tyr Trp Ser His Gly 181 112249 295 300 305 CAA AAT CAG TGG CCC CTT TCA TGC CCC CAG TAT GTC TAT GGG TCT GCT 1433

Gin Asn Gin Trp Pro Leu Ser Cys Pro Gin Tyr Val Tyr Gly Ser Ala 310 315 320 325 ACA GTC ACT TGC GTG TGG GGT TCC GCT TCT TGG TTT GCC TCC ACC AGT 1481

Thr Val Thr Cys Val Trp Gly Ser Ala Ser Trp Phe Ala Ser Thr Ser 330 335 340 GGT CGC GAC TCG AAG ATA GAT GTG TGG AGT TTA GTG CCA GTT GGC TCT 1529

Gly Arg Asp Ser Lys lie Asp Val Trp Ser Leu Val Pro Val Gly Ser 345 350 355 GCC ACC TGC ACC ATA GCC GCA CTT GGA TCA TCG GAT CGC GAC ACG GTG 1577

Ala Thr Cys Thr lie Ala Ala Leu Gly Ser Ser Asp Arg Asp Thr Val 360 365 370 CCT GGG CTC TCC GAG TGG GGA ATC CCG TGC GTG ACG TGT GTT CTG GAC 1625

Pro Gly Leu Ser Glu Trp Gly lie Pro Cys Val Thr Cys Val Leu Asp 375 380 385 CGT CGG CCT GCC TCC TGC GGC ACC TGT GTG AGG GAC TGC TGG CCC GAG 1673

Arg Arg Pro Ala Ser Cys Gly Thr Cys Val Arg Asp Cys Trp Pro Glu 390 395 400 405 ACC GGG TCG GTT AGG TTC CCA TTC CAT CGG TGC GGC GTG GGG CCT CGG 1721

Thr Gly Ser Val Arg Phe Pro Phe His Arg Cys Gly Val Gly Pro Arg 410 415 420 CTG ACA AAG GAC TTG GAA GCT GTG CCC TTC GTC AAC AGG ACA ACT CCC 1769

Leu Thr Lys Asp Leu Glu Ala Val Pro Phe Val Asn Arg Thr Thr Pro 425 430 435 TTC ACC ATT AGG GGG CCC CTG GGC AAC CAG GGC CGA GGC AAC CCG GTG 1817

Phe Thr lie Arg Gly Pro Leu Gly Asn Gin Gly Arg Gly Asn Pro Val 440 445 450 CGG TCG CCC TTG GGT TTT GGG TCC TAC GCC ATG ACC AGG ATC CGA GAT 1865

Arg Ser Pro Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Ala Met Thr Arg lie Arg Asp 455 460 465 ACC CTA CAT CTG GTG GAG TGT CCC ACA CCA GCC ATT GAG CCT CCC ACC 1913

Thr Leu His Leu Val Glu Cys Pro Thr Pro Ala lie Glu Pro Pro Thr • ... 470 475 480 485 ··. GGG ACG TTT GGG TTC TTC CCC GGG ACG CCG CCT CTC AAC AAC TGC ATG 1961

Gly Thr Phe Gly Phe Phe Pro Gly Thr Pro Pro Leu Asn Asn Cys Met 490 495 500 CTC TTG GGC ACG GAA GTG TCC GAG GCA CTT GGG GGG GCT GGC CTC ACG 2009 ..,: Leu Leu Gly Thr Glu Val Ser Glu Ala Leu Gly Gly Ala Gly Leu Thr , .·. 505 510 515 » * GGG GGG TTC TAT GAA CCC CTG GTG CGC AGG TGT TCG AAG CTG ATG GGA 2057 * Gly Gly Phe Tyr Glu Pro Leu Val Arg Arg Cys Ser Lys Leu Met Gly 520 525 530 . ;·. AGC CGA AAT CCG GTT TGT CCG GGG TTT GCA TGG CTC TCT TCG GGC AGG 2105 ! “ Ser Arg Asn Pro Val Cys Pro Gly Phe Ala Trp Leu Ser Ser Gly Arg 535 540 545 t · · • . CCT GAT GGG TTT ATA CAT GTC CAG GGT CAC TTG CAG GAG GTG GAT GCA 2153

Pro Asp Gly Phe lie His Val Gin Gly His Leu Gin Glu Val Asp Ala 550 555 560 565 Ί' GGC AAC TTC ATC CCG CCC CCG CGC TGG TTG CTC TTG GAC TTT GTA TTT 2201 ; Gly Asn Phe lie Pro Pro Pro Arg Trp Leu Leu Leu Asp Phe Val Phe :.: : 570 575 580 MM* 182 1 12249 GTC CTG TTA TAC CTG ATG AAG CTG GCT GAG GCA CGG TTG GTC CCG CTG 2249

Val Leu Leu Tyr Leu Met Lys Leu Ala Glu Ala Arg Leu Val Pro Leu 585 590 595 ATC TTG CTG CTG CTA TGG TGG TGG GTG AAC CAG CTG GCA GTC CTA GGG 2297 lie Leu Leu Leu Leu Trp Trp Trp Val Asn Gin Leu Ala Val Leu Gly 600 605 610 CTG CCG GCT GTG GAA GCC GCC GTG GCA GGT GAG GTC TTC GCG GGC CCT 2345

Leu Pro Ala Val Glu Ala Ala Val Ala Gly Glu Val Phe Ala Gly Pro 615 620 625 GCC CTG TCC TGG TGT CTG GGA CTC CCG GTC GTC AGT ATG ATA TTG GGT 2393

Ala Leu Ser Trp Cys Leu Gly Leu Pro Val Val Ser Met lie Leu Gly 630 635 640 645 TTG GCA AAC CTG GTG CTG TAC TTT AGA TGG TTG GGA CCC CAA CGC CTG 2441

Leu Ala Asn Leu Val Leu Tyr Phe Arg Trp Leu Gly Pro Gin Arg Leu 650 655 660 ATG TTC CTC GTG TTG TGG AAG CTT GCT CGG GGA GCT TTC CCG CTG GCC 2489

Met Phe Leu Val Leu Trp Lys Leu Ala Arg Gly Ala Phe Pro Leu Ala 665 670 675 CTC TTG ATG GGG ATT TCG GCG ACC CGC GGG CGC ACC TCA GTG CTC GGG 2537

Leu Leu Met Gly lie Ser Ala Thr Arg Gly Arg Thr Ser Val Leu Gly 680 685 690 GCC GAG TTC TGC TTC GAT GCT ACA TTC GAG GTG GAC ACT TCG GTG TTG 2585

Ala Glu Phe Cys Phe Asp Ala Thr Phe Glu Val Asp Thr Ser Val Leu 695 700 705 GGC TGG GTG GTG GCC AGT GTG GTA GCT TGG GCC ATT GCG CTC CTG AGC 2633

Gly Trp Val Val Ala Ser Val Val Ala Trp Ala lie Ala Leu Leu Ser 710 715 720 725 TCG ATG AGC GCA GGG GGG TGG AGG CAC AAA GCC GTG ATC TAT AGG ACG 2681

Ser Met Ser Ala Gly Gly Trp Arg His Lys Ala Val lie Tyr Arg Thr 730 735 740 TGG TGT AAG GGG TAC CAG GCA ATC CGT CAA AGG GTG GTG AGG AGC CCC 2729

Trp Cys Lys Gly Tyr Gin Ala lie Arg Gin Arg Val Val Arg Ser Pro 745 750 755 . . CTC GGG GAG GGG CGG CCT GCC AAA CCC CTG ACC TTT GCC TGG TGC TTG 2777 : · Leu Gly Glu Gly Arg Pro Ala Lys Pro Leu Thr Phe Ala Trp Cys Leu 760 765 770 I · " GCC TCG TAC ATC TGG CCA GAT GCT GTG ATG ATG GTG GTG GTT GCC TTG 2825

Ala Ser Tyr lie Trp Pro Asp Ala Val Met Met Val Val Val Ala Leu 775 780 785 • · · GTC CTT CTC TTT GGC CTG TTC GAC GCG TTG GAT TGG GCC TTG GAG GAG 2873

Val Leu Leu Phe Gly Leu Phe Asp Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Glu ...t 790 795 800 805 I · » ATC TTG GTG TCC CGG CCC TCG TTG CGG CGT TTG GCT CGG GTG GTT GAG 2921 lie Leu Val Ser Arg Pro Ser Leu Arg Arg Leu Ala Arg Val Val Glu .. 810 815 820 .... TGC TGT GTG ATG GCG GGT GAG AAG GCC ACA ACC GTC CGG CTG GTC TCC 2969 ’,· · Cys Cys Val Met Ala Gly Glu Lys Ala Thr Thr Val Arg Leu Val Ser • ^ 825 830 835 AAG ATG TGT GCG AGA GGA GCT TAT TTG TTC GAT CAT ATG GGC TCT TTT 3017 l”: Lys Met Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Phe Asp His Met Gly Ser Phe ·;· 840 845 850 : TCG CGT GCT GTC AAG GAG CGC CTG TTG GAA TGG GAC GCA GCT CTT GAA 3065 ; Ser Arg Ala Val Lys Glu Arg Leu Leu Glu Trp Asp Ala Ala Leu Glu 112249 183 855 860 865 CCT CTG TCA TTC ACT AGG ACG GAC TGT CGC ATC ATA CGG GAT GCC GCG 3113

Pro Leu Ser Phe Thr Arg Thr Asp Cys Arg lie lie Arg Asp Ala Ala 870 875 880 885 AGG ACT TTG TCC TGC GGG CAG TGC GTC ATG GGT TTA CCC GTG GTT GCG 3161

Arg Thr Leu Ser Cys Gly Gin Cys Val Met Gly Leu Pro Vai Val Ala 890 895 900 CGC CGT GGT GAT GAG GTT CTC ATC GGC GTC TTC CAG GAT GTG AAT CAT 3209

Arg Arg Gly Asp Glu Val Leu lie Gly Val Phe Gin Asp Val Asn His 905 910 915 TTG CCT CCC GGG TTT GTT CCG ACC GCG CCT GTT GTC ATC CGA CGG TGC 3257

Leu Pro Pro Gly Phe Val Pro Thr Ala Pro Val Val lie Arg Arg Cys 920 925 930 GGA AAG GGC TTC TTG GGG GTC ACA AAG GCT GCC TTG ACA GGT CGG GAT 3305

Gly Lys Gly Phe Leu Gly Val Thr Lys Ala Ala Leu Thr Gly Arg Asp 935 940 945 CCT GAC TTA CAT CCA GGG AAC GTC ATG GTG TTG GGG ACG GCT ACG TCG 3353

Pro Asp Leu His Pro Gly Asn Val Met Val Leu Gly Thr Ala Thr Ser 950 955 960 965 CGA AGC ATG GGA ACA TGC TTG AAC GGC CTG CTG TTC ACG ACC TTC CAT 3401

Arg Ser Met Gly Thr Cys Leu Asn Gly Leu Leu Phe Thr Thr Phe His 970 975 980 GGG GCT TCA TCC CGA ACC ATC GCC ACA CCC GTG GGG GCC CTT AAT CCC 3449

Gly Ala Ser Ser Arg Thr lie Ala Thr Pro Val Gly Ala Leu Asn Pro 985 990 995 AGA TGG TGG TCA GCC AGT GAT GAT GTC ACG GTG TAT CCA CTC CCG GAT 3497

Arg Trp Trp Ser Ala Ser Asp Asp Val Thr Val Tyr Pro Leu Pro Asp 1000 1005 1010 GGG GCT ACT TCG TTA ACA CCT TGT ACT TGC CAG GCT GAG TCC TGT TGG 3545

Gly Ala Thr Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gin Ala Glu Ser Cys Trp 1015 1020 1025 GTC ATC AGA TCC GAC GGG GCC CTA TGC CAT GGC TTG AGC AAG GGG GAC 3593

Val lie Arg Ser Asp Gly Ala Leu Cys His Gly Leu Ser Lys Gly Asp ; 1030 1035 1040 1045 AAG GTG GAG CTG GAT GTG GCC ATG GAG GTC TCT GAC TTC CGT GGC TCG 3641 '··· Lys Val Glu Leu Asp Val Ala Met Glu Val Ser Asp Phe Arg Gly Ser ; 1050 1055 1060 .·· TCT GGC TCA CCG GTC CTA TGT GAC GAA GGG CAC GCA GTA GGA ATG CTC 3689 ··· Ser Gly Ser Pro Val Leu Cys Asp Glu Gly His Ala Val Gly Met Leu : 1065 1070 1075 GTG TCT GTG CTT CAC TCC GGT GGT AGG GTC ACC GCG GCA CGG TTC ACT 3737 ‘ Val Ser Val Leu His Ser Gly Gly Arg Val Thr Ala Ala Arg Phe Thr 1080 1085 1090 . AGG CCG TGG ACC CAA GTG CCA ACA GAT GCC AAA ACC ACT ACT GAA CCC 3785

Arg Pro Trp Thr Gin Val Pro Thr Asp Ala Lys Thr Thr Thr Glu Pro 1095 1100 1105 CCT CCG GTG CCG GCC AAA GGA GTT TTC AAA GAG GCC CCG TTG TTT ATG 3833 * * Pro Pro Val Pro Ala Lys Gly Val Phe Lys Glu Ala Pro Leu Phe Met 1110 1115 1120 1125 I : CCT ACG GGA GCG GGA AAG AGC ACT CGC GTC CCG TTG GAG TAC GAT AAC 3881 > ·'· Pro Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Arg Val Pro Leu Glu Tyr Asp Asn ; 1130 1135 1140 I * » * * 112249 184 ATG GGG CAC AAG GTC TTA ATC TTG AAC CCC TCA GTG GCC ACT GTG CGG 3929

Met Gly His Lys Val Leu lie Leu Asn Pro Ser Vai Ala Thr Val Arg 1145 1150 1155 GCC ATG GGC CCG TAC ATG GAG CGG CTG GCG GGT AAA CAT CCA AGT ATA 3977

Ala Met Gly Pro Tyr Met Glu Arg Leu Ala Gly Lys His Pro Ser lie 1160 1165 1170 TAC TGT GGG CAT GAT ACA ACT GCT TTC ACA AGG ATC ACT GAC TCC CCC 4025

Tyr Cys Gly His Asp Thr Thr Ala Phe Thr Arg lie Thr Asp Ser Pro 1175 1180 1185 CTG ACG TAT TCA ACC TAT GGG AGG TTT TTG GCC AAC CCT AGG CAG ATG 4073

Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ala Asn Pro Arg Gin Met 1190 1195 1200 1205 CTA CGG GGC GTT TCG GTG GTC ATT TGT GAT GAG TGC CAC AGT CAT GAC 4121

Leu Arg Gly Val Ser Val Val lie Cys Asp Glu Cys His Ser His Asp 1210 1215 1220 TCA ACC GTG CTG TTA GGC ATT GGG AGA GTC CGG GAG CTG GCG CGT GGG 4169

Ser Thr Val Leu Leu Gly lie Gly Arg Val Arg Glu Leu Ala Arg Gly 1225 1230 1235 TGC GGG GTG CAA CTA GTG CTC TAC GCC ACC GCT ACA CCT CCC GGA TCC 4217

Cys Gly Val Gin Leu Val Leu Tyr Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser 1240 1245 1250 CCT ATG ACG CAG CAC CCT TCC ATA ATT GAG ACA AAA TTG GAC GTG GGC 4265

Pro Met Thr Gin His Pro Ser lie lie Glu Thr Lys Leu Asp Val Gly 1255 1260 1265 GAG ATT CCC TTT TAT GGG CAT GGA ATA CCC CTC GAG CGG ATG CGA ACC 4313

Glu lie Pro Phe Tyr Gly His Gly lie Pro Leu Glu Arg Met Arg Thr 1270 1275 1280 1285 GGA AGG CAC CTC GTG TTC TGC CAT TCT AAG GCT GAG TGC GAG CGC CTT 4361

Gly Arg His Leu Val Phe Cys His Ser Lys Ala Glu Cys Glu Arg Leu 1290 1295 1300 GCT GGC CAG TTC TCC GCT AGG GGG GTC AAT GCC ATT GCC TAT TAT AGG 4409

Ala Gly Gin Phe Ser Ala Arg Gly Val Asn Ala lie Ala Tyr Tyr Arg 1305 1310 1315 ,·, GGT AAA GAC AGT TCT ATC ATC AAG GAT GGG GAC CTG GTG GTC TGT GCT 4457 ,! ΐ Gly Lys Asp Ser Ser lie lie Lys Asp Gly Asp Leu Val Val Cys Ala ·«'. 1320 1325 1330 ACA GAC GCG CTT TCC ACT GGG TAC ACT GGA AAT TTC GAC TCC GTC ACC 4505

Thr Asp Ala Leu Ser Thr Gly Tyr Thr Gly Asn Phe Asp Ser Val Thr .I. 1335 1340 1345 GAC TGT GGA TTA GTG GTG GAG GAG GTC GTT GAG GTG ACC CTT GAT CCC 4553

Asp Cys Gly Leu Val Val Glu Glu Val Val Glu Val Thr Leu Asp Pro 1350 1355 1360 1365 > * · t ACC ATT ACC ATC TCC CTG CGG ACA GTG CCT GCG TCG GCT GAA CTG TCG 4601

Thr lie Thr lie Ser Leu Arg Thr Val Pro Ala Ser Ala Glu Leu Ser 1370 1375 1380 I I · ATG CAA AGA CGA GGA CGC ACG GGT AGG GGC AGG TCT GGA CGC TAC TAC 4649 * Met Gin Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Ser Gly Arg Tyr Tyr * . 1385 1390 1395 III* I · ,,, TAC GCG GGG GTG GGC AAA GCC CCT GCG GGT GTG GTG CGC TCA GGT CCT 4697 ! : Tyr Ala Gly Val Gly Lys Ala Pro Ala Gly Val Val Arg Ser Gly Pro ’I’ 1400 1405 1410 I r '· GTC TGG TCG GCG GTG GAA GCT GGA GTG ACC TGG TAC GGA ATG GAA CCT 4745 ,,,,: Val Trp Ser Ala Val Glu Ala Gly Val Thr Trp Tyr Gly Met Glu Pro 112249 185 1415 1420 1425 GAC TTG ACA GCT AAC CTA CTG AGA CTT TAC GAC GAC TGC CCT TAC ACC 4793

Asp Leu Thr Ala Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Asp Cys Pro Tyr Thr 1430 1435 1440 1445 GCA GCC GTC GCG GCT GAT ATC GGA GAA GCC GCG GTG TTC TTC TCT GGG 4841

Ala Ala Vai Ala Ala Asp Ile Gly Glu Ala Ala Val Phe Phe Ser Gly 1450 1455 1460 CTC GCC CCA TTG AGG ATG CAC CCT GAT GTC AGC TGG GCA AAA GTT CGC 4889

Leu Ala Pro Leu Arg Met His Pro Asp Val Ser Trp Ala Lys Val Arg 1465 1470 1475 GGC GTC AAC TGG CCC CTC TTG GTG GGT GTT CAG CGG ACC ATG TGT CGG 4937

Gly Val Asn Trp Pro Leu Leu Val Gly Val Gin Arg Thr Met Cys Arg 1480 1485 1490 GAA ACA CTG TCT CCC GGC CCA TCG GAT GAC CCC CAA TGG GCA GGT CTG 4985

Glu Thr Leu Ser Pro Gly Pro Ser Asp Asp Pro Gin Trp Ala Gly Leu 1495 1500 1505 AAG GGC CCA AAT CCT GTC CCA CTC CTG CTG AGG TGG GGC AAT GAT TTA 5033

Lys Gly Pro Asn Pro Val Pro Leu Leu Leu Arg Trp Gly Asn Asp Leu 1510 1515 1520 1525 CCA TCT AAA GTG GCC GGC CAC CAC ATA GTG GAC GAC CTG GTC CGG AGA 5081

Pro Ser Lys Val Ala Gly His His lie Val Asp Asp Leu Val Arg Arg 1530 1535 1540 CTC GGT GTG GCG GAG GGT TAC GTC CGC TGC GAC GCT GGG CCG ATC TTG 5129

Leu Gly Val Ala Glu Gly Tyr Val Arg Cys Asp Ala Gly Pro lie Leu 1545 1550 1555 ATG ATC GGT CTA GCT ATC GCG GGG GGA ATG ATC TAC GCG TCA TAC ACC 5177

Met lie Gly Leu Ala lie Ala Gly Gly Met lie Tyr Ala Ser Tyr Thr 1560 1565 1570 GGG TCG CTA GTG GTG GTG ACA GAC TGG GAT GTG AAG GGG GGT GGC GCC 5225

Gly Ser Leu Val Val Val Thr Asp Trp Asp Val Lys Gly Gly Gly Ala 1575 1580 1585 CCC CTT TAT CGG CAT GGA GAC CAG GCC ACG CCT CAG CCG GTG GTG CAG 5273

Pro Leu Tyr Arg His Gly Asp Gin Ala Thr Pro Gin Pro Val Val Gin 1 ,·, 1590 1595 1600 1605 I · I · · GTT CCT CCG GTA GAC CAT CGG CCG GGG GGT GAA TCA GCA CCA TCG GAT 5321

Val Pro Pro Val Asp His Arg Pro Gly Gly Glu Ser Ala Pro Ser Asp 1610 1615 1620 * · » · GCC AAG ACA GTG ACA GAT GCG GTG GCA GCC ATC CAG GTG GAC TGC GAT 5369 ,,: Ala Lys Thr Val Thr Asp Ala Val Ala Ala lie Gin Val Asp Cys Asp , 1625 1630 1635 « I » « I > TGG ACT ATC ATG ACT CTG TCG ATC GGA GAA GTG TTG TCC TTG GCT CAG 5417 ’ Trp Thr lie Met Thr Leu Ser lie Gly Glu Val Leu Ser Leu Ala Gin 1640 1645 1650 GCT AAG ACG GCC GAG GCC TAC ACA GCA ACC GCC AAG TGG CTC GCT GGC 5465 > ” Ala Lys Thr Ala Glu Ala Tyr Thr Ala Thr Ala Lys Trp Leu Ala Gly 1655 1660 1665

I I I

’ , TGC TAT ACG GGG ACG CGG GCC GTT CCC ACT GTA TCC ATT GTT GAC AAG 5513 ': * I Cys Tyr Thr Gly Thr Arg Ala Val Pro Thr Val Ser lie Val Asp Lys 1670 1675 1680 1685

I I

* I

CTC TTC GCC GGA GGG TGG GCG GCT GTG GTG GGC CAT TGC CAC AGC GTG 5561 * Leu Phe Ala Gly Gly Trp Ala Ala Val Val Gly His Cys His Ser Val : 1690 1695 1700 I t i » » I · 112249 186 ATT GCT GCG GCG GTG GCG GCC TAC GGG GOT TCA AGG AGC CCG CCG TTG 5609

Ile Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Gly Ala Ser Arg Ser Pro Pro Leu 1705 1710 1715 GCA GCC GCG GCT TCC TAC CTG ATG GGG TTG GGC GTT GGA GGC AAC GCT 5657

Ala Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Met Gly Leu Gly Val Gly Gly Asn Ala 1720 1725 1730 CAG ACG CGC CTG GCG TCT GCC CTC CTA TTG GGG GCT GCT GGA ACC GCC 5705

Gin Thr Arg Leu Ala Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Thr Ala 1735 1740 1745 TTG GGC ACT CCT GTC GTG GGC TTG ACC ATG GCA GGT GCG TTC ATG GGG 5753

Leu Gly Thr Pro Val Val Gly Leu Thr Met Ala Gly Ala Phe Met Gly 1750 1755 1760 1765 GGG GCC AGT GTC TCC CCC TCC TTG GTC ACC ATT TTA TTG GGG GCC GTC 5801

Gly Ala Ser Val Ser Pro Ser Leu Val Thr lie Leu Leu Gly Ala Val 1770 1775 1780 GGA GGT TGG GAG GGT GTT GTC AAC GCG GCG AGC CTA GTC TTT GAC TTC 5849

Gly Gly Trp Glu Gly Val Val Asn Ala Ala Ser Leu Val Phe Asp Phe 1785 1790 1795 ATG GCG GGG AAA CTT TCA TCA GAA GAT CTG TGG TAT GCC ATC CCG GTA 5897

Met Ala Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Leu Trp Tyr Ala lie Pro Val 1800 1805 1810 CTG ACC AGC CCG GGG GCG GGC CTT GCG GGG ATC GCT CTC GGG TTG GTT 5945

Leu Thr Ser Pro Gly Ala Gly Leu Ala Gly lie Ala Leu Gly Leu Val 1815 1820 1825 TTG TAT TCA GCT AAC AAC TCT GGC ACT ACC ACT TGG TTG AAC CGT CTG 5993

Leu Tyr Ser Ala Asn Asn Ser Gly Thr Thr Thr Trp Leu Asn Arg Leu 1830 1835 1840 1845 CTG ACT ACG TTA CCA AGG TCT TCA TGT ATC CCG GAC AGT TAC TTT CAG 6041

Leu Thr Thr Leu Pro Arg Ser Ser Cys He Pro Asp Ser Tyr Phe Gin 1850 1855 1860 CAA GTT GAC TAT TGC GAC AAG GTC TCA GCC GTG CTC CGG CGC CTG AGC 6089 " * Gin Val Asp Tyr Cys Asp Lys Val Ser Ala Val Leu Arg Arg Leu Ser 1865 1870 1875 CTC ACC CGC ACA GTG GTT GCC CTG GTC AAC AGG GAG CCT AAG GTG GAT 6137 * · Leu Thr Arg Thr Val Val Ala Leu Val Asn Arg Glu Pro Lys Val Asp ··· 1880 1885 1890 ‘Ml ; GAG GTA CAG GTG GGG TAT GTC TGG GAC CTG TGG GAG TGG ATC ATG CGC 6185 ··* Glu Val Gin Val Gly Tyr Val Trp Asp Leu Trp Glu Trp He Met Arg 1895 1900 1905 CAA GTG CGC GTG GTC ATG GCC AGA CTC AGG GCC CTC TGC CCC GTG GTG 6233

Gin Val Arg Val Val Met Ala Arg Leu Arg Ala Leu Cys Pro Val Val 1910 1915 1920 1925 :T: TCA CTA CCC TTG TGG CAT TGC GGG GAG GGG TGG TCC GGG GAA TGG TTG 6281

Ser Leu Pro Leu Trp His Cys Gly Glu Gly Trp Ser Gly Glu Trp Leu ,,,.: 1930 1935 1940 ,···, CTT GAC GGT CAT GTT GAG AGT CGC TGC CTC TGT GGC TGC GTG ATC ACT 6329 ’...· Leu Asp Gly His Val Glu Ser Arg Cys Leu Cys Gly Cys Val He Thr 1945 1950 1955 ’’· · GGT GAC GTT CTG AAT GGG CAA CTC AAA GAA CCA GTT TAC TCT ACC AAG 6377 ·;··· Gly Asp Val Leu Asn Gly Gin Leu Lys Glu Pro Val Tyr Ser Thr Lys 1960 1965 1970 CTG TGC CGG CAC TAT TGG ATG GGG ACT GTC CCT GTG AAC ATG CTG GGT 6425

Leu Cys Arg His Tyr Trp Met Gly Thr Val Pro Val Asn Met Leu Gly 187 1 12249 1975 1980 1985 TAC GGT GAA ACG TCG CCT CTC CTG GCC TCC GAC ACC CCG AAG GTT GTG 6473

Tyr Gly Glu Thr Ser Pro Leu Leu Ala Ser Asp Thr Pro Lys Vai Val 1990 1995 2000 2005 CCC TTC GGG ACG TCT GGC TGG GCT GAG GTG GTG GTG ACC ACT ACC CAC 6521

Pro Phe Gly Thr Ser Gly Trp Ala Glu Val Val Val Thr Thr Thr His 2010 2015 2020 GTG GTA ATC AGG AGG ACC TCC GCC TAT AAG CTG CTG CGC CAG CAA ATC 6569

Val Val lie Arg Arg Thr Ser Ala Tyr Lys Leu Leu Arg Gin Gin lie 2025 2030 2035 CTA TCG GCT GCT GTA GCT GAG CCC TAC TAC GTC GAC GGC ATT CCG GTC 6617

Leu Ser Ala Ala Val Ala Glu Pro Tyr Tyr Val Asp Gly lie Pro Val 2040 2045 2050 TCA TGG GAC GCG GAC GCT CGT GCG CCC GCC ATG GTC TAT GGC CCT GGG 6665

Ser Trp Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Val Tyr Gly Pro Gly 2055 2060 2065 CAA AGT GTT ACC ATT GAC GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT CAA CTG 6713

Gin Ser Val Thr lie Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu 2070 2075 2080 2085 AGG CTC AGG AAT GTG GCA CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG TCC ATT 6761

Arg Leu Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val Ser Ser Glu Val Ser lie 2090 2095 2100 GAC ATT GGG ACG GAG ACT GAA GAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC GAT CTG 6809

Asp lie Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu 2105 2110 2115 CCG CCG GCG GCT GCT GCT CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG AGG ATT 6857

Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala lie Glu Asn Ala Ala Arg lie 2120 2125 2130 CTT GAA CCG CAC ATT GAT GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA CCC TCT 6905

Leu Glu Pro His lie Asp Val lie Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser ; 2135 2140 2145 ,··*. CTT TGT GGT AGT AGC CGA GAG ATG CCT GTA TGG GGA GAA GAC ATC CCC 6953

Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Val Trp Gly Glu Asp lie Pro . 2150 2155 2160 2165 CGT ACT CCA TCG CCA GCA CTT ATC TCG GTT ACT GAG AGC AGC TCA GAT 7001 ···· Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu lie Ser Val Thr Glu Ser Ser Ser Asp . 2170 2175 2180 GAG AAG ACC CCG TCG GTG TCC TCC TCG CAG GAG GAT ACC CCG TCC TCT 7049 '·' Glu Lys Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser 2185 2190 2195 I'·,, GAC TCA TTC GAG GTC ATC CAA GAG TCC GAG ACA GCC GAA GGG GAG GAA 7097 * Asp Ser Phe Glu Val lie Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu 2200 2205 2210 . AGT GTC TTC AAC GTG GCT CTT TCC GTA TTA AAA GCC TTA TTT CCA CAG 7145

Ser Val Phe Asn Val Ala Leu Ser Val Leu Lys Ala Leu Phe Pro Gin ... 2215 2220 2225 AGC GAC GCG ACC AGG AAG CTT ACC GTC AAG ATG TCG TGC TGC GTT GAA 7193 : ·’· Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Val Lys Met Ser Cys Cys Val Glu ’· 2230 2235 2240 2245 AAG AGC GTC ACG CGC TTT TTC TCA TTG GGG TTG ACG GTG GCT GAT GTT 7241

Lys Ser Val Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly Leu Thr Val Ala Asp Val 2250 2255 2260 112249 188 GCT AGC CTG TGT GAG ATG GAA ATC CAG AAC CAT ACA GCC TAT TGT GAC 7289

Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu lie Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp 2265 2270 2275 CAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG CAG GTT GGG TGC TTG GTG GGC AAT 7337

Gin Val Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Val Gly Cys Leu Val Gly Asn 2280 2285 2290 GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG GCT AGG CAA GAA ACC TTG 7385

Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu 2295 2300 2305 GCC TCC TTC TCT TAC ATT TGG TCT GGA GTG CCG CTG ACT AGG GCC ACG 7433

Ala Ser Phe Ser Tyr lie Trp Ser Gly Val Pro Leu Thr Arg Ala Thr 2310 2315 2320 2325 CCG GCC AAG CCT CCC GTG GTG AGG CCG GTT GGC TCT TTG TTA GTG GCC 7481

Pro Ala Lys Pro Pro Val Val Arg Pro Val Gly Ser Leu Leu Val Ala 2330 2335 2340 GAC ACT ACT AAG GTG TAT GTT ACC AAT CCA GAC AAT GTG GGA CGG AGG 7529

Asp Thr Thr Lys Val Tyr Val Thr Asn Pro Asp Asn Val Gly Arg Arg 2345 2350 2355 GTG GAC AAG GTG ACC TTC TGG CGT GCT CCT AGG GTT CAT GAT AAG TAC 7577

Val Asp Lys Val Thr Phe Trp Arg Ala Pro Arg Val His Asp Lys Tyr 2360 2365 2370 CTC GTG GAC TCT ATT GAG CGC GCT AAG AGG GCC GCT CAA GCC TGC CTA 7625

Leu Val Asp Ser lie Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Gin Ala Cys Leu 2375 2380 2385 AGC ATG GGT TAC ACT TAT GAG GAA GCA ATA AGG ACT GTA AGG CCA CAT 7673

Ser Met Gly Tyr Thr Tyr Glu Glu Ala lie Arg Thr Val Arg Pro His 2390 2395 2400 2405 GCT GCC ATG GGC TGG GGA TCT AAG GTG TCG GTT AAG GAC TTA GCC ACC 7721

Ala Ala Met Gly Trp Gly Ser Lys Val Ser Val Lys Asp Leu Ala Thr 2410 2415 2420 ! :’: ccc gcg ggg aag atg gcc gtc cat gac cgg ctt cag gag ata ctt gaa lies * Pro Ala Gly Lys Met Ala Val His Asp Arg Leu Gin Glu lie Leu Glu : 2425 2430 2435 : GGG ACT CCG GTC CCC TTT ACT CTT ACT GTG AAA AAG GAG GTG TTC TTC 7817

Gly Thr Pro Val Pro Phe Thr Leu Thr Val Lys Lys Glu Val Phe Phe '·· 2440 2445 2450 ! AAA GAC CGG AAG GAG GAG AAG GCC CCC CGC CTC ATT GTG TTC CCC CCC 7865 ['/, Lys Asp Arg Lys Glu Glu Lys Ala Pro Arg Leu lie Val Phe Pro Pro : : : 2455 2460 2465 CTG GAC TTC CGG ATA GCT GAA AAG CTC ATC TTG GGA GAC CCA GGC CGG 7913

Leu Asp Phe Arg lie Ala Glu Lys Leu lie Leu Gly Asp Pro Gly Arg : 2470 2475 2480 2485 ::: GTA GCC AAG GCG GTG TTG GGG GGG GCC TAC GCC TTC CAG TAC ACC CCA 7961

Val Ala Lys Ala Val Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Phe Gin Tyr Thr Pro ,,,,: 2490 2495 2500 (···. AAT CAG CGA GTT AAG GAG ATG CTC AAG CTA TGG GAG TCT AAG AAG ACC 8009 ..." Asn Gin Arg Val Lys Glu Met Leu Lys Leu Trp Glu Ser Lys Lys Thr , ·, 2505 2510 2515 “· ; CCT TGC GCC ATC TGT GTG GAC GCC ACC TGC TTC GAC AGT AGC ATA ACT 8057 * I * *: Pro Cys Ala lie Cys Val Asp Ala Thr Cys Phe Asp Ser Ser lie Thr 2520 2525 2530 GAA GAG GAC GTG GCT TTG GAG ACA GAG CTA TAC GCT CTG GCC TCT GAC 8105

Glu Glu Asp Val Ala Leu Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Leu Ala Ser Asp 112249 189 2535 2540 2545 CAT CCA GAA TGG GTG CGG GCA CTT GGG AAA TAC TAT GCC TCA GGC ACC 8153

His Pro Glu Trp Val Arg Ala Leu Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Gly Thr 2550 2555 2560 2565 ATG GTC ACC CCG GAA GGG GTG CCC GTC GGT GAG AGG TAT TGC AGA TCC 8201

Met Val Thr Pro Glu Gly Val Pro Val Gly Glu Arg Tyr Cys Arg Ser 2570 2575 2580 TCG GGT GTC CTA ACA ACT AGC GCG AGC AAC TGC TTG ACC TGC TAC ATC 8249

Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Ala Ser Asn Cys Leu Thr Cys Tyr lie 2585 2590 2595 AAG GTG AAA GCT GCC TGT GAG AGA GTG GGG CTG AAA AAT GTC TCT CTT 8297

Lys Val Lys Ala Ala Cys Glu Arg Val Gly Leu Lys Asn Val Ser Leu 2600 2605 2610 CTC ATA GCC GGC GAT GAC TGC TTG ATC ATA TGT GAG CGG CCA GTG TGC 8345

Leu lie Ala Gly Asp Asp Cys Leu lie lie Cys Glu Arg Pro Val Cys 2615 2620 2625 GAC CCA AGC GAC GCT TTG GGC AGA GCC CTA GCG AGC TAT GGG TAC GCG 8393

Asp Pro Ser Asp Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ala Ser Tyr Gly Tyr Ala 2630 2635 2640 2645 TGC GAG CCC TCA TAT CAT GCA TCA TTG GAC ACG GCC CCC TTC TGC TCC 8441

Cys Glu Pro Ser Tyr His Ala Ser Leu Asp Thr Ala Pro Phe Cys Ser 2650 2655 2660 ACT TGG CTT GCT GAG TGC AAT GCA GAT GGG AAG CGC CAT TTC TTC CTG 8489

Thr Trp Leu Ala Glu Cys Asn Ala Asp Gly Lys Arg His Phe Phe Leu 2665 2670 2675 ACC ACG GAC TTC CGG AGG CCG CTC GCT CGC ATG TCG AGT GAG TAT AGT 8537

Thr Thr Asp Phe Arg Arg Pro Leu Ala Arg Met Ser Ser Glu Tyr Ser 2680 2685 2690 GAC CCG ATG GCT TCG GCG ATC GGT TAC ATC CTC CTT TAT CCT TGG CAC 8585

Asp Pro Met Ala Ser Ala lie Gly Tyr lie Leu Leu Tyr Pro Trp His 2695 2700 2705 : CCC ATC ACA CGG TGG GTC ATC ATC CCT CAT GTG CTA ACG TGC GCA TTC 8633

Pro lie Thr Arg Trp Val lie lie Pro His Val Leu Thr Cys Ala Phe ; 2710 2715 2720 2725 ··* AGG GGT GGA GGC ACA CCG TCT GAT CCG GTT TGG TGC CAG GTG CAT GGT 8681

Arg Gly Gly Gly Thr Pro Ser Asp Pro Val Trp Cys Gin Val His Gly *, : : 2730 2735 2740 > < · I AAC TAC TAC AAG TTT CCA CTG GAC AAA CTG CCT AAC ATC ATC GTG GCC 8729

Asn Tyr Tyr Lys Phe Pro Leu Asp Lys Leu Pro Asn lie lie Val Ala 2745 2750 2755 I *.. CTC CAC GGA CCA GCA GCG TTG AGG GTT ACC GCA GAC ACA ACT AAA ACA 8777

Leu His Gly Pro Ala Ala Leu Arg Val Thr Ala Asp Thr Thr Lys Thr .* : : 2760 2765 2770 AAG ATG GAG GCT GGT AAG GTT CTG AGC GAC CTC AAG CTC CCT GGC TTA 8825 ‘ * Lys Met Glu Ala Gly Lys Val Leu Ser Asp Leu Lys Leu Pro Gly Leu ,···, 2775 2780 2785 I t > GCA GTC CAC CGA AAG AAG GCC GGG GCG TTG CGA ACA CGC ATG CTC CGC 8873 : I : Ala Val His Arg Lys Lys Ala Gly Ala Leu Arg Thr Arg Met Leu Arg ; 2790 2795 2800 2805 TCG CGC GGT TGG GCT GAG TTG GCT AGG GGC TTG TTG TGG CAT CCA GGC 8921

Ser Arg Gly Trp Ala Glu Leu Ala Arg Gly Leu Leu Trp His Pro Gly 2810 2815 2820 112249 190 CT A CGG CTT CCT CCC CCT GAG ATT GCT GGT ATC CCG GGG GGT TTC CCT 8969

Leu Arg Leu Pro Pro Pro Glu Ile Ala Gly Ile Pro Gly Gly Phe Pro 2825 2830 2835 CTC TCC CCC CCC TAT ATG GGG GTG GTA CAT CAA TTG GAT TTC ACA AGC 9017

Leu Ser Pro Pro Tyr Met Gly Vai Vai His Gin Leu Asp Phe Thr Ser 2840 2845 2850 CAG AGG AGT CGC TGG CGG TGG TTG GGG TTC TTA GCC CTG CTC ATC GTA 9065

Gin Arg Ser Arg Trp Arg Trp Leu Gly Phe Leu Ala Leu Leu Ile Vai 2855 2860 2865 GCC CTC TTC GGG TGAACTAAAT TCATCTGTTG CGGCAAGGTC TGGTGACTGA 9117

Ala Leu Phe Gly 2870 TCATCACCGG AGGAGGTTCC CGCCCTCCCC GCCCCAGGGG TCTCCCCGCT GGGTAAAAAG 9177 GGCCCGGCCT TGGGAGGCAT GGTGGTTACT AACCCCCTGG CAGGGTCAAA GCCTGATGGT 9237 GCTAATGCAC TGCCACTTCG GTGGCGGGTC GCTACCTTAT AGCGTAATCC GTGACTACGG 9297 GCTGCTCGCA GAGCCCTCCC CGGATGGGGC ACAGTGCACT GTGATCTGAA GGGGTGCACC 9357 CCGGGAAGAG CTCGGCCCGA AGGCCGGSTT CTACT 9392 (2) SEKVENSSIN ID NO:15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2873 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:15:

Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Arg 15 10 15 · Ile Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Phe Phe Tyr Thr Ile Met 20 25 30 • ·

Ala Vai Leu Leu Leu Leu Leu Vai Vai Glu Ala Gly Ala Ile Leu Ala ; 35 40 45 » *"* Pro Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn : 50 55 60 • * * : : Cys Cys Ala Pro Glu Asp Ile Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu 65 70 75 80

Vai Ala Leu Gly Cys Thr Ile Cys Thr Asp Gin Cys Trp Pro Leu Tyr 85 90 95 ; ; : Gin Ala Gly Leu Ala Vai Arg Pro Gly Lys Ser Ala Ala Gin Leu Vai 100 105 110 • ’ * Gly Glu Leu Gly Ser Leu Tyr Gly Pro Leu Ser Vai Ser Ala Tyr Vai "·, 115 120 125 i * f ' Ala Gly Ile Leu Gly Leu Gly Glu Vai Tyr Ser Gly Vai Leu Thr Vai : 130 135 140 • * » ·

Gly Vai Ala Leu Thr Arg Arg Vai Tyr Pro Vai Pro Asn Leu Thr Cys 145 150 155 160

Ala Vai Ala Cys Glu Leu Lys Trp Glu Ser Glu Phe Trp Arg Trp Thr 165 170 175 112249 191

Glu Gin Leu Ala Ser Asn Tyr Trp lie Leu Glu Tyr Leu Trp Lys Val 180 185 190

Pro Phe Asp Phe Trp Arg Gly Val lie Ser Leu Thr Pro Leu Leu Val 195 200 205

Cys Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Glu Gin Arg lie Val Met Val Phe 210 215 220

Leu Leu Val Thr Met Ala Gly Met Ser Gin Gly Ala Pro Ala Ser Val 225 230 235 240

Leu Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Gly Leu Thr Trp Gin Thr Cys Ser 245 250 255

Cys Arg Ala Asn Gly Ser Arg Phe Ser Thr Gly Glu Lys Val Trp Asp 260 265 270

Arg Gly Asn Val Thr Leu Gin Cys Asp Cys Pro Asn Gly Pro Trp Val 275 280 285

Trp Leu Pro Ala Phe Cys Gin Ala lie Gly Trp Gly Asp Pro lie Thr 290 295 300

Tyr Trp Ser His Gly Gin Asn Gin Trp Pro Leu Ser Cys Pro Gin Tyr 305 310 315 320

Val Tyr Gly Ser Ala Thr Val Thr Cys Val Trp Gly Ser Ala Ser Trp 325 330 335

Phe Ala Ser Thr Ser Gly Arg Asp Ser Lys lie Asp Val Trp Ser Leu 340 345 350

Val Pro Val Gly Ser Ala Thr Cys Thr lie Ala Ala Leu Gly Ser Ser 355 360 365

Asp Arg Asp Thr Val Pro Gly Leu Ser Glu Trp Gly lie Pro Cys Val 370 375 380 , Thr Cys Val Leu Asp Arg Arg Pro Ala Ser Cys Gly Thr Cys Val Arg *. : 385 390 395 400 i · I Asp Cys Trp Pro Glu Thr Gly Ser Val Arg Phe Pro Phe His Arg Cys ‘I 405 410 415 ( · ! Gly Val Gly Pro Arg Leu Thr Lys Asp Leu Glu Ala Val Pro Phe Val 420 425 430 ' '> ! Asn Arg Thr Thr Pro Phe Thr lie Arg Gly Pro Leu Gly Asn Gin Gly 435 440 445 > » > * b

Arg Gly Asn Pro Val Arg Ser Pro Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Ala Met 450 455 460 > .. Thr Arg lie Arg Asp Thr Leu His Leu Val Glu Cys Pro Thr Pro Ala 465 470 475 480 » · « lie Glu Pro Pro Thr Gly Thr Phe Gly Phe Phe Pro Gly Thr Pro Pro 485 490 495

( I

Leu Asn Asn Cys Met Leu Leu Gly Thr Glu Val Ser Glu Ala Leu Gly 500 505 510 * » • I i Gly Ala Gly Leu Thr Gly Gly Phe Tyr Glu Pro Leu Val Arg Arg Cys " ! 515 520 525 » ·

Ser Lys Leu Met Gly Ser Arg Asn Pro Val Cys Pro Gly Phe Ala Trp 530 535 540

Leu Ser Ser Gly Arg Pro Asp Gly Phe lie His Val Gin Gly His Leu 112249 545 550 555 560

Gin Glu Vai Asp Ala Gly Asn Phe Ile Pro Pro Pro Arg Trp Leu Leu 565 570 575

Leu Asp Phe Vai Phe Vai Leu Leu Tyr Leu Met Lys Leu Ala Glu Ala 580 585 590

Arg Leu Vai Pro Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Trp Trp Vai Asn Gin 595 600 605

Leu Ala Vai Leu Gly Leu Pro Ala Vai Glu Ala Ala Vai Ala Gly Glu 610 615 620

Vai Phe Ala Gly Pro Ala Leu Ser Trp Cys Leu Gly Leu Pro Vai Vai 625 630 635 640

Ser Met Ile Leu Gly Leu Ala Asn Leu Vai Leu Tyr Phe Arg Trp Leu 645 650 655

Gly Pro Gin Arg Leu Met Phe Leu Vai Leu Trp Lys Leu Ala Arg Gly 660 665 670

Ala Phe Pro Leu Ala Leu Leu Met Gly Ile Ser Ala Thr Arg Gly Arg 675 680 685

Thr Ser Vai Leu Gly Ala Glu Phe Cys Phe Asp Ala Thr Phe Glu Vai 690 695 700

Asp Thr Ser Vai Leu Gly Trp Vai Vai Ala Ser Vai Vai Ala Trp Ala 705 710 715 720

Ile Ala Leu Leu Ser Ser Met Ser Ala Gly Gly Trp Arg His Lys Ala 725 730 735

Vai Ile Tyr Arg Thr Trp Cys Lys Gly Tyr Gin Ala Ile Arg Gin Arg 740 745 750

Vai Vai Arg Ser Pro Leu Gly Glu Gly Arg Pro Ala Lys Pro Leu Thr 755 760 765 i » * Phe Ala Trp Cys Leu Ala Ser Tyr Ile Trp Pro Asp Ala Vai Met Met \· 770 775 780 • » : Vai Vai Vai Ala Leu Vai Leu Leu Phe Gly Leu Phe Asp Ala Leu Asp 785 790 795 800 ' I * » ' 'ΐ Trp Ala Leu Glu Glu Ile Leu Vai Ser Arg Pro Ser Leu Arg Arg Leu : ; : 805 8io 815 ' ! ; Ala Arg Vai Vai Glu Cys Cys Vai Met Ala Gly Glu Lys Ala Thr Thr 820 825 830

Vai Arg Leu Vai Ser Lys Met Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Phe Asp , ·. 835 840 845 t 4 : I : His Met Gly Ser Phe Ser Arg Ala Vai Lys Glu Arg Leu Leu Glu Trp 850 855 860 « . * » » #

Asp Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Arg Thr Asp Cys Arg Ile 865 870 875 880 ’ t

. I

‘, Ile Arg Asp Ala Ala Arg Thr Leu Ser Cys Gly Gin Cys Vai Met Gly > ! ; 885 890 895 ? i » »

Leu Pro Vai Vai Ala Arg Arg Gly Asp Glu Vai Leu Ile Gly Vai Phe 900 905 910

Gin Asp Vai Asn His Leu Pro Pro Gly Phe Vai Pro Thr Ala Pro Vai 915 920 925 112249 193

Vai Ile Arg Arg Cys Gly Lys Gly Phe Leu Gly Vai Thr Lys Ala Ala 930 935 940

Leu Thr Gly Arg Asp Pro Asp Leu His Pro Gly Asn Vai Met Vai Leu 945 950 955 960

Gly Thr Ala Thr Ser Arg Ser Met Gly Thr Cys Leu Asn Gly Leu Leu 965 970 975

Phe Thr Thr Phe His Gly Ala Ser Ser Arg Thr Ile Ala Thr Pro Vai 980 985 990

Gly Ala Leu Asn Pro Arg Trp Trp Ser Ala Ser Asp Asp Vai Thr Vai 995 1000 1005

Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Ala Thr Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gin 1010 1015 1020

Ala Glu Ser Cys Trp Vai Ile Arg Ser Asp Gly Ala Leu Cys His Gly 1025 1030 1035 1040

Leu Ser Lys Gly Asp Lys Vai Glu Leu Asp Vai Ala Met Glu Vai Ser 1045 1050 1055

Asp Phe Arg Gly Ser Ser Gly Ser Pro Vai Leu Cys Asp Glu Gly His 1060 1065 1070

Ala Vai Gly Met Leu Vai Ser Vai Leu His Ser Gly Gly Arg Vai Thr 1075 1080 1085

Ala Ala Arg Phe Thr Arg Pro Trp Thr Gin Vai Pro Thr Asp Ala Lys 1090 1095 1100

Thr Thr Thr Glu Pro Pro Pro Vai Pro Ala Lys Gly Vai Phe Lys Glu 1105 1110 1115 1120

Ala Pro Leu Phe Met Pro Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Arg Vai Pro 1125 1130 1135

Leu Glu Tyr Asp Asn Met Gly His Lys Vai Leu Ile Leu Asn Pro Ser 1140 1145 1150 , Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly Pro Tyr Met Glu Arg Leu Ala Gly : : 1155 1160 1165 : Lys His Pro Ser Ile Tyr Cys Gly His Asp Thr Thr Ala Phe Thr Arg ", 1170 1175 1180 ! Ile Thr Asp Ser Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ala ·;· 1185 1190 1195 1200 • Ϊ Asn Pro Arg Gin Met Leu Arg Gly Vai Ser Vai Vai Ile Cys Asp Glu ;;; 1205 1210 1215

Cys His Ser His Asp Ser Thr Vai Leu Leu Gly Ile Gly Arg Vai Arg 1220 1225 1230

Glu Leu Ala Arg Gly Cys Gly Vai Gin Leu Vai Leu Tyr Ala Thr Ala 1235 1240 1245 • · • »

Thr Pro Pro Gly Ser Pro Met Thr Gin His Pro Ser Ile Ile Glu Thr 1250 1255 1260

Lys Leu Asp Vai Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly His Gly Ile Pro Leu 1265 1270 1275 1280 I Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Vai Phe Cys His Ser Lys Ala "" ; 1285 1290 1295

Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gin Phe Ser Ala Arg Gly Vai Asn Ala 112249 194 1300 1305 1310

Ile Ala Tyr Tyr Arg Gly Lys Asp Ser Ser Ile Ile Lys Asp Gly Asp 1315 1320 1325

Leu Vai Vai Cys Ala Thr Asp Ala Leu Ser Thr Gly Tyr Thr Gly Asn 1330 1335 1340

Phe Asp Ser Vai Thr Asp Cys Gly Leu Vai Vai Glu Glu Vai Vai Glu 1345 1350 1355 1350

Vai Thr Leu Asp Pro Thr Ile Thr Ile Ser Leu Arg Thr Vai Pro Ala 1365 1370 1375

Ser Ala Glu Leu Ser Met Gin Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg 1380 1385 1390

Ser Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Gly Vai Gly Lys Ala Pro Ala Gly Vai 1395 1400 1405

Vai Arg Ser Gly Pro Vai Trp Ser Ala Vai Glu Ala Gly Vai Thr Trp 1410 1415 1420

Tyr Gly Met Glu Pro Asp Leu Thr Ala Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Asp 1425 1430 1435 1440

Asp Cys Pro Tyr Thr Ala Ala Vai Ala Ala Asp Ile Gly Glu Ala Ala 1445 1450 1455

Vai Phe Phe Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Met His Pro Asp Vai Ser 1460 1465 1470

Trp Ala Lys Vai Arg Gly Vai Asn Trp Pro Leu Leu Vai Gly Vai Gin 1475 1480 1485

Arg Thr Met Cys Arg Glu Thr Leu Ser Pro Gly Pro Ser Asp Asp Pro 1490 1495 1500

Gin Trp Ala Gly Leu Lys Gly Pro Asn Pro Vai Pro Leu Leu Leu Arg 1505 1510 1515 1520

Trp Gly Asn Asp Leu Pro Ser Lys Vai Ala Gly His His Ile Vai Asp 1525 1530 1535

Asp Leu Vai Arg Arg Leu Gly Vai Ala Glu Gly Tyr Vai Arg Cys Asp ; : 1540 1545 1550 : : : Ala Gly Pro Ile Leu Met Ile Gly Leu Ala Ile Ala Gly Gly Met Ile ' ", 1555 1560 1565 ! » · '“1 Tyr Ala Ser Tyr Thr Gly Ser Leu Vai Vai Vai Thr Asp Trp Asp Vai , : : 1570 1575 1580 • : : Lys Gly Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Arg His Gly Asp Gin Ala Thr Pro 1585 1590 1595 1600

Gin Pro Vai Vai Gin Vai Pro Pro Vai Asp His Arg Pro Gly Gly Glu : 1605 1610 1615 • ! · Ser Ala Pro Ser Asp Ala Lys Thr Vai Thr Asp Ala Vai Ala Ala Ile 1620 1625 1630 > · > ·

Gin Vai Asp Cys Asp Trp Thr Ile Met Thr Leu Ser Ile Gly Glu Vai ,·*. 1635 1640 1645 t t , Leu Ser Leu Ala Gin Ala Lys Thr Ala Glu Ala Tyr Thr Ala Thr Ala ; : : 1650 1655 1660

Lys Trp Leu Ala Gly Cys Tyr Thr Gly Thr Arg Ala Vai Pro Thr Vai 1665 1670 1675 1680 112249 195

Ser Ile Vai Asp Lys Leu Phe Ala Gly Gly Trp Ala Ala Vai Vai Gly 1685 1690 1695

His Cys His Ser Vai Ile Ala Ala Ala Vai Ala Ala Tyr Gly Ala Ser 1700 1705 1710

Arg Ser Pro Pro Leu Ala Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Met Gly Leu Gly 1715 1720 1725

Vai Gly Gly Asn Ala Gin Thr Arg Leu Ala Ser Ala Leu Leu Leu Gly 1730 1735 1740

Ala Ala Gly Thr Ala Leu Gly Thr Pro Vai Vai Gly Leu Thr Met Ala 1745 1750 1755 1760

Gly Ala Phe Met Gly Gly Ala Ser Vai Ser Pro Ser Leu Vai Thr Ile 1765 1770 1775

Leu Leu Gly Ala Vai Gly Gly Trp Glu Gly Vai Vai Asn Ala Ala Ser 1780 1785 1790

Leu Vai Phe Asp Phe Met Ala Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Leu Trp 1795 1800 1805

Tyr Ala Ile Pro Vai Leu Thr Ser Pro Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ile 1810 1815 1820

Ala Leu Gly Leu Vai Leu Tyr Ser Ala Asn Asn Ser Gly Thr Thr Thr 1825 1830 1835 1840

Trp Leu Asn Arg Leu Leu Thr Thr Leu Pro Arg Ser Ser Cys Ile Pro 1845 1850 1855

Asp Ser Tyr Phe Gin Gin Vai Asp Tyr Cys Asp Lys Vai Ser Ala Vai 1860 1865 1870

Leu Arg Arg Leu Ser Leu Thr Arg Thr Vai Vai Ala Leu Vai Asn Arg 1875 1880 1885

Glu Pro Lys Vai Asp Glu Vai Gin Vai Gly Tyr Vai Trp Asp Leu Trp 1890 1895 1900

Glu Trp Ile Met Arg Gin Vai Arg Vai Vai Met Ala Arg Leu Arg Ala ; 1905 1910 1915 1920 * ! t * ; Leu Cys Pro Vai Vai Ser Leu Pro Leu Trp His Cys Gly Glu Gly Trp 1925 1930 1935 ' ‘ Ser Gly Glu Trp Leu Leu Asp Gly His Vai Glu Ser Arg Cys Leu Cys ·” 1940 1945 1950 ( : ί Gly Cys Vai Ile Thr Gly Asp Vai Leu Asn Gly Gin Leu Lys Glu Pro ;;; 1955 I960 1965 • · ·

Vai Tyr Ser Thr Lys Leu Cys Arg His Tyr Trp Met Gly Thr Vai Pro 1970 1975 1980 ; Vai Asn Met Leu Gly Tyr Gly Glu Thr Ser Pro Leu Leu Ala Ser Asp 1985 1990 1995 2000 » · > * »

Thr Pro Lys Vai Vai Pro Phe Gly Thr Ser Gly Trp Ala Glu Vai Vai 2005 2010 2015 ,**. Vai Thr Thr Thr His Vai Vai Ile Arg Arg Thr Ser Ala Tyr Lys Leu 2020 2025 2030 1 : : Leu Arg Gin Gin Ile Leu Ser Ala Ala Vai Ala Glu Pro Tyr Tyr Vai I 2035 2040 2045

Asp Gly Ile Pro Vai Ser Trp Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met »« 112249 2050 2055 2060

Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr Thr 2065 2070 2075 2080

Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala Pro Ser Glu Vai Ser 2085 2090 2095

Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu Leu 2100 2105 2110

Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala Ile Glu 2115 2120 2125

Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp Vai Ile Met Glu Asp 2130 2135 2140

Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Vai Trp 2145 2150 2155 2160

Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu Ile Ser Vai Thr 2165 2170 2175

Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Vai Ser Ser Ser Gin Glu 2180 2185 2190

Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Vai Ile Gin Glu Ser Glu Thr 2195 2200 2205

Ala Glu Gly Glu Glu Ser Vai Phe Asn Vai Ala Leu Ser Vai Leu Lys 2210 2215 2220

Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Vai Lys Met 2225 2230 2235 2240

Ser Cys Cys Vai Glu Lys Ser Vai Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly Leu 2245 2250 2255

Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu Ile Gin Asn His 2260 2265 2270

Thr Ala Tyr Cys Asp Gin Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly , . 2275 2280 2285

Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala : : 2290 2295 2300 : : · Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr Ile Trp Ser Gly Vai Pro 2305 2310 2315 2320 ♦ *. Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro Vai Vai Arg Pro Vai Gly l 2325 2330 2335 ' · 1 Ser Leu Leu Vai Ala Asp Thr Thr Lys Vai Tyr Vai Thr Asn Pro Asp 2340 2345 2350

Asn Vai Gly Arg Arg Vai Asp Lys Vai Thr Phe Trp Arg Ala Pro Arg 2355 2360 2365 : · Vai His Asp Lys Tyr Leu Vai Asp Ser Ile Glu Arg Ala Lys Arg Ala 2370 2375 2380

Ala Gin Ala Cys Leu Ser Met Gly Tyr Thr Tyr Glu Glu Ala Ile Arg .”*· 2385 2390 2395 2400 * · , Thr Vai Arg Pro His Ala Ala Met Gly Trp Gly Ser Lys Vai Ser Vai I,; \ 2405 2410 2415

Lys Asp Leu Ala Thr Pro Ala Gly Lys Met Ala Vai His Asp Arg Leu 2420 2425 2430 112249 197

Gin Glu Ile Leu Glu Gly Thr Pro Vai Pro Phe Thr Leu Thr Vai Lys 2435 2440 2445

Lys Glu Vai Phe Phe Lys Asp Arg Lys Glu Glu Lys Ala Pro Arg Leu 2450 2455 2460

Ile Vai Phe Pro Pro Leu Asp Phe Arg Ile Ala Glu Lys Leu Ile Leu 2465 2470 2475 2480

Gly Asp Pro Gly Arg Vai Ala Lys Ala Vai Leu Gly Gly Ala Tyr Ala 2485 2490 2495

Phe Gin Tyr Thr Pro Asn Gin Arg Vai Lys Glu Met Leu Lys Leu Trp 2500 2505 2510

Glu Ser Lys Lys Thr Pro Cys Ala Ile Cys Vai Asp Ala Thr Cys Phe 2515 2520 2525

Asp Ser Ser Ile Thr Glu Glu Asp Vai Ala Leu Glu Thr Glu Leu Tyr 2530 2535 2540

Ala Leu Ala Ser Asp His Pro Glu Trp Vai Arg Ala Leu Gly Lys Tyr 2545 2550 2555 2560

Tyr Ala Ser Gly Thr Met Vai Thr Pro Glu Gly Vai Pro Vai Gly Glu 2565 2570 2575

Arg Tyr Cys Arg Ser Ser Gly Vai Leu Thr Thr Ser Ala Ser Asn Cys 2580 2585 2590

Leu Thr Cys Tyr Ile Lys Vai Lys Ala Ala Cys Glu Arg Vai Gly Leu 2595 2600 2605

Lys Asn Vai Ser Leu Leu Ile Ala Gly Asp Asp Cys Leu Ile Ile Cys 2610 2615 2620

Glu Arg Pro Vai Cys Asp Pro Ser Asp Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ala 2625 2630 2635 2640

Ser Tyr Gly Tyr Ala Cys Glu Pro Ser Tyr His Ala Ser Leu Asp Thr 2645 2650 2655

Ala Pro Phe Cys Ser Thr Trp Leu Ala Glu Cys Asn Ala Asp Gly Lys 2660 2665 2670 : Arg His Phe Phe Leu Thr Thr Asp Phe Arg Arg Pro Leu Ala Arg Met 2675 2680 2685

Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Met Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Ile Leu 2690 2695 2700 ί Leu Tyr Pro Trp His Pro Ile Thr Arg Trp Vai Ile Ile Pro His Vai 2705 2710 2715 2720

Leu Thr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Gly Thr Pro Ser Asp Pro Vai Trp 2725 2730 2735 t

Cys Gin Vai His Gly Asn Tyr Tyr Lys Phe Pro Leu Asp Lys Leu Pro ... 2740 2745 2750 • *

Asn Ile Ile Vai Ala Leu His Gly Pro Ala Ala Leu Arg Vai Thr Ala 2755 2760 2765

Asp Thr Thr Lys Thr Lys Met Glu Ala Gly Lys Vai Leu Ser Asp Leu 2770 2775 2780 : I I Lys Leu Pro Gly Leu Ala Vai His Arg Lys Lys Ala Gly Ala Leu Arg *" ; 2785 2790 2795 2800

Thr Arg Met Leu Arg Ser Arg Gly Trp Ala Glu Leu Ala Arg Gly Leu 112249 198 2805 2810 2815

Leu Trp His Pro Gly Leu Arg Leu Pro Pro Pro Glu Ile Ala Gly He 2820 2825 2830

Pro Gly Gly Phe Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Met Gly Vai Val His Gin 2835 2840 2845

Leu Asp Phe Thr Ser Gin Arg Ser Arg Trp Arg Trp Leu Gly Phe Leu 2850 2855 2860

Ala Leu Leu He Val Ala Leu Phe Gly 2865 2870 (2) SEKVENSSIN ID NO:16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Koetin 470-20-1-152F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:16: TCGGTTACTG AGAGCAGCTC AGATGAG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:17 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ; : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t ·

: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

* · : (iii) HYPOTEETTINEN: ei ·· (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: JML-A, aluke * · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:17: ’ AGGAATTOAG CGGCCGCGAG 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:18 TIEDOT: l : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ‘ ' (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ,···. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i ·

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

» · · ! (iii) HYPOTEETTINEN: ei t * (vi) ALKUPERÄ: 112249 199 (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: JML-B, aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:18: CTCGCGGCCG CTGAATTCCT TT 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 203 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470-20-1 klooni, ilman SISPA- linkeriä (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 2..203 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:19: G GOT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC GGG 46

Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly 15 10 15 GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC GGC GGG GTC TTC TCA TCT GAG CTG 94

Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Gly Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu 20 25 30 CTC TCA GTA ACC GAG ATA AGT GCT GGC GAT GGA GTA CGG GGG ATG TCT 142

Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met Ser 35 40 45 TCT CCC CAT ACA GGC ATC TCT CGG CTA CTA CCA CAA AGA GAG GGT GTA 190 , : : Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Vai 50 55 60 • · CTG CAG TCC TCC A 203 : : : Leu Gin Ser Ser 65 l (2) SEKVENSSIN ID NO:20 TIEDOT: ! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 67 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t · · ... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini * · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:20: . f · * »

Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai ,*·\1 5 10 15 , *. Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Gly Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu Leu : ; : 20 25 30

Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met Ser Ser 35 40 45 112249 200

Pro His Thr Gly lie Ser Arg Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Val Leu 50 55 60

Gin Ser Ser 65 (2) SEKVENSSIN ID NO:21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470-20-1-152R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:21: CTCATCTGAG CTGCTCTCAG TAACCGA 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: oligonukleotidi B

' */ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:22: « · CTGTCTCGGA CTCTTGGATG ACCT 24 ' < ♦ » ! (2) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: • * * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

T: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

rl(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei * · (vi) ALKUPERÄ: i ; : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: samankaltainen ) oligonukleotidi 211R' • M * » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:23: 112249 201 ATACCCCGTC CTCTGACTCA TTCG 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: sukulaisoligonukleotidi B' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:24: AGGTCATCCA AGAGTCCGAG ACAG 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: LAMBDA GT 11 etualuke, 20meeri (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:25: • * ; *: CACATGGCTG AATATCGACG 20 * I f · ·’'* (2) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT: < » · ·; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; ; (A) PITUUS: 180 emäsparia *' (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’{*; (C) JUOSTEISUUS: molemmat ‘ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei * i > · \ (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: *>·, (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 4E3 k ( (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:26: » · * “* \ GCGAGCCTAG TCTTTGACTT CATGGCGGGG AAACTTTCAT CAGAAGATCT GTGGTATGCC 60 ATCCCGGTAC TGACCAGCCC GGGGGCGGGC CTTGCGGGGA TCGCTCTCGG GTTGGTTTTG 120 112249 202 TATTCAGCTA ACAACTCTGG CACTACCACT TGGTTGAACC GTCTGCTGAC TACGTTACCA 180 (2) SEKVENSSIN ID NO:27 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 430 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 3E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:27: GGCACTACCA CTTGGTTGAA CCGTCTGCTG ACTACGTTÄC CAAGGTCTTC ATGTATCCCG 60 GACAGTTACT TTCAGCAAGT TGACTATTGC GACAAGGTCT CAGCCGTGCT CCGGCGCCTG 120 AGCCTCACCC GCACAGTGGT TGCCCTGGTC AACAGGGAGC CTAAGGTGGA TGAGGTACAG 180 GTGGGGTATG TCTGGGACCT GTGGGAGTGG ATCATGCGCC AAGTGCGCGT GGTCATGGCC 240 AGACTCAGGG CCCTCTGCCC CGTGGTGTCA CTACCCTTGT GGCATTGCGG GGAGGGGTGG 300 TCCGGGGAAT GGTTGCTTGA CGGTCATGTT GAGAGTCGCT GCCTCTGTGG CTGCGTGATC 360 ACTGGTGACG TTCTGAATGG GCAACTCAAA GAACCAGTTT ACTCTACCAA GCTGTGCCGG 420 CACTATTGGA 430 (2) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 180 emäsparia i (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat ; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t

I ; { (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA

*!' (iii) HYPOTEETTINEN: ei : I ; (iv) ANTI-SENSE: ei . 4 * (vi) ALKUPERÄ: ' (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 2E5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:28: i » ' . CTTACCGTCA AGATGTCGTG CTGCGTTGAA AAGAGCGTCA CGCGCTTTTT CTCATTGGGG 60 ♦ t TTGACGGTGG CTGATGTTGC TAGCCTGTGT GAGATGGAAA TCCAGAACCA TACAGCCTAT 120 ' ’ TGTGACCAGG TGCGCACTCC GCTTGAATTG CAGGTTGGGT GCTTGGTGGG CAATGAACTT 180 ti» i i (2) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: ! I f " (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *:·*; (A) PITUUS: 344 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 112249 203 (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 1E5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:29: CTTCTCTTTG TGGTAGTAGC CGAGAGATGC CTGTATGGGG AGAAGACATC CCCCGTACTC 60 CATCGCCAGC ACTTATCTCG GTTACTGAGA GCAGCTCAGA TGAGAAGACC CCGTCGGTGT 120 CCTCCTCGCA GGAGGATACC CCGTCCTCTG ACTCATTCGA GGTCATCCAA GAGTCCGAGA 180 CAGCCGAAGG GGAGGAAAGT GTCTTCAACG TGGCTCTTTC CGTATTAAAA GCCTTATTTC 240 CACAGAGCGA CGCGACCAGG AAGCTTACCG TCAAGATGTC GTGCTGCGTT GAAAAGAGCG 300 TCACGCGCTT TTTCTCATTG GGGTTGACGG TGGCTGATGT TGCT 344 (2) SEKVENSSIN ID NO:30 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 423 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 4E5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:30: GTAAGGCCAC ATGCTGCCAT GGGCTGGGGA TCTAAGGTGT CGGTTAAGGA CTTAGCCACC 60 t · ' · CCCGCGGGGA AGATGGCCGT CCATGACCGG CTTCAGGAGA TACTTGAAGG GACTCCGGTC 120 . CCCTTTACTC TTACTGTGAA AAAGGAGGTG TTCTTCAAAG ACCGGAAGGA GGAGAAGGCC 180 l‘J‘: CCCCGCCTCA TTGTGTTCCC CCCCCTGGAC TTCCGGATAG CTGAAAAGCT CATCTTGGGA 240 GACCCAGGCC GGGTAGCCAA GGCGGTGTTG GGGGGGGCCT ACGCCTTCCA GTACACCCCA 300 AATCAGCGAG TTAAGGAGAT GCTCAAGCTA TGGGAGTCTA AGAAGACCCC TTGCGCCATC 360 TGTGTGGACG CCACCTGCTT CGACAGTAGC ATAACTGAAG AGGACGTGGC TTTGGAGACA 420 ( GAG 423 s » < » i » · (2) SEKVENSSIN ID NO:31 TIEDOT: I (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ··' * (A) PITUUS: 516 emäsparia ;··· (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 112249 204

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 3E5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:31: TACAGCCTAT TGTGACCAGG TGCGCACTCC GCTTGAATTG CAGGTTGGGT GCTTGGTGGG 60 CAATGAACTT ACCTTTGAAT GTGACAAGTG TGAGGCTAGG CAAGAAACCT TGGCCTCCTT 120 CTCTTACATT TGGTCTGGAG TGCCGCTGAC TAGGGCCACG CCGGCCAAGC CTCCCGTGGT 180 GAGGCCGGTT GGCTCTTTGT TAGTGGCCGA CACTACTAAG GTGTATGTTA CCAATCCAGA 240 CAATGTGGGA CGGAGGGTGG ACAAGGTGAC CTTCTGGCGT GCTCCTAGGG TTCATGATAA 300 GTACCTCGTG GACTCTATTG AGCGCGCTAA GAGGGCCGCT CAAGCCTGCC TAAGCATGGG 360 TTACACTTAT GAGGAAGCAA TAAGGACTGT AAGGCCACAT GCTGCCATGG GCTGGGGATC 420 TAAGGTGTCG GTTAAGGACT TAGCCACCCC CGCGGGGAAG ATGGCCGTCC ATGACCGGCT 480 TCAGGAGATA CTTGAAGGGA CTCCGGTCCC CTTTAC 516 (2) SEKVENSSIN ID NO:32 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 518 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ' . . (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ' (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 2E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:32: * GAATGGGCAA CTCAAAGAAC CAGTTTACTC TACCAAGCTG TGCCGGCACT ATTGGATGGG 60 ’ GACTGTCCCT GTGAACATGC TGGGTTACGG TGAAACGTCG CCTCTCCTGG CCTCCGACAC 120 CCCGAAGGTT GTGCCCTTCG GGACGTCTGG CTGGGCTGAG GTGGTGGTGA CCACTACCCA 180 CGTGGTAATC AGGAGGACCT CCGCCTATAA GCTGCTGCGC CAGCAAATCC TATCGGCTGC 240 TGTAGCTGAG CCCTACTACG TCGACGGCAT TCCGGTCTCA TGGGACGCGG ACGCTCGTGC 300 ' GCCCGCCATG GTCTATGGCC CTGGGCAAAG TGTTACCATT GACGGGGAGC GCTACACCTT 360 ' : " · GCCTCATCAA CTGAGGCTCA GGAATGTGGC ACCCTCTGAG GTTTCATCCG AGGTGTCCAT 420 : TGACATTGGG ACGGAGACTG AAGACTCAGA ACTGACTGAG GCCGATCTGC CGCCGGCGGC 480 : TGCTGCTCTC CAAGCGATCG AGAATGCTGC GAGGATTC 518 (2) SEKVENSSIN ID NO:33 TIEDOT: 112249 205 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 268 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 1E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:33: CTTACTGAGG CCGATCTGCC GCCGGCGGCT GCTGCTCTCC AAGCGATCGA GAATGCTGCG 60 AGGATTCTTG AACCGCACAT TGATGTCATC ATGGAGGACT GCAGTACACC CTCTCTTTGT 120 GGTAGTAGCC GAGAGATGCC TGTATGGGGA GAAGACATCC CCCGTACTCC ATCGCCAGCA 180 CTTATCTCGG TTACTGAGAG CAGCTCAGAT GAGAAGACCC CGTCGGTGTC CTCCTCGCAG 240 GAGGATACCC CGTCCTCTGA CTCATTCG 268 (2) SEKVENSSIN ID NO:34 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 781 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ' (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Yksittäinen klooni 4E5-20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:34: GTAAGGCCAC ATGCTGCCAT GGGCTGGGGA TCTAAGGTGT CGGTTAAGGA CTTAGCCACC 60 • · CCCGCGGGGA AGATGGCCGT CCATGACCGG CTTCAGGAGA TACTTGAAGG GACTCCGGTC 120 CCCTTTACTC TTACTGTGAA AAAGGAGGTG TTCTTCAAAG ACCGGAAGGA GGAGAAGGCC 180 *·* CCCCGCCTCA TTGTGTTCCC CCCCCTGGAC TTCCGGATAG CTGAAAAGCT CATCTTGGGA 240 GACCCAGGCC GGGTAGCCAA GGCGGTGTTG GGGGGGGCCT ACGCCTTCCA GTACACCCCA 300 ·’ '* AATCAGCGAG TTAAGGAGAT GCTCAAGCTA TGGGAGTCTA AGAAGACCCC TTGCGCCATC 360 '·' TGTGTGGACG CCACCTGCTT CGACAGTAGC ATAACTGAAG AGGACGTGGC TTTGGAGACA 420 GAGTTATACG CTCTGGCCTC TGACCATCCA GAATGGGTGC GGGCACCTGG GAAATACTAT 480 i : GCCTCAGGCA CCATGGTCAC CCCGGAAGGG GTGCCCGTCG GTGAGAGGTA TTGCAGATCC 540 I TCGGGTGTCC TAACAACTAG CGCGAGCAAC TGCCTGACCT GCTACATCAA GGTGAAAGCT 600 I GCCTGTGAGA GAGTGGGGCT GAAAAATGTC TCTCTTCTCA TAGCCGGCGA TGACTGCTTG 660 ATCATATGTG AGCGGCCAGT GTGCGACCCA AGCGACGCTT TGGGCAGAGC CCTAGCGAGC 720 112249 206 TATGGGTACG CGTGCGAGCC CTCATATCAT GCATCATTGG ACACGGCCCC CTTCTGCTCC 780 A 781 (2) SEKVENSSIN ID NO:35 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Koetin 470-201-1-142R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:35: TCGGTTACTG AGAGCAGCTC AGATGAG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:36 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

: . (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Koetin 470-20-1-152F

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:36: . TCGGTTACTG AGAGCAGCTC AGATGAG 27 **··“ (2) SEKVENSSIN ID NO:37 TIEDOT: (i) sekvenssin ominaispiirteet: I* j* j (A) PITUUS: 570 emäsparia • (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

*, (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni 470EXP1 ··· ; (ix) OMINAISPIIRRE:

·;··| (A) NIMI / SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..570 112249 207 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:37: GCT GTA TGG TTC TGG ATT TCC ATC TCA CAC AGG CTA GCA ACA TCA GCC 48

Ala Vai Trp Phe Trp Ile Ser Ile Ser His Arg Leu Ala Thr Ser Ala 15 10 15 ACC GTC AAC CCC AAT GAG AAA AAG CGC GTG ACG CTC TTT TCA ACG CAG 96

Thr Vai Asn Pro Asn Glu Lys Lys Arg Vai Thr Leu Phe Ser Thr Gin 20 25 30 CAC GAC ATC TTG ACG GTA AGC TTC CTG GTC GCG TCG CTC TGT GGA AAT 144

His Asp Ile Leu Thr Vai Ser Phe Leu Vai Ala Ser Leu Cys Gly Asn 35 40 45 AAG GCT TTT AAT ACG GAA AGA GCC ACG TTG AAG ACA CTT TCC TCC CCT 192

Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro 50 55 60 TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC GGG 240

Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly 65 70 75 80 GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC GAC GGG GTC TTC TCA TCT GAG CTG 288

Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu 85 90 95 CTC TCA GTA ACC GAG ATA AGT GCT GGC GAT GGA GTA CGG GGG ATG TCT 336

Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met Ser 100 105 110 TCT CCC CAT ACA GGC ATC TCT CGG CTA CTA CCA CAA AGA GAG GGT GTA 384

Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Vai 115 120 125 CTG CAG TCC TCC ATG ATG ACA TCA ATG TGC GGT TCA AGA ATC CTC GCA 432

Leu Gin Ser Ser Met Met Thr Ser Met Cys Gly Ser Arg Ile Leu Ala 130 135 140 GCA TTC TCG ATC GCT TGG AGA GCA GCA GCC GCC GGC GGC AGA TCG GCC 480

Ala Phe Ser Ile Ala Trp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ser Ala 145 150 155 160 TCA GTC AGT TCT GAG TCT TCA GTC TCC GTC CCA ATG TCA ATG GAC ACC 528 ; : Ser Vai Ser Ser Glu Ser Ser Vai Ser Vai Pro Met Ser Met Asp Thr ·. 165 170 175 ,·, TCG GAT GAA ACC TCA GAG GGT GCC ACA TTC CTG AGC CTC AGT 570

Ser Asp Glu Thr Ser Glu Gly Ala Thr Phe Leu Ser Leu Ser 180 185 190 :.i,: (2) SEKVENSSIN ID NO: 38 TIEDOT: *.· ‘ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 190 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo ;·, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini * , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:38: t · , . Ala Vai Trp Phe Trp Ile Ser Ile Ser His Arg Leu Ala Thr Ser Ala I ‘ : 1 5 10 15

Thr Vai Asn Pro Asn Glu Lys Lys Arg Vai Thr Leu Phe Ser Thr Gin · 20 25 30 ' ‘ His Asp Ile Leu Thr Vai Ser Phe Leu Vai Ala Ser Leu Cys Gly Asn 35 40 45 ,M 112249 208

Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro 50 55 60

Ser Ala Val Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly 65 70 75 80

Val Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Gly Val Phe Ser Ser Glu Leu 85 90 95

Leu Ser Val Thr Glu lie Ser Ala Gly Asp Gly Val Arg Gly Met Ser 100 105 110

Ser Pro His Thr Gly lie Ser Arg Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Val 115 120 125

Leu Gin Ser Ser Met Met Thr Ser Met Cys Gly Ser Arg lie Leu Ala 130 135 140

Ala Phe Ser lie Ala Trp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ser Ala 145 150 155 160

Ser Val Ser Ser Glu Ser Ser Val Ser Val Pro Met Ser Met Asp Thr 165 170 175

Ser Asp Glu Thr Ser Glu Gly Ala Thr Phe Leu Ser Leu Ser 180 185 190 (2) SEKVENSSIN ID NO:39 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1288 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: • · (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 5E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:39: ACGGGTAGGG GCAGGTCTGG ACGCTACTAC TACGCGGGGG TGGGCAAAGC CCCTGCGGGT 60 ”·· GTGGTGCGCT CAGGTCCTGT CTGGTCGGCG GTGGAAGCTG GAGTGACCTG GTACGGAATG 120 gaacctgact tgacagctaa cctactgaga ctttacgacg actgccctta caccgcagcc iso i !': • gtcgcggctg atatcggaga agccgcggtg ttcttctctg ggctcgcccc attgaggatg 240 CACCCTGATG TCAGCTGGGC AAAAGTTCGC GGCGTCAACT GGCCCCTCTT GGTGGGTGTT 300 'CAGCGGACCA TGTGTCGGGA AACACTGTCT CCCGGCCCAT CGGATGACCC CCAATGGGCA 360 GGTCTGAAGG GCCCAAATCC TGTCCCACTC CTGCTGAGGT GGGGCAATGA TTTACCATCT 420 ' ' AAAGTGGCCG GCCACCACAT AGTGGACGAC CTGGTCCGGA GACTCGGTGT GGCGGAGGGT 480 ‘..,* TACGTCCGCT GCGACGCTGG GCCGATCTTG ATGATCGGTC TAGCTATCGC GGGGGGAATG 540 • ATCTACGCGT CATACACCGG GTCGCTAGTG GTGGTGACAG ACTGGGATGT GAAGGGGGGT 600 ‘;"i GGCGCCCCCC TTTATCGGCA TGGAGACCAG GCCACGCCTC AGCCGGTGGT GCAGGTTCCT 660 CCGGTAGACC ATCGGCCGGG GGGTGAATCA GCACCATCGG ATGCCAAGAC AGTGACAGAT 720 112249 209 GCGGTGGCAG CCATCCAGGT GGACTGCGAT TGGACTATCA TGACTCTGTC GATCGGAGAA 780 GTGTTGTCCT TGGCTCAGGC TAAGACGGCC GAGGCCTACA CAGCAACCGC CAAGTGGCTC 840 GCTGGCTGCT ATACGGGGAC GCGGGCCGTT CCCACTGTAT CCATTGTTGA CAAGCTCTTC 900 GCCGGAGGGT GGGCGGCTGT GGTGGGCCAT TGCCACAGCG TGATTGCTGC GGCGGTGGCG 960 GCCTACGGGG CTTCAAGGAG CCCGCCGTTG GCAGCCGCGG CTTCCTACCT GATGGGGTTG 1020 GGCGTTGGAG GCAACGCTCA GACGCGCCTG GCGTCTGCCC TCCTATTGGG GGCTGCTGGA 1080 ACCGCCTTGG GCACTCCTGT CGTGGGCTTG ACCATGGCAG GTGCGTTCAT GGGGGGGGCC 1140 AGTGTCTCCC CCTCCTTGGT CACCATTTTA TTGGGGGCCG TCGGAGGTTG GGAGGGTGTT 1200 GTCAACGCGG CGAGCCTAGT CTTTGACTTC ATGGCGGGGA AACTTTCATC AGAAGATCTG 1260 TGGTATGCCA TCCCGGTACT GACCAGCC 1288 (2) SEKVENSSIN ID NO:40 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 862 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 6E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:40: ACGGCAACAT GGGGCACAAG GTCTTAATCT TGAACCCCTC AGTGGCCACT GTGCGGGCCA 60 . \ TGGGCCCGTA CATGGAGCGG CTGGCGGGTA AACATCCAAG TATATACTGT GGGCATGATA 120 . ". CAACTGCTTT CACAAGGATC ACTGACTCCC CCCTGACGTA TTCAACCTAT GGGAGGTTTT 180 , TGGCCAACCC TAGGCAGATG CTACGGGGCG TTTCGGTGGT CATTTGTGAT GAGTGCCACA 240 .GTCATGACTC AACCGTGCTG TTAGGCATTG GGAGAGTTCG GGAGCTGGCG CGTGGGTGCG 300 * » * i . GAGTGCAACT AGTGCTCTAC GCCACCGCTA CACCTCCCGG ATCCCCTATG ACGCAGCACC 360 i · · CTTCCATAAT TGAGACAAAA TTGGACGTGG GCGAGATTCC CTTTTATGGG CATGGAATAC 420 CCCTCGAGCG GATGCGAACC GGAAGGCACC TCGTGTTCTG CCATTCTAAG GCTGAGTGCG 480 AGCGCCTTGC TGGCCAGTTC TCCGCTAGGG GGGTCAATGC CATTGCCTAT TATAGGGGTA 540 AAGACAGTTC TATCATCAAG GATGGGGACC TGGTGGTCTG TGCTACAGAC GCGCTTTCCA 600 ’ . CTGGGTACAC TGGAAATTTC GACTCCGTCA CCGACTGTGG ATTAGTGGTG GAGGAGGTCG 660 ... TTGAGGTGAC CCTTGATCCC ACCATTACCA TCTCCCTGCG GACAGTGCCT GCGTCGGCTG 720 i : AACTGTCGAT GCAAAGACGA GGACGCACGG GTAGGGGCAG GTCTGGACGC TACTACTACG 780 • » ' ·: CGGGGGTGGG CAAAGCCCCT GCGGGTGTGG TGCGCTCAGG TCCTGTCTGG TCGGCGGTGG 840 AAGCTGGAGT GACCTCGTAC GG 862 112249 210 (2) SEKVENSSIN ID NO;41 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 865 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Yksittäinen klooni GE3L-11 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:41: AGTACGGCAA CATGGGGCAC AAGGTCTTAA TCTTGAACCC CTCAGTGGCC ACTGTGCGGG 60 CCATGGGCCC GTACATGGAG CGGCTGGCGG GTAAACATCC AAGTATATAC TGTGGGCATG 120 ATACAACTGC TTTCACAAGG ATCACTGACT CCCCCCTGAC GTATTCAACC TATGGGAGGT 180 TTTTGGCCAA CCCTAGGCAG ATGCTACGGG GCGTTTCGGT GGTCATTTGT GATGAGTGCC 240 ACAGTCATGA CTCAACCGTG CTGTTAGGCA TTGGGAGAGT CCGGGAGCTG GCGCGTGGGT 300 GCGGGGTGCA ACTAGTGCTC TACGCCACCG CTACACCTCC CGGATCCCCT ATGACGCAGC 360 ACCCTTCCAT AATTGAGACA AAATTGGACG TGGGCGAGAT TCCCTTTTAT GGACATGGAA 420 TACCCCTCGA GCGGATGCGA ACCGGAAGGC ACCTCGTGTT CTGCCATTCT AAGGCTGAGT 480 GCGAGCGCCT TGCTGGCCAG TTCTCCGCTA GGGGGGTCAA TGCCATTGCC TATTATAGGG 540 GTAAAGACAG TTCTATCATC AAGGATGGGG ACCTGGTGGT CTGTGCTACA GACGCGCTTT 600 CCACTGGGTA CACTGGAAAT TTCGACTCCG TCACCGÄCTG TGGATTAGTG GTGGAGGAGG 660 TCGTTGAGGT GACCCTTGAT CCCACCATTA CCATCTCCCT GCGGACAGTG CCTGCGTCGG 720 * * ‘ · CTGAACTGTC GATGCAAAGA CGAGGACGCA CGGGTAGGGG CAGGTCTGGA CGCTACTACT 780 ACGCGGGGGT GGGCAAAGCC CCTGCGGGTG TGGTGCGCTC AGGTCCTGTC TGGTCGGCGG 840 ·'·* TGGAAGCTGG AGTGACCTCG TACGG 865 , (2) SEKVENSSIN ID NO:42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • (A) PITUUS: 596 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

_ (iii) HYPOTEETTINEN: ei > * ... (iv) ANTI-SENSE: ei i : ’ (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 7E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:42: AGCATGGGAA CATGCTTGAA CGGCCTGCTG TTCACGACCT TCCATGGGGC TTCATCCCGA 60 211 112249 ACCATCGCCA CACCCGTGGG GGCCCTTAAT CCCAGATGGT GGTCAGCCAG TGATGATGTC 120 ACGGTGTATC CACTCCCGGA TGGGGCTACT TCGTTAACAC CTTGTACTTG CCAGGCTGAG 180 TCCTGTTGGG TCATCAGATC CGACGGGGCC CTATGCCATG GCTTGAGCAA GGGGGACAAG 240 GTGGAGCTGG ATGTGGCCAT GGAGGTCTCT GACTTCCGTG GCTCGTCTGG CTCACCGGTC 300 CTATGTGACG AAGGGCACGC AGTAGGAATG CTCGTGTCTG TGCTTCACTC CGGTGGTAGG 360 GTCACCGCGG CACGGTTCAC TAGGCCGTGG ACCCAAGTGC CAACAGATGC CAAAACCACT 420 ACTGAACCCC CTCCGGTGCC GGCCAAAGGA GTTTTCAAAG AGGCCCCGTT GTTTATGCCT 480 ACGGGAGCGG GAAAGAGCAC TCGCGTCCCG TTGGAGTACG ATAACATGGG GCACAAGGTC 540 TTAATCTTGA ACCCCTCAGT GGCCACTGTG CGGGCCATGG GCCCGTACAT GGAGCG 596 (2) SEKVENSSIN ID NO:43 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 586 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 5E5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:43: GAGCTATGGG TACGCGTGCG AGCCCTCATA TCATGCATCA TTGGACACGG CCCCCTTCTG 60 CTCCACTTGG CTTGCTGAGT GCAATGCAGA TGGGAAGCGC CATTTCTTCC TGACCACGGA 120 CTTCCGGAGG CCGCTCGCTC GCATGTCGAG TGAGTATAGT GACCCGATGG CTTCGGCGAT 180 . CGGTTACATC CTCCTTTATC CTTGGCACCC CATCACACGG TGGGTCATCA TCCCTCATGT 240 *. GCTAACGTGC GCATTCAGGG GTGGAGGCAC ACCGTCTGAT CCGGTTTGGT GCCAGGTGCA 300 TGGTAACTAC TACAAGTTTC CACTGGACAA ACTGCCTAAC ATCATCGTGG CCCTCCACGG 360 ACCAGCAGCG TTGAGGGTTA CCGCAGACAC AACTAAAACA AAGATGGAGG CTGGTAAGGT 420 TCTGAGCGAC CTCAAGCTCC CTGGCTTAGC AGTCCACCGA AAGAAGGCCG GGGCGTTGCG 480 AACACGCATG CTCCGCTCGC GCGGTTGGGC TGAGTTGGCT AGGGGCTTGT TGTGGCATCC 540 AGGCCTACGG CTTCCTCCCC CTGAGATTGC TGGTATCCCG GGGGGT 586 '·' (2) SEKVENSSIN ID NO:44 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ... (A) PITUUS: 242 emäsparia !jit: (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’·’ (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

..j (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 212 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 6E5 (44F) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:44: CGAACGCGCA TGCTCCGCTC GCGCGGTTGG GCTGAGTTGG CTAGGGGCTT GTTGTGGCAT 60 CCAGGCCTAC GGCTTCCTCC CCCTGAGATT GCTGGTATCC CGGGGGGTTT CCCTCTCTCC 120 CCCCCCTATA TGGGGGTGGT ACACCAATTG GATTTCACAA GCCAGAGGAG TCGCTGGCGG 180 TGGTTGGGGT TCTTAGCCCT GCTCATCGTA GCCCTCTTCG GGTGAACTAA ATTCATCTGT 240 TG 242 (2) SEKVENSSIN ID NO:45 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Gtll rev-JL (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:45: TGGTAATGGT AGCGACCGGC GCTCAGC 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:46 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • (A) PITUUS: 45 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ' (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE-3F

l (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:46: *· ‘ GCCGCCATGG TCTCATGGGA CGCGGACGCT CGTGCGCCCG CGATG 45 (2) SEKVENSSIN ID NO:47 TIEDOT: ( : '·' (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: '· (A) PITUUS: 34 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,,j (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 213 1 12249

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE-3R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:47: GCGCGGATCC GATAAGTGCT GGCGATGGAG TACG 34 (2) SEKVENSSIN ID NO:48 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE-9F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:48: GGCACCATGG TCACCCCGGA AG 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:49 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

", (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

. (iii) HYPOTEETTINEN: ei !. (iv) ANTI-SENSE: ei . (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE-9R

>' * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:49: GCTCGGATCC GGAGCAGAAG GGGGCCGT 28 ♦ · (2) SEKVENSSIN ID NO:50 TIEDOT: , (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 364 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,,· (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 214 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: GE3-2 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 2..364 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:50: G GTC TCA TGG GAC GCG GAC GCT CGT GCG CCC GCG ATG GTC TAT GGC 46

Val Ser Trp Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Val Tyr Gly 15 10 15 CCT GGG CAA AGT GTT ACC ATT GAC GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT 94

Pro Gly Gin Ser Val Thr lie Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His 20 25 30 CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG GCA CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG 142

Gin Leu Arg Leu Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val Ser Ser Glu Val 35 40 45 TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG ACT GAA GAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC 190

Ser lie Asp lie Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala 50 55 60 GAT CTG CCG CCG GCG GCT GCT GCT CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG 238

Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala lie Glu Asn Ala Ala 65 70 75 AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATT GAT GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA 286

Arg lie Leu Glu Pro His lie Asp Val lie Met Glu Asp Cys Ser Thr 80 85 90 95 CCC TCT CTT TGT GGT AGT AGC CGA GAG ATG CCT GTA TGG GGA GAA GAC 334

Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Val Trp Gly Glu Asp 100 105 110 ATC CCC CGT ACT CCA TCG CCA GCA CTT ATC 364 lie Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu lie 115 120 (2) SEKVENSSIN ID NO:51 TIEDOT: * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ' (A) PITUUS: 121 aminohappoa ;. (B) TYYPPI: aminohappo ! (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:51:

Vai Ser Trp Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro ,1 5 10 15 » ·

Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin * 20 25 30

Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser 35 40 45

Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp 50 55 60 t « i

Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg 65 70 75 80 215 1 12249

Ile Leu Glu Pro His Ile Asp Val lie Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro 85 90 95

Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Val Trp Gly Glu Asp lie 100 105 110

Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu lie 115 120 (2) SEKVENSSIN ID NO:52 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 290 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni GE9-2 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 3..290 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:52: CC ATG GTC ACC CCG GAA GGG GTG CCC GTT GGT GAG AGG TAT TGC AGA 47

Met Vai Thr Pro Glu Gly Vai Pro Vai Gly Glu Arg Tyr Cys Arg 15 10 15 TCC TCG GGT GTC CTA ACA ACT AGC GCG AGC AAC TGC TTG ACC TGC TAC 95

Ser Ser Gly Vai Leu Thr Thr Ser Ala Ser Asn Cys Leu Thr Cys Tyr 20 25 30 ATC AAG GTG AAA GCC GCC TGT GAG AGG GTG GGG CTG AAA AAT GTC TCT 143

Ile Lys Vai Lys Ala Ala Cys Glu Arg Vai Gly Leu Lys Asn Vai Ser 35 40 45 > · · CTT CTC ATA GCC GGC GAT GAC TGC TTG ATC ATA TGT GAG CGG CCA GTG 191 ’*· Leu Leu Ile Ala Gly Asp Asp Cys Leu Ile Ile Cys Glu Arg Pro Vai ; 50 55 60 ··· TGC GAC CCA AGC GAC GCT TTG GGC AGA GCC CTA GCG AGC TAT GGG TAC 239 ’’·· Cys Asp Pro Ser Asp Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ala Ser Tyr Gly Tyr ; 65 70 75 * « · GCG TGC GAG CCC TCA TAT TAT GCA TGC TCG GAC ACG GCC CCC TTC TGC 287 ‘ Ala Cys Glu Pro Ser Tyr Tyr Ala Cys Ser Asp Thr Ala Pro Phe Cys 80 85 90 95 TCC 290 ... Ser * * · (2) SEKVENSSIN ID NO: 53 TIEDOT: • · ,···, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: '...* (A) PITUUS: 96 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo • (D) TOPOLOGIA: lineaarinen *:·*; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:53: 112249 216

Met Vai Thr Pro Glu Gly Vai Pro Vai Gly Glu Arg Tyr Cys Arg Ser 15 10 15

Ser Gly Vai Leu Thr Thr Ser Ala Ser Asn Cys Leu Thr Cys Tyr Ile 20 25 30

Lys Vai Lys Ala Ala Cys Glu Arg Vai Gly Leu Lys Asn Vai Ser Leu 35 40 45

Leu Ile Ala Gly Asp Asp Cys Leu Ile Ile Cys Glu Arg Pro Vai Cys 50 55 60

Asp Pro Ser Asp Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ala Ser Tyr Gly Tyr Ala 65 70 75 80

Cys Glu Pro Ser Tyr Tyr Ala Cys Ser Asp Thr Ala Pro Phe Cys Ser 85 90 95 (2) SEKVENSSIN ID NO:54 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: JML-A SISPA-aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:54: AGGAATTCAG CGGCCGCGAG 20 ;.· ; (2) SEKVENSSIN ID NO:55 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . (A) PITUUS: 22 emäsparia ’·_·,· (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’ (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

:,j.: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

V : (lii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ; ’** (vi) ALKUPERÄ: ;·, (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: JML-B SISPA-aluke t · · • (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:55: CTCGCGGCCG CTGAATTCCT TT 22 • · · ! : . ‘.f (2) SEKVENSSIN ID NO:56 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ’·"* (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 112249 217 (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-fl aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:56: GCGAATTCGC CATGGCGGGG AGACTTTCAT CA 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:57 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-Rl aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:57: GCGAATTCGG ATCCAGGGCC ATAGACCATC GCGGG 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:58 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ,·. (A) PITUUS: 26 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo _···, (C) JUOSTEISUUS: molemmat ·,,,· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

'.V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei * (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-f2 aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:58: GCGAATTCCG TGCGCCCGCC ATGGTC 26 » » ;*·: (2) SEKVENSSIN ID NO:59 TIEDOT: l”‘: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: '!* (A) PITUUS: 32 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo : (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

218 1Ί 2 2 4 9 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-R3 aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:59: GCGAATTCGG ATCCCAAGGT TTCTTGCCTA GC 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:60 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-f4 aluke (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N0:60: GCGAATTCAA GTGTGAGGCT AGGCAA 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:61 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei /·. (iv) ANTI-SENSE: ei .·. (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 470ep-R4 aluke M.* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:61: ’ .* * GCGAATTCGG ATCCCCACAC AGATGGCGCA AGGGG 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:62 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * (A) PITUUS: 27 emäsparia • (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·;··· (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i”:

T (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

ί.! i (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei 112249 219 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: KL-1 SISPA-aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:62: GCAGGATCCG AATTCGCATC TAGAGAT 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:63 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: KL-2 SISPA-aluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:63: ATCTCTAGAT GCGAATTCGG ATCCTGCGA 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:64 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 186 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-10 '.V (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..186 ’.i.: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:64: V * CGT GCG CCC GCC ATG GTC TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT GCC ATT GAC 48

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Ala Ile Asp 15 10 15 ’ *·* GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG GCA 96 ·;·. Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala V * 20 25 30 ·;·· CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG GCT 144

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Ala Γ": 35 40 45 i > i ; GAA AAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC GAT CTG CCG CCG GCG GCT 186

Glu Asn Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala 50 55 60 (2) SEKVENSSIN ID NO:65 TIEDOT: 112249 220 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 62 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:65:

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Ala Ile Asp 15 10 15

Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Ala 35 40 45

Glu Asn Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala 50 55 60 (2) SEKVENSSIN ID NO:66 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 282 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-12 (ix) OMINAISPIIRRE:

. (A) NIMI/SELITYS : CDS

* * (B) ASEMA: 1. .282 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:66: ,V CGT GCG CCC GCC ATG GTC TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT ACC ATT GAC 48

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp is ίο is M,· GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG GCA 96 ... Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala 1: 20 25 30 CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG ACT 144

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr : '· 35 40 45 V * GAA GAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC GAT CTG CCG CCG GCG GCT GCT GCT 192 • Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala ·:*·· 50 55 60 Γ": CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATT GAT 240 *** Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp . 65 70 75 80 GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT AGT 282 • ‘ Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser 85 90 (2) SEKVENSSIN ID NO:67 TIEDOT: 112249 221 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 94 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:67:

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp 15 10 15

Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr 35 40 45

Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala 50 55 60

Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp 65 70 75 80

Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser 85 90 (2) SEKVENSSIN ID NO:68 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 279 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ! (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: , ,·. (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-26 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI / SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..279 * · ·

I M

/;·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:68: CGT GCG CCC GCC ATG GTC TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT TCC ATT GAC 48

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Ser Ile Asp 1 5 10 15 GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG GCA 96 V * Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala 20 25 30 CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG ACT 144 ! : Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr ;· 35 40 45 ; GAA GAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC GAC CTG CCG CCG GCG GCT GCT GCT 192

Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala * · 50 55 60 112249 222 CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATC GAT 240

Leu Gin Ala lie Glu Asn Ala Ala Arg lie Leu Glu Pro His lie Asp 65 70 75 80 GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT 279

Val lie Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly 85 90 (2) SEKVENSSIN ID NO:69 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 93 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:69:

Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Ser Ile Asp 15 10 15

Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr 35 40 45

Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala 50 55 60

Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp 65 70 75 80

Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly 85 90 (2) SEKVENSSIN ID NO:70 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . . (A) PITUUS: 108 emasparia '· | (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat ί (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

*. : : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

1’ (iii) HYPOTEETTINEN: ei t : : (iv) ANTI-SENSE: ei * * I ' ' * « » ί (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-5 (ix) OMINAISPIIRRE:

• '·· (A) NIMI/SELITYS: CDS

... (B) ASEMA: 1..108 t · » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:70: GCC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG CAG GTT GGG TGC 48

Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys »;·' 15 10 15 :: I TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG GCT AGG 96 . Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg 20 25 30 112249 223 CAA GAA ACC TTG 108

Gin Glu Thr Leu 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:71 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:71:

Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys 15 10 15

Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg 20 25 30

Gin Glu Thr Leu 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:72 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 132 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-3 * · I.'.' (ix) OMINAISPIIRRE:

·* (A) NIMI/SELITYS : CDS

(B) ASEMA: 1..132 ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 72: GAG ATG GAA ATC CAG AAC CAT ACA GCC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT 48 ,·,· Glu Met Glu Ile Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr 15 10 15 CCG CTT GAA TTG CAG GTT GGG TGC TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT 96

Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe ;·, 20 25 30 GAA TGT GAC AAG TGT G AG GCT AGG CAA GAA ACC TTG 132 '.* * Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu 35 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:73 TIEDOT: . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 44 aminohappoa . (B) TYYPPI: aminohappo ’*”· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:73: 112249 224

Glu Met Glu Ile Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr 15 10 15

Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe 20 25 30

Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu 35 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:74 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 258 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-27 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..258 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:74: AAA GCC TTA TTT CCA CAG AGC GAC GCG ACC AGG AAG CTT ACC GTC AAG 48

Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Vai Lys 15 10 15 ATG TCA TGC TGC GTT GAA AAG AGC GTC ACG CGC TTT TTC TCA TTG GGG 96

Met Ser Cys Cys Vai Glu Lys Ser Vai Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly 20 25 30 : TTG ACG GTG GCT GAT GTT GCT AGC CTG TGT GAG ATG GAA ATC CAG AAC 144 .Leu Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu Ile Gin Asn ; : 35 40 45 • * » ί : CAT ATA GCC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG CAG GTT 192

His Ile Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai 'ί* 50 55 60 * t * * GGG TGC TTG GTG GGC AAT GAA CTC ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG 240 !!! Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu ί 65 70 75 80 GCT AGG CAA GAA ACC TTG 258

Ala Arg Gin Glu Thr Leu ; ·.. 85 t I · (2) SEKVENSSIN ID NO:75 TIEDOT: ♦ t * · * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 86 aminohappoa ··· (B) TYYPPI: aminohappo , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ! (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini i * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:75: 11224¾ 225 I e- r -·

Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Val Lys 15 10 15

Met Ser Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly 20 25 30

Leu Thr Val Ala Asp Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu lie Gin Asn 35 40 45

His lie Ala Tyr Cys Asp Lys Val Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Val 50 55 60

Gly Cys Leu Val Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu 65 70 75 80

Ala Arg Gin Glu Thr Leu 85 (2) SEKVENSSIN ID NO:76 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 108 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-25 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..108 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:76: ACC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG CAG GTT GGG TGC 48 ‘ * Thr Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys 15 10 15

* * I

:*: TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG GCT AGG 96 ' * Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg ·;* 20 25 30 ' i · * CAA GAA ACC TTG 108 !)’, Gin Glu Thr Leu ' : : 35 * ,, (2) SEKVENSSIN ID NO:77 TIEDOT: t · ',// (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; ! (A) PITUUS: 36 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ···, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini * i * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:77: | Thr Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys '1 5 10 15

Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg 22β 112249 20 25 30

Gin Glu Thr Leu 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:78 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 108 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-20 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 52..108 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:78: GCCGACACTA CTAAGGTGTA TGTTACCAAT CCAGACAATG TGGGACGAAG G GTG GGC 57

Vai Gly 1 AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG GCT AGG CAA GAA ACC 105

Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr 5 10 15 TTG 108

Leu (2) SEKVENSSIN ID NO:79 TIEDOT: *' * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa *'· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen k · ·· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • I » : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:79: . · * , ’· : Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin ‘ 15 10 15

Glu Thr Leu i % % (2) SEKVENSSIN ID NO: 80 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * 1 (A) PITUUS: 168 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat ‘ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

» » I

; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

M> I

(iii) HYPOTEETTINEN: ei 227 112249 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-16 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..168 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:80: TTG GGG TTG ACG GTG GCT GAT GTT GCT AGC CTG TGT GAG ATG GAA ATC 48

Leu Gly Leu Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu Ile 15 10 15 CAG AAC CAT ACA GCC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG 96

Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu 20 25 30 CAG GTT GGG TGC TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG 144

Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys 35 40 45 TGT GAG GCT AGG CAA GAA ACC TTG 168

Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu 50 55 (2) SEKVENSSIN ID NO:81 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 56 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:81:

Leu Gly Leu Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu Ile 15 10 15

Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu Glu Leu 20 25 30 • 1 • · . Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys ,,,· 35 40 45 ·,· · Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu 50 55 (2) SEKVENSSIN ID NO:82 TIEDOT: > · · ‘ « · !!! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :,· · (A) PITUUS: 313 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

• (iii) HYPOTEETTINEN: ei * · · 1 1 [ ’ (iv) ANTI-SENSE: ei * · ’···1 (vi) ALKUPERÄ: . 1. (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-50 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:82: 112249 228 (B) ASEMA: 1..313 ATC ACC GTC AAC CCC AAT GAG AAA AAG CGC GTG ACG CTC TTT TCA ACG 48

Ile Thr Vai Asn Pro Asn Glu Lys Lys Arg Vai Thr Leu Phe Ser Thr 15 10 15 CAG CAC GAC ATC TTG ACG GTA AGC TTC CTG GTC GCG TCG CTC TGT GGA 96

Gin His Asp Ile Leu Thr Vai Ser Phe Leu Vai Ala Ser Leu Cys Gly 20 25 30 AAT AAG GCT TTT AAT ACG G AA AGA GCC ACG TTG AAG ACA CTT TCC TCC 144

Asn Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser 35 40 45 CCT TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC 192

Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 50 55 60 GGG GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC GAC GGG GTC TTC TCA TCT GAG 240

Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu 65 70 75 80 CTG CTC TCA GTA ACC GAG ATA AGT GCT GGC GAT GGA GTA CGG GGG ATG 288

Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met 85 90 95 TCT TCT CCC CAT ACA GGC ATC TCT C 313

Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser 100 (2) SEKVENSSIN ID NO:83 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 104 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ' .·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:83: * ♦ * · * ·

Ile Thr Vai Asn Pro Asn Glu Lys Lys Arg Vai Thr Leu Phe Ser Thr 15 10 15

Gin His Asp Ile Leu Thr Vai Ser Phe Leu Vai Ala Ser Leu Cys Gly 20 25 30 [ Asn Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser ··’·* 35 40 45 ’·* Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 50 55 60 !*· Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu : " 65 70 75 80

I I I

’·* Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met 85 90 95 ... Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser I..,: 100 :·’· *· (2) SEKVENSSIN ID NO: 84 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 89 emäsparia 229 1 12 2 4 9 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-52 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 28..87 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:84: ACTGAGAGCA GCTCAGATGA GAAGACC CCT TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG 51

Pro Ser Ala Val Ser Asp Ser Trp 1 5 ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC GGG GTA TCC TCG CA 89

Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Val Ser Ser 10 15 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:85 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:85:

Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 15 10 15 · Gly Vai Ser Ser : 20 • · ^ (2) SEKVENSSIN ID NO:86 TIEDOT: *.!. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 214 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ' » · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA ;·. (iii) HYPOTEETTINEN: ei /:·. (iv) ANTI-SENSE: ei • (vi) ALKUPERÄ: ·;··· (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-53 Γ”: (ix) OMINAISPIIRRE:

*;* (A) NIMI/SELITYS: CDS

; (B) ASEMA: 1..100 , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:86: • · AAT AAG GCT TTT AAT ACG GAA AGA GCC ACG TTG AAG ACA CTT TCC TCC 48 112249 230

Asn Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser 15 10 15 CCT TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC 96

Pro Ser Ala Val Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 20 25 30 GGG G ATCTCTAGAT GCGAATTCAA GTGTGAGGCT AGGCAAGAAA CCTTGGCCTC 150

Gly CTTCTCTTAC ATTTGGTCTG GAGTGCCGCT GACTAGGGCC ACGCCGGCCA AGCCTCCCGT 210 GGTG 214 (2) SEKVENSSIN ID NO:87 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:87:

Asn Lys Ala Phe Asn Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser 15 10 15

Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 20 25 30

Gly (2) SEKVENSSIN ID NO:88 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 113 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ; (iv) ANTI-SENSE: ei < « ··· (vi) ALKUPERÄ: "·· (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-55 i (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

' (B) ASEMA: 52..113 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:88: CCATCGCCAG CACTTATCTC GGTTACTGAG AGCAGCTCAG ATCAGAAGAC C CCT TCG 57

Pro Ser 1 '·"· GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC GGG GTA 105 ··· Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai 5 10 15 ; Tcc TCG CA 113 “* · Ser Ser ·:·: 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:89 TIEDOT: 231 1 12249 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:89:

Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp 1 5 10 15

Gly Vai Ser Ser 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:90 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 330 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-56 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..330 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:90: . ACG TTG AAG ACA CTT TCC TCC CCT TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG 48 ; · Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met !!.’ 15 10 15 > a ACC TCG AAT GAG TCA GAG GAC GGG GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC 96 *,·,· Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr . 20 25 30 t · · GAC GGG GTC TTC TCA TCT GAG CTG CTC TCA GTA ACC GAG ATA AGT GCT 144

Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala 35 40 45 * · · • GGC GAT GGA GTA CGG GGG ATG TCT TCT CCC CAT ACA GGC ATC TCT CGG 192

Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg ;·# 50 55 60 CTA CTA CCA CAA AGA GAG GGT GTA CTG CAG TCC TCC ATG ATG ACA TCA 240 * Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Vai Leu Gin Ser Ser Met Met Thr Ser • 65 70 75 80 ’’ ATG TGC GGT TCA AGA ATC CTC GCA GCA TTC TCG ATC GCT TGG AGA GCA 288 I * * *; Met Cys Gly Ser Arg Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Ala Trp Arg Ala ·;· 85 90 95 I,· GCA GCC GCC GGC GGC AGA TCG GCC TCA GTC AGT TCT GAG TCT 330 . · Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ser Ala Ser Vai Ser Ser Glu Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:91 TIEDOT: 112249 232 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 110 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:91:

Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met 15 10 15

Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr 20 25 30

Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr Glu Ile Ser Ala 35 40 45

Gly Asp Gly Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr Gly Ile Ser Arg 50 55 60

Leu Leu Pro Gin Arg Glu Gly Vai Leu Gin Ser Ser Met Met Thr Ser 65 70 75 80

Met Cys Gly Ser Arg Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Ala Trp Arg Ala 85 90 95

Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ser Ala Ser Vai Ser Ser Glu Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:92 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 195 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

, . (iii) HYPOTEETTINEN: ei « · (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-57 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

!.i.: (B) ASEMA: 1..195 V : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:92: ACG GAA AGA GCC ACG TTG AAG ACA CTT TCC TCC CCT TCG GCT GCC TCG 48 .. Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ser • ’·· 1 5 10 15 ’.· : GAC TCT TGG ATG ACC TCG AAT GAG TCG GAG GAC GGG GTA TCC TCC TGC 96 • Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys •:..j 20 25 30 l"‘: GAA GAG GAC ACC GAC GGG GTC TTC TCA TCT GAG CTG CTC TCA GTA ACC 144 *·· Glu Glu Asp Thr Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr . \ 35 40 45 ! GAG ATA AGT GCT GGC GGT GGA GTA CGG GGG ATG TCT TCT CCC CAT ACG 192

Glu Ile Ser Ala Gly Gly Gly Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr 233 112249 50 55 60 GGC 195

Gly 65 (2) SEKVENSSIN ID NO:93 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 65 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:93:

Thr Glu Arg Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ser 15 10 15

Asp Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys 20 25 30

Glu Glu Asp Thr Asp Gly Vai Phe Ser Ser Glu Leu Leu Ser Vai Thr 35 40 45

Glu Ile Ser Ala Gly Gly Gly Vai Arg Gly Met Ser Ser Pro His Thr 50 55 60

Gly 65 (2) SEKVENSSIN ID NO:94 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 115 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei * > · I .* (vi) ALKUPERÄ: ’ ! (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-60 « · i * (ix) OMINAISPIIRRE:

: ί : (A) NIMI/SELITYS: CDS

;;; (bj asema: 1..115 1 * » * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:94: ,, AAG ACA CTT TCC TCC CCT TCG GCT GTC TCG GAC TCT TGG ATG ACC TCG 48 ! '·· Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser 15 10 15 AAT GAG TCA GAG GAC GGG GTA TCC TCC TGC GAG GAG GAC ACC GAC TGG 96

Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Trp 20 25 30 ! : GTC TTC TCA TCT GAG CTG C 115 , Vai Phe Ser Ser Glu Leu ; 35 234 1 12249 (2) SEKVENSSIN ID NO:95 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:95:

Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser 15 10 15

Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser Cys Glu Glu Asp Thr Asp Trp 20 25 30

Vai Phe Ser Ser Glu Leu 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:96 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 93 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni Y5-63 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 19..93 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:96: I I GAGAGCAGCT CAGATGAG AAG ACA CTT TCC TCC CCT TCG GCT GTC TCG GAC 51

Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp : 15 ίο • i · : TCT TGG ATG ACC TCG gAG tca gag GAC GGG GTA TCC TCG 93

Ser Trp Met Thr Ser Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser , ;· 15 20 25 f · * (2) SEKVENSSIN ID NO: 97 TIEDOT: » » (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . ’·· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen v : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ·...; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:97:

Lys Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Vai Ser Asp Ser Trp Met Thr Ser 15 10 15 ’ ! < Asn Glu Ser Glu Asp Gly Vai Ser Ser 20 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:98 TIEDOT: 235 112249 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1181 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 8E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:98: GCTGGCTGAG GCACGGTTGG TCCCGCTGAT CTTGCTGCTG CTATGGTGGT GGGTGAACCA 60 GCTGGCAGTC CTAGGGCTGC CGGCTGTGGA AGCCGCCGTG GCAGGTGAGG TCTTCGCGGG 120 CCCTGCCCTG TCCTGGTGTC TGGGACTCCC GGTCGTCAGT ATGATATTGG GTTTGGCAAA 180 CCTGGTGCTG TACTTTAGAT GGTTGGGACC CCAACGCCTG ATGTTCCTCG TGTTGTGGAA 240 GCTTGCTCGG GGAGCTTTCC CGCTGGCCCT CTTGATGGGG ATTTCGGCGA CCCGCGGGCG 300 CACCTCAGTG CTCGGGGCCG AGTTCTGCTT CGATGCTACA TTCGAGGTGG ACACTTCGGT 360 GTTGGGCTGG GTGGTGGCCA GTGTGGTAGC TTGGGCCATT GCGCTCCTGA GCTCGATGAG 420 CGCAGGGGGG TGGAGGCACA AAGCCGTGAT CTATAGGACG TGGTGTAAGG GGTACCAGGC 480 AATCCGTCAA AGGGTGGTGA GGAGCCCCCT CGGGGAGGGG CGGCCTGCCA AACCCCTGAC 540 CTTTGCCTGG TGCTTGGCCT CGTACATCTG GCCAGATGCT GTGATGATGG TGGTGGTTGC 600 CTTGGTCCTT CTCTTTGGCC TGTTCGACGC GTTGGATTGG GCCTTGGAGG AGATCTTGGT 660 GTCCCGGCCC TCGTTGCGGC GTTTGGCTCG GGTGGTTGAG TGCTGTGTGA TGGCGGGTGA 720 » .·. GAAGGCCACA ACCGTCCGGC TGGTCTCCAA GATGTGTGCG AGAGGAGCTT ATTTGTTCGA 780 t*<«, TCATATGGGC TCTTTTTCGC GTGCTGTCAA GGAGCGCCTG TTGGAATGGG ACGCAGCTCT 840 TGAACCTCTG TCATTCACTA GGACGGACTG TCGCATCATA CGGGATGCCG CGAGGACTTT 900 * · · GTCCTGCGGG CAGTGCGTCA TGGGTTTACC CGTGGTTGCG CGCCGTGGTG ATGAGGTTCT 960 CATCGGCGTC TTCCAGGATG TGAATCATTT GCCTCCCGGG TTTGTTCCGA CCGCGCCTGT 1020

I t I

TGTCATCCGA CGGTGCGGAA AGGGCTTCTT GGGGGTCACA AAGGCTGCCT TGACAGGTCG 1080 * · · GGATCCTGAC TTACATCCAG GGAACGTCAT GGTGTTGGGG ACGGCTACGT CGCGAAGCAT 1140 ;·, GGGAACATGC TTGAACGGCC TGCTGTTCAC GACCTTCCAT G 1181 V ' (2) SEKVENSSIN ID NO:99 TIEDOT: ':··· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia 1 : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·;· (C) JUOSTEISUUS: molemmat j (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ft* *

____; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

236 1 12 2 4 9 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Y5-10-F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:99: TCAGCCATGG CTCGTGCGCC CGCGATGGTC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:100 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Y5-10-R1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N0:100: CGAGGATCCA GCCGCCGGCG GCAGATC 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:101 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

! (iii) HYPOTEETTINEN: ei • « « · (iv) ANTI-SENSE: ei : (vi) alkuperä: ' ; (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Y5-16F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:101: I * * GATTCCATGG GTTTGGGGTT GACGGTGGCT GA 32 » * * t * * (2) SEKVENSSIN ID NO:102 TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *,,, (A) PITUUS: 32 emäsparia ’li (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei l (iv) ANTI-SENSE: ei J l » i ) 112249 237 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EP-R3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:102: GCGAATTCGG ATCCCAAGGT TTCTTGCCTA GC 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:103 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Y5-5-F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:103: GAGGCCATGG CCTATTGTGA CAAGGTG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:104 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ! (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke PGEX-R

* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:104: ? 1 * * ; GACCGTCTCC GGGAGCT 17 t l (2) SEKVENSSIN ID NO:105 TIEDOT: i ; : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 326 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat . · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

1 : ; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei * » (iv) ANTI-SENSE: ei (ix) OMINAISPIIRRE: , , (vi) ALKUPERÄ: ! : : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni GE15 112249 238

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 3..326 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:105: CC ATG GAG GTC TCT GAC TTC CGT GGC TCG TCT GGC TCA CCG GTC CTA 47

Met Glu Vai Ser Asp Phe Arg Gly Ser Ser Gly Ser Pro Vai Leu 15 10 15 TGT GAC GAA GGG CAC GCA GTA GGA ATG CTC GTG TCT GTG CTT CAC TCC 95

Cys Asp Glu Gly His Ala Vai Gly Met Leu Vai Ser Vai Leu His Ser 20 25 30 GGT GGT AGG GTC ACC GCG GCA CGG TTC ACT AGG CCG TGG ACC CAA GTG 143

Gly Gly Arg Vai Thr Ala Ala Arg Phe Thr Arg Pro Trp Thr Gin Vai 35 40 45 CCA ACA GAT GCC AAA ACC ACC ACT GAA CCC CCT CCG GTG CCG GCC AAA 191

Pro Thr Asp Ala Lys Thr Thr Thr Glu Pro Pro Pro Vai Pro Ala Lys 50 55 60 GGA GTT TTC AAA GAG GCC CCG TTG TTT ATG CCT ACG GGA GCG GGA AAG 239

Gly Vai Phe Lys Glu Ala Pro Leu Phe Met Pro Thr Gly Ala Gly Lys 65 70 75 AGC ACT CGC GTC CCG TTG GAG TAC GGC AAC ATG GGG CAC AAG GTC TTA 287

Ser Thr Arg Vai Pro Leu Glu Tyr Gly Asn Met Gly His Lys Vai Leu 80 85 90 95 ATC TTG AAC CCC TCA GTG GCC ACT GTG CGG GCG ATG GGC 326

Ile Leu Asn Pro Ser Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly 100 105 (2) SEKVENSSIN ID NO:106 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 108 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:106: t *

Met Glu Vai Ser Asp Phe Arg Gly Ser Ser Gly Ser Pro Vai Leu Cys : 1 5 10 15 : ! ! Asp Glu Gly His Ala Vai Gly Met Leu Vai Ser Vai Leu His Ser Gly 20 25 30 « f * »

Gly Arg Vai Thr Ala Ala Arg Phe Thr Arg Pro Trp Thr Gin Vai Pro '· ·,· 35 40 45 • * * ! · * Thr Asp Ala Lys Thr Thr Thr Glu Pro Pro Pro Vai Pro Ala Lys Gly 50 55 60

Vai Phe Lys Glu Ala Pro Leu Phe Met Pro Thr Gly Ala Gly Lys Ser ; ’·· 65 70 75 80 t # * *,* · Thr Arg Vai Pro Leu Glu Tyr Gly Asn Met Gly His Lys Vai Leu Ile 85 90 95 ( > * t i »

Leu Asn Pro Ser Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly 100 105 t t i » f ; (2) SEKVENSSIN ID NO:107 TIEDOT: SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 112249 239 (A) PITUUS: 138 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Klooni GE17 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..138 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:107: GGT GAT GAG GTT CTC ATC GGC GTC TTC CAG GAT GTG AAT CAT TTG CCT 48

Gly Asp Glu Vai Leu Ile Gly Vai Phe Gin Asp Vai Asn His Leu Pro 15 10 15 CCC GGG TTT GTT CCG ACC GCG CCT GTT GTC ATC CGA CGG TGC GGA AAG 96

Pro Gly Phe Vai Pro Thr Ala Pro Vai Vai Ile Arg Arg Cys Gly Lys 20 25 30 GGC TTC TTG GGG GTC ACA AAG GCT GCC TTG ACA GGT CGG GAT 138

Gly Phe Leu Gly Vai Thr Lys Ala Ala Leu Thr Gly Arg Asp 35 40 45 (2) SEKVENSSIN ID NO:108 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 46 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:108: ; ; : Gly Asp Glu Vai Leu Ile Gly Vai Phe Gin Asp Vai Asn His Leu Pro .···. 15 10 15 n · , .·. Pro Gly Phe Vai Pro Thr Ala Pro Vai Vai Ile Arg Arg Cys Gly Lys 20 25 30 ··.! Gly Phe Leu Gly Vai Thr Lys Ala Ala Leu Thr Gly Arg Asp . 35 40 45 » · · ’.· · (2) SEKVENSSIN ID NO: 109 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 395 emäsparia • '' (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat *·' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

I (iii) HYPOTEETTINEN: ei : .·. (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: * ' (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 9E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:109: 112249 240 TGTATTTGTC CTGTTATACC TGATGAAGCT GGCTGAGGCA CGGTTGGTCC CGCTGATCTT 60 GCTGCTGCTA TGGTGGTGGG TGAACCAGCT GGCAGTCCTA GGGCTGCCGG CTGTGGAAGC 120 CGCCGTGGCA GGTGAGGTCT TCGCGGGCCC TGCCCTGTCC TGGTGTCTGG GACTCCCGGT 180 CGTCAGTATG ATATTGGGTT TGGCAAACCT AGTGCTGTAC TTTAGATGGT TGGGACCCCA 240 ACGCCTGATG TTCCTCGTGT TGTGGAAGCT TGCTCGGGGA GCTTTCCCGC TGGCCCTCTT 300 GATGGGGATT TCGGCGACCC GCGGGCGCAC CTCAGTGCTC GGGGCCGAGT TCTGCTTCGA 360 TGCTACATTC GAGGTGGACA CTTCGGTGTT GGGCT 395 (2) SEKVENSSIN ID NO:110 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 460 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 10E3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:110: GCCCCTGGGC AACCAGGGCC GAGGCAACCC GGTGCGGTCG CCCTTGGGTT TTGGGTCCTA 60 CGCCATGACC AGGATCCGAG ATACCCTACA TCTGGTGGAG TGTCCCACAC CAGCCATTGA 120 GCCTCCCACC GGGACGTTTG GGTTCTTCCC CGGGACGCCG CCTCTCAACA ACTGCATGCT 180 CTTGGGCACG GAAGTGTCCG AGGCACTTGG GGGGGCTGGC CTCACGGGGG GGTTCTATGA 240 . : ACCCCTGGTG CGCAGGTGTT CGAAGCTGAT GGGAAGCCGA AATCCGGTTT GTCCGGGGTT 300 TGCATGGCTC TCTTCGGGCA GGCCTGATGG GTTTATACAT GTCCAGGGTC ACTTGCAGGA 360 GGTGGATGCA GGCAACTTCA TCCCGCCCCC GCGCTGGTTG CTCTTGGACT TTGTATTTGT 420 CCTGTTATAC CTGATGAAGC TGGCTGAGGC ACGGTTGGTC 460 * » · (2) SEKVENSSIN ID NO: 111 TIEDOT: » (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·’. (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

... (iii) HYPOTEETTINEN: ei i.,: (iv) ANTI-SENSE: ei : (vi) alkuperä:

....: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE15F

241 1 12249 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:111: GCCGCCATGG AGGTCTCTGA CTTCCGTG 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:112 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE15R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:112: GCGCGGATCC GCCCATCGCC CGCACAGTGG C 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:113 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE17F : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:113: CGCTCCATGG GTGATGAGGT TCTCATCGGC G 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:114 TIEDOT: . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *··’ (A) PITUUS: 28 emäsparia [*’**· (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei t<'", (iv) ANTI-SENSE: ei

t I

... (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE17R

: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:114: GTAAGTCAGG ATCCCGACCT GTCAAGGC 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:115 TIEDOT: 112249 242 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 452 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: pGEX-HISb-GE3-s HGV-plasmidin NcoI/EcoRI:n sisältävä fragmentti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:115: CAAAATCGGA TCTGGTTCCG CGTGGTTCCA TGGTCTCATG GGACGCGGAC GCTCGTGCGC 60 CCGCGATGGT CTATGGCCCT GGGCAAAGTG TTACCATTGA CGGGGAGCGC TACACCTTGC 120 CTCATCAACT GAGGCTCAGG AATGTGGCAC CCTCTGAGGT TTCATCCGAG GTGTCCATTG 180 ACATTGGGAC GGAGACTGAA GACTCAGAAC TGACTGAGGC CGATCTGCCG CCGGCGGCTG 240 CTGCTCTCCA AGCGATCGAG AATGCTGCGA GGATTCTTGA ACCGCACATT GATGTCATCA 300 TGGAGGACTG CAGTACACCC TCTCTTTGTG GTAGTAGCCG AGAGATGCCT GTATGGGGAG 360 AAGACATCCC CCGTACTCCA TCGCCAGCAC TTATCGGATC CCACCATCAC CATCACCATT 420 AGAATTCATC GTGACTGACT GACGATCTAC CT 452 (2) SEKVENSSIN ID NO:116 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 590 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ··· (iv) ANTI-SENSE: ei ; (vi) ALKUPERÄ: ;;; (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 11E3 f * * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:116: AGCAATCGGC TGGGGTGACC CCATCACTTA TTGGAGCCAC GGGCAAAATC AGTGGCCCCT 60 TTCATGCCCC CAGTATGTCT ATGGGTCTGC TACAGTCACT TGCGTGTGGG GTTCCGCTTC 120 TTGGTTTGCC TCCACCAGTG GTCGCGACTC GAAGATAGAT GTGTGGAGTT TAGTGCCAGT 180 TGGCTCTGCC ACCTGCACCA TAGCCGCACT TGGATCATCG GATCGCGACA CGGTGCCTGG 240 GCTCTCCGAG TGGGGAATCC CGTGCGTGAC GTGTGTTCTG GACCGTCGGC CTGCCTCCTG 300 ; CGGCACCTGT GTGAGGGACT GCTGGCCCGA GACCGGGTCG GTTAGGTTCC CATTCCATCG 360 :' ·: GTGCGGCGTG GGGCCTCGGC TGACAAAGGA CTTGGAAGCT GTGCCCTTCG TCAACAGGAC 420 112249 243 AACTCCCTTC ACCATTAGGG GGCCCCTGGG CAACCAGGGC CGAGGCAACC CGGTGCGGTC 480 GCCCTTGGGT TTTGGGTCCT ACGCCATGAC CAGGATCCGA GATACCCTAC ATCTGGTGGA 540 GTGTCCCACA CCAGCCATCG AGCCTCCCAC CGGGACGTTT GGGTTCTTCC 590 (2) SEKVENSSIN ID NO:117 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Koetin E3-111PROB (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:117: TGGTGAAGGG AGTTGTCCTA TTGACGAAG 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:118 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 735 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ‘ ‘ (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 12E3 ·;' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:118: ATTGTTGTGC CCCGGAGGAC ATCGGGTTCT GCCTGGAGGG TGGATGCCTG GTGGCCCTGG 60 ·· GGTGCACGAT TTGCACTGAC CAATGCTGGC CACTGTATCA GGCGGGTTTG GCTGTGCGGC 120 I » · i · · ctggcaagtc cgcggcccaa ctggtggggg agctgggtag cctatacggg cccctgtcgg iso t TCTCGGCCTA TGTGGCTGGG ATCCTGGGCC TGGGTGAGGT GTACTCGGGT GTCCTAACGG 240 TGGGAGTCGC GTTGACGCGC CGGGTCTACC CGGTGCCTAA CCTGACGTGT GCAGTCGCGT 300 GTGAGCTAAA GTGGGAAAGT GAGTTTTGGA GATGGACTGA ACAGCTGGCC TCCAACTACT 360 \ * GGATTCTGGA ATACCTCTGG AAGGTCCCAT TTGATTTCTG GAGAGGCGTG ATAAGCCTGA 420 CCCCCTTGTT GGTTTGCGTG GCCGCATTGC TGCTGCTTGA GCAACGGATT GTCATGGTCT 480 TCCTGTTGGT GACGATGGCC GGGATGTCGC AAGGCGCCCC TGCCTCCGTT TTGGGGTCAC 540 ; GCCCCTTTGA CTACGGGTTG ACTTGGCAGA CCTGCTCTTG CAGGGCCAAC GGTTCGCGTT 600 ·;·; TTTCGACTGG GGAGAAGGTG TGGGACCGTG GGAACGTTAC GCTTCAGTGT GACTGCCCTA 660 112249 244 ACGGCCCCTG GGTGTGGTTG CCAGCCTTTT GCCAAGCAAT CGGCTGGGGT GACCCCATCA 720 CTTATTGGAG CCACG 735 (2) SEKVENSSIN ID NO:119 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EXT4-2189R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:119: ATCTGTGGTA TGCCATCCCG GT 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:120 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EXT4-29F : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:120: ',,,· GTTATGCTAC TGTCGAAGCA GGT 23 t · (2) SEKVENSSIN ID NO:121 TIEDOT: f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei »ti** ' ' (vi) ALKUPERÄ: 1(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: NS5 Aluke GV57-4512 MF ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:121: ··· GGACTTCCGG ATAGCTGARA AGCT 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:122 TIEDOT: 112249 245 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: NS5 Aluke GV57-4657 MR (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:122: GCRTCCACAC AGATGGCGCA 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:123 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: NS5 koetin GV22dc-89 MF (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:123: CYCGCTGRTT TGGGGTGTAC TGGAAGGC 28 ;/ (2) SEKVENSSIN ID NO:124 TIEDOT: ·’; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; : (A) PITUUS: 31 emäsparia | (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·;· (C) JUOSTEISUUS: molemmat ”! (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

I!.* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

’ (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

: : : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 5'-UTR aluke FV94-22F

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:124: ,**. GAAAGCCCCA GAAACCGACG CCTATCTAAG T 31 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:125 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia 246 1 12 2 4 9 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 5'UTR aluke FV94-724R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:125: GCACAGCCAA ACCCGCCTGA TACAGT 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:126 TIEDOT: I (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: I (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 5'-UTR aluke FV94-94F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:126: GTGGTGGATG GGTGATGACA GGGTTGGT 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:127 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *; (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat ·'· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

* ·/ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

'·; (iii) HYPOTEETTINEN: ei ;;; (iv) ANTI-SENSE: ei ·’ (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 5'-UTR aluke FV94-912R

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:127: TAACTCACAC GCGACTGCAC ACGTCAGGT 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:128 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia ; I ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo “· ; (C) JUOSTEISUUS: molemmat ;**; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 247 1 12249

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN; ei (iv) ANTI-SENSE; ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: ENV kokoelma-aluke GEP-F15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:128: GCGGCCATGG TGCCCTTCGT CAATAGGACA 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:129 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: ENV kokoelma-aluke GEP-R15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:129: CTTGCCATGG CCAGCTGGTT CACCCACCA 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:130 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ’ I (iv) ANTI-SENSE: ei '‘I (vi) ALKUPERÄ: ; : : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-F17 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:130: GCAGGATCCC CTCTGGAAGG TCCCATTTGA 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:131 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,*··. (C) JUOSTEISUUS: molemmat ’···* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

‘:··· (iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 248 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-R16 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:131: TGCGAATCCT CGGCCCTGGT TGCCCAG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:132 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470ep-F9 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:132: GCTAGATCTG GCAACATGGG GCACAAGGTC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:133 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei "I (vi) ALKUPERÄ: : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470ep-R9 '** (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:133: t CACAGATCTC GCGTAGTAGT AGCGTCCAGA 30 tl· * (2) SEKVENSSIN ID NO:134 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 emäsparia ... (B) TYYPPI: nukleiinihappo : (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

* * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei I (iv) ANTI-SENSE: ei ·:·*ί (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: AP aluke Race PCR:lle (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:134: 112249 249 CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 (2) SEKVENSSIN ID NO:135 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-F10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:135: GCTGGATCCA GCATGGGAAC ATGCTTGAAC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:136 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-R10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:136: ; CGCGGATCCC ACAGTGGCCA CTGAGGGGTT 30 ’· ;* (2) SEKVENSSIN ID NO:137 TIEDOT: * » · •'j (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: t , : (A) PITUUS: 27 emäsparia ; '1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo f‘ (C) JUOSTEISUUS: molemmat ’ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

,, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei * * · (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ···. (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke EXY10-F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:137: ·'* ; GCCCATATGG TGATCACTGG TGACGTT 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:138 TIEDOT: 250 1 12249 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke EXY10-F2 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:138: GCCCATATGC TGGGTTACGG TGAA 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:139 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke EXY10-F3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:139: GCCCATATGA CCTCCGCCTA TAAGCTG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:140 TIEDOT: • '··' (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; (A) PITUUS: 27 emäsparia ' * (B) TYYPPI: nukleiinihappo ··· (C) JUOSTEISUUS: molemmat

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen I

;;; (ii) molekyylityyppi: dna Γ ’ (iii) HYPOTEETTINEN: ei , (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ; (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke EXY10-R1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:140: ,···. GCCCATATGA GCCGCCGGCG GCAGATC 27 * ; (2) SEKVENSSIN ID NO:141 TIEDOT: ':*! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia 251 1 12249 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke EXY5-R1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:141: TGCGGATCCC ACATTGTCTG GATT 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:142 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke Y5-5-F1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:142: TCGGCCATGG CCTATTGTGA CAAGGTG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:143 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .·, (A) PITUUS: 219 emäsparia , l (B) TYYPPI: nukleiinihappo ···, (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

:.V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei V : (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni Q7-12-1 (ix) OMINAISPIIRRE:

i *' (A) NIMI/SELITYS: CDS

, (B) ASEMA: 1..219 ’ ( (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:143: GTG CCC TTC GTC AAT AGG ACA ACT CTC TTC ACC ATT AGG GGG CCC CTG 48

Vai Pro Phe Vai Asn Arg Thr Thr Leu Phe Thr Ile Arg Gly Pro Leu ;· 1 5 10 15 : ’ GGC AAC CAG GGC CGA GGC AAC CCG GTG CGG TCG CCC TTG GGT TTT GGG 96

Gly Asn Gin Gly Arg Gly Asn Pro Vai Arg Ser Pro Leu Gly Phe Gly 20 25 30 252 1 12249 TCC TAC GCC ATG ACC AGG ATC CGA GAT ACC CTA CAT CTG GTG GAG TGT 144

Ser Tyr Ala Met Thr Arg lie Arg Asp Thr Leu His Leu Val Glu Cys 35 40 45 CCC ACA CCA GCC ATC GAG CCT CCC ACC GGG ACG TCT GGG TTC TTC CCC 192

Pro Thr Pro Ala lie Glu Pro Pro Thr Gly Thr Ser Gly Phe Phe Pro 50 55 60 GGG ACG CCG CCT CTC AAC AGC TGC ATG 219

Gly Thr Pro Pro Leu Asn Ser Cys Met 65 70 (2) SEKVENSSIN ID NO:144 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 73 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:144:

Vai Pro Phe Vai Asn Arg Thr Thr Leu Phe Thr Ile Arg Gly Pro Leu 15 10 15

Gly Asn Gin Gly Arg Gly Asn Pro Vai Arg Ser Pro Leu Gly Phe Gly 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Thr Arg Ile Arg Asp Thr Leu His Leu Vai Glu Cys 35 40 45

Pro Thr Pro Ala Ile Glu Pro Pro Thr Gly Thr Ser Gly Phe Phe Pro 50 55 60

Gly Thr Pro Pro Leu Asn Ser Cys Met 65 70 (2) SEKVENSSIN ID NO:145 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 264 emäsparia • (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat ’*·’ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * «

'*·* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

vt· **; (iii) HYPOTEETTINEN: ei I * ;j|‘ (iv) ANTI-SENSE: ei * · * ’ (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni Y12-10-3 (ix) OMINAISPIIRRE:

‘ ’* (A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..264 ‘ . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:145: ...f CCC CTC GAG CGG ATG CGA ACC GGA AGG CAC CTC GTG TTC TGC CAT TCT 48 *,,,· Pro Leu Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Vai Phe Cys His Ser 15 10 15 I * » : 1 AAG GCT GAG TGC GAG CGC CTT GCT GGC CAG TTC TCC GCT AGG GGG GTC 96 >··' Lys Ala Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gin Phe Ser Ala Arg Gly Vai 20 25 30 112249 253 AAT GCC ATT GCC TAT TAT AGG GGT AAA GAC AGC TCT ATC ATC AAG GAT 144

Asn Ala Ile Ala Tyr Tyr Arg Gly Lys Asp Ser Ser Ile Ile Lys Asp 35 40 45 GGG GAC CTG GTG GTC TGT GCT ACA GAC GCG CTT TCC ACT GGG TAC ACT 192

Gly Asp Leu Vai Vai Cys Ala Thr Asp Ala Leu Ser Thr Gly Tyr Thr 50 55 60 GGA AAT TTC GAC TCC GTC ACC GAC TGT GGA TTA GTG GTG GAG GAG GTC 240

Gly Asn Phe Asp Ser Vai Thr Asp Cys Gly Leu Vai Vai Glu Glu Vai 65 70 75 80 GTT GAG GTG ACC CTT GAT CCC ACC 264

Vai Glu Vai Thr Leu Asp Pro Thr 85 (2) SEKVENSSIN ID NO:146 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 88 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:146:

Pro Leu Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Vai Phe Cys His Ser 15 10 15

Lys Ala Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gin Phe Ser Ala Arg Gly Vai 20 25 30

Asn Ala Ile Ala Tyr Tyr Arg Gly Lys Asp Ser Ser Ile Ile Lys Asp 35 40 45

Gly Asp Leu Vai Vai Cys Ala Thr Asp Ala Leu Ser Thr Gly Tyr Thr 50 55 60

Gly Asn Phe Asp Ser Vai Thr Asp Cys Gly Leu Vai Vai Glu Glu Vai 65 70 75 80 ? ί Vai Glu Vai Thr Leu Asp Pro Thr 85 i * !ί (2) SEKVENSSIN ID NO:147 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ' (A) PITUUS: 205 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo '! (C) JUOSTEISUUS: molemmat ! ! ί (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

‘ (iii) HYPOTEETTINEN: ei '9 ! (iv) ANTI-SENSE: ei .·! (vi) ALKUPERÄ: ‘ (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni Y12-15-1 » (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS : CDS

; ; (B) ASEMA: 1..205 t ‘ί (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:147: 112249 254 GCT AGA TCT GGC AAC ATG GGG CAC AAG GTC TTA ATC TTG AAC CCC TCA 48

Ala Arg Ser Gly Asn Met Gly His Lys Vai Leu Ile Leu Asn Pro Ser 15 10 15 GTG GCC ACT GTG CGG GCC ATG GGC CCG TAC ATG GAG CGG CTG GCG GGT 96

Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly Pro Tyr Met Glu Arg Leu Ala Gly 20 25 30 AAA CAT CCA AGT ATA TAC TGT GGG CAT GAT ACA ACT GCT TTC ACA AGG 144

Lys His Pro Ser Ile Tyr Cys Gly His Asp Thr Thr Ala Phe Thr Arg 35 40 45 ATC ACT GAC TCC CCC CTG ACG TAT TCA ACC TAT GGG AGG TTT TTG GCC 192

Ile Thr Asp Ser Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ala 50 55 60 AAC CCT AGG CAG A 205

Asn Pro Arg Gin 65 (2) SEKVENSSIN ID NO:148 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 68 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:148:

Ala Arg Ser Gly Asn Met Gly His Lys Vai Leu Ile Leu Asn Pro Ser 15 10 15

Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly Pro Tyr Met Glu Arg Leu Ala Gly 20 25 30

Lys His Pro Ser Ile Tyr Cys Gly His Asp Thr Thr Ala Phe,Thr Arg 35 40 45

Ile Thr Asp Ser Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gin : : 65 , (2) SEKVENSSIN ID NO:149 TIEDOT: I · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat .‘I*. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

. ( iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ‘ . (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE4F

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:149: GCCGCCATGG CTCTCCAAGC GATCGAGAAT GC 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:150 TIEDOT: 255 1 1224 9 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE4R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:150: GCGCGGATCC CAACCCCAAT GAGAAAAAGC G 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:151 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EXP3F (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:151: CCGCCATGGG ACGCGGACGC TCG 23 .·. (2) SEKVENSSIN ID NO:152 TIEDOT: * · J I » · ,··. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat .I. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

. /. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

» i i (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

; ** (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EXP3R

’·’ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:152: ' t ’ ·: CGCGGATCCT TACTGTCTTA TTGCTTCC 28 1 · ’!* (2) SEKVENSSIN ID NO:153 TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 emäsparia 256 1 12 2 4 9 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-2888F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:153: GCGGAATTCT TGGCTCGGGT GGTTGAGTGC TGTG 34 (2) SEKVENSSIN ID NO:154 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-3216R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:154: GCGAAGCTTC CGTCGGATGA CAACAGGCGC GG 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:155 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . (A) PITUUS: 36 emäsparia > l (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat J (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f · · : (ii) molekyylityyppi: dna • * 1’ (iii) HYPOTEETTINEN: ei : : : (iv) ANTI-SENSE: ei : : : (vi) alkuperä: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-6521F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:155: GCGGAATTOA CCTCCGCCTA TAAGCTGCTG CGCCAG 36 * « · (2) SEKVENSSIN ID NO:156 TIEDOT: j’··. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: '·*·* (A) PITUUS: 42 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo •t| · (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · 112249 257

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-7483R (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:156: GCTGCGGCCG CCCTCCGTCC CACATTGTCT GGATTGGTAA CA 42 (2) SEKVENSSIN ID NO:157 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke T7F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:157: ATTAATACGA CTCACTATAG GG 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:158 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

! (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei : (iv) ANTI-SENSE: ei ·:· (vi) ALKUPERÄ:

"·; (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke T7R

;;; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:158: i * * CAAGGGGTTA TGCTAGTTAT TG 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:159 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : : : (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat * ' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

'...· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

‘ (iii) HYPOTEETTINEN: ei :**: (iv) ANTI-SENSE: ei 112249 258 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni GE4-8 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..402 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:159: GCT CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATT 48

Ala Leu Gin Ala lie Glu Asn Ala Ala Arg lie Leu Glu Pro His lie 15 10 15 GAT GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT AGT AGC 96

Asp Val lie Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser 20 25 30 CGA GAG ATG CCT GTA TGG GGA GAA GAC ATC CCC CGT ACT CCA TCG CCA 144

Arg Glu Met Pro Val Trp Gly Glu Asp lie Pro Arg Thr Pro Ser Pro 35 40 45 GCA CTT ATC TCG GTT ACT GAG AGC AGC TCA GAT GAG AAG ACC CCG TCG 192

Ala Leu lie Ser Val Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser 50 55 60 GTG TCC TCC TCG CAG GAG GAT ACC CCG TCC TCT GAC TCA TTC GAG GTC 240

Val Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Val 65 70 75 80 ATC CAA GAG TCC GAG ACA GCC GAA GGG GAG GAA AGT GTC TTC AAC GTG 288 lie Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Val Phe Asn Val 85 90 95 GCT CTT TCC GTA TTA AAA GCC TTA TTT CCA CAG AGC GAC GCG ACC AGG 336

Ala Leu Ser Val Leu Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg 100 105 110 AAG CTT ACC GTC AAG ATG TCG TGC TGC GTT GAA AAG AGC GTC ACG CGC 384

Lys Leu Thr Val Lys Met Ser Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg 115 120 125 TTT TTC TCA TTG GGG TTG 402

Phe Phe Ser Leu Gly Leu 130 < · (2) SEKVENSSIN ID NO:160 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 134 aminohappoa ,:. (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini V ’ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:160:

Ala Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile 1 5 10 15 • · /:1. Asp Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser V * 20 25 30 ;·*: Arg Glu Met Pro Vai Trp Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro 35 40 45 ' ♦ *!* Ala Leu Ile Ser Vai Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser 50 55 60

Vai Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Vai » * 259 1 12249 65 70 75 80

Ile Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Vai Phe Asn Vai 85 90 95

Ala Leu Ser Vai Leu Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg 100 105 110

Lys Leu Thr Vai Lys Met Ser Cys Cys Vai Glu Lys Ser Vai Thr Arg 115 120 125

Phe Phe Ser Leu Gly Leu 130 (2) SEKVENSSIN ID NO:161 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1011 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni EXP3-7 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..1011 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:161: ATG GTC TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT ACC ATT GAC GGG GAG CGC TAC 48

Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr 15 10 15 ACC TTG CCT CAT CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG GCA CCC TCT GAG GTT 96

Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai Ala Pro Ser Glu Vai ··' : 20 25 30 ··.' TCA TCC GAG GTG TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG ACT GAA GAC TCA GAA 144

Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu 35 40 45 · CTG ACT GAG GCC GAT CTG CCG CCG GCG GCT GCT GCT CTC CAA GCG ATC 192 ·’· Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala Ile :·’ 50 55 60 • i · ·’ GAG AAT GCT GCG AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATT GAT GTC ATC ATG GAG 240

Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp Vai Ile Met Glu 65 70 75 80 “ GAC TGC AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT AGT AGC CGA GAG ATG CCT GTA 288 ’”· Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Vai [ 85 90 95 • TGG GGA GAA GAC ATC CCC CGT ACT CCA TCG CCA GCA CTT ATC TCG GTT 336 ·.. Trp Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu Ile Ser Vai i,,,: 100 105 110 ACT GAG AGC AGC TCA GAT GAG AAG ACC CCG TCG GTG TCC TCC TCG CAG 384 · Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Vai Ser Ser Ser Gin 115 120 125 112249 260 GAG GAT ACC CCG TCC TCT GAC TCA TTC GAG GTC ATC CAA GAG TCC GAG 432

Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Val lie Gin Glu Ser Glu 130 135 140 ACA GCC GAA GGG GAG GAA AGT GTC TTC AAC GTG GCT CTT TCC GTA TTA 480

Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Val Phe Asn Val Ala Leu Ser Val Leu 145 150 155 160 AAA GCC TTA TTT CCA CAG AGC GAC GCG ACC AGG AAG CTT ACC GTC AAG 528

Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Val Lys 165 170 175 ATG TCG TGC TGC GTT GAA AAG AGC GTC ACG CGC TTT TTC TCA TTG GGG 576

Met Ser Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly 180 185 190 TTG ACG GTG GCT GAT GTT GCT AGC CTG TGT GAG ATG GAA ATC CAG AAC 624

Leu Thr Val Ala Asp Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu lie Gin Asn 195 200 205 CAT ACA GCC TAT TGT GAC CAG GTG CGC ACT CCG CTT GAA TTG CAG GTT 672

His Thr Ala Tyr Cys Asp Gin Val Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Val 210 215 220 GGG TGC TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAC AAG TGT GAG 720

Gly Cys Leu Val Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu 225 230 235 240 GCT AGG CAA GAA ACC TTG GCC TCC TTC TCT TAC ATT TGG TCT GGA GTG 768

Ala Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr lie Trp Ser Gly Val 245 250 255 CCG CTG ACT AGG GCC ACG CCG GCC AAG CCT CCC GTG GTG AGG CCG GTT 816

Pro Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro Val Val Arg Pro Val 260 265 270 GGC TCT TTG TTA GTG GCC GAC ACT ACT AAG GTG TAT GTT ACC AAT CCA 864

Gly Ser Leu Leu Val Ala Asp Thr Thr Lys Val Tyr Val Thr Asn Pro 275 280 285 GAC AAT GTG GGA CGG AGG GTG GAC AAG GTG ACC TTC TGG CGT GCT CCT 912

Asp Asn Val Gly Arg Arg Val Asp Lys Val Thr Phe Trp Arg Ala Pro 290 295 300 :.· · agg gtt cat gat aag tac ctc gtg gac tct att gag cgc gct aag agg 960

Arg Val His Asp Lys Tyr Leu Val Asp Ser lie Glu Arg Ala Lys Arg 305 310 315 320 .*,· GCC GCT CAA GCC TGC CTA AGC ATG GGT TAC ACT TAT GAG GAA GCA ATA 1008 ; Ala Ala Gin Ala Cys Leu Ser Met Gly Tyr Thr Tyr Glu Glu Ala lie 325 330 335 : AGG 1011 ; · t Arg (2) SEKVENSSIN ID NO:162 TIEDOT: ;·, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 1 * (A) PITUUS: 337 aminohappoa ' ( (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini *·, (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:162:

Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr 1 5 10 15 112249 261

Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val 20 25 30

Ser Ser Glu Val Ser lie Asp lie Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu 35 40 45

Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala lie 50 55 60

Glu Asn Ala Ala Arg lie Leu Glu Pro His lie Asp Val lie Met Glu 65 70 75 80

Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Val 85 90 95

Trp Gly Glu Asp lie Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu lie Ser Val 100 105 110

Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Gin 115 120 125

Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Val lie Gin Glu Ser Glu 130 135 140

Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Val Phe Asn Val Ala Leu Ser Val Leu 145 150 155 160

Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Val Lys 165 170 175

Met Ser Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly 180 185 190

Leu Thr Val Ala Asp Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu lie Gin Asn 195 200 205

His Thr Ala Tyr Cys Asp Gin Val Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Val 210 215 220

Gly Cys Leu Val Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu 225 230 235 240 , , Ala Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr lie Trp Ser Gly Val : 245 250 255 « I · . : Pro Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro Val Val Arg Pro Val 260 265 270 * » * 1 Gly Ser Leu Leu Val Ala Asp Thr Thr Lys Val Tyr Val Thr Asn Pro ·:· 275 280 285 ' *. : Asp Asn Val Gly Arg Arg Val Asp Lys Val Thr Phe Trp Arg Ala Pro 290 295 300 I « · * » ·

Arg Val His Asp Lys Tyr Leu Val Asp Ser lie Glu Arg Ala Lys Arg 305 310 315 320 : Ala Ala Gin Ala Cys Leu Ser Met Gly Tyr Thr Tyr Glu Glu Ala lie 325 330 335 * * * . Arg * « t · * • · ,*·. (2) SEKVENSSIN ID NO:163 TIEDOT: , (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .* ; : (A) PITUUS: 351 emäsparia ’t (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 112249 262

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni GENS2b-l (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..351 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:163: TTG GCT CGG GTG GTT GAG TGC TGT GTG ATG GCG GGT GAG AAG GCC ACA 48

Leu Ala Arg Vai Vai Glu Cys Cys Val Met Ala Gly Glu Lys Ala Thr 15 10 15 ACC GTC CGG CTG GTC TCC AAG ATG TGT GCG AGA GGA GCT TAT TTG TTC 96

Thr Val Arg Leu Val Ser Lys Met Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Phe 20 25 30 GAT CAT ATG GGC TCT TTT TCG CGT GCT GTC AAG GAG CGC CTG TTG GAA 144

Asp His Met Gly Ser Phe Ser Arg Ala Val Lys Glu Arg Leu Leu Glu 35 40 45 TGG GAC GCA GCT CTT GAA CCT CTG TCA TTC ACT AGG ACG GAC TGT CGC 192

Trp Asp Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Arg Thr Asp Cys Arg 50 55 60 ATC ATA CGG GAT GCC GCG AGG ACT TTG TCC TGC GGG CAG TGC GTC ATG 240 lie lie Arg Asp Ala Ala Arg Thr Leu Ser Cys Gly Gin Cys Val Met 65 70 75 80 GGT TTA CCC GTG GTT GCG CGC CGT GGT GAT GAG GTT CTC ATC GGC GTC 288

Gly Leu Pro Val Val Ala Arg Arg Gly Asp Glu Val Leu lie Gly Val 85 90 95 TTC CAG GAT GTG AAT CAT TTG CCT CCC GGG TTT GTT CCG ACC GCG CCT 336

Phe Gin Asp Val Asn His Leu Pro Pro Gly Phe Val Pro Thr Ala Pro 100 105 110 . . GTT GTC ATC CGA CGG 351 • · Val Val lie Arg Arg '!!.* 115 « (2) SEKVENSSIN ID NO:164 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: , (A) PITUUS: 117 aminohappoa ί,';/ (Β) TYYPPI: aminohappo !!! (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini .. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:164: * * ·

Leu Ala Arg Vai Vai Glu Cys Cys Vai Met Ala Gly Glu Lys Ala Thr : 1 5 10 15

Thr Vai Arg Leu Vai Ser Lys Met Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Phe 20 25 30 ·*· Asp His Met Gly Ser Phe Ser Arg Ala Vai Lys Glu Arg Leu Leu Glu 35 40 45 < I * t l . Trp Asp Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Arg Thr Asp Cys Arg 50 55 60 263 1 12249

Ile Ile Arg Asp Ala Ala Arg Thr Leu Ser Cys Gly Gin Cys Vai Met 65 70 75 80

Gly Leu Pro Vai Vai Ala Arg Arg Gly Asp Glu Vai Leu Ile Gly Vai 85 90 95

Phe Gin Asp Vai Asn His Leu Pro Pro Gly Phe Vai Pro Thr Ala Pro 100 105 110

Vai Vai Ile Arg Arg 115 (2) SEKVENSSIN ID NO:165 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 993 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Antigeeniklooni GENS5a-3 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..993 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:165: ACC TCC GCC TAT AAG CTG CTG CGC CAG CAA ATC CTA TCG GCT GCT GTA 48

Thr Ser Ala Tyr Lys Leu Leu Arg Gin Gin Ile Leu Ser Ala Ala Vai 15 10 15 GCT GAG CCC TAC TAC GTC GAC GGC ATT CCG GTC TCA TGG GAC GCG GAC 96

Ala Glu Pro Tyr Tyr Vai Asp Gly Ile Pro Vai Ser Trp Asp Ala Asp 20 25 30 * · * * f * · GCT CGT GCG CCC GCC ATG GTC TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT ACC ATT 144 ; ' ; Ala Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile 35 40 45 ' GAC GGG GAG CGC TAC ACC TTG CCT CAT CAA CTG AGG CTC AGG AAT GTG 192 ·;· Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai 50 55 60 GCA CCC TCT GAG GTT TCA TCC GAG GTG TCC ATT GAC ATT GGG ACG GAG 240 ! : : Ala Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu ’ 65 70 75 80 ,, ACT GAA GAC TCA GAA CTG ACT GAG GCC GAT CTG CCG CCG GCG GCT GCT 288 : Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala 85 90 95 * · · GCT CTC CAA GCG ATC GAG AAT GCT GCG AGG ATT CTT GAA CCG CAC ATT 336

Ala Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile • · 100 105 110 GAT GTC ATC ATG GAG GAC TGC AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT AGT AGC 384

Asp Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser ; 115 120 125 * f * » : * *: CGA GAG ATG CCT GTA TGG GGA GAA GAC ATC CCC CGT ACT CCA TCG CCA 432

Arg Glu Met Pro Vai Trp Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro 112249 264 130 135 140 GCA CTT ATC TCG GTT ACT GAG AGC AGC TCA GAT GAG AAG ACC CCG TCG 480

Ala Leu Ile Ser Val Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser 145 150 155 160 GTG TCC TCC TCG CAG GAG GAT ACC CCG TCC TCT GAC TCA TTC GAG GTC 528

Val Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Val 165 170 175 ATC CAA GAG TCC GAG ACA GCC GAA GGG GAG GAA AGT GTC TTC AAC GTG 576 lie Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Val Phe Asn Val 180 185 190 GCT CTT TCC GTA TTA AAA GCC TTA TTT CCA CAG AGC GAC GCG ACC AGG 624

Ala Leu Ser Val Leu Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg 195 200 205 AAG CTT ACC GTC AAG ATG TCG TGC TGC GTT GAA AAG AGC GTC ACG CGC 672

Lys Leu Thr Val Lys Met Ser Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg 210 215 220 TTT TTC TCA TTG GGG TTG ACG GTG GCT GAT GTT GCT AGC CTG TGT GAG 720

Phe Phe Ser Leu Gly Leu Thr Val Ala Asp Val Ala Ser Leu Cys Glu 225 230 235 240 ATG GAA ATC CAG AAC CAT ACA GCC TAT TGT GAC CAG GTG CGC ACT CCG 768

Met Glu lie Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Gin Val Arg Thr Pro 245 250 255 CTT GAA TTG CAG GTT GGG TGC TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA 816

Leu Glu Leu Gin Val Gly Cys Leu Val Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu 260 265 270 TGT GAC AAG TGT GAG GCT AGG CAA GAA ACC TTG GCC TCC TTC TCT TAC 864

Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr 275 280 285 ATT TGG TCT GGA GTG CCG CTG ACT AGG GCC ACG CCG GCC AAG CCT CCC 912 lie Trp Ser Gly Val Pro Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro 290 295 300 GTG GTG AGG CCG GTT GGC TCT TTG TTA GTG GCC GAC ACT ACT AAG GTG 960

Val Val Arg Pro Val Gly Ser Leu Leu Val Ala Asp Thr Thr Lys Val ·· · 305 310 315 320 » ' ·' TAT GTT ACC AAT CCA GAC AAT GTG GGA CGG AGG 993 . Tyr Val Thr Asn Pro Asp Asn Val Gly Arg Arg 325 330 » * * * ! f t * (2) SEKVENSSIN ID NO:166 TIEDOT: . I · : ''I*. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ’ (A) PITUUS: 331 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini s f f '*] ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:166: «

Thr Ser Ala Tyr Lys Leu Leu Arg Gin Gin Ile Leu Ser Ala Ala Vai ... 15 10 15 I t

Ala Glu Pro Tyr Tyr Vai Asp Gly Ile Pro Vai Ser Trp Asp Ala Asp . 20 25 30

I I

Ala Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Vai Thr Ile 35 40 45 112249 265

Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Vai 50 55 60

Ala Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr Glu 65 70 75 80

Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala 85 90 95

Ala Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile 100 105 110

Asp Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser 115 120 125

Arg Glu Met Pro Vai Trp Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro 130 135 140

Ala Leu Ile Ser Vai Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser 145 150 155 160

Vai Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Vai 165 170 175

Ile Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Vai Phe Asn Vai 180 185 190

Ala Leu Ser Vai Leu Lys Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg 195 200 205

Lys Leu Thr Vai Lys Met Ser Cys Cys Vai Glu Lys Ser Vai Thr Arg 210 215 220

Phe Phe Ser Leu Gly Leu Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu 225 230 235 240

Met Glu Ile Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Gin Vai Arg Thr Pro 245 250 255

Leu Glu Leu Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu 260 265 270

Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr 275 280 285 « ♦ · t . ·*. Ile Trp Ser Gly Vai Pro Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro 290 295 300

Vai Vai Arg Pro Vai Gly Ser Leu Leu Vai Ala Asp Thr Thr Lys Vai 305 310 315 320 , Tyr Vai Thr Asn Pro Asp Asn Vai Gly Arg Arg 325 330 t · · (2) SEKVENSSIN ID NO:167 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *’ (A) PITUUS: 536 emäsparia . (B) TYYPPI: nukleiinihappo * (C) JUOSTEISUUS: molemmat * . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

T (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ‘ * (vi) ALKUPERÄ: 112249 266 (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 3'-pää (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:I67: CTGAGCGACC TCAAGCTCCC TGGCTTAGCA GTCCACCGAA AGAAGGCCGG GGCGTTGCGA 60 ACACGCATGC TCCGCTCGCG CGGTTGGGCT GAGTTGGCTA GGGGCTTGTT GTGGCATCCA 120 GGCCTACGGC TTCCTCCCCC TGAGATTGCT GGTATCCCGG GGGGTTTCCC TCTCTCCCCC 180 CCCTATATGG GGGTGGTACA TCAATTGGAT TTCACAAGCC AGAGGAGTCG CTGGCGGTGG 240 TTGGGGTTCT TAGCCCTGCT CATCGTAGCC CTCTTCGGGT GAACTAAATT CATCTGTTGC 300 GGCAAGGTCT GGTGACTGAT CATCACCGGA GGAGGTTCCC GCCCTCCCCG CCCCAGGGGT 360 CTCCCCGCTG GGTAAAAAGG GCCCGGCCTT GGGAGGCATG GTGGTTACTA ACCCCCTGGC 420 AGGGTCAAAG CCTGATGGTG CTAATGCACT GCCACTTCGG TGGCGGGTCG CTACCTTATA 480 GCGTAATCCG TGACTACGGG CTGCTCGCAG AGCCCTCCCC GGATGGGGCA CAGTGC 536 (2) SEKVENSSIN ID NO:168 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 594 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNÄ (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Yksittäinen klooni MP3-3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:168: CTGAGCGACC TCAAGCTCCC TGGCTTAGCA GTCCACCGAA AGAAGGCCGG GGCGTTGCGA 60 t · ACACGCATGC TCCGCTCGCG CGGTTGGGCT GAGTTGGCTA GGGGCTTGTT GTGGCATCCA 120 * · GGCCTACGGC TTCCTCCCCC TGAGATTGCT GGTATCCCGG GGGGTTTCCC TCTCTCCCCC 180 » · CCCTATATGG GGGTGGTACA CCAATTGGAT TTCACAAGCC AGAGGAGTCG CTGGCGGTGG 240 t ,·. TTGGGGTTCT TAGCCCTGCT CATCGTAGCC CTCTTCGGGT GAACTAAATT CATCTGTTGC 300 » · *;·. GGCAAGGTCT GGTGACTGAT CATCACCGGA GGAGGTTCCC GCCCTCCCCG CCCCAGGGGT 360 CTCCCCGCTG GGTAAAAAGG GCCCGGCCTT GGGAGGCATG GTGGTTACTA ACCCCCTGGC 420 AGGGTCAAAG CCTGATGGTG CTAATGCACT GCCACTTCGG TGGCGGGTCG CTACCTTATA 480 GCGTAATCCG TGACTACGGG CTGCTCGCAG AGCCCTCCCC GGATGGGGCA CAGTGCACTG 540 * , TGATCTGAAG GGGTGCACCC CGGGAAGAGC TCGGCCCGAA GGCCGGCTTC TACT 594 i"‘: (2) SEKVENSSIN ID NO:169 TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: I.; ; (A) PITUUS: 594 emäsparia ____: (B) TYYPPI: nukleiinihappo ' * (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 112249 267

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Yksittäinen klooni MP3-7 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:169: CTGAGCGACC TCAAGCTCCC TGGCTTAGCA GTCCACCGAA AGAAGGCCGG GGCGTTGCGA 60 ACACGCATGC TCCGCTCGCG CGGTTGGGCT GAGTTGGCTA GGGGCTTGTT GTGGCATCCA 120 GGCCTACGGC TTCCTCCCCC TGAGATTGCT GGTGTCCCGG GGGGTTTCCC TCTCTCCCCC 180 CCCTATATGG GGGTGGTACA CCAATTGGAT TTCACAAGCC AGAGGAGTCG CTGGCGGTGG 240 TTGGGGTTCT TAGCCCTGCT CATCGTAGCC CTCTTCGGGT GAACTAAATT CATCTGTTGC 300 GGCAAGGTCT GGTGACTGAT CATCACCGGA GGAGGTTCCC GCCCTCCCCG CCCCAGGGGT 360 CTCCCCGCTG GGTAAAAAGG GCCCGGCCTT GGGAGGCATG GTGGTTACTA ACCCCCTGGC 420 AGGGTCAAAG CCTGATGGTG CTAATGCACT GCCACTTCGG TGGCGGGTCG CTACCTTATA 480 GCGTAATCCG TGACTACGGG CTGCTCGCAG AGCCCTCCCC GGATGGGGCA CAGTGCACTG 540 TGATCTGAAG GGGTGCACCC CGGTAAGAGC TCGGCCCGAA GGCCGGGTTC TACT 594 (2) SEKVENSSIN ID NO:170 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

• (iii) HYPOTEETTINEN: ei « t · (iv) ANTI-SENSE: ei * · (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV5446IRT (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:170: M.· CGGTCCCTCG AACTCCAGCG AGTCTTTTTT χχχχχχχχχ 39 • t « I t * (2) SEKVENSSIN ID NO:171 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : ·· (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo '.· · (C) JUOSTEISUUS: molemmat * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

! ’ : ·;· (iii) HYPOTEETTINEN: ei · (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV59-5446F

112249 268 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:171: CTGAGCGACC TCAAGCTCCC TGGC 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:172 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV-5446IR (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:172: CGGTCCCTCG AACTCCAGCG AGTC 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:173 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Koetin E5-7-PRB

' ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:173: CGTAGCCCTC GGGTGAACTA AAT 23 ··· (2) SEKVENSSIN ID NO:174 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ;;; (A) PITUUS: 35 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo * (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei » (iv) ANTI-SENSE: ei ···, (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Race Anchor sekvenssi | (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:174: 1 · · · ·;·· CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG 35 112249 269 (2) SEKVENSSIN ID NO:175 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 736 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Konsensussekvenssi 5'-pää (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:175: ACGTGGGGGA GTTGATCCCC CCCCCCCGGC ACTGGGTGCA AGCCCCAGAA ACCGACGCCT 60 ATCTAAGTAG ACGCAATGAC TCGGCGCCGA CTCGGCGACC GGCCAAAAGG TGGTGGATGG 120 GTGATGACAG GGTTGGTAGG TCGTAAATCC CGGTCACCTT GGTAGCCACT ATAGGTGGGT 180 CTTAAGAGAA GGTTAAGATT CCTCTTGTGC CTGCGGCGAG ACCGCGCACG GTCCACAGGT 240 GTTGGCCCTA CCGGTGGGAA TAAGGGCCCG ACGTCAGGCT CGTCGTTAAA CCGAGCCCGT 300 TACCCACCTG GGCAAACGAC GCCCACGTAC GGTCCACGTC GCCCTTCAAT GTCTCTCTTG 360 ACCAATAGGC GTAGCCGGCG AGTTGACAAG GACCAGTGGG GGCCGGGGGC TTGGAGAGGG 420 ACTCCAAGTC CCGCCCTTCC CGGTGGGCCG GGAAATGCAT GGGGCCACCC AGCTCCGCGG 480 CGGCCTGCAG CCGGGGTAGC CCAAGAATCC TTCGGGTGAG GGCGGGTGGC ATTTCCTTTT 540 TCTATACCAT CATGGCAGTC CTTCTGCTCC TTCTCGTGGT TGAGGCCGGG GCCATTCTGG 600 CCCCGGCCAC CCACGCTTGT CGAGCGAATG GGCAATATTT CCTCACAAAT TGTTGTGCCC 660 CGGAGGACAT CGGGTTCTGC CTGGAGGGTG GATGCCTGGT GGCCCTGGGG TGCACGATTT 720 • ,·. GCACTGACCA ATGCTG 736 I · * » I · « I · · (2) SEKVENSSIN ID NO: 176 TIEDOT: V.· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 688 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei . : “ (iv) ANTI-SENSE: ei t * ‘ (vi) ALKUPERÄ: • , (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV variantti BG34

t I M I

(ix) OMINAISPIIRRE:

I : (A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 272..688 '. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID ΝΟ.Ί76: ’ * GACTCGGCGC CGACTCGGCG ACCGGCCAAA AGGTGGTGGA TGGGTGATGA CAGGGTTGGT 60 112249 270 AGGTCGTAAA TCCCGGTCAC CTTGGTAGCC ACTATAGGTG GGTCTTAAGA GAAGGTTAAG 120 ATTCCTCTTG TGCCTGCGGC GAGACCGCGC ACGGTCCACA GGTGTTGGCC CTACCGGTGT 180 GAATAAGGGC CCGACGTCAG GCTCGTCGTT AAACCGAGCC CGTCACCCAC CTGGGCAAAC 240 GACGCCCACG TACGGTCCAC GTCGCCCTTC A ATG CCT CTC TTG GCC AAT AGG 292

Met Pro Leu Leu Ala Asn Arg 1 5 AGT ATC CGG CGA GTT GAC AAG GAC CAG TGG GGG CCG GGA GTC ACG GGG 340

Ser Ile Arg Arg Val Asp Lys Asp Gin Trp Gly Pro Gly Val Thr Gly 10 15 20 ATG GAC CCC GGG CTC TGC CCT TCC CGG TGG AAC GGG AAA CGC ATG GGG 388

Met Asp Pro Gly Leu Cys Pro Ser Arg Trp Asn Gly Lys Arg Met Gly 25 30 35 CCA CCC AGC TCC GCG GCG GCC TGC AGC CGG GGT AGC CCA AGA ACC CTT 436

Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Arg Thr Leu 40 45 50 55 CGG GTG AGG GCG GGT GGC ATT TCT CTT TTC TGT ATC ATC ATG GCA GTC 484

Arg Val Arg Ala Gly Gly lie Ser Leu Phe Cys lie lie Met Ala Val 60 65 70 CTC CTG CTC CTT CTC GTG GTT GAG GCC GGG GCC ATT CTG GCC CCG GCC 532

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Glu Ala Gly Ala lie Leu Ala Pro Ala 75 80 85 ACC CAC GCT TGT CGA GCG AAT GGA CAA TAT TTC CTC ACA AAC TGT TGC 580

Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys 90 95 100 GCC CTC GAG GAC ATC GGG TTC TGC CTG GAA GGC GGG TGC CTG GTG GCC 628

Ala Leu Glu Asp lie Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu Val Ala 105 110 115 TTA GGG TGC ACC ATT TGC ACT GAC CGT TGC TGG CCA CTG TAT CAG GCG 676

Leu Gly Cys Thr lie Cys Thr Asp Arg Cys Trp Pro Leu Tyr Gin Ala 120 125 130 135 GGT TTG GCT GTG 688

Gly Leu Ala Val '···* (2) SEKVENSSIN ID NO:177 TIEDOT: ’·' (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: •j. (A) PITUUS: 139 aminohappoa ··· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:177:

Met Pro Leu Leu Ala Asn Arg Ser lie Arg Arg Val Asp Lys Asp Gin : “ 1 5 10 15 * Trp Gly Pro Gly Val Thr Gly Met Asp Pro Gly Leu Cys Pro Ser Arg 20 25 30 ... Trp Asn Gly Lys Arg Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser >...· 35 40 45 : Arg Gly Ser Pro Arg Thr Leu Arg Val Arg Ala Gly Gly lie Ser Leu :·: ’· 50 55 60

Phe Cys lie lie Met Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Glu Ala 271 1 12249 55 70 75 80

Gly Ala lie Leu Ala Pro Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin 85 90 95

Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala Leu Glu Asp lie Gly Phe Cys Leu 100 105 110

Glu Gly Gly Cys Leu Val Ala Leu Gly Cys Thr lie Cys Thr Asp Arg 115 120 125

Cys Trp Pro Leu Tyr Gin Ala Gly Leu Ala Val 130 135 (2) SEKVENSSIN ID NO:178 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 663 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV variantti T55806 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 271..663 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:178: GACTCGGCGC CGACTCGGCG ACCGGCCAAA AGGTGGTGGA TGGGTGATGC CAGGGTTGGT 60 AGGTCGTAAA TCCCGGTCAT CTTGGTAGCC ACTATAGGTG GGTCTTAAGA GAAGGTTAAG 120 ATTCCTCTTG TGCCTGCGGC GAGACCGCGC ACGGTCCACA GGTGTTGGCC CTACCGGTGG 180 • · '·· AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC TGGGCAAACG 240 ACGCTCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATG TCT CTC TTG ACC AAT AGG TTT 294 , Met Ser Leu Leu Thr Asn Arg Phe ’·'·* 1 5 ATC CGG CGA GTT GAC AAG GAC CAG TGG GGG CCG GGG GTT ACG GGG ACG 342

Ile Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly Thr y·’ 10 15 20 ’·’ GAC CCC GAA CCC TGC CCT TCC CGG TGG GCC GGG AAA TGC ATG GGG CCA 390

Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser Arg Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly Pro 25 30 35 40 : ** CCC AGC TCC GCG GCG GCC TGC AGC CGG GGT AGC CCA AGA ATC CTT CGG 438

Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg ·] ‘ 45 50 55 GTG AGG GCG GGT GGC ATT TCT CTT TTC TAT ACC ATC ATG GCA GTC CTT 486 ... Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Leu Phe Tyr Thr Ile Met Ala Vai Leu 60 65 70 ; .·. CTG CTC TTC TTC GTG GTT GAG GCC GGG GCG ATT CTC GCC CCG GCC ACC 534 ’·· * Leu Leu Phe Phe Vai Vai Glu Ala Gly Ala Ile Leu Ala Pro Ala Thr 75 80 85 » · 112249 272 CAC GCT TGT CGG GCG AAT GGG CAA TAT TTC CTC ACA AAT TGT TGC GCC 582

His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala 90 95 100 CCA GAG GAT GTT GGG TTC TGC CTG GAG GGC GGA TGC CTG GTG GCT CTG 630

Pro Glu Asp Val Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu Val Ala Leu 105 110 115 120 GGG TGT ACG ATT TGC ACT GAC CGT TGC TGG CCA 663

Gly Cys Thr lie Cys Thr Asp Arg Cys Trp Pro 125 130 (2) SEKVENSSIN ID NO:179 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 131 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:179:

Met Ser Leu Leu Thr Asn Arg Phe Ile Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin 15 10 15

Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly Thr Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser Arg 20 25 30

Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser 35 40 45

Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Leu 50 55 60

Phe Tyr Thr Ile Met Ala Vai Leu Leu Leu Phe Phe Vai Vai Glu Ala 65 70 75 80

Gly Ala Ile Leu Ala Pro Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin 85 90 95

Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala Pro Glu Asp Vai Gly Phe Cys Leu • 100 105 110

Glu Gly Gly Cys Leu Vai Ala Leu Gly Cys Thr Ile Cys Thr Asp Arg 115 120 125 * » »

Cys Trp Pro 130 (2) SEKVENSSIN ID NO: 180 TIEDOT: ’·’ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 632 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo -·. (C) JUOSTEISUUS: molemmat ' ’* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

*'" (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei : (vi) ALKUPERÄ: : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV variantti EB20-2 (ix) OMINAISPIIRRE: 273 112249

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 271..632 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:180: GACTCGGCGC CGACTCGGCG ACCGGCCAAA AGGTGGTGGA TGGGTGATGC CAGGGTTGGT 60 AGGTCGTAAA TCCCGGTCAT CTTGGTAGCC ACTATAGGTG GGTCTTAAGA GAAGGTTAAG 120 ATTCCTCTTG TGCCTGCGGC GAGACCGCGC ACGGTCCACA GGTGTTGGCC CTACCGGTGT 180 AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC TGGGCAAACG 240 ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATG CCT CTC TTG GCC AAT AGG AGT 294

Met Pro Leu Leu Ala Asn Arg Ser 1 5 TAT CTC CGG CGA GTT GGC AAG GAC CAG TGG GGG CCG GGG GTT ACG GGG 342

Tyr Leu Arg Arg Vai Gly Lys Asp Gin Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly 10 15 20 AAG GAC CCC GAA CCC TGC CCT TCC CGG TGG GCC GGG AAA TGC ATG GGG 390

Lys Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser Arg Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly 25 30 35 40 CCA CCC AGC TCC GCG GCG GCC TGC AGC CGG GGT AGC CCA AAA AAC CTT 438

Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Lys Asn Leu 45 50 55 CGG GTG AGG GCG GGT GGC ATT TTC TTT TCC TAT ACC ATC ATG GCA GTC 486

Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Phe Phe Ser Tyr Thr Ile Met Ala Vai 60 65 70 CTT CTG CTC CTT CTC GTG GTT GAG GCC GGG GCC ATT TTG GCC CCG GCC 534

Leu Leu Leu Leu Leu Vai Vai Glu Ala Gly Ala Ile Leu Ala Pro Ala 75 80 85 ACC CAC GCT TGC AGA GCT AAT GGG CAA TAT TTC CTC ACA AAC TGT TGT 582

Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys 90 95 100 GCC TTG GAG GAC ATC GGG TTC TGC CTG GAA GGC GGA TGC TTG GTG GCG CT 632

Ala Leu Glu Asp Ile Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu Vai Ala . ^ 105 110 115 120 (2) SEKVENSSIN ID NO:181 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 120 aminohappoa ,(B) TYYPPI: aminohappo ,·, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ;·, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:181:

Met Pro Leu Leu Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Arg Arg Vai Gly Lys Asp . : '·· 1 5 10 15 . * · Gin Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly Lys Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser • 20 25 30

Arg Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys l’“: 35 40 45 • · Ser Arg Gly Ser Pro Lys Asn Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Phe : so 55 60 * Phe Ser Tyr Thr Ile Met Ala Vai Leu Leu Leu Leu Leu Vai Vai Glu 274 1 12249 65 70 75 80

Ala Gly Ala Ile Leu Ala Pro Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly 85 90 95

Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala Leu Glu Asp Ile Gly Phe Cys 100 105 110

Leu Glu Gly Gly Cys Leu Vai Ala 115 120 (2) SEKVENSSIN ID NOs 182 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 9103 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-JC variantti (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 276..9005 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:182: CAATGACTCG GCGCCGACTC GGCGACCGGC CAAAAGGTGG TGGATGGGTG ATGACAGGGT 60 TGGTAGGTCG TAAATCCCGG TCACCTTGGT AGCCACTATA GGTGGGTCTT AAGAGAAGGT 120 TAAGATTCCT CTTGTGCCTG CGGCGAGACC GCGCACGGTC CACAGGTGTT GGCCCTACCG 180 GTGGGAATAA GGGCCCGACG TCAGGCTCGT CGTTAAACCG AGCCCGTAAC CCGCCTGGGC 240 .·. AAACGACGCC CACGTACGGT CCACGTCGCC CTTCA ATG TCG CTC TTG ACC AAT 293 . ‘ Met Ser Leu Leu Thr Asn 1 5 ,*; AGG CTT AGC CGG CGA GTT GAC AAG GAC CAG TGG GGG CCG GGG TTT ATG 341 ·'* Arg Leu Ser Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin Trp Gly Pro Gly Phe Met 10 15 20 GGG AAG GAC CCC AAA CCC TGC CCT TCC CGG CGG ACC GGG AAA TGC ATG 389 .I." Gly Lys Asp Pro Lys Pro Cys Pro Ser Arg Arg Thr Gly Lys Cys Met ,·*.·. 25 30 35 GGG CCA CCC AGC TCC GCG GCG GCC TGC AGC CGG GGT AGC CCA AGA ATC 437

Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser Arg Gly Ser Pro Arg Ile ;*. _ 40 45 50 CTT CGG GTG AGG GCG GGT GGC ATT TCT CTT CCT TAT ACC ATC ATG GAA 485 "·’ * Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Leu Pro Tyr Thr Ile Met Glu * . 55 60 65 70 » · ... GCC CTC CTG TTC CTC CTC GGG GTG GAG GCC GGG GCC ATT CTG GCC CCG 533 I · Ala Leu Leu Phe Leu Leu Gly Vai Glu Ala Gly Ala Ile Leu Ala Pro *!* 75 80 85 GCC ACC CAC GCT TGT CGA GCG AAT GGG CAA TAT TTC CTC ACA AAC TGT 581

Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin Tyr Phe Leu Thr Asn Cys 90 95 100 112249 275 TGT GCT CCA GAG GAC ATT GGG TTC TGC CTC GAA GGC GGT TGC CTT GTG 629

Cys Ala Pro Glu Asp lie Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu Val 105 110 115 GCC CTG GGG TGC ACA GTT TGC ACT GAC CGA TGC TGG CCG CTG TAT CAG 677

Ala Leu Gly Cys Thr Val Cys Thr Asp Arg Cys Trp Pro Leu Tyr Gin 120 125 130 GCG GGC TTG GCT GTG CGG CCT GGC AAG TCC GCA GCC CAG CTG GTG GGG 725

Ala Gly Leu Ala Val Arg Pro Gly Lys Ser Ala Ala Gin Leu Val Gly 135 140 145 150 CAA CTG GGT GGC CTC TAC GGG CCC TTG TCG GTG TCG GCC TAC GTG GCC 773

Gin Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Pro Leu Ser Val Ser Ala Tyr Val Ala 155 160 165 GGC ATC CTG GGC CTG GGT GAG GTG TAC TCG GGT GTC CTA ACA GTT GGT 821

Gly lie Leu Gly Leu Gly Glu Val Tyr Ser Gly Val Leu Thr Val Gly 170 175 180 GTT GCG TTG ACG CGC CGG GTC TAC CCG ATG CCC AAC CTG ACG TGT GCA 869

Val Ala Leu Thr Arg Arg Val Tyr Pro Met Pro Asn Leu Thr Cys Ala 185 190 195 GTA GAG TGT GAG CTT AAG TGG GAA AGT GAG TTT TGG AGA TGG ACT GAG 917

Val Glu Cys Glu Leu Lys Trp Glu Ser Glu Phe Trp Arg Trp Thr Glu 200 205 210 CAG CTG GCC TCC AAT TAC TGG ATT CTG GAA TAC CTT TGG AAG GTC CCG 965

Gin Leu Ala Ser Asn Tyr Trp lie Leu Glu Tyr Leu Trp Lys Val Pro 215 220 225 230 TTT GAC TTC TGG AGA GGC GTG CTA AGC CTG ACT CCC TTG CTG GTT TGC 1013

Phe Asp Phe Trp Arg Gly Val Leu Ser Leu Thr Pro Leu Leu Val Cys 235 240 245 GTG GCC GCG TTG CTG CTG CTG GAG CAA CGG ATT GTC ATG GTC TTC CTG 1061

Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Glu Gin Arg lie Val Met Val Phe Leu 250 255 260 TTG GTG ACG ATG GCC GGG ATG TCG CAA GGC GCT CCG GCC TCC GTT TTG 1109

Leu Val Thr Met Ala Gly Met Ser Gin Gly Ala Pro Ala Ser Val Leu 265 270 275 .! I GGG TCT CGC CCC TTT GAC TAC GGG TTG ACA TGG CAG TCT TGT TCC TGC 1157 ···, Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Gly Leu Thr Trp Gin Ser Cys Ser Cys 280 285 290 AGG GCT AAT GGG TCG CGC TAT ACT ACT GGG GAG AAG GTG TGG GAC CGT 1205 ,:. Arg Ala Asn Gly Ser Arg Tyr Thr Thr Gly Glu Lys Val Trp Asp Arg ..: 295 300 305 310 .I.· GGG AAC GTC ACG CTC CTG TGT GAC TGC CCC AAC GGC CCC TGG GTG TGG 1253 ;·. Gly Asn Val Thr Leu Leu Cys Asp Cys Pro Asn Gly Pro Trp Val Trp 315 320 325 TTG CCG GCC TTT TGC CAA GCA ATC GGC TGG GGC GAT CCC ATC ACT CAT 1301 ;·. Leu Pro Ala Phe Cys Gin Ala lie Gly Trp Gly Asp Pro lie Thr His : " 330 335 340 » * » ‘ TGG AGC CAC GGC CAA AAT CGG TGG CCC CTC TCA TGC CCC CAG TAT GTC 1349 ’ , Trp Ser His Gly Gin Asn Arg Trp Pro Leu Ser Cys Pro Gin Tyr Val :*·: 345 350 355 i ’ I TAT GGG TCT GTT TCA GTC ACT TGC GTG TGG GGT TCC GTC TCT TGG TTT 1397

Tyr Gly Ser Val Ser Val Thr Cys Val Trp Gly Ser Val Ser Trp Phe : 360 365 370 t I I · ,,.,: GCC TCG ACT GGC GGT CGC GAC TCG AAG ATC GAT GTG TGG AGT CTG GTG 1445

Ala Ser Thr Gly Gly Arg Asp Ser Lys lie Asp Val Trp Ser Leu Val 112249 276 1 375 380 385 390 CCG GTT GGT TCC GCC AGC TGC ACC ATA GCC GCT CTT GGA TCG TCG GAT 1493

Pro Val Gly Ser Ala Ser Cys Thr lie Ala Ala Leu Gly Ser Ser Asp 395 400 405 CGG GAC ACG GTA GTT GAG CTC TCC GAG TGG GGA GTC CCG TGC GCA ACG 1541

Arg Asp Thr Val Val Glu Leu Ser Glu Trp Gly Val Pro Cys Ala Thr 410 415 420 TGC ATT CTG GAT CGT CGG CCG GCC TCG TGC GGC ACC TGT GTG AGA GAC 1589

Cys lie Leu Asp Arg Arg Pro Ala Ser Cys Gly Thr Cys Val Arg Asp 425 430 435 TGC TGG CCC GAA ACC GGG TCG GTT AGG TTT CCA TTC CAT CGG TGC GGC 1637

Cys Trp Pro Glu Thr Gly Ser Val Arg Phe Pro Phe His Arg Cys Gly 440 445 450 GCG GGG CCT AAG CTG ACA AAG GAC TTG GAA GCT GTG CCC TTC GTC AAT 1685

Ala Gly Pro Lys Leu Thr Lys Asp Leu Glu Ala Val Pro Phe Val Asn 455 460 465 470 AGG ACA ACT CCC TTC ACC ATA AGG GGC CCC CTG GGC AAC CAG GGG AGA 1733

Arg Thr Thr Pro Phe Thr lie Arg Gly Pro Leu Gly Asn Gin Gly Arg 475 480 485 GGC AAC CCG GTG CGG TCG CCC TTG GGT TTT GGG TCC TAC GCC ATG ACC 1781

Gly Asn Pro Val Arg Ser Pro Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Ala Met Thr 490 495 500 AAG ATC CGA GAC TCC TTA CAT TTG GTG AAA TGT CCC ACA CCA GCC ATT 1829

Lys lie Arg Asp Ser Leu His Leu Val Lys Cys Pro Thr Pro Ala lie 505 510 515 GAG CCT CCC ACC GGG ACG TTT GGG TTC TTC CCC GGA GTG CCG CCT CTT 1877

Glu Pro Pro Thr Gly Thr Phe Gly Phe Phe Pro Gly Val Pro Pro Leu 520 525 530 AAC AAC TGC CTG CTG TTG GGC ACG GAA GTG TCC GAA GCG CTG GGC GGG 1925

Asn Asn Cys Leu Leu Leu Gly Thr Glu Val Ser Glu Ala Leu Gly Gly 535 540 545 550 GCC GGC CTC ACG GGG GGG TTC TAT GAA CCC CTG GTG CGC AGG CGT TCG 1973 ,·. Ala Gly Leu Thr Gly Gly Phe Tyr Glu Pro Leu Val Arg Arg Arg Ser I 555 560 565 GAG CTG ATG GGG CGC CGA AAT CCG GTT TGC CCG GGG TTT GCA TGG CTG 2021 ,·. Glu Leu Met Gly Arg Arg Asn Pro Val Cys Pro Gly Phe Ala Trp Leu 570 575 580 ,,: TCC TCG GGT CGA CCT GAC GGG TTT ATA CAC GTC CAG GGC CAC TTG CAG 2069

Ser Ser Gly Arg Pro Asp Gly Phe lie His Val Gin Gly His Leu Gin • I.* 585 590 595 I · ‘ GAG GTC GAT GCT GGC AAC TTC ATC CCT CCA CCT CGC TGG TTG CTC TTG 2117

Glu Val Asp Ala Gly Asn Phe lie Pro Pro Pro Arg Trp Leu Leu Leu 600 605 610 : " GAC TTT GTG TTT GTC CTG TTA TAC CTG ATG AAG CTG GCT GAG GCA CGG 2165

Asp Phe Val Phe Val Leu Leu Tyr Leu Met Lys Leu Ala Glu Ala Arg *' ' 615 620 625 630 CTG GTC CCG TTG ATC TTG CTT CTG CTG TGG TGG TGG GTG AAC CAG TTG 2213 ,,, Leu Val Pro Leu lie Leu Leu Leu Leu Trp Trp Trp Val Asn Gin Leu i : 635 640 645 , GCA GTC CTT GGA CTG CCG GCT GTG GAC GCC GCC GTG GCT GGT GAG GTC 2261 : Ala Val Leu Gly Leu Pro Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Gly Glu Val 650 655 660 112249 277 TTC GCG GGC CCG GCC CTG TCG TGG TGT CTG GGC CTC CCC ACC GTT AGT 2309

Phe Ala Gly Pro Ala Leu Ser Trp Cys Leu Gly Leu Pro Thr Val Ser 665 670 675 ATG ATC CTG GGC TTA GCA AAC CTG GTG TTG TAT TTC CGG TGG ATG GGT 2357

Met lie Leu Gly Leu Ala Asn Leu Val Leu Tyr Phe Arg Trp Met Gly 680 685 690 CCC CAA CGC CTC ATG TTC CTC GTG TTG TGG AAG CTC GCT CGG GGA GCC 2405

Pro Gin Arg Leu Met Phe Leu Val Leu Trp Lys Leu Ala Arg Gly Ala 695 700 705 710 TTC CCG CTG GCA CTT CTG ATG GGG ATC TCG GCA ACC CGC GGG CGC ACC 2453

Phe Pro Leu Ala Leu Leu Met Gly lie Ser Ala Thr Arg Gly Arg Thr 715 720 725 TCG GTG CTC GGG GCC GAG TTC TGC TTC GAT GTC ACA TTC GAG GTG GAC 2501

Ser Val Leu Gly Ala Glu Phe Cys Phe Asp Val Thr Phe Glu Val Asp 730 735 740 ACG TCG GTT TTG GGC TGG GTG GTG GCC AGT GTG GTA GCC TGG GCC ATT 2549

Thr Ser Val Leu Gly Trp Vai Vai Ala Ser Vai Vai Ala Trp Ala He 745 750 755 GCG CTC CTG AGC TCG ATG AGC GCG GGA GGG TGG AGG CAC AAG GCC GTG 2597

Ala Leu Leu Ser Ser Met Ser Ala Gly Gly Trp Arg His Lys Ala Val 760 765 770 ATC TAT AGG ACG TGG TGT AAG GGG TAC CAG GCA ATA CGC CAA CGG GTG 2645

He Tyr Arg Thr Trp Cys Lys Gly Tyr Gin Ala He Arg Gin Arg Val 775 780 785 790 GTG CGG AGC CCC CTC GGG GAG GGG CGG CCC ACC AAA CCC TTG ACG TTT 2693

Val Arg Ser Pro Leu Gly Glu Gly Arg Pro Thr Lys Pro Leu Thr Phe 795 800 805 GCT TGG TGC TTG GCC TCA TAC ATC TGG CCG GAT GCT GTG ATG ATG GTG 2741

Ala Trp Cys Leu Ala Ser Tyr He Trp Pro Asp Ala Val Met Met Val 810 815 820 GTG GTA GCC TTG GTG CTC CTC TTT GGC CTG TTC GAC GCG TTG GAC TGG 2789

Val Val Ala Leu Val Leu Leu Phe Gly Leu Phe Asp Ala Leu Asp Trp 825 830 835 ; ; GCT TTG GAG GAG CTC TTG GTG TCC CGG CCC TCG TTA CGG CGT CTG GCC 2837 ... Ala Leu Glu Glu Leu Leu Val Ser Arg Pro Ser Leu Arg Arg Leu Ala ,./ 840 845 850 ,·'/ CGG GTG GTT GAG TGC TGT GTG ATG GCG GGA GAG AAG GCC ACA ACC GTC 2885 . Arg Val Val Glu Cys Cys Val Met Ala Gly Glu Lys Ala Thr Thr Val 855 860 865 870 ,·,* CGG CTG GTC TCC AAG ATG TGC GCG AGA GGG GCC TAT TTG TTT GAC CAT 2933 ·*’ Arg Leu Val Ser Lys Met Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Phe Asp His / : 875 880 885 ATG GGC TCT TTT TCG CGC GCT GTC AAG GAG CGC CTG CTG GAG TGG GAC 2981 *· Met Gly Ser Phe Ser Arg Ala Val Lys Glu Arg Leu Leu Glu Trp Asp • 890 895 900 V * GCG GCT TTG GAA CCC CTG TCA TTC ACT AGG ACG GAC TGT CGC ATC ATT 3029 • Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Arg Thr Asp Cys Arg He He ·;··! 905 910 915 l“‘: AGA GAT GCT GCG AGG ACC TTG GCC TGC GGG CAG TGC GTC ATG GGC TTG 3077

Arg Asp Ala Ala Arg Thr Leu Ala Cys Gly Gin Cys Val Met Gly Leu . ' 920 925 930 CCT GTG GTA GCG CGC CGT GGT GAC GAG GTT CTT ATC GGT GTC TTT CAG 3125 • · Pro Val Val Ala Arg Arg Gly Asp Glu Val Leu He Gly Val Phe Gin 112249 278 935 940 945 950 GAT GTG AAC CAT TTG CCT CCC GGA TTC GTC CCG ACC GCA CCC GTT GTC 3173

Asp Val Asn His Leu Pro Pro Gly Phe Val Pro Thr Ala Pro Vai Val 955 960 965 ATC CGG CGG TGC GGG ÄAG GGG TTT CTG GGG GTC ACT AAG GCT GCC TTG 3221 lie Arg Arg Cys Gly Lys Gly Phe Leu Gly Val Thr Lys Ala Ala Leu 970 975 980 ACT GGT CGG GAT CCT GAC TTA CAT CCA GGG AAC GTC ATG GTG TTG GGG 3269

Thr Gly Arg Asp Pro Asp Leu His Pro Gly Asn Val Met Val Leu Gly 985 990 995 ACG GCT ACG TCG CGA AGC ATG GGG ACA TGC CTG AAC GGC CTG CTG TTC 3317

Thr Ala Thr Ser Arg Ser Met Gly Thr Cys Leu Asn Gly Leu Leu Phe 1000 1005 1010 ACG ACT TTC CAT GGG GCT TCA TCC CGA ACC ATC GCC ACG CCC GTG GGG 3365

Thr Thr Phe His Gly Ala Ser Ser Arg Thr lie Ala Thr Pro Val Gly 1015 1020 1025 1030 GCC CTT AAT CCC AGG TGG TGG TCC GCC AGT GAT GAC GTC ACG GTG TAC 3413

Ala Leu Asn Pro Arg Trp Trp Ser Ala Ser Asp Asp Val Thr Val Tyr 1035 1040 1045 CCG CTC CCG GAT GGG GCA ACC TCG TTG ACG CCC TGC ACT TGC CAG GCT 3461

Pro Leu Pro Asp Gly Ala Thr Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gin Ala 1050 1055 1060 GAG TCC TGT TGG GTC ATA CGG TCC GAC GGG GCT TTG TGC CAT GGC TTG 3509

Glu Ser Cys Trp Val lie Arg Ser Asp Gly Ala Leu Cys His Gly Leu 1065 1070 1075 AGT AAG GGA GAC AAG GTG GAG CTA GAT GTG GCC ATG GAG GTC TCA GAT 3557

Ser Lys Gly Asp Lys Val Glu Leu Asp Val Ala Met Glu Val Ser Asp 1080 1085 1090 TTC CGT GGC TCG TCC GGC TCA CCT GTC CTG TGC GAC GAG GGG CAC GCA 3605

Phe Arg Gly Ser Ser Gly Ser Pro Val Leu Cys Asp Glu Gly His Ala 1095 1100 1105 1110 GTA GGA ATG CTC GTG TCG GTG CTC CAC TCG GGT GGT CGG GTC ACC GCG 3653

Val Gly Met Leu Val Ser Val Leu His Ser Gly Gly Arg Val Thr Ala 1115 1120 1125 I * * GCT CGA TTC ACC AGG CCG TGG ACC CAG GTC CCA ACA GAT GCT AAG ACC 3701

Ala Arg Phe Thr Arg Pro Trp Thr Gin Val Pro Thr Asp Ala Lys Thr : 1130 1135 1140 ··· ACC ACT GAA CCC CCT CCG GTG CCG GCA AAG GGA GTT TTC AAG GAA GCC 3749 ··· Thr Thr Glu Pro Pro Pro val pro A^.a Lys Gly Val Phe Lys Glu Ala : : 1145 1150 1155 CCA CTG TTT ATG CCC ACG GGC GCA GGA AAG AGC ACG CGC GTC CCG TTG 3797

Pro Leu Phe Met Pro Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Arg Val Pro Leu 1160 1165 1170 GAG TAT GGC AAC ATG GGG CAC AAG GTC CTG ATT TTG AAC CCC TCG GTG 3845

Glu Tyr Gly Asn Met Gly His Lys Val Leu lie Leu Asn Pro Ser Val : i : 1175 1180 1185 1190 GCG ACA GTG AGG GCC ATG GGC CCT TAC ATG GAG CGA CTG GCG GGA AAA 3893 * * Ala Thr Val Arg Ala Met Gly Pro Tyr Met Glu Arg Leu Ala Gly Lys ···. 1195 1200 1205 CAT CCA AGT ATC TAC TGT GGC CAT GAC ACC ACT GCC TTC ACA AGG ATC 3941 ; ; : His Pro Ser lie Tyr Cys Gly His Asp Thr Thr Ala Phe Thr Arg lie ” ; 1210 1215 1220 it··· 112249 279 ACT GAT TCC CCC TTA ACG TAC TCT ACC TAT GGG AGG TTT CTG GCC AAC 3989

Thr Asp Ser Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ala Asn 1225 1230 1235 CCT AGG CAG ATG CTG CGA GGT GTG TCG GTG GTC ATT TGC GAT GAA TGC 4037

Pro Arg Gin Met Leu Arg Gly Vai Ser Vai Val lie Cys Asp Glu Cys 1240 1245 1250 CAC AGT CAT GAT TCC ACT GTG TTG TTG GGG ATT GGA CGG GTC CGG GAG 4085

His Ser His Asp Ser Thr Val Leu Leu Gly lie Gly Arg Val Arg Glu 1255 1260 1265 1270 CTG GCA CGA GAG TGT GGG GTG CAG CTT GTG CTC TAC GCC ACT GCC ACG 4133

Leu Ala Arg Glu Cys Gly Val Gin Leu Val Leu Tyr Ala Thr Ala Thr 1275 1280 1285 CCT CCT GGG TCC CCC ATG ACT CAG CAT CCG TCA ATC ATT GAG ACC AAA 4181

Pro Pro Gly Ser Pro Met Thr Gin His Pro Ser lie lie Glu Thr Lys 1290 1295 1300 TTG GAT GTG GGT GAG ATT CCC TTC TAT GGG CAT GGC ATA CCC CTC GAG 4229

Leu Asp Val Gly Glu lie Pro Phe Tyr Gly His Gly lie Pro Leu Glu 1305 1310 1315 CGG ATG CGG ACC GGT AGG CAC CTC GTA TTC TGC TAC TCT AAG GCA GAG 4277

Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Val Phe Cys Tyr Ser Lys Ala Glu 1320 1325 1330 TGT GAG CGG CTA GCC GGT CAG TTT TCT GCT AGG GGA GTT AAC GCC ATA 4325

Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gin Phe Ser Ala Arg Gly Val Asn Ala lie 1335 1340 1345 1350 GCC TAT TAC AGG GGA AAA GAC AGT TCT ATC ATC AAG GAC GGA GAT CTG 4373

Ala Tyr Tyr Arg Gly Lys Asp Ser Ser lie lie Lys Asp Gly Asp Leu 1355 1360 1365 GTG GTG TGC GCG ACC GAC GCG CTA TCC ACT GGA TAC ACT GGG AAC TTC 4421

Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Leu Ser Thr Gly Tyr Thr Gly Asn Phe 1370 1375 1380 GAT TCT GTC ACC GAC TGT GGG TTA GTG GTG GAG GAG GTC GTC GAG GTG 4469

Asp Ser Val Thr Asp Cys Gly Leu Val Val Glu Glu Val Val Glu Val 1385 1390 1395 t t w ί ACC CTT GAT CCC ACC ATT ACC ATC TCC CTG CGG ACA GTG CCC GCG TCG 4517

Thr Leu Asp Pro Thr lie Thr lie Ser Leu Arg Thr Val Pro Ala Ser ·.* 1400 1405 1410 I 1 •V GCA GAA CTG TCG ATG CAG AGA CGA GGA CGC ACG GGT AGA GGC AGG TCT 4565 I. Ala Glu Leu Ser Met Gin Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Ser ·>' 1415 1420 1425 1430 I » GGG CGC TAC TAC TAC GCC GGG GTC GGA AAG GCC CCC GCG GGT GTG GTG 4613 . Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Gly Val Gly Lys Ala Pro Ala Gly Val Val ‘ 1435 1440 1445 CGC TCG GGT CCT GTC TGG TCG GCG GTG GAG GCC GGA GTG ACC TGG TAT 4661 ’. Arg Ser Gly Pro Val Trp Ser Ala Val Glu Ala Gly Val Thr Trp Tyr *' 1450 1455 1460 t ( · GGA ATG GAA CCT GAC TTG ACA GCT AAC CTA TTG AGA CTT TAC GAC GAC 4709 ‘ , Gly Met Glu Pro Asp Leu Thr Ala Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Asp 1465 1470 1475 ( I * !(4,: TGC CCT TAC ACC GCA GCC GTC GCA GCT GAC ATC GGT GAA GCC GCG GTG 4757

Cys Pro Tyr Thr Ala Ala Val Ala Ala Asp lie Gly Glu Ala Ala Val 1480 1485 1490 I I > f i I » ,,,: TTT TTC TCC GGG CTA GCC CCG TTG AGG ATG CAT CCC GAT GTT AGC TGG 4805

Phe Phe Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Met His Pro Asp Val Ser Trp 112249 280 1495 1500 1505 1510 GCA AAA GTG CGC GGC GTC AAC TGG CCC CTC TTG GTG GGT GTT CAG CGG 4853

Ala Lys Vai Arg Gly Val Asn Trp Pro Leu Leu Vai Gly Val Gin Arg 1515 1520 1525 ACC ATG TGC CGG GAA ACA CTG TCT CCC GGA CCA TCG GAC GAC CCC CAA 4901

Thr Met Cys Arg Glu Thr Leu Ser Pro Gly Pro Ser Asp Asp Pro Gin 1530 1535 1540 TGG GCA GGT CTG AAG GGC CCG AAT CCT GTT CCA CTA CTG CTG AGG TGG 4949

Trp Ala Gly Leu Lys Gly Pro Asn Pro Val Pro Leu Leu Leu Arg Trp 1545 1550 1555 GGC AAT GAT TTA CCA TCA AAA GTG GCC GGC CAC CAC ATT GTT GAC GAC 4997

Gly Asn Asp Leu Pro Ser Lys Val Ala Gly His His lie Val Asp Asp 1560 1565 1570 CTG GTT CGT AGG CTT GGT GTG GCG GAG GGT TAT GTC CGC TGC GAT GCG 5045

Leu Val Arg Arg Leu Gly Val Ala Glu Gly Tyr Val Arg Cys Asp Ala 1575 1580 1585 1590 GGG CCG ATC TTA ATG GTC GGC CTC GCT ATC GCG GGG GGG ATG ATC TAC 5093

Gly Pro lie Leu Met Val Gly Leu Ala lie Ala Gly Gly Met lie Tyr 1595 1600 1605 GCA TCT TAC ACC GGG TCT TTA GTG GTG GTG ACA GAC TGG GAT GTA AAG 5141

Ala Ser Tyr Thr Gly Ser Leu Val Val Val Thr Asp Trp Asp Val Lys 1610 1615 1620 GGG GGT GGC AGC CCT CTT TAT CGG CAT GGA GAC CAG GCC ACG CCA CAG 5189

Gly Gly Gly Ser Pro Leu Tyr Arg His Gly Asp Gin Ala Thr Pro Gin 1625 1630 1635 CCG GTT GTG CAG GTC CCC CCG GTA GAC CAT CGG CCG GGG GGG GAG TCT 5237

Pro Val Val Gin Val Pro Pro Val Asp His Arg Pro Gly Gly Glu Ser 1640 1645 1650 GCG CCT TCG GAT GCC AAG ACA GTG ACA GAT GCG GTG GCG GCC ATC CAG 5285

Ala Pro Ser Asp Ala Lys Thr Val Thr Asp Ala Val Ala Ala lie Gin 1655 1660 1665 1670 GTG GAT TGC GAT TGG TCA GTC ATG ACC CTG TCG ATC GGG GAA GTG CTG 5333

Val Asp Cys Asp Trp Ser Val Met Thr Leu Ser lie Gly Glu Val Leu ; ; 1675 1680 1685 ,,/ TCC TTG GCT CAG GCT AAA ACA GCT GAG GCC TAC ACG GCA ACC GCC AAG 5381

Ser Leu Ala Gin Ala Lys Thr Ala Glu Ala Tyr Thr Ala Thr Ala Lys ,*/ 1690 1695 1700 * ,,,!** TGG CTC GCT GGC TGC TAC ACG GGG ACG CGG GCC GTT CCC ACT GTT TCA 5429

Trp Leu Ala Gly Cys Tyr Thr Gly Thr Arg Ala Val Pro Thr Val Ser ;,· 1705 1710 1715 * i » I : : ATT GTT GAC AAG CTC TTT GCC GGA GGG TGG GCG GCT GTG GTT GGC CAC 5477 lie Val Asp Lys Leu Phe Ala Gly Gly Trp Ala Ala Val Val Gly His 1720 1725 1730 : t , “’· TGT CAC AGC GTC ATA GCT GCG GCG GTG GCT GCC TAC GGG GCT TCC AGG 5525 ;*. Cys His Ser Val lie Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Gly Ala Ser Arg '.· * 1735 1740 1745 1750 ':·* AGT CCG CCG TTG GCA GCC GCG GCT TCC TAC CTG ATG GGA CTG GGC GTC 5573 , Ser Pro Pro Leu Ala Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Met Gly Leu Gly Val I 1755 1760 1765 I » * . ‘.t GGA GGC AAC GCT CAG ACG CGT TTG GCG TCT GCC CTC CTG TTG GGG GCC 5621 I,; ; Gly Gly Asn Ala Gin Thr Arg Leu Ala Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ala 1770 1775 1780 » · M1 1 12249 GCT GGC ACC GCC CTG GGC ACT CCC GTC GTG GGT TTA ACC ATG GCG GGG 5669

Ala Gly Thr Ala Leu Gly Thr Pro Vai Val Gly Leu Thr Met Ala Gly 1785 1790 1795 GCG TTC ATG GGG GGT GCT AGC GTC TCT CCC TCC TTG GTC ACC ATC TTG 5717

Ala Phe Met Gly Gly Ala Ser Val Ser Pro Ser Leu Val Thr lie Leu 1800 1805 1810 TTG GGG GCC GTG GGA GGC TGG GAG GGC GTC GTC AAC GCT GCT AGC CTT 5765

Leu Gly Ala Val Gly Gly Trp Glu Gly Val Val Asn Ala Ala Ser Leu 1815 1820 1825 1830 GTC TTT GAC TTC ATG GCG GGG AAA CTA TCG TCA GAA GAT CTG TGG TAC 5813

Val Phe Asp Phe Met Ala Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Leu Trp Tyr 1835 1840 1845 GCC ATC CCA GTG CTC ACC AGC CCG GGG GCG GGC CTT GCG GGG ATC GCC 5861

Ala lie Pro Val Leu Thr Ser Pro Gly Ala Gly Leu Ala Gly lie Ala 1850 1855 1860 CTT GGG TTG GTG CTG TAC TCA GCT AAC AAC TCT GGT ACT ACC ACT TGG 5909

Leu Gly Leu Val Leu Tyr Ser Ala Asn Asn Ser Gly Thr Thr Thr Trp 1865 1870 1875 TTG AAC CGT CTG CTG ACT ACG TTA CCT AGG TCT TCT TGC ATC CCT GAC 5957

Leu Asn Arg Leu Leu Thr Thr Leu Pro Arg Ser Ser Cys lie Pro Asp 1880 1885 1890 AGC TAT TTC CAA CAG GCC GAT TAC TGT GAC AAG GTC TCG GCC GTG CTT 6005

Ser Tyr Phe Gin Gin Ala Asp Tyr Cys Asp Lys Val Ser Ala Val Leu 1895 1900 1905 1910 CGC CGA CTG AGC CTC ACC CGC ACT GTG GTG GCC CTA GTC AAT AGG GAA 6053

Arg Arg Leu Ser Leu Thr Arg Thr Val Val Ala Leu Val Asn Arg Glu 1915 1920 1925 CCC AAG GTG GAC GAG GTA CAG GTG GGG TAC GTC TGG GAT CTC TGG GAG 6101

Pro Lys Val Asp Glu Val Gin Val Gly Tyr Val Trp Asp Leu Trp Glu 1930 1935 1940 TGG ATC ATG CGT CAA GTG CGC ATG GTC ATG GCC AGG CTC CGG GCT CTC 6149

Trp lie Met Arg Gin Val Arg Met Val Met Ala Arg Leu Arg Ala Leu 1945 1950 1955 * · ··. TGC CCC GTG GTG TCA CTG CCT TTG TGG CAC TGC GGG GAG GGG TGG TCC 6197 ,.· Cys Pro Val Val Ser Leu Pro Leu Trp His Cys Gly Glu Gly Trp Ser ,·, 1960 1965 1970 ,:. GGA GAG TGG TTG TTG GAC GGC CAT GTG GAG AGT CGC TGT CTT TGC GGG 6245 ..I Gly Glu Trp Leu Leu Asp Gly His Val Glu Ser Arg Cys Leu Cys Gly .·, 1975 1980 1985 1990 • ♦ < » · *:*. TGC GTG ATC ACC GGC GAT GTT TTC AAT GGG CAA CTC AAA GAG CCA GTT 6293 · Cys Val lie Thr Gly Asp Val Phe Asn Gly Gin Leu Lys Glu Pro Val 1995 2000 2005 TAC TCT ACA AAG TTG TGC CGG CAC TAT TGG ATG GGG ACC GTT CCT GTG 6341

Tyr Ser Thr Lys Leu Cys Arg His Tyr Trp Met Gly Thr Val Pro Val 2010 2015 2020 * , AAC ATG CTG GGT TAC GGC GAA ACA TCA CCC CTC TTG GCC TCT GAC ACC 6389

Asn Met Leu Gly Tyr Gly Glu Thr Ser Pro Leu Leu Ala Ser Asp Thr 2025 2030 2035 CCG AAG GTG GTG CCT TTT GGG ACG TCG GGC TGG GCT GAG GTG GTG GTG 6437 • ,·, Pro Lys Val Val Pro Phe Gly Thr Ser Gly Trp Ala Glu Val Val Val ; 2040 2045 2050 ACC CCT ACC CAC GTG GTG ATC AGG AGA ACC TCT CCC TAC GAG TTG CTG 6485

Thr Pro Thr His Val Val lie Arg Arg Thr Ser Pro Tyr Glu Leu Leu 282 1 1 2 2 4 9 2055 2060 2065 2070 CGC CAA CAA ATC CTA TCA GCT GCA GTT GCT GAG CCC TAT TAT GTC GAC 6533

Arg Gin Gin lie Leu Ser Ala Ala Val Ala Glu Pro Tyr Tyr Val Asp 2075 2080 2085 GGC ATA CCG GTC TCA TGG GAC GCG GAC GCT CGT GCG CCT GCT ATG GTT 6581

Gly He Pro Val Ser Trp Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Val 2090 2095 2100 TAT GGC CCT GGG CAA AGT GTT ACC ATT GAC GGG GAG CGC TAC ACC CTG 6629

Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Val Thr He Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu 2105 2110 2115 CCG CAT CAA CTG CGG CTC AGG AAT GTA GCG CCC TCT GAG GTT TCA TCC 6677

Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val Ser Ser 2120 2125 2130 GAG GTG TCC ATA GAC ATT GGG ACG GAG ACT GAA GAC TCA GAA CTG ACT 6725

Glu Val Ser He Asp He Gly Thr Glu Thr Glu Asp Ser Glu Leu Thr 2135 2140 2145 2150 GAG GCC GAC CTG CCG CCG GCA GCT GCA GCC CTC CAG GCT ATC GAG AAT 6773

Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Leu Gin Ala He Glu Asn 2155 2160 2165 GCT GCG AGG ATT CTT GAG CCT CAT ATT GAT GTC ATC ATG GAG GAT TGC 6821

Ala Ala Arg He Leu Glu Pro His He Asp Val He Met Glu Asp Cys 2170 2175 2180 AGT ACA CCC TCT CTT TGT GGT AGT AGC CGA GAG ATG CCT GTG TGG GGA 6869

Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg Glu Met Pro Val Trp Gly 2185 2190 2195 GAA GAC ATC CCC CGC ACT CCA TCG CCA GCA CTT ATC TCG GTT ACC GAG 6917

Glu Asp He Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala Leu He Ser Val Thr Glu 2200 2205 2210 AGC AGC TCA GAT GAG AAG ACC CCG TCG GTG TCC TCC TCG CAG GAG GAT 6965

Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Gin Glu Asp 2215 2220 2225 2230 ACC CCG TCC TCT GAC TCA TTC GAA GTC ATC CAA GAG TCT GAG ACA GCT 7013 : : Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Val He Gin Glu Ser Glu Thr Ala ··. 2235 2240 2245 ,·. GAA GGA GAG GAA AGT GTC TTC AAC GTG GCT CTT TCC GTA CTA GAA GCC 7061 .Glu Gly Glu Glu Ser Val Phe Asn Val Ala Leu Ser Val Leu Glu Ala .:. 2250 2255 2260 TTG TTT CCA CAG AGT GAT GCC ACT AGA AAG CTT ACC GTC AGG ATG AAT 7109

Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys Leu Thr Val Arg Met Asn ·;·. 2265 2270 2275 TGC TGC GTT GAG AAG AGC GTC ACG CGC TTC TTT TCT TTG GGG CTG ACG 7157

Cys Cys Val Glu Lys Ser Val Thr Arg Phe Phe Ser Leu Gly Leu Thr 2280 2285 2290 • · ,·;·. GTG GCT GAT GTG GCC AGT CTG TGT GAG ATG GAG ATC CAG AAC CAT ACA 7205

Val Ala Asp Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Glu He Gin Asn His Thr ’ . 2295 2300 2305 2310 I ♦ ... GCC TAT TGT GAC AAG GTG CGC ACT CCG CTC GAA TTG CAA GTT GGG TGC 7253 I : Ala Tyr Cys Asp Lys Val Arg Thr Pro Leu Glu Leu Gin Val Gly Cys 2315 2320 2325

• I

1 TTG GTG GGC AAT GAA CTT ACC TTT GAA TGT GAT AAG TGT GAG GCT AGG 7301 ,.,.: Leu Val Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys Asp Lys Cys Glu Ala Arg ' ’ 2330 2335 2340 112249 283 CAA GAG ACT TTG GCC TCC TTC TCC TAT ATT TGG TCT GGG GTG CCA TTG 7349

Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr Ile Trp Ser Gly Val Pro Leu 2345 2350 2355 ACT AGG GCC ACA CCG GCT AAA CCA CCT GTG GTG AGG CCG GTG GGG TCC 7397

Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro Val Val Arg Pro Val Gly Ser 2360 2365 2370 TTG TTG GTG GCT GAC ACC ACG AAA GTG TAT GTC ACA AAC CCG GAC AAT 7445

Leu Leu Val Ala Asp Thr Thr Lys Val Tyr Val Thr Asn Pro Asp Asn 2375 2380 2385 2390 GTT GGG AGA AGA GTG GAC AAG GTG ACC TTC TGG CGC GCC CCC AGG GTC 7493

Val Gly Arg Arg Val Asp Lys Val Thr Phe Trp Arg Ala Pro Arg Val 2395 2400 2405 CAT GAC AAA TAT CTC GTG GAC TCC ATC GAG CGT GCC AGG AGG GCG GCT 7541

His Asp Lys Tyr Leu Val Asp Ser lie Glu Arg Ala Arg Arg Ala Ala 2410 2415 2420 CAA GCC TGC CAA AGC ATG GGT TAC ACT TAT GAG GAA GCA ATA AGG ACT 7589

Gin Ala Cys Gin Ser Met Gly Tyr Thr Tyr Glu Glu Ala lie Arg Thr 2425 2430 2435 GTT AGG CCA CAT GCT GCC ATG GGC TGG GGA TCT AAG GTG TCG GTC AAG 7637

Val Arg Pro His Ala Ala Met Gly Trp Gly Ser Lys Val Ser Val Lys 2440 2445 2450 GAC TTG GCC ACC CCT GCG GGG AAG ATG GCC GTC CAC GAC CGA CTT CAG 7685

Asp Leu Ala Thr Pro Ala Gly Lys Met Ala Val His Asp Arg Leu Gin 2455 2460 2465 2470 GAG ATA CTT GAG GGG ACT CCG GTC CCT TTT ACT CTT ACT GTG AAA AAG 7733

Glu lie Leu Glu Gly Thr Pro Val Pro Phe Thr Leu Thr Val Lys Lys 2475 2480 2485 GAG GTG TTC TTC AAA GAC CGT AAG GAG GAG AAG GCC CCC CGC CTC ATT 7781

Glu Val Phe Phe Lys Asp Arg Lys Glu Glu Lys Ala Pro Arg Leu lie 2490 2495 2500 GTG TTC CCC CCC CTG GAC TTC CGG ATA GCT GAG AAG CTT ATC CTG GGA 7829

Val Phe Pro Pro Leu Asp Phe Arg lie Ala Glu Lys Leu lie Leu Gly . 2505 2510 2515 GAC CCG GGG CGG GTG GCC AAG GCG GTG TTG GGG GGG GCT TAC GCC TTC 7877 : Asp Pro Gly Arg Val Ala Lys Ala Val Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Phe 2520 2525 2530 ' I CAG TAC ACC CCA AAT CAG CGA GTT AAG GAG ATG CTC AAA CTG TGG GAG 7925 *;* Gin Tyr Thr Pro Asn Gin Arg Val Lys Glu Met Leu Lys Leu Trp Glu 2535 2540 2545 2550 ::: TCA AAG AAA ACA CCT TGC GCC ATC TGT GTG GAC GCC ACT TGC TTC GAC 7973 I Ser Lys Lys Thr Pro Cys Ala lie Cys Val Asp Ala Thr Cys Phe Asp 2555 2560 2565 AGT AGC ATT ACT GAA GAG GAC GTG GCG CTG GAG ACA GAG CTG TAC GCT 8021

Ser Ser lie Thr Glu Glu Asp Val Ala Leu Glu Thr Glu Leu Tyr Ala 2570 2575 2580 CTG GCC TCT GAC CAT CCA GAG TGG GTG CGA GCT TTG GGG AAG TAC TAT 8069

Leu Ala Ser Asp His Pro Glu Trp Val Arg Ala Leu Gly Lys Tyr Tyr • · 2585 2590 2595 » ♦ GCC TCA GGA ACC ATG GTC ACC CCT GAG GGG GTT CCC GTA GGT GAG AGG 8117 , Ala Ser Gly Thr Met Val Thr Pro Glu Gly Val Pro Val Gly Glu Arg : : : 2600 2605 2610 TAT TGT AGA TCC TCA GGC GTT TTG ACT ACC AGC GCG AGT AAC TGC CTG 8165

Tyr Cys Arg Ser Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Ala Ser Asn Cys Leu 284 1 12249 2615 2620 2625 2630 ACC TGC TAC ATC AAG GTG AAA GCC GCT TGT GAG AGA GTG GGG CTG AAA 8213

Thr Cys Tyr Ile Lys Vai Lys Ala Ala Cys Glu Arg Val Gly Leu Lys 2635 2640 2645 AAT GTC TCG CTT CTC ATA GCC GGC GAT GAC TGT TTG ATC ATA TGC GAA 8261

Asn Val Ser Leu Leu lie Ala Gly Asp Asp Cys Leu lie lie Cys Glu 2650 2655 2660 CGG CCA GTG TGC GAC CCT TGT GAC GCC TTG GGC AGA GCC CTG GCG AGC 8309

Arg Pro Val Cys Asp Pro Cys Asp Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ala Ser 2665 2670 2675 TAT GGG TAT GCT TGC GAG CCT TCG TAT CAT GCA TCA CTG GAC ACG GCC 8357

Tyr Gly Tyr Ala Cys Glu Pro Ser Tyr His Ala Ser Leu Asp Thr Ala 2680 2685 2690 CCC TTC TGC TCC ACT TGG CTC GCT GAG TGC AAC GCA GAT GGG AAA CGC 8405

Pro Phe Cys Ser Thr Trp Leu Ala Glu Cys Asn Ala Asp Gly Lys Arg 2695 2700 2705 2710 CAT TTC TTC CTG ACC ACG GAC TTT CGG AGG CCG CTT GCT CGC ATG TCG 8453

His Phe Phe Leu Thr Thr Asp Phe Arg Arg Pro Leu Ala Arg Met Ser 2715 2720 2725 AGC GAG TAT AGT GAC CCA ATG GCT TCG GCC ATA GGT TAC ATC CTC CTG 8501

Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Met Ala Ser Ala lie Gly Tyr lie Leu Leu 2730 2735 2740 TAT CCC TGG CAT CCC ATC ACA CGG TGG GTC ATC ATC CCT CAT GTG CTA 8549

Tyr Pro Trp His Pro lie Thr Arg Trp Val lie lie Pro His Val Leu 2745 2750 2755 ACG TGC GCA TTC AGG GGT GGT GGT ACA CCG TCT GAT CCG GTT TGG TGT 8597

Thr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Gly Thr Pro Ser Asp Pro Val Trp Cys 2760 2765 2770 CAG GTG CAT GGT AAC TAC TAC AAG TTT CCA CTG GAC AAA CTG CCT AAC 8645

Gin Val His Gly Asn Tyr Tyr Lys Phe Pro Leu Asp Lys Leu Pro Asn 2775 2780 2785 2790 ,·, ATC ATC GTG GCC CTC CAC GGA CCA GCA GCG TTG AGG GTT ACC GCA GAC 8693 ! : Ile He Val Ala Leu His Gly Pro Ala Ala Leu Arg Val Thr Ala Asp *·. 2795 2800 2805 . ,·, ACA ACT AAG ACA AAA ATG GAA GCT GGG AAG GTG CTG AGT GAC CTC AAG 8741

Thr Thr Lys Thr Lys Met Glu Ala Gly Lys Val Leu Ser Asp Leu Lys ,:. 2810 2815 2820 , ,·. CTC CCT GGC CTA GCG GTC CAC CGA AAG AAG GCC GGA GCA CTG CGA ACA 8789

Leu Pro Gly Leu Ala Val His Arg Lys Lys Ala Gly Ala Leu Arg Thr ;·. 2825 2830 2835 CGC ATG CTT CGG TCG CGC GGT TGG GCC GAG TTG GCG AGG GGC CTG TTG 8837

Arg Met Leu Arg Ser Arg Gly Trp Ala Glu Leu Ala Arg Gly Leu Leu 2840 2845 2850 ;·, TGG CAT CCA GGC CTC CGG CTC CCT CCC CCT GAG ATT GCT GGT ATC CCG 8885 ’ Trp His Pro Gly Leu Arg Leu Pro Pro Pro Glu He Ala Gly He Pro 1 . 2855 2860 2865 2870

i I

,,. GGG GGT TTC CCC CTC TCC CCC CCC TAC ATG GGG GTG GTG CAT CAA TTG 8933 : Gly Gly Phe Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Met Gly Val Val His Gin Leu 2875 2880 2885 :.i : GAT TTT ACA AGC CAG AGG AGT CGC TGG CGG TGG CTG GGG TTC TTA GCC 8981 ,,,,; Asp Phe Thr Ser Gin Arg Ser Arg Trp Arg Trp Leu Gly Phe Leu Ala ’ ’ 2890 2895 2900 112249 285 CTG CTC ATC GTA GCC CTC TTC GGG TGAACTAAAT TCATCTGTTG CGGCAAGGTC 9035

Leu Leu Ile Val Ala Leu Phe Gly 2905 2910 CAGTGACTGA TCATCACTGG AGGAGGTTCC CGCCCTCCCC GCCCCAGGGG TCTCCCCGCT 9095 GGGTAAAA 9103 (2) SEKVENSSIN ID NO:183 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2910 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:183:

Met Ser Leu Leu Thr Asn Arg Leu Ser Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin 15 10 15

Trp Gly Pro Gly Phe Met Gly Lys Asp Pro Lys Pro Cys Pro Ser Arg 20 25 30

Arg Thr Gly Lys Cys Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser 35 40 45

Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Leu 50 55 60

Pro Tyr Thr Ile Met Glu Ala Leu Leu Phe Leu Leu Gly Vai Glu Ala 65 70 75 80

Gly Ala Ile Leu Ala Pro Ala Thr His Ala Cys Arg Ala Asn Gly Gin 85 90 95

Tyr Phe Leu Thr Asn Cys Cys Ala Pro Glu Asp Ile Gly Phe Cys Leu 100 105 110

Glu Gly Gly Cys Leu Vai Ala Leu Gly Cys Thr Vai Cys Thr Asp Arg ,·. 115 120 125 I · » · ··, Cys Trp Pro Leu Tyr Gin Ala Gly Leu Ala Vai Arg Pro Gly Lys Ser 130 135 140 *

Ala Ala Gin Leu Vai Gly Gin Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Pro Leu Ser 145 150 155 160 , ,·. Vai Ser Ala Tyr Vai Ala Gly Ile Leu Gly Leu Gly Glu Vai Tyr Ser 165 170 175 *' * Gly Vai Leu Thr Vai Gly Vai Ala Leu Thr Arg Arg Vai Tyr Pro Met 180 185 190

Pro Asn Leu Thr Cys Ala Vai Glu Cys Glu Leu Lys Trp Glu Ser Glu ’ ·’ 195 200 205 . ‘ ' Phe Trp Arg Trp Thr Glu Gin Leu Ala Ser Asn Tyr Trp Ile Leu Glu • , 210 215 220 ... Tyr Leu Trp Lys Vai Pro Phe Asp Phe Trp Arg Gly Vai Leu Ser Leu t 225 230 235 240 : .·. Thr Pro Leu Leu Vai Cys Vai Ala Ala Leu Leu Leu Leu Glu Gin Arg : 245 250 255 : ’ Ile Vai Met Vai Phe Leu Leu Vai Thr Met Ala Gly Met Ser Gin Gly 260 265 270 112249 286

Ala Pro Ala Ser Val Leu Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Gly Leu Thr 275 280 285

Trp Gin Ser Cys Ser Cys Arg Ala Asn Gly Ser Arg Tyr Thr Thr Gly 290 295 300

Glu Lys Val Trp Asp Arg Gly Asn Val Thr Leu Leu Cys Asp Cys Pro 305 310 315 320

Asn Gly Pro Trp Val Trp Leu Pro Ala Phe Cys Gin Ala lie Gly Trp 325 330 335

Gly Asp Pro lie Thr His Trp Ser His Gly Gin Asn Arg Trp Pro Leu 340 345 350

Ser Cys Pro Gin Tyr Val Tyr Gly Ser Val Ser Val Thr Cys Val Trp 355 360 365

Gly Ser Val Ser Trp Phe Ala Ser Thr Gly Gly Arg Asp Ser Lys lie 370 375 380

Asp Val Trp Ser Leu Val Pro Val Gly Ser Ala Ser Cys Thr lie Ala 385 390 395 400

Ala Leu Gly Ser Ser Asp Arg Asp Thr Val Val Glu Leu Ser Glu Trp 405 410 415

Gly Val Pro Cys Ala Thr Cys lie Leu Asp Arg Arg Pro Ala Ser Cys 420 425 430

Gly Thr Cys Val Arg Asp Cys Trp Pro Glu Thr Gly Ser Val Arg Phe 435 440 445

Pro Phe His Arg Cys Gly Ala Gly Pro Lys Leu Thr Lys Asp Leu Glu 450 455 460

Ala Val Pro Phe Val Asn Arg Thr Thr Pro Phe Thr lie Arg Gly Pro 465 470 475 480

Leu Gly Asn Gin Gly Arg Gly Asn Pro Val Arg Ser Pro Leu Gly Phe 485 490 495 , Gly Ser Tyr Ala Met Thr Lys lie Arg Asp Ser Leu His Leu Val Lys : : 500 505 510 I * Ϊ Cys Pro Thr Pro Ala lie Glu Pro Pro Thr Gly Thr Phe Gly Phe Phe 515 520 525

Pro Gly Val Pro Pro Leu Asn Asn Cys Leu Leu Leu Gly Thr Glu Val :* 530 535 540 - > · ’ : Ser Glu Ala Leu Gly Gly Ala Gly Leu Thr Gly Gly Phe Tyr Glu Pro 545 550 555 560

Leu Val Arg Arg Arg Ser Glu Leu Met Gly Arg Arg Asn Pro Val Cys 565 570 575

Pro Gly Phe Ala Trp Leu Ser Ser Gly Arg Pro Asp Gly Phe lie His _ 580 585 590 I · . Val Gin Gly His Leu Gin Glu Val Asp Ala Gly Asn Phe lie Pro Pro ....: 595 600 605 l‘··. Pro Arg Trp Leu Leu Leu Asp Phe Val Phe Val Leu Leu Tyr Leu Met ·;·* 610 615 620 I : · Lys Leu Ala Glu Ala Arg Leu Val Pro Leu lie Leu Leu Leu Leu Trp . 625 630 635 640

Trp Trp Val Asn Gin Leu Ala Val Leu Gly Leu Pro Ala Val Asp Ala 287 1 12249 645 650 655

Ala Vai Ala Gly Glu Vai Phe Ala Gly Pro Ala Leu Ser Trp Cys Leu 660 665 670

Gly Leu Pro Thr Vai Ser Met Ile Leu Gly Leu Ala Asn Leu Vai Leu 675 680 685

Tyr Phe Arg Trp Met Gly Pro Gin Arg Leu Met Phe Leu Vai Leu Trp 690 695 700

Lys Leu Ala Arg Gly Ala Phe Pro Leu Ala Leu Leu Met Gly Ile Ser 705 710 715 720

Ala Thr Arg Gly Arg Thr Ser Vai Leu Gly Ala Glu Phe Cys Phe Asp 725 730 735

Vai Thr Phe Glu Vai Asp Thr Ser Vai Leu Gly Trp Vai Vai Ala Ser 740 745 750

Vai Vai Ala Trp Ala Ile Ala Leu Leu Ser Ser Met Ser Ala Gly Gly 755 760 765

Trp Arg His Lys Ala Vai Ile Tyr Arg Thr Trp Cys Lys Gly Tyr Gin 770 775 780

Ala Ile Arg Gin Arg Vai Vai Arg Ser Pro Leu Gly Glu Gly Arg Pro 785 790 795 800

Thr Lys Pro Leu Thr Phe Ala Trp Cys Leu Ala Ser Tyr Ile Trp Pro 805 810 815

Asp Ala Vai Met Met Vai Vai Vai Ala Leu Vai Leu Leu Phe Gly Leu 820 825 830

Phe Asp Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Vai Ser Arg Pro 835 840 845

Ser Leu Arg Arg Leu Ala Arg Vai Vai Glu Cys Cys Vai Met Ala Gly 850 855 860

Glu Lys Ala Thr Thr Vai Arg Leu Vai Ser Lys Met Cys Ala Arg Gly 865 870 875 880 * a

Ala Tyr Leu Phe Asp His Met Gly Ser Phe Ser Arg Ala Vai Lys Glu 885 890 895 ’ ' Arg Leu Leu Glu Trp Asp Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Arg ! 900 905 910 < · ♦ *

Thr Asp Cys Arg Ile Ile Arg Asp Ala Ala Arg Thr Leu Ala Cys Gly 915 920 925 ’· ' Gin Cys Vai Met Gly Leu Pro Vai Vai Ala Arg Arg Gly Asp Glu Vai ' 930 935 940

Leu Ile Gly Vai Phe Gin Asp Vai Asn His Leu Pro Pro Gly Phe Vai ' ·.. 945 950 955 960 112249 288

Ile Ala Thr Pro Vai Gly Ala Leu Asn Pro Arg Trp Trp Ser Ala Ser 1025 1030 1035 1040

Asp Asp Vai Thr Vai Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Ala Thr Ser Leu Thr 1045 1050 1055

Pro Cys Thr Cys Gin Ala Glu Ser Cys Trp Vai Ile Arg Ser Asp Gly 1060 1065 1070

Ala Leu Cys His Gly Leu Ser Lys Gly Asp Lys Vai Glu Leu Asp Vai 1075 1080 1085

Ala Met Glu Vai Ser Asp Phe Arg Gly Ser Ser Gly Ser Pro Vai Leu 1090 1095 1100

Cys Asp Glu Gly His Ala Vai Gly Met Leu Vai Ser Vai Leu His Ser 1105 1110 1115 1120

Gly Gly Arg Vai Thr Ala Ala Arg Phe Thr Arg Pro Trp Thr Gin Vai 1125 1130 1135

Pro Thr Asp Ala Lys Thr Thr Thr Glu Pro Pro Pro Vai Pro Ala Lys 1140 1145 1150

Gly Vai Phe Lys Glu Ala Pro Leu Phe Met Pro Thr Gly Ala Gly Lys 1155 1160 1165

Ser Thr Arg Vai Pro Leu Glu Tyr Gly Asn Met Gly His Lys Vai Leu 1170 1175 1180

Ile Leu Asn Pro Ser Vai Ala Thr Vai Arg Ala Met Gly Pro Tyr Met 1185 1190 1195 1200

Glu Arg Leu Ala Gly Lys His Pro Ser Ile Tyr Cys Gly His Asp Thr 1205 1210 1215

Thr Ala Phe Thr Arg Ile Thr Asp Ser Pro Leu Thr Tyr Ser Thr Tyr 1220 1225 1230

Gly Arg Phe Leu Ala Asn Pro Arg Gin Met Leu Arg Gly Vai Ser Vai 1235 1240 1245

Vai Ile Cys Asp Glu Cys His Ser His Asp Ser Thr Vai Leu Leu Gly 1250 1255 1260 I · ; Ile Gly Arg Vai Arg Glu Leu Ala Arg Glu Cys Gly Vai Gin Leu Vai 1265 1270 1275 1280 * * ; *

Leu Tyr Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Pro Met Thr Gin His Pro ·';* 1285 1290 1295 , j « i ' Ser Ile Ile Glu Thr Lys Leu Asp Vai Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly ;;; 1300 1305 1310 . · « » * His Gly Ile Pro Leu Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Vai Phe 1315 1320 1325

Cys Tyr Ser Lys Ala Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gin Phe Ser Ala 1330 1335 1340 i ’ > ;

Arg Gly Vai Asn Ala Ile Ala Tyr Tyr Arg Gly Lys Asp Ser Ser Ile 1345 1350 1355 1360 Φ t *-·, Ile Lys Asp Gly Asp Leu Vai Vai Cys Ala Thr Asp Ala Leu Ser Thr 1365 1370 1375 ; /: Gly Tyr Thr Gly Asn Phe Asp Ser Vai Thr Asp Cys Gly Leu Vai Vai ; ; 1380 1385 1390

Glu Glu Vai Vai Glu Vai Thr Leu Asp Pro Thr Ile Thr Ile Ser Leu 1395 1400 1405 112249 289 1 1

Arg Thr Vai Pro Ala Ser Ala Glu Leu Ser Met Gin Arg Arg Gly Arg 1410 1415 1420

Thr Gly Arg Gly Arg Ser Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Gly Val Gly Lys 1425 1430 1435 1440

Ala Pro Ala Gly Val Val Arg Ser Gly Pro Val Trp Ser Ala Val Glu 1445 1450 1455

Ala Gly Val Thr Trp Tyr Gly Met Glu Pro Asp Leu Thr Ala Asn Leu 1460 1465 1470

Leu Arg Leu Tyr Asp Asp Cys Pro Tyr Thr Ala Ala Val Ala Ala Asp 1475 1480 1485 lie Gly Glu Ala Ala Val Phe Phe Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Met 1490 1495 1500

His Pro Asp Val Ser Trp Ala Lys Val Arg Gly Val Asn Trp Pro Leu 1505 1510 1515 1520

Leu Val Gly Val Gin Arg Thr Met Cys Arg Glu Thr Leu Ser Pro Gly 1525 1530 1535

Pro Ser Asp Asp Pro Gin Trp Ala Gly Leu Lys Gly Pro Asn Pro Val 1540 1545 1550

Pro Leu Leu Leu Arg Trp Gly Asn Asp Leu Pro Ser Lys Val Ala Gly 1555 1560 1565

His His lie Val Asp Asp Leu Val Arg Arg Leu Gly Val Ala Glu Gly 1570 1575 1580

Tyr Val Arg Cys Asp Ala Gly Pro lie Leu Met Val Gly Leu Ala lie 1585 1590 1595 1600

Ala Gly Gly Met lie Tyr Ala Ser Tyr Thr Gly Ser Leu Val Val Val 1605 1610 1615 , . Thr Asp Trp Asp Val Lys Gly Gly Gly Ser Pro Leu Tyr Arg His Gly . : : 1620 1625 1630 *. · Asp Gin Ala Thr Pro Gin Pro Val Val Gin Val Pro Pro Val Asp His 1635 1640 1645 • « t I Arg Pro Gly Gly Glu Ser Ala Pro Ser Asp Ala Lys Thr Val Thr Asp 1650 1655 1660 J ' · Ala Val Ala Ala lie Gin Val Asp Cys Asp Trp Ser Val Met Thr Leu I'.'. 1665 1670 1675 1680 • · ·

Ser lie Gly Glu Val Leu Ser Leu Ala Gin Ala Lys Thr Ala Glu Ala 1685 1690 1695 : ’.-Tyr Thr Ala Thr Ala Lys Trp Leu Ala Gly Cys Tyr Thr Gly Thr Arg 1700 1705 1710

« t I

• Ala Val Pro Thr Val Ser lie Val Asp Lys Leu Phe Ala Gly Gly Trp 1715 1720 1725 .’"•Ala Ala Val Val Gly His Cys His Ser Val lie Ala Ala Ala Val Ala '···' 1730 1735 1740 : Älä Tyr Gly Ala Ser Arg Ser Pro Pro Leu Ala Ala Ala Ala Ser Tyr J.745 1750 1755 1760

Leu Met Gly Leu Gly Val Gly Gly Asn Ala Gin Thr Arg Leu Ala Ser 1765 1770 1775 112249 290

Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Thr Ala Leu Gly Thr Pro Vai Val 1780 1785 1790

Gly Leu Thr Met Ala Gly Ala Phe Met Gly Gly Ala Ser Val Ser Pro 1795 1800 1805

Ser Leu Val Thr lie Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Trp Glu Gly Val 1810 1815 1820

Val Asn Ala Ala Ser Leu Val Phe Asp Phe Met Ala Gly Lys Leu Ser 1825 1830 1835 1840

Ser Glu Asp Leu Trp Tyr Ala lie Pro Val Leu Thr Ser Pro Gly Ala 1845 1850 1855

Gly Leu Ala Gly lie Ala Leu Gly Leu Val Leu Tyr Ser Ala Asn Asn 1860 1865 1870

Ser Gly Thr Thr Thr Trp Leu Asn Arg Leu Leu Thr Thr Leu Pro Arg 1875 1880 1885

Ser Ser Cys lie Pro Asp Ser Tyr Phe Gin Gin Ala Asp Tyr Cys Asp 1890 1895 1900

Lys Val Ser Ala Val Leu Arg Arg Leu Ser Leu Thr Arg Thr Val Val 1905 1910 1915 1920

Ala Leu Val Asn Arg Glu Pro Lys Val Asp Glu Val Gin Val Gly Tyr 1925 1930 1935

Val Trp Asp Leu Trp Glu Trp lie Met Arg Gin Val Arg Met Val Met 1940 1945 1950

Ala Arg Leu Arg Ala Leu Cys Pro Val Val Ser Leu Pro Leu Trp His 1955 1960 1965

Cys Gly Glu Gly Trp Ser Gly Glu Trp Leu Leu Asp Gly His Val Glu 1970 1975 1980 . Ser Arg Cys Leu Cys Gly Cys Val lie Thr Gly Asp Val Phe Asn Gly : : 1985 1990 1995 2000 « · · * t · • Gin Leu Lys Glu Pro Val Tyr Ser Thr Lys Leu Cys Arg His Tyr Trp 2005 2010 2015 • · ! Met Gly Thr Val Pro Val Asn Met Leu Gly Tyr Gly Glu Thr Ser Pro 2020 2025 2030 • · Leu Leu Ala Ser Asp Thr Pro Lys Val Val Pro Phe Gly Thr Ser Gly .’!! 2035 2040 2045

Trp Ala Glu Val Val Val Thr Pro Thr His Vai Val He Arg Arg Thr 2050 2055 2060 : *·· Ser Pro Tyr Glu Leu Leu Arg Gin Gin He Leu Ser Ala Ala Val Ala ... 2065 2070 2075 2080 • · •

Glu Pro Tyr Tyr Val Asp Gly He Pro Val Ser Trp Asp Ala Asp Ala 2085 2090 2095 '"· Arg Ala Pro Ala Met Val Tyr Gly Pro Gly Gin Ser Val Thr He Asp '···' 2100 2105 2110 t ’ · Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn Val Ala ! 2115 2120 2125 I * * I t • »

Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Val Ser He Asp He Gly Thr Glu Thr 2130 2135 2140

Glu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala 112249 291 2145 2150 2155 2160

Leu Gin Ala Ile Glu Asn Ala Ala Arg Ile Leu Glu Pro His Ile Asp 2165 2170 2175

Vai Ile Met Glu Asp Cys Ser Thr Pro Ser Leu Cys Gly Ser Ser Arg 2180 2185 2190

Glu Met Pro Vai Trp Gly Glu Asp Ile Pro Arg Thr Pro Ser Pro Ala 2195 2200 2205

Leu Ile Ser Vai Thr Glu Ser Ser Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Vai 2210 2215 2220

Ser Ser Ser Gin Glu Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Glu Vai Ile 2225 2230 2235 2240

Gin Glu Ser Glu Thr Ala Glu Gly Glu Glu Ser Vai Phe Asn Vai Ala 2245 2250 2255

Leu Ser Vai Leu Glu Ala Leu Phe Pro Gin Ser Asp Ala Thr Arg Lys 2260 2265 2270

Leu Thr Vai Arg Met Asn Cys Cys Vai Glu Lys Ser Vai Thr Arg Phe 2275 2280 2285

Phe Ser Leu Gly Leu Thr Vai Ala Asp Vai Ala Ser Leu Cys Glu Met 2290 2295 2300

Glu Ile Gin Asn His Thr Ala Tyr Cys Asp Lys Vai Arg Thr Pro Leu 2305 2310 2315 2320

Glu Leu Gin Vai Gly Cys Leu Vai Gly Asn Glu Leu Thr Phe Glu Cys 2325 2330 2335

Asp Lys Cys Glu Ala Arg Gin Glu Thr Leu Ala Ser Phe Ser Tyr Ile 2340 2345 2350

Trp Ser Gly Vai Pro Leu Thr Arg Ala Thr Pro Ala Lys Pro Pro Vai 2355 2360 2365 * · · * * * # ,·*·, Vai Arg Pro Vai Gly Ser Leu Leu Vai Ala Asp Thr Thr Lys Vai Tyr ·...* 2370 2375 2380 V.* Vai Thr Asn Pro Asp Asn Vai Gly Arg Arg Vai Asp Lys Vai Thr Phe 2385 2390 2395 2400

Mil , Trp Arg Ala Pro Arg Vai His Asp Lys Tyr Leu Vai Asp Ser Ile Glu 2405 2410 2415 V ’ Arg Ala Arg Arg Ala Ala Gin Ala Cys Gin Ser Met Gly Tyr Thr Tyr 2420 2425 2430

Glu Glu Ala Ile Arg Thr Vai Arg Pro His Ala Ala Met Gly Trp Gly I " 2435 2440 2445 ‘ Ser Lys Vai Ser Vai Lys Asp Leu Ala Thr Pro Ala Gly Lys Met Ala 1 , 2450 2455 2460 ... Vai His Asp Arg Leu Gin Glu Ile Leu Glu Gly Thr Pro Vai Pro Phe : 2465 2470 2475 2480 ; Thr Leu Thr Vai Lys Lys Glu Vai Phe Phe Lys Asp Arg Lys Glu Glu : 2485 2490 2495 1 ' Lys Ala Pro Arg Leu Ile Vai Phe Pro Pro Leu Asp Phe Arg Ile Ala 2500 2505 2510

Glu Lys Leu Ile Leu Gly Asp Pro Gly Arg Vai Ala Lys Ala Vai Leu 2515 2520 2525 112249 292

Gly Gly Ala Tyr Ala Phe Gin Tyr Thr Pro Asn Gin Arg Val Lys Glu 2530 2535 2540

Met Leu Lys Leu Trp Glu Ser Lys Lys Thr Pro Cys Ala lie Cys Val 2545 2550 2555 2560

Asp Ala Thr Cys Phe Asp Ser Ser lie Thr Glu Glu Asp Val Ala Leu 2565 2570 2575

Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Leu Ala Ser Asp His Pro Glu Trp Val Arg 2580 2585 2590

Ala Leu Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Gly Thr Met Val Thr Pro Glu Gly 2595 2600 2605

Val Pro Val Gly Glu Arg Tyr Cys Arg Ser Ser Gly Val Leu Thr Thr 2610 2615 2620

Ser Ala Ser Asn Cys Leu Thr Cys Tyr lie Lys Val Lys Ala Ala Cys 2625 2630 2635 2640

Glu Arg Val Gly Leu Lys Asn Val Ser Leu Leu lie Ala Gly Asp Asp 2645 2650 2655

Cys Leu lie lie Cys Glu Arg Pro Val Cys Asp Pro Cys Asp Ala Leu 2660 2665 2670

Gly Arg Ala Leu Ala Ser Tyr Gly Tyr Ala Cys Glu Pro Ser Tyr His 2675 2680 2685

Ala Ser Leu Asp Thr Ala Pro Phe Cys Ser Thr Trp Leu Ala Glu Cys 2690 2695 2700

Asn Ala Asp Gly Lys Arg His Phe Phe Leu Thr Thr Asp Phe Arg Arg 2705 2710 2715 2720

Pro Leu Ala Arg Met Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Met Ala Ser Ala 2725 2730 2735 lie Gly Tyr lie Leu Leu Tyr Pro Trp His Pro lie Thr Arg Trp Val -·' : 2740 2745 2750 • ‘ ·«·" lie lie Pro His Val Leu Thr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Gly Thr Pro . 2755 2760 2765 .1. Ser Asp Pro Val Trp Cys Gin Val His Gly Asn Tyr Tyr Lys Phe Pro ’·- 2770 2775 2780 ···1 Leu Asp Lys Leu Pro Asn lie lie Val Ala Leu His Gly Pro Ala Ala *:1. 2785 2790 2795 2800 * 1 ♦

Leu Arg Val Thr Ala Asp Thr Thr Lys Thr Lys Met Glu Ala Gly Lys 2805 2810 2815 ' ’1 Val Leu Ser Asp Leu Lys Leu Pro Gly Leu Ala Val His Arg Lys Lys 2820 2825 2830

Ala Gly Ala Leu Arg Thr Arg Met Leu Arg Ser Arg Gly Trp Ala Glu 2835 2840 2845 ’ · Leu Ala Arg Gly Leu Leu Trp His Pro Gly Leu Arg Leu Pro Pro Pro 2850 2855 2860 ··» · Glu lie Ala Gly lie Pro Gly Gly Phe Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Met ...: 2865 2870 2875 2880

Gly Val Val His Gin Leu Asp Phe Thr Ser Gin Arg Ser Arg Trp Arg 2885 2890 2895

Trp Leu Gly Phe Leu Ala Leu Leu lie Val Ala Leu Phe Gly 293 1 12 2 4 9 2900 2905 2910 (2) SEKVENSSIN ID NO:184 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV5446IRT (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:184: CGGTCCCTCG AACTCCAGCG AGTCTTTTTT TTTTTTTTT 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:185 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 70 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: J I (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: GE-CAP T55806:sta ;>t· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:185: • · · Met Ser Leu Leu Thr Asn Arg Phe Ile Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin 1 5 10 15 . Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly Thr Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser Arg 20 25 30 V · Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser 35 40 45 >· Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly Ile Ser Leu ; '·· 50 55 60 1

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

· ·’ Phe Tyr Thr Ile Met Ala 65 70 (2) SEKVENSSIN ID NO:186 TIEDOT: , (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ;,· j (A) PITUUS: 401 emäsparia . (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·"· (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 294

11224V

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-S59 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:186: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGGGAA GGACCTCAAG 360 CCCTGCCCTT CCCGGTGGGG CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:187 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ’ (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-S368 variantti • · · « (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:187: t « · ; AGACGCAATG ACTCGGCGCC AACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 *·· AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 ! AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 CGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGAGAG GGACTCCAAG 360 tcctgccctt cccggtgggc cgggaaatgc atggggccac c 40l (2) SEKVENSSIN ID NO:188 TIEDOT: !...· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’*· ; (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen ·:··; (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei 295 1 12 2 49 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-S309 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:188: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC CTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCATGCGGCG AGAACGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GTCACGGGGA AGGACCCCGG 360 ATCCTGCCCT TCCCGGTGGG CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:189 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-FZ variantti . . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:189: • « « · · AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 * · “! AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 i * * ! AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 * t · ’’’! TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GCTACCCACC 240 ! TGGGCAAACG ACGCCCATGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GATTCGTCCG GCGAGTTGAC AAGGACCAGT GGGGGCCGGG GGCCTGGGGA AGGACCCCAG 360 ACCCTGCCCT TCCCGGTGGG ACGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 • * V : (2) SEKVENSSIN ID NO:190 TIEDOT: ;··; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ;·' (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen , (D) TOPOLOGIA: tuntematon

! (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei 112249 296 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G21 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:190: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGTCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGACC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGGGAA GGACCCCAAG 360 CCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:191 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G23 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:191: AGACGCAATG ACTCGGCGCC AACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 : AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCGCAG GTGTTGGCCC 180 >· TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACATCAGG CATGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCGCC 240 > TGGGCTAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GTTACGGGGA AGGACCCCGA 360 ACCCTGCCCT TCCCGGCGGA CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 : · (2) SEKVENSSIN ID NO:192 TIEDOT: } · t *, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (i>; (A) PITUUS: 405 emäsparia ‘ · (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon »

; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

I · · ';·· (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G59 variantti 112249 297 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:192: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGGG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACTGAGCCC GTAACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 GGATTATTCC CGGCGAGTTG GCAAGGACCA GTGGGGGCCG GGAGCTACAG AGAAGGACTC 360 TGAGCTCTGC CCTTCCCGGT GGAACGGGAA ATGCATGGGG CCACC 405 (2) SEKVENSSIN ID NO:193 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-E36 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:193: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 * * f f · AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGCCCACAG GTGTTGGCCC 180 » f * t · TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ACTACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCTACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 ’ I t "··’ GCTAAGCCGG CGAGTTGACA AAGACCAGTG GGGGCCGGGG GTCACAGGGA TGGACCCTGG 360 ( ACCCTGCCCT TCCCGGTGGA GTGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 ' i * (2) SEKVENSSIN ID NO:194 TIEDOT: ;'*f> (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ; (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-R38730 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:194: ,M 1Ί 2 2 4 9 298 AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGG ATCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTATCCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GTTCGTCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GTTGCGGGGA AGGACCCCGA 360 ACTCTGCCCT TCCCGGTGGG CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:195 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G281 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:195: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGTCC 180 * t ; TACCGGTGTG AATAAGGACC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 > TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 V,·' GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGGGAA GGACCCCAAG 360 CCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 I k ·

* t I

"" (2) SEKVENSSIN ID NO:196 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia ;> (B) TYYPPI: nukleiinihappo : '·· (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 1 * k

* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

f 4 « t ‘ / (iii) HYPOTEETTINEN: ei l » (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: if. (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G157 variantti * * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:196: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 112249 299 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGTGGCG AGACAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGACC GACACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGT GCTGGGGGAA GGACCCCCTT 360 GCACCGCCCT TCCCGGTGGG ACGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:197 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G154 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:197: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC CTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTAC GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGCTGGCCT 180 TACCGGTGTG AATAAAGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAGTAG 300 GTTTAACCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG CCTTGGAGAT GGACTCCAAG 360 ,···. TCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 , (2) SEKVENSSIN ID NO: 198 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo ‘.I.’ (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei * · · (iv) ANTI-SENSE: ei * (vi) ALKUPERÄ: ·;··: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G213 variantti (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 198: : .·. AGACGCAATG ACTCGGCGCC AACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 ....I AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGTCC 180 112249 300 TACCGGTGGG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ATGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GTTCGGGGAA GGACCCCGTA 360 CCCTGCCCTT CCCGGTGGAA CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:199 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G204 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:199: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTT AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCCTGGAGAG GGACTCCAGG 360 TCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 , * (2) SEKVENSSIN ID NO:200 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

I. * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

,* * (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ; '·· (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G191 variantti ( · · • (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:200: ‘ * t AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 *; AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC CTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 * · I.·. AAGGTTAAGG ATCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGCTA AACCGAGCCC GTATCCCACC 240 112249 301 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGAG GTTACGGGGA AGGACCCCGA 360 GCCTCGCCCT TCCCGGTGGG CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:201 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-G299 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:201: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGC ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 GAGTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGA GTCACGGGGA TGGACCCCGG 360 GCTCTGCCCT TCCCGGTGGA ACGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:202 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

;;; (iii) HYPOTEETTINEN: ei ' (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-T56957 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:202: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 « · AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 * · i AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 “· ; TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTACA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 112249 302 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GTCACAGGGA TGGACCCTGG 360 GCCCTGCCCT TCCCGGTGGG GTGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:203 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-C01698 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:203: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGAGAT GGACTCCAAG 360 TCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:204 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: , . (A) PITUUS: 402 emäsparia . · · (B) TYYPPI: nukleiinihappo ... (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen ! t '· (D) TOPOLOGIA: tuntematon *

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

” (lii) HYPOTEETTINEN: ei 11·<· (iv) ANTI-SENSE: ei >/· : (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-T27034 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N0:204: * · · AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 * · ; · · AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 f ‘ M * · AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATTTCCCGCC 240 * · : : : tgggctaacg acgcccacgt acggtccacg tcgcccttca atgtctctct tgaccaatag 300 • · · * GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGA GTCACTGGGA TGGACCCAGG 360 112249 303 GCTCTGCCCT TCCCGGCGGG GTGGGAAAAG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:205 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-E57963 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:205: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCGCAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGAGAA GGACTCCAAG 360 TCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:206 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen : (D) TOPOLOGIA: tuntematon

...· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

V,· (iii) HYPOTEETTINEN: ei ..!·* (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-R37166 variantti » · » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:206: ;·, AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 » t * « « · TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTAACCCGCC 240 Γ’ ·;* TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 :,· * GTTTAACCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG CCTTGGAGAT GGACTCCAAG 360 TCCTGCCCTT CCCGGCGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 112249 304 (2) SEKVENSSIN ID NO:207 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 404 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-B5 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:207: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTÄ GGTCGTAAAT CCCGGTCATC CTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 TGGGCTAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTTTGCC GGCGAGTTGA CAAGGACCAG TGGGGGCCGG GGGTTATGGG GAAGGACCCC 360 AAACCCTGCC CTTCCCGGTG GGCCGGGAAA TGCATGGGGC CACC 404 (2) SEKVENSSIN ID NO:208 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

• » (iii) HYPOTEETTINEN: ei , (iv) ANTI-SENSE: ei * » (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-B33 variantti l.i.' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:208: V ‘ AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC CTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 : ” AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 ’ TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTCCCCGCC 240 ;··· TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 Γ”'. GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG ATCATGGGGA AGGACCCCAG 360 • t t ; ATCCTGCCCT TCCCGGCGGG CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 ♦ · * * Φ · · · » ’ ' (2) SEKVENSSIN ID NO:209 TIEDOT: 305 112249 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-FH010 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:209: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGTGGCG AGACAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACTGAGACC GACACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTGGGGGAA GGACCCCCAG 360 TCCTGCCCTT CCCGGTGGGA CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:210 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei ; : (iv) ANTI-SENSE: ei • · (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-PNF2161 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:210: , AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 ,··.*. AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 I · · AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGGG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTTACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 ' . GCGTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGAGAG GGACTCCAAG 360 « · ... TCCCGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 t : I (2) SEKVENSSIN ID NO:211 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 306 1 12249 (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-JC variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:211: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGGG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTAACCCGCC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCGCTCT TGACCAATAG 300 GCTTAGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG TTTATGGGGA AGGACCCCAA 360 ACCCTGCCCT TCCCGGCGGA CCGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:212 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei : : (vi) ALKUPERÄ: '·. (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-7155 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:212: AGACGTTATG AACCGGCGCC GCCCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 * ( AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 » « · I*:·. GTGGTCAAGG TCCCTCTAGC GCTTGTGGCG AGAAAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATTATCCTCC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 .‘I’. GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGT GCCGGGGGAA GGACCCCCGG 360 • · ' . TACTGCCCCT CCCGGAGGAG TGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:213 TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 112249 307

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-7244 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:213: AGACGTTAAG AACCGGCGCC GCCCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 GTGGTCAAGG TCCCTCTGGC GCTTGTGGCG AGAAAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATTACCCTCC 240 TGGGCAAACG ACGCCCATGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGT GGCGGGGGAA GGACCCCCGT 360 CACTGCCCTT CCCGGAGGGG TGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:214 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-K27 variantti ' · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:214: '*··' AGACGTTAAG TACCGGCGCC GACCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 • · · **'·' AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 ···· TTGGTCAAGG TCCCTCTGGC GCTTGTGGCG AGAAAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 i : : ··· TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATTACCCACC 240 i 1 * ·’ ' TGGGCAAACA ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTACA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCTGGGC GGCGAGGGAA GGACCCTCGT 360 CGCTGCCCTT CCCGGCGGGG TGGGGAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:215 TIEDOT: ♦ * i · « ' ' * · ...f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *,,,· (A) PITUUS: 401 emäsparia • (B) TYYPPI: nukleiinihappo j (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen '·· · (D) TOPOLOGIA: tuntematon

’ * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

112249 308 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-K30 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:215: AGACGTTAAG AACCGGCGCC TTCCCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAGT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGGG 120 AGGGTTAAGG TCCCTCTGGC GCTTGTGGCG AGAAAGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ATTACCCACC 240 TGGGCAAACA ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTTTGCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCTGGGC GGTAGGGGAA GGACCCTTGC 360 CGCTGCCCTT CCCGGTGGGG TGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:216 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 401 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-T55875 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:216: ; : AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGACG AGACCGCGCA CGGTCCGCAG GTGTTGGCCC 180 t TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 ! . i. ’ TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 . · GTTTAACCGG CGAGTTGGCA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTTGGAGAG GGACTCCAAG 360 TCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 » t · * (2) SEKVENSSIN ID NO:217 TIEDOT: * . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia ... (B) TYYPPI: nukleiinihappo l : (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

i (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

' ‘ (iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 309 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-T56633 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:217: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC ACTACCCACC 240 TGGGCTAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGTCTCTCT TGACCAATAG 300 GCTAGTCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGAG GTCACAGGGA TGGACCCTGG 360 GCCTTGCCCT TCCCGGTGGA GTGGGAAAAG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:218 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 404 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-EB20 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:218: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 * * AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 ' ,,,* AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 » ',v TACCGGTGTA ATAAGGGCCC GACGTCAGGC TCGTCGTTAA ACCGAGCCCG TCACCCACCT 240 .,!·* GGGCAAACGA CGCCCACGTA CGGTCCACGT CGCCCTTCAA TGCCTCTCTT GGCCAATAGG 300 AGTTATCTCC GGCGAGTTGG CAAGGACCAG TGGGGGCCGG GGGTTACGGG GAAGGACCCC 360 I I · V : GAACCCTGCC CTTCCCGGTG GGCCGGGAAA TGCATGGGGC CACC 404 ;·, (2) SEKVENSSIN ID NO:219 TIEDOT: l · · ,·!*, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ‘(A) PITUUS: 401 emäsparia ’ , (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon » *

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

1 (iii) HYPOTEETTINEN: ei * (iv) ANTI-SENSE: ei 112249 310 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-T55806 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:219: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGCC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCATC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 TACCGGTGGA ATAAGGGCCC GACGTCAGGC TCGTCGTTAA ACCGAGCCCG TCACCCACCT 240 GGGCAAACGA CGCTCACGTA CGGTCCACGT CGCCCTTCAA TGTCTCTCTT GACCAATAGG 300 TTTATCCGGC GAGTTGACAA GGACCAGTGG GGGCCGGGGG TTACGGGGAC GGACCCCGAA 360 CCCTGCCCTT CCCGGTGGGC CGGGAAATGC ATGGGGCCAC C 401 (2) SEKVENSSIN ID NO:220 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-BG34 variantti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:220: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 .·' : AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCACAG GTGTTGGCCC 180 * TACCGGTGTG AATAAGGGCC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GTCACCCACC 240 * · TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 » * * · GAGTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGA GTCACGGGGA TGGACCCCGG 360 t · GCTCTGCCCT TCCCGGTGGA ACGGGAAACG CATGGGGCCA CC 402 I · • · (2) SEKVENSSIN ID NO:221 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * * (A) PITUUS: 402 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo » (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

I · % · *” (iii) HYPOTEETTINEN: ei » » (iv) ANTI-SENSE: ei ♦ (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-BE12 variantti 311 112249 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:221: AGACGCAATG ACTCGGCGCC GACTCGGCGA CCGGCCAAAA GGTGGTGGAT GGGTGATGAC 60 AGGGTTGGTA GGTCGTAAAT CCCGGTCACC TTGGTAGCCA CTATAGGTGG GTCTTAAGAG 120 AAGGTTAAGA TTCCTCTTGT GCCTGCGGCG AGACCGCGCA CGGTCCGCAG GTGTTGGTCC 180 TACCGGTGTG AATAAGGACC CGACGTCAGG CTCGTCGTTA AACCGAGCCC GCCACCCACC 240 TGGGCAAACG ACGCCCACGT ACGGTCCACG TCGCCCTTCA ATGCCTCTCT TGGCCAATAG 300 GTTTATCCGG CGAGTTGACA AGGACCAGTG GGGGCCGGGG GCTCCGGGGA AGAACCCCGA 360 GCCCCGCCCT TCCCGGTGGG ACGGGAAATG CATGGGGCCA CC 402 (2) SEKVENSSIN ID NO:222 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-etualuke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:222: CCAAAAGGTG GTGGATGGGT GATG 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:223 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ,·, (A) PITUUS: 24 emäsparia II (B) TYYPPI: nukleiinihappo ", (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: tuntematon

»V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

» (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei * « : V ' (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-etualuke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:223: « · GTGATGMCAG GGTTGGTAGG TCGT 24 » l * (2) SEKVENSSIN ID NO:224 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo >! ' (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ,,,.ϊ (D) TOPOLOGIA: tuntematon t 1

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

112249 312 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-etualuke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:224: GGTAGCCACT ATAGGTGGGT CTTAAG 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:225 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-käänteisaluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:225: GAGMGRCATT GWAGGGCGAC GTRGA 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:226 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

' (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ; (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-käänteisaluke 4 ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:226: : : GRCATTGWAG GGCGACGTRG A 21 ,, (2) SEKVENSSIN ID NO:227 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ! (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon » 4 *

'*··' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei 112249 313 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: HGV-käänteisaluke (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:227: CCCCACTGGT CYTTGYCAAC TC 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:228 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV75-36FE (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:228: GCGAGATCTA AAATGCAGGC CTGATGGGT 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:229 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei I · 1 (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GV75-7064RLE

. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:229: GCGAGATCTA AAATGTGGAC TGCTAAGCC 29 '···* (2) SEKVENSSIN ID NO: 230 TIEDOT: >' ‘ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 46 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen • (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · *

’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei : (vi) ALKUPERÄ:

··· · (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-28F

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:230: 112249 314 GCGAGATCTA AAATGGCAAG CCCCAGAAAC CGACGCCTAT CTAAGT 46 (2) SEKVENSSIN ID NO:231 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-2864R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:231: GGCATGATGA ATTCGCAACG AGGGCCGGGA CACCAAGAT 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:232 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-6439F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:232: Λ GCGAGATCTA AAATGGGCCT CCGACACCCC GAAGGTTGT 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:233 TIEDOT: ’ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo *. 1 : (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon > · ·

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke FV94-9331R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:233: GCGAGATCTG AATTCTTCCC GGGGTGCACC CCTTCAGAT 39 (2) SEKVENSSIN ID NO: 234 TIEDOT: 112249 315 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET s (A) PITUUS: 9327 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: 3ZHGV-6, HGV PNF2161:stä (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:234: GCAAGCCCCA GAAACCGACG CCTATCTAAG TAGACGCAAT GACTCGGCGC CGACTCGGCG 60 ACCGGCCAAA AGGTGGTGGA TGGGTGATGA CAGGGTTGGT AGGTCGTAAA TCCCGGTCAC 120 CTTGGTAGCC ACTATAGGTG GGTCTTAAGA GAAGGTTAAG ATTCCTCTTG TGCCTGCGGC 180 GAGACCGCGC ACGGTCCACA GGTGTTGGCC CTACCGGTGG GAATAAGGGC CCGACGTCAG 240 GCTCGTCGTT AAACCGAGCC CGTTACCCAC CTGGGCAAAC GACGCCCACG TACGGTCCAC 300 GTCGCCCTTC AATGTCTCTC TTGACCAATA GGCGTAGCCG GCGAGTTGAC AAGGACCAGT 360 GGGGGCCGGG GGCTTGGAGA GGGACTCCAA GTCCCGCCCT TCCCGGTGGG CCGGGAAATG 420 CATGGGGCCA CCCAGCTCCG CGGCGGCCTG CAGCCGGGGT AGCCCAAGAA TCCTTCGGGT 480 GAGGGCGGGT GGCATTTCCT TTTTCTATAC CATCATGGCA GTCCTTCTGC TCCTTCTCGT 540 GGTTGAGGCC GGGGCCATTC TGGCCCCGGC CACCCACGCT TGTCGAGCGA ATGGGCAATA 600 TTTCCTCACA AATTGTTGTG CCCCGGAGGA CATCGGGTTC TGCCTGGAGG GTGGATGCCT 660 GGTGGCCCTG GGGTGCACGA TTTGCACTGA CCAATGCTGG CCACTGTATC AGGCGGGTTT 720 GGCTGTGCGG CCTGGCAAGT CCGCGGCCCA ACTGGTGGGG GAGCTGGGTA GCCTATACGG 780 GCCCCTGTCG GTCTCGGCCT ATGTGGCTGG GATCCTGGGC CTGGGTGAGG TGTACTCGGG 840 ; TGTCCTAACG GTGGGAGTCG CGTTGACGCG CCGGATCTAC CCGGTGCCTA ACCTGACGTG 900 : TGCAGTCGCG TGTGAGTTAA AGTGGGAAAG TGAGTTTTGG AGATGGACTG AACAGCTGGC 960 ··· CTCCAACTAC TGGATTCTGG AATACCTCTG GAAGGTCCCA TTTGATTTCT GGAGAGGCGT 1020 GATAAGCCTG ACCCCCTTGT TGGTTTGCGT GGCCGCATTG CTGCTGCTTG AGCAACGGGT 1080 TGTCATGGTC TTCCTGTTGG TGACGATGGC CGGGATGTCG CAAGGCGCCC CTGCCTCCGT 1140 TTTGGGGTCA CGCCCCTTTG ACTACGGGTT GACTTGGCAG ACCTGCTCTT GCAGGGCCAA 1200 j *.· CGGTTCGCGT TTTTCGACTG GGGAGAAGGT GTGGGACCGT GGGAACGTTA CGCTTCAGTG 1260 : : · TGACTGCCCT AACGGCCCCT GGGTGTGGTT GCCAGCCTTT TGCCAAGCAA TCGGCTGGGG 1320 TGACCCCATC ACTTATTGGA GCCACGGGCA AAATCAGTGG CCCCTTTCAT GCCCCCAGTA 1380 ... TGTCTATGGG TCTGCTACAG TCACTTGCGT GTGGGGTTCC GCTTCTTGGT ATGCCTCCAC 1440 CAGTGGTCGC GACTCGAAGA TAGATGTGTG GAGTTTAGTG CCAGTTGGCT CTGCCACCTG 1500 ' CACCATAGCC GCACTTGGAT CATCGGATCG CGACACGGTG CCTGGGCTCT CCGAGTGGGG 1560 AATCCCGTGC GTGACGTGTG TTCTGGACCG TCGGCCTGCT TCATGCGGCA CCTGTGTGAG 1620 112249 316 GGACTGCTGG CCCGAGACCG GGTCGGTTAG GTTCCCATTC CATCGGTGCG GCGTGGGGCC 1680 TCGGCTGACA AAGGACTTGG AAGCTGTGCC CTTCGTCAAT AGGACAACTC CCTTCACCAT 1740 TAGGGGGCCC CTGGGCAACC AGGGCCGAGG CAACCCGGTG CGGTCGCCCT TGGGTTTTGG 1800 GTCCTACGCC ATGACCAGGA TCCGAGATAC CCTACATCTG GTGGAGTGTC CCACACCAGC 1860 CATCGAGCCT CCCACCGGGA CGTTTGGGTT CTTCCCCGGG ACGCCGCCTC TCAACAACTG 1920 CATGCTCTTG GGCACGGAAG TGTCCGAGGC ACTTGGGGGG GCTGGCCTCA CGGGGGGGTT 1980 CTATGAACCC CTGGTGCGCA GGTGTTCGGA GCTGATGGGA AGCCGAAATC CGGTTTGTCC 2040 GGGGTTTGCA TGGCTCTCTT CGGGCAGGCC TGATGGGTTT ATACATGTCC AGGGTCACTT 2100 GCAGGAGGTG GATGCAGGCA ACTTCATCCC GCCCCCGCGC TGGTTGCTCT TGGACTTTGT 2160 ATTTGTCCTG TTATACCTGA TGAAGCTGGC TGAGGCACGG TTGGTCCCGC TGATCTTGCT 2220 GCTGCTATGG TGGTGGGTGA ACCAGCTGGC AGTCCTAGGG CTGCCGGCTG TGGAAGCCGC 2280 CGTGGCAGGT GAGGTCTTCG CGGGCCCTGC CCTGTCCTGG TGTCTGGGAC TCCCGGTCGT 2340 CAGTATGATA TTGGGTTTGG CAAACCTGGT GCTGTACTTT AGATGGTTGG GACCCCAACG 2400 CCTGATGTTC CTCGTGTTGT GGAAGCTTGC TCGGGGAGCT TTCCCGCTGG CCCTCTTGAT 2460 GGGGATTTCG GCGACCCGCG GGCGCACCTC AGTGCTCGGG GCCGAGTTCT GCTTCGATGC 2520 TACATTCGAG GTGGACACTT CGGTGTTGGG CTGGGTGGTG GCCAATGTGG TAGCTTGGGC 2580 CATTGCGCTC CTGAGCTCGA TGAGCGCAGG GGGGTGGAGG CACAAAGCCG TGATCTATAG 2640 GACGTGGTGT AAGGGGTACC AGGCAATCCG TCAAAGGGTG GTGAGGAGCC CCCTCGGGGA 2700 GGGGCGGCCT GCCAAACCCC TGACCTTTGC CTGGTGCTTG GCCTCGTACA TCTGGCCAGA 2760 TGCTGTGATG ATGGTGGTGG TTGCCTTGGT TCTTCTCTTT GGCCTGTTCG ACGCGTTGGA 2820 TTGGGCCTTG GAGGAGATCT TGGTGTCCCG GCCCTCGCTG CGGCGTTTGG CTCGGGTGGT 2880 TGAGTGCTGT GTGATGGCGG GTGAGAAGGC CACAACCGTC CGGCTGGTCT CCAAGATGTG 2940 TGCGAGAGGA GCTTATTTGT TCGATCATAT GGGCTCATTT TCGCGTGCTG TCAAGGAGCG 3000 CCTGTTGGAA TGGGACGCGG CTCTTGAACC TCTGTCATTC ACTAGGACGG ACTGTCGCAT 3060 ! CATACGGGAT GCCGCGAGGA CTTTGTCCTG CGGGCAATGC GTCATGGGTT TACCCGTGGT 3120 TGCGCGCCGT GGTGATGAGG TTCTCATCGG CGTCTTCCAG GATGTGAATC ATTTGCCTCC 3180 !’,! CGGGTTTGTT CCGACCGCGC CTGTTGTCAT CCGACGGTGC GGAAAGGGCT TCTTGGGGGT 3240 CACAAAGGCT GCCTTGACAG GTCGGGATCC TGACTTACAT CCAGGGAACG TCATGGTGTT 3300 ... GGGGACGGCT ACGTCGCGAA GCATGGGAAC ATGCTTGAAC GGCCTGCTGT TCACGACCTT 3360 ’ ,CCATGGGGCT TCATCCCGAA CCATCGCCAC ACCCGTGGGG GCCCTTAATC CCAGATGGTG 3420 GTCAGCCAGT GATGATGTCA CGGTGTATCC ACTCCCGGAT GGGGCTACTT CGTTAACGCC 3480 TTGTACTTGC CAGGCTGAGT CCTGTTGGGT CATCAGATCC GACGGGGCCC TATGCCATGG 3540 Γ* : CTTGAGCAAG GGGGACAAGG TGGAGCTGGA TGTGGCCATG GAGGTCCCTG ATTTCCGTGG 3600 :.: i CTCGTCTGGC TCACCGGTCC TATGTGACGA GGGGCACGCA GTAGGAATGC TCGTGTCTGT 3660 GCTTCACTCC GGTGGTAGGG TCACCGCGGC ACGGTTCACT AGGCCGTGGA CCCAAGTGCC 3720 112249 317 AACAGATGCC AAAACCACCA CTGAACCCCC TCCGGTGCCG GCCAAAGGAG TTTTCAAAGA 3780 GGCCCCGTTG TTTATGCCTA CGGGAGCGGG AAAGAGCACT CGCGTCCCGT TGGAGTACGG 3840 CAACATGGGG CACAAGGTCT TAGTCTTGAA CCCCTCAGTG GCCACTGTGC GGGCCATGGG 3900 CCCGTACATG GAGCGGCTGG CGGGTAAACA TCCAAGTATA TACTGTGGGC ATGATACAAC 3960 TGCTTTCACA AGGATCACTG ACTCCCCCCT GACGTATTCA ACCTATGGGA GGTTTTTGGC 4020 CAACCCTAGG CAGATGCTAC GGGGCGTTTC GGTGGTCATT TGTGATGAGT GCCACAGTTA 4080 TGACTCAACC GTGCTGTTAG GCATTGGGAG GGTTCGGGAG CTGGCGCGTG GGTGCGGAGT 4140 GCAACTAGTG CTCTACGCCA CCGCTACGCC TCCCGGATCC CCTATGACGC AGCACCCTTC 4200 CATAATTGAG ACAAAATTGG ACGTGGGCGA GATTCCCTTT TATGGGCACG GAATACCCCT 4260 CGAGCGGATG CGAACCGGAA GGCACCTCGT GTTCTGCCAT TCTAAGGCTG AGTGCGAGCG 4320 CCTTGCTGGC CAGTTCTCCG CTAGGGGGGT CAATGCCATT GCCTATTATA GGGGTAAAGA 4380 CAGTTCTATC ATCAAGGATG GGGACCTGGT GGTCTGTGCC ACAGACGCGC TTTCCACTGG 4440 GTACACTGGA AATTTCGACT CCGTCACCGA CTGTGGATTA GTGGTGGAGG AGGTCGTTGA 4500 GGTGACCCTT GATCCTACCA TTACCATCTC CCTGCGGACA GTGCCTGCGT CGGCTGAACT 4560 GTCGATGCAA AGACGAGGAC GCACGGGTAG GGGCAGGTCT GGACGCTACT ACTACGCGGG 4620 GGTGGGCAAA GCCCCTGCGG GTGTGGTGCG CTCAGGTCCT GTCTGGTCGG CGGTGGAAGC 4680 TGGAGTGACC TGGTACGGAA TGGAACCTGA CTTGACAGCT AACCTACTGA GACTTTACGA 4740 CGACTGCCCT TACACCGCAG CCGTCGCGGC TGATATCGGA GAAGCCGCGG TGTTCTTCTC 4800 TGGGCTCGCC CCATTGAGGA TGCACCCTGA TGTCAGCTGG GCAAAAGTTC GCGGCGTCAA 4860 CTGGCCCCTC TTGGTGGGTG TTCAGCGGAC CATGTGTCGG GAAACACTGT CTCCCGGCCC 4920 ATCGGATGAC CCCCAATGGG CAGGTCTGAA GGGCCCAAAT CCTGTCCCAC TCCTGCTGAG 4980 GTGGGGCAAT GATTTACCAT CTAAAGTGGC CGGCCACCAC ATAGTGGACG ACCTGGTCCG 5040 / GAGACTCGGT GTGGCGGAGG GTTACGCCCG CTGCGACGCT GGGCCGATCT TGATGATCGG 5100 *·* TCTAGCTATC GCGGGGGGAA TGATCTACGC GTCGTACACC GGGTCGCTAG TGGTGGTGAC 5160 ’· ‘ AGACTGGGAT GTGAAGGGGG GTGGCGCCCC CCTTTATCGG CATGGAGACC AGGCCACGCC 5220 *"· TCAGCCGGTG GTGCAGGTTC CTCCGGTAGA CCATCGGCCG GGGGGTGAAT CAGCACCATC 5280 * · · I · · ;;; ggatgccaag acagtgacag atgcggtggc agcgatccag gtggactgcg attggactat 5340 t 1 : * CATGACTCTG TCGATCGGAG AAGTGTTGTC CTTGGCTCAG GCTAAGACGG CCGAGGCCTA 5400 CACAGCAGCC ACCAAGTGGC TCGCTGGCTG CTATACGGGG ACGCGGGCCG TTCCCACTGT 5460 ,,. ATCCATTGTT GACAAGCTCT TCGCCGGAGG GTGGGCGGCT GTGGTGGGCC ATTGCCACAA 5520 CGTGATTGCT GCGGCGGTGG CGGCCTACGG GGCTTCAAAG AGCCCGCCGT TGGCAGCCGC 5580 ’ GGCTTCCTAC CTGATGGGGT TGGGCGTTGG AGGCAACGCT CAGACGCGTC TGGCATCTGC 5640 CCTCCTATTG GGGGCTGCTG GAACCGCCTT GGGCACTCCT GTCGTGGGCT TGACCATGGC 5700 • AGGTGCGTTC ATGGGGGGCG CCAGTGTCTC CCCCTCCTTG GTCACCATTT TATTGGGGGC 5760 ;··: CGTCGGAGGT TGGGAGGGTG TTGTCAACGC GGCGAGCCTA GTCTTTGACT TCATGGCGGG 5820 112249 318 GAAACTTTCA TCAGAAGATC TGTGGTATGC CATCCCGGTA CTGACCAGCC CGGGGGCGGG 5880 CCTTGCGGGG ATCGCTCTCG GGTTGGTTTT GTATTCAGCT AACAACTCTG GCACTACCAC 5940 TTGGTTGAAC CGTCTGCTGA CTACGTTACC AAGGTCTTCA TGTATCCCGG ACAGTTACTT 6000 TCAGCAAGTT GACTATTGCG ACAAGGTCTC AGCCGTGCTC CGGCGCCTGA GCCTCACCCG 6060 CACAGTGGTT GCCCTGGTCA ACAGGGAGCC TAAGGTGGAT GAGGTACAGG TGGGGTATGT 6120 CTGGGACCTG TGGGAGTGGA TCATGCGCCA AGTGCGCGTG GTCATGGCCA GACTCAGGGC 6180 CCTCTGCCCC GTGGTGTCAT TACCCTTGTG GCACTGCGGG GAGGGGTGGT CCGGGGAATG 6240 GTTGCTTGAC GGTCATGTTG AGAGTCGCTG CCTCTGTGGC TGCGCGATCA CTGGTGACGT 6300 TCTGAATGGG CAACTCAAAG AACCAGTTTA CTCTACCAAG CTGTGCCGGC ACTATTGGAT 6360 GGGGACTGTC CCTGTGAACA TGCTGGGTTA CGGTGAAACG TCGCCTCTCC TGGCCTCCGA 6420 CACCCCGAAG GTTGTGCCCT TCGGGACGTC TGGCTGGGCT GAGGTGGTGG TGACCACTAC 6480 CCACGTGGTA ATCAGGAGAA CCTCCGCCTA TAAGCTGCTG CGCCAGCAAA TCCTATCGGC 6540 TGCTGTAGCT GAGCCCTACT ACGTCGACGG CATTCCGGTC TCATGGGACG CGGACGCTCG 6600 TGCGCCCGCC ATGGTCTATG GCCCTGGGCA AAGTGTTACC ATTGACGGGG AGCGCTACAC 6660 CCTGCCTCAT CAACTGAGGC TCAGGAATGT GGCGCCCTCT GAGGTTTCAT CCGAGGTGTC 6720 CATTGACATT GGGACGGAGA CTGGAGACTC AGAACTGACT GAGGCCGATC TGCCGCCGGC 6780 GGCTGCTGCT CTCCAAGCGA TCGAGAATGC TGCGAGGATT CTTGAACCGC ACATTGATGC 6840 CATCATGGAG GACTGCAGTA CACCCTCTCT TTGTGGTAGT AGCCGAGAGA TGCCTGTATG 6900 GGGAGAAGAC ATCCCCCGTA CTCCATCGCC AGCACTTATC TCGGTTACTG AGAGCAGCTC 6960 AGATGAGAAG ACCCCGTCGG TGTCCTCCTC GCAGGAGGAT ACCCCGTCCT CTGACTCATT 7020 CGAGGTCATC CAAGAGTCCG AGACAGCCGA AGGGGAGGAA AGCGTCTTCA ACGTGGCTCT 7080 TTCCGTATTA GAAGCCTCAT TTCCACAGAG CGACGCGACC AGGAAGCTTA CCGTCAAGAT 7140 ’ GTCGTGCTGC GTTGAAAAGA GCGTCACGCG CTTTTTCTCA TTGGGGTTGA CGGTGGCTGA 7200 TGTTGCTAGC CTGTGTGAGA TGGAAATCCA GAACCATACA GCCTATTGTG ACAAGGTGCG 7260 '·*; CACTCCGCTT GAATTGCAGG TTGGGTGCTT GGTGGGCAAT GAACTTACCT TTGAATGTGA 7320 *·*! CAAGTGTGAG GCTAGGCAAG AAACCTTGGC CTCCTTCTCT TACATTTGGT CTGGAGTGCC 7380 I · · GCTGACTAGG GCCACGCCGG CCAAGCCTCC CGTGGTGAGG CCGGTTGGCT CTTTATTAGT 7440 I : : ’ GGCCGACACT ACTAAGGTGT ATGTTACCAA TCCAGACAAT GTGGGACGGA GGGTGGACAA 7500 GGTGACCTTC TGGCGTGCTC CTAGGGTTCA TGATAAGTAC CTCGTGGACT CTATTGAGCG 7560 *>§, CGCTAAGAGG GCCGCTCAAG CCTGCCTAAG CATGGGTTAC ACTTATGAGG AAGCAATAAG 7620 » * · GACTGTAAGG CCACATGCTG CCATGGGCTG GGGATCTAAG GTGTCGGTTA AGGACTTAGC 7680 ’·"· CACCCCCGCG GGGAAGATGG CCGTCCATGA CCGGCTCCAG GAGATACTTG AAGGGACTCC 7740 GGTCCCCTTT ACTCTTACTG TGAAAAAGGA GGTGTTCTTC AAAGACCGGA AGGAGGAGGA 7800 i GGCCCCCCGC CTCATTGTGT TCCCCCCCCT GGACTTCCGG ATAGCTGAAA AGCTCATCTT 7860 ·;··· GGGAGACCCA GACCGGGTAG CCAAGGCGGT GTTGGGGGGG GCCTACGCCT TCCAGTACAC 7920 112249 319 CCCAAATCAG CGAGTTAAGG AGATGCTCAA GCTATGGGAG TCTAAGAAGA CCCCTTGCGC 7980 CATCTGTGTG GACGCCACCT GCTTCGACAG TAGCATAACT GAAGAGGACG TGGCTTTGGA 8040 GACAGAGCTG TACGCTCTGG CCTCTGACCA TCCAGAATGG GTGCGGGCAC TTGGGAAATA 8100 CXATGCCTCA GGCACCATGG TCACCCCGGA AGGGGTGCCC GTCGGTGAGA GGTATTGCAG 8160 ATCCTCGGGT GTCCTAACAA CTAGCGCGAG CAACTGCTTG ACCTGCTACA TCAAGGTGAA 8220 AGCCGCCTGT GAGAGGGTGG GGCTGAAGAA TGTCTCTCTT CTCATAGCCG GCGATGACTG 8280 CTTGATCATA TGTGAGCGGC CAGTGTGCGA CCCAAGCGAC GCTTTGGGCA GAGCCCTAGC 8340 GAGCTATGGG TACGCGTGCG AGCCCTCATA TCATGCATCC TTGGACACGG CCCCCTTCTG 8400 CTCCACTTGG CTTGCTGAGT GCAATGCAGA TGGGAAGCGC CATTTCTTCC TGACCACGGA 8460 CTTCCGGAGG CCGCTCGCTC GCATGTCGAG TGAGTATAGT GACCCGATGG CTTCGGCGAT 8520 CGGTTACATC CTCCTTTATC CTTGGCACCC CATCACACGG TGGGTCATCA TCCCTCATGT 8580 GCTAACGTGC GCATTCAGGG GTGGAGGCAC ACCGTCTGAT CCGGTTTGGT GCCAGGTACA 8640 TGGTAACTAC TACAAGTTTC CACTGGACAA ACTGCCTAAC ATCATCGTGG CCCTCCACGG 8700 ACCAGCAGCG TTGAGGGTTA CCGCAGACAC AACTAAAACA AAGATGGAGG CTGGTAAGGT 8760 TCTGAGCGAC CTCAAGCTCC CTGGCTTAGC AGTCCACCGA AAGAAGGCCG GGGCGTTGCG 8820 AACACGCATG CTCCGCTCGC GCGGTTGGGC TGAGTTGGCT AGGGGCTTGT TGTGGCATCC 8880 AGGCCTACGG CTTCCTCCCC CTGAGATTGC TGGTATCCCG GGGGGTTTCC CTCTCTCCCC 8940 CCCCTATATG GGGGTGGTAC ACCAATTGGA TTTTACAAGC CAGAGGAGTC GCTGGCGGTG 9000 GTTGGGGTTC TTAGCCCTGC TCATCGTAGC CCTCTTCGGG TGAACTAAAT TCATCTGTTG 9060 CGGCGAGGTC TGGTGACTGA TCGTCACCGG AGGAGGTTCC CGCCCTCCCC GCCCCAGGGG 9120 TCTCCCCGCT GGGTAAAAAG GGCCCGGCCT TGGGAGGCAT GGTGGTTACT AACCCCCTGG 9180 CAGGGTTAAA GCCTGATGGT GCTAATGCAC TGCCACTTCG GTGGCGGGTC GCTACCTTAT 9240 : · AGCGTAATCC GTGACTACGG GCTGCTCGCA GAGCCCTCCC CGGATGGGGC ACAGTGCACT 9300 GAGATCTGAA GGGGTGCACC CCGGGAA 9327 • t ··· (2) SEKVENSSIN ID NO:235 TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo • (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA T: ( Lii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei *··, (vi) ALKUPERÄ:

‘,..· (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GLI-F

: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:235: TAGCATGGCC TTTGCAGGGC TG 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:236 TIEDOT: 112249 320 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GLI-R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:236: AAGCTGTGAC CGTCTCCG 18 (2) SEKVENSSIN ID NO:237 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE1-NF (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:237: GCCGCCATGG CGGGGAAACT TTCATCAGAA G 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:238 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ’*.* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

> ί (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

T: (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei *·.. (vi) ALKUPERÄ:

.... (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE1-NR

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:238: ' ‘ GCGCGGATCC TAGTGACACC ACGGGGCAGÄ GG 32 . (2) SEKVENSSIN ID NO:239 TIEDOT: f t · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: !’*: (A) PITUUS: 33 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 112249 321 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE57F (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:239: GCCGCCATGG CTCTCTTGAC CAATAGGTTT ATC 33 (2) SEKVENSSIN ID NO:240 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GE57R (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:240: GCGCGGATCC AGAAATGCCA CCCGCCCTCA C 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:241 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 61 aminohappoa , : : (B) TYYPPI: aminohappo ' ‘* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen > · "* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini t » · » · * ‘ *. (iii) HYPOTEETTINEN: ei i * » (iv) ANTI-SENSE: ei

< « I

i * » ;;; (vi) ALKUPERÄ: : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: GE57 aminohapposekvenssi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO-.241: I ’·· Met Ser Leu Leu Thr Asn Arg Phe Ile Arg Arg Vai Asp Lys Asp Gin 15 10 15 » t *

Trp Gly Pro Gly Vai Thr Gly Thr Asp Pro Glu Pro Cys Pro Ser Arg 20 25 30 » · '·*. Trp Ala Gly Lys Cys Met Gly Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Cys Ser ·.' 35 40 45 ' : ; Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Arg Vai Arg Ala Gly Gly ’ 50 55 60 (2) SEKVENSSIN ID NO:242 TIEDOT: 112249 322 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 52 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke El:lie (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:242: GCGCAGATCT AAAATGAGCC GTGGTGGCAT TTCCTTTTTC TATACCATCA TG 52 (2) SEKVENSSIN ID NO:243 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke El:lie (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:243: GCGCAGATCT CCAGAAATCA AATGGGACCT TCCAGAGG 38 (2) SEKVENSSIN ID NO:244 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ! (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei .., (iv) ANTI-SENSE: ei ·;·, (vi) ALKUPERÄ: V * (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke E2:lle hyönteisen ' signaalisekvenssin kanssa t I I > » ' ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:244: I ' : CGCGAGATCT GTCGCAAGGC GCCCCT 26 (2) SEKVENSSIN ID NO: 245 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 112249 323 (A) PITUUS: 28 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke E2:lle hyönteisen signaalisekvenssin kanssa (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:245: GCGCAGATCT AGTTGCCTGC ATCCACCT 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:246 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke E2:lle HGV-signaalisekvenssin kanssa (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:246: CGCGAGATCT AAAATGAAAC TGCTTGTCAT GGTCTTCCTG TT 42 (2) SEKVENSSIN ID NO:247 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia ; ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ··,· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; < » *

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke E2:lle HGV-! i .* signaalisekvenssin kanssa (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:247: \ * '·, GCGCAGATCT AGTTGCCTGC ATCCACCT 28 : (2) SEKVENSSIN ID NO:248 TIEDOT: *;*Ί (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 emäsparia 324 112249 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS2a:lle (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:248: GCGCAGATCT GGCCGTGGCA GGTGAGGTCT TCGC 34 (2) SEKVENSSIN ID NO:249 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS2a:lle (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:249: GCGCAGATCT TAACGCCGCA ACGAGGGCCG G 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:250 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·'; (A) PITUUS: 46 emäsparia ' * (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen "* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • «

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

? * f "Ί (iii) HYPOTEETTINEN: ei i * * I'/, (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS2b:lle (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:250: ; Γ: GCGCGGATCC AAAATGATCG CTCGGGTGGT TGAGTGCTGT GTGATG 46 ;,,J (2) SEKVENSSIN ID NO:251 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ‘ t (A) PITUUS: 32 emäsparia * ; ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 112249 325

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS2b:lle (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:251: GCGCGGATCC AGGCGCGGTC GGAACAAACC CG 32 (2) SEKVENSSIN ID NO:252 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:252: GCGAGATCTA AAATGTGCGG AAAGGGCTTC TTGGGGGTC 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:253 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

/ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: : : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:253: GCGAGATCTC ATCTCCGGAC CAGGTCGTCC ACTATGTGG 39 * · · (2) SEKVENSSIN ID NO:254 TIEDOT: > » a (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia ‘ * (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

i (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

·;·*: (iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 326 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS4a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:254: GGCGGATCCA AAATGATCGG TGTGGCGGAG G 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:255 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS4a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:255: GGCGGGATCC ATGCGCCGGA GCACGG 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:256 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: : (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS4b (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:256: : : : gcgggatcca aaatgatcag cctcacccgc acag 34 : : : (2) SEKVENSSIN ID NO:257 TIEDOT: » (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 emäsparia j (B) TYYPPI: nukleiinihappo ... (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei '“ 1 (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS5a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:257: 112249 327 GGCGGGATCC TACCTCCTGA TTACCACGT 29 (2) SEKVENSSIN ID NO:258 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS5a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:258: GCGAGATCTA AAATGACCTC CGCCTATAAG CTGCTGCGCC AG 42 (2) SEKVENSSIN ID NO:259 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS5a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:259: GGCAGATCTA CCTCCGTCCC ACATTGTCTG GATTGGTAAC 40 ·’· (2) SEKVENSSIN ID NO:260 TIEDOT: i (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 43 emäsparia ; : : (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA : (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ,*··. (vi) ALKUPERÄ: ···' (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke NS5b (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:260: • « · » GCGAGATCTA AAATGGTGGA CAAGGTGACC TTCTGGCGTG CTC 43 (2) SEKVENSSIN ID NO:261 TIEDOT: 112249 328 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke NS5b (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:261: GCGAGATCTC ACCCGAAGAG GGCTACGATG AGCAGG 36 (2) SEKVENSSIN ID NO:262 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 52 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Etualuke El-E2-NS2a (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:262: GCGCAGATCT AAAATGAGCC GTGGTGGCAT TTCCTTTTTC TATACCATCA TG 52 (2) SEKVENSSIN ID NO:263 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo .ί (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen .·. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen > » *

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: ·' * (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Käänteisaluke El-E2-NS2a '"’S (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:263: GCGCAGATCT TAACGCCGCA ACGAGGGCCG G 31 M". (2) SEKVENSSIN ID NO:264 TIEDOT: ‘ ‘ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia 112249 329 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 9E3-REV (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:264: GCTGGCTGAG GCACGGTTGG TC 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:265 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke E39-94PR (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:265: CACCATCATC ACAGCATCTG GC 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:266 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; ; (A) PITUUS: 32 emäsparia ;/ (B) TYYPPI: nukleiinihappo I (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

♦ · · ·; (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-F12 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:266: l : GCAACCATGG AACCTGCCAA ACCCCTGACC TT 32 · ' (2) SEKVENSSIN ID NO: 267 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *, (A) PITUUS: 21 emäsparia ; : ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo '· (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 330 112249

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (Vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-R12 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:267: AGCCCCATGG AAGGTCGTGA A 21 (2) SEKVENSSIN ID NO:268 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-F14 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:268: TTGGGATCCC TCGTGTTCCG CCATTCTAAG 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:269 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-R13 V : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:269: TATGGATCCT GGTAAATCAT TGCCCCACCT 30 f ·;·. (2) SEKVENSSIN ID NO:270 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ;··· (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo i“*j (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen '·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen :,· · (ii) molekyylityyppi: dna (iii) HYPOTEETTINEN: ei 331 1 12249 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke 470EP-F8 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:270: GCTGAATTCG CCATGGCGAC GTGCGCATTC AGGGGTGGA 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:271 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Aluke GEP-R14 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:271: GGAGGATCCG CGACCCGCCA CCGAAGT 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:272 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 48 aminohappoa (b) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei ;.* (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Y5 epitooppi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:272: '!* Ile Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gin Leu Arg Leu Arg Asn 1 5 10 15

Vai Ala Pro Ser Glu Vai Ser Ser Glu Vai Ser Ile Asp Ile Gly Thr : : 20 25 30

Glu Ala Glu Asn Ser Glu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala 35 40 45 (2) SEKVENSSIN ID NO:273 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 55 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: ei 112249 332 (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Q9 epitooppi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:273:

Cys Gly Leu Leu Thr Arg His His Thr Ala Leu Asn His Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Pro Gin Arg Gly Pro Gly His Gin Asp Leu Leu Gin Gly Pro lie 20 25 30

Gin Arg Val Glu Gin Ala Lys Glu Lys Asp Gin Gly Asn His His His 35 40 45

His His Ser lie Trp Pro Asp 50 55 (2) SEKVENSSIN ID NO:274 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Qll epitooppi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:274:

Ala Ala Vai Ala Glu Pro Tyr Tyr Vai Asp Gly Ile Pro Vai Ser Trp 15 10 15

Asp Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Vai Tyr Gly Pro Gly Gin Ser 20 25 30

Vai Thr Ile : 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:275 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ,·/ (A) PITUUS: 225 emäsparia ’!! (B) TYYPPI: nukleiinihappo / · (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

... (iii) HYPOTEETTINEN: ei • · (iv) ANTI-SENSE: ei ’ t · · · (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Q7-12-1 env klooni (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:275: * « » » t » GTGCCCTTCG TCAACAGGAC AACTCTCTTC ACCATTAGGG GGCCCCTGGG CAACCAGGGC 60 CGAGGCAACC CGGTGCGGTC GCCCTTGGGT TTTGGGTCCT ACGCCATGAC CAGGATCCGA 120 333 1 1224 y GATACCCTAC ATCTGGTGGA GTGTCCCACA CCAGCCATCG AGCCTCCCAC CGGGACGTCT 180 GGGTTCTTCC CCGGGACGCC GCCTCTCAAC AACTGCATGC ATATG 225 (2) SEKVENSSIN ID NO:276 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 192 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iv) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Y12-15-1 NS3 klooni DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:276: AACATGGGGC ACAAGGTCTT AATCTTGAAC CCCTCAGTGG CCACTGTGCG GGCCATGGGC 60 CCGTACATGG AGCGGCTGGC GGGTAAACAT CCAAGTATAT ACTGTGGGCA TGATACAACT 120 GCTTTCACAA GGATCACTGA CTCCCCCCTG ACGTATTCAA CCTATGGGAG GTTTTTGGCC 180 AACCCTAGGC AA 192 (2) SEKVENSSIN ID NO:277 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 264 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei » · (iv) ANTI-SENSE: ei , (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: Y12-10-2 NS3 klooni • » · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:277: » » I · !',! CCCCTCGAGC GGATGCGAAC CGGAAGGCAC CTCGTGTTCT GCCATTCTAA GGCTGAGTGC 60 • · ‘ GAGCGCCTTG CTGGCCAGTT CTCCGCTAGG GGGGTCAATG CCATTGCCTA TTATAGGGGT 120 AAAGACAGCT CTATCATCAA GGATGGGGAC CTGGTGGTCT GTGCTACAGA CGCGCTTTCC 180 ACTGGGTACA CTGGAAATTT CGACTCCGTC ACCGACTGTG GATTAGTGGT GGAGGAGGTC 240 • » · • I · GTTGAGGTGA CCCTTGATCC CACC 264 * · i"': I * * f I I II» » «

t I

Claims (23)

112249 334

1. Ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-virus (HGV) oleellisesti eristetyssä muodossa, jossa mainitulle

2. Ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen 15 (HGV) polypeptidi oleellisesti eristetyssä muodossa, jossa mainitulle HGV:lie on tunnusomaista seuraavat: (i) sillä on patenttivaatimuksen 1 mukaisen HGV-viruksen ominaispiirteet, ja (ii) sille on lisäksi tunnusomaista polypep-tidit, joiden aminohapposekvensseillä on ainakin 40-%:n 20 sekvenssihomologia aminohapposekvensseihin, jotka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sekvenssistä, sekvenssin nro 38 190 aminohapon sekvenssistä ja sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssistä.

: 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, joka ' 25 käsittää antigeenin, joka on spesifisesti immunoreaktiivi- nen ainakin yhden anti-HGV vasta-aineen kanssa, kuten to distetaan antigeenin kyvyllä immunoreagoida spesifisesti ! HGV-positiivisesta kohteesta saadun kehon nesteen tai ku dosnäytteen kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, joka ;v. valmistetaan rekombinantti-DNA:n ilmentymisellä, joka kä- t* t sittää polypeptidisekvenssin, joka koodataan sekvenssillä I I *) nro 14 tai sekvenssin nro 14 komplementilla. : 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, joka ·*,,,· 35 on rekombinanttifuusiopolypeptidi, joka koostuu HGV-poly- .·, : peptidistä ja toisesta polypeptidistä, jossa mainittu toi- nen polypeptidi valitaan ryhmästä, joka koostuu β-galak-tosidaasiproteiineista, glutationi-S-transferaasiproteii- 112249 335 neista ja partikkelin muodostavista proteiineista.

5 HGV:lie on tunnusomaista seuraavat: (i) se on kädellisten mukana siirtyvä, (ii) se on serologisesti erilainen kuin hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus (HDV) ja hepatitis E virus (HEV), (iii) se on Flaviviridae-heimon jäsen, ja 10 (iv) se sisältää polynukleotidejä, joilla on ainakin 55-%:n sekvenssihomologia polynukleotidiin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, nro 37 ja nro 19, tai niiden komplementeista.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, joka käsittää ainakin 15 viereisen aminohapon sekvenssin, joka koodataan HGV-genomilla, cDNA:lla tai sen komplementilla, 5 jossa mainittu aminohapposekvenssi valitaan ryhmästä, joka koostuu (i) sekvenssin nro 15 2873 aminohapon sekvenssistä, tai sen fragmenteista, (ii) sekvenssin nro 38 190 aminohapon sekvenssistä, tai sen fragmenteista, (iii) sekvenssin nro 20 67 aminohapon sekvenssistä, tai sen frag-10 menteista, ja (iv) aminohapposekvenssistä, joka koodataan PNF 2161 cDNA lähteen lambda gtll kokoelmassa.

7. Diagnostinen kokoonpanopakkaus käytettäväksi kehon nesteen tai kudosnäytteen, joka sisältää vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä patenttivaatimuksen 1 mukais- 15 ta ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-virusta (HGV) vastaan, seulomisessa, joka käsittää patenttivaatimuksen 3 mukaisen polypeptidiantigee- nin, ja keinot immunologisen kompleksin havaitsemiseksi, 20 joka muodostuu mainitun antigeenin spesifisellä im-munoreaktiolla mainitussa näytteessä olevien vasta-aineiden kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen diagnostinen kokoonpano käytettäväksi seulontaseerumissa.

9. Diagnostinen kokoonpano käytettäväksi kehon nes teen tai kudosnäytteen, joka sisältää ei-A ei-B ei-C ei-D 1 ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) antigeenejä, seulomisessa, : ’ : joka käsittää ; , ; oleellisesti eristetyn vasta-aineen, joka on spesi- 30 fisesti immunoreaktiivinen patenttivaatimuksen 3 mukaisen ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) polypep-tidiantigeenin kanssa, ja keinot mainitun polypeptidiantigeenin sitomisen : mainittuun vasta-aineeseen havaitsemiseksi. : 35

10. Menetelmä ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis- .·. : virusinfektion (HGV) havaitsemiseksi koekohteessa, joka ' menetelmä käsittää vaiheet, joissa: koekohteesta saatu kehon neste tai kudosnäyte 112249 336 saatetaan reagoimaan oleellisesti eristetyn patenttivaatimuksen 9 mukaisen kokoonpanon HGV-spesifisen vasta-aineen kanssa, ja tutkitaan sitoutuneen antigeenin läsnäolo vasta-5 aineesta.

11. Monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifisesti immunoreaktiivinen patenttivaatimuksen 3 mukaisen ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) antigeenin kanssa.

12. Polyklonaalisten vasta-aineiden, jotka ovat spesifisesti immunoreaktiivisia patenttivaatimuksen 3 mukaisen ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) antigeenin kanssa, oleellisesti eristetty valmiste.

13. Menetelmä kehon nesteen tai kudosnäytteen seu-15 lomiseksi, joka näyte sisältää vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä patenttivaatimuksen 1 mukaista ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-virusta (HGV) vastaan, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa: näyte saatetaan kosketuksiin patenttivaatimuksen 3 20 mukaisen polypeptidiantigeenin kanssa, ja havaitaan immunologinen kompleksi, joka muodostuu mainitun antigeenin spesifisellä immunoreaktiolla mainitussa näytteessä olevan vasta-aineiden kanssa.

14. Mosaiikkipolypeptidi, joka käsittää 25 ainakin kaksi erilaista patenttivaatimuksen 3 mu kaista antigeeniä, joissa mainitusta mosaiikkipolypepti-distä puuttuu aminohapot, jotka normaalisti ovat mainittu-; jen antigeenien välissä luontaisessa HGV-polypeptidissä.

15. Ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen 30 (HGV) rokotekoostumus, joka käsittää patenttivaatimuksen 3 mukaisen oleellisesti eristetyn HGV-polypeptidin, joka on läsnä farmakologisesti tehokkaassa annoksessa farmaseuttisesti hyväksyttävässä kan- tajassa. : 35

16. Ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen ; (HGV) polynukleotidi oleellisesti eristetyssä muodossa, jossa mainitulla HGV:llä on patenttivaatimuksen 1 mukaisen HGV-viruksen ominaispiirteet. 337 1 1224 V

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen polynukleotidi, jolla on ainakin 55-%:n sekvenssihomologia polynukleoti-diin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu sekvenssistä nro 14, nro 37 ja nro 19, tai niiden komplementeista.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen polynukleotidi, joka on käyttökelpoinen ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) PCR-havaitsemista varten.

19. Menetelmä ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) nukleiinihapon havaitsemiseksi koekohtees- 10 sa, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa: nukleiinihappoa sisältävä näyte saadaan kohteesta, nukleiinihappoa sisältävä näyte ja patenttivaatimuksen 16 mukaisesta polynukleotidista koostuva koetin yhdistetään sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa, ja 15 havaitaan HGV-nukleiinihapon/koetin-kompleksit, jotka muodostuvat HGV-nukleiinihapon hybridisaatiolla mainitun koettimen kanssa.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, jossa mainittu havaitseminen käsittää vaiheet, joissa käyte- 20 tään HGV-nukleiinihappospesifisiä koettimia, jossa kaksi koetinta määrittelevät HGV-nukleiinihapon sisäisen alueen, ja kullakin koettimella on yksi säie, joka sisältää 3'-: pään, joka on sisäinen alueelle, jolloin muutetaan nukle- : iinihappo/koetin hybridisaatiokompleksit kaksisäikeisiksi 25 koettimen sisältäviksi fragmenteiksi alukelaajennusreakti-oilla, amplifioidaan koettimen sisältävien fragmenttien määrää toistamalla peräkkäin kohdat, joissa (i) denaturoidaan kaksisäikeiset fragmentit, jolloin tuotetaan yk-30 sisäikeisiä fragmentteja, (ii) hybridisoidaan yksittäiset säikeet koettimien kanssa, jolloin muodostuu säie/koetin-komplekseja, (iii) muodostetaan kaksisäikeisiä fragmentteja säie/koetin-komplekseista entsyymin ja kaikkien neljän deoksiribonukleotidin ollessa läsnä, ja (iv) toistetaan 35 kohtia (i) - (iii), kunnes haluttu amplifikaatioaste on saavutettu, ' ' identifioidaan amplifikaatiotuotteet.

21. Kokoonpano polynukleotidien, jotka on johdettu 112249 338 patenttivaatimuksen 1 mukaisesta ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E hepatitis-viruksesta (HGV), läsnäolon analysoimiseksi näytteistä, joka kokoonpano käsittää ainakin yhden polynukleotidikoettimen, joka sisäl-5 tää nukleotidisekvenssin, joka hybridisoituu spesifisesti patenttivaatimuksen 16 mukaisen HGV-polynukleotidin kanssa, ja sopivan säiliön.

22. Kloonausvektori, joka pystyy ilmentämään, sopi-10 vissa olosuhteissa, cDNA:n avoimen lukukehyksen (ORF), joka johdetaan ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E hepatitis-viruksen (HGV) genomista, tai sen komplementeista, joissa mainitulla viruksella on patenttivaatimuksen 1 mukaiset ominaispiirteet ja ORF liitetään käyttökelpoisesti kontrollisek-15 venssiin, joka on yhteensopiva halutun isännän kanssa.

23. Menetelmä ei-A ei-B ei-C ei-D ei-E Hepatitis-viruksen (HGV) polypeptidin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa: viljellään solua, joka on muutettu patenttivaati-20 muksen 22 mukaisella vektorilla, olosuhteissa, jotka johtavat avoimen lukukehyksen (ORF) sekvenssin ilmentymiseen. t 112249 339