JP4885476B2 - タンパク質及び/又はペプチドの細胞内導入方法 - Google Patents
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なお、遺伝子導入の場合、遺伝子を蛍光物質等で標識すると転写機能に影響を及ぼすおそれがあるため、通常は標識せずに導入することから、エンドソーム内での滞留に由来するバックグラウンドが問題となるのはタンパク質及び/又はペプチド特有の現象であるといえる。
そして本発明者らは、タンパク質及び/又はペプチドの細胞内導入方法について、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との結合体が生細胞内に効率よく取り込まれ、このような細胞内導入技術が有用であることを見いだしていたが、更に当該細胞内導入方法について種々検討したところ、上記結合体を形成するタンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との間に溶媒に露出した状態でジスルフィド結合等のポリスルフィド結合を配置して細胞内に導入後、細胞表面を還元剤で処理すると、ポリスルフィド結合が容易に切断可能であることに起因して、露出したポリスルフィド結合が速やかに還元され、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物とが解離することを見いだした。両者が解離することで、細胞表面に吸着する化合物を介して細胞表面に吸着していたタンパク質及び/又はペプチドが細胞表面への結合能を失うことから、細胞表面に吸着したタンパク質及び/又はペプチドを充分に洗浄・除去することが可能となることを見いだし、これにより、細胞内に導入されたタンパク質及び/又はペプチドの機能を効果的に解析できることを見いだし、上記課題をみごとに解決できることに想到した。
なお、本発明の細胞内導入方法は、従来の固定化された細胞内で行われてきた免疫組織化学的な解析から、生細胞内で動的な分子の可視化(Live cell imaging)までを可能とするものであり、特に、画像解析技術に好適に利用・応用できる技術である。
本発明はまた、タンパク質及び/又はペプチドを細胞内に導入する方法であって、上記タンパク質及び/又はペプチドは、標識されたものであり、上記細胞内導入方法は、生細胞内のエンドソームを破壊する物質を添加し、エンドソームを破壊する過程を含んでなるタンパク質及び/又はペプチドの細胞内導入方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
なお、上記細胞内導入方法としては、生体外での(in vitro)細胞内導入方法であることが好適である。すなわち、生体外で、生体内等から採取した細胞にタンパク質及び/又はペプチドを導入する方法であることが好ましい。この場合、後述する結合体の導入過程や、還元剤による還元処理過程、エンドソームを破壊する過程等は、生体外で行うこととなる。
ここで、「還元剤により処理する」とは、還元剤を用いて本発明の結合体が有するポリスルフィド結合を還元することを意味し、本発明では、溶媒に露出した状態でタンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との間に、ジスルフィド結合等のポリスルフィド結合を配置することにより、温和な条件下で還元処理を行うことが可能となる。このような還元処理により、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物とが解離することとなり、両者が解離することで、細胞表面に吸着する化合物を介して細胞表面に吸着していたタンパク質及び/又はペプチドが細胞表面への結合能を失い、細胞表面からタンパク質及び/又はペプチドを充分に洗浄・除去することができることとなる。この結果、例えば、標識されたタンパク質及び/又はペプチドを蛍光顕微鏡等で観察する場合には、細胞表面に静電相互作用によって吸着した標識タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との結合体に由来するバックグラウンド(背景光)が充分に低減した像を観察することが可能となる。
一方、細胞内に導入された結合体は、細胞質内の還元的環境下では、主に還元型グルタチオン等の作用により上記式(1)の反応が進行するため、該結合体を構成するタンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との解離が期待される。このため、タンパク質及び/又はペプチドが細胞内の標的部位に結合する際にも、細胞表面に吸着する化合物の影響を受けずに本来の機能を充分に発揮できる。これらの優位性から、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物との間には、ジスルフィド結合等の切断が容易な部位を配しておくことが望ましい。
このような疎水基及びカルボキシル基を有する重合体の好適な例としては、(メタ)アクリル酸、桂皮酸、クロトン酸、マレイン酸、イタコン酸、フマル酸等のカルボキシル基を有するモノマーと、(メタ)アクリル酸メチル等の(メタ)アクリル酸エステル類;スチレン、アルファメチルスチレン等の不飽和芳香族類とを、定法に従い重合・精製した重合体を挙げることができる。
本発明において、タンパク質及び/又はペプチドとは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を意味する。本発明で用いることのできるタンパク質及び/又はペプチドとしては特に限定されず、例えば、ペプチド、酵素、抗体、その他機能性(薬理作用等の生理活性)を有し、医薬・薬物として有用なタンパク質及び/又はペプチド等の任意のタンパク質及び/又はペプチドを用いることができ、その分子量としては100〜100万が好ましい。中でも、チオール基(SH基)を有するタンパク質及び/又はペプチドを用いることが好ましく、システイン(Cys)残基を有するものが好適である。なお、本発明において、タンパク質とは、そのタンパク質に、糖鎖、脂質及び/又はリン酸基が結合した複合タンパク質をも含む意味である。また、そのタンパク質の構造は天然状態であっても変性状態であってもよい。
上記カチオン性の基を有する重合体としては、水溶液中でカチオンとなり得る原子を有する重合体であればよく、例えば、2を超えて30000以下のカチオン価を有する重合体であることが好ましい。2以下であると、タンパク質及び/又はペプチドに充分な正電荷を導入することができないおそれがあり、30000を超えると、本発明の作用効果を充分に発揮することができないおそれがある。より好ましくは、20000以下であり、更に好ましくは、2500以下であり、特に好ましくは、250以下であり、最も好ましくは、4以上、70以下である。
蛍光標識に用いる蛍光物質としては、特に限定されないが、例えば、ピレン、アントラニロイル基、ダンシル基、フルオレセイン、ローダミン、ニトロベンゾキサジアゾール基等の蛍光団を有する化合物が挙げられる。上記の蛍光団を有する化合物は公知(例えば、平塚寿章、「蛋白質 核酸 酵素」、Vol.42,No.7(1997)等参照。)であり、常法によりタンパク質及び/又はペプチド等に導入することができる。
上記試験キットの使用方法としては、本発明の作用効果を発揮する限り特に限定されないが、例えば、導入目的物であるタンパク質及び/又はペプチドを容器1に入れ、次いで容器1の内容物を容器2に入れた後、その内容物を導入しようとする細胞を含む培地中に添加して種々の培養等を行い、そこに容器3の内容物を添加する方法;容器1の内容物を容器2に入れ、次いで導入目的物であるタンパク質及び/又はペプチドを容器2に入れた後、その内容物を導入しようとする細胞を含む培地中に添加して種々の培養等を行い、そこに容器3の内容物を添加する方法等が好ましい。
また上記細胞内導入試験キットとして、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物とがポリスルフィド結合を介して結合した結合体が封入された容器と、還元剤が封入された容器とを含んでなる試験キットを用いることもできる。
このような生成物は、例えば、試薬として、「Live Cell Imaging」技術の他、医薬品や試薬、創薬支援、再生医療等に好適に用いられるものである。
蛍光Probeと細胞内導入用カチオン性Carrierの調製
緑色蛍光タンパク質(eGFP)のカルボキシル末端側に、SV40ウイルスLarge−T抗原由来の核移行シグナルが3回繰り返されたペプチド配列(NLS)を付加したeGFP−NLSを大腸菌組換えタンパク質として発現・精製し、Phosphate Buffered Saline(PBS),pH7.4に溶解した状態で調製した。次にスペーサー内にSS結合を含むBiotin化試薬:Sulfo−NHS−SS−Biotin(PIERCE社)をジメチルスルフォキシドに予め溶解し、eGFP−NLSとSulfo−NHS−SS−Biotinのモル比を1:4で混合し、25℃で4時間反応した。この反応液をPBSで平衡化されたSephadexG−25カラムを用いて精製し、eGFP−NLS−SS−Biotinを得た。
1mgのChicken Avidin(和光純薬)を0.5mLの純水に溶解した後、予め塩酸でpHを5に調整した20%ポリエチレンイミン(PEI,平均分子量600)水溶液を0.5mL添加した。次に固体の水溶性カルボジイミド(EDC)を純水中で10mg/mLの濃度で溶解し、Avidin/PEI水溶液中に速やかに10μL添加した(終濃度:0.5mg/mL Avidin, 10% PEI600−HCl, pH5, 0.1mg/mL EDC)。25℃で4時間反応した後、PBSで平衡化されたSephadexG−25カラム用いて精製し、PEI600−Avidinを得た。また、PEIの結合反応の前に、RhodamineB(RITC,Sigma社)で予め標識したAvidin−RITCについても同様の反応でPEI600を結合させ、PEI600−Avidin−RITCを調製した。
予め100μLのDMEM培地(無血清)中で各1μMのPEI600−Avidin(またはPEI600−Avidin−RITC)とeGFP−NLS−SS−Biotinを混合し室温で5分放置することでBiotin/Avidinの結合体を形成させ、2mLのDMEM培地(無血清)に希釈した(結合体の終濃度は50nM)。実験に用いる細胞については、マウス繊維芽細胞(Balb/c3T3)を10%FBSが含まれるDMEM培地を用いてカバーガラス(直径18mm)上に1晩培養し生着させた。細胞が生着した1枚のカバーガラスあたり、0.5mLの上記結合体を含むDMEM培地を添加し、炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で2時間培養した。
上記の手法でeGFP−NLS−SS−Biotin + PEI600−Avidinを細胞内に導入した後、上清を除去し、20mMのDTTが含まれるDMEM培地(無血清)を添加し、37℃で10分間の処理を行った後、DMEM培地(無血清)に戻した。
上記の導入操作の後、細胞をDMEM培地(無血清)で1回洗浄し、シリコーンテープ(3M Scotch No70)をスペーサーとして貼り付けたスライドガラスにDMEM培地(無血清)を用いて細胞の付着面を内側にして封入し、細胞表面・内部の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡(ZEISS 510META)を用いて観察・解析を行った。
本発明の証明には、eGFPによる蛍光観察と、NLS付加により、細胞内に導入後に核へ移行することが期待されるeGFP−NLSを「蛍光Probe」として、細胞内へProbeを導入するCarrierにはPEI600−Avidin若しくはPEI600−Avidin−RITCを「カチオン性Carrier」としてそれぞれ活用した。また、本発明では溶媒に露出したSS結合を配置することが鍵となるため、スペーサー内に含むビオチン化試薬(Sulfo−NHS−SS−Biotin)を用いた。
なお、この際のeGFP−NLS−SS−Biotin + PEI600−Avidinの形態を図2に概念的に示す。図2においては、アビジン1個に対して、ビオチン(Bi)やジスルフィド結合(SS)が1個等とされているが、これは概念的に示したものであり、この形態に限定される旨を示したものではない。
図3−Bは、本手法で細胞内導入を行った際の、細胞表面及び細胞内のProbeに由来する蛍光を全て可視化した様子を示している。これに対し、図3−Cでは、観察直前に細胞表面を20mMのDTTを含むDMEM培地で10分間処理をするだけで、細胞表面のProbeに由来する蛍光を速やかに洗浄・消去されていることが確認された。この処理条件では、生細胞に対する影響は観察されず、非常に温和な条件で本技術が達成されたことを示している。
図3−Dでは、図3−Cで観察された画像の一部を拡大し、更にZ軸方向への細胞内蛍光の局在を解析した結果を示した。この結果は、細胞内に導入されたeGFP−NLSが確実に細胞内の核へ移行していること、及び細胞表面の蛍光が消失した低バックグラウンドな解析が可能になったことが証明された。
蛍光Probeと細胞内導入用カチオン性Carrierの調製
スペーサー内にSS結合を含むBiotin化試薬:Sulfo−NHS−SS−Biotin(PIERCE社)をジメチルスルフォキシドに予め溶解し、eGFPとSulfo−NHS−SS−Biotinのモル比を1:4で混合し、25℃で4時間反応した。この反応液をPBSで平衡化されたSephadexG−25カラム用いて精製し、eGFP−SS−Biotinを得た。
1mgのChicken Avidin(和光純薬)を0.5mLの純水に溶解した後、予め塩酸でpHを5に調整した20%ポリエチレンイミン(PEI,平均分子量600)水溶液を0.5mL添加した。次に固体の水溶性カルボジイミド(EDC)を純水中で10mg/mLの濃度で溶解し、Avidin/PEI水溶液中に速やかに10μL 添加した(終濃度:0.5mg/mL Avidin, 10% PEI600−HCl, pH5, 0.1mg/mL EDC)。25℃で4時間反応した後、PBSで平衡化されたSephadexG−25カラム用いて精製し、PEI600−Avidinを得た。
エンドソームを破壊する物質として、pH依存性の溶解性を示すカルボキシル基含有ポリマーの合成を実施した。
スチレン55重量部及びモノイソプロピルマレート70重量部を定法に従い、水中で懸濁重合を行うことでカルボキシル基含有ポリマーを得た。このポリマーのpHに対する溶解性を調べた結果、1%水溶液は、pHが6.5(25℃)で不溶化することを確認した。
予め100μLのDMEM培地(無血清)中で各1μMのPEI600−AvidinとeGFP−SS−Biotinを混合し室温で5分放置することでBiotin/Avidinの結合体を形成させ、2mLのDMEM培地(無血清)に希釈した(結合体の終濃度は50nM)。実験に用いる細胞については、マウス繊維芽細胞(Balb/c3T3)を10%FBSが含まれるDMEM培地を用いてカバーガラス(直径18mm)上に1晩培養し生着させた。細胞が生着した1枚のカバーガラスあたり、0.5mLの上記結合体を含むDMEM培地を添加し、炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で2時間培養した。
上記の手法でeGFP−SS−Biotin + PEI600−Avidinを細胞内に導入した後、上清を除去しカルボキシル基含有ポリマーを50μg/mL含むDMEM培地(無血清)を添加し、37℃で2時間の処理を行った後、DMEM培地(無血清)に戻した。
上記の処理後、上清を除去し、20mMのDTTが含まれるDMEM培地(無血清)を添加し、37℃で10分間の処理を行った後、DMEM培地(無血清)に戻した。
ジチオスレイトール(DTT)による細胞表面の還元・洗浄をしたもの、及び未処理のもの、細胞をDMEM培地(無血清)で1回洗浄し、シリコーンテープ(3M Scotch No70)をスペーサーとして貼り付けたスライドガラスにDMEM培地(無血清)を用いて細胞の付着面を内側にして封入し、細胞表面・内部の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡(ZEISS 510META)を用いて観察・解析を行った。
図4−Aに示したとおり、eGFPの緑色蛍光(Probe)は、細胞内で顆粒状に存在する。一方、図4−Bに示したように、カルボキシル基含有ポリマーで処理した細胞は、細胞内に均一に蛍光が存在し、エンドソームから細胞質に均一にeGFPが拡散していることから、エンドソームに滞留した背景光を低減できることが明らかとなった。
(2):カチオン性キャリアーを介したタンパク質細胞内導入過程
(3):細胞表面に吸着している蛍光Probeの洗浄・除去過程
(4):細胞内の還元的環境でのSS結合の還元過程
(5):細胞内標的分子と蛍光Probeとの結合・可視化過程
(a):タンパク質
(b):カチオン性ポリマー
(c):静電相互作用による吸着
(d):エンドサイトーシス及び/又は直接的な膜透過による細胞内導入
(e):特定の分子を認識する蛍光Probe
(f):温和な条件下でのDTT等の還元剤による細胞表面の処理
(g):負電荷を帯びる生細胞の表面
(h):蛍光
(i):PEI600
(j):eGFP
(k):NLS
Claims (2)
- タンパク質及び/又はペプチドを細胞内に導入する方法であって、
該細胞内導入方法は、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物とがポリスルフィド結合を介して結合した結合体を細胞内に導入し、還元剤により処理して細胞表面に付着した結合体からタンパク質及び/又はペプチドを離脱させる過程を含んでなり、
該細胞表面に吸着する化合物は、カチオン性の基を有する重合体、カチオン化された複合体、又は、脂質であり、
該結合体は、タンパク質及び/又はペプチドと細胞表面に吸着する化合物とがジスルフィド結合を介して結合した結合体である
ことを特徴とするタンパク質及び/又はペプチドの細胞内導入方法。 - 前記タンパク質及び/又はペプチドは、標識されたものであり、
前記細胞内導入方法は、生細胞内のエンドソームを破壊する物質を添加しエンドソームを破壊する過程を含んでなる
ことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質及び/又はペプチドの細胞内導入方法。
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