JP2007105038A - 診断用及び治療用の精製c型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】形質転換宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する際に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、E1及び/又はE2及び/又はE1/E2よりなる群から選択される組換えHCVの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を精製する方法。また、このような方法により単離された組成物。これらの組成物の診断用及び治療用の応用、更に、HCV治療の臨床的有効性及び/又は臨床的結果を予知及び監視するための、HCVのE1蛋白及びペプチドの用途。
【選択図】なし
Description
更に詳しくは、本発明は、C型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白の精製方法、診断、予防又は治療における本発明に記載の方法により精製されたHCVエンベロープ蛋白の使用、疾患を監視するための測定法、及び/又は疾患の診断、及び/又は疾患の治療における単一の又は特定オリゴマーのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2エンベロープ蛋白の使用に関する。
以下の定義は、本発明に使用される異なる用語や表現を例示する。
「C型肝炎ウイルス単一エンベロープ蛋白」という用語は、E1又はE2領域の少なくとも1つのHCVエピトープを定義するアミノ酸配列(及び/又はアミノ酸類似体)を含む、ポリペプチド又はその類似体〔例えば、ミモトープ(mimotopes)〕を意味する。これらの単一のエンベロープ蛋白は、広義には、組換えにより発現されたエンベロープ蛋白のモノマー形態でもホモオリゴマー形態でもよい。典型的には、エピトープを規定する配列は、HCVのE1又はE2領域のアミノ酸配列に対応する(同一であるか)、又はエピトープを破壊しない本来のアミノ酸残基の類似体の置換による)。一般に、エピトープを規定する配列の長さは、3個以上のアミノ酸、更に典型的には5個以上のアミノ酸、更に典型的には8個以上のアミノ酸、そして更に典型的には10個以上のアミノ酸である。コンフォメーション性エピトープは、抗原の三次元構造(例えば、折りたたみ)により形成されると考えられるため、エピトープを規定する配列の長さは大きく変動しうる。すなわち、エピトープを規定するアミノ酸は、数は比較的少ないが、折りたたみにより正しいエピトープのコンフォメーションとなる分子の長さに沿って広く散在している。エピトープを規定する残基問の抗原の部分は、エピトープのコンフォメーション構造に決定的に重要ではない可能性がある。例えば、エピトープコンフォメーションに決定的に重要な配列(例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など)が維持されるならば、これらの介在配列を欠失又は置換させても、コンフォメーション性エピトープは影響を受けないことがある。コンフォメーション性エピトープはまた、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーのサブユニットの2個以上の基本的領域により形成されてもよい。
(例えば、大腸菌)中で抗原を発現させて、回収後蛋白を復元することも、可能であり、充分である。
(3)天然には存在しない。
更に詳しくは、本発明は、形質転換された宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する場合に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、E1及び/又はE2及び/又はE1/E2よりなる群から選択される組換えHCVの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を単離又は精製する方法に関する。
(1)システイン残基がシステイン酸に修飾される、システイン酸による過ギ酸酸化(Mooreら、1963)。
(2)例えば妥当な酸化剤(例えば、Cu2+)と共に亜硫酸塩(SO3 2-)を用いる、システインがS−スルホシステインに修飾される、亜硫酸分解(R−S−S−R → 2R−SO3 -)(Bailey and Cole、1959)。
(3)ジチオスレイトール(DTT)、β−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオンレッド、ε−メルカプトエチルアミン、又はチオグリコール酸のようなメルカプタンによる還元〔このうち、DTTとβ−メルカプトエタノールが通常使用される(Cleland,1964)〕は、水環境で実施することができ、システインが修飾を受けないため、本発明の好適な方法である。
(4)ホスフィン(例えば、Bu3 P)による還元(Ruegg and Rudinger、1997)。
R1S−SR2+R3SH→R1S−SR3+R2SH
*R1、R2:蛋白凝集物の化合物
*R3SH:競合的物質(有機性、蛋白性)
− グルタチオン
− 5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)又はビス−(3−カルボキシ−4−ニトロフェニル)−ジスルフィド〔DTNB又はエルマン試薬(Ellman's reagent)〕(Elmann、1959)
− N−エチルマレイミド(NEM;Benesch ら、1956)
− N−(4−ジメチルアミノ−3,5−ジニトロフェニル)マレイミド又はタピーの(Tuppy's)マレイミド(これは、蛋白を着色する)
− P−クロロメルクリ安息香酸(Grassetti ら、1969)
− 4−ビニルピリジン(Friedman and Krull、1969)は、酸加水分解反応後に放出されうる
− アクリロニトリル、これは酸加水分解反応後に放出されうる(Weil and Seibles、1961)
− NEM−ビオチン〔例えば、シグマ(Sigma)B1267から入手できる〕
− 2,2’−ジチオピリジン(Grassetti and Murray、1967)
− 4,4’−ジチオピリジン(Grassetti and Murray、1967)
− 6,6’−ジチオジニコチン酸(DTDNA;Brown and Cunnigham、1970)
− 2,2’−ジチオビス−(5’−ニトロピリジン)(DTNP;米国特許第3597160号)又は他のジチオビス(複素環誘導体)化合物(Grassetti and Murray、1969)。
− 組換えE1及び/又はE2及び/又はE1/E2発現宿主細胞を、好適にはN−エチルマレイミド(NEM)のようなSH基保護剤及び場合により適切な界面活性剤(好適にはエンピゲン−BB)の存在下で、溶解し、
− 例えばレクチンクロマトグラフィー〔例えばレンチル(lentil)レクチンクロマトグラフィー〕あるいは抗E1及び/又は抗E2特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーなどの親和性精製により、該HCVエンベロープ蛋白を回収し、次に
− ジスルフィド結合切断剤(例えばDTT)を用いて、好適にはSH基保護剤(例えばNEM又はビオチン−NEM)の存在下で、ジスルフィド結合を還元又は切断して、そして
− 還元したHCVのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2エンベロープ蛋白を、例えばゲル濾過(サイズ排除クロマトグラフィー又は分子ふるい)により及び場合により付加的なNi2+−IMACクロマトグラフィー及び脱塩工程により、回収する。
− E1及び/又はE2及び/又はE1/E2HCVエンベロープ蛋白を発現する、本発明の組換えベクター又は公知の組換えベクターで形質転換した、前記で定義した宿主細胞を、適切な培地中で生育させ、
− 適切な条件下で、前記で定義した該ベクター配列を発現させ、
− 好適にはN−エチルマレイミド(NEM)のようなSH基保護剤、及び場合により(好適にはエンピゲン−BBである)適切な界面活性剤の存在下で、該形質転換宿主細胞を溶解し、
− レクチンクロマトグラフィーあるいは抗E1及び/又は抗E2特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィー(該レクチンは好適にはレンチルレクチン又はGNAである)のような親和性精製により、該HCVエンベロープ蛋白を回収し、次に
− 前工程の溶出液をジスルフィド結合切断手段(例えば、DTT)とインキュベートし、好適には、引き続きSH基保護剤(例えば、NEM又はビオチン−NEM)とインキュベートして、そして
− ゲル濾過、及び場合により引き続きNi2+−IMACクロマトグラフィー及び脱塩工程のような手段により、HCVの単一の又は特定オリゴマーのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白を単離する。
コア/E1V1領域のアミノ酸181〜200位にわたるE1−31(配列番号56)、
E1領域のアミノ酸193〜212位にわたるE1−33(配列番号57)、
E1V2領域のアミノ酸205〜224位にわたるE1−35(配列番号58)(エピトープB)、
E1V2領域のアミノ酸208〜227位にわたるE1−35A(配列番号59)(エピトープB)、
E1領域〔V1、C1及びV2領域(エピトープBを含有する)〕のアミノ酸192〜228位にわたる1bE1(配列番号53)、
E1領域のアミノ酸301〜320位にわたるE1−51(配列番号66)、
E1C4領域のアミノ酸313〜332位にわたるE1−53(配列番号67)(エピトープA)、
E1領域のアミノ酸325〜344位にわたるE1−55(配列番号68)。
本発明はまた、表3に記載の以下のE2ペプチドの少なくとも1つを含む組成物に関する:
E2領域のアミノ酸397〜416位にわたるEnv67すなわちE2−67(配列番号72)(エピトープA、モノクローナル抗体2F10H10に認識される、図19を参照)、
E2領域のアミノ酸409〜428位にわたるEnv69すなわちE2−69(配列番号73)(エピトープA)、
E2領域の583〜602位にわたるEnv23すなわちE2−23(配列番号86)(エピトープE)、
E2領域の595〜614位にわたるEnv25すなわちE2−25(配列番号87)(エピトープE)、
E2領域の607〜626位にわたるEnv27すなわちE2−27(配列番号88)(エピトープE)、
E2領域の547〜566位にわたるEnv17BすなわちE2−17B(配列番号83)(エピトープD)、
E2領域の523〜542位にわたるEnv13BすなわちE2−13B(配列番号82)(エピトープC、モノクローナル抗体16A6E7に認識される、図19を参照)。
モノクローナル抗体15C8C1、12D11F1及び8G10D1H9により認識されるエピトープF、
モノクローナル抗体9G3E6に認識されるエピトープG、
モノクローナル抗体10D3C4及び4H6B2により認識されるエピトープH(又はC)、又は、
モノクローナル抗体17F2C2に認識されるエピトープI。
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、前記で定義したE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体の任意のものに、該生物学的試料を接触させ、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、分析される試料中に存在する抗体に特異的に結合する異種抗体(この異種抗体は、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている)とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に(例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により)検出する。
− 好適には固体基材上に固定された、前記で定義した少なくとも1つのモノクローナル抗体、
− これらの抗体と、生物学的試料中に存在するHCV抗原との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を作成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により観察された結合パターンから試料中に存在するHCV抗原を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するHCV抗原のインビトロ診断のためのキットに関する。
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、前記で定義したエンベロープペプチド又は蛋白の任意のものを含む組成物に、該生物学的試料を接触させ(ここで、該ペプチド又は蛋白は、ストレプトアビジン又はアビジン複合体により固体基材に共有結合したビオチン化ペプチド又は蛋白であってもよい)、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に(例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により)検出する。
− 場合によりHCV又は他のタイプのHCVからの他のポリペプチド又はペプチドと組合せた、好適には固体基材上に、より好適には同じELISAプレートの異なるマイクロウェル上に、更により好適には同じ膜ストリップ上に固定化された、前記で定義した少なくとも1つのペプチド又は蛋白組成物、
− これらのポリペプチド又はペプチドと、生物学的試料中に存在するHCVに対する抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を作成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により、観察された結合パターンから試料中に存在するHCV遺伝子型を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中のHCV抗体の存在を測定するためのキットに関する。
− C型肝炎感染患者からの生物学的試料を、E1蛋白又はその好適な部分と、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
− 結合しなかった成分を除去し、
− 該試料中〔例えば、(インターフェロン)治療の開始時及び/又は治療中の〕に存在する抗E1力価を計算し、
− 治療の開始時及び/又は治療中の該試料中の抗E1力価に基づき、HCV疾患の自然の経過を監視し、又は治療に対する患者の応答を予知する、
ことを含む。
コア/E1V1領域のアミノ酸181〜200位にわたるE1−31(配列番号56)、
E1領域のアミノ酸193〜212位にわたるE1−33(配列番号57)、
E1V2領域のアミノ酸205〜224位にわたるE1−35(配列番号58)(エピトープB)、
E1V2領域のアミノ酸208〜227位にわたるE1−35A(配列番号59)(エピトープB)、
E1領域〔V1、C1及びV2領域(エピトープBを含有する)〕のアミノ酸192〜228位にわたる1bE1(配列番号53)、
E1領域のアミノ酸301〜320位にわたるE1−51(配列番号66)、
E1C4領域のアミノ酸313〜332位にわたるE1−53(配列番号67)(エピトープA)、
E1領域のアミノ酸325〜344位にわたるE1−55(配列番号68)。
− 少なくとも1つのE1蛋白又はE1ペプチド、更に詳しくは前記で定義したE1蛋白又はE1ペプチド、
− これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗E1抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作成するのに必要な成分又は緩衝剤、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により、治療の進行中の抗E1力価の低下を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、HCV感染患者のHCV疾患を監視、又は治療(例えばインターフェロン治療)に対する応答を予知するためのキットに関する。
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化さ
れた形で、E1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白組成物の少なくとも1つ、あるいは前述のE1又はE2ペプチド組成物の少なくとも1つのものに、1つまたはそれ以上の血清型のHCV抗体の存在について分析すべき生物学的試料を接触させ、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、異種抗体(該異種抗体は、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている)とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に(例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により)検出し、観察された結合パターンから1つ又はそれ以上のHCV血清型の存在を推定する。
− 前記で定義した少なくとも1つのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白あるいはE1又はE2ペプチド、
− これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗E1抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作成するのに必要な成分又は緩衝剤、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により、観察された結合パターンから1つ又はそれ以上の血清型の存在を検出するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するHCVの1つ又はそれ以上の血清型を分類する(serotyping)ための、更に詳しくはHCVのこれらの血清型に対する抗体を検出するためのキットに関する。
1.ワクシニアウイルス組換えベクターの構築
pgptATA18ワクシニア組換えプラスミドは、pATA18(Stunnenberg ら、1988)を改変したものであり、ワクシニアウイルスI3中間プロモーターの制御下に大腸菌(E. coli)キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する付加的な挿入体(インサート)を有する(図1)。プラスミドpgsATA18は、3つの読み枠中に停止コドンを含有する配列番号1/94のオリゴヌクレオチドリンカーを、PstIとHindIIIで切断したpATA18ベクターに挿入して構築した。これにより余分のPacI制限部位が作成された(図2)。元々のHindIII部位は保存されなかった。
配列番号1/94を有するオリゴヌクレオチドリンカー:
組換え蛋白に融合した設計されたヒスチジンストレッチのNi2+キレート化により、迅速かつ効率的な精製を容易にするために、付加的なカルボキシ末端のヒスチジン付加部分(タッグ)を有する分泌蛋白を発現するように、ワクシニア組換えベクターpMS66を設計した。平滑末端を生成する3つの制限酵素(SmaI、StuI及びPmlI/BbrPI)のユニーク(単一)部位を含有する配列番号2/95のオリゴヌクレオチドリンカーを、任意のcDNAのカルボキシ末端が、蛋白分解酵素第Xa因子切断部位をコードする配列の後に6つのヒスチジンと2つの停止コドンをコードするヌクレオチド配列が続く枠(フレーム)に挿入されうるように合成した(3’末端の下流に、新しいPacI制限部位も導入された)。配列番号2/95を有するこのオリゴヌクレオチドを、pgptATA18のXmaI部位とPstI部位の間に導入した(図3)。
配列番号2/95を有するオリゴヌクレオチドリンカー:
2.1.異なる形態のE1蛋白をコードする構築物
血清試料から、既に記載されている(Stuyver ら、1993b )ように、RNAを調製し、次に逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行って、PCR生成物を得た。表1に、増幅に使用した各クローン及びプライマーの特徴を示す。PCR断片を、SmaIで切断したpSP72〔プロメガ(Promega)〕プラスミドにクローン化した。ワクシニア組換えベクターへの挿入のために、以下のクローンを選択した:HCCl9A(配列番号3)、HCCl10A(配列番号5)、HCCl11A(配列番号7)、HCCl12A(配列番号9)、HCCl13A(配列番号11)及びHCCl17A(配列番号13)(図21に記載した)。各pSP72プラスミドから、EcoRIとHindIII制限酵素切断により、E1コード領域を含有するcDNA断片を切断し、EcoRI/HindIIIで切断したpgptATA−18ワクシニア組換えベクター(実施例1に記載)中に、11Kワクシニアウイルス後期プロモーターの下流に挿入した。各プラスミドを、pvHCV−9A、pvHCV−10A、pvHCV−11A、pvHCV−12A、pvHCV−13A及びpvHCV−17Aと命名した。このうち、pvHCV−11Aを図4に示す。
コドンAsp 264〜Val 287(ヌクレオチド790〜861、疎水性ドメインIをコードする領域)が欠失しているクローンHCCl37を、以下のように作成した:HCPr52(配列番号16)/HCPr107(配列番号19)とHCPr108(配列番号20)/HCPR54(配列番号18)のプライマーセットを用いて、クローンHCCl10Aから2つのPCR断片を作成した。これらのプライマーを図21に示す。この2つのPCR断片を、電気泳動後、アガロースゲルから精製し、各断片1ngをプライマーHCPr52(配列番号16)とHCPr54(配列番号18)を用いるPCRの鋳型として一緒に使用した。得られた断片を、SmaIで切断したpSP72ベクターにクローン化し、欠失を有するクローンは、24コドン(72塩基対)が欠失しているために容易に同定できた。クローンHCCl37(配列番号15)を含有するプラスミドpSP72HCCl37を選択した。欠失のまわりのHCV配列(ベクターpSP72−HCCl37からXmaIとBamHIにより切断された断片)を、ワクシニアプラスミドpvHCV−10AのXmaI−BamHI部位に挿入することにより、疎水性ドメインIの欠如した全長E1cDNAを含有する組換えワクシニアプラスミドを構築した。得られたプラスミドを、pvHCV−37と命名した。確認のための配列決定の後、内部欠失を有するアミノ末端領域を、このベクターpvHCV−37から単離(EcoRIとBstEIIにより切断)し、EcoRIとBstEIIで切断したpvHCV−11Aプラスミドに再挿入した。この構築物は、両方の疎水性ドメインが欠失したE1蛋白を発現すると予測され、pvHCV−38と命名した。クローンHCCl38のE1をコードする領域を、配列番号23に示す。
慢性C型肝炎の3a型感染患者(血清BR36、クローンBR36−9−13、WO 94/25601中の配列番号19、及びStuyver ら、1993a も参照)からクローンHCCl62(配列番号29)を得、輸血後肝炎の5a型感染小児(血清BE95、クローンPC−4−1、WO 94/25601中の配列番号45)からHCCl63(配列番号31)を得た。
血清BE11(遺伝子型1b)から、プライマーHCPr109(配列番号33)とHCPr72(配列番号34)により、Stuyver ら、1993b に記載されたようにRNA調製、逆転写及びPCR法を用いて、HCVのE2PCR断片22を得、この断片をSmaIで切断したpSP72ベクターにクローン化した。クローンHCCl22A(配列番号35)をNcoI/AlwNI又はBamHI/AlwNIで切断し、断片の粘着末端を平滑末端にした〔NcoI部位及びBamHI部位はクレノウDNAポリメラーゼI(ベーリンガー(Boehringer)で、AlwNI部位はT4DNAポリメラーゼ(ベーリンガー(Boehringer))で〕。次に、EcoRIとHindIIIでの切断により線状にし、粘着末端をクレノウDNAポリメラーゼ〔ベーリンガー(Boehringer)〕で充填したワクシニアpgsATA−18ベクターに、このBamHI/AlwNI cDNA断片を挿入した。得られたプラスミドを、pvHCV−41と命名した。これは、シグナル配列として作用しうるE1蛋白の37アミノ酸(Met 347〜Gly 383)を含有する、アミノ酸Met 347〜Gln 673のE2領域をコードしていた。EcoRIとBbrPIで切断した後、クレノウDNAポリメラーゼで平滑末端としたベクターpMS66に、同じHCV cDNAを挿入した。得られたプラスミドをpvHCV−42と命名した。これはアミノ酸347〜683をコードしていた。NcoI/AlwNI断片を、同様の方法で、pgsATA−18(pvHCV−43)又はpMS−66ワクシニアベクター(pvHCV−44)の同じ部位に挿入した。pvHCV−43とpvHCV−44は、HCVポリ蛋白のアミノ酸364〜673をコードしており、このうちアミノ酸364〜383は、E2のシグナル配列をコードするE1蛋白の天然のカルボキシ末端領域由来であり、アミノ酸384〜673は、成熟E2蛋白由来である。
ウサギ腎RK13細胞(ATCC CCL37)、ヒト骨肉腫143Bチミジンキナーゼ欠損(TK- )(ATCC CRL8303)、HeLa(ATCC CCL2)及びHepG2(ATCC HB8065)細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、ロックヴィル、メリーランド州、アメリカ合衆国)から得た。RK13と143B(TK- )についてはアールの塩類(Earle's salts)(EMEM)と共に、HepG2についてはグルコース(4g/l)と共に、10%ウシ胎児血清を補足したダルベッコー改変イーグル培地(DMEM)中で、細胞を生育させた。既に記載されている(Panicali & Paoletti 、1982;Piccini ら、1987;Mackett ら、1982、1984、及び1986)ように、ワクシニアウイルスWR株〔ウェスタンリザーブ(Western Reserve)、ATCC VR119〕を、143B又はRK13細胞中で通常通り増殖させた。143B細胞のコンフルエントな単層に、感染多重度(m.o.i.)0.1〔=0.1プラーク形成単位(PFU)/細胞〕で野性型ワクシニアウイルスを感染させた。2時間後、500ngのプラスミドDNAを含有するリン酸カルシウム共沈殿物の形で、ワクシニア組換えプラスミドを感染細胞にトランスフェクションして、相同組換えを起こさせた(Graham & van der Eb 、1973;Mackett ら、1985)。選択培地〔ミコフェノール酸(mycophenolic acid)(MPA)25μg/ml、キサンチン250μg/ml、及びヒポキサンチン15μg/mlを含有するEMEM;Falkner and Moss、1988;Janknecht ら、1991〕中でインキュベートしたウサギ腎RK13細胞上で、大腸菌(Escherichia coli)キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)を発現する組換えウイルスを選択した。選択培地中で0.9%アガロース重層下で、RK13細胞の新鮮な単層上で単一の組換えウイルスを精製した。チミジンキナーゼ欠損(TK- )組換えウイルスを選択し、次に5−ブロモ−2’−デオキシウリジン25μg/mlの存在下で、ヒト143B細胞(TK- )の新鮮な単層上でプラークを精製した。精製した組換えHCV−ワクシニアウイルスの原液を、m.o.i.0.05でヒト143B細胞又はウサギRK13細胞に感染させることにより調製した(Mackett ら、1988)。組換えワクシニアウイルス中のHCV cDNA断片の挿入は、各HCV断片(表1を参照)をクローン化するために使用したプライマーを用いるPCRにより、MPA選択後の細胞溶解物の一定分量(50μl )で確認した。組換えワクシニア−HCVウイルスを、ワクシニア組換えプラスミド番号に従って命名した。例えば、組換えワクシニアウイルスvvHCV−10Aは、野性型WR株をpvHCV−10Aプラスミドで組換えすることにより得た。
RK13細胞のコンフルエントな単層を、実施例2に記載したようにm.o.i.3で組換えHCV−ワクシニアウイルスに感染させた。感染のためには、細胞単層をリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4(PBS)で2回洗浄し、組換えワクシニアウイルス原液をMEM培地で希釈した。m.o.i.が3になるように、106 個の細胞につきウイルス溶液200μl を添加し、24℃で45分間インキュベートした。ウイルス溶液を吸引し、106 個の細胞につき完全増殖培地2ml(実施例2を参照)を加えた。細胞を37℃で24時間インキュベートし、この間にHCV蛋白を発現させた。
感染細胞をPBSで2回洗浄し、溶解緩衝液〔50mMトリス−塩酸、pH7.5、150mM NaCl、1%トリトンX−100、5mM MgCl2 、1μg/mlアプロチニン(シグマ(Sigma)、ボルネム(Bornem)、ベルギー)〕で直接溶解するか、又は50mMトリス−塩酸、pH7.5/10mM EDTA/150mM NaCl中で5分間インキュベートしてフラスコからはがして、遠心分離(1000gで5分間)により回収した。次に、細胞ペレットを、106 個の細胞につき200μl の溶解緩衝液(50mMトリス−塩酸、pH8.0、2mM EDTA、150mM NaCl、5mM MgCl2 、アプロチニン、1%トリトンX−100)に再懸濁した。エッペンドルフ遠心分離機で14,000rpm で5分間遠心分離して、細胞溶解物から不溶性の破片を除去して清澄にした。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により、20μl の溶解物の蛋白を分離した。次に、トランスファー緩衝液〔25mMトリス−塩酸、pH8.0、192mMグリシン、20%(v/v)メタノール〕中で、4℃に冷却したヘーファー(Hoefer)HSIトランスファー装置を用いて100V(定電圧)で2時間、蛋白をゲルからニトロセルロースシート〔アマーシャム(Amersham)〕に電気的にトランスファーした。ニトロセルロースフィルターをブロット液(Blotto)〔PBS中の5%(w/v)脱脂インスタントミルク粉末;Johnson ら、1981〕でブロッキング処理し、ブロット液/0.1%ツイーン(Tween)20で希釈した一次抗体とインキュベートした。非特異結合を減らすために、通常、ヒト陰性対照血清又はHCV感染患者血清を200倍希釈し、200倍希釈した野性型ワクシニアウイルス感染細胞溶解物と室温で1時間プレインキュベートした。ブロット液/0.1%ツイーン20で洗浄後、ニトロセルロースフィルターを、ブロット液/0.1%ツイーン20で希釈したアルカリホスファターゼ基質溶液とインキュベートした。PBS中の0.1%ツイーン20で洗浄後、フィルターをアルカリホスファターゼ基質溶液(100mMトリス−塩酸、pH9.5、100mM NaCl、5mM MgCl2 、0.38μg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.165μg/ml 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート)とインキュベートした。電気的トランスファー以外の全ての操作は、室温で行った。
5.1.溶解
感染したRK13細胞(E1又はE2構築物を有する)をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、10mM EDTAを含有するPBS中でインキュベートして培養レシピエントからはがした。はがした細胞をPBSで2回洗浄し、4℃で、105 個の細胞につき、2mM ビオチン化N−エチルマレイミド(ビオチン−NEM)〔シグマ(Sigma)〕を含有する溶解緩衝液〔50mMトリス−塩酸、pH7.5、150mM NaCl、1%トリトンX−100、5mM MgCl2 、1μg/mlアプロチニン(シグマ(Sigma 、ボルネム(Bornem)、ベルギー)〕1mlを加えた。この溶解物を、B型ダウンサー(douncer)でホモゲナイズし、室温で0.5時間放置した。一次溶解物に、10mM N−エチルマレイミド〔NEM、アルドリッチ(Aldrich)、ボルネム(Bornem)、ベルギー〕を含有する溶解緩衝液5倍量を更に加え、この混合物を室温で15分間放置した。ベックマンJA−14ローター中で14,000rpm (rmax で30,100g)で4℃で1時間遠心分離して、溶液から不溶性細胞破片を除去して清澄にした。
カラムの5倍量の溶解緩衝液で流速1 ml/分で平衡化させた0.8×10cmのレンチルレクチンセファロース4Bカラム〔ファルマシア(Pharmacia)〕に、清澄化した細胞溶解物を流速1 ml/分でのせた。レンチルレクチンカラムをカラムの5〜10倍量の緩衝液1〔0.1M リン酸カリウム、pH7.3、500mM KCl、5%グリセロール、1mM 6−NH2 −ヘキサン酸、1mM MgCl2 、及び1%デシルPEG(DecylPEG)(クワント(KWANT)、ベヅム(Bedum)、オランダ)〕で洗浄した。ある実験では、次にカラムを、1%デシルPEG(DecylPEG)の代わりに0.5%エンピゲン−BB〔カルビオケム(Calbiochem)、カリフォルニア州サンディエゴ、米国〕を含有するカラムの10倍量の緩衝液1で洗浄した。溶出緩衝液(10mMリン酸カリウム、pH7.3、5%グリセロール、1mMヘキサン酸、1mM MgCl2 、0.5%エンピゲン−BB、及び0.5M α−メチル−マンノピラノシド)を適用して、結合物質を溶出した。溶出した物質を分画し、実施例6に記載のようにELISAを用いて、画分を、E1又はE2の存在についてスクリーニングした。図22に、vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)、及びvvHCV63(5a型)で感染させた細胞溶解物の4つの異なるE1精製物の、レンチルレクチン溶出画分から得られたELISA結果を示す。図23に、図22に示した値から得られたプロフィールを示す。これらの結果は、異なる型のHCVのエンベロープ蛋白についてレクチン親和性カラムを使用できることを示している。
E1陽性又はE2陽性画分をプールし、ベックマンJA−20ローター中で4℃で5,000rpm で3時間遠心分離し、セントリコン(Centricon)30kDa 〔アミコン(Amicon)〕で濃縮した。ある実験では、E1陽性又はE2陽性画分をプールし、窒素蒸発により濃縮した。3×108 個の細胞相当量を約200μl に濃縮した。部分的還元のために、この200μl に、最終濃度3.5%になるように30%エンピゲン−BB〔カルビオケム(Calbiochem)、カリフォルニア州サンディエゴ、米国〕を加え、次に最終濃度1.5〜7.5mMになるように1M DTT水溶液を加え、37℃で30分間インキュベートした。次に、NEM(ジメチルスルホキシド中、1M)を最終濃度50mMになるように加え、更に37℃で30分間反応させて遊離のスルフヒドリル基をブロックした。
スーパーデックス(Superdex)−200HR10/20カラム〔ファルマシア(Pharmacia)〕を、カラムの3倍量のPBS/3%エンピゲン−BBで平衡化させた。還元混合物をスマートシステム(Smart System)〔ファルマシア(Pharmacia)〕の500μl 試料ループに注入し、PBS/3%エンピゲン−BB緩衝液を加えてゲル濾過した。V0 からVt まで250μl の画分を集めた。実施例6に記載のように、画分をE1蛋白又はE2蛋白の存在についてスクリーニングした。
実施例5.1.〜5.4.に示すように、vvHCV44に感染したRK13細胞から、E2蛋白(アミノ酸384〜673)を精製した。図30に、レンチルレクチンクロマトグラフィーのOD280 プロフィール(連続線)を示す。点線は、ELISA(実施例6を参照)で検出されたE2反応性を示す。図31に、レンチルレクチンE2プール(図30を参照)(その一部は実施例5.3.に記載の方法に従い還元してブロックしたものであり、また一部は直ちにカラムに適用したものである)のゲル濾過クロマトグラフィーから得られた同じプロフィールを示す。E2プールの両方の部分を別々のゲル濾過カラムにかけた。還元をしない場合、E2は夾雑蛋白と共有結合凝集物を生成することが証明できた。還元とブロッキングの後、夾雑蛋白の大部分はV0 画分に集まった。E2蛋白と一緒に精製された他の夾雑蛋白は、以後の工程で除去できたため、もはやE2蛋白に共有結合していなかった。図32に、E2蛋白精製について実施した付加的なNi2+−IMAC精製工程を示す。この親和性精製工程では、vvHCV44から発現されたE2蛋白に付加された6個のヒスチジン残基を使用した。夾雑蛋白は、カラムから流れ出すか、又は30mMイミダゾール洗浄により除去することができた。図33に、0.5μg の精製E2蛋白と30mMイミダゾール洗浄物の銀染色したSDS/PAGEを示す。純粋なE2蛋白は、200mMイミダゾール溶出工程により容易に回収することができた。図34に、イミダゾールを除去して目的の緩衝液(例えば、PBS、炭酸緩衝液、生理食塩水)に変更することができることを目的とした付加的な脱塩工程を示す。
(予想に反して)分泌されたE2蛋白(約30〜40%を構成し、60〜70%は細胞内形態である)は、凝集物を形成したことで特徴付けられることにも注目すべきである。したがって、分泌されたE2を精製するにも同じ問題があった。分泌されたE2は前述のように精製することができた。
マクシソルブ(Maxisorb)マイクロウェルプレート〔ヌンク(Nunc)、ロスキルデ(Roskilde)、デンマーク〕を、1ウェル当たりPBS中5μg/mlのストレプトアビジン〔ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)〕溶液1部(例えば、50μl 又は100μl 又は200μl)で、4℃で16時間又は37℃で1時間、コーティングした。あるいは、ウェルを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中5μg/mlガランタス・ニバリス・アグルチニン(Galanthus nivalis agglutinin)(GNA)1部で、4℃で16時間又は37℃で1時間、コーティングした。GNAによるコーティングの場合は、プレートをイノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液(Washing Solution)400μl で2回洗浄した。非結合コーティング表面は、1.5〜2部のブロッキング溶液(PBS中0.1%カゼイン及び0.1%NaN3)で、37℃で1時間又は4℃で16時間、ブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引した。精製したE1又はE2は100〜1,000ng/ml (濃度はA=280nmで測定した)に希釈し、あるいはE1若しくはE2についてスクリーニングすべきカラム画分(実施例5を参照)又は精製していない細胞溶解物(実施例5.1.)中のE1若しくはE2は、ブロッキング溶液で20倍希釈し、各ウェルに1部のE1又はE2溶液を加え、ストレプトアビジン又はGNAでコーティングしたプレート上で、37℃で1時間インキュベートした。マイクロウェルをイノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液1部で3回洗浄した。イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキットの試料希釈液(Sample Diluent)で、血清試料は20倍希釈し、又はモノクローナル抗E1若しくは抗E2抗体は20ng/ml の濃度に希釈し、この溶液1部をE1又はE2蛋白と37℃で1時間反応させた。マイクロウェルを、イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液400μl で5回洗浄した。イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕のコンジュゲート希釈液(Conjugate Diluent)1部で、1/80,000希釈したヤギ抗ヒト又は抗マウスIgGペルオキシダーゼ結合二次抗体〔ダコ(DAKO)、グロストルップ(Glostrup)、デンマーク〕で、37℃で1時間インキュベートし、プレートを、イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液400μl で3回洗浄後、イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の基質溶液(Substrate Solution)1部で100倍希釈した、イノテスト(Innotest)HCV AbIIIキット〔インノジェネティックス(Innogenetics)、ズウィジンドレヒト(Zwijndrecht)、ベルギー〕の基質を24℃で30分間添加して得られた発色により、結合した抗体を検出した。
7.1.抗E1及び抗E2抗体の監視
現在のC型肝炎ウイルス(HCV)診断方法は、HCV抗体の存在のスクリーニングと確認のために開発された。このような測定法は、治療の監視や疾患の予後の予知のために有用な情報を与えないようである。しかし、B型肝炎の場合のように、臨床の場においては抗エンベロープ抗体の検出及び定量がより有用なことがある。C型肝炎ウイルス疾患の予後の予知マーカーとしての抗E1抗体力価及び抗E2抗体力価の使用の可能性を探るために、IFN−α治療で長期持続性の応答を示す一連の患者〔治療後少なくとも1年の期間、血液中のトランスアミナーゼレベルは正常であり、HCV−RNA試験(5’非コード領域のPCR)が陰性である患者と定義する〕を、応答を示さないか又は治療の最後に再発の生化学的応答を示す患者と比較した。
このパイロット試験から、本発明者らは、感染が完全に消失した場合、HCVエンベロープ蛋白に対する抗体は、より通常試験されるHCV抗原に対する抗体より急速に変化し、E1抗体が最も激しく変化する、と結論した。したがって、我々は、より多くの1b型及び3a型感染LTRを入れ、さらに対応する(マッチさせた)シリーズのNRをコホートに補足して、両群に14名ずつの患者が含まれるようにした。数名の部分的応答者(PR)と再発を有する応答者(RR)も解析した。
HCV抗原同定のための分子生物学的アプローチにより、ウイルス診断薬の開発において驚くべき進展がもたらされたが、λgt11ライブラリーの免疫スクリーニング法では、主に、コア及び非構造領域全体に分散した直鎖のエピトープが得られ、エンベロープ領域の解析のためには、哺乳動物細胞におけるE1/E2領域のクローニング及び発現を待たなければならなかった。このアプローチは、ゲノム構造の解読のかなり前から既にエンベロープ領域にそのエピトープがマッピングされていた、他の多くのウイルス感染とは著しく異なる。このようなエピトープ及び対応する抗体は、しばしば、ワクチンの開発に有用な中和活性を有し、及び/又は臨床的若しくは予知的意義のある診断用検定法の開発を可能にした(例えば、B型肝炎表面抗原に対する抗体)。今日HCVワクチン又はC型肝炎疾患の臨床診断及び予知を可能にする検査がないため、免疫監視機構に暴露されたウイルスエンベロープ領域の性状解析は、HCVの診断と予防における新しい方向付けに大きく貢献しうる。
ペプチドenv35A−ビオチン
NH2 −SNSSEAADMIMHTPGCV−GKビオチン(配列番号51)
E1領域のHCVポリ蛋白のアミノ酸208〜227にわたる
ペプチドビオチン−env53(「エピトープA」)
ビオチン−GG−ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL−COOH(配列番号52)
E1領域のHCVポリ蛋白のアミノ酸313〜332にわたる
ペプチド1bE1(「エピトープB」)
H2 N−YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK−ビオチン(配列番号53)
E1領域のHCVポリ蛋白のアミノ酸192〜228にわたる
を合成し、ペプチドE1a−BB(ビオチン−GG−TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL、配列番号54)及びE1b−BB(ビオチン−GG−TPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL、配列番号55)〔これらは、それぞれ遺伝子型1a及び1bの配列の同一領域から得られ、また第9回国際ウイルス学会(the IXth international virology meeting)(グラスゴー、1993)で記載された(「エピトープC」)〕の反応性と比較した。HCV血清のパネルの反応性を、エピトープA、B及びCで試験し、エピトープBは、env35Aとも比較した(47個のHCV陽性血清のうち、8個はエピトープBで陽性であったが、env35Aと反応するものはなかった)。エピトープA、B及びCに対する反応性は、実施例6に記載のようにストレプトアビジンでコーティングしたプレートに結合したビオチン化ペプチド(50μg/ml)に対して、直接、試験した。明らかに、エピトープA及びBが最も反応性が高く、エピトープC及びenv35Aは、はるかに反応性が低かった。完全なE1蛋白に対する反応性を監視したのと同じシリーズの患者(実施例7.1.)で、エピトープA、B及びCに対する反応性を試験した。エピトープCについてはほとんど反応性が見られず、一方、図15、図16、図17及び図18に示すように、エピトープA及びBは大部分の血清と反応した。しかし、最も反応性のエピトープ(エピトープA)に対する抗体でも疾患の緩解を予測するようには見えず、一方、抗1bE1抗体(エピトープB)は、IFN治療の開始時に、ほとんど長期応答者にのみ存在した。したがって、抗1bE1(エピトープB)抗体及び抗env53(エピトープA)抗体が、C型肝炎疾患の予後の有用なマーカーであることが示された。env53エピトープは、交差反応性抗体(主要な遺伝子型と交差反応する抗体)の検出に使用することが有利であり、env53領域に対する抗体は、血清又は肝臓組織中の普遍的なE1抗原の検出に対して非常に有用である可能性がある。env53領域を認識するモノクローナル抗体を、ランダムエピトープライブラリーと反応させた。免疫スクリーニングでモノクローナル抗体5E1A10と反応した4つのクローンには、配列−GWD−が存在していた。配列AWDは、全てのHCV変異株のenv53領域に存在する普遍的なHCV配列に類似しているため、env53交差反応性のマウスのエピトープの基本的な配列を含有すると考えられる。env31も、アミノ末端配列−YQVRNSTGL−(配列番号93)中にエピトープを含有する可能性のある可変領域を明らかに含有し、診断に有用でありうる。表3に示したenv31又はE1−31は、ペプチド1bE1の一部である。ペプチドE1−33及びE1−51もまた、マウス抗体とある程度反応し、ペプチドE1−55〔可変領域6(V6)を含有する;アミノ酸329〜336位にわたる〕もまた、患者血清のあるものと反応した。
24個の抗E2MAbのうち、3個のみが組換えE2に対する反応性についてペプチドによる競合を受け得、そのうち2個は、HVRI領域(ペプチドE2−67及びE2−69、エピトープAと呼ぶ)と反応し、エピトープを認識した1個は、ペプチドE2−13B(エピトープC)による競合を受けた。大多数のマウス抗体は、コンフォメーション性抗E2エピトープを認識した(図19)。HVRI(エピトープA)、及びHVRII(エピトープB)(これは少ない)、及び3番目の直鎖エピトープ領域(ペプチドE2−23、E2−25又はE2−27による競合を受ける、エピトープEと呼ぶ)、及び4番目の直鎖エピトープ領域(ペプチドE2−17Bによる競合を受ける、エピトープD)に対するヒトの応答も、しばしば観察できたが、大部分の血清はコンフォメーション性エピトープと反応した(図20)。これらのコンフォメーション性エピトープは、その相対的位置により以下のように分類されうる:コンフォメーション性エピトープを認識する、ハイブリドーマ15C8C1、12D11F1、9G3E6、8G10D1H9、10D3C4、4H6B2、17F2C2、5H6A7、15B7A2の上澄液中のIgG抗体を、プロテインA親和性クロマトグラフィーにより精製し、得られたIgGを1mg/ml にし、ビオチン存在下でホウ酸緩衝液中でビオチン化した。ゲル濾過クロマトグラフィーにより、ビオチン化抗体を遊離のビオチンから分離した。プールしたビオチン化抗体画分を、100〜10,000倍希釈した。固相に結合したE2蛋白を、非ビオチン化競合抗体の100倍量の存在下でビオチン化IgGにより検出し、次にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンにより検出した。
8.1.緒言
哺乳動物細胞から発現される、vvHCV10AにコードされるE1蛋白及びvvHCV41〜44にコードされるE2蛋白は、それぞれ6個及び11個の炭水化物部分を含有する。これは、vvHCV10A感染又はvvHCV44感染RK13細胞の溶解物を、溶解物中の蛋白(E1を含む)が部分的に脱グリコシル化されるように、低下する濃度のグリコシダーゼ〔PNGaseF又はエンドグリコシダーゼH、(ベーリンガー・マンハイム・ビオケミカ(Boehringer Mannhein Biochemica)、製造業者の取り扱い説明書による〕とインキュベートすることにより、示すことができた(それぞれ図39及び図40)。
幾つかのグリコシル化部位の欠如した突然変異体は、免疫学的反応性が改良されたエンベロープ蛋白の選択を可能にした。例えばHIVについては、幾つかの選択された糖付加モチーフが欠如したgp120蛋白が、診断的目的及びワクチンとしての目的に特に有用であることが見いだされた。A/ホンコン/3/68(H3N2)インフルエンザウイルスのエスケープ突然変異体の血球凝集素蛋白中の新しいオリゴ糖側鎖の付加は、中和モノクローナル抗体との反応性を妨害する(Skehelら、1984)。インフルエンザ血球凝集素蛋白中に、部位特異的突然変異誘発により新規なグリコシル化部位を導入すると、劇的な抗原性変化が観察され、炭水化物が抗原性の調節物質であることが示唆された(Gallagher ら、1988)。別の分析では、フレンドマウス白血病ウイルスの表面蛋白gp70の8個の炭水化物付加モチーフを欠失させた。この突然変異のうち7つはウイルス感染性に影響を与えなかったが、アミノ末端に関して4番目のグリコシル化シグナルの突然変異により、非感染性表現型が得られた(Kaymanら、1991)。更に、N−結合炭水化物鎖の付加は、折りたたみ中間体の安定化、したがって効率的折りたたみ、正しくない折りたたみ及び小胞体での分解の防止、オリゴマー化、生物学的活性、及び糖蛋白の輸送に重要であることが、当該分野で公知である(Roseら、1988;Domsら、1993;Helenius、1994の総説を参照)。
全ての突然変異はクローンHCCl10A(配列番号5)のE1配列上に行なった。第1回目のPCRを、ワクシニア11K後期プロモーターの上流に位置するGPT配列をターゲットとしたセンスプライマー「GPT」(表7を参照)と、突然変異誘発を得るために目的の塩基変化を含有するアンチセンスプライマー(GLY#と命名、#はグリコシル化部位の数を示す。図41を参照)とを使用して行なった。6つのGLY#プライマー(それぞれ特定のグリコシル化部位に対して特異的)を以下のように設計した:
− N−グリコシル化Asnをコードするコドン(AAC又はAAT)を、Glnコドン(CAA又はCAG)に変更。アスパラギンに非常に似ていることからグルタミンを選択した〔2つのアミノ酸は共に中性であり、非極性残基を含有する。グルタミンの側鎖の方が長い(−CH2 −基が1つ余分にある)〕。
− 新しいユニーク(単一)又は稀な制限酵素部位(例えば、E1Gly5の第2のSmaI部位)を作成するために、グリコシル化部位の下流のコドンの1つ又は幾つかに、サイレント変異を導入。アミノ酸配列を変更することなく、この突然変異は、突然変異配列を元々のE1配列(pvHCV−10A)から又は互いに区別する方法を与える(図41)。この追加の制限部位は、新しいハイブリッド(2重、3重、など)グリコシル化突然変異体の構築にも有用でありうる。
− 最初のミスマッチのヌクレオチドの5’に18ヌクレオチドを、そして3’末端に12〜16ヌクレオチドを伸長させる。表7に、N−結合グリコシル化部位の配列と重複する6つのGLY#プライマーの配列を示す。
実施例8.2に記載の突然変異E1配列を含有する6つのプラスミドから出発して、実施例2.5に記載の野性型ワクシニアウイルスとの組換えを行って、組換えワクシニアウイルスを作成した。簡単に説明すると、サブコンフルエントなRK13細胞の175cm2 フラスコを、突然変異E1配列を有する6つの組換えワクシニアウイルスで、及びvvHCV−10A(非突然変異E1配列を有する)と野性型ワクシニアウイルスとで、感染させた。感染の24時間後、細胞を溶解して、実施例4に記載のウェスタンブロッティングで分析した(図44Aを参照)。全ての突然変異体は、SDS−PAGEで、元々のE1蛋白より速い移動度を示し(約2〜3kDa 小さい分子量に相当する)、これにより炭水化物部分が1つ付加されなかったことを確認した。また、組換えウイルスをPCRと制限酵素分析で解析して、異なる突然変異体の同一性を確認した。図44Bに、全ての突然変異体(図41に記載)が予測された追加の制限部位を含有することを示す。細胞溶解物の別の部分を、ELISAにより異なる突然変異体の反応性を試験するために使用した。溶解物を20倍希釈し、実施例6に記載のようにレクチンGNAでコーティングしたマイクロウェルプレートに添加した。捕捉された(突然変異)E1糖蛋白を、実施例6に記載の24名のHCV感染患者の20倍希釈血清と反応させた。6つの突然変異体及びE1のシグナル対ノイズ(S/N)値(GLY#のOD/野性型のOD)を、表8に示す。この表にはまた、GLY#及びE1蛋白のS/N値の比を示す。患者血清との反応性の比較のために異なる突然変異体の細胞溶解物を使用するアプローチにより、反応性レベルではなく異なる発現レベルの結果が観察される可能性があることを理解すべきである。このような困難さは、実施例5に記載のように異なる突然変異体を精製し、全ての異なるE1蛋白の同一量を試験することにより解決できた。しかし、表5に示した結果は、第1(GLY1)、第3(GLY3)、及び第6(GLY6)のグリコシル化モチーフの除去により、幾つかの血清の反応性が低下するが、第2と第5の部位の除去ではそうではないことを、既に示している。GLY4の除去は、幾つかの血清の反応性を改良するようであった。これらのデータは、異なる患者は、本発明のグリコシル化突然変異体に対して異なって反応することを示す。すなわち、このような突然変異体E1蛋白は、HCV疾患の診断(スクリーニング、確認、予知など)と予防に有用でありうる。
クローンHCCL41に対応するE2配列に、α−接合因子プレ/プロシグナル配列を付加し、酵母発現ベクターに挿入した。この構築物で形質転換したS・セレビシエ(S. cerevisiae)細胞は、増殖培地中にE2蛋白を分泌した。S. cerevisiae 株中でのこのような構築物の発現の際に、ほとんどのグリコシル化部位は、高マンノース型グリコシル化で修飾されていたことが観察された(図45)。このため、不均一性のレベルが高くなりすぎ、反応性が妨害され、このことはワクチンにも診断目的にも不適であった。この問題を解決するために、バナジン酸耐性クローンの選択により、改変されたグリコシル化経路を有する S. cerevisiae突然変異体を作成した。このクローンを、分子量の分析及び糖蛋白インベルターゼの不均一性の分析により、改変グリコシル化経路について解析した。これにより、異なるグリコシル化欠損 S. cerevisiae突然変異体が同定できた。次に、選択された突然変異体の幾つかでE2蛋白を発現させ、実施例4に記載のウェスタンブロッティング上で、実施例7に記載のモノクローナル抗体と反応させた(図46)。
これら結果は、HCVエンベロープ蛋白とヒト患者血清との高い反応性を得るには、良好な発現系のみならず良好な精製プロトコールが必要であることを示している。これは、蛋白の本来の折りたたみの保存を保証する本発明の適正なHCVエンベロープ蛋白発現系及び/又は精製プロトコールを用い、夾雑蛋白の排除を保証し、コンフォメーション(したがって、HCVエンベロープ蛋白の反応性)を保持する本発明の精製プロトコールを用いることにより達成される。診断的スクリーニング測定法に必要な精製HCVエンベロープ蛋白の量は、1年間に数グラムの範囲である。ワクチンとして使用するには、更に多量のエンベロープ蛋白が必要であろう。したがって、最適の発現構築物の選択及び小規模のスケールアップにはワクシニアウイルス系が使用でき、数種の酵母株から発現させる場合、高マンノース炭水化物を含有する単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白の大規模発現と精製が達成されうる。例えば、B型肝炎の場合は、哺乳動物細胞からのHBsAgの製造は、酵母由来のB型肝炎ワクチンと比較してはるかに費用がかさむ。
表1:実施例1に記載したE1蛋白の異なる形態を作成するための増幅に使用した各クローン及びプライマーの特徴。
表2:抗E1試験の要約。
表3:競合試験用の合成ペプチド。
表4:エンベロープ抗体レベルの経時変化。
表5:LTRとNRの差。
表6:マウスE2モノクローナル抗体間の競合実験。
表7:E1グリコシル化突然変異体の構築のためのプライマー。
表8:E1グリコシル化突然変異体のELISAによる分析。
Claims (48)
- 形質転換宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する際に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、E1及び/又はE2及び/又はE1/E2よりなる群から選択される組換えHCVの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を精製する方法。
- ジスルフィド結合切断又は還元工程を、部分的切断又は還元条件下で行う、請求項1記載の方法。
- ジスルフィド結合切断剤が、好適には0.1〜50mM、好適には0.1〜20mM、更に好適には0.5〜10mMの範囲の濃度の、ジチオスレイトール(DTT)である、請求項1又は2記載の方法。
- ジスルフィド結合切断剤が、界面活性剤である、請求項1記載の方法。
- 界面活性剤が、好適には1〜10%の濃度、更に好適には3.5%の濃度の、エンピゲン−BB(Empigen-BB)である、請求項4記載の方法。
- ジスルフィド結合切断剤が、DTTのような古典的ジスルフィド結合切断剤と、エンピゲン−BBのような界面活性剤との組合せを含む、請求項1又は2記載の方法。
- SH基保護剤によりジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を更に含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- SH基保護剤が、N−エチルマレイミド(NEM)又はその誘導体である、請求項7記載の方法。
- ジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を、低pH条件により達成する、請求項7記載の方法。
- 少なくとも以下の工程:
− 組換えE1及び/又はE2及び/又はE1/E2発現宿主細胞を、場合によりN−エチルマレイミド(NEM)のようなSH基保護剤の存在下で、溶解し、
− レンチルレクチンクロマトグラフィーのようなレクチンクロマトグラフィー、あるいは抗E1及び/又は抗E2特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性などの親和性精製により、上記HCVエンベロープ蛋白を回収し、
− DTTのようなジスルフィド結合切断剤を用いて、好適にはNEM又はビオチン−NEMのようなSH基保護剤の存在下で、ジスルフィド結合を還元又は切断して、そして
− 還元されたE1及び/又はE2及び/又はE1/E2エンベロープ蛋白を、ゲル濾過、及び場合によりこれに続くNi2+−IMACクロマトグラフィーと脱塩工程により回収する工程、
により更に特徴づけられる、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。 - 請求項1〜10のいずれか1項記載の方法により単離されることを特徴とする、E1及び/又はE2及び/又はE1/E2よりなる群から選択される実質的に精製された組換えHCVの単一の又は特定オリゴマーの組換えエンベロープ蛋白を含む組成物。
- 更に、組換えHCVエンベロープ蛋白が、ワクシニアのような組換え哺乳動物細胞から発現されることを特徴とする、請求項11記載の組成物。
- 更に、組換えHCVエンベロープ蛋白が、組換え酵母細胞から発現されることを特徴とする、請求項11記載の組成物。
- 更に、組換えHCVエンベロープ蛋白が、請求項15〜24のいずれか1項記載の少なくとも1つの組換えベクターの発現生成物であることを特徴とする、請求項11記載の組成物。
- ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性又はウイルス性プロモーター配列及びその後に続く単一の又は特定オリゴマーのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白の発現を可能にするヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸1位と192位の間の領域で開始し、アミノ酸250位と400位の間の領域で終わるか、より好適には250位と341位の間の領域で終わるか、更により好適には290位と341位の間の領域で終わる単一のHCVのE1蛋白をコードすることを特徴とする、請求項15記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸117位と192位の間の領域で開始し、アミノ酸263位と400位の間の領域で終わるか、より好適には250位と326位の間の領域で終わる単一のHCVのE1蛋白をコードすることを特徴とする、請求項16記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、264〜293位プラスマイナス8アミノ酸の間の最初の疎水性ドメインが欠失している単一のHCVのE1蛋白をコードすることを特徴とする、請求項16又は17記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸290位と406位の間の領域で開始し、アミノ酸600位と820位の間の領域で終わるか、より好適には322位と406位の間の領域で開始するか、更により好適には347位と406位の間の領域で開始するか、そして最も好適には364位と406位の間の領域で開始する単一のHCVのE2蛋白をコードすることを特徴とする、請求項15記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸623、650、661、673、710、715、720、746又は809位のいずれかの位置で終わることを特徴とする、請求項19記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、それに5’末端ATGコドン及び3’末端停止コドンを加えられていることを特徴とする、請求項16〜20のいずれか1項記載の組換えベクター。
- ヌクレオチド配列が、更に、コード領域の3’末端に第Xa因子切断部位及び/又は3〜10個、好適には6個のヒスチジンコドンを加えられていることを特徴とする、請求項16〜21のいずれか1項記載の組換えベクター。
- 配列番号3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47及び49に示されるいずれかの配列又はこれらの部分を含む核酸。
- 請求項23記載の組換え核酸を有する組換えベクター。
- 更に、上記E1又はE2蛋白に存在する少なくとも1つのグリコシル化部位が、核酸レベルで除去されていることを特徴とする、請求項15〜24のいずれか1項記載の組換えベクター。
- ベクターが、宿主細胞中で機能することが可能、かつHCVのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白の発現を制御することが可能な制御配列に加えて、請求項15〜23のいずれか1項記載のHCVのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項15〜25のいずれか1項記載の少なくとも1つの組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項26記載の宿主細胞により発現された組換えE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白。
- 少なくとも以下の工程:
− 請求項15〜25のいずれか1項記載の組換えベクターで形質転換された請求項26記載の宿主細胞を、適切な培地中で増殖させ、
− 適切な条件下で請求項16〜25のいずれか1項記載のベクター配列を発現させ、そして
− 好適にはN−エチルマレイミド(NEM)のようなSH基保護剤の存在下で、上記形質転換細胞を溶解し、
− 例えばレクチンクロマトグラフィーあるいは抗E1及び/又は抗E2特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーのような親和性精製(上記レクチンは好適にはレンチルレクチンである)により、上記HCVエンベロープ蛋白を回収し、次に− 前工程の溶出液を、DTTのようなジスルフィド結合切断剤と、好適にはNEM又はビオチン−NEMのようなSH基保護剤の存在下で、インキュベートして、そして
− ゲル濾過、及び場合により更にNi2+−IMACクロマトグラフィーと脱塩工程により、HCVの単一の又は特定オリゴマーのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白を単離する工程、
を含むことを更に特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。 - 少なくとも1つの下記のE1及び/又はE2ペプチド:
コア/E1V1領域のアミノ酸181〜200位にわたるE1−31(配列番号56)、
E1領域のアミノ酸193〜212位にわたるE1−33(配列番号57)、
E1V2領域のアミノ酸205〜224位にわたるE1−35(配列番号58)(エピトープB)、
E1V2領域のアミノ酸208〜227位にわたるE1−35A(配列番号59)(エピトープB)、
E1領域〔V1、C1及びV2領域(エピトープBを含有する)〕のアミノ酸192〜228位にわたる1bE1(配列番号53)、
E1領域のアミノ酸301〜320位にわたるE1−51(配列番号66)、
E1C4領域のアミノ酸313〜332位にわたるE1−53(配列番号67)(エピトープA)、
E1領域のアミノ酸325〜344位にわたるE1−55(配列番号68)、
E2領域のアミノ酸397〜416位にわたるEnv67即ちE2−67(配列番号72)(エピトープA)、
E2領域のアミノ酸409〜428位にわたるEnv69即ちE2−69(配列番号73)(エピトープA)、
E2領域の583〜602位にわたるEnv23即ちE2−23(配列番号86)(エピトープE)、
E2領域の595〜614位にわたるEnv25即ちE2−25(配列番号87)(エピトープE)、
E2領域の607〜626位にわたるEnv27即ちE2−27(配列番号88)(エピトープE)、
E2領域の547〜566位にわたるEnv17B即ちE2−17B(配列番号83)(エピトープD)、
E2領域の523〜542位にわたるEnv13B即ちE2−13B(配列番号82)(エピトープC)、
を含む組成物。 - 少なくとも1つの下記のコンフォメーション性エピトープ:
モノクローナル抗体15C8C1、12D11F1、及び8G10D1H9により認識されるエピトープF、
モノクローナル抗体9G3E6により認識されるエピトープG、
モノクローナル抗体10D3C4及び4H6B2により認識されるエピトープH(又はC)、
モノクローナル抗体17F2C2により認識されるエピトープI、
を含む組成物。 - 請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の組成物で免疫して作成されるE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体。
- 薬剤としての使用のための、更に詳しくはHCVのE1又はE2抗原の存在の検出のための免疫測定用キットに組み込むため、疾患の予知/監視のため、又はHCV治療のための、請求項31記載のE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体。
- HCVのE1又はE2抗原の検出のための免疫測定用キットの調製のための、HCV疾患の予知/監視のためのキットの調製のための、又はHCV薬剤の調製のための、請求項31記載のE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体の用途。
- 少なくとも下記の工程:
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求項31記載のE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体に、生物学的試料を接触させ、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に検出する工程
を含む、生物学的試料中に存在するHCV抗原のインビトロ診断の方法。 - 以下のもの:
− 好適には固体基材上に固定された形の、請求項31記載の少なくとも1つのE1及び/又はE2特異的モノクローナル抗体、
− これらの抗体と、生物学的試料中に存在するHCV抗原との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
を含む、生物学的試料中に存在するHCV抗原の存在を測定するためのキット。 - 薬剤として使用するための、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の組成物。
- 免疫応答を起こすために、場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にして、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の有効量の組成物を投与することを特徴とする、HCVに対する哺乳動物(好適にはヒト)の免疫のためのワクチンとして使用するための、前記組成物。
- 免疫応答を起こすために、場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にして、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の有効量の組成物を投与することを特徴とする、HCVに対する哺乳動物(好適にはヒト)の免疫のためのワクチンを調製するための、前記組成物の用途。
- 場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にした、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の有効量の組成物を含む、HCVに対して哺乳動物(好適にはヒト)を免疫するためのワクチン組成物。
- 生物学的試料中に存在するHCV抗体のインビトロ検出のための、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の組成物。
- 生物学的試料中に存在するHCV抗体の検出のための免疫測定用キットの調製のための、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の組成物の用途。
- 少なくとも以下の工程:
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求項11〜14又は請求項29〜30のいずれか1項記載の組成物に、生物学的試料を接触させ、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に検出する工程、
を含む、生物学的試料中に存在するHCV抗体のインビトロ診断の方法。 - 以下のもの:
− 好適には固体基材上に固定された形の、請求項11〜14項又は請求項29〜30のいずれか1項記載の少なくとも1つのペプチド又は蛋白組成物、
− これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在するHCVに対する抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
を含む、生物学的試料中に存在するHCV抗体の存在を測定するためのキット。 - 以下の工程:
− HCV感染患者からの生物学的試料を、E1蛋白又はその好適な部分と、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
− 結合しなかった成分を除去し、
− 治療の開始時及び治療中の上記試料中の抗E1力価を計算し、
− 治療の開始時及び/又は治療中の上記試料中の抗E1力価に基づき、HCV疾患の自然の経過を監視するか、又は上記患者の治療に対する応答を予知する工程、
を含む、HCV感染に罹っている患者のHCV疾患のインビトロ監視、又は、特にインターフェロンによる、治療に対する応答を予知するための、請求項11〜14のいずれか1項記載のE1蛋白又は請求項29記載のその部分、更に詳しくはHCVの単一のE1蛋白又はE1ペプチドを含む組成物の用途。 - 以下のもの:
− 少なくとも1つのE1蛋白又はE1ペプチド、更に詳しくは請求項11〜14又は請求項29のいずれか1項記載のE1蛋白又はE1ペプチド、
− これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗E1抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により治療の進行中の抗E1力価の低下を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、HCV感染に罹っている患者のHCV疾患の監視、又は、特にインターフェロンによる、治療に対する応答を予知するためのキット。 - 少なくとも以下の工程:
(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求項11〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白組成物、あるいは請求項29項記載の少なくとも1つのE1又はE2ペプチド組成物に、1つ又はそれ以上の血清型のHCV抗体の存在について分析すべき生物学的試料を接触させ、
(ii)結合しなかった成分を除去し、
(iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
(iv)該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に(例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により)検出し、観察された結合パターンから1つ又はそれ以上のHCV血清型の存在を推定する工程、
を含む、生物学的試料中に存在するHCVの1つまたはそれ以上の血清型を検出するための、更に詳しくは検出すべきHCVの異なる型の抗体を検出するための、1つの測定フォーマットに組合せた血清型測定法。 - 以下のもの:
− 請求項11〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つのE1及び/又はE2及び/又はE1/E2蛋白、あるいは請求項29記載のE1又はE2ペプチド、
− これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗E1抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
− 前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
− 場合により、観察された結合パターンから1つ又はそれ以上の血清型の存在を検出するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するHCVの1つ又はそれ以上の血清型を分類する(serotyping)ための、更に詳しくはHCVのこれらの血清型に対する抗体を検出するためのキット。 - 請求項42〜46のいずれか1項記載の方法によりHCVの有無又は遺伝子型を決定するために、固体基材上に固定化するための、及び逆相ハイブリダイゼーション測定法に取り込むための、好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線状に固定化するための、請求項11〜14又は請求項29のいずれか1項記載のペプチド又は蛋白組成物。
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