CN1325517C - 抗丙型肝炎病毒抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

叙述了一种新颖的抗体，该抗体特异性识别HCV糖蛋白E2的构象依赖性表位，并能中和E2蛋白与易感性细胞的结合。另外，提供了上述抗体识别的抗原和表位，以及编码所述抗体的多核苷酸。还提供了载体，其包含所述多核苷酸和被其转化的宿主细胞，以及其在所述抗体产生中的用途。另外，提供了药物和诊断组合物，其包含任何上述的抗体、抗原、表位、多核苷酸、载体或细胞。还叙述了上述抗体、抗原、多核苷酸和载体在继承性免疫治疗，优选在治疗或预防肝移植中HCV感染的用途。

Description

抗丙型肝炎病毒抗体及其用途
发明领域
本发明涉及能特异性结合丙型肝炎病毒(HCV)糖蛋白E2的构象依赖性表位的人抗体，及其各种用途。
在本说明书中引用了数篇文献。各篇文献在此引入以供参考(包括制造厂商说明书、指南等)；然而，并不认为所引用的任何文献确实是本发明的现有技术。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型肝炎的主要病原体。已估计献血者人群中的HCV感染流行率在0.4到2％范围内(Choo等，1989)。在70％以上的病人中，急性HCV感染引起慢性肝炎的产生，它能向肝硬化和肝细胞癌演化(Saito等，1990)。HCV是一种具有包膜的、正链RNA病毒，归类于黄病毒科(Francki等，1991，Miller等，1990)。它含有约9，500nts的基因组，编码3010到3033个氨基酸的一种多蛋白。宿主和病毒蛋白酶对该多蛋白的加工导致产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白(Rice等，1996)。结构蛋白包括核衣壳和两个推定的病毒粒子包膜糖蛋白E1和E2(Miyamura等，1993)。非结构蛋白包括NS2到NS5抗原。
在一些人中，急性感染成功的缓解，表明HCV可被宿主免疫系统控制。宿主克服HCV感染的机制仍然未知。以前的报道强烈提示，人和黑猩猩能产生病毒中和性抗体(Choo等，1994，Farci等，1994，1996，Shimizu等，1994)。在用重组E1和E2蛋白免疫接种后，已成功实现了体内的保护黑猩猩防止被同源HCV分离物初次感染(Choo等，1994)。在该研究中，只有那些显示抗E2抗体高滴度的黑猩猩受到了保护。虽然未鉴定出未识别中和抗原结构域，但推测免疫原的构象对中和性抗体的诱导是关键的。
由于到目前为止，尚无培养病毒和开发中和试验的有效体外复制系统，因此正在积极寻找评估抗-E1/E2抗体的生物学功能的其它试验。已在初步的研究中描述了对病毒附着于推测的易感细胞上的预防方法(Shimizu等，1994，Zibert等，1995)。更近的，已开发了一种“体外”中和结合(NOB)的试验，其利用了高度纯化的E2蛋白与易感性靶细胞的特异性结合(Rosa等，1996)。该试验使得能定量评价能中和E2与这些细胞的结合的NOB抗体。用该系统，Rosa等已显示，只有用E1和E2蛋白免疫，产生抗-NOB高滴度的黑猩猩才受到保护，对抗攻击性感染(Rosa等，1996)，提示NOB活性可能是“体内”病毒感染被中和的一种指标。在HIV感染中，一种类似的模式最近已显示，抗体与包膜糖蛋白寡聚物结合的亲和力是病毒中和的良好预告(Fouts等，1997)。另一种评估抗-E1和/或抗-E2抗体的生物学活性的方法包括，测试这些抗体识别据信存在于病毒颗粒表面的天然结构的能力。体外研究已显示，E1和E2相互反应，形成非共价连接的复合物(Deleersnyder等，1997，Ralston等，1993)。已提出这些复合物代表HCV病毒颗粒的功能性亚基(Deleersnyder等，1997，Dubuisson等，1994，Dubuisson和Rice，1996，Ralston等，1993)。对病毒感染中B细胞所有组成成分的探测，对于理解与这些感染有关的病理是关键的。人单克隆抗体提供了另一种方法。对于HCV，仅报道了对有限数目的病毒抗原的这类抗体的分离和特性分析。这些包括核衣壳、NS3和NS4蛋白质(Akatsuka等，1993，Cerino等，1991，1993，Chan等，1996，Mondelli等，1994)和最近的是糖蛋白E2(Chan等，1996)。对于后一种情况，作者使用了噬菌体展示技术，与合成肽的使用结合，来筛选抗-E2免疫反应性，并能获得特异性IgG单链Fvs，其识别E2序列。虽然鉴定到了一种特异性线性表位序列，但未描述过该抗-E2抗体的生物学活性，并且该抗体在控制感染进程中的推定作用仍然未限定。最近，WO97/40176描述了从一组合文库中获得的免疫球蛋白分子，其能特异性与HCV E2抗原结合。虽然显示这些免疫球蛋白的Fab片段在中和结合试验中具有结合活性，但发现重组表达的Fab克隆和对应的完整IgG分子在中和HCV E2多肽的结合中是无效的。
发明简述
本发明涉及新颖抗体，其包括人抗体可变区的至少一个互补决定区(CDR)，能特异性识别HCV糖蛋白E2的构象依赖性表位。另外，本发明涉及被所述抗体识别的抗原。此外，本发明涉及编码上述抗体或抗原的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体，以及含有上述多核苷酸或载体的细胞。本发明的另一个方面是一种制备能识别HCV糖蛋白E2构象依赖性表位，并能中和E2蛋白与易感性细胞结合的抗体的方法。本发明还涉及含有上述抗体、抗原、多核苷酸、载体或细胞的药物和诊断组合物，以及上述化合物在各种治疗和诊断应用中的用途。
发明详述
因此，本发明的技术问题是提供治疗和预防人HCV感染的工具和方法。
该技术问题的解决是通过提供权利要求中确定特征的实施例而实现，即提供以下抗体，其1)能识别构象依赖性决定簇，2)能识别衍生自不同HCV基因型的抗原，和3)能沉淀据信存在于病毒颗粒表面上的非共价结合的E1E2复合物；和4)能中和E2蛋白与易感性细胞的结合，这提示该抗体体内中和的能力。这些抗体对发展战胜高度易变因子(如HCV)感染的治疗性或预防性策略特别有用。
因此，本发明涉及一种抗体，其包含至少一个(优选两个，更优选三个、四个或五个，和最优选六个)人抗体VH和/或VL区的互补决定区(CDR)，所述VH和/或VL区包含图5(VL)(SEQID NO：1)和图6(VH)(SEQ ID NO：3)描述的DNA序列编码的氨基酸序列，其特异性识别丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位，并能沉淀共价或非共价结合的E2/E1复合物。另外，和/或本发明的抗体还包含人免疫球蛋白链VL区的至少1，2或3个CDR，包含SEQ ID：6的氨基酸序列，并由SEQ ID NO：5(代表编码SEQID NO：1(图5)的VL等位变体)描述的DNA序列编码。
本领域技术人员知道，抗体的各可变区(重链VH和轻链VL)包含三个高变区，有时称为互补决定区或“CDR”，侧接4个相对保守的构架区，或“FR”。可测定本发明抗体可变区中包含的CDR，如根据Kabat，免疫学感兴趣的蛋白质序列(U.S.Department of Health and Human Services，3rd edition，1983，4th edition，1987，5th edition 1990)。本领域技术人员可轻易理解，可使用具有上述可变区的抗体可变区，来构建其它具有所需特异性和生物功能的多肽或抗体。因此，本发明还包括含有至少一个上述可变区的CDR，并有利的，具有与本文所附实施例中描述的抗体结合性能基本相同或相似的多肽和抗体。本领域技术人员将易于理解，使用上述可变区或CDR，可根据本领域已知方法，如EP-A1 0 451 216和EP-A1 0549 581中所述的方法构建上述抗体。
术语“丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位”指被本发明的抗体识别的表位的非线性性质。这意味着该表位的抗原决定簇是由HCV糖蛋白E2的三维结构提供的，而不是由其氨基酸序列提供的。
术语“能沉淀共价或非共价结合的E2/E1复合物”指本发明的抗体沉淀E1和E2非共价结合复合物的能力，据信该复合物存在于病毒颗粒上。
术语“能中和E2蛋白和易感性细胞的结合”描述了候选抗体中和高度纯化的E2与对HCV感染易感性细胞结合(结合的中和或NOB)的能力；也见实施例4。有利的，本发明的抗体在浓度为约每毫升1微克，优选浓度为每毫升0.1微克，和最优选的浓度为每毫升约0.03微克时具有NOB活性。
根据本发明，选择一种不需要抗原纯化，特异性检测能识别直接在细胞中表达的E2的抗-E2抗体的筛选试验，来鉴定和纯化针对构象决定性决定簇的抗体。该试验还能根据基因型1a衍生抗原的表达，从而确定交叉反应性抗-E2抗体和表位的特征。用该方法，已从两个HCV慢性感染病人获得了两种产生抗-E2抗体的克隆。第一个克隆(克隆503)获自被基因型4分离物感染的病人(病人1)，而第二个克隆(克隆108)衍生自被基因型1b分离物感染的病人(病人2)。另外显示对基因型1b抗原有良好反应性的HMab表明，在全世界发现的至少两种主要流行性病毒亚型(亚型1a和1b)中，这些抗体靶向的决定簇是保守的。根据上文，可合理的预计，本发明的抗体也能与其它基因型，如2，3a，4，5和/或6的抗原反应。与这些基因型有关的本发明抗体的结合活性可易于根据实施例中叙述的方法来测试。
本发明获得的结果表明，本发明HMab识别的决定簇位于E2的构象依赖性区域，因为各种使用表达的截短的蛋白质结构域的筛选方法(包括肽扫描、蛋白质印迹和免疫荧光分析)不能用来鉴定线性决定簇；见实施例2。另一方面，在还原条件或非还原条件下进行的免疫沉淀研究表明，HMab识别一种构象依赖性决定簇。在非还原条件下，这些抗体沉淀共价和非共价结合的E1E2复合物；见实施例3.2。相信后者是掺入病毒颗粒中的功能性亚基(Deleersnyder等，1997)。具体从表位形成的动力学分析获得的现存数据强烈表明，这两个HMab识别E2蛋白质看来早折叠的区域。这些区域随该在蛋白质的进一步成熟将维持可及，直到它采取了其最终构象特征(存在于病毒颗粒表面的易感性E2形式)。动力学分析和NOB数据(即抗体503，显示NOB活性)还提示这两个抗体识别不同决定簇；见实施例4。另外，抗体对E2蛋白质的亲和力也不同。
本发明获得的最鼓舞人心的结果是，证明了HMab之一显示强HOB活性。这些观察，结合Rosa等(Rosa等，1996)的观察，表明NOM抗体识别的决定簇可能是E2的构象依赖性区域，看来是在不同基因型之间保守的功能域。这些区域似乎与已显示含有中和表位的高变区1(HVR)不同。在最近研究中，Zibert等(Zibert等，1997)已能使针对HVR中发现的非构象性结构的抗体早期出现与急性自身限制性感染关联起来。该研究结果提示，针对E2线性决定簇的抗体在HCV感染控制中的关键性存在和作用，该观察与最初在黑猩猩模式中Farci等(Farci等，1996)进行的研究结果一致。在后来一研究中，作者诱导出了针对HVR中肽的超免疫血清，血清含有能体外中和明确特性的接种物感染力的抗体。Shimizu等也进行了相似的实验(Shimizu等，1996)。因此，所有这些研究强烈提出，HCV的中和大部分是类特异性的，涉及可变的非保守表位的参与。不过，最近的观察已开始提出存在其它中和决定簇，具有交叉反应性，并不针对HVR。在Choo等的疫苗研究中，诱导的中和抗体不针对E2的HVR，而明显针对该抗原携带的其它决定簇(Choo等，1994)。Abrignani最近已观察到，在慢性感染的自发缓解和抗-NOB抗体高滴度之间的关系(Abrignani，1997)。在本文下文实施例所述的病人中，对E2结合的高的或可测量的中和能力并不限于被基因型1a分离物感染的病人血清，从而提示交叉反应性表位(如本申请中所述的那些)的存在。由于在纯化的Mab的NOB滴度和病人(我们的研究中的病人都具有相似的大于1∶1000的NOB血清滴度)血清中发现的滴度之间，寻找直接关系困难，但因此令人惊讶的是，抗体503在极低浓度下(0.03微克/毫升)可检测的，提供强大活性的NOB活性；见实施例4。
预期本发明产生的HMAb生物合成，HCV糖蛋白的生物合成，折叠和装配，以及对病毒颗粒结构和推定的细胞表面受体进行特性分析的有用工具。由于以Ab503作示范的本发明的抗体代表迄今描述的第一种具有NOB活性的HMAb，该抗体对被动免疫研究特别有用。对于慢病毒而言，抗体灌注研究已证明，施用中和性抗体在不同动物模型中控制和预防感染的有益作用(Conley等，1996，Emini等，1992，Putkonen等，1991)。
在本发明的优选例中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人源化抗体、或其片段，它们能特异性结合所述的HCV E2糖蛋白，还包括双特异性抗体、合成抗体、抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等，或这些抗体任何一种的化学修饰衍生物。可通过Khler和Milstein，自然256(1975)，495，和Galfr，酶学方法73(1981)，3，首先描述的技术(其包含将小鼠骨髓瘤细胞和衍生自接种过的哺乳动物的脾细胞融合)，以及本领域所发展的改良)来制备单克隆抗体。另外，可用Harlow和Lane“抗体，实验手册”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988描述的方法，获得针对上述表位的抗体及其片段。当用噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可用如BIAcore系统中使用的表面细胞质基因组共振，来提高能与构象依赖性HCV糖蛋白E2表位的某表位结合的噬菌体抗体的效力(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志，183(1995)，7-13)。在例如WO89/09622中描述了嵌合抗体的产生。在EP-Al 0 239400和WO90/07861中描述了产生人源化抗体的方法。本发明所用的另一个抗体来源是所谓的异种抗体。在WO91/1074 1，WO94/02602，WO96/34096和WO96/33735中描述了产生异种抗体，如在小鼠中产生人抗体的一般原理。如上所述，本发明的抗体可以以完整抗体之外的各种形式存在；包括例如：Fv、Fab和F(ab)2，以及单链；见例如WO88/09344。对于双特异性抗体，其中一种特异性针对HCVE2糖蛋白表位，而另一种优选针对T细胞抗原(如CD3)，为了捕捉病毒或受HCV感染并能被高效摧毁的靶细胞，识别病毒表位的结合位点具有高亲和力是有利的。另一方面，识别T细胞的结合位点的亲和力必须是天然T细胞受体/配体相互作用，或T细胞共刺激分子与其受体相互作用中发现的亲和力的数量级。
可单用或联用本领域已知的常规技术，使用例如氨基酸缺失、插入、取代、加成、和/或重组，和/或任何本领域已知的其它修饰方法，来进一步修饰本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链。在作为免疫球蛋白的氨基酸序列基础的DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员是熟知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.y.。
在一具体优选例中，本发明的抗体分别包含图5和6中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列。
在另一个优选例中，本发明涉及一种抗原或其表位，其被本发明的抗体识别。所述抗原或表位可以是糖基化的、未糖基化的或部分去糖基化的。如本文所讨论的，和实施例中解释的，本发明的特征是由上述抗体识别的新颖抗原。为了鉴定和分离本发明的抗原和表位，可通过将各种cDNA注入卵母细胞，经充分时间来表达cDNA基因产物，并用本发明的抗体测试所要的cDNA表达产物的存在，来筛选cDNA文库。
另外，可用本发明的抗体，对大肠杆菌中的cDNA表达文库间接筛选具有至少一个本发明的表位的肽(Chang和Gottlieb，神经科学杂志，8：2123，1988)。在揭示了这些抗原的结构后，可合理设计结合合伴和/或区域。例如，可用合适的计算机程序，来进行结构基序的折叠模拟和计算机重设计(Olszewski，蛋白质25(1996)，286-299；Hoffman，计算机应用生物科学11(1995)，675-679)。另外，可用计算机来对详细的蛋白质模型进行构象和能量分析(Monge，分子生物学杂志，247(1995)，995-1002；Renouf，高等实验医学生物学(1995)，37-45)。
在本发明的另一个实施例中，涉及编码本发明上述任何抗体免疫球蛋白链的至少一个可变区的多核苷酸。免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单元。该形式是四聚体，由两对相同的免疫球蛋白链构成，每对具有一条轻链和一条重链。在各对中，轻链和重链可变区或功能域都负责结合抗原，而恒定区负责抗体的效应器功能。除了抗体，免疫球蛋白还存在各种其它形式(包括比全长短，但保留所要的活性的形式)，包括Fv，Fab，和F(ab’)2，以及单链抗体(如Huston，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，85(1988)，5879-5883和Bird，科学242(1988)，423-426)；也见上。免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个高变区(也称为CDR)间的“构架”区构成；见上。
还可通过单独或联合表达编码本发明的抗体免疫球蛋白的重链或轻链的重组DNA节段产生本发明的抗体。
本发明编码上述抗体的多核苷酸可以是例如：DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子，包含任何单独或联合的那些多核苷酸。所述多核苷酸优选是载体的一部分。这些载体还可包含其它基因，如标记基因，其使所述载体能在合适的宿主细胞中，和合适的条件下被选择。优选的，本发明的多核苷酸可和能使基因在原核或真核细胞中表达的表达控制序列操作性连接。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸转录成可翻译的mRNA。本领域技术人员对确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调控元件是熟知的。它们通常包括确保转录起始的调控序列，和可任选的确保转录终止和转录稳定的聚腺苷酸化信号。其它调控元件可包括转录和翻译增强子，和/或天然结合的或异源启动子区域。就此而言，本领域技术人员易于理解，编码至少一条轻链和/或重链可变区的多核苷酸可编码两条免疫球蛋白链或仅一条链的可变区。类似的，所述多核苷酸可受同一启动子的控制，或可分别受控制进行表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括例如：大肠杆菌的PL、lac、trp或tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调控元件例子是酵母的AOX1或GAL1启动子，或CMV-、SV40-、RSV-启动子(Rous肉瘤病毒)，GMV-增强子，SV40-增强子或哺乳动物和其它动物细胞中的珠蛋白内含子。除了负责转录起始的元件以外，这些调控元件还可包含在多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-聚腺苷酸位点或tk-聚腺苷酸位点。另外，根据所用的表达系统，可将能将多核苷酸指向细胞区室，或将其分泌入介质的前导序列加到本发明多核苷酸的编码序列上，这是本领域熟知的。前导序列在适当的时象与翻译、起始和终止序列装配在一起，而且优选能指导翻译的蛋白质或其部分分泌入(周质)空间或胞外介质的前导序列。可任选的，异源序列能编码一种融合蛋白，该蛋白包括能赋予所需特征，如稳定性或简化表达的重组产物纯化过程的C-和N-末端识别肽。就此而言，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNA1，pcDNA3(In-vitrogene)，或pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选表达控制序列将是在载体中能转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦载体被掺入合适宿主，将宿主维持在适合高水平表达核苷酸序列的条件下，而且如需要，可收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚物或完整抗体，结合性片段或其它免疫球蛋白形式；见Beychok，免疫球蛋白合成的细胞，Academic Press，N.Y.(1979)；还可见例如附加实施例。
如上所述，可单独或作为载体的一部分使用本发明的多核苷酸，来在细胞中表达本发明的多肽，用于与HCV感染有关疾病的基因治疗或诊断。将本发明的多核苷酸或载体引入细胞，进而产生抗体。根据采用体外或体内技术，将治疗性基因引入细胞的基因治疗是最重要的基因转移的应用之一。在文献中描述了体外或体内基因治疗的合适方法和载体，它们对本领域技术人员人员是已知的；见例如Giordano，天然药物2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，科学256(1992)，808-813；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Wang，天然药物2(1996)，714-716；WO94/29469；WO 97/00957或Schaper，生物技术的当前观点7(1996)，635-640，和其中引用的文献。可设计本发明的多核苷酸和载体，用于直接引入或通过脂质体或细菌载体(如腺病毒、反转录病毒)引入细胞。优选所述细胞是种系细胞，胚胎细胞，或卵细胞或其衍生物，最优选的所述细胞是种系细胞。
另外，本发明涉及载体，特别是在基因工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码本发明抗体免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸；可任选的联合编码本发明抗体的其它免疫球蛋白链可变区的，本发明的多核苷酸。优选所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。可使用衍生自反转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、或牛乳头瘤病毒的表达载体，来将本发明的多核苷酸或载体传递入靶细胞群。可使用本领域技术人员熟知的方法，来构建重组病毒载体；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel，分子生物学现有方案，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)描述的技术。另外，可将本发明的多核苷酸和载体重新构建入脂质体来传递给靶细胞。可将含有本发明的多核苷酸的载体(如免疫球蛋白重链和/或轻链可变区编码序列和表达控制序列)用熟知的方法(其根据细胞宿主的类型而不同)转移入宿主细胞。例如，对于原核细胞常用氯化钙转染，而对于其它细胞宿主可用磷酸钙处理或电穿孔；见Sambrook，上文。
本发明还涉及用本发明的多核苷酸或载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体存在于宿主细胞中，可以整合入宿主细胞的基因组或可维持在染色体外。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，如细菌，昆虫，真菌，植物，动物或人细胞。优选真菌细胞是例如：酵母属，特别是酿酒酵母种的细胞。术语“原核”指能用DNA或RNA转化或转染，来表达本发明抗体或对应的免疫球蛋白链的细菌。真核宿主可包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽胞杆菌。术语“真核”指包括酵母、高等植物、昆虫和优选哺乳动物的细胞。根据在重组产生程序中使用的宿主，本发明的多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化或非糖基化的。本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链还可包括起始甲硫氨酸残基。可用本发明的多核苷酸，使用任何本领域技术人员通常已知的技术来转化或转染宿主。另外，制备融合的可操作性连接的基因和在哺乳动物细胞和细菌等中表达它们的方法是本领域熟知的(Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.)。可利用本文所述的基因构建物和方法，来在真核或原核宿主中表达本发明的抗体和对应的免疫球蛋白链。一般与宿主联系，使用含有启动子序列，促使插入的多核苷酸有效转录的表达载体。表达载体通常含有复制起始点，启动子和终止子，以及能提供转化细胞的表型选择的特异性基因。另外，可用含有本发明细胞的转基因动物，优选哺乳动物来大量产生本发明的(多)肽。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及产生能识别丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位的抗体，或其功能性片段或免疫球蛋白链的方法，该方法包括
(a)培养本发明的细胞；和
(b)从培养物中分离所述抗体或其功能性片段或免疫球蛋白链。
转化的宿主可在发酵罐中生长，并根据本领域已知的技术培养，以实现最佳细胞生长。一旦表达，可根据本领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等纯化本发明的完整抗体、其二聚物、独立的轻链和重链，或其它免疫球蛋白形式；见Scopes“蛋白质纯化”，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然后，可从生长培养基、细胞裂解液、或细胞膜组分中分离出本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链。可通过任何常规方法，如与针对本发明抗体恒定区的单克隆和多克隆抗体的使用有关的，制备性层析分离和免疫学分离来分离和纯化微生物表达的抗体或免疫球蛋白链。对本领域技术人员清楚的是，本发明的抗体可进一步与其它分子偶联，用于药物靶向和显影应用。可在抗体或抗原表达后，用化学方法将其交联到结合位点，或可将偶联产物经基因工程在DNA水平改造入本发明的抗体或抗原。然后在合适的宿主细胞中表达该DNA，如需要，收集表达的蛋白质并复性。
对于药物学使用，优选至少约90到95％均一性的基本纯化的免疫球蛋白，最优选是98到99％或以上的均一性。一旦部分纯化(或按所需纯化至均一)可用该抗体治疗(包括体外)或用于开发和进行试验程序。
本发明还涉及产生能表达本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链的细胞的方法，包括用本发明的多核苷酸或载体基因工程改造细胞。可使用本发明方法获得的细胞，来测试本发明抗体与其抗原的相互作用。
另外，本发明涉及由本发明的多核苷酸编码，或可由上述方法获得的，或从上述方法产生的细胞获得的本发明抗体或其片段。本发明的抗体通常在对单克隆抗体治疗敏感的疾病的基本治疗中是有用的。特别是，可使用免疫球蛋白通过补体介导的裂解等，被动免疫或除去HCV或其它不需要的细胞或抗原，均不会发生与许多前抗体有关的大的免疫反应(如过敏性休克)。对于本发明的抗体，适于治疗的典型疾病状态包括慢性HCV感染。
本发明的抗体、抗原和表位可治疗性用于患HCV感染的病人。可通过施用本发明的抗体、抗原和表位来完成这种治疗。这种施药可利用未标记的和标记的抗体或抗原。例如，当使用未标记的抗原或表位有利时，其形式例如，抗原可以是小到以至于不能刺激免疫应答，但足够大，能结合或封闭HCV通过E2糖蛋白停靠在靶细胞上的片段。
另外，可施用标记了治疗剂的本发明的抗体、抗原和表位。这些药剂可直接或间接的与本发明抗体或抗原偶联。间接偶联的一个例子可使用间隔分子。另外，本发明的抗体还可包含一个区域，所述区域用共价或非共价键联接。联接可根据本领域已知的和上述的方法作基因融合，或如WO94/04686所述作化学交联。融合蛋白中存在的，包含本发明抗体的其它功能域可优选通过可弯曲接头连接，有利的是多肽接头连接，其中所述多肽接头包含多个亲水性肽键氨基酸，具有足够跨越所述功能域的C-末端和本发明抗体的N-末端距离(反之亦然)的长度。上述融合蛋白还可包含可切割接头或蛋白酶的切割位点。这些间隔分子可以是不溶性的或是可溶性的(Diener等，科学231：148，1986)，而且可被选来使药物在靶位点从抗原上释放。能与本发明的抗体、抗原和表位偶联，用于免疫治疗的治疗剂例子是药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可与本发明抗体、抗原和表位交联的药物包括以下化合物：经典的药物，如丝裂霉素C、道诺红霉素和长春花碱等化合物。在使用放射性同位素偶联的本发明的抗体、抗原或表位作免疫治疗中，某些同位素可能比其它的更优选，这取决于白细胞分布和稳定性以及发射等因素。由自身免疫应答决定，某些发射物可能比其它的更优选。一般在免疫治疗中，发射α和β粒子的放射性同位素是优选的。优选短射程、高能α发射物，如212Bi。可与本发明的抗体、抗原或表位结合，用于治疗目的的放射性同位素的例子是125I、131I、90y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。其它可与本发明的抗体、抗原或表位偶联的治疗剂，以及体外和体内治疗方案是已知的，或易于由本领域技术人员确定。在任何合适的情况下，本领域技术人员可使用本发明编码任何上述抗体、抗原或表位或的多核苷酸，或对应的载体，来代替蛋白质材料本身。
另外，本发明涉及药物组合物，包含上述本发明的抗体、抗原或表位、多核苷酸、载体或细胞。本发明的药物组合物还可包含药物学上可接受的运载体。合适的药物学上可接受的运载体的例子是本领域熟知的，包括：磷酸缓冲盐溶液、水、油/水乳剂等乳剂、各种湿润剂、无菌溶液等。可用熟知的常规方法配制含有这些运载体的组合物。可以合适的剂量将这些药物组合物施给人。可经不同途径施用合适的组合物，如静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、外用或透皮施用。由参与的生理和临床因素确定剂量疗法。如医学领域熟知的，任一病人的剂量取决于许多因素，包括病人的大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施药的时间和途径、健康状况、和其它同时施用的药物。典型的剂量可以是，如0.001到1000微克范围内(或该范围内用于表达或抑制表达的核酸)；然而，低于或高于该示范性范围的剂量也是可预料的，尤其要考虑上述因素时。一般，有规律的施用该药物组合物的疗法应在每天1微克到10毫克单位范围内。如果该疗法是连续输液，它还应在每千克体重每分钟1微克到10毫克范围内。可用周期性评估来监控进程。剂量不同，但静脉内施用DNA的优选剂量是从大约106到1012个DNA分子拷贝。本发明的组合物可局部或全身施用。施用一般是胃肠外的，如静脉内；DNA还可直接施用到靶位点，如通过生物弹射法(biolistic)传递到内部或外部的靶位点，或通过导管传递到动脉内的位点。胃肠外施药的制备物包括无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙三醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、和油酸乙酯等可注射有机酯。水相载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬液，包括盐和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳化Ringer’s，或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补液，电解补液(如基于Ringer’s葡萄糖的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可存在，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。另外，本发明的药物组合物可以包括其它试剂，如白介素或干扰素，视药物组合物的用途而定。例如，如上所述本发明的药物组合物可与其它抗病毒剂联用。这些药剂包括(不限于)：干扰素，其它抗HCV单克隆或多克隆抗体、核苷类似物，DNA聚合酶抑制剂，和如实施例6中所述的药剂。就这种联合治疗而言，可同时施用抗体和抗病毒剂或顺序在用抗病毒剂治疗之前或之后施用抗体。还可用这种药物组合物来免疫肝脏移植病人，以消除这些病人复发HCV感染的可能性。另外，还可将药物组合物配制成疫苗，例如，如果本发明的药物组合物包含如上所述，能诱导针对HCV的有效免疫应答的抗原。有利的，本发明的药物组合物将用于肝脏移植。另外，预期本发明的抗体能用于防止Tupaia-肝细胞被HCV感染性人血清感染。
本发明预料，各种本发明的多核苷酸和载体可用标准载体和/或基因传递系统，单独或组合施用，并可任选的和药物学上可接受的运载体或赋形剂一起施用。施用后，所述多核苷酸或载体可稳定整合入个体的基因组中。另一方面，可使用病毒载体(它们对某些细胞或组织是特异性的，并在所述细胞中维持)。合适的药物学运载体和赋形剂是本领域熟知的。可用根据本发明制备的药物组合物来预防或治疗，或延迟HCV感染。另外，将本发明包含本发明的多核苷酸或载体的药物组合物用于基因治疗是可能的。合适的基因传递系统可包括脂质体、受体介导的传递系统、裸露DNA、和病毒载体，如疱疹病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒等；见上。将核酸传递到体内的一个特异性位点，用于基因治疗，也可用生物弹射biolistic传递系统完成，如Williams所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)，2726-2729)。
在本发明的另一个实施例中，涉及一种在人中预防丙型肝炎病毒(重)感染的方法，包含：施用本发明的抗体、多核苷酸或载体的步骤。还包含一种在人中减轻慢性丙型肝炎的方法，包含步骤：用本发明上述化合物与药物学上可接受的运载体联用，治疗所述病人。
在本发明的另一个实施例中，涉及一种诊断组合物，它包含任何一种上述的本发明的抗体、抗原、多核苷酸、载体或细胞，并可任选的合适检测工具。本发明的抗原和抗体适合用于免疫试验，其中可以水相或结合于固相载体上利用它们。可利用本发明抗原的免疫试验的例子是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫试验。这些免疫试验的例子是放射性免疫测定(RIA)，夹心法(免疫测量试验)和蛋白质印迹试验。本发明的抗原和抗体可与许多不同的运载体结合，并用来分离与这些多肽特异性结合的细胞。熟知的运载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。对于本发明的目的，运载体的性质可以是可溶的或不溶的。
本领域普通技术人员知道，有许多不同的标记物和标记方法。可在本发明中使用的标记物类型的例子包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也见上文讨论的实施例。
在另一个实施例中，本发明的抗体还可用于诊断个体中HCV感染的方法，通过从被测试的个体中获得体液样品，其可以是血样、淋巴样品或任何其它体液样品，并将该体液样品与本发明的抗体在能形成抗体-抗原复合物的条件下接触。然后通过本领域已知的方法，测定这些复合物的水平，比对照样品中形成的水平显著高，表明被测试个体有HCV感染。以同样的方式，也可用被本发明的抗体特异性结合的抗原来诊断个体中的HCV感染，通过使被测个体的体液样品与上述抗原接触，并测定样品中抗原-抗体复合物的形成。因此，本发明涉及一种测定丙型肝炎病毒糖蛋白E2的体外免疫试验，其特征是优选在非还原条件下，测量其与本发明抗体的共沉淀。另外，本发明包括一种诊断病人中慢性丙型肝炎的方法，其特征在于用本发明的抗体测试所述病人的样品中丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶细胞上的结合能否被中和。因此，本发明还涉及一种用本发明的抗体抑制丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶细胞上的结合的中和试验。
本发明还包含检测样品(如细胞样品)中HCV抗原存在的方法，包括：从人体获得细胞样品，使所述样品与上述抗体之一接触，优选在允许抗体与抗原结合的非还原条件下，并用放射性免疫试验或酶联免疫试验等免疫试验技术来检测被结合抗体的存在。另外，本发明涉及一种检测人体中抗丙型肝炎病毒的自身抗体的方法，包括：使病人的样品与本发明的抗原接触，并检测与所述抗原结合的抗体的存在。
在另一个优选例中，本发明涉及上述抗体、抗原、多核苷酸、载体或细胞用于制备药物组合物，治疗或预防人体中HCV感染，或防止HCV感染复发的用途。优选所述药物组合物是设计成在肝脏移植之前、之中或之后施用的。
本发明的药物组合物、方法和用途可理想的用于人。虽然本文所述的方法和用途也包括动物治疗。
本发明的描述和实施例公开并包括了这些实施例和其它的实施例。关于任何一种根据本发明使用的抗体、方法、用途和化合物的文献可从公共图书馆和数据库获得，用于示范性的电子装置。例如可用在互联网上可得到的公共数据库″Medline″，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它数据库和网址，如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.infobiogen.fr/，http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html，http://www.tigr.org/，是本领域技术人员已知的。而且还可用例如http://www.lycos.com获得。在Berks，TIBTECH12(1994)，352-364中给出了对于生物技术专利信息的综述，以及对回顾性检索和目前了解有用的专利信息有关来源的评述。
上述公开内容总体上描述了本发明。参考下列具体例子可获得更完整的理解。这些例子是为了说明而提供的，不是要限制本发明的范围。
附图显示：
图1：间接免疫荧光分析。用如前所述的SVE2重组病毒感染CV-1细胞(Fournilllier-Jacob等，1996)，用病人血清(1∶20稀释度)或产生HMAb的细胞系的上清液进行免疫荧光分析。用与荧光素偶联的山羊抗人IgG免疫血清进行染色。(A)病人1的血清；(B)病人2的血清；(C)HMAb503；(D)HMAb108；(E)与HCV无关的慢性肝炎的病人血清。额外的阴性对照(F)含有用SVE1重组病毒(表达E1)感染的CV-1细胞，并用HMAb503或108染色(结果只显示HMAb503)。
图2：在表位作图研究中使用的质粒。(A)代表编码病毒核衣壳(C)、糖蛋白E1和E2，以及非结构蛋白p7、NS2和NS3的HCV基因组功能域(Rice等，1996)。标出了蛋白酶切割位点的氨基酸位置。(B)不同表达质粒编码的序列的图上位置和氨基酸边界。
图3：E2的免疫沉淀和E1共沉淀，以及在还原和非还原条件下表位形成分析。脉冲标记了用vTF7-3和vHCV1-1488(vHCV)共感染或用TF7-3单独(M)感染的细胞，跟踪指定的时间(小时)。用HMAb108，503和小鼠MAb H2(Dellersnyder等，1997)免疫沉淀E2糖蛋白。在还原或非还原条件下，通过SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析免疫沉淀物。在图左侧标出了HCV特异性蛋白的预期位置。
图4：E2结合被HCV-E2 HMAb中和的百分数。测试了各种浓度的抗-E2HMAb503和108中和纯化的CHO表达的E2蛋白与MOLT-4细胞结合的能力。如所述计算了中和作用(Rosa等，1996)，标出50％中和滴度。
图5：HMAb503轻链可变区(VL)的核酸序列和氨基酸序列。
图6：HMAb503重链可变区(VH)的核酸序列和氨基酸序列。
实施例说明了本发明。
实施例1：病人的筛选和产生人单克隆抗体的B细胞(LCL)的产生
两个病人加入了本研究。用RIBA III试验(Abbott Laboratories)测定了HCy感染。在PBMC(外周血单核细胞)无限增殖时，如用组织学检查和阳性PCR试验测定所显示，两个病人都患有慢性肝炎。用bDNA试验2.0版(quantiplex HCV RNA试验，Chiron Diagnostics)测定血清病毒负荷。用三种不同方法测定了HCV基因型。第一种是根据检测基因型特异性的，针对非结构抗原4(NS4)的抗体，并用MUREX1-6血清定型试验，按厂商说明书(MUREXDiagnotics SA，Bhattacherj ee等，1995)测定。第二种是根据从基因组的5’非编码区(NCR)，用基因型/亚型特异性探针扩增病毒序列，并用INNO-LIPA试验(Innogenetics S.A.)进行。在这两个病人之一中，病人1：尽管用PCR可在血清中检测到HCV RNA，血清ALT(丙氨酸转移酶)水平是正常的，而且保持正常(轻度肝炎)。相反，在病人2中ALT水平保持持续上升，该病人中的感染特征是肝硬化。
如前所述进行了产生HMAb细胞系的生成(Boyer等，1991，Desgranges等，1988，Seigneurin等，1983)。简单说，在Ficoll分离后，使PBMC与EBV培养上清液(1毫升B95.8株的上清液，具有10-3 TD50/ml对5×106PBMC的滴度)在室温下接触。培育后，将它们稀释在培养液中，浓度范围为每孔50到100×103细胞。2到4周后，用SVE2 CV-1 IFA筛选上清液的抗-E2反应性。已报道抗-E2抗体的检测是严格依赖于抗原产生方法的(Chien等，1993，Hsu等，1993，Lesniewski等，1995)。已显示HCV E2的真核表达，而不是原核表达使该蛋白能正确加工并糖基化(Selby等，1993)。在我们的研究中，我们用作抗-E2抗体的筛选试验的是，一种真核表达的E2抗原，以天然形式，即通过免疫荧光试验(IFA)可见的形式分析。先前Fournillier-Jacob等曾用过这种检测试验，并显示对抗体检测特别有效(Fournillier-Jacob等，1996)。简单说，用来自原型H株(基因型1a)的重组质粒pCW18 E2(表达HCV E2氨基酸序列371到746)，和辅助性SV40突变病毒一起转染CV-1细胞，来产生重组病毒表达的E2的储备原液(SVE2，Fournillier-Jacob等，1996，Wychowski等，1986)。用SVE2病毒来进一步感染CV-1细胞，并用感染病人的血清和EBV-无限增殖的B细胞的上清液，如前所述进行免疫荧光分析(Fournillier-Jacob等，1996)。在分析前，将细胞固定在甲醇∶乙酮(3∶7)中。
以每孔2到20个细胞，用50×103个射线照射的(2,500rad)同种异体PBMC进一步亚克隆两次LCL。获得自两个病人衍生的两个保持阳性的克隆。表1总结了两个病人和两种淋巴类B-细胞系产生的HMAb，称为503和108的特性。这两个克隆的培养上清液的分析揭示这两个克隆都仅分泌IgG1。用IFA在用重组SVE2病毒感染的CV-1细胞上测试了各个克隆的上清液，用对人IgM、IgG或IgA(Byosis)、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类(Sigma Immuno Chemical Co.)和λ和κ轻链(Dakopatts)特异性的第二抗体来揭示染色情况。
表1病人抗体和衍生的人抗-E2单克隆抗体的特征
病人 基因型a 病毒负荷beq/ml×105 组织学诊断 HMAb 同种型c
1 4 5.2 轻度肝炎 503 IgG1λ
2 1b 21.8 肝硬化 108 IgG1λ
a用从病人EBV-PBMC转化之曰和从后来两年随访中两个不同时间点得到的样品进行分析。不同时间点和不同试验之间的结果是一致的。
b用Quantiplex bDNA试验(Quantiplex HCV RNA试验，Chiron Diagnostics，Emeryville)在血清中定量。
c通过IFA在CV-1感染的细胞上，用重组SVE2病毒测试了各个克隆的上清液，用对人IgM、IgG、IgA、IgG1-4亚类的特异性第二抗体揭示了染色。
用蛋白A(Pharmacia)柱亲和纯化产生HMAb的上清液。用ELISA如前述进行培养上清液中抗体浓度的测定(Boyer等，1991)。每毫升常规培养液中LCL产生2到5微克Ab。用两种不同试验，在PBMC无限增殖和在无限增殖前两年中的两个不同时间测定感染病人1和2的病毒基因型。两个试验都给出一致的结果，表明病人1被基因型4的分离物所感染，而病人2被基因型1b的分离物所感染。由于商业上可购得的HCV基因定型试验可能缺少特异性，并为了排除双重感染的可能性，我们进一步对PCR衍生的序列作图分析HCV基因组的5’非编码区，来确定上述结果。将衍生自克隆的准种的核苷酸序列与公布的数据库比较(Bukh等，1992)，结果证实了用商品基因定型试验获得的结果，即两个病人被单一病毒型感染。图1表明在IFA中用病人血清(A和B)或纯化的单克隆抗体(C和D)观察到的，SVE2感染的CV-1细胞的染色。该反应性定位在细胞膜上，具有占优势的核周围分布。
实施例2：HMAb的免疫学特征
用不同方法确定产生的抗体的免疫反应性。使用原始病人血清，LCL的上清液，和纯化抗体，在变性条件下，用含有亚型1a和1b衍生的E2蛋白质的制备物进行蛋白质印迹分析(Nakano等，1997)。对于蛋白质印迹分析，如前所述使用了来自基因型1a和1b序列的杆状病毒表达的E2蛋白质(Nakano等，1997)。使用了病人血清(1∶50)、两个克隆的上清液，和纯化的HMAb(在高达10微克/毫升浓度下测试)。用全套合成肽(包括整个E2开放阅读框)如前所述，用病人血清和纯化的抗体进行表位作图(Courtesy A.M.Prince，Wang等，1996)。合成肽大多是在连续肽之间有6个氨基酸重叠的12聚物，对应于HCV-H株(基因型1a)E2蛋白的序列。总共有57条E2肽(aa 384-727)，所有都由AnaSpec合成。
虽然两个感染HCV病人的血清都和E2 1a和1b衍生蛋白质反应，但没有一个培养上清液或纯化的HMAb给出阳性信号，即使在浓度高达10微克/毫升时测试也没有。在肽扫描ELISA中，用一组覆盖E2 1a序列的合成肽测试培养上清液或纯化抗体时，也观察不到反应性。
由于上述观察提示，识别的决定簇可以是非线性的，因此在IF试验中分析了不同样品的免疫反应性。用表达不同E2功能域的全套质粒转染细胞(见图2)，来尝试鉴定限制性决定簇序列。用IFA在LTK细胞(已经用表达截短的E2蛋白功能域(见图2)的全套载体转染过)上评估获得的这两种HMab的反应性。在pcDNA3质粒(Promega)的CMV启动子控制下直接克隆E2序列，产生质粒pCIE2和pCIE2t，或作为与乙型肝炎病毒表面抗原的融合蛋白表达产生质粒pS2S.E2A-E，用标准技术和如前所述的技术表达(Sambrook等，1989，Nakano等，1997)。用Qiagen纯化柱(Qiagen)根据厂商说明书产生所有的DNA制备物。用1.0微克DNA在Lipofectamin(Gibco BRL)存在下转染LTK细胞。通过IFA在感染后48小时，如前所述测试了细胞上清液和纯化的HMAb的免疫反应性(Major等，1995)。阳性对照包括采用直接注射质粒pCiE2t免疫的小鼠产生的反应性超免疫血清(Nakano等，1997)。阴性对照包括使用未感染的LTK细胞和用表达E1的重组SV40病毒感染的CV-1细胞(Fournillier-Jacob等，1996)。
表2：病人血清和纯化的单克隆抗体(HMAb)针对截短的E2功能域的免疫反应性
HCV构建物a A B C D E pCIE2 α pCIE2t pcDNA3
病人1b 血清 + - + - - + + -
HMAb503 - - - - - - + -
病人2c 血清 - - - - - - + -
HMAb108 - - - - - - + -
小鼠多克隆Abb + + + + + + + -
a用标出的质粒瞬时转染LTK细胞，并如Major等所述(1995)，在48小时后进行IFA。pS2.SE2A-E质粒是根据Nakano等(Nakano等，1997)。用pcDNA3质粒(Promega)作为阴性对照。
b以1/20稀释度测试病人血清；以高达10微克/毫升的浓度在至少两个独立进行的实验中使用了LCL上清液或纯化的HMAb。
c在所有情况下，采用直接注射质粒pCIE2t免疫的小鼠获得的反应性超免疫血清，评估了转染的效率和质粒的正确表达(Nakano等，1997)。
表2总结了IF研究的结果。病人1的血清识别了各种E2表达质粒表达的序列中(作图)的多个决定簇。相反，该病人衍生的HMAb503仅识别将近全长的E2表达形式(由质粒pCIE2t编码)，但不识别该抗原较小的任何表达形式。对于病人2，血清和衍生的108抗体都仅和最大的E2表达形式反应。因此，用该方法，不可能鉴定出两种纯化抗体之一所识别的限制性决定簇序列。所有上面的实验与亚型1a衍生抗原有关。此外评估了纯化的单克隆抗体识别亚型1b衍生的E2的能力，作为评估其交叉反应性能的一种方法。通过免疫沉淀，用被重组新培斯病毒，Sinrep/HCV-BK1-1207(表达该抗原)感染的细胞测试了HMAb的反应性。两种抗体都能识别该抗原，如观察到强特异性信号所显示的那样。
联合上面的结果，这些数据提示HMAb能识别至少两种不同E2亚型(1a和1b)衍生抗原的特异性决定簇。另外，它们强烈提示该二抗体可能识别构象依赖性决定簇。
实施例3：免疫沉淀研究
在蛋白质印迹中和在用一组表达不同截短的E2部分载体转染的LTK细胞上进行IFA中HMAb缺乏反应性，提示该抗体识别构象依赖性表位。因此，进一步在脉冲跟踪实验中评估了HMAb对E2的识别。另外，由于先前报道已提出，E1和E2相互反应形成复合物被假设成是掺入病毒颗粒中的功能性亚基(Deleersnyder等，1997)，还评估了HMAb识别这些复合物的能力。这些E1E2复合物是非共价结合的，或因分子间二硫键而稳定，形成E1E2聚集物。还已报道，共价结合的E1E2复合物据信不是病毒颗粒的功能性亚基部分(Dubuisson等，1994，Grakaoui等，1993，Ralston等，1993)。对于本发明的目的，使用了不同的重组病毒。这些包括：1)重组痘病毒vTF7.3，表达T7 DNA-依赖性RNA聚合酶(Fuerst等，1986)，2)全套重组痘病毒，表达HCV-H氨基酸序列，vHCV 170-809，vHCV 371-809，vHCV 1-1488和vHCV 370-661(Grakoui等，1993，Michalak等，1997，Fourniller-Jacob等，1996，Major等，1995)和3)重组新培斯病毒(Sinrep/HCV-BK1-1207)，表达基因型1b株的结构蛋白，BK株(Dubuisson等，1994)。如所述在CV-1单层(对于痘病毒)或在BHK-21细胞(对于新培斯病毒)中产生病毒储备原液。(Dubuisson等，1994，Bredenbdeeck等，1993)。感染细胞并用35S-转标记(ICN)进行代谢标记细胞，方法如前所述(Dubuisson等，1994，Dubuisson和Rice，1996)。用10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl和2mM EDTA配的0.5％NP-40裂解细胞。在实验用的裂解缓冲液中加入20mM碘化乙酰胺，在其中分析了二硫键的形成。如所述进行免疫沉淀(Dubuisson等，1994，Dubuisson和Riee，1996)。对于定量实验，用密度测量法分析放射性自显影照片。
3.1 HMAb识别E的早折叠功能域
进行免疫沉淀来分析由这些HMAb识别的蛋白的特征(图3)。用针对构象非依赖性(MAb A11)或构象依赖性(MAb H2)表位的小鼠抗-E2 MAb作比较(Dubui sson等，1994，Deleersnyder等，1997)。在还原条件下，HMAb108和503在脉冲中不沉淀E2蛋白，但在跟踪30分钟后，一条对应于E2的条带开始被检测到，60分钟后强度增大(图3，还原HMAb108和503)。这与用小鼠MAb A11(针对构象依赖性表位)获得的结果相反(图3，还原，MAb A11)。如先前用这后一种抗体观察到的那样，在脉冲过程中检测到异源E2相关产物，可能是在E2-NS2前体的NS2区合成中翻译暂停的结果(Dubuisson等，1996)。对于Mab A11，在跟踪30分钟后，E2-NS2前体沉淀的强度非常高，并随时间下降，而对于被HMAb108和503沉淀的E2-NS2蛋白来说，它是低而恒定的，表明E2在从E2-NS2前体上切下后，主要被该抗体所沉淀。与用构象依赖性MAb H2进行的免疫沉淀比较，表明在E2检测中的极大延迟(图3，还原，Mab H2)。这些观察表明，确实HMAb识别E2的构象依赖性区域，该区域在E2蛋白的成熟加工过程中早期出现。两种HMAb表位形成的估计半衰期是大约15分钟(数据未显示)。
3.2  HMAb可沉淀非共价E1E2复合物
在非还原条件下进行了其它脉冲跟踪实验，并与那些在还原条件下进行的比较(图3)。在还原条件下，两种HMAb协同沉淀了E1，表明它们识别E1和E2复合物，当在阻止二硫键稳定E1E2复合物的非还原条件下进行免疫沉淀时，在凝胶顶部还检测到缓慢移动的条带。后面的这些观察提示，沉淀的E1E2复合物是由非共价结合的异二聚物和异源连接的聚集物构成的。如先前所观察，对于已显示能识别E2天然形式的Mab H2，仅在那时候在凝胶上检测到对应于E1和E2的条带(图3，非还原，H2，Dellersnyder等，1997)。在非还原条件下，E1单体形式和HMAb 108的共沉淀更少，与HMAb 503比较，仅在延长接触时间后才检查到一条特异性条带。因此，这两种HMAb都识别E2蛋白的功能域(该功能域呈现早折叠，而且在蛋白形成其最终构象中保持可接触)，如非共价结合的E1E2复合物的共沉淀所提示的。
总的说，上述数据表明，HMAb108和503识别一个或多个构象依赖性决定簇，并能沉淀据信存在于病毒颗粒上的E1和E2非共价结合的复合物。
实施例4：E2与细胞结合的中和
Rosa等(Rosa等，1996)最近开发的试验使得能以定量方式评估候选抗体中和高度纯化的E2与HCV感染易感性细胞的结合(中和结合或NOB)的能力。在该试验中评估了两种HMAb。在Rosa等(Rosa等，1996)最近开发的试验中评估了HMAb中和E2(中和结合或NOB)与MOLT4细胞结合的能力。该试验在96U-底微量滴定板中进行。简单说，将20微升重组CHO E2384-715蛋白(0.5微克/毫升)与各种稀释度抗E2 HMAb和对照HMAb混合(Rosa等，1996，Boyer等，1991)。4℃培育1小时后，将混合物加到MOLT-4细胞(每孔105个细胞)中。洗涤后，随后用1/100稀释度的人血清(含有识别结合靶细胞的E2的抗-E2免疫球蛋白)培育细胞。洗涤细胞，并用异硫氰酸盐偶联的抗IgG血清培育细胞。用FACScan流式细胞计数器分析荧光。如下计算特异性中和：((阳性对照MFI-实验MFI)/(阳性对照MFI-阴性对照MFI))×100，其中(MFI)＝细胞群的平均荧光强度，其直接与荧光标记的、与细胞结合的HCV蛋白的表面密度相关。比较了用或不用HCV蛋白，和用HCV HMAb或HCV-阴性HMAb，或免疫前血清培育的细胞的MFI值(Rosa等，1996)。对于各实验，不用HCV蛋白，用流式细胞计数器分析(未结合HCV蛋白的)细胞设置阳性阈值，这些细胞已用抗HCV蛋白的抗血清，和异硫氰酸荧光素标记过。对于竞争结合分析，抗体被如下生物素化：用2毫克/毫升的N-，N-二甲基甲酰胺生物素4℃培育以0.4M磷酸缓冲液配的1毫克/毫升抗体2小时，并以PBS充分透析过夜。用两种抗体进行NOB活性试验，所用的竞争物标记的抗体为2.5微克/毫升。
图4显示了不同浓度的抗体获得的中和百分数。结果表明HMAb 503显示NOB活性，而且50％结合的中和是在0.03微克/毫升的浓度下实现的。对于HMAb108，在任何测试浓度下都未检测到NOB活性。因此，具有NOB活性的HMAb 503是第一种迄今为止描述的这样的抗体。感兴趣的是，产生的克隆(503)衍生自被基因型4感染的病人，而试验所用的是基因型1(a)衍生抗原，从而证实了该抗体的交叉反应能力。数据还提示，具有NOB活性的抗体看来是靶向不同病毒基因型之间保守的决定簇的。
进行了竞争实验，来测定两种抗体是否与相似的或拓扑图不同的表位结合。HMAb不阻止(即不竞争)503Ab中和活性的检测。这些结果强烈提示，HMAb108和503识别E2蛋白质上的不同表位。
实施例5：预防肝脏移植中的HCV感染
下文描述了丙型肝炎病毒(HCV)感染的病例下的肝脏移植，其中施用了本发明的一种抗体，来避免植入器官的再感染。
病人的准备：剃去全身体毛，灌肠，取血(定量测定HCV-RNA)，在药物的帮助下净化肠道。
捐献者的准备(证实大脑死亡，心脏还在跳动)：取血(检查抗乙肝、丙肝；HIV、巨细胞病毒的抗体)，取下器官，在储藏液中保藏，以转运到Wisconsin大学(储藏液为富含钾的电解溶液，保存在4℃)，并转运给病人。在手术室中对病人施用常用麻醉药和免疫抑制(约1克脱氢皮质醇+FK506或环孢菌素A+可任选的硫唑嘌呤+可任选的抗胸腺细胞球蛋白)；打开胃(剖腹术)；将一条旁路固定在股静脉(脊)和腋静脉(腋)之间，来稳定血循环；从周围组织中分离肝脏，准备输入和输出血管(肝动脉、肝门静脉、胆总管、肝静脉)，并剥离肝脏(Pringel-Manver)。钳住血管，取出肝脏。
在该阶段：施用抗体：将作为冻干液或作为浓缩溶液的100-200毫克抗体+500毫克人血清白蛋白，溶于100毫升等渗盐溶液中或5％葡萄糖溶液中，用2小时输入。在输液过程中，将捐献者的器官放入病人的腹部区域。将血管交叉合流(缝合)，再次取血样(测定HCV-RNA滴度)。输液结束后，重新灌注血管，并检查闭合度。如果它们是闭合的，将肝脏置于腹部区。灌注开始一小时后，进行肝脏活体标本检查，闭合腹腔。免疫组织化学分析活检标本，是否抗原已到达靶部位。
将病人送到重病监护室，保持麻醉，并给予人工呼吸。密切监视肝功能、继发性出血、静脉闭塞、感染状态、血抗体浓度和HCV-RNA-滴度(HCV-RNA-滴度的正常过程：几天后低于其在约1周后增高的示范水平)。
长期过程：在时间的第一阶段，每天施用100毫克脱氢皮质醇，在3个月的过程中剂量减至5毫克；在病人一生中都施用不同剂量的脱氢皮质醇和FK506或环孢菌素，仅在前4周施用硫唑嘌呤和/或抗胸腺细胞球蛋白。每6到8周更新一次治疗性抗体(输入100-200毫克)；每4周测定HCV-RNA滴度和抗体浓度。如果对该抗体有更好的了解，就不需要再测量。病人一生都监测肝功能、感染和可能的排斥反应(活体检查)。接触前预防(受感染人的配偶；如不要怀孕，通常用阴茎套保护)：每6到8周肌肉内(如可充分接受)或通过输液施用100-200毫克抗体丸剂。监测血液抗体浓度。
对于接触前预防(被针等刺伤的护士)，取血(HCV-RNA滴度)，在有结果前，通过输液施用100-200毫克抗体。
实施例6：人抗-HCV抗体的功能性免疫球蛋白可变区序列的克隆和测定，以及在CHO-细胞中的表达
从产生抗体的EBV转化的人B细胞系中，按照Chomczynski方法(分析生物化学162(1987)156-159)制备总RNA。
然后，根据标准方案(Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring HarborLaboratory Press 1989，第二版)合成cDNA。
用表3中列出的寡核苷酸引物组，和从所述人B细胞系合成的cDNA作为模板，扩增了编码人抗HCV抗体的λ轻链和γ1-重链Fd-节段(VH+CH1)的DNA区域。该引物组产生了重链Fd-节段的5’-Xhol和3’-Spel识别位点，和λ轻链的5’-Sacl和3’-Xbal识别位点。对于PCR扩增编码重链Fd节段的DNA片段，将5个不同5’-VH-引物(VH1，3，5，7，VH2，VH4，VH4B和VH6)分别与3’-VH引物CGd1联合；对于PCR扩增λ轻链片段，将8个不同5’-VL引物(VL1-8)各与3’-VL引物CL2联合。
用下列PCR程序来扩增：94℃变性20秒；52℃引物退火50秒，72℃引物延伸60秒。进行40轮循环，最后72℃最终延伸10分钟。
在琼脂凝胶上跑PCR产物，分离合适大小的DNA条带。然后用限制性酶Xho 1和Spe 1(对于重链片段)或用Sac 1和Xba 1(对于轻链片段)消化各分离的DNA条带，并克隆入质粒载体Bluescript(Stratagene)，该载体是已用Xho 1和Spe 1消化或用Sac 1和Xba 1切割制备的。
然后对克隆的重链和轻链片段的质粒制备物进行序列分析。选择两条分别编码功能性免疫球蛋白重链或轻链可变区(VH和VL)的序列；这样可鉴定正好一条功能性VH和一条功能性VL区域。在图5(SEQ ID NOS：1和2)和6(SEQID NOS：3和4)中描述了功能性VL-和VH-序列。通过与人V基因序列数据库(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/)提供的对应种系序列比较，完成了成熟N-末端的氨基酸序列。
根据标准方法(Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring HarborLaboratory Press 1989，第二版)进行克隆和测序。
为了克隆含有人抗-HCV抗体的重链和轻链的原始N-末端的VL-和VH-片段，进行了下列实验：
用MMLV反转录酶SuperscriptII(Gibco BRL，Eggenstein)根据标准方案(Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989，第二版)反转录总RNA。用两种寡核苷酸CGd1(对于重链)和CL2(对于轻链)进行cDNA特异性引发。
然后用末端转移酶(Pharmacia，Freiburg)根据标准方案对cDNA的第一链加poly-A尾。用含有poly-C延伸的有义引物PCR扩增加尾的cDNA，根据Gilliland，L.K等公布的锚定引物序列(组织抗原47，1-20，1996)和指定的5’-AncTail(CGTCGATGAGCTCTAGAATT CCCCCCCCCCCCCD)。该锚定引物和对编码λ轻链恒定区(CL2)或IgG1-CH1重链区(CGd1)C末端的核苷酸序列分别有特异性的反义引物联合。
如下进行PCR：初次变性：94℃4分钟；扩增30轮：93℃30秒；55℃30秒；72℃30秒；终末延伸：72℃3分钟。这些引物各含有限制性酶切位点(5’-AncTail：EcoR1；CL2：Xba1；CGd1：Spe1)，使对应的PCR片段分别克隆入用EcoR1/Xba1或EcoR1/Spe1消化的质粒载体中；为此，使用了bluescriptKS+质粒载体(Genebank登录号X52327)，因为它使得能使用常用的测序引物，易于对得到的插入物进行序列分析。证明几个重链和轻链片段的克隆分别具有相同序列，并能被鉴定成编码功能性VL区或VH区。证明VH序列与上述方法克隆的相同。将VL氨基酸序列(SEQ ID NO：6)和上述方法获得的VL序列比较，证明其在成熟N－末端的位置2上有一个氨基酸替换。
根据标准程序，用PCR将包含天然前导肽的完整λ轻链克隆入哺乳动物表达载体pEF-ADA中(见PCT/EP98/02180)。根据标准程序用PCR，还将VH克隆入PCT/EP98/02180中所述的哺乳动物表达载体pEF-DHFR中的人γ1-重链的基因组中。
通过稳定转染CHO-细胞然后基因扩增，如(PCT/EP98/02180)所述进行完整人IgG1λ-抗体的表达。通过PCT/EP98/02180中所述的蛋白A亲和层析从细胞培养上清液中纯化该抗体。
表3：引物表
5’-VH引物组：
VH 1，3，5，7：AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG
VH2：          CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGG
VH4：          CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG
VH4B：         CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG
VH6：          CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG
3｀-VH引物：
CGd1     GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGG
5’VL引物组：
VL1：    AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC
VL2：    TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG
VL3：    TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG
VL4：    TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG
VL5：    CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC
VL6：    CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC
VL7：    CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC
VL8：    CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC
3’VL引物：
CL2：    CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG
参考文献
Abrignani，Springer Semin.免疫病理学.19(1997)，47-55.
Akatsuka，肝脏病学18(1993)，503-510.
Bhattacherjee，遗传病毒学杂志.76(1995)，1737-1748.
Bergeron，生物化学科学趋势19(1994)，124-129.
Boyer，临床实验免疫学83(1991)，452-459.
Bredenbeek，病毒学杂志67(1993)，6439-6446.
Bukh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(1992)，4942-4946.
Cerino，免疫学杂志147(1991)，2692-2696.
Cerino，免疫学杂志151(1993)，7005-7015.
Chan，遗传病毒学杂志77(1996)，2531-2539.
Chien，柳叶刀342(1993)，933.
Choo，科学244(1989)，359-362.
Choo，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91(1994)，1294-1298.
Conley，病毒学杂志70(1996)，6751-6758.
Deleersnyder，病毒学杂志71(1997)，697-704.
Desgranges，柳叶刀，8591(1988)，935-936.
Dubuisson，病毒学杂志68(1994)，6147-6160.
Dubuisson，病毒学杂志70(1996)，778-786.
Emini，自然355(1992)，728-730.
Farci，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91(1994)，7792-7796.
Farci，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(1996)，15394-15399.
Fournillier-Jacob，医学病毒学杂志50(1996)，159-167.
Fournillier-Jacob，遗传病毒学杂志77(1996)，1055-1064
Fouts，病毒学杂志71(1997)，2779-2785.
Francki，经典病毒学2(1991)，223-233.
Fuerst，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(1986)，8122-8126.
Gakoui，病毒学杂志67(1993)，1385-1395.
Hsu，肝脏病学17(1993)，763-771.
Fuerst，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83(1986)，8122-8126.
Lesniewski，医学病毒学杂志45(1995)，415-422.
Lanford，病毒学197(1993)，225-235.
Major，病毒学杂志69(1995)，5798-5805.
Michalak，遗传病毒学杂志78(1997)，2299-2306.
Miller，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87(1990)，2057-2061.
Miyamura，微生物学趋势1(1993)，229-231.
Mondelli，病毒学杂志68(1994)，4829-4836.
Nakano，病毒学杂志71(1997)，7101-7109.
Putkonen，自然352(1991)，436-438.
Ralston，病毒学杂志67(1993)，6753-6761.
Rice，Fields病毒学，第三版Raven Press，New York(1996).
Rosa，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(1996)，1759-1763.
Saito，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87(1990)，6547-6549.
Sambrook，分子克隆：实验手册，第二版Cold Spring Harbor Laboratory Press.ColdSpring Harbor，New York(1989).
Seigneurin，科学221(1983)，173-175.
Selby，遗传病毒学杂志74(1993)，1103-1113.
Shimizu，病毒学杂志68(1994)，1494-1500.
Shimizu病毒学223(1996)，409-412.
Weiner，病毒学180(1991)，842-848.
Wang，传染病杂志173(1996)，808-821.
Wychowski，EMBO J.5(1986)，2569-2576.
Zibert，病毒学208(1995)，653-661.
Zibert，肝脏病学25(1997)，1245-1249.
序列表
<110>康耐克斯研究发展优化有限公司
<110>国家健康及医学研究院(INSERM)
<120>抗丙型肝炎病毒抗体及其用途
<130>B3070PCT
<150>EP 98 11 35 95.7
<151>1998-07-21
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>324
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>1
tct tac gag ctc acg cag ccg ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag  48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
  1               5                  10                  15
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca ttg cca aag caa tat gct  96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
             20                  25                  30
tac tgg tat cag cag aag cca ggc cag gcc cct gtg ttg gtg ata tat  144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
aaa gat aat gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc  192
Lys Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
agg tca ggg aca aca gtc acg ttg acc atc agt gga gtc cag gca gaa  240
Arg Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
 65                  70                  75                  80
gac gag gct gac tat tac tgt caa tca gca gac agc agt ggt tct tcc  288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Ser
                 85                  90                  95
tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta                  324
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>2
<211>108
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
             20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
Lys Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
 Arg Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
  65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Ser
                 85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>3
<211>351
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<400>3
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag  48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc tta agt ggt tac  96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Gly Tyr
             20                  25                  30
ttc tgg acc tgg atc cgc cag tcc ccc ggg aag ggg ctg gag tgg att  144
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
ggg gaa agc aat tat agt gga agt acc agg tac aac ccg tcc ctc aag  192
Gly Glu Ser Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc cag aac cag ttc tcc ctg  240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu
 65                  70                  75                  80
aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gta tat tac tgt gcg  288
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
aga ggt tgg gcg gtg gac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg  336
Arg Gly Trp Ala Val Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
gtc acc gtc tcc tca                                              351
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>4
<211>117
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Gly Tyr
             20                  25                  30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Glu Ser Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu
 65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
Arg Gly Trp Ala Val Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>5
<211>324
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>5
tcc tct gag ctg aca cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag  48
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
  1               5                  10                  15
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca ttg cca aag caa tat gct  96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
             20                  25                  30
tac tgg tat cag cag aag cca ggc cag gcc cct gtg ttg gtg ata tat  144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
aaa gat aat gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc  192
Lys Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
agg tca ggg aca aca gtc acg ttg acc atc agt gga gtc cag gca gaa  240
Arg Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
 65                  70                  75                  80
gac gag gct gac tat tac tgt caa tca gca gac agc agt ggt tct tcc  288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Ser
                 85                  90                  95
tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta                  324
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>6
<211>108
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
             20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
Lys Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
Arg Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
 65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Ser
                 85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                  105

Claims (15)

1.一种抗体，其特征在于，该抗体具有VH序列和VL序列，其中所述抗体包含SEQ ID NO：4的重链可变区的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3，和SEQ ID NO：2的轻链可变区的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3，所述氨基酸序列特异性识别丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位，而且能沉淀共价或非共价结合的E2/E1复合物。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体包含如SEQ ID NO：4的重链可变区。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体含有SEQ ID NO：4的重链可变区和SEQ ID NO：2的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体含有SEQ ID NO：4的重链可变区和SEQ ID NO：6的轻链可变区。
5.如权利要求1-4任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体在VH或VL区中含有一个氨基酸取代，所述取代不改变抗体的功能性质。
6.一种载体，其特征在于，该载体包含编码SEQ ID NO：2或6的VL区的多核苷酸联合编码SEQ ID NO：4的VH区的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该细胞包含权利要求6所述的载体。
8.一种制备能识别丙型肝炎病毒糖蛋白E2或免疫球蛋白链的抗体的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)培养权利要求7所述的细胞，和
(b)从培养物中分离所述抗体或其功能性片段或免疫球蛋白链。
9.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有治疗量的权利要求1到5任一项所述的抗体和药物学可接受的运载体。
10.一种诊断组合物，其特征在于，该诊断组合物包含权利要求1到5任一项所述的抗体和在免疫诊断方法中常规使用的合适试剂。
11.一种体外测定体外样品中和丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶细胞上的结合的免疫试验，其特征在于，用权利要求1到5任一项所述的抗体来测试所述体外样品。
12.一种检测丙型肝炎病毒糖蛋白E2存在的体外免疫试验，其特征在于，该方法测量所述糖蛋白E2和权利要求1到5任一项所述的抗体在非还原条件下的共沉淀。
13.一种检测来自病人的体外样品中抗丙型肝炎病毒的抗体的方法，其特征在于，该方法包括使来自所述个体的体外样品与针对权利要求1-5任一所述的抗体的抗原接触；并检测与所述抗原结合的抗体的存在。
14.权利要求1到5任一项所述的抗体的用途，其特征在于，该用途是制备药物组合物，用于治疗或预防个体中丙型肝炎病毒感染，或预防丙型肝炎病毒感染的复发。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物组合物用于肝脏移植的个体。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091324B2 (en) * 1998-11-05 2006-08-15 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes
EP1256348B1 (en) * 2000-02-14 2012-05-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Remedies for hepatitis c
IL137522A (en) * 2000-07-26 2007-06-17 Drk Blutspendediendst Baden Wu HCV human monoclonal antibody E2 glycoprotein antibody
EP1178116A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-06 Hybrigenics S.A. Sid nucleic acids and polypeptides selected from a pathogenic strain of hepatitis C virus and applications thereof
GB0021859D0 (en) * 2000-09-06 2000-10-18 Imp College Innovations Ltd Methods
GB0114629D0 (en) * 2001-06-15 2001-08-08 Pfizer Ltd Method
ITRM20020049A1 (it) * 2002-01-30 2003-07-30 Biostrands S R L Frammenti fab di anticorpi monoclonali umani diretti contro la glicoproteina e2 di hcv e dotati di potere neutralizzante in vitro.
CN101124315A (zh) * 2003-01-17 2008-02-13 伊势龙医学股份有限公司 利用凝集素亲和性血液透析去除血液中病毒的方法
CN102584947B (zh) 2003-04-01 2014-03-12 国家健康医学研究所 针对丙型肝炎病毒e1e2 复合体的抗体、hcv 颗粒的组合物和药物组合物
GB0309126D0 (en) * 2003-04-17 2003-05-28 Neutec Pharma Plc Clostridium difficile focussed antibodies
EP1765869B1 (en) * 2004-07-08 2015-05-20 JV Bio S.r.l Antigen binding proteins directed against scavenger receptor b1 that inhibit hcv replication
JP2009511452A (ja) * 2005-10-07 2009-03-19 プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ Ｃ型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ
SI2066351T1 (sl) 2006-10-02 2016-02-29 E.R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo cxcr4 in njihova uporaba
KR20150067395A (ko) 2006-12-01 2015-06-17 메다렉스, 엘.엘.시. 씨디22에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
NZ578354A (en) 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
MX2009008706A (es) * 2007-02-21 2009-09-14 Univ Massachusetts Anticuerpos humanos contra el virus de la hepatitis c (hcv) y usos de los mismos.
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
US20100104555A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute HCV neutralizing epitopes
CA3053156A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
US20110033389A1 (en) * 2009-04-29 2011-02-10 Zhifeng Chen Modified antibodies for passive immunotherapy
CA2778568A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Toray Industries, Inc. Antibody having activity of inhibiting hepatitis c virus (hcv) infection and use thereof
BR112012029881A2 (pt) 2010-05-25 2019-09-24 Inserm (Institut National De La Santé De La Recherche Médicale) combinação de anticorpos anti-envelope e anticorpos anti-receptor para o tratamento e a presenção de infecção por hcv
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
CN103308697B (zh) * 2013-06-09 2014-11-26 卫生部北京医院 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒
CN103472233A (zh) * 2013-06-21 2013-12-25 温州大学 丙型肝炎检测试剂盒及其应用
CA2918989C (en) 2013-08-09 2021-11-02 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of cancer
CN104974246A (zh) * 2014-04-01 2015-10-14 中国科学院上海巴斯德研究所 一种中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体及其用途
GB201415714D0 (en) * 2014-09-05 2014-10-22 Medical Res Council Antibodies and antigen binding fragments thereof
CN105254756B (zh) * 2015-11-27 2018-09-07 武汉大学 一种针对丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的单克隆抗体及应用
CN107286238B (zh) * 2017-08-07 2019-11-26 广州泰诺迪生物科技有限公司 抗hcv广谱中和抗体的制备、检测以及应用
SG11202012713RA (en) 2018-06-22 2021-01-28 Genmab As Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
TWI754157B (zh) 2018-07-25 2022-02-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 抗ｔｉｇｉｔ抗體及其用途
CN109762067B (zh) 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
US20230105029A1 (en) 2020-02-27 2023-04-06 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Antibodies binding il4r and uses thereof
AU2021271960A1 (en) 2020-05-12 2023-02-02 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. ST2 antigen binding protein
EP4259658A1 (en) * 2020-12-10 2023-10-18 Wuxi Biologics Ireland Limited An antibody against p-cadherin and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0520499A1 (en) * 1991-06-28 1992-12-30 Mitsubishi Chemical Corporation Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
WO1997040176A1 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 Mats Axel Atterdag Persson Human monoclonal antibodies specific for hepatitis c virus (hcv) e2 antigen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE520499C (de) 1929-09-14 1931-03-11 Heinrich Elsner Vorrichtung zum Biegen von Pappe, Fiber u. dgl.
DE69526636D1 (de) 1994-07-29 2002-06-13 Innogenetics Nv Gereinigte hepatitis-c-virus hüllproteine zur diagnostischen und therapeutischen verwendung
AU1462300A (en) 1998-11-05 2000-05-22 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human pan-hcv human monoclonal antibodies
US6682909B2 (en) 2000-09-13 2004-01-27 Hawaii Biotech, Inc. Immunogenic composition of hepatitis C and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0520499A1 (en) * 1991-06-28 1992-12-30 Mitsubishi Chemical Corporation Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
WO1997040176A1 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 Mats Axel Atterdag Persson Human monoclonal antibodies specific for hepatitis c virus (hcv) e2 antigen

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Publication number Publication date
US20090104188A1 (en) 2009-04-23
US7507408B2 (en) 2009-03-24
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