PT98156B - Um processo de preparacao de uma composicao de vacina - Google Patents

Description

Epigrafe: UM PROCESSO DE PREPARAÇAO DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA

Titular: CHIRON CORPORATION

MEMÓRIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo Técnico

Esta invenção refere-se geralmente a vacinas e está particularmente dirigida a técnicas e composições para aumentar a eficiência de vacinas e produzir anticorpos neutralizadores.

Antecedentes

Os lipossomas são vesículas esféricas consistindo numa bicamada lipidica e num espaço aquoso fechado, tipicamente formadas por fosfolipidos em soluções aquosas. Por incorporação de substâncias químicas ou bioquímicas na fase aquosa da suspensão na qual os lipossomas são formados, podem ser obtidos lipossomas que contenham, dentro do seu espaço interior, várias substâncias biologicamente activas. Os lipossomas que variam tipicamente em tamanho de cerca de 25 nm a cerca de 1 μκι de diâmetro, dependendo do modo como são produzidos e do conteúdo da sua camada lipidica, podem assim ser usados como estruturas de libertação de várias substâncias solúveis em água. Uma vez que as moléculas com carga geralmente não penetram a bicamada lipidica, e como as grandes moléculas penetram tais camadas apenas lentamente, a parede dos lipossomas actua para isolar o organismo no qual os lipossomas foram administrados com um efeito muito rápido pelo material contido.

Os lipossomas foram previamente utilizados para modular a resposta imune em animais pela administração de lipossomas com um antigênio. A resposta imune pode ser modulada quer com o propósito de induzir imunidade no hospedeiro contra um patogénio, ou com o propósito de produzir anticorpos usados no exterior do hospedeiro. Por exemplo, há um interesse crescente em melhorar e variar a capacidade de preparação de anticorpos para uma grande variedade de sitios determinantes para serem usados em imuno-ensaios e terapia imunodirigida. A capacidade única dos anticorpos se ligarem a um sitio determinante especifico ou estrutura quimica torna-os particularmente úteis na administração de fármacos, radiosótopos, ou marcadores para um sitio particular no hospedeiro. Além disso, a capacidade dos anticorpos de distinguir uma estrutura especifica de estruturas semelhantes tem resultado na sua larga utilização em diagnóstico.

Indiferentemente de se desejarem anticorpos monoclonais ou policlonais para uso exterior ao hospedeiro ou uma resposta imune para proteger o hospedeiro contra um patogénio, a etapa inicial é a imunização de um hospedeiro. Como se tornará claro adiante, a composição usada na imunização é aqui referida como uma vacina, quer a composição seja utilizada para proteger o hospedeiro quer para produzir anticorpos monoclonais. Usualmente hiperimuniza-se o hospedeiro através de injecções repetidas do imunogénio numa composição da vacina de acordo com um horário pré-determinado. São adicionados adjuvantes para potenciar a resposta imune. Adjuvantes vários incluem sais de aluminio e cálcio, adjuvantes emulsificadores e bactérias, e.g., micobactérias e corinebactérias.

Quando se desejam anticorpos monoclonais, é particularmente desejável aumentar a resposta imune a sitios ectópicos específicos. Uma vez que a preparação de anticorpos monoclonais requer a detecção de ocorrência de baixas populações, qualquer técnica que aumente a população de linfócitos B de interesse pode revelar-se importante na produção de anticorpos monoclonais. Ver a Patente Norte Americana No. 4.565.696 que descreve a produção de imunogénios por conjugação de antigénios a lipossomas.

Como será descrito a seguir, a presente invenção refere-se à preparação de composições de vacinas contendo lipossomas . Os lipossomas e vários outros componentes que serão discutidos em detalhe a seguir actuam como adjuvantes para aumentar a imunogenecidade dos antigénios derivados de, ou, por outro lado, relacionados com os agentes patogénicos.

Correntemente, os únicos adjuvantes aprovados para uso humano nos Estados Unidos são sais de aluminio (alume). Estes adjuvantes têm-se revelado úteis para algumas vacinas incluindo hepatite B, difteria, polio, raiva, e gripe, mas podem não ser úteis para outras, especialmente se a estimulação da imunidade mediada por células for requerida para protecção. Relatórios indicam que o alume não conseguiu melhorar a eficácia de ambas as vacinas de tosse convulsa e tifóide e forneceram apenas um ligeiro melhoramento nas vacinas de adenovirus. Problemas com os sais

de alumínio incluem indução de granulomas no local da injecção e uma grande variaç~ao das preparaçês de alume.

Adjuvante Completo de Freund (CFA) é um poderoso agente imunoestimulatório que tem sido usado com sucesso com muitos antigénios numa base experimental. 0 CFA é composto por um óleo mineral, um agente emulsificante como Arlacel A, e micobactérias mortas como Mycobacterium tuberculosis. Soluções aquosas de antigénio são misturadas com estes componentes para criar uma emulsão de água em óleo. Contudo, o CFA provoca graves efeitos secundários incluindo dores, formação de abcessos, e febre, o que impede a sua utilização quer em vacinas humanas quer em veterinárias. Estes efeitos secundários são principalmente devidos às reacções do paciente ao composto micobacteriano do

CFA.

Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) é semelhante ao CFA sem o composto bacteriano. Embora o seu uso não seja aprovado nos Estados Unidos, o IFA tem sido útil em vários tipos de vacinas noutros paises. 0 IFA foi usado com sucesso com vacinas da gripe e polio em humanos e com várias vacinas animais incluindo raiva, doença canina, e doença do casco-e-boca???. Experiências mostraram que quer o óleo quer o emulsificador usado no IFA podem provocar tumores em ratos, indicando que um adjuvante alternativo seria uma melhor escolha para utilização em humanos.

dipéptido de muramilo (MDP) representa a unidade minima do complexo da parede celular micobacteriana que produz a actividade do adjuvante observada com o CFA (ver Ellouz et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 59:1317). Foram criados

muitos análogos sintéticos do MDP que apresentam uma grande variedade de potência de adjuvantes de efeitos secundários (revisto em Chedid et al. (1978) Prog. Allergy, 25:63). Três análogos que podem ser especialmente úteis como adjuvante de vacinas são derivados do treonilo do MDP (ver Byards et al. (1987) Vaccine, 5;223), derivados n-butilo do MDP (ver Chedid et al. (1982) Infect. and Immun., 35:417), e derivados lipofilicos do tripéptido muramilo (ver Gisler et al. (1981) Immunomodulation of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, Y.

Yamamura and S. Kotani, eds., Excerpta Medica, Amsterdam, p.167). Estes compostos estimulam eficazmente a imunidade humoral e mediada por células e apresentam baixos niveis de toxicidade.

Um derivado lipofilico do MDP promissor é Nacetilmuramil- L - alanil- D - isoglutaminil - L - alanina -2[l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)] etilamida (MTP-PE). Este péptido muramilo tem uma cauda fosfolipidica que permite a associação da porção hidrofóbica da molécula com um meio lipidico, enquanto a porção do péptido muramilo se associa ao meio aquoso. Assim o próprio MTP-PE pode actuar como um agente emulsificador para produzir emulsões óleo-em -água estáveis.

Nos laboratórios dos presentes inventores, usando-se experiências em ratos, o MTP-PE mostrou ser eficaz como adjuvante na estimulação dos titulos de anticorpos anti-HSV gD contra o antigénio gD do virus Herpes simplex, e a sua eficácia era bastante aumentada se o MTP-PE e gD fossem libertados em óleo (IFA) em vez da solução aquosa. Uma vez que o IFA não é aprovado para uso humano, outros sistemas de libertação de óleo foram investigados para o MTP-PE e antigénios. Uma emulsão de 4% de

Ή esqualeno com 0,008% de Tween 80 e HSV gD deu resultados muitos bons em cobaias. Esta formulação, MTP-PE-LO (óleo baixo), foi emulsifiçada passando através de uma agulha hipodérmica e era bastante instável. Apesar disso, o MTP-PE-LO forneceu altos titulos de anticorpos na cobaia e boa protecção na ameaça de HSV da cobaia imunizada (ver Sanchez-Pescador et al. (1988) J.

Immunology, 141:1720-1727 e Technoloqical Advances in Vaccine Development (1988) Lasky et al., eds., Alan R. Liss, Inc., p. 445-469). A formulação MTP-PE-LO foi também eficaz na estimulação da resposta imune à proteína do envelope HIV produzida pelas leveduras na cobaia. Ambos os titulos de anticorpos ELISA e titulos de anticorpos neutralizadores do virus foram estimulados a altos niveis com a formulação MTP-PE. Contudo, quando a mesma formulação foi testada em animais maiores, como cabras e babuínos, as composições não foram tão eficazes. A conveniência de formulações de adjuvantes adicionais, para usar com antigénios moleculares em humanos ou noutros animais grandes, era evidente tendo em conta esta falta de previsibilidade.

As experiências dos presentes inventores demonstraram depois que uma composição de adjuvante composta por um óleo metabolizável e um agente emulsificador, em que o óleo e o agente emusificador estão presentes na forma de uma emulsão de óleo-emágua tendo todas as gotículas de óleo substancialmente com menos de 1 micron de diâmetro, é uma composição adjuvante eficaz para aumentar a eficácia das vacinas. Investigações mostraram a superioridade de tais composições de adjuvantes, em relação a adjuvantes contendo óleo e agentes nos quais as gotículas de óleo eram composições de emulsificadores, significativamente maiores. Estas composições de adjuvantes são objecto de uma outra Patente (Patente Norte Americana com o No.

de Série 357.035, depositada em 25 de Maio de 1989).

Contudo são ainda desejáveis outros melhoramentos nas formulações de adjuvantes. São, por exemplo, desejáveis composições imunogénicas que conduzem a respostas imunes celulares aumentadas, bem como a respostas imunes humorais aumentadas.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, é um objectivo da presente invenção melhorar a imunogenicidade das vacinas, particularmente das subunidades de vacinas.

E também objectivo da presente invenção fornecer vacinas nas quais são activadas as respostas imunes, quer celulares quer humorais.

Estes e outros objectivos da invenção foram conseguidos fornecendo uma formulação de vacina compreendendo dois compostos, um composto antigénio/lipossoma e uma emulsão de óleo-em-água. Os liposssomas utilizados nalgumas concretizações são conhecidos como lipossomas fusogénicos, o que quer dizer que eles se podem fundir com membranas biológicas em condições apropriadas como se descreve a seguir. Contudo, não são requeridos lipossomas fusogénicos. São particularmente úteis as composições formadas usando um péptido muramilo e um óleo metabolizável na forma de uma emulsão de óleo-em-água, em que as goticulas de óleo são de dimensão substancialmente sub-micrónica, e um composto lipossoma/antigénio formado separadamente, que é combinado com a emulsão para formar a composição final da vacina.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS ESQUEMAS

A figura 1 é um gráfico que mostra a média dos titulos do anticorpo em diferentes tempos, apôs a imunização com o antigénio gD2 em cabras, utilizando diferentes formulaçOes de adjuvantes.

A figura 2 é um gráfico que mostra a média dos titulos do anticorpo, em diferentes tempos, após a imunização com o antigénio gB2 em cabras, utilizando diferentes formulaçOes de adjuvantes env2-3.

A figura 3 é um gráfico que mostra a média dos titulos do anticorpo, em diferentes tempos, após a imunização com o antigénio env203/sf2 em macacos rhesus utilizando diferentes formulaçOes de adjuvantes.

A figura 4 é um gráfico que mostra a média dos titulos do anticorpo em diferentes tempos após a imunização com o antigénio gD2 em coelhos utilizando diferentes formulaçOes de adjuvantes.

A figura 5 é um gráfico que mostra parasitemia cumulativa em vários grupos de macacos imunizados com um antigénio malariano e diferentes adjuvantes e depois ameaçados com malária heteróloga.

A figura 6 é um conjunto de dois gráficos que mostram o titulo ELISA (tabela superior) e sobrevivência (tabela inferior) dos ratos imunizados com uma vacina da gripe e diferentes adjuvantes e depois ameaçados com gripe.

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DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECIFICAS

São conhecidos os componentes individuais das composições das vacinas da presente invenção, mas não foram combinados da maneira corrente. Em particular, foi inesperado e surpreendente que tais composições de vacinas aumentassem a eficácia dos imunogénios, para além dos niveis previamente obtidos quando se usaram os componentes separados.

Enquanto os componentes individuais da composição da vacina são aqui descritos, quer na sua forma general quer pormenorizadamente, para modalidades preferíveis, todos os componentes são bem conhecidos na área, e os termos aqui usados, como lipossoma, péptido de muramilo, óleo metabolizável e agente emulsificador, são suficientemente bem conhecidos dos especialistas na área para se descrever e identificar esses componentes.

Os lipossomas usados na prática desta invenção podem ser preparados a partir de uma grande variedade de materiais lipidicos, incluindo éteres e ésteres de fosfatidilo, tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, e fosfatidilcolina; glicéridos, tais como dioleoilglicerosuccinato; cerebrosidos; gangliosidos; esfingomielina; esteroides, como colesterol; e outros lipidos. Ver Patente Norte Americana Nos. 4.235.871; 4.762.720; 4.737.323; 4.789.633; 4.861.597; e 4.873.089 para descrições adicionais da preparação dos lipossomas.

A preparação dos lipossomas 'per se' não faz parte da presente invenção, uma vez que os lipossomas são bem conhecidos de áreas anteriores, como é indicado nas patentes acima referidas. Em geral, os lipossomas tem sido feitos através de

diferentes técnicas, incluindo injecção de etanol, (Batzri et al., Biochem. Biophys. Acta. 298:1015 (1973)); infusão de éter, (Deamer et al., Biochem. Biophys. Acta. 443:629 (1976) e Schieren et al., Biochem. Biophys. Acta. 542:137 (1978)), remoção de detergente, (Raz in, Biochem. Biophys. Acta.265:241 (1972)), evaporação do solvente, (Matsumato et al., J. Colloid Interface Sei 62:149 (1977)), evaporação de solventes orgânicos a partir de emulsões de clorofórmio em água (REV's), (Szoka Jr et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:4194 (1978)); extrusão de MLV's ou LUV's através de nucleoporos da membrana policarbonatada (Olson et al., Biochem. Biophys. Acta. 557:9 (1979)); e congelação e descongelação de misturas de fosfolipidos, (Pick, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186 (1981)).

Convencionalmente, os lipossomas são categorizados pelo tamanho, e um acrónimo de três letras é usado para designar o tipo de lipossoma em questão. Vesículas multilamelares são geralmente designadas MLV. Vesículas unilamelares pequenas são designadas por SUV, e vesículas unilamelares grandes são designadas por LUV. Estas designações são por vezes acrescidas da composição química do lipossoma. Para um debate da nomenclatura e um sumário dos tipos conhecidos de lipossomas, ver Papahadjopoulos, Ann. N. Y. Acad. Sei., 308:1 (1978) e Ann. Repts. Med. Chem., 14:250 (1979).

Uma classe de lipossomas que mostrou ser útil na libertação de substâncias biologicamente activas para as células, (incluindo substâncias úteis como imunogénios) é composta por materiais conhecidos como lipossomas fusogénicos. Estes são lipossomas sensíveis ao pH gue se agregam, se tornam destabilizados, e se fundem com membranas biológicas durante a apropriada alteração nas condições fisiológicas. Tais lipossomas são feitos tipicamente para serem sensíveis ao pH, tipicamente sensíveis a ácidos, para se obter vantagem dos vários fenómenos fisiológicos. Por exemplo a endocitose mostrou ser o primeiro caminho pelo qual os lipossomas carregados negativamente são interiorizados pelas células de mamiferos. A endocitose leva a que os lipossomas sejam transportados até um meio acidico de um endossoma ou de um lisossoma. Como o meio destes organelos é ácido relativamente às condições fisiológicas da corrente sanguinea dos organismos, a alteração do pH pode ser usada para libertar o conteúdo dos lipossomas para o meio celular. A libertação do antigénio directamente para o citoplasma pode permitir a apresentação da classe I do antigénio, estimulando assim a resposta imune mediada por células. Ver Patentes Norte Americanas Nos. 4.789.633 e 4.873.089 para exemplos de lipossomas fusogénicos.

Os lipossomas fusogénicos são geralrnente preparados usando uma molécula lipidica que é electricamente neutra no pH presente na corrente sanguinea do hospedeiro, mas que é carregada no pH presente no endossoma ou lisossoma (tipicamente um pH inferior a 6,5). Exemplos de lipidos adequados incluem fosfatidiletanolamina (PE) e palmitoilhomocisteina. Tais lipossomas fusogénicos são tipicamente compostos em parte de moléculas lipidicas, nas quais a área de secção cruzada eficaz do grupo da cabeça é menor que a área de secção cruzada eficaz da porção hidrofóbica, ambas perpendiculares ao plano da bicamada (i.e., PE). Os lipossomas fusogénicos podem ainda conter moléculas lipidicas capazes de ligações de hidrogénio com os grupos das cabeças das moléculas lipidicas previamente descritas (e.g., ácido oleico, succinato glicerol dioleoilo). Quando a ligação de hidrogénio ocorre, é condensada a área da superfície eficaz da bicamada, resultando numa bicamada metastável, de fusão-competente. Esta configuração pode facilmente ser reorganizada na fase hexagonal II quando fortemente aplicada noutra bicamada de fusão-competente, resultando na fusão de duas membranas.

inicio da fusão pode ser controlado pelo pH, que determina a quantidade de ligações de hidrogénio inter-cabeças do grupo (i.e·, lipossomas fusogénicos sensíveis ao pH). Alternativamente, a fusão pode ser controlada termicamente; as bicamadas da fusão competente devem estar na fase lamelar a, ou no estado cristalino liquido. Se for inferior a Tm, devem estar no estado de gel, ou na fase lamelar β, e serão incapazes de fusão. 0 aumento da temperatura acima de T_m provocará a fusão.

Deve-se realçar, contudo, que os lipossomas fusogénicos são apenas uma concretização de uma parte da presente invenção e foram previamente conhecidos de várias formas. Como exemplo de publicações que descrevem lipossomas fusogénicos, ver Connor et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1984) 81:1715-1718; Schneider

et al.,	Proc.	Natl. Acad. Sei. U.S.A.	(1980)	77:442-446
Schenkman	et	al., Biochem. Biophys. Acta.	(1981)	649:633-641
Schenkman	et	al., Chem. Phys. Lipids	(1981)	28:165-180
Blumenthal	et	al.,J. Biol. Chem. (1983) 258	:349-3415	; Yatvin e

al., Science (1980) 210:1253-1255; Duzgunes et al., Biochemistry (1985) 24:3091-3098; Straubinger, Receptor-mediated Targeting of

Drugs (Gregoriadis,eds.) pp. 297-315, Plenum Press New York;

Straubinger et al., FEBS Lett. (1985) 179:148-154. Para informações gerais sobre lipossomas, suas propriedades, e métodos de preparação, ver Liposome Technology (Gregoriadis, ed.) CRC Press, Boca Raton, Florida (1983). Para uma revisão geral recente do uso de lipossomas como adjuvantes imunológicos, incluindo uma listagem de publicações descrevendo diferentes aspectos da composição dos lipossomas, preparação, e uso com antigénios como agentes imunogénicos, ver Gregoriadis, Immunology Today(1990) 11:89-97.

A presente invenção tem levado a cabo um grande número de composições de lipossomas, utilizando quer lipossomas fusogénicos quer lipossomas não fusogénicos. Neste e noutros exemplos ao longo das especificações, são utilizadas as seguintes abreviaturas: PE, fosfatidiletanolamina; GS, dioleoil glicerol succinato; CHOL, colesterol; OA, ácido oleico; PC, fosfatidil colina; e PS, fosfatidil serina. Uma composição preferível de lipossomas fusogénicos é composta por fosfatidil etanolamina e dioleoil glicerol succinato numa razão molar de 8:2; a abreviatura desta composição é PE/GS(8:2). PE/GS/CHOL (8:2:1) é também uma composição preferível de lipossomas fusogénicos. Composições de lipossomas não fusogénicos incluem PC/PS (7:3) e PC/PS/CHOL (7:3:1).

A formulação da vacina total desta invenção contém, como foi previamente mencionado, dois principais componentes: o componente antigénio/lipossoma e a emulsão do óleo. De acordo, os lipossomas aqui descritos são preparados numa primeira composição contendo o antigénio que vai ser usado para induzir a r·” resposta imune, que é combinado com o segundo componente (emulsão) para formar a composição da invenção.

A palavra antigénio aqui usada refere-se a qualquer substância (incluindo uma proteina ou proteina-polissacárido, proteina-lipopolissacárido, polissacárido, lipopolissacárido, sub-unidades virais, ou virus completo) que, quando é estranha à corrente sanguínea de um animal, ao ganhar acesso ao tecido desse animal, estimula a formação de anticorpos específicos e reage especificamente in vivo ou in vitro com tais anticorpos. Mais ainda, o antigénio estimula a proliferação de linfócitos T com receptores para o antigénio e pode reagir com os linfócitos para iniciar a série de respostas designada por imunidade mediada por células.

Um hapteno está dentro do âmbito desta definição . Um hapteno é a porção de uma molécula de antigénio ou do complexo antigénico que determina a sua especificidade imunológica. Normalmente, um hapteno é um péptido ou um polissacárido nos antigénios que ocorrem naturalmente. Nos antigénios artificiais pode ser uma substância de baixo peso molecular como derivados do ácido arsanilico. Um hapteno vai reagir especificamente in vivo ou in vitro, com um anticorpo ou um linfócito T induzido por uma forma antigénica do hapteno (e.g., o hapteno ligado a uma substância imunogénica). Categorias alternativas são os determinantes antigénicos, agrupamentos estruturais antigénicos e agrupamentos hapténicos.

A formulação de uma vacina desta invenção utilizará uma quantidade eficaz de um antigénio. Isto é, será incluida uma quantidade do antigénio que, em combinação com o adjuvante, vai levar o sujeito a produzir uma resposta imunolõgica suficiente e especifica, de modo a conferir protecção ao sujeito a partir de subsequentes exposições a um virus ou outro patogénio.

Os antigénios podem ser produzidos por métodos conhecidos na área ou podem ser adquiridos em fontes comerciais. Antigénios dentro do âmbito desta invenção incluem particulas virais totalmente inactivadas, protéinas virais isoladas, e subunidades proteicas (como as produzidas por engenharia genética). As vacinas desta invenção podem ser utilizadas para imunizar mamíferos contra vários patogénios, bem como para induzir formação de anticorpos para uso em diagnóstico.

Exemplos de antigénios que têm sido incorporados em composições contendo lipossomas da invenção incluem uma protéina recombinante segregada por células ováricas de hamsters (CHO) chineses geneticamente construídas e derivados do virus herpes simplex, sendo a protéina recombinante designada por HSV rgD2. Esta protéina tem a região fixa normal truncada, segregando uma proteína glicosilada para o meio de cultura tecidular. 0 HSV gD2, como foi usado nos lipossomas, foi purificado a partir do meio CHO até mais de 90% de pureza. O HSV rgB2 é uma protéina segregada completamente glicosilada , produzida nas células CHO, semelhante ao HSV gD2 descrito acima. A HIV gp 120 é uma protéina do virus da imunodeficiência humana totalmente glicosilado, produzido de um modo semelhante ao descrito acima para o HSV gD2. O HIV RT6, uma forma recombinante da transcriptase reversa do HIV, é produzida em Saccharomyces cerevisae e é geneticamente construída. A esta protéina falta o terminal C da transcriptase reversa nativa. Ambas as protéinas

HIV, bem como um número de diferentes vacinas comerciais da gripe, foram incorporadas em lipossomas para utilização na prática da presente invenção.

Sera 1, uma forma recombinante de uma proteina do merozoito do Plasmodium falciparum, é produzida na Saccharomyces cerevisae construída geneticamente. Esta proteina contém apenas os 262 aminoácidos do terminal-N do antigénio de merozoito nativo. HA Taiwan, a hemaglutinina da estirpe A/Taiwan/1/86(H1N1) da gripe, é cultivada em ovos de frango por Parke-Davis para uma vacina comercial da gripe. Foi também utilizado um péptido de onze aminoácidos sintéticos, H-Ile-TyrSer-Thr-Val-Ala-Ser-Ser-Leu-Val-Leu-OH, correspondente a um epitopo de célula T identificado no HSV gB2 nativo (Hanke, T., et al. (1991) J. of Virology 65;1177-1186).

Um grande número de outros antigénios são especificamente considerados para o uso da presente composição. Estes incluem HlV-env 2-3, uma proteina HIV geneticamente construída; vários virus da malária, como fale. 2.3; mero; sera N; e vivax 1, 2, e 3. Proteinas do citomegalovirus (CMV), incluindo as designadas por gB e gH, são também consideradas juntamente com várias proteinas do virus da hepatite C (HCV). Para uma mais detalhada descrição destes antigénios, bem como uma listagem de um grande número de publicações nas quais estes e outros antigénios são descritos em detalhe, ver Pedido de Patente Norte Americano com o No. de Série 357.035, depositado em 25 de Maio, 1989. Ver também o correspondente PCT No. de Série PCT/US90/02954, depositado em 24 de Maio,1990, e entitulada Adjuvant Formulation Comprising a Submicron Oil Droplet

Ci

Emulsion.

Em geral, a presente invenção pode ser usada com qualquer protéina natural ou recombinante ou subunidade de protéina, que sejam adequadas para o desenvolvimento de vacinas bem como de péptidos compostos pelos epítopos das células B e células T. Podem também ser utilizados antigénios não proteicos (e.g., carbohidratos, glicolipidos) .

Não há uma indicação de uma dose única que possa ser referida que forneça orientação especifica para cada um dos antigénio que podem ser utilizados nesta invenção. A quantidade eficaz de antigénio será função da sua actividade inerente e pureza como entendido no ramo. Valores exemplificativos são discutidos a seguir numa secção descrevendo as quantidades relativas dos vários componentes da composição da invenção.

componente da emulsão da presente invenção compreende um péptido muramilo e um óleo metabolizável, numa emulsão óleoem-água. As goticulas do óleo em suspensão podem ter qualquer dimensão adequada e não é necessário que sejam substancialmente submicrónicas para serem utilizadas no aumento da eficácia das vacinas, apesar de serem preferíveis goticulas submicrónicas como se descreve a seguir. 0 péptido muramilo funciona como um imunoestimulador na composição do adjuvante e também possui propriedades emulsionadoras, de modo que não é necessário um agente emulsionador separado. No entanto, o componente da emulsão da presente emulsão inclui, preferencialmente, um ou mais agentes emulsificantes adicionais.

Qualquer péptido de muramilo estimulador da resposta imune (também conhecido como um glicopéptido) pode ser usado na i

composição da presente invenção. E indicado a seguir um grande número de péptidos de muramilo preferíveis.

Exemplos da união do agente emulsificador/agente imunoestimulador são os péptidos muramilo lipofllicos descritos nas duas publicações de Sanchez-Pescador et al. acima citadas. Estes materiais compreendem o péptido N-acetilmuramilo básico (porção hidrofilica) qua actua como um grupo imunoestimulador, mas também inclui uma porção lipofilica que fornece caracteristicas de superficie activa ao composto resultante. Estes compostos, tal como outro tipo de substâncias imunoestimuladoras anfipáticas, actuam quer como agentes imunoestimuladores quer como agentes emulsificadores, e são preferidos na prática da presente invenção. Além disso, é também possível a prática da presente invenção usando substâncias imunoestimuladoras anfipáticas em combinação com uma segunda substância imunoestimuladora que não é anfipática. Um exemplo será a utilização de um péptido muramilo lipofilico em combinação com um dipéptido muramilo essencialmente não substituído (i.e., essencialmente hidrofilico).

Os péptidos muramilo estimuladores da resposta imune, preferíveis desta invenção, são um grupo de compostos relacionados e normalmente derivados do N-acetilmuramil-L-alanilD-isoglutamina, que foi determinado por Ellouz et al.(1974) Biochem. & Biophys. Res. Comm., 59:1317, como sendo a mais pequena unidade eficaz possuindo actividade adjuvante imunológica em M. tubérculosis, o componente micobacteriano do adjuvante completo de Freund. Um grande número de substitutos de dipéptidos e polipéptidos derivados do ácido murâmico foram subsequentemente desenvolvidos e mostraram ter actividade imunoestimuladora.

Apesar destes péptidos muramilo serem um grupo variado de compostos, podem ser genéricamente representados pela fórmula I abaixo apresentada:

em que os oxigénios hidroxilo do anel pirânico são substituídos por hidrogénio, alquilo, ou acilo ou semelhantes, ou podem ser substituídos por substitutos com base de nitrogénio, particularmente o oxigénio da posição 6; o grupo 2-amina é um grupo acilo ou qualquer outra amida; a cadeia lateral do lactilo está modificada, e.g., é etilo ou outra porção alquilo, na posição 2; e a função do péptido é um dipétido ou polipéptido que pode ser derivatizado. Análogos furanosilo do composto piranosilo têm também actividade imunopotenciadora e são úteis nesta invenção.

Entre os péptidos muramilo usados nesta invenção encontram-se os dissacáridos e tetrassacáridos ligados pelo ácido meso-WyG-diaminopimélico, como foi descrito nas Patentes Norte Americanas Nos. 4.235.771 e 4.186.194.

Outros péptidos de muramilo estimuladores da resposta imune que podem ser usados na prática desta invenção são revelados nas Patentes Norte Americanas Nos. 4.094.971; 4.101.536; 4.153.684; 4.235.771; 4.323.559; 4.327.085;._4.185.089;

4.082.736; 4.369.178; 4.314.998; 4.082.735; e 4.186.194. Α divulgação dos péptidos de muramilo nestas patentes é aqui incorporada para referência e tornada uma parte da mezma como se fosse aqui apresentada no seu contexto geral. Os compostos dos documentos J5 4079-2227, J5 4079-228, e J5 41206-696 das patentes Japonesas são também úteis na prática da presente invenção.

Métodos de preparação destes compostos são divulgados e bem conhecidos na área. Exemplificações dos processos preparativos podem ser encontrados nas Patentes Norte Americanas 4.082.736 e 4.082.735. Adicionalmente, processos preparativos semelhantes podem ser encontrados nas Patentes Norte Americanas referidas no parágrafo precendente.

Péptidos muramilo preferíveis são aqueles que têm a fórmula IIj

(II) em que :

R é um radical alquilo não substituido ou substituido contendo de 1 a 22 átomos de carbono, ou um radical arilo não substituido ou substituido, contendo de 6 a 10 átomos de carbono; 1 2

R e R são iguais ou diferentes e são hidrogénio ou um radical acilo contendo de 1 a 22 átomos de carbono;

R é hidrogénio, alquilo de 1 a 22 carbonos, ou arilo de 7 a 10 átomos de carbono;

R é hidrogénio ou alquilo de 1 a 7 carbonos; n é 0 ou

1; X e Z são independentemente alanilo, valilo, leucilo, iso20

Τ⁵³” «κ

-leucilo, α-aminobutarilo, treonilo, metionilo, cisteinilo, glutamilo, glutaminilo, isoglutamilo, isoglutaminilo, aspartilo, fenilalanilo, tirosilo, lisilo, orintinilo, arginilo, histidilo, asparaginilo, prolilo, hidroxiprolilo, serilo ou glicilo;

R é um grupo carboxilo facultativamente esterificado ou amidatado do aminoácido terminal; e fí fi

Y é -NHCHR^oCH2CH2C0-, em que R° é um grupo carboxilo facultativamente esterificado ou amidatado.

Um grupo carboxilo facultativamente esterificado ou amidatado é o próprio grupo carboxilo ou um grupo carboxilo esterificado com um alcanol C1-C4, como metanol, etanol, propanol, butanol, ou um grupo carbamoilo, que no átomo de azoto é não substituído ou monosubstituido ou di-substituido pelo alquilo C1-C7, especíalmente um alquilo C1-C4, arilo, particularmente fenilo , ou arilalquilo, particularmente benzilo.

grupo carbamoilo pode também ser substituído por um radical alquilideno como radical butilideno ou pentilideno. Em adiçao, o 5 grupo carbamoilo R pode também ser substituído por um grupo carbamoilmetilo no átomo de azoto.

Os compostos particularmente preferíveis sao os da 1 fórmula II em que R e R são iguais ou diferentes e sao hidrogénio ou um radical acilo contendo de 1 a 22 átomos de 2 3 carbono; R é metilo; R é hidrogénio; X é L-alanilo, Y é Disoglutaminilo, e n é 0.

Um grupo diferente de péptidos de muramilo preferíveis 1 é o dos compostos da fórmula II em que R e R são hidrogénio ou 2 3 acrlo de 1 a 22 átomos de carbono, R é metilo, R é hidrogénio, 4

R é metilo ou butilo, e X é L- valilo, L-serilo, L-alanilo, L 21 treonilo ou L-a-aminobutirilo.

Exemplos específicos incluem os seguintes compostos: N-acetilmuramil-L-a-aminobutiril-D-isoglutamina;

6-0-estearoil-N-acetilmuramil-L-a-aminobutiril-D-isoglutamina; N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina; N-acetilmuramil-L-valil-D-isoglutamina; N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina-n-butil éster; N-acetil-desmetil-D-muramil-L-alanil-D-isoglutamina; N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina; N-acetilmuramil-L-seril-Disoglutamina;

N-acetil(butilmuramil)-L-a-aminobutil-D-isoglutamina; e

N-acetil(butilmuramil)-L-alanil-D-isoglutamina.

Uma quantidade eficaz do péptido muramilo imunoestimulador é a quantidade que efectua um aumento no nivel do titulo do anticorpo, quando administrado em conjunto com um antigénio sobre o nivel do titulo observado quando o péptido muramilo não foi co-administrado. Como pode ser apreciado, cada péptido muramilo pode ter uma amplitude na dose eficaz que pode diferir de outros pêptidos muramilo. Por isso não pode ser prescrita uma amplitude de dose única que tenha uma precisão própria para cada péptido muramilo possivel dentro do alcance desta invenção. Contudo, como regra geral, o péptido muramilo estará presente preferencialmente na vacina numa quantidade entre 0,001 e 5% (p/v). Uma quantidade ainda mais preferencial é 0,01 a 3% (p/v).

A maioria dos pêptidos muramilo imunoestimuladores acima descritos são compostos essencialmente hidrofílicos.

Portanto são pretendidos para a utilização com um agente emulsificador separado (que pode ser, como referido acima, também um agente imunoestimulador). Nalguns casos os compostos acimas descritos têm um carácter lipofilico, como os compostos compreendendo os substituintes dos ácidos gordos e/ou os substituintes arilo na porção do açúcar, particularmente aqueles contendo um ou mais radicais acilo contendo de 14 a 22 átomos de carbono, particularmente os que contêm mais do que um substituinte acilo. Contudo, também é possivel conseguir carácter lipofilico num péptido muramilo fornecendo uma porção lipidica ligada através do grupo carboxilato ou cadeias laterais da porção peptidica. Em particular, os compostos tendo um ou mais grupos de lipidos, unidos à porção peptidica através do grupo carboxilato terminal, representam um grupo de compostos preferencial. Esta ligação pode ser facilmente fornecida quer directamente, como por formação de uma ligação éster entre o terminal carboxilato e um álcool de ácido gordo contendo de 14 a 22 átomos de carbono, quer usando um grupo de ligação bifuncional, como etanolamina, para ligar o carboxilato, através guer de uma ligação éster ou amida a um lipido. Particularmente preferíveis nesta concretização da invenção são os fosfolípidos, uma vez que os grupos fosfato fornecem um grupo funcional de ligação rápida. Diacilfosfo-glicéridos fornecem um dos tais fosfolípidos de ligação rápida. Fosfatidil etanolamina, um ligante rápido, um composto que ocorre naturalmente, pode ser facilmente ligado ao carboxilato terminal da porção peptidica através de uma ligação amida. Outros lipidos incluem acilgliceróis, fosfatidil colina,

fosfatidil serina, fosfatidil inositol, fosfatidil glicerol, cardiolipina e esfingomielinas.

Um grande número de péptidos imunoestimuladores anfipáticos preferíveis sao aqueles que tem a fórmula III abaixo:

(III)

4 em que R, R -R , X, Y, Z e n têm significados descritos previamente. L representa uma porção lipidica, como as porções de lipidos aqui descritos.

Em sumário, a porção de ácido murâmico e a porção peptídica da molécula, conjuntamente, fornecem uma porção hidrofilica. Uma porção lipofilica está também presente na molécula, sendo a lipofilicidade geralmente fornecida por um grupo hidrocarboneto de cadeia longa, tipicamente presente na forma de um ácido gordo. 0 ácido gordo ou outro radical contendo hidrocarboneto pode ser ligado a um grupo hidroxilo do açúcar ou pode ser ligado à porção peptídica da molécula, quer directamente, como por reacção de um ácido gordo com... um grupo amina livre presente na porção peptídica, quer através de um grupo de ligação , como hidroxialquilamina que forma uma ligação entre um grupo do ácido carboxílico do péptido através da formação de uma ligação amida e um grupo funcional do lipido, como o grupo fosfato. Porções de fosfolipidos são particularmente preferíveis para a utilização na formação de péptidos muramilo lipofilicos. Um grupo de compostos preferíveis incluem dipéptidos e tripéptidos de muramilo ligados a uma porção fosfolipidica '“X, através de uma porção hidroxialquilamina. Um exemplo, e um composto particularmente preferível, é N-acetilmuramil-L-alanilD-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (abreviado MTP-PE), produzido pela CibaGeigy, Ltd., Basel, Suiça.

Outro componente usado na presente invenção é um óleo não tóxico, metabolizável, preferencialmente um de 6 a 30 átomos de carbono, incluindo, mas não limitado a, alcanos, alcenos, alcinos, e seus correspondentes ácidos e álcoois, seus éteres e ésteres e suas misturas. 0 óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal, ou óleo preparado sinteticamente, que podem ser metabolizados pelo corpo do sujeito ao qual o adjuvante vai ser administrado e que não é tóxico para esse sujeito. O sujeito é um animal, tipicamente um mamifero, e preferencialmente um humano, ©leo mineral e óleos destilados de petróleo tóxico semelhantes são expressamente excluídos desta invenção.

O composto oleico desta invenção pode ser qualquer alcano, alceno, ou alcino de cadeia longa, ou um ácido ou álcool, ou seus derivados quer como o ácido livre, seu sal ou éster como um mono-, di-, ou triester, como o glicérido e ésteres de 1,2,propanodiol ou poli-hidroxi álcoois semelhantes. Álcoois podem ser acilados utilizando um ácido mono- ou poli- funcional, por exemplo ácido acético, ácido propânico, ácido citrico ou semelhantes. Éteres derivados de álcoois de cadeia longa, que são óleos e que tem outros critérios aqui estipulados, podem também ser usados.

A porção individual de alcano, alceno ou alcino, e seus ácidos ou álcoois derivados, têm geralmente 6-30 átomos de carbono. A porção pode ter uma estrutura de cadeia linear ou ramificada. Pode ser completamente saturada ou ter uma ou mais ligações duplas ou triplas. Quando são utilizados óleos de base mono ou poli éster ou éter, a limitação de 6 a 30 carbonos aplica-se ao ácido gordo individual ou à porção álcool gordo, e não ao número total de carbonos.

Qualquer óleo metabolizável pode ser aqui usado, incluindo óleos artificiais, mas são preferíveis óleos derivados de uma fonte animal, peixe, ou vegetal. E essencial que o óleo seja metabolizado pelo hospedeiro ao qual vai ser administrado; de outro modo o composto do óleo pode causar abcessos, granulomas ou mesmo carcinomas, ou, quando usado na prática veterinária, pode tornar a carne das aves e animais vacinados inadequada para o consumo humano, devido ao resultado nocivo que o óleo não metabolizável pode ter no consumidor.

As fontes dos óleos vegetais incluem nozes, sementes e grão. Oleo de amendoim, óleo de soja, óleo de côco, e azeite, são exemplos de óleos de nozes vulgarmente disponíveis. Qleos de sementes incluem óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e semelhantes. No grupo de grão, o óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros cereais em grão, como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticale e semelhantes pode também ser usado.

A tecnologia para obter estes óleos vegetais está bera desenvolvida e é bem conhecida. A composição destes e de outros óleos semelhantes pode ser encontrada, por exemplo, no Index Merck e fontes materiais sobre alimentos, nutrição e tecnologia

alimentar.

Os ésteres de ácidos gordos de 6 a 10 carbonos do glicerol e do 1,2-propanodiol, embora não ocorrendo naturalmente nos óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados a partir dos óleos de nozes e sementes. Estes produtos estão comercialmente disponíveis sob o nome NEOBE^-^ do PVO International, Inc., Divisão das Especialidades Químicas, 416 Division Street, Boongon, NJ e outros.

Qleos de muitas fontes animais podem ser empregues nos adjuvantes e vacinas desta invenção. Qleos e gorduras de animais são geralmente sólidos a temperaturas fisiológicas porque são triglicéridos e têm um grau de saturação mais elevado que os óleos de peixe ou vegetais. Contudo, os ácidos gordos são obtidos a partir de gorduras animais através de saponificação completa ou parcial dos triglicéridos, a qual fornece os ácidos gordos livres. Gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, por isso, ser usados na prática desta invenção . Os processos de separação, purificação, saponificação, e outros meios necessários para obter óleos puros a partir de fontes animais são bem conhecidos na área.

Muitos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser rapidamente recuperados. Por exemplo, óleo de figado de bacalhau, óleos de figado de tubarão, e óleo de baleia tal como espermacete, exemplificam os vários óleos de peixe que podem ser usados. Um grande número de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente referidas como terpenoides. Qleo de

figado tubarão contém um terpenoide não saturado, ramificado, conhecido como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é aqui particularmente preferível. Esqualano, o análogo saturado do esqualeno, é também um óleo particularmente preferível. Oleos de peixe incluindo esqualano e esqualeno, estão disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos pelos métodos conhecidos na área.

componente do óleo destes adjuvantes e formulações de vacinas devem estar presentes numa quantidade de 0.5% a 15% por volume, preferencialmente numa quantidade de 1% a 12% E mais preferencialmente para se usar de 1% a 4% do óleo.

A porção aquosa destas composições de adjuvantes é normalmente tampão salino ou, nalgumas concretizações preferíveis, água não adulterada. Pelo facto destas composições se destinarem à administração parentérica, é preferível completar as soluções salinas finais usadas como vacinas, de forma a que a tonicidade, i. e., a osmolalidade seja essencialmente a mesma dos fluidos fisiológicos normais, para evitar inchaço pós administração ou absorção rápida da composição devido à diferente concentração de iões entre a composição e os fluidos fisiológicos. Também é preferivel tamponar a solução salina, de modo a manter um pH compatível com as condições fisiológicas normais. Também nalguns casos pode ser necessário manter o pH num certo nivel, para aumentar a estabilidade de certos componentes da composição, como os glicopéptidos.

Qualquer tampão fisiologicamente aceitável pode ser usado aqui, mas são preferíveis os tampões fosfato. Outros tampões aceitáveis como citrato, acetato, tris, bicarbonato, carbonato, ou semelhantes podem ser usados como substitutos do tampão fosfato. 0 pH do componente aquoso deve ser preferencialmente entre 6 e 8.

Contudo, se o adjuvante fôr preparado como uma emulsão óleo-em-água submicrónica, água não adulterada é preferivel como o componente aquoso da emulsão durante a formação da emulsão. O aumento da concentração do sal torna mais dificil conseguir o tamanho desejado das pequenas gotículas. Quando a formulação da vacina final é preparada a partir do adjuvante, o material antigénico pode ser adicionado num tampão a uma osmolalidade apropriada para fornecer a composição de vacina desejada.

A quantidade do componente aquoso empregue nestas composições será a quantidade necessária para perfazer o valor da composição até à unidade. Isto é, uma quantidade de componente aquoso, suficiente para fazer os 100%, será misturada com os outros componentes listados acima, de modo a levar as composições ao volume desejado.

Um número substancial de agentes emulsifiçadores e de suspensão são geralmente usados nas ciências farmacêuticas. Estes incluem materiais de origem natural, como resina de árvores, protéinas vegetais, polímeros baseados em açúcares como alginatos e celulose, e semelhantes. Certos oxipolimeros ou polímeros, que têm um hidróxido ou outro substituinte hidrofilico no esqueleto de carbono, têm actividade surfactante, por exemplo, povidona, álcool polivinilico, e compostos de glicol mono- e poli-funcionais baseados em éter. Compostos derivados de ácidos gordos de cadeia longa formam um terceiro grupo substancial de agentes emulsificadores e de suspensão que podem ser usados nesta

invenção. Qualquer dos seguintes surfactantes são úteis desde que não sejam tóxicos.

Exemplos específicos de agentes emulsificantes adequados (também referidos como surfactantes ou detergentes) que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem o seguinte:

1- Sabões solúveis em água, como os sais potássio, amónio e alcanol-amónio de ácidos gordos (Ciq-C22)z ^e particularmente sebo de sódio e potássio de sódio, superiores e sabão de côco.

2- Detergentes de não sabão sintético aniónicos, que podem ser representados pelos sais solúveis em água de produtos de reacção do ácido sulfúrico orgânico que têm na sua estrutura molecular um radical alquilo contendo de cerca de 8 a 22 átomos de carbono e um radical seleccionado de um grupo composto por radicais ésteres de ácido sulfónico e ácido sulfúrico. Exemplos destes são os sulfatos alquilo de sódio ou potássio, derivados do sebo ou óleo de côco; sulfonatos benzeno alquilo de sódio ou potássio; sulfonatos eter glicerilo alquilo de sódio; sulfonatos e sulfatos monoglicéridos do ácido gordo do óleo de côco de sódio; sais de sódio ou potássio de ésteres de ácido sulfúrico do produto de reacção de uma mole ou um álcool gordo superior e cerca de 1 a 6 moles de óxido de etileno; sulfonatos éter óxido de etileno fenol alquilo de sódio ou potássio, com 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula, e em que os radicais alquilo contém de 8 a 12 átomos de carbono; o produto de reacção de ácidos gordos esterificados com ácido isetiónico e neutralizados com hidróxido de sódio; sais de sódio ou potássio

-Μ de uma amida de ácido gordo de um taurido metil; sais de sódio e potássio de α-olefinas C1Q-C24 sulfonatadas -SO3.

3- detergentes sintéticos não iónicos feitos através da condensação de grupo óxidos de alquileno com um composto hidrofóbico orgânico. Grupos hidrofóbicos tipicos incluem produtos da condensação do óxido de propileno com glicol propileno, alquilo fenois, produtos da condensação do óxido de propileno e diamina etileno, álcoois alifáticos que têm 8 a 22 átomos de carbono, e amidas de ácidos gordos.

4- Detergentes não iónicos, como óxidos de aminas, óxidos de fosfina e sulfóxidos, tendo caracteristicas semipolares. Exemplos específicos de óxidos de amina terciária de cadeia longa incluem óxido de dimetildodecilamina e bis-(2hidroxietil)dodecilamina. Exemplos específicos de óxidos de fosfina encontram-se na Patente Norte Americana No. 3.304.263 publicada em 15 de Fevereiro de 1967, e incluem óxido de dimetildodecilfosfina e óxido de dimetil(2-hidroxidodecil) fosfina.

5- Sulfóxidos de cadeia longa, que incluem os correspondentes à fórmula R1-SO-R2 em que R^ e R2 são radicais alquilo substituídos ou não substituídos, contendo o primeiro de cerca de 10 a cerca de 28 átomos de carbono, enquanto o R2 contém de 1 a 3 átomos de carbono. Exemplos específicos destes sulfóxidos incluem sulfóxido dodecil metil e sulfóxido 3-hidroxi tridecil metil.

6- Detergentes sintéticos anfoliticos, como 3dodecilaminopropionato de sódio e sulfonato 3-dodecilaminopropano de sódio.

Ί- Detergentes sintéticos anfotéricos, como 3-(N,Ndimetil-N-hexadecilamonio)propano-l-sulfonato e 3-(N,N-dimetil-Nhexadecilamónio)-2-hidroxipropano-l-sulfonato.

Adicionalmente, todos dos seguintes tipos de agentes emulsifiçadores podem ser usados numa composição da presente invenção: (a) sabões (i.e., sais alcalinos) de ácidos gordos, ácidos de resinas, e óleo alto; (b) sulfonatos areno alquilo; (c) sulfatos de alquilos, incluindo surfactantes quer com grupos hidrofóbicos de cadeia ramificada e linear, bem como grupos sulfato primários e secundários; (d) sulfatos e sulfonatos contendo uma ligação intermediária entre os grupos hidrofóbico e hidrofilico, como tauridos metil acilados gordos e monoglicéridos gordos sulfatados; (e) ésteres ácidos de cadeia longa de glicol polietileno, especialmente ésteres de óleo alto; (f) ésteres de glicol polietileno de alquilfenois; (g) éteres de glicol polietileno de álcoois de cadeia longa e mercaptanos; (h) amidas dietanol acil gordas; e (i) copolímeros bloqueadores de óxido de etileno e óxido de propileno. Uma vez que os surf actantes podem ser classificados por mais de uma forma, um grande número de classes de surfactantes indicados neste parágrafo sobrepõe-se às classes de surfactantes previamente descritas.

Existe um grande número de agentes emulsificadores especialmente concebidos para (e normalmente usados em) situações biológicas. Por exemplo, um número de detergentes biológicos (surfactantes) estão listados como tal pela Sigma Chemical Company nas páginas 310-316 do seu Catálogo de Compostos Orgânicos e Bioquímicos de 1987. Tais surfactantes são divididos em quatro tipos básicos: aniónico, catiónico, anfotéricos, e não iónico. Exemplos de detergentes aniónicos incluem ácido alginico, ácido caprilico, ácido eólico, ácido 1-decanosulfónico, ácido deoxicólico, ácido 1-dodecanosulfónico, N-lauroilasarcosina, e ácido taurocólico. Detergentes catiónicos incluem brometo dodecil-trimetilamónio, cloreto benzalcónio, cloreto benzildimetilhexadecil amónio, cloreto cetilpiridinio, cloreto metilbenzetónio, e sulfato 4-picolino dodecil. Exemplos de detergentes anfotéricos incluem 3-[(3-colamidopropil)dimetilamónio]-l-propano-sulfonato (normalmente abreviado CHAPS),

3-[(3-colamidopropil)-dimetilamónio]-2- hidróxi-1propanosulfonato (geralmente abreviado CHAPSO), N-dodecil-N,Ndimetil-3-amónio-l-propanosulfonato, e liso-a-fosfatidileolina. Exemplos de detergentes não iónicos incluem decanoil-Nmetilglucamina, éter dietileno glicol monopentil , n-dodecil β-Dglucopiranosido, condensados de óxido de etileno de álcoois gordos (e.g., vendidos sob o nome de marca Lubrol), éteres de polioxietileno de ácidos gordos (particularmente ácidos gordos C12-C20)/ éteres de ácidos gordos de polioxietilieno de sorbitan (e.g., vendidos sob o nome de marca Tween), e éteres de ácidos gordos de sorbitan (e.g., vendidos sob o nome de marca Span).

Um grupo de surfactantes particularmente úteis são os surfactantes não iónicos baseados em sorbitan. Estes surfactantes sao preparados por desidratação do sorbitol para dar 1,4-sorbitan que depois reage com um ou mais equivalentes de um ácido gordo. A porção substituída do ácido gordo pode depois reagir com o óxido de etileno para dar um segundo grupo de surfactantes.

Os surfactantes de sorbitan dos ácidos gordos substituídos são feitos pela reacção do 1,4-sorbitan com um ácido

gordo como o ácido láurico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido oleico, ou um ácido gordo de cadeia longa semelhante para dar o 1,4-sorbitan monoéster, 1,4-sorbitan sesquiéster ou 1,4sorbitan triéster. Os nomes comuns destes incluem, por exemplo, sorbitan monolaurato, sorbitan monopalmitato, sorbitan monoestearato, sorbitan monooleato, sorbitan esquiolato, e sorbitan trioleato. Estes encontram-se comercialmente disponíveis sob o nome de SPA^^ou ARLACEl^P normalmente com uma letra da designação numérica que se distingue entre os vários sorbitans mono, di- e triésteres substituídos.

Os surfactantes SPAI^e ARLACE](E)sao hidrofilicos e são geralmente solúveis ou dispersiveis em óleo. São também solúveis na maioria dos solventes orgânicos. Em água são geralmente insolúveis mas dispersiveis. Estes surfactantes têm geralmente um equilíbrio hidrofilico-lipofilico (HLB) entre 1,8 e 8,6. Tais surfactantes podem ser feitos facilmente pelos meios conhecidos na área ou estão comercialmente disponíveis a partir de, por exemplo, ICI America's INC., Wilmington, DE sob a marca registada

ATLA:

Um grupo relacionado de surfactantes compreende monoésteres de polioxietileno de sorbitan e triésteres de polioxietileno de sorbitan. Estes materiais são preparados por adição de óxido de etileno a um monoéster ou triéster 1,4sorbitan. A adição do polioxietileno converte o surfactante monoou triéster sorbitan lipofilico num surfactante hidrofílico geralmente solúvel ou dispersivel em água e solúvel em variados graus em liquidos orgânicos.

Estes materiais, comercialmente disponíveis sob a marca

TweeíP sao úteis para preparar emulsões de óleo-em-água e dispersões, ou para a solubilizaçâo de óleos e fazer unguentos anidros solúveis em água ou laváveis. Os surfactantes TWEEl^ podem ser combinados com um surfactante monoéster ou triéster sorbitan relacionado para promover a estabilidade da emulsão.

Surfactantes TWEEN-^estão comercialmente disponíveis a partir de um grande número de fabricantes, por exemplo, ICI America's INC., (í e é um polioxietileno do ácido esteárico. Surfactantes MYR,

Wilmington, DE, sob a marca registada surfactantes ATLAS^-f

Um terceiro grupo de surfactantes não iónicos que podem ser usados sós ou em conjunto com os surfactantes SPAlíP ARLACE^^ e TWEElí^ são os ácidos gordos de polioxietileno produzidos através da reacção do óxido de etileno com um ácido gordo de cadeia longa. 0 surfactante deste tipo mais vulgarmente disponível é vendido sob o nome MYR^^ e é um derivado são hidrofilicos e solúveis ou dispersiveis em água como os surfactantes TWEEI^ Os surfactantes MYRií^podem ser misturados com surfactantes TWEElC^ ou com misturas de surfactantes TWEE^PspaiC^ ou ARLACE^^ para usar na formação de emulsões.

Surfactantes MYRJ<->podem ser produzidos por métodos conhecidos na área ou estão disponíveis a partir da ICI America's INC.

Um quarto grupo de surfactantes não iónicos com base de polioxietileno são os éteres de ácido gordo polioxietileno derivados dos álcoois lauril, acetil, estearil, e oleil. Estes materiais são preparados como acima referido, por adição do óxido de etileno a um álcool gordo. 0 nome comercial deste surfactante é BRI^ Os surfactantes BRI>® podem ser hidrofilicos ou lipofilicos dependendo do tamanho da porção do polioxietileno no surfactante. Embora a preparação destes compostos se encontre disponível na técnica, encontram-se também facilmente disponíveis a partir das fontes comerciais como ICI America's INC.

Outros surfactantes que podem ser potencialmente usados na prática desta invenção incluem polioxetileno, ésteres de ácidos gordos poliol, éter de polioxietileno, éteres de ácidos gordos de polioxipropileno, derivados de cera de abelhas contendo polioxietileno, derivados de lanolina polioxietileno, glicéridos de ácidos gordos polioxietileno, e ésteres de ácidos gordos glicerol ou outro álcool ácido polioxietileno ou derivados de éteres de ácidos gordos de cadeia longa de 12 a 22 átomos de carbono.

Como as formulações do adjuvante e da vacina desta invenção pretendem ser sistemas de multi-fase, é preferível escolher um surfactante não iónico formador de emulsão que tenha um valor HLB na ordem de cerca de 7 a 16. Este valor pode ser obtido através do uso de um surfactante não iónico único como um surfactante TWEEI^P ou pode ser conseguido pelo uso de uma mistura de surfactantes, como com um surfactante de base sorbitan mono-, di- ou triéster; um ãcido gordo esterpolioxetileno sorbitan; um éster sorbitan em combinação com um surfactante derivado de lanolina polioxietileno; um surfactante éster sorbitan em combinação com um surfactante éter gordo polioxietileno HLB elevado; ou um surfactante éter gordo polioxietileno ou um ácido gordo sorbitan polioxietileno.

E preferível usar um surfactante não iónico único, mais particularmente um surfactante TWEElíÉp como o surfactante não iónico, estabilizador da emulsão, na prática desta invenção.

surfactante com o nome TWEEN^sO, conhecido, por outro lado, como polisorbato 80 ou monooleato sorbitan 20 polioxietileno, é dos surfactantes seguintes o mais preferível.

Emulsões de óleo-em-água adequadas podem ser normalmente efectuadas tendo o surfactante presente numa quantidade de 0.02% a 2.5% em peso (p/p). Uma quantidade de 0,05% a 1% é preferível, sendo especialmente preferível com 0,01 a 0,5%.

O modo pelo qual a emulsão óleo-em-água desta invenção é conseguida não é importante para a prática da presente invenção. Um modo pelo qual uma emulsão pode ser obtida é o uso de emulsificantes comerciais, como o modelo número 110Y disponível a partir do Microfluidics, Newton, MA. Exemplos de outros emulsificantes comerciais incluem Modelo 30CD Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, MA) e Rainnie Minlab Tipo 8.30H (Micro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, WI). Estes emulsificantes funcionam segundo o principio do desenvolvimento de grandes forças de separação, forçando os fluidos através de pequenos orifícios sob grande pressão. Embora o uso da presente invenção não evite o uso de tais emulsificantes, o seu uso não é necessário, nem preferível, para a prática da presente invenção. Se não se desejam goticulas de óleo submicrónicas, outros aparelhos que desenvolvem forças de separação mais baixas podem ser usados (incluindo a simples passagem de formulaçOes através da agulha de uma seringa).

Pode-se variar o tamanho das goticulas de óleo alterando a razão do detergente em relação ao óleo (aumentando a razão, decresce o tamanho das goticulas), accionando a pressão

(aumentando a pressão do processo, decresce o tamanho das gotículas), a temperatura (aumentando a temperatura decresce o tamanhho das gotículas), e adicionando um agente imunoestimulador anfipático (adicionando tais agentes, decresce o tamanho das gotículas). 0 tamanho real das gotículas varia com o detergente especifico, o óleo, e o agente imunoestimulador (se houver) e com as condições especificas seleccionadas do processo. 0 tamanho das goticulas pode ser verificado através do uso de instrumentos de medição, como o Analisador de Partículas Sub-micrónicas Comercial (modelo N4MD), produzido pela Coulter Corporation.

Os componentes da emulsão são preparados a partir dos ingredientes descritos acima antes da combinação com o componente lipossoma/antigénio que serã usado na vacina. Os lipossomas não podem ser preparados na presença dos componentes da emulsão, porque os fosfolipidos e outros componentes dos lipossomas seriam simplesmente incorporados na emulsão e funcionariam como emulsificantes.

Uma vez que o componente da emulsão da invenção é estável, o lipossoma/antigénio e a emulsão podem ser combinados por simples mistura, mexendo ou agitando. Outras técnicas, como passar a mistura dos dois componentes rapidamente através de uma pequena abertura (como uma agulha hipodérmica), fornece facilmente uma útil composição da vacina .

Os vários componentes da composição da presente invenção podem estar presentes numa grande variedade de proporções. 0 lipossoma/antigénio e os componentes da emulsão são tipicamente usados numa razão de volume de 1:10 a 10:1. Razões de volume de 1:3 a 3:1 são preferíveis, com razões de volume de 1:1 sendo preferíveis, porque são fáceis de preparar e facilmente visiveis. Contudo, outras razões podem ser mais apropriadas para objectivos específicos, como quando um antigénio especifico é dificil de incorporar num lipossoma e tem uma baixa imunogenicidade, o que, neste caso, exige uma quantidade relativamente maior do componente antigénico.

Os lipossomas são geralmente preparados a cerca de 1 a 100 mg de lipidos por ml de suspensão lipidica, para uma concentração final de cerca de 0,5 a 50 mg de lipidos por ml. Os lipossomas preparados a cerca de 3 a 30 mg de lipidos por ml são mais preferíveis, e ainda mais preferíveis os de cerca de 10 mg de lipidos por ml.

Massas de antigénio são geralmente seleccionadas com base na dose desejada e no volume da composição final que será injectada. Por exemplo, se se sabe que 10 microgramas de um antigénio induzem a resposta imunogénica desejada e se 1 mililitro é a quantidade injectada normal para um animal ser imunizado, uma composição da vacina deve ser preparada usando a orientação aqui estabelecida de modo que 1 mililitro da composição final da vacina contenha 10 microgramas do antigénio. Os antigênios são tipicamente administrados em concentrações de cerca de 1 a 500 gg/ml, mais normalmente 10 a 50 μ9/χα1 . Contudo, estas são apenas as orientações gerais e a quantidade especifica do antigénio deve ser ajustada dependendo da resposta imunogénica, como foi previamente referido.

De um modo semelhante, a quantidade do tripéptido muramilo (se usado) é ajustada para fornecer uma dose padrão e a composição final da vacina. Tais doses padrão estão tipicamente

na ordem de cerca de 1 a cerca de 2500 gg/ml, preferencialmente cerca de 10 a 250 gg/ml.

Para assegurar a mistura com a emulsão, o tamanho é geralmente seleccionado para condizer com o tamanho das particulas da emulsão. Por exemplo, lipossomas na ordem de 200 a 450 nM de diâmetro foram preparados para serem usados em emulsões submicrónicas. Lipossomas unilamelares são particularmente preferíveis.

Apesar de pelo menos uma parte do antigénio ser associado com os lipossomas por ser ai incorporado ou ser associado à superfície do lipossoma, também é possivel ter composições da invenção em que o antigénio que está presente não está associado com os lipossomas. Este antigénio pode estar presente na emulsão quando a emulsão é inicialmente preparada, ou o antigénio pode dissociar-se da composição do lipossoma, que conterá tipicamente alguma fase liquida associada com, e externa aos lipossomas.

A invenção que estã agora a ser genericamente descrita, será melhor entendida com referência aos seguintes exemplos detalhados que são fornecidos como ilustração e não pretendem ser limitativos da invenção, a menos que tal seja especificado.

EXEMPLOS

Exemplo 1; Associação Fisica do gD2 com Lipossomas

Foram levados a cabo estudos para demonstrar a associação de antigénios com lipossomas, um pré-requisito para a libertação de antigénios pelos lipossomas para as células.

Não fusogénicos

Foram preparados lipossomas compostos de PC/PS (7:3), quer por diálise glucosido octil quer por evaporação de fase reversa (REV). gD2 a 100 gg/ml foi seguida usando gD2 iodinatado estável como marcador. A separação dos lipossomas do gD2 não associado por cromatografia liquida demonstrou que 17% de gD2 se associavam com lipossomas da diálise, e que lipossomas REV tinham 33% do gD2 associado. Nenhum dos lipossomas associados com gD2 foi susceptível de digestão da tripsina, indicando que o gD2 não estava presente na superfície exterior das vesículas. Incubando os lipossomas (lipido 2mM), durante a noite com de 0,4 a 2 mM TritoÀ^ X-100 resultou numa dissociação progressiva do gD2 a elevados niveis de Trito^P consistente com permeabilizaçâo progressiva dos lipossomas. Os lipossomas REV são algo mais resistentes, com este método, à permeabilizaçâo do detergente, devido à falta do glucosido octil residual.

Fusogénicos

Foram preparados lipossomas compostos de PE/GS (8:2) por diálise glucosido octil. Uma vez que esta composição lipidica era incompatível com a técnica REV, usou-se PE/OA (8:2) para aquele método de preparação. A substituição do ácido oleico pelo glicerol-succinato produz LUV estáveis por REV. Lipossomas dializados têm 39% de gD2 associado e lipossomas REV têm 72% de associação (Tabela 1). Do gD2 associado , cerca de 50% foi removido dos lipossoams dializados por digestão de tripsina e era então acessível externamente. Lipossomas dializados fusogénicos eram mais facilmente permeabilizados pelo Tritoí^ do que a

Λ

formulação não fusogénica. Os lipossoams REV contendo ácido oleico perderam a maioria do gD2 marcado quando tratados quer com tripsina quer com Trito^ Ainda que fornecendo informação útil no que respeita a associação gD2 com estas vesículas, isto demonstra a permeabilidade intrínseca de uma preparação de vesículas contendo 20% molar de ácidos gordos.

A incubação de gD2 com lipossomas dializados PE/GS/CHOL (8:2:2) pré-formados teve como resultado a associação nula do gD2 com os lipossomas.

TABELA 1 _____ Associação de gD2 com Lipossomas

Composição Método de Associação Digestão PerrredxLlisçãõ

Lipidica Preparação gD2 % de Tripsina Triton X-100

PC/PS (7x3,	ocíilse Slucosido	17	-	++
	evaporação de fase inversa	33	-	+
PE/GS (8:2)	diálise qlucosido octil	39	++	+++
PE/OA	evaporação de fase	72	+++ +
(8:2)	inversa	*+++

-	= não houve perda do gD2 dos	lipossomas
+	= libertação do gD2 com 0,1%	Triton

++ = gD2 removido dos lipossomas com 0,05% Triton +++ = gD2 removido com 0,025% ++++ = libertação total do gD2 dos lipossomas com 0,025% Triton

Exemplo 2: Associação Física do RT6 com Lipossomas

De um modo semelhante ao descrito no exemplo 1, a associação da molécula RT6 da transcriptase inversa HIV, geneticamente construída, com lipossomas, foi medida. RT6 associa-se 29% com lipossomas dializados PC/PS (7:3)'* o 73% com lipossomas dializados PE/GS (8:2). A marcação do RT6 com iodina baixa teve como resultado digestão, suspeita de tripsina e efeitos de permeabilização Trito/^O

Exemplo 3: Associação Física do gp!20 com Lipossomas

De um modo semelhante, a associação do HIV gpl20 com lipossomas dializados PC/PS (7:3) foi determinada como sendo 8% e com lipossomas dializados PE/GS (8:2), 11%, muito mais baixo que os niveis de associação observados para gD2 e RT6. Cromatogramas HPLC de filtração gel revelaram a presença de um pico de gpl20 alto que se encontra entre a fracção lipossómica e gpl20 monomérico. 0 pico é provavelmente micelas misturadas de gpl20 e octilglucosido. A digestão de tripsina e a permeabilização Tritol^) indicam que o gpl20 estã encapsulado em ambas as preparações de lipossomas e não é acessível exteriormente em qualquer uma delas.

A associação do gpl20 com lipossomas fusogénicos foi aumentada pela preparação dos lipossomas pelo método congelaçâodescongelação-filtração. A associação de antigénios foi determinada pela análise de protéinas dos lipossomas depositados. A incubação do gpl20 com lipossomas congelados-descongeladosfiltrados pré-formados (FTF), quer da composição PC/PS (7:3) quer PE/GS/CHOL (8:2:2), resultou em associação nula.

HWii» 'S

TABELA 2

Associação da gpl20 com Lipossomas

Composição Lipidira	Método de Preparação	Associação gpl20%	Digestão de Tripsina	Ftermeabrlizaçao Triton X-100
PC/PS (7:3)	Diálise glucosido octil	8	-	++
PE/GS	Diálise glucosido	11		++
(8:2)	octil
PE/GS/CHOL	congelação-descon-	56	ND	ND
(8:2:1)	gelação-filtração

> ____

- = não houve perda do gpl20 dos lipossomas ++ = gpl20 removido dos lipossomas com 0.1% Triton

ND = não determinado

Exemplo 4: Associação de Soro 1 de Malária com

Lipossomas

A associação da proteína de soro 1 de malária com lipossomas PC/PS (7:3) foi de 67% com lipossomas diali-zados e 95% com lipossomas FTP. Soro 1 adicionado aos lipossomas pré-formados associou 75% com vesiculas FTF. Associação de soro 1 com lipossomas PE/GS/CHOL (8:2:2) foi de 65% com lipossomas ι dializados e 87% com lipossomas dializados pré-formados. Soro 1

associou-se a	91% com lipossomas dializados	pré-formados. A
proteina não	ligada foi separada	dos	lipossomas	por
centrifugação.	A associação do antigênio	foi	determinada	por

teste de proteina dos depósitos de lipossomas.

Exemplo 5: Associação Física da Gripe HA Taiwan com lipossomas.

HA Taiwan associou 69% com lipossomas dializados DPPC/DMPG (8:2). HA Taiwan associou 78% com lipossomas dializados

PE/GS/CHOL (8:2:2) e 80% com vesículas pré-formadas. A associação foi medida com foi descrito para o soro 1.

Exemplo 6: Associação Fisica do Péptido HSV gB2 com lipossomas péptido HSV gB2 associou-se a 40% com lipossomas FTF PC/PS (7:3), determinado como descrito para soro 1.

Exemplo 7: Associação Fisica do gB2 com lipossomas

HSB gB2 associou-se 24% com lipossomas PE/GS/CHOL (8:2:2), preparados por diálise. A associação do gB2 é 84% quando os lipossomas são preparados por FTF. A associação de protéinas foi determinada pela remoção do gB2 não ligado por centrifugação e medição do gB2 associado ao depósito dos lipossomas pela captura ELISA.

Exemplo 8: Estudos in vitro da Apreensão do Antigênio e Localização Celular

Foram realizados estudos para determinar o destino intracelular do antigênio usando as composições da invenção.

Experiências iniciais para demonstrar que a apreensão dos lipossomas, carregados de FITC-dextran pela murina e macrófagos humanos, têm sido consequentemente bem sucedidas. Os lipossomas preparados por evaporação de fase inversa e por extrusão de alta pressão são conseguidos de uma forma igualmente boa. As composições de lipidos não fusogénicos usadas foram PC/PS, a uma razão molar de 7:3 e PC/fosfatidilglicerol a 9:1. As composições de lipidos fusogénicos foram quer PE/CHOL/OA a 4:4:2 ou PE/OA a 8:2. Para formar os lipossomas fusogénicos, a fase aquosa encontra-se, inicialmente, a um pH de 10. Durante a troca do volume externo pela filtraçao gel a um pH de 7,4, os lipossomas são estáveis durante, pelo menos, dois dias, com base no contraste de fase e microscopia de epifluorescência.

Uma emissão de dezoito horas dos lipossomas não fusogénicos com macrófagos produz fluorescência pontual brilhante no interior das células. Experiências de perseguição da emissão (pulse chase) demonstraram que os lipossomas estão inicialmente presentes na periferia do citosol, depois deslocamse para a região perinuclear. Isto é compativel com a apreensão endossómica seguida pelo transporte intracelular para os lisossomas. A incorporação do MTP-PE na bicamada no lipidosMTPPE, numa razão molar de 250:1, não tem consequências na cinética dos dados.

Experiências semelhantes feitas com lipossomas fusogénicos tiveram como resultado uma combinação de fluorescência pontual brilhante e fluorescência difusa baça.

Experiências de perseguição da emissão não eliminaram completamente a fluorescência pontual, sugerindo que a fusão endossómica é menos de 100% eficiente. Experiências de titulação dos lipossomas mostraram ainda que a fusão pode ser dominada :

° maior que 100 gg de fosfolipido/10 células/ fluorescência pontual fortemente carregada fluorescência difusa, enquanto que menos de 4 2 fosfolipido/10 células/ cm produzem predominantemente difusa. Incorporação de

cm	produzem
com	alguma
10	gg de
fluorescência
MTP-	-PE em
i:l,	e 250:1
: difusa quer

pontual extremamente ténues, com o efeito mais marcado abaixo de 1000:1. FITC-dextran livre não foi endocitosado nestas condições, sugerindo fortemente que a interrupção da endocitose não é um efeito de superfície, mas um resultado da entrada do MTP-PE no citosol. Experiências preliminares com lipossomas carregados com FITC-gD2 indicaram que o gD2 é rapidamente libertado para os macrófagos por este método.

Exemplo 9; Levantamento de Macrófagos

Foi comparada o levantmamento dos lipossomas carregados de FITC-dextran pelas células U937, uma linha celular semelhante a monócitos humanos da American Type Culture Collection, com as nossas experiências prévias de apreensão com culturas de macrófagos primários. Células U937 não diferenciadas não fagocitaram nem os lipossomas nem FITC-dextran livres. Se as células forem diferenciadas com forbol-miristico-acetato e incubadas 18 horas com lipossomas não fusogénicos PC/PG (8:2), adquirem fluorescência pontual indicando apreensão do dextran para os endossomas ou lisossomas. Incubação com lipossomas fusogénicos PE/GS (8:2) produzem fluorescência difusa uniforme indicando a libertação do dextran para o citoplasma celular. Incorporação do MTP-PE nos lipossomas não afectou a fagocitose. Enquanto estes resultados são semelhantes aos observados em verdadeiros macrófagos, uma grande diferença entre estes dois tipos de células encontra-se na razão da apreensão: as células U937 diferenciadas exigem cerca de 10 vezes mais lipidos como macrófagos para adquirir quantidades visiveis de fluorescência. Para os macrófagos, a fagocitose é ela própria um sinal de

activação. As células U937 podem não ser activadas pela fagocitose.

As células U937 amadurecidas com 25 ng/ml de PMA durante 5 dias foram incubadas durante a noite com gD2 solúvel, lipossomas PC não fusogénicos com gD2, e lipossomas fusogénicos PE com gD2. A presença de gD2 intracelular foi avaliada pela imunof luorescência de FITC-cabra-α Ab rato ligado a gD Mab a-rato.

Verificamos que o gD2 solúvel teve como resultado niveis de fluorescência mais baixos que qualquer das preparações de lipossomas, e que os lipossomas PE produziam niveis de fluorescência mais elevados que os lipossomas PC. Em geral, o mesmo padrão de apreensão foi observado, quer as células fossem incubadas na presença ou na ausência de 10% de soro, sendo a fluorescência algo maior na presença do soro. As células incubadas com gD2 solúvel tiveram baixos niveis de fluorescência difusa. As células incubadas com qualquer das preparações de lipossomas tiveram fluorescência predominantemente difusa com ocasional fluorescência pontual. Estes resultados contrastam com as experiências anteriores com lipossomas carregados de dextranFITC, em que a fluorescência difusa estava associada com os lipossomas fusogénicos e a fluorescência pontual era observada nos lipossomas não fusogénicos. Uma vez que o gD2 é uma proteina fusogénica não sensivel ao pH, poderia induzir fusão de ambos os tipos de lipossomas com as células, o que produziria fluorescência difusa.

As experiências acima descritas sugerem que o gD2 pode alterar a localização intracelular do conteúdo do lipossoma. Para testar isto, as células U937 foram incubadas durante a noite com lipossomas preparados quer com gD2 e FITC-dextran quer com gD2 e RT6. A microscopia de epifluorescência mostrou que os lipossomas PC/PS produzem um padrão de fluorescência pontual para FITCdextran e RT6. No caso dos lipossomas PE/GS, foi observada fluorescência difusa para FITC-dextran e RT6. Nestas condições, o gD2 não é capaz de alterar a localização do conteúdo do lipossoma.

Exemplo 10: Imunogenicidade das Combinações do

Lipossoma/Emulsão com gD2 em cabras

Estes dados mostram que para uma dada emulsão, são obtidos titulos elevados de anticorpos se o antigénio estiver combinado com os lipossomas antes da mistura com a emulsão. Os titulos de anticorpos, extraídos quer por lipossomas fusogénicos quer não fusogénicos, são aproximadamente equivalentes quando misturados com as emulsões.

Nesta experiência, uma composição consistindo numa emulsão óleo-em-água contendo MTP-PE, designada MF79/1501 (10% de esqualeno (v/v); 1% TweenZ 80(v/v); 5% Tetroniò-^ 1501 (um polímero bloqueador polioxietileno-polioxipropileno) (v/v); 400μ9^1 MTP-PE), combinado com o antigénio gD2, foi testada para imunogenicidade. Esta composição foi depois comparada com a combinação de MF79/1501 mais lipossomas fusogénicos. A mistura lipossoma-gD2 foi usada três vezes com três semanas de intervalo para imunizar animais. Como se observa na Tabela 3, esta imunização combinada de emulsão-lipossoma deu altas respostas de anticorpos. Após duas imunizações, o grupo lipossoma mais emulsão mostrou um titulo médio de 7258, aproximadamente três vezes mais alto que a emulsão M79/1501 sózinha. Esta resposta foi muito coerente dentro do grupo com um desvio padrão de apenas a terceira imunização, todos os animais do grupo aumentos moderados no titulo com excepção de um lipossomas combinados com emulsões oferecem significativos na resposta imune.

10%. Após mostraram

Assim, aumentos

TABELA 3

Estudo do Adjuvante gD2 em Cabras

Média £ Título R TSA para as Sangrias

N9. do animal	Adjuvante	Pré-Sangria	1/2-	'2/2	3/2*'
5026	2x MF59	(<5)	37	448	800
5035 6156	(ccntroln	(<5) (<5) (<5)	385 40	802 191	741 450
6511	interno)*	<5	887	617
6629	(<5) <<5)	144	941	576
	53+39	564+170	624+63
5031	MF79/1501	(<5)	3,277	4,456	8,766
6153		(<5)	. 125	870	5,189
6165		(<5)	96	1,173	1,204
6517		(<5)	784	3,830	10,706
6626		ISii (<5)	40	4,009	4,113
	.262+209	2,338+810	4,747+1,823
5033	MF79/1501	(<5)	598	7,381	10,633
6155 6510	+ Lipossomas	(<5) (<5)	869 846	5,878 10,517	8,683 14,995
6519		(<5)	279	6,354	13,079
6628			235	6,945	1,845
		492+136	7,258+729	8,039+3,041

a - Média geométrica + desvio padrão b - Identificação da sangria: Número de imunizações/semana após imunização.

* - 2x MF59 =10% esqualeno (v/v); 0,4% Tween 80 (v/v); 1,6% Span (v/v); 400 pg/ml MTP-PE

Exemplo 11: Efeitos das Combinações Emulsão/lipossoma com gD2 nos Títulos de Anticorpos em cabras

Nesta experiência, cabras foram imunizadas com gD2 (25 gg) combinado com várias emulsões, combinações lipossoma/emulsão, e lipossomas sózinhos. As combinações lipossoma/emulsão testadas foram lipossomas PE/GS mais 2xMF59, lipossomas PE/GS mais MF79/5% Tetroni<£^1501, e lipossomas PC/PS mais MF79/5% Tetroni ©1501 . Os controlos nesta experiência incluíram alume, e 2x MF59. Todas as doses MTP-PE foram de 100gg. Com as combinações emulsão/lipossoma, aproximadamente 50% do antigénio foi apanhado pelo lipossoma e 50% estava livre na solução. Todo o MTP-PE estava na fase da emulsão nas combinações lipossoma/emulsão. No grupo de apenas lipossomas , o MTP-PE foi adicionado exogenamente aos lipossomas. Os animais foram imunizados três vezes com três semanas de intervalo e os titulos de anticorpo anti-gD2 foram determinados 14 dias depois de cada imunização (a Tabela 4 mostra os resultados).

As combinações de MF79/5% 1501 e de lipossomas (fusogénicos LUV) PE/GS deram titulos de anti-gD2 bastante mais altos que os das emulsões MF59 separadas. Os presentes resultados demonstraram que as combinações de lipossomas PE/GS com 2x MF59 não resultam tão bem como os liposomas PE/GS combinados com MF79/5% 1501. Os lipossomas PE/GS melhoram os resultados do 2xMF59. Os lipossomas PE/GS sózinhos dão respostas de anticorpo anti-gD2 muito baixas. Combinação de lipossomas PC/PS com MF79/5% 1501 actuam de modo equivalente aos lipossomas PE/GS combinados com MF79/5% 1501 (a média dos titulos após três imunizações é de 6946 vs. 4653).

TABELA 4

Estudo do Adjuvante gD2 em Cabras

	Média Título ELISA para as Sangrias
Adjuvante Pré-Sangria	1/2	2/2	3/2
2x MP59	<5	<5	144+85	837+169
2x #F59 + Líprésomas( pe/gs)	<5	<5	344+187	1440+842
MF79/1501	<5	<5	1000+328	4653+616
+Lipossomas(pe/gs)
Alujna	<5	<5	39+24	<5
MF7.9/1501 + Lipossomas(pc/ps)	<5	58+61	1980+416	6946+1503
Lipossomas, <pe/gs>	<5	<5	6+1	6+1

+ μϊρ exógeno

Exemplo 12: Efeitos da Associação de gD2 com Lipossomas na Imunogenicidade das Combinações Lipossoma/Emulsao em Cabras

Nesta experiência, cabras foram imunizadas três vezes com 25 gg de gD2 e 100 gg de MTP-PE, com intervalos de quatro semanas com um dos seguintes adjuvantes:

1, MF79/121 (10% esqualeno, 1% Tween 80, 5% Plurónico

L121, 400 gg/ml MTP-PE); 2, MF79/121 combinado com LPC (lipossomas dializados PC/PS (7:3)), de modo a que 50% de gD2 foi associado com os lipossomas, e 50% de gD2 ficou livre na fase aquosa da formulação; 3, MF79/121 combinado com o LPC, de modo que 100% de gD2 ficou associado com os lipossomas. Como mostra a figura 1, um aumento nos titulos do anticorpo está correlacionado com a crescente associação dos antigénios com os lipossomas. As médias geométricas dos titulos do anticorpo para os grupos de 5 animais são dadas na Tabela 5. Titulos Ab aumentados persistiram, pelo menos durante seis semanas, após uma quarta imunização.

TABELA 5

Estudo do Adjuvante gD2 em Cabras

Número AdjuvaT- Sangria Sangria Sangria Sangria de arrimnrifi te Sjngtaa 2/135 3/145 3/90 _4/7__4/21 4/42

5	MF79/L121	<5	888+179	2,582+948	60+28	3,782+917	2,267+692	492+196
5	MF79/L121 +	<5,	1,418+391	6,884+1,274	115+51	6,229+1,544	7,987+1,250	1,241+345
5	MF79/L121 + Upossanas B (1Ó0*)	<5	784+628	13,449+1,908
5	MF.79/L121 + „ upossanas B (50/50* + MTP,	<5	945+609	4,563+2,563	·	•
5	Lipossomas C (50/50* + MTP)	6+1	<5	9+2	19+5	<5	6+1	12+5
5	UF.79/1501 + . upossanas A (50/50*)	<5	2,068+268	7,864+1,253

a - Média geométrica ± desvio padrão b - imunizações no/dias após imunização; MTP-PE a 100 gg/dose.

* - antigénio gD2 a 25 gg/dose.

taxa de incorporação de gD2 e/ou MTP nos lipossomas

Exemplo 13: Efeitos da Associação de gB2 com Lipossomas na Imunogenicidade das Combinações Lipossoma/Emulsão em Cabras

Nesta experiência, cabras foram imunizadas três vezes com intervalos de quatro semanas com 5, 25, ou 100 gg de gB2 e 100 gg de MTP-PE com um dos seguintes adjuvantes: 1, MF79/121, como foi definido no Exemplo 12; 2, MF79/121 combinado com LPE (lipossomas FTF PE/GS/CHOC (8:2:2)), de modo que 50% de gB2 ficou associado aos lipossomas e 50% ficou livre na solução; 3, MF79/L121 combinado com o LPE de modo que 100% de gB2 ficou associado com os lipossomas. A Figura 2 mostra os efeitos da associação do antigénio com os lipossomas para os grupos da dose de 25 gd de gB2. Mais uma vez, a imunogenicidade aumenta com o aumento da associação dos antigénios com os lipossomas. A média geométrica dos titulos do anticorpo ± desvio padrão, para cada grupo de animais, é dada na Tabela 6.

TABELA 6

Grupo	Associação *,b	Núnsro Ard/fes	Adjuvante8	Média Pré-sangria	Sangria Mààa4	saA2/1<
1	—	5	MF79/L121-MTP (5/íg gB2)	<5	1,678+473	29,656+3,218	33,325+3,100
2	0	5	MF79/L121-MTP (25/ig gB2)	<5	434+129	18,609+3,962	44,846+5,203
3		5	MF79/L121-MTP (100/ig gB2)	<5	412+131	35,161+4,959	42,228+7,585
4		5	MF79/L121-MTP + Lipossomas a > (5/ig gB2)	<5	1,666+413	17,565±3,610	36,700+6,230
5	100	5	MF79/LI21-MTP + Lipossoma(A) (25/ig gB2)	<5 5	,096+1,716	47,285+10,173	73,109+13,199
6		5	MK7.9/L121-MTP + Lipossomas A) (100/ig gB2)	<5	1,289+422	38,544+6,263	59,493+13,706
7	50/50	5	MF7.9/L121-MTP +UpossomaqB) (25/ig gB2)	<5	1,733+844	32,835+12,628	39,746+14,871
8	—	5	Lipossomas (Cjmtp MF79/L121-MTP	* <5	152+85	12,022+3,825	25,163+3,044

(25/ig gB2)

* = primeiro contacto com lipossomas segundo e terceiro com MF79/L121 a Todas as doses de MTP-PE sâo de 100 gg/dose b Associação Ag é mostrada apenas para a composição que aparece na figura 2:

= gB2 livre na fase aquosa;

100 = gB2 todo associado com lipossomas; e

50/50= gB2 associado 50% com lipossomas e 50% livre na fase aquosa.

Exemplo_14: Imunogenicidade da_Combinação

Lipossoma/Emulsão Usando gp!20 em Macacos Rhesus

Nesta experiência, grupos de 3 macacos rhesus foram imunizados 3 vezes com intervalos de 4 semanas, e uma vez 14 semanas após a terceira imunização. Os animais foram sangrados cada duas semanas ao longo da experiência. Um grupo recebeu MF79/1501 (10% esqualeno, 1% Tween 80, 5% Tetronic 1501, 400 gg/ml MTP-PE) combinado com lipossomas LPE FTF contendo gpl20/SF2. Os outros dois grupos receberam quer 2xMF59 (10% esqualeno, 1% Tween 80, 1% Span 85, 400 gg/ml MTP-PE) quer emulsão SAF (10% esqualeno, 5% Pluronic L121, 0,4% Tween 80, 500 gg/ml MDP). A Figura 3 mostra que MF79/1501 e lipossomas produzem consequentemente titulos mais elevados que as outras duas formulações de emulsões. A Tabela 7 mostra a listagem dos titulos dos animais individuais e os titulos médios para cada grupo ao longo da experiência.

de Anticorpos individuais, Títulos de is Médins + Desvio Padrão

TABELA 7

	Sum	ári	.o dos Títulos
			Anticorpc
imunização	lempo	uangria
			(Semana)	#
1		1	0	.0
2			2	.01
3		2	4	.02
4			6	.03
5		3	8	.04
6			10	.05
7			12	.06
8		4	22	.07
9			24	.08
10			26	.09
	8432		8433	qr2 X
1	1		1	1
2	89		1	60
3	70		50	56
4	10200		3900	5798
5	4300		1200	2021
6	14162		14713	11874
7	3880		4263	3164
8	338		411	270
9	8808		6646	6811
10	4683		2503	2747
			Exemplo 15:

8428	8429	8430	qrl X
1	1	1	1
50	50	1	14
70	50	50	56
4300	5100	5600	4971
1500	1400	1800	1558
5218	4841	2925	4196
1442	1	649	714
117	75	109	100
5574	6808	4093	5375
3335	3405	3368	3369
qp2.0 +SE	8434	8435	8436
0	1	1	1
11	50	50	82
6	50	50	105
1681	6200	3700	6900
781	2700	1100	2300
2843	5471	8869	14790
800	1569	2156	3014
88	165	119	221
967	4372	3386	6459
783	2471	1475	4886
Efeitos	da Associação	mtp-p;

3^2.0	+SE	8431
	0	1
	17	1
	6	50
	384	4900
	117	1600
	762	6746
	365	1915
	14	142
	796	5397
	20	1768
gp?.,-	X	qp3.	0 ±SE
	1		0
	59		9
	64		15
	5409		1041
	1897		525
	4712		1956
	2168		408
	263		29
	4573		859
	2611		906
com	Lipossomas

ou Emulsão na Imunogenicidade das Formulações Combinadas de qD2 nos Coelhos.

Os coelhos foram imunizados três vezes com quatro semanas de intervalo com 10 pg de gD2 e 100 pg de MTP-PE. Os resultados desta experiência, até duas semanas após a segunda imunização, são aqui incluídos na Figura 4 e Tabela 8, A comparação dos grupos 2 e 3 da Tabela 8, mostra que mais uma vez a imunogenicidade foi aumentada pela combinação da emulsão MF59 (5% esqualeno, 0.5% Tween 80, 0.5% Span 85, 400 pg/ml MTP-PE) com gD2 preparado com LPE. A inclusão do MTP-PE na emulsão, grupo 3, ou dos lipossomas, grupo 4, não provocou alterações significativas na imunogenecidade. 0 grupo 6 foi imunizado uma vez com LPE e depois reforçado duas vezes com MF59. No grupo 7, a ordem foi invertida, os animais primeiro receberam uma injecção de MF59 seguida de duas imunizações com LPE. Iniciar com a emulsão e reforçar com os lipossomas é, nitidamente, mais imunogénico do que o contrário. A experiência com gD2 em cabras, anteriormente citada (exemplo 13, tabela 6, grupo 8) confirma respostas pobres quando os animais eram iniciados com liposomas e reforçados com emulsão.

TABELA 8

Associação do gD2-MTP-PE no Coelho

Grupo	Sangria 1/2	Sangria 2/2
1- LPE com MTP-PE	468+191	12254+3517
2- MF59	14418+2698	200764+32488
3- MF59/LPE	20859+4508	307828+75470
4- MF58/LPE com MTP-PE	15241+1203	202640+58941
5- MF58/LPE	6330+903	68069+8127
6- IX LPE com MTP-PE 2X com MF59	1140+160	72001+3741
7- IX MF59 2X LPE com MTP-PE	11272+3117	211980+25964
- gD2 a 10 gg/dose - MTP-PE a 100 μς/άοεβ;	o grupo 5 não recebeu	MTP-PE

- 5 animais por grupo

Exemplo 16: Efeitos da Combinação Emulsão/Lipossoma na Imunogenicidade do Soro 1 da Malária em Macacos Aotus

Macacos aotus foram imunizados três vezes com quatro semanas de intervalo com 100 μg de soro 1. Oitenta e quatro dias depois da primeira imunização, os animais foram sangrados e ameaçados com a estirpe Honduras do Plasmodium falciparum. Os macacos foram subseguentemente monitorizados para a doença e para a parasitemia.

A Tabela 9 mostra os titulos de anticorpo no dia 84 e posterior protecção da doença. 0 grupo 1 recebeu apenas Adjuvante

de Freund e nenhum antigénio. 0 grupo 2 recebeu Adjuvante de Freund e Soro 1. Os grupo 3 e 4 receberam Soro 1 e quer MF59 quer MF59 com LPE, respectivamente. A formulação da combinação produz nos títulos Ab um aumento de 5 vezes comparado com a emulsão sózinha. Em ambos os grupos, um dos três animais foi protegido da doença. A figura 5 mostra os valores cumulativos correspondentes da parasitemia. 0 valor da parasitemia para a combinação do grupo 4 foi aproximadamente dez vezes mais baixa que o do grupo 3, que recebeu MF59.

TABELA 9

Títulos de ELISA da Experiência #2 Panama Soro 1

Macaco Aotus de Antisoro do Soro 1 Aotus

Rré-Sangria	Sangria Final	Média dos
		Dia da Aneaça	Títulos	Protecçâo
Grupo 1	<10	92		·- ..
COntrolOCFA/XFA	<10	88	87	0/3
	<10	81
Gruoo 2	<10	465,021		2/3
Controlo CFA/IFA	<10	909,318	719,333
Soro 1	19	783,661
Grunn 3 „ SorO 1 2	191 336	20,258 13,718 59,625	31,200	1/3
<10
Grupo 4	13	141,295
Soro 1	24	254,074	169266	1/3
LipossomqMFs?.2	<10	112,430

Grupo No : (1) controlo FCA/FIA (2) Soro 1 FCA/FIA (3) Soro 1 MF59.2 (4) Soro 1 Lipossomas Fusogénicos/MF59.2

Exemplo 17: Imunogenicidade das Combinações Emulsão/ Lipossoma num Modelo de Ameaça de Gripe no Rato

Esta experiência foi concebida para testar a eficácia das formulações de adjuvantes numa ameaça virai heteróloga. Os ratos foram imunizados duas vezes com intervalos de quatro semanas com 9 μ9 de antigénio HA e 40 gg MTP-PE. Os grupos de animais estão definidos na Tabela 10. O grupo 1 recebeu HA sem adjuvante. O grupo 2 recebeu MF59. O grupo 3 recebeu uma imunização com MF77 (10% esqualeno, 5% Pluronic L121, 1% Tween 80, 400 gg/ml MTP-PE), seguida por uma segunda imunização com MF59. O grupo 4 recebeu uma imunização com uma formulação combinada contendo MF77 sem MTP-PE e LPE com MTP-PE, seguida de uma segunda imunização com MF58 e LPE com MTP-PE. 0 grupo 5 recebeu LPE com MTP-PE. O grupo 6 não foi imunizado. Os titulos de anticorpo da Tabela 10 referem-se ao dia 55, justamente antes da ameaça virai. Os titulos mais elevados foram obtidos no grupo 4 com a formulação combinada. A figura 6 ilustra os titulos Ab relativos para todos os grupos. No dia 56, os ratos foram ameaçados intranasalmente com gripe A/Hong Kong/13/68 (H1N1). Os animais foram monitorizados diariamente para a doença, e a sobrevivência diária foi registada na Tabela 11. A percentagem de sobrevivência de 14 dias após ameaça é mostrada na tabela inferior da Figura 6. A formulação combinada teve 100% de sobrevivência, o melhor grupo seguinte foi MF77 com 90% de sobrevivência. A vacina HA sem adjuvante teve 40 % de sobrevivência comparada com uma razão de 30% para o grupo não imunizado.

TABELA 10

Rato/Gripe

Grupo

- só HA

- MF59

- lx MF77

HA A/Shangai

259 ± 60 7822 ± 514 28749 ± 3778 lx MF59

- lx MF77 w/o MTP-PE

44257 + 5234 +LPE+MTP-PE lx MF58+LPE+MTP-PE

- LPE + MTP-PE

- Não imunização

1579 + 184 < 5 n = 10 dose de MTPE-PE = 40 gg

HA = 9 gg de vacina de gripe Parke-Davis contendo 30 gg/ml de cada: A/Taiwan/1/86, A/Shangai/11/87, e B/Yamaguta/16/88

TABELA 11

Imunização Taiwan , Ameaça Hong Kong ,

Registo Diano do Numero de Animais Sobreviventes por Grupo

Grupo	Dia
0 10	1 10	2 10	3 10	4 10
1	Ha apenas
2	MF59.1	10	10	10	10	10
3	MF77.1/MF59	10	10	10	10	10
4	MF77.1 + Lips MF59 + Lips	10	10	10	10	10
5	Lipossomas	10	10	10	10	10
6	0	10	10	10	10	10

5	6	7	8	9	10	11	12	13
9	7	5	5	4	4	4	4	4
10	9	7	6	4	4	4	4	4
10	10	10	9	9	9	9	9	9
10	. 10	10	10	10	10	10	10	10
10	10	8	7	7	7	6	6	6
10	8	3	3	3	3	3	3	3

Exemplo

18:

Estabilidade das

CombinaçOes

Lipossoma/Emulsão

Para avaliar a estabilidade fisica de uma mistura de partículas da emulsão e lipossomas, foram preparados lipossomas dializados PE/GS (8:2)/MTP-PE (PL/MTP-PE, 20:1) contendo FITCdextran. O FITC-dextran externo foi removido por filtração gel e os lipossomas foram misturados com MF79/1501 (10% esqualeno/1% Tween 80/5% Tetronic 1501/400 gg/ml MTP-PE). Observações por microscopia leve indicaram que não houve agregação ou coalescência de qualquer das partículas da emulsão ou dos lipossomas. A integridade estrutural dos lipossomas foi depois confirmada por observação de esferas fluorescentes contra um fundo escuro. Não ocorreram alterações na aparência após 3 meses de armazenamento a 4°C.

Exemplo 19: Armazenamento dos lipossomas e Emulsões

Foram exploradas condições de armazenamento estáveis e formas de armazenamento, de modo a que os lipossomas contendo os antigénios (encapsulados ou incorporados por adsorção de superficie ou integração na bicamada) e as emulsões, como uma combinação, sejam entidades farmaceuticamente viáveis. Três formas de dosagem diferentes foram concebidas para aumentar a estabilidade dos adjuvantes e antigénios: 1) Armazenamento a 28°C de combinações suspensão-emulsão de lipossomas liquidas em dois recipientes ou num único recipiente. 2) Armazenamento a 510°C de combinações de lipossomas-emulsâo congeladas em dois recipientes separados ou num único recipiente. 3) Armazenamento a

2-8°C ou a temperatura ambiente de lipossomas-emulsões liofilizados, em dois recipientes separados ou num único recipiente.

Foi escolhido um pH ligeiramente ácido (>5,0=<7,0 preferencialmente 6,5) para estas formulações, para melhorar a estabilidade dos componentes dos lipidos e os antigénios das proteínas. Foram seleccionados crioprotectores (para as liofilizações e congelamentos) da seguinte lista de açúcares ou compostos polihidroxílicos e aminoácidos: dextrose, manitol, sorbitol, lactose, sucrose, trehalose, glicerol, dextran, maltose, maltodextrinas, glicina, alanina, prolina, arginina, e lisina. Nalgumas formulações, foi usada uma combinação de açúcares e aminoácidos e.g. sucrose-manitol (sucrose 5-8% p/v, manitol 2,5-1% p/v), sucrose-glicina (sucrose 8% w/v, glicina 60mm). Estes excipientes serviram também como tonificantes, i.e., fornecem osmolalidade fisiológica. Os tampões foram seleccionados a partir de um grupo composto por fosfato (5-50mM) citrato; solução salina tamponada com fosfato (PBS); acetato; maleato; ascorbato; trometamina; e tampões semelhantes.

No caso dos lipossomas, os crioprotectores e tampões são incluídos em a) quer no interior quer no exterior aquoso ou b) adicionados apenas externamente. No último caso, qualquer tampão ou sal (e.g., NaCl) fornece o equilibrio osmótico para o interior, e o sal exterior é removido por centrifugações repetidas e lavagem. Os lipossomas são depois suspendidos na mistura excipiente desta invenção. As emulsões são tipicamente preparadas em água e suspendidas no meio acima referido. Em adição às combinações açúcar/aminoácido/tampão, são também adicionados, a algumas formulações, aumentadores da viscosidade. Pensa-se geralmente que estas substâncias poliméricas envolvem as partículas e evitam o contacto, o que, de outro modo resultaria em agregação, fusão ou coalescência. Os polímeros usados incluem polietileno glicol 300, 400, 1450, e 3150; polivinil pirrolidona; sulfato dextran; carboximetil celulose; hidroxietilcelulose e ácido alginico. E preferível o polietileno glicol 1450 e incluido numa concentração de 1% (p/v) na formulação (para uma lista de ingredientes tipicos ver Tabela 12).

Os lipossomas, em adição aos excipientes acima listados, também contêm 1 mole porcento da vitamina E ou dl atocoferol como um antioxidante. Isto protege as porções dos ácidos gordos não saturadas nos surfactantes da oxidação, o que, por sua vez, podia catalizar a degradação do antigénio. Os lipossomas assim formulados são misturados com emulsões em diferentes razões, e.g., 1:10 a 10:1 (v/v) como foi referido anteriormente, embora seja preferivel 1:1 (v/v). Esta mistura contém quantidades adequadas dos antigénios e do imunoestimulador numa dose terapêutica.

Um grande número de outras técnicas pode ser usado para preparar as composições desejadas. Por exemplo, Gauthier e Levinson (EPO211257) congelaram a seco uma emulsão de fosfolipidos num processo de duas etapas: o primeiro passo consistiu em congelar por vaporização, i.e., vaporizar uma emulsão pré-formada sobre um clorofluorocarboneto ou solvente compatível semelhante, a < -20°C, e recolher as partículas congeladas (que já continham os crioprotectores) e, numa segunda etapa, liofilizaçâo das partículas. O pó ou massa resultante, que geralmente continha açúcares com um enorme excesso, foi rehidratado para produzir emulsões óleo-em-água com partículas de dimensões na ordem de 0,48-0,7 micron. Este método é algo complicado, fornece grandes gotas na emulsão que podem não ser úteis para certas aplicações terapêuticas, em que, por exemplo, se espera que as partículas residam no local da injecção e sejam lentamente arrastadas para os vasos linfáticos ou locais anatómicos adequados. Assim, um aspecto da presente invenção é gerar pequenos e submicrónicos lipossomas (< 0,4μ) e partículas de emulsão num meio adequado, fornecendo vantagens de armazenamento de modo que o tamanho possa ser mantido sem posterior aumento. Outro aspecto da invenção é preparar combinações lipossoma/emulsão liofilizadas que são facilmente reconstituiveis em partículas com um diâmetro médio de < 0,4μ, adequadas para as aplicações pretendidas como vacinas.

Ilustram-se, em seguida, através de exemplos, as diferentes formas de dosagem de combinações de emulsão/lipossomas transportadores de antigênio, úteis como vacinas que fornecem imunogenicidade mais elevada nos animais, como foi demonstrado acima.

1- Combinação Liquida de Emulsão/Lipossoma Portador de

Antigênio

Os lipossomas foram preparados em sucrose-citrato (10% p/v, lOmM), ou qualquer outra combinação de excipíentes referidos nesta secção, com o antigênio. Qualquer protéina não ligada é removida através de uma técnica adequada, como diálise, diafiltraçâo ou centrifugação (preferencialmente centrifugação). Os lipossomas são suspendidos no meio contendo os mesmos excipíentes que o interior dos lipossomas, excepto o antigênio. Num outro conjunto de lipossomas (apesar de não preferível), as vesículas foram preparadas numa solução salina (0,9% p/v) ou PBS, juntamente com os antigénios e, após lavagem para remover a protéina não ligada, os lipossomas foram suspendidos no crioprotector/aumentador de viscosidade e tampão, e.g., sucrose, PGE 1450, ou citrato. As emulsões, que são tipicamente processadas por homogenização em água, foram ajustadas à osmolalidade fisiológica com as combinações de excipiente para condizerem com os lipossomas. Volumes iguais das vesículas e emulsões são combinados e armazenados num frigorifico a 2-8°C. Análises do tempo indicaram que não houve perda do conteúdo lipossomal e retenção do tamanho por ambas as partículas (lipossomas e emulsões).

2- Combinação congelada de lipossoma portador de antigénio /emulsão

Os lipossomas (fusogénicos ou outros) são preparados em sucrose (8% p/v)/manitol (1% p/v), fosfato 10 mM/PEG 1450 (1% p/v) contendo o antigénio proteico e expelido através de um filtro policarbonato para reduzir o tamanho médio das partículas para 0,1 - 0,4 μ. 0 excesso do antigénio é removido por centrifugação, e as vesículas do depósito ressuspendidas na mesma mistura do tampão excipiente. Os lipossomas são depois combinados com as emulsões microfluidizadas (<0,4 μ) e congelados num frigorifico a temperaturas < - 10°C. Após o armazenamento durante a noite, é permitido à formulação descongelar lentamente à temperatura ambiente. Alternativamente, lipossomas e emulsões são congelados separadamente, descongelados, e misturados ou os lipossomas, a 2-8°C, são misturados com emulsões tratadas por congelamento/descongelamento e combinados antes da administração aos animais. Qualquer destes materiais particulados retêm a sua integridade fisíca durante o ciclo congelamento/descongelamento. Espera-se assim que forneçam conveniente armazenamento para administração humana sendo armazenados em recipientes únicos ou em dois recipientes. Pensa-se que certos sacáridos (e.g., manitol, lactose), incluídos como únicos crioprotectores, não ajudam a preservar a estrutura fisica dos lipossomas e emulsões. Contudo, crioprotectores como glicerol (2-20% p/v, preferencialmente 2%), prolina (0,3 Μ), arginina (0,3 Μ) , sucrose-manitol (sucrose 8% p/v, manitol 1% p/v), sucrose-gli ou arginina (sucrose 8% p/v, glicina ou arginina 60 mM), misturas de aminoácidos (prolina, glicina, alanina; lOOmM de cada) fornecem todas crioprotecção adequada durante o processo de congelamento/descongelamento, sugerindo a aplicação possivel em formulações de vacinas. Lipossomas contendo antigénios e excipientes como PBS, salino ou fosfato no interior e crioprotector/tampão/ (aumentador de viscosidade), na fase exterior, podem também ser misturados com a emulsão na mesma combinação crioprotectora para a aplicação pretendida.

3- Combinações Liofilizadas de Lipossomas Portadores de Antigénio/Emulsão

Como forma de armazenamento estável, esta combinação é altamente preferível porque o volume de água que pode causar instabilidade química aos lípidos e proteínas é eliminado. Em adição, os carbohidratos e aminoácidos normalmente usados como crioprotectores são um bom meio de suporte para o crescimento microbiano. Ilustramos em seguida a concepção usada nas liofilizações para produzir as formulações de vacinas secas.

Lipossomas portadores de antigénios suspendidos num crioprotector/tampão/(aumentador de viscosidade) adequado, como os listados na Tabela 12, são combinados com emulsões microfluidizadas no mesmo meio e congelados a seco a temperaturas abaixo da temperatura de destruição da massa para essa combinação do excipiente durante 24-72 horas (preferencialmente 24 horas). Numa concretização, por exemplo, contendo sucrose 10% p/v, citrato lOmM, a secagem inicial é iniciada a -40°C e a temperatura atinge gradualmente os -10°C em bom vácuo (10 - 100 microns, preferencialmente 50 microns). Após a conclusão do processo de secagem primário, o patamar da temperatura é gradualmente aumentado até à temperatura ambiente (10 - 20°C por hora), e mantido a esta temperatura e no vácuo por um periodo adicional de 2 - 10 horas (preferencialmente 4 horas) ou até o nivel da mistura no produto em secagem ser reduzido 1 3 %. Outra variante desta fórmula consiste em secar separadamente os lipossomas e emulsões e misturar as suspensões reconstituídas para fornecer a formulação desejada. Em qualquer dos casos, a massa liofilizada tem um aspecto fisico aceitável e facilmente se reconstitui para fornecer formulações de vacinas injectáveis.

As formulações liofilizadas em um ou dois recipientes, pelo facto de terem um baixo conteúdo em água, têm estabilidades aceitáveis para os componentes lipidicos e os antigénios proteicos. As formulações podem ser armazenadas a 2-8°C ou à temperatura ambiente.

TABELA 12

Combinações de Crioprotectores e Aumentadores de Viscosidade usados nas Formulações ⁺

Sucrose* (10% p/v)

Sucrose (8% p/v), manitol (1% p/v)

Dextrose (5% p/v)

Sucrose (9% p/v), PEG 400, 1450 ou 3350 (1% p/v)

Sucrose (9% p/v), gelatina hidrolizada (1% p/v)

Sucrose (9% p/v), gelatina (pele de peixe, bovina ou porcina 1% p/v)

Sucrose (9% p/v), Povidona 10000 ou 40000 (1% p/v)

Glicina, alanina ou prolina (0,3M pH 6-6,5)

Sucrose (9% p/v) carboximetil celulose (1% p/v) glicerol (2-20% p/v) + Em adição, é usado tampão fosfato ou citrato numa concentração lOmM para fornecer estabilidade aos antigénios.

* Outros açúcares como a lactose, a trehalose, a maltose, etc., sao substituidos em quantidades de peso apropriadas para fornecer osmolalidade fisiológica equivalente.

Todas as publicações e Pedidos de patentes citados nesta Descrição são aqui incorporadas para referência como se cada publicação ou Pedido de Patente fosse aqui especifica e individualmente indicado para ser incorporado como referência no local onde foi indicado.

Apesar de a invenção ter sido descrita com algum detalhe como ilustração e exemplificação para fins de clareza de facilitar a compreensão, tornar-se-á facilmente evidente para os especialistas na área, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espirito ou alcance das reivindicações anexas.

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um processo de preparação de uma composição de vacina, caracterizado pelo facto de compreender as fases de:

   combinar ou formar, sob condições de esterilização, uma composição contendo:

   (1) uma quantidade imuno-estimulante de uma substância antigénica contida no interior, ou localizada na superfície dos lipossomas, e (2) uma emulsão de óleo-em-água compreendendo um péptido de muramilo e um óleo metabolizável, numa fase aquosa continua rodeando os ditos lipossomas.
2. 2- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida substância antigénica estar também presente na referida fase continua.
3. 3- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os referidos lipossomas compreenderem lipossomas fusogénicos.
4. 4- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os referidos lipossomas e da referida emulsão estarem presentes numa taxa de volume de cerca de 1:10 até 10:1.
5. 5- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os referidos lipossomas e da referida emulsão estarem presentes como particulas ocupando substancialmente a mesma gama de distribuição de tamanho.
6. 6- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de as referidas partículas terem todas, substancialmente, menos que 1 micron em diâmetro.
7. 7- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido de muramilo ser um composto da fórmula:

   em que R é H OU COCH3;

   12 3

   R , R e R representam, independentemente, H ou uma porção lipidica;

   R é hidrogénio ou alquilo;

   X e Z representam, independentemente, uma porção aminoacilica seleccionada do grupo consistindo em alanilo, valilo, leucilo, isoleucilo, α-aminobutirilo, treonilo, metionilo, cisteinilo, glutamilo, isoglutamilo, glutaminilo, isoglitaminilo, aspartilo, fenilalanilo, tirosilo, triptofanilo, lisilo, ornitinilo, arginilo, histidilo, asparinginilo, prolilo, hidroxipropilo, serilo e glicilo;

   n é 0 ou 1;

   5 5

   Y é -NHCHR CH2CH2CO-, em que R representa um grupo carboxilo opcionalmente esterificado ou amidado; e g n G 7

   L é OH, NR R , em que R e R representam, independentemente, H ou um grupo alquilo inferior, ou uma porção lipidica.
8. 8- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido péptido de muramilo ser, quer um dipéptido de muramilo ou um tripéptido de muramilo.
9. 9- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido péptido de muramilo ser seleccionado do grupo consistindo em dipéptidos e tripéptidos de muramilo ligados a uma porção fosfolipidica, através de uma porção hidroxialquilaminica.
10. 10- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido péptido de muramilo ser Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)etilamida.
11. 11- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido óleo ser um óleo animal.
12. 12- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido óleo ser o esqualeno.
13. 13- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida composição compreender, ainda, um agente emulsificante adicional.
14. 14- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a referida composição compreender mais do que 15% em volume do referido óleo.
15. 15- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido agente emulsificante adicional ser seleccionado do grupo consistindo em ésteres de sorbitano, mono, di, ou triésteres de polioxietileno de sorbitano, ácidos gordos de polioxietileno, éteres de ácidos gordos de polioxietileno, e combinações dos mesmos.
16. 16- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o referido agente emulsificante adicional ser escolhido do grupo do monooleato de polioxietileno de sorbitano 20, trioleato de sorbitano Span 85, e combinações dos mesmos.
17. 17- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto da referida composição compreender mais do que até 2,5% em peso do referido agente emulsificante adicional.
18. 18- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida substância antigénica ser uma partícula ou sub-unidade virai.
19. 19- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida substância antigénica ser um antigénio molecular virai.
20. 20- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 14, caracterizado pelo facto de a referida substância antigénica ser seleccionada do grupo das proteínas geneticamente concebidas consistindo na HSV rgD2, HIV gpl20, HIV RT6, HSV gB-2, malaria sera 1, antigénios da vacina da influenza.