KR20140126113A

KR20140126113A - Rgd 모사체 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140126113A
Application number: KR1020130044239A
Authority: KR
Inventors: 이명규; 정봉현; 아바스 목타리에 아미르
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2014-10-30
Also published as: KR101776941B1

Abstract

본 발명은 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 다중 모티프로 구성된 펩티드가 세포독성이 없으며 비대칭 리포좀(asymmetric liposome; ALP)과 결합하였을 때, 세포 내 흡수를 현저히 증가시켜 다양한 치료용 약물 전달 시스템 및 약물치료 기술에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

RGD 모사체 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptide comprising multiple motifs derived from RGD analogs and using thereof}

본 발명은 세포투과가 어려운 약물, 나노입자, 리포솜(liposome) 등에 결합하여 이들을 세포 내로 전달할 수 있으며, 또한 독성이 적은 RGD 모사체 다중 모티프(multiple motif)로 구성된 신규한 세포투과 펩티드 개발 및 이를 이용한 세포 내 생물학적 활성물질의 전달방법에 관한 것이다.

일반적으로 친수성이거나 분자량이 크고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩티드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어오더라도 세포의 용해소체 분획(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 상기 거대 분자들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다. 또한, 항암제의 경우 세포 내로 약물을 전달하기 위해선 다약제 저항성(multidrug resistance)과 같은 장애물을 극복해야만 한다. 이에 약물 분해를 막기 위해 다양한 거대 분자 및 약물이 함유된 전달체를 엔도사이토시스 과정을 통하지 않고, 직접 세포 내로 전달하는 많은 방법이 제시되었다. 이러한 방법들에는 마이크로 주입(microinjection), 전기적 자극(electroporation) 등이 있는데, 이는 세포막에 손상을 줄 가능성이 있다. 또 다른 방법들로 pH 민감성 리포좀과 세포투과성 물질을 이용하는 방법이 있다. 하지만 이러한 방법을 통하여 세포 내로 약물들을 전달했다 하더라도 약효를 발휘하기 위해서는 특정한 기관으로 이동되어야 하는 문제가 있다.

대부분 약물의 안정성 및 효율성을 높이고 부작용을 감소시키기 위하여 약물전달체를 많이 사용한다. 대표적인 예로 리포좀(liposome)과 마이셀(micelle)이 있다. 리포좀은 인공적으로 만든 인지질 전달체로 친유성 및 친수성 약물 모두 봉입할 수 있으며, 생체 적합성 물질이므로 독성이 없고 약물을 외부환경으로부터 보호한다. 하지만 흡수가 지연되고 분포의 제한을 받으며 대사율이 낮아진다. 또한, 간이나 비장의 세포에 포획되어 혈액으로부터 신속하게 제거되는 단점이 있다. 표적화를 위해 항체를 붙인 면역리포좀의 경우도 혈액 내에서 신속하게 제거되는 문제 때문에 표적에 도달되는 양이 적어질 수밖에 없다. 또 다른 전달체인 마이셀은 약물의 용해도 및 생체이용률을 높여줄 수 있는 특징이 있으나(Vladimir P. Torchilin, Annual Review of Biomedical Engineering, 8:343-375, 2006), 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용가능성에 대해서는 아직도 많은 연구가 필요하다. 이러한 한계점 때문에, 생체물질을 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있고, 세포독성이 없으며, 특히 엔도사이토시스를 통하여 들어가지 않는 새로운 재재들이 필요하다.

최근, 새로운 대안들이 제시되었는데 그 중 세포막 투과성 펩티드(cell penetrating peptide)들이 지금까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인하여, 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 이용가치를 높일 수 있어 많은 각광을 받고 있다. 세포투과 펩티드들이 단백질뿐만 아니라 여러 물질들과 화학적으로 결합하여 세포 내로 상기 물질들을 투과시킬 수 있다는 것은 이미 많이 보고되었다(Maarja and Ulo, Current Opinion in Pharmacology, 6:509-514, 2006). 이러한 세포막 투과성 펩티드에는 대표적으로 인간 면역 결핍 바이러스 전사인자인 Tat 단백질의 47번째 아미노산부터 57번째 아미노산으로 구성된 펩티드(Schwarze SR et al., Science, 285:1569-1572, 1999), 초파리의 안테나페디아(antennapedia) 단백질의 339번째 아미노산부터 355번째 아미노산으로 이루어진 펩티드(Joliot A. et al., Proc Natl Acad Sci, 88:1864-1868, 1991) 등이 알려져 있다. 이러한 펩티드에 의한 거대분자의 생체 내 운반 가능성에 대해서도 많은 연구가 되어왔다. Tat 펩티드에 의해 베타갈락토시데이즈의 생체 내 운반(Schwarze SR et al., Science, 285:1569-1572, 1999), 아르기닌 올리고머(arginine oligomer)에 의한 사이클로스포린 A(cyclosporin A)의 국소적 적용 및 그에 따른 항염증효과(Jonathan B. Rothbard. et al., Nature Medicine, 6:1253-1257, 2000), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)의 시그날 펩티드로부터 유래된 Hph-1 펩티드에 의한 CTL-4 부분의 코점막 적용에 따른 알러지 염증반응의 억제효과(JM Choi et al., Nature Medicine, 12:574-579, 2006) 등이 보고되어 있다.

RGD 펩티드는 3개의 아미노산, 즉 아르기닌-글라이신-아스파르트산염(arginine-glycine-aspartate) 모티프(motif)로 구성된 물질로써, 최초 파이브로넥틴(fibronectin)의 세포부착부위에서 발견되었다. 이들은 종양혈관의 내피세포층에 주로 발현되고 있는 알파v베타3 인테그린 수용체(integrin receptor)에 강한 친화력을 갖고 있기 때문에 약물 표적형 치료와 간단 시약과 같은 연구에 보편적인 수단으로 많이 쓰이고 있다. 또한, RGD 펩티드는 강한 친화력(affinity)와 내화성(internalization)에 의해 다가의 RGD-리간드(ligand) 제조에 용이하고, 혈액 순환에서 수용체나 효소에 의한 약물감소를 최소화하는 등의 장점이 있으나, 인테그린과의 직접적인 상호작용을 제외하고 아스파르트산 잔기의 양쪽 측면이 펩티드의 접합(folding)에 영향을 미치는 구조적인 단점이 있다. 게다가 선형 RGD-펩티드 리간드들은 화학적 소실(chemical degradation)에 많이 취약한 것으로 알려졌다. 따라서, 상기 단점들을 극복하기 위해서 RGD의 구조적 변형에 대한 시도가 다양하게 이루어지고 있다.

본 발명자들은 RGD 펩티드의 구조적 단점을 극복할 수 있는 세포막 투과성 펩티드를 개발하기 위해 노력하던 중, 본 발명의 다중 모티프로 구성된 펩티드가 세포독성이 없으며 비대칭 리포좀(asymmetric liposome; ALP)과 결합하였을 때, 세포 내 흡수를 현저히 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 및 15번째에 위치한 글라이신(glycine; G)을 각각 루신(leucine; L) 및 아르기닌(arginine; R)으로 치환한 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 모든 아스파르트산(aspartic acid; D)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환한 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 모든 아스파르트산(aspartic acid; D)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환한 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과 펩티드 및 이의 변이체, 및 상기 펩티드에 결합된 지질 구조체를 포함하는 약물전달담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과 펩티드 및 이의 변이체, 및 생물학적 활성 물질이 융합된 융합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포 내 생물학적 활성물질의 전달방법을 제공한다:

1) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과 펩티드 및 이의 변이체를 생물학적 활성물질과 결합하여 전달 복합체를 제조하는 단계; 및

2) 상기 전달 복합체를 세포 또는 조직에 처리하는 단계.

본 발명의 다중 모티프로 구성된 신규한 세포투과 펩티드는 세포 독성이 없으며 인테그린-의존 인터널리제이션(integrin-dependent internalization)의 유도 및 산성 내포낭(acidic endosome)에 있어서 양친매성 α-나선구조(amphiphthic α-helix structure)의 형성에 의한 내포낭 탈출(endosome escape)을 촉진함으로써, 다양한 치료용 약물 전달 시스템 및 약물치료 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 본 발명의 펩티드 및 PD2 펩티드의 나선형 휠(helical wheel) 구조를 나타내는 도이다.
도 1B는 본 발명의 펩티드가 세포독성이 없음을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 펩티드와 결합한 비대칭 리포좀(asymmetric liposome; ALP)의 세포 내 흡수가 증가함을 나타내는 도이다.
도 3은 GFP를 과발현하는 세포주에 본 발명읜 펩티드와 결합한 siGFP를 처리하였을 때 GFP의 발현이 감소하는 것을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 펩티드와 결합한 siTMPRSS4를 처리하였을 때, TMPRSS4 매개의 세포 이동 및 침입이 억제됨을 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드는 5개의 아르기닌(arginine; R)-글리신(glycine; G)-아스파르트산(aspartic acid; D)으로 이루어진 RGD 모티프(motif)들을 나선 휠 도해(helical wheel diagram)에서 아르기닌이 한쪽으로 모이도록 RGDRGDRGDXRGDRGDXR의 서열로 연결하고 X에는 소수성이 큰 루신(leucine; L)을 배치한 후, 상기 나선 휠 도해에서 아르기닌의 배치가 잘 맞도록 3번째 및 4번째 RGD의 글리신을 각각 아르기닌 및 루신으로 치환한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단 및 C-말단으로부터 각각 5번째에 위치한 글라이신(glycine; G)을 각각 루신(leucine; L) 및 아르기닌(arginine; R)으로 치환하고, 모든 아스파르트산(aspartic acid; D)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환한 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 세포투과 펩티드는 PD1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 세포투과 펩티드는 PD2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 세포투과 펩티드는 PE1 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 세포투과 펩티드는 PE2로 각각 명명하였다. 상기 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 물질에 결합하여 세포 내 또는 생체 내로 상기 물질을 전달하여 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내게 할 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포투과 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.

상기 세포투과 펩티드는 소수성인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 상기 펩티드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D- 아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다. 이렇게 제작된 변이체들은 세포투과성 및 세포 내 전달 기능을 보유하도록 변형될 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세포투과 펩티드 및 상기 펩티드에 결합된 지질 구조체를 포함하는 약물전달담체를 제공한다.

상기 약물전달담체는 리포좀, 에멀젼 또는 고분자 입자 등의 구조체를 이용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 비대칭 리포좀(asymmetric liposome; ALP)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 지질 구조체의 지질성분으로는 탄소수가 12 내지 24개의 다양한 지방산 사슬을 갖는 인지질류나 질소 지질이 사용될 수 있다.

또한, 상기 지질은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 상기 비대칭 리포좀의 외부 필름(flim)은 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine):DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine):mPEG-PE[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(methoxy(polyethylene glycol)-2000)]:miPEG-PE[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(maleimide(polyethylene glycol)-2000)]:콜레스테롤이 4:3:0.8:0.2:4의 비율로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 내부 필름은 DODAP(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane):DOPE가 9:1의 비율로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세포투과 펩티드 및 생물학적 활성 물질이 융합된 융합체를 제공한다.

상기 생물학적 활성을 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타낸다. 또한, 상기 생물학적 활성을 나타내는 물질은 DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물일 수 있다. 상기 화학화합물은 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 항생제 및 생물의 성장, 발달 또는 분화의 인자일 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포투과 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 융합체는 다양한 세포 내로 전달할 수 있어서, 추후 생체 내 다양한 부위의 세포 내로의 전달체 개발에 적용될 수 있다. 상기 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 세포 내 생물학적 활성물질의 전달방법을 제공한다:

1) 본 발명의 세포투과 펩티드를 생물학적 활성물질과 결합하여 전달 복합체를 제조하는 단계; 및

2) 상기 전달 복합체를 세포 또는 조직에 처리하는 단계.

상기 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 다중 모티프로 구성된 4개의 펩티드를 합성하였고, 상기 펩티드가 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 상기 합성된 펩티드의 세포 투과성을 확인하기 위하여 비대칭 리포좀에 결합하였고, 이들이 유의적인 세포 투과활성을 나타내는 것을 확인하였으며(도 2 참조), 아울러, GFP를 과발현하는 세포주에 siGFP를 본 발명의 펩티드와 결합하여 처리한 결과 GFP의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 3 참조). 또한, 본 발명의 펩티드에 TMPRSS4 유전자를 억제하는 siRNA를 결합시켜 처리한 결과, TMPRSS4 유전자에 의해 매개되는 세포의 이동 및 침입이 억제하는 것을 확인하였다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 세포투과성 펩티드가 다양한 치료용 약물 전달 시스템 및 약물치료 기술에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해서 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 다중 모티프( multiple motif)로 구성된 펩티드의 제조

RGD/인테그린-의존 인터널리제이션(RGD/integrin-dependent internalization)을 유도 및 산성 내포낭(acidic endosome)에 있어서 양친매성 α-나선 구조(amphipathic α-helix structure)의 형성에 의한 내포낭 탈출(endosomal escape)을 촉진하기 위한 펩티드를 합성하였다.

구체적으로, 상기 펩티드의 합성은 Fmoc-chemistry를 사용하여, 고체상방법(solid-phase method)으로 합성되었다. 상기 방법으로 합성된 펩티드는 C18 컬럼을 사용한 HPLC로 정체되었고, MALDI-TOF 질량분석기(MALDI-TOF mass spectroscopy, Axima Plus, Shimazu Scientific Instruments, 일본)를 사용하여 분석되었다.

그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 다중 RGD 모티프(multiple RGD motif)를 갖는 펩티드(PD1)를 합성하였고, 또한, 염기성 및 소수성(hydrophobic properties)을 증가시키기 위하여 상기 PD1 펩티드의 N-말단(terminus) 및 C-말단으로부터 5번째 글라이신(glycine)을 각각 아르기닌(arginine) 및 루신(leucine)으로 변형하여 PD2 펩티드를 합성하였다. 또한, RGD 모티프를 제거하기 위하여 상기 PD1 및 PD2 펩티드의 모든 아스파르트산(aspartic acid)을 글루탐산(glutamic acid)으로 바꾸어 PE1(서열번호 3) 및 PE2 펩티드를 각각 합성하였다. PL은 대조군으로 사용되었다(도 1).

< 실시예 2> 다중 모티프로 구성된 펩티드의 세포독성 확인

상기 <실시예 1>의 방법으로 합성된 펩티드의 세포독성을 확인하기 위하여 WST-1 분석 시스템(WST-1 assay system)을 사용하여 세포증식분석(cell proliferation assay)을 수행하였다.

구체적으로, A549 및 NCI-H322(상기 세포주의 구입처를 알려주시기 바랍니다.)을 96-웰 플레이트에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 분주하였고, 상기 세포주에 본 발명의 펩티드를 0 내지 100 uM의 농도로 단계 희석(serial dilution)하여 첨가하여, CO₂ 배양기(incubator)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그리고나서 Premix WST-1 세포증식분석 시스템(Takara, 일본)을 제조사의 사용설명서에 따라 사용하여 살아있는 세포를 분석하였다. 이는 WST-1 시약 10 ㎕를 상기 세포에 첨가하여 4시간 동안 방치한 후, 450 nm에서 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader, Multiskan FC, Thermo Sci., 미국)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 일반적으로 염기성 및 소수성 성질을 갖는 펩티드가 박테리아, 곰팡이 및 동물 세포(특히 암세포)에서 세포독성을 나타내는 것과는 달리 본 발명의 펩티드는 100 uM의 농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다. 반면, 대조군인 PL 펩티드는 강한 세포독성을 나타내었다(도 1B).

< 실시예 3> 다중 모티프로 구성된 펩티드의 세포투과성 확인

<3-1> 펩티드-변형된 비대칭 리포좀(asymmetric liposome)의 제작

상기 <실시예 1>의 방법으로 합성된 펩티드의 세포투과성을 확인하기 위하여 비대칭 리포좀(asymmetric liposome; ALP)에 본 발명의 펩티드를 결합시키고, 상기 펩티드 결합된 리포좀을 이용하여 세포 내 흡수를 확인하였다.

구체적으로, FITC-siRNA가 캡슐화(encapsulating)된 ALP는 외부 및 내부 필름(film)이 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine):DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine):mPEG-PE[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(methoxy(polyethylene glycol)-2000)]:miPEG-PE[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(maleimide(polyethylene glycol)-2000)]:콜레스테롤이 4:3:0.8:0.2:4(총 1.7 umol), 및 DODAP(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane):DOPE가 9:1(총 1.5 umol)의 비율로 구성되었고, 상기 필름은 HBS(20 mM HEPES 및 150 mM 염화나트륨, pH 7.5) 200 ㎕, 에탄올 120 ㎕, 및 100 ㎍ siRNA가 포함된 150 mM 시트르산나트륨(pH 4) 150 ㎕가 혼합된 혼합물에 각각 수화되었다(hydrated). 또한, 디에틸에테르(diethylether) 600 및 400 ㎕가 각각 첨가되어 외부 및 내부 전환된 미셀(micelles)을 제조한 후, ALP는 상기 미셀과 혼합되고, 증발(evaporation), 및 HBS에 투석(dialysis)되어 제조되었다. 본 발명의 펩티드를 ALP에 결합시키기 위하여, ALP의 miPEG-PE보다 5배 몰랄농도(molar) 초과한 펩티드를 상온에서 ALP와 3시간 동안 배양하였다. 그리고 결합되지 않은 펩티드는 50 K 투석막(dialysis membrane)을 이용하여 HBS에서 투석하여 제거되었다.

그 결과, PD1 또는 PD2 펩티드는 각각의 펩티드의 C-말단 시스테인(cysteine) 잔기에 APL 표면 miPEG-PE의 말레이미드 군(maleimide group)이 결합되었다.

<3-2> 펩티드-변형된 APL 의 세포 내 흡수 확인

상기 실시예 <3-1>방법으로 제작된 펩티드-변형된 ALP의 세포 내 흡수를 확인하였다.

구체적으로, A549, NCI-H322, NCI-H460 및 NIH-3T3 세포주를 마이크로-슬라이드 8-웰 현미경관찰 챔버(micro-slide 8-well microscopy chamber, ibidi, 독일)에 분주되어 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양되었다. 상기 세포주는 웰당 1 ㎕ FITC-siRNA가 포함되도록 펩티드-변형된 FITC-siRNA-ALP로 처리되어 배양되었고, 배양 1일 후, 공초점현미경(confocal microscope, Olympus FV1000, 일본)을 사용하여 FITC-siRNA-APL의 세포 내 흡수가 관찰되었다. 공초점현미경 관찰 사진에서 녹색 형광 강도의 합은 Bio2D 프로그램(Vilber Lourmat, 독일)을 이용하여 측정되었고, 각각의 세포에 있어서 형광 강도의 평균은 전체 형광강도를 전체 세포 수로 나누어 계산되었다.

또한, PE2 유도된 ALP 흡수를 재확인하기 위하여 ROX 표지된 PE2를 ALP에 결합시켜 A549, NCI-H322 및 NCI-H460 세포주에 처리하여 하룻밤 동안 배양하여, ROX-PE2의 적색 신호 및 FITC-siRNA의 청색 신호의 위치가 같은지 확인하였다.

그 결과, 도 2A 및 2C에 나타난 바와 같이 변형되지 않은 ALP는 세포를 투과하지 못한 반면, 펩티드-결합된 ALP의 경우 세포를 투과하는 것을 확인하였다. 또한, 적은 수의 RGD 모티프를 가짐에도 불구하고, PD2가 PD1보다 높은 세포 투과활성을 나타내었고, PE1 및 PE2 펩티드-결합된 APL은 PD1 및 PD2 펩티드-결합된 APL보다 더 높은 전달효율(delivery efficiency)을 나타냈다(도 2A 및 2C). 또한, 도 2B에 나타난 바와 같이 ROX-PE2 및 FITC-siRNA가 같은 위치에 분포하고 있으므로(도 2B), 본 발명의 펩티드가 세포투과 펩티드(cell penetrating peptide; CPP)로써 효과적임을 확인하였다.

<3-3> 유전자 침묵 효과 확인

세포 내로 흡수된 siRNA가 표적 세포의 침묵을 유도하는지 확인하기 위하여 GFP를 과발현하는 MDA-MB-435 세포주에 siGFP를 처리하여 그 효과를 확인하였다.

구체적으로, siGFP는 5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3'(서열번호 6)의 서열로, 펩티드-결합된 ALP에 결합하여 사용하였다. GFP를 발현하는 MDA-MB-435 세포주는 상기 실시예 <3-2>의 방법으로 배양되었고, 상기 배양된 세포주에 웰당 0.6 ㎍의 siGFP가 포함되도록 펩티드-결합된 siGFP/ALP를 처리하였으며, 처리 3일 후, GFP 형광강도를 공초점현미경을 사용하여 관찰하였다. 세포당 GFP 형광강도의 평균은 ImageJ 3D 프로그램(IJ 1.45r 버전, NIH, 미국)을 사용하여 분석하였다.

아울러, TMPRSS4의 발현을 억제하기 위하여, 상기 방법과 동일한 방법으로 6-웰 플레이트에 NCI-H322 세포주를 이용하여, 펩티드-결합된 siTMPR4/ALP 처리 48시간 후 유전자 침묵효과를 확인하였고, 이때, 5'-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3'(서열번호 7)로 기재되는 서열을 siTMPR4로 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 펩티드 결합하지 않은 ALP는 음성대조군과 비슷한 GFP 강도를 나타내었고, Tat이 결합된 ALP의 경우 44.2 ± 8.6% 정도 GFP 발현을 감소시켰으며, 본 발명의 펩티드인 PD1, PD2, PE1 및 PE2를 결합한 ALP의 경우 51.8 ± 11.7% 내지 37.3 ± 7.6% 범위 내에서 GFP 발현을 감소시켰다(도 3). 따라서, 본 발명의 펩티드에 의한 GFP 유전자-침묵 활성을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 결과를 재확인하기 위해서 TMPRSS4 유전자를 이용한 실험에 있어서도 상기 결과와 동일한 결과를 나타내었다. 특히, PD2 및 PE2 펩티드에 의하여 TMRPSS4의 전사가 현저히 억제되었고, PD1 및 PE1 펩티드도 유의적인 전달효율을 나타내었다. 또한, 상기 TMPRSS4의 전사가 억제됨으로써 TMPRSS4 매개의 세포 이동(migration) 및 침입(invasion)도 억제됨을 확인하였다(도 4).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for infinite reproduction of somatic cells for inducing induced pluripotent stem cells by formation of teratoma <130> 13P-02-20 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2-F <400> 1 ccatgtatag atctggagga aa 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2-R <400> 2 caaatattaa aacttttttt tcatcg 26 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-F <400> 3 cccaggtccc cactttggca c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-R <400> 4 acccctgttg tgcttttaat ccc 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog-F <400> 5 caccagtgga gtatcccagc at 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog-R <400> 6 tggcagagaa gttttgctgc aac 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zfp42-F <400> 7 catcctaacc cacgcaaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zfp42-R <400> 8 aagagttgca aaattatttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FSP-F <400> 9 aggccctgga tgtaattgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FSP-R <400> 10 gctgtccaag ttgctcatca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fap-F <400> 11 tcaactgtga tggcaagagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fap-R <400> 12 catggttctg gtcagagtac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fap-1F <400> 13 tcaactgtga tggcaagagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fap-1R <400> 14 gtaccacatc gcctggaaat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 15 ccagtatgac tccactcacg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 16 ttcacaccca tcacaaacat 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드.
제 1항의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 및 15번째에 위치한 글라이신(glycine; G)을 각각 루신(leucine; L) 및 아르기닌(arginine; R)으로 치환한 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드.
제 1항의 아미노산 서열에서 모든 아스파르트산(aspartic acid; D)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환한 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드.
제 2항의 아미노산 서열에서 모든 아스파르트산(aspartic acid; D)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환한 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 세포투과 펩티드.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 세포투과 펩티드, 및 상기 펩티드에 결합된 지질 구조체를 포함하는 약물전달담체.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 세포투과 펩티드와 생물학적 활성 물질이 융합된 융합체.
제 6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합체.
1) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 세포투과 펩티드를 생물학적 활성물질과 결합하여 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
2) 상기 전달 복합체를 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내 생물학적 활성물질의 전달방법.