WO2020256150A1 - 細胞透過性ペプチド - Google Patents

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WO2020256150A1
WO2020256150A1 PCT/JP2020/024273 JP2020024273W WO2020256150A1 WO 2020256150 A1 WO2020256150 A1 WO 2020256150A1 JP 2020024273 W JP2020024273 W JP 2020024273W WO 2020256150 A1 WO2020256150 A1 WO 2020256150A1
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cell
cancer
cells
permeable peptide
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滋 天野
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滋 天野
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to peptides, especially cell-permeable peptides or delivery carriers.
  • taxanes such as paclitaxel and docetaxel, which bind to microtubules, stabilize and inhibit depolymerization, inhibit tumor cell division, and vincristine, which inhibits microtubule polymerization and arrests cell division.
  • Vinca alkaloid compounds such as vincristine are known.
  • platinum preparations such as cisplatin, carboplatin, nedaplatin and oxaliplatin, which bind to DNA and exert an anticancer effect, can be easily used by injection or intravenous drip infusion (Non-Patent Documents 1 to 3). ..
  • Non-Patent Document 4 There is also a report that the fusion polypeptide-anticancer agent can efficiently target cancer cells by binding the NGR motif to a glycoprotein (Patent Document 1).
  • the present inventor has found that the NGR motif of the ligand molecule that binds to the cell surface does not require another motif structurally in order to bind to the cell surface. Based on the idea of the heel, I found a unique motif necessary for the combination. Then, the surprising finding that the peptide having the above-mentioned unique motif induces apoptosis after being taken up into the cytoplasm and transferred to the nucleus was found, and further research was carried out to complete the present invention. That is, the present invention relates to:
  • a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN, and a motif selected from the group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 are included, and each of the above motifs An isolated cell-permeable peptide having a ⁇ -strand structure between.
  • [4] Selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the cell-permeable peptide according to any one of [1] to [3], which has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with the amino acid sequence.
  • [5] Selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer which comprises the cell-permeable peptide according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer which comprises the cell-permeable peptide according to any one of [1] to [5] as a drug delivery carrier in the nucleus.
  • the agent is selected from the group consisting of doxorubicin, mitomycin C, vindesine, methotrexate, retinoic acid, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin, epirubicin, actinomycin D, gemcitabine and oteracil potassium, according to [8].
  • Pharmaceutical composition [10] The pharmaceutical composition according to any one of [6] to [9], wherein the cancer is epithelial cell cancer or carcinoma, non-epithelial cancer or sarcoma or blood cancer.
  • Cancers are lung cancer, gastric cancer, cholecyst / bile duct cancer, pancreatic cancer, liver cancer, colon cancer, rectal cancer, breast cancer, osteosarcoma, liposarcoma, hemangiosarcoma, rhabdomyosarcoma, smooth myeloma, acute myeloma.
  • the pharmaceutical composition according to [10] which is selected from the group consisting of leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute premyelogenous leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma and multiple myeloma.
  • the cell-permeable peptide of the present invention can permeate the cell membrane and translocate into the cytoplasm via the cell membrane receptor, instead of simply passing through the cell membrane. Not only that, it can also move to the nucleus. Furthermore, since it has little effect on normal cells, induces apoptosis in target cells, suppresses and shrinks tumors, etc., it provides a cell-permeable peptide with higher selective toxicity (acts specifically on target cells). Can be provided. Cell-permeable peptides as activator delivery carriers can also be provided into the cell nucleus.
  • FIG. 1 is a graph showing the apoptosis-inducing effect of Example 1 on normal cells and cancer cells.
  • FIG. 2A is a graph showing the cell death-inducing action of Example 2 on normal cells and various cancer cells.
  • 2B to 2E are graphs showing the cell death-inducing action of Examples on cancer cells.
  • FIG. 3 is an image of immunoprecipitation showing that Example 2 and CD13 are bound.
  • FIG. 4 is an image photograph of a confocal microscope in which Example 2 was administered to cancer cells.
  • 5A and 5B are image photographs of a confocal microscope in which Example 2 was administered to normal cells or various cancer cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the size of the tumor and the number of days of administration after administration of the control or Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the size of the tumor and the number of days of administration after administration of the control, Comparative Example 4 or Example 3.
  • peptide As used herein, the terms “peptide,” “oligopeptide,” “polypeptide,” and “protein” are interchangeable to refer to a polymer with at least two amino acid residues bonded by a peptide bond. used. The term does not mean a polymer of a particular length, whether the peptide is produced using recombinant techniques, produced using chemical or enzymatic synthesis, is natural or isolated. It is not intended to distinguish whether it was done or not.
  • amino acid in its broad sense refers to any compound and / or substance that can be incorporated into a peptide, oligopeptide, polypeptide or protein.
  • the amino acid has the general structure H 2 N-C (H) (R) -COOH.
  • the amino acid is a naturally occurring amino acid, a synthetic amino acid, a D-amino acid or an L-amino acid.
  • cell-penetrating peptide as used herein is used interchangeably and is also referred to as "transport peptide” or “carrier peptide”.
  • Cell-permeable peptides are known or have the ability, but not limited to, to cross the cell membrane and invade or translocate into cells for cells that can elicit a biological response or affect their function. Refers to a variable length peptide chain that can be demonstrated.
  • motif refers to a peptide that can be recognized by a receptor molecule in a particular cell or has a particular structure or function.
  • the present invention relates to RGN (Arg-Gly-Asn), RGH (Arg-Gly-His), RYN (Arg-Tyr-Asn), LYN (Leu-Tyr-Asn), FFN (Phe-).
  • the first motif selected from the group consisting of Ph-Asn) and QYN (Gln-Tyr-Asn), and NGR (Asn-Gly-Arg), NGQR (Asn-Gly-Gln-Arg) (SEQ ID NO: 44).
  • NGYR Asn-Gly-Tyr-Arg
  • SEQ ID NO: 45 a second motif selected from the group consisting of NGYR (Asn-Gly-Tyr-Arg) (SEQ ID NO: 45), and having a ⁇ -strand structure between the first and second motifs. It is a released cell-permeable peptide.
  • the present invention is also represented by a motif represented by either RGN (Arg-Gly-Asn) or LYN (Leu-Tyr-Asn) and either NGR (Asn-Gly-Arg) or SEQ ID NO: 44. It is an isolated cell-permeable peptide having a ⁇ -strand structure between the motifs and the motifs.
  • the present invention includes an RGN (Arg-Gly-Asn) motif and an NGR (Asn-Gly-Arg) motif, and has a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif. It is a sex peptide.
  • the first or second motif may be capable of specifically binding to a glycoprotein or cell membrane receptor, eg, an amino acid sequence constituting a ⁇ -turn structure.
  • the amino acid sequences that make up the ⁇ -turn structure are, but are not limited to, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, LYN (Leu-Tyr-Asn) or LY (Leu-Tyr). It may be a peptide.
  • amino acid sequences constituting the ⁇ -strand structure are not limited, but SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23. , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 42.
  • a random coil structure may be further added to the N-terminal or C-terminal.
  • the amino acid sequence constituting the random coil structure may be any amino acid sequence that enhances hydrophilicity.
  • the amino acid sequence on the N-terminal side is KD (Lys-Asp), TD (Thr-Asp), KT (Lys-Thr), KH (Lys-His), KR (Lys-Arg), KN. It may be a peptide having (Lys-Asn) or KHG (Lys-His-Gly).
  • the amino acid sequence on the C-terminal side may be a peptide having SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 43.
  • the cell-permeable peptide may be a cell-permeable peptide having a full length of 40 or less amino acids.
  • the full length of the cell-permeable peptide is 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37. , 38, 39 or 40 amino acid residues or less.
  • KDNRGNLLQCVCTGNGRGEWKC (SEQ ID NO: 1), KDNRGNLLQCICTGNGRGEWKC (SEQ ID NO: 2), TDTRGNLLQCICTGNGRGEWKC (SEQ ID NO: 3), KTDSRGHVLQCLCTGNGRGEWKC (SEQ ID NO: 4), KHGRYNLKQCKMSLNGQRGECWC (SEQ ID NO: 5), KHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWC (SEQ ID NO: 6), KHGLYNLKQCKMSVNGQRGECWC (SEQ ID NO: 7), KNGFFNLKQCKMSVNGQRGECWC (SEQ ID NO: 8), KRGQYNLKQCKMSVNGYRGECWC (SEQ ID NO: 9) and KDNRGNLLQCLCTGWRC You can.
  • the cell-permeable peptide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 34.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 34. It may be a peptide or cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of, or SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6. It may be a peptide or a cell-permeable peptide consisting of the amino acid sequence shown in No.
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 34.
  • it is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 34.
  • It may be a peptide or a cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence having the same.
  • the term "specifically” refers to a significantly higher binding affinity for a specific glycoprotein (eg, 3, 4, etc.) as compared to the affinity for a non-specific glycoprotein. Refers to glycoproteins with 5, 6, 7, 8, 9 or 10-fold higher binding affinity).
  • glycoprotein refers to a protein in which a sugar chain is bound to a part of the amino acids that make up the protein.
  • cell membrane receptor refers not only to proteins that are present on the surface of the cell membrane (including complex proteins), but also to proteins that penetrate the cell membrane and have a portion of that protein in the cytoplasm. Also points to.
  • the invention may be a cell-permeable peptide that specifically binds to a glycoprotein or cell membrane receptor in a target cell.
  • the cell surface glycoprotein or cell membrane receptor may be a cell marker, eg, but not limited to, a cell marker can be T cell lineage, B cell lineage, myeloid lineage, erythroid lineage or It may be a megakaryocyte marker or a cancer stem cell marker.
  • the cell surface glycoprotein or cell membrane receptor is CD3, CD9, CD11c, CD13, CD14, CD19, CD20, CD29, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD64, CD65, CD105, CD117. , CD133, CD166, CD271, CD326, CD338 or CD340.
  • inducing apoptosis may be paraphrased as killing a target cell or killing a cell.
  • the cell-permeable peptide induces apoptosis in target cells.
  • the target cell may be a T cell lineage, B cell lineage, myeloid lineage, erythroid lineage or megakaryocyte lineage marker, or a cell expressing a cancer stem cell marker.
  • the target cells are, for example, but not limited to, CD3, CD9, CD11c, CD13, CD14, CD19, CD20, CD29, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD64, CD65, CD105, CD117, CD133, CD166. , CD271, CD326, CD338 or CD340.
  • Target cells refer to those cells suffering from a disorder or condition, those cells suffering from a cell proliferation disorder, but not limited to, by way of example, malignant tumors, ie, epithelial cell carcinomas or cancers, non-cancerous. It may be a cancer cell or tumor cell such as epithelial cancer or sarcoma or hematological cancer (hematocyte cancer), and such cancer cell or tumor cell is a hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma or biliary tract cancer).
  • Epithelial cell carcinoma or cancer such as pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, thyroid cancer or lung cancer (small cell lung cancer or non-small cell lung cancer), laryngeal cancer, pharyngeal cancer or tongue cancer, Memoromas (non-epithelial cell carcinomas) such as osteosarcoma, chondrosarcoma, horizontal print myoma, smooth myeloma, fibrosarcoma, liposarcoma or angiosarcoma, or leukemia, ie acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute It may be a hematological malignancy such as premyelogenous leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma or multiple myeloma.
  • the pharmacologically active agent (activator) or agent may be attached or added directly or by a linker to the terminal portion of the cell-permeable peptide.
  • the linker may be a water soluble polymer.
  • it may be a click chemistry reagent such as, for example, polyethylene glycol (PEG) or an azide or dibenzocyclooctyne (DBCO) that causes an azido-alkyne cycloaddition reaction.
  • the activator or agent may be directly attached to the amino-terminal (N-terminal) and / or carboxyl-terminal (C-terminal) portion of the cell-permeable peptide.
  • the activator or agent is not limited, but is limited to proteins, peptides, oligonucleotides, polypeptides, polynucleotides, polypeptides, lipids, antibodies, antibody fragments, aptamers, nucleic acids (eg, eg). It can be, but is not limited to, siRNA, shRNA, DNA / RNA hybrids, antisense oligonucleotides, ribozymes), small molecule drugs, or any other biologically active substance.
  • the activator or agent may act intracellularly or may be specific for a component inside the target cell, and may be a cytotoxic or cell division inhibitor. May be good.
  • the activator or agent may be a cytotoxic radionuclide, chemical toxin, or protein toxin.
  • the activator or agent may be an anticancer or antitumor agent, eg, but not limited to paclitaxel, doxorubicin, vincristine, vincristine, vinblastine, methotrexate, mitomycin C, retinoic acid, cisplatin, carboplatin , Nedaplatin, oxaliplatin, docetaxel, bleomycin, fluorouracil, epirubicin, actinomycin D, gemcitabine, oteracil potassium or iron oxide nanoparticles.
  • the invention is selected from a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN, and a group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45. It may be a medicine or a pharmaceutical composition containing a cell-permeable peptide as an active ingredient, which contains a motif and has a ⁇ -strand structure between the motifs. Further, the present invention may be a medicine or a pharmaceutical composition containing a cell-permeable peptide as an active ingredient, which contains an RGN motif and an NGR motif and has a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif. ..
  • the active ingredient may be combined with any other optional ingredient as long as the effect of the active ingredient is not impaired.
  • the pharmaceutical composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent, as well as an inert diluent, smoothing agent, buffer or adjuvant such as a preservative. , Stabilizers, wetting agents, emulsifiers or buffers and the like may be included.
  • the pharmaceutical composition may be, for example, but not limited to, oral administration, parenteral administration, rectal administration, and the like.
  • compositions of the present invention may also be in solid form (including, without limitation, capsules, tablets, pills, granules, powders or suppositories) or in liquid form (without limitation, solutions, suspensions or emulsions). Includes). Further, depending on the route of administration, the mode of drug release, etc., the drug or pharmaceutical composition of the present invention may be coated with an appropriate material such as a time-disintegrating material, or may be incorporated into an appropriate drug release system. Good.
  • the medicaments or pharmaceutical compositions of the invention described herein are various routes, including both oral and parenteral, such as, without limitation, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral. , Rectal, intraarterial, portal vein, ventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary and intrauterine routes may be administered, and the dosage form is suitable for each administration route. You may. Any known dosage form and formulation method can be appropriately adopted.
  • treatment includes the suppression, alleviation, delay, alleviation and elimination of conditions, diseases, symptoms or unwanted side effects thereof.
  • the invention is selected from a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN, and a group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45.
  • Compositions and pharmaceutical compositions for the treatment or prevention of cancer or tumor which contain an isolated cell-permeable peptide as an active ingredient, which comprises a motif and has a ⁇ -strand structure between the motifs. It is a substance or a medicine.
  • the present invention also comprises a cell-permeable peptide or composition for treating or preventing cancer or tumor, comprising an RGN motif and an NGR motif and having a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif.
  • exemplary cancers or tumors are hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma or bile duct cancer), pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, thyroid cancer, lung cancer (small cell lung cancer). Or non-small cell lung cancer), epithelial cell cancer or cancer such as laryngeal cancer, pharyngeal cancer or tongue cancer, osteosarcoma, chondrosarcoma, horizontal print myoma, smooth myosuma, fibrosarcoma, liposarcoma or angiosarcoma, etc. It may be a sarcoma (non-epithelial cell carcinoma) or a hematological malignancies such as leukemia, malignant lymphoma or multiple myeloma.
  • the invention comprises a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN for the treatment or prevention of cancer or tumor, and NGR, SEQ ID NO:. It may be an isolated cell-permeable peptide comprising a motif selected from the group consisting of 44 and SEQ ID NO: 45 and having a ⁇ -strand structure between the motifs.
  • carrier refers to a pharmacologically active agent (activator) or drug transporter and may interact with or assist with the activator or agent transported by itself. , And may have some activity in itself.
  • the invention is a carrier for intracellular or nuclear delivery of a pharmacologically active agent (activator) or drug in a target cell, wherein said carrier is RGN, A motif selected from the group consisting of RGH, RYN, LYN, FFN and QYN and a motif selected from the group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 are included, and a ⁇ strand is provided between the respective motifs.
  • the carrier may specifically bind to a glycoprotein or a cell membrane receptor.
  • the present invention contains an RGN motif and an NGR motif, and has a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif, which is pharmacologically intracellular or intranuclear in a target cell. It can be an activator (activator) or a cell-permeable peptide or carrier peptide or carrier for drug delivery.
  • the target cells (or malignant tumors) of the carriers of the present invention may be epithelial cell carcinomas or carcinomas, sarcomas or hematological malignancies, as described above, but not exclusively.
  • the cell-permeable peptide is composed of the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 34.
  • the selected amino acid sequence which may be exemplary, such as the active agent or agent that can be added to the target cell sugar protein or cell membrane receptor, target cell, and carrier, is as described above.
  • the invention is selected from a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN, and a group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45.
  • An isolated cell-permeable peptide containing a motif and having a ⁇ -strand structure between the motifs can be used as a pharmacologically active agent (activator) or into the cell or nucleus in a target cell. It may be a pharmaceutical or pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer or tumor, for drug delivery or contained as a carrier peptide or carrier.
  • exemplary amino acid sequences, glycoproteins or cell membrane receptors of target cells, target cells (or malignant tumors), and activators or agents are as described above.
  • the pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent, or inert diluent which may be included in the composition is not limited, but is as described above.
  • the invention comprises the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer or tumor.
  • a cell-permeable peptide or pharmacologically comprising a selected motif and a motif selected from the group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 and having a ⁇ -strand structure between the respective motifs. It may be the use of an activator (activator) or a carrier peptide or carrier for drug delivery.
  • the present invention also comprises an RGN motif and an NGR motif in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer or tumor, and has a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif.
  • Cell permeable peptide may be used.
  • pharmaceutical or pharmaceutical composition uses, cell-permeable peptides or pharmacologically active agents (activators) or carrier peptides or carriers for drug delivery may be present.
  • Smoothing agents, buffers and the like are as described above.
  • the invention is a method for treating or preventing cancer or tumor in a subject, in a therapeutically effective amount, for a subject having cancer or tumor.
  • a motif selected from the group consisting of RGN, RGH, RYN, LYN, FFN and QYN and a motif selected from the group consisting of NGR, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 are included, and between the respective motifs.
  • the method described above comprising administering a cell-permeable peptide having a ⁇ -strand structure or a pharmacologically active agent (activator) or a carrier peptide or carrier for drug delivery.
  • the present invention also comprises a method for treating or preventing cancer or tumor in a subject, which comprises a therapeutically effective amount of an RGN motif and an NGR motif for a subject having cancer or tumor.
  • the method comprising administering a cell-permeable peptide having a ⁇ -strand structure between the RGN motif and the NGR motif.
  • the subject is a human or non-human mammal subject such as a monkey, cow, pig, sheep, horse, dog, cat, rabbit, mouse, rat, hamster, bird, turtle, soft-shelled turtle or zebrafish. You can. Also, but not limited to, exemplary cancers or tumors are as described above.
  • the effective amount in various methods of the present invention described in the present specification may be, for example, an amount that promotes the death of cancer cells or kills cancer cells with respect to cancer, and may be an amount that kills cancer cells.
  • the amount may be an amount that suppresses cell proliferation or delays cell proliferation.
  • the treatment of the disease it may be an amount that reduces the symptoms of the disease or delays or stops the progression of the disease, and is also an amount that suppresses or cures the disease.
  • Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog, pig or monkey, and such a test method is well known to those skilled in the art. ing.
  • the dose of the drug used in the treatment method of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the above-mentioned test or the like.
  • Specific doses of the active ingredient administered in the treatment methods of the invention described herein can be determined by various conditions relating to the subject requiring treatment, such as the condition or stage of cancer, the severity of symptoms, and the subject. It may be determined in consideration of general health condition, age, weight, sex of subject, diet, timing and frequency of administration, concomitant medication, responsiveness to treatment, dosage form, and compliance with treatment.
  • the invention is oral, intraportal, at least every 4, 3, 2 or daily, or multiple times a day (ie, 2, 3, 4 or 5 or more times a day).
  • Intravenous, intramuscular, subcutaneous, nasal, transpulmonary, transdermal, local, intratumoral, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine, sublingual or rectal administration approximately 2. It may be administered to the subject in the range of 5, 5, 7.5, 10.0, 12.5 or 15 mg / kg, or about 2.5-15 mg / kg.
  • the total daily dose of the present invention is not limited, for example, about 1 ⁇ g / kg to about 1000 mg / kg body weight, about 10 ⁇ g / kg to about 100 mg / body weight kg, and about 100 ⁇ g / kg to about 10 mg / body weight kg. And so on.
  • the peptide used in the present invention can be chemically synthesized or genetically engineered.
  • the peptides used in the present invention or peptides to which a drug is added can be prepared according to a general method known to those skilled in the art.
  • the peptide was produced by consignment to Medical & Biological Research Institute Co., Ltd. (Japan) or Genscript Japan Co., Ltd. (Japan). Briefly describing the synthesis method, H-Cys (Trt) -2-crototrityl chloride (CTC) resin (Merck) was swollen with DMF.
  • the resin was further treated with 20% piperidine / DMF, washed with methanol and dried to give a peptide-resin.
  • Example 1 (SEQ ID NO: 1) (Medical Biology Laboratory Co., Ltd.) under the condition of 210 nm.
  • FITC was bound to the above peptide-resin via an Ahx linker, and the peptide purified in the same manner as above was designated as Example 2 (SEQ ID NO: 32) (Genscript Japan Co., Ltd.).
  • peptide-resin was mixed with Azide-PEG4-NHS (CLICK CHEMISTRY TOOLS) in an equivalent amount in a DMF solvent. Further, 10 times equivalent of DIEA was added to this solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to obtain the obtained peptide (MW 272.09, 95%, 100.5 mg, TFA free) (PH Japan Co., Ltd.). , Prepared to 50 mg / ml (17.5 mM) with sterile Milli-Q water.
  • reaction solution was adsorbed on a 1 ml Resource 15 RPC column (GE Healthcare) equilibrated with A buffer (0.1% (V / V) acetic acid (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). Then, with a 30-44% linear gradient of A buffer and B buffer (acetonitrile (ANC) containing 0.1% (V / V) acetic acid (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 90: water 10), a flow rate of 1 ml / min. Then, the Dox-PEG5-DBCO fraction was fractionated. At the same time, the absorbance from 210 nm to 500 nm was monitored.
  • the fractions collected were concentrated in a centrifugal concentrator and dissolved in DMSO to a concentration of 67 mg / ml (52.6 mM).
  • the Dox-PEG5-DBCO solution prepared with the above obtained peptide was mixed in DMSO at a molar ratio of 1: 1 for 3 hours at room temperature. After adsorbing the obtained reaction solution on the above column, fractionation was carried out in the same manner as above with a 20-45% linear gradient using A buffer and B buffer. After further concentrating in the same manner as above, it was dissolved in sterile Milli-Q water, and this was designated as Example 3 (SEQ ID NO: 33).
  • Arg (Pbf), Gly, Asn (Trt) and Cys (Trt) were sequentially introduced into the CTC resin in the same procedure as in Example 1.
  • SEQ ID NO: 31) (Medical Biology Laboratory Co., Ltd.).
  • Lys (Boc), Trp (Boc), Glu (OtBu), Gly, Arg (Pbf), Gly, Asn (Trt), Gly, Thr (tBu), Cys (Trt), Leu, Cys (Trt), Leu, Cys Trt), Gln (Trt), Leu, Leu, Asn (Trt), Gly, Arg (Pbf), Asn (Trt), Asp (OtBu) and Lys (Boc) are sequentially introduced in the same procedure as in Example 1. Then, a preparatively purified peptide was obtained (SEQ ID NO: 34). Further, the peptide-resin obtained as a result was bound to FITC via an Ahx linker, and the peptide purified by preparative use was designated as Example 4 (SEQ ID NO: 35) (Genscript Japan Co., Ltd.).
  • Lys (Boc), Trp (Boc), Glu (OtBu), Gly, Arg (Pbf), Gly, Asn (Trt), Gly, Thr (tBu), Cys (Trt), Ile (Boc) are added to the CTC resin.
  • Cys (Trt), Gln (Trt), Leu, Leu, Asn (Trt), Gly, Arg (Pbf), Asn (Trt), Asp (OtBu) and Lys (Boc) in the same procedure as in Example 1.
  • SEQ ID NO: 2 a preparatively purified peptide
  • the peptide-resin obtained as a result was bound to FITC via an Ahx linker, and the peptide purified by preparative use was designated as Example 5 (SEQ ID NO: 36) (Genscript Japan Co., Ltd.).
  • the above CTC resins include Trp (Boc), Cys (Trt), Glu (OtBu), Gly, Arg (Pbf), Gln (Trt), Gly, Asn (Trt), Leu, Ser (tBu), Met, Lys ( Boc), Cys (Trt), Gln (Trt), Lys (Boc), Leu, Asn (Trt), Trp (Boc), Leu, Gly, His (Trt) and Lys (Boc) are the same as in Example 1.
  • the peptides were sequentially introduced according to the above procedure to obtain a preparatively purified peptide (SEQ ID NO: 6). Further, the peptide-resin obtained as a result was bound to FITC via an Ahx linker, and the peptide purified by preparative use was designated as Example 6 (SEQ ID NO: 37) (Genscript Japan Co., Ltd.).
  • human fibrosarcoma-derived HT-1080 cells (HT-1080 cells, JCRB cell bank) were subjected to a cell death induction test of cancer cells in In vitro and nuclear transfer of Example 2.
  • HT-1080 cells human osteosarcoma cell line Hos cells (Hos cells, JCRB cell bank), human histocytic lymphoma / macrophages U937 cells (U937 cells, JCRB cell bank), human myeloid leukemia cells HL-60.
  • Falcon 96-well culture
  • HT-1080 cells (1 ⁇ 10 7 cells / 200 ⁇ l) were subcutaneously transplanted to the backs of 5-week-old BALB / c nude mice (Charles River Japan). Furthermore, after confirming that the tumor after transplantation reached 30 to 60 mm 3 , this was subjected to the following test.
  • Test Example 1 Measurement test of changes in mitochondrial membrane potential Add the synthetic peptides of Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 to cells, culture in a serum-added medium ( ⁇ -MEM + 10% FBS), and control the serum-added medium. Cultured only with ( ⁇ -MEM + 10% FBS). After culturing for 7 days, the cells were washed once with phosphate buffered saline (PBS) and stained with 2 ⁇ M JC-1 at 37 ° C. in a 5% CO 2 cell incubator for 30 minutes. Further, the cells were washed once with PBS, 100 ⁇ l of PBS was added, images were acquired with a confocal laser scanning microscope LSM800 (Zeiss), and then analyzed with ImageJ.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the vertical axis represents the mean value ⁇ SD (standard deviation) of the apoptosis rate (number of JC1 stained green cells / total number of cells ⁇ 100 (%)), and the horizontal axis represents Example 1, Comparative Example 1, and Comparative Example 2. And Comparative Example 3 is shown.
  • the left center right bar of Example 1 the left bar shows the added peptide concentration of 25 ⁇ g / ml, the center bar shows the added peptide concentration of 50 ⁇ g / ml, and the right bar shows the added peptide concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • Test Example 2A Cell death induction test of cancer cells in vitro
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 was labeled with FITC (Example 2).
  • Example 2 was added in 100 ⁇ l, 10% FBS was further added, and the cells were cultured under the condition of 200 ⁇ l of serum-added medium (Alpha modeling of Eagle's MEM ( ⁇ -MEM) + 10% FBS) for 9 days.
  • ⁇ -MEM Alpha modeling of Eagle's MEM
  • FBS FBS
  • the results were shown by the mean ⁇ SD (standard deviation) of the dead cell rate (PI-stained red cell number / total cell number x 100 (%)).
  • the vertical axis shows the dead cell rate at the time of culturing in Example 2 (50 ⁇ g / ml) for 9 days for each cell, and the horizontal axis shows various cells. No increase in the rate of dead cells relative to Gin-1 cells was observed. On the other hand, the increase in the dead cell rate with respect to HT-1080 cells, U937 cells, HL-60 cells and Hos cells was significantly different at the 1% level. A significant difference was observed at the 5% level for THP-1 cells.
  • the cell-permeable peptide of the present invention does not have a cell death-inducing effect in normal cells, but has a cell death-inducing effect in cancer cells, demonstrating extremely high selective toxicity.
  • Test Example 2B Cell death induction test of cancer cells in In vitro
  • a peptide in which the peptide of SEQ ID NO: 34 was labeled with FITC was used in Example 4
  • SEQ ID NO: A peptide in which the peptide of 2 was labeled with FITC was used as Example 5
  • a peptide in which the peptide of SEQ ID NO: 6 was labeled with FITC was used as Example 6.
  • Examples 2 and 4 to 6 were adjusted to 12.5, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml, respectively, and a 9-day administration test was performed using HT-1080 cells in the same manner as in Test Example 2A above. Cell staining and subsequent analysis of the ratio of dead cells to the total number of cells were performed in the same manner as in Test Example 2A.
  • the vertical axis shows the dead cell rate at the time of culturing in Examples 2 or 4 to 6 (12.5, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml, respectively) for HT1080 cells for 9 days, and the horizontal axis shows each of the cases. Examples and their dosing concentrations, or controls are shown. A significant difference was observed in the increase in the dead cell rate with respect to HT-1080 cells at the 1% level.
  • the 50 and 100 ⁇ g / ml doses of Example 2 showed at least 60% or more. Similar dose concentrations in Examples 4 and 5 showed at least 60% and 50% or more dead cell rates, respectively.
  • Example 2 In Examples 2, 4 and 5, where the administration concentrations were 25 and 12.5 ⁇ g / ml, the dead cell rate was about 50% to 40%, respectively. In particular, Example 6 showed a dead cell rate almost equal to that of 100 ⁇ g / ml even when the administration concentration was 12.5 ⁇ g / ml, and maintained a dead cell rate of about 35%. This experiment showed that Examples 2, 4-6 were also effective at a dosing concentration of 12.5 ⁇ g / ml.
  • Test Example 2C E In vitro Cancer Cell Death Induction Test The dose of Example 2 was adjusted to 50 ⁇ g / ml, and A549 cells, MIA Paca2 cells or HuH7 cells were used in the same manner as in Test Example 2A. Was used to perform administration tests for 9, 16 or 23 days. Cell staining and subsequent analysis of the ratio of dead cells to the total number of cells were performed in the same manner as in Test Example 2A.
  • the vertical axis shows the dead cell rate at the time of culturing in Example 2 (50 ⁇ g / ml) for 9, 16 or 23 days for various cells, and the horizontal axis shows Example 2 or control.
  • a significant difference was observed in the increase in the dead cell rate at the 1% level in each of the cells.
  • a dead cell rate of about 50% was confirmed on the 9th day of culture, about 60% on the 16th day, and about 80% or more on the 21st day. Was done.
  • the dead cell rate was about 10% on the 9th day, but about 50% on the 16th day and about 80% on the 23rd day. Demonstrated dead cell rate. This indicates that the present invention is effective for pancreatic cancer, which has few effective measures. In addition, it is shown that the effect of Example 2 is exerted on these cancer cells day by day. On the other hand, in the administration test to HuH7 cells shown in FIG. 2E, the effects on the 9th day and the 16th and 23rd days of the administration were almost the same, and the cancer cell killing effect was demonstrated from the initial stage of the administration. This confirmed the effectiveness of the present invention for epithelial cell carcinoma.
  • Test Example 3 Binding protein analysis test by immunoprecipitation Example 2 (80 ⁇ g / 400 ⁇ l) was allowed to act on HT1080 cells (40 million cells) at 4 ° C. for 2 hours. Then, after washing with PBS, the centrifuged cells were added with Halt Protease & Phosphatase inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-free (Thermo Fisher Scientific) (10 ⁇ l), and IP Phosphate Buffer 1000 (10 ⁇ l) was added. It was dissolved under the condition of 1 minute. Centrifugation was performed at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • Example 2 specifically binds to CD13 on the cell membrane.
  • Example 4 Binding test to cell membrane in Example 2 PE-labeled human CD13 antibody (Clone: WM-15 BioLegend) (1 ⁇ g / 100 ⁇ l) and Example 2 (1 ⁇ g / 100 ⁇ l) were added to each cell (500,000 cells / 100 ⁇ l). And stained at 4 ° C. for 1 hour. After washing with PBS, the CD13 expression of each cell and the binding site of Example 2 were observed with a confocal laser scanning microscope LSM800 based on the fluorescence intensity of HT1080 cells. CD13 (red) expression was the strongest in HT1080 cells and Gin-1 cells, and Example 2 (green) luminescence was also strong.
  • Example 2 and CD13 were co-localized. Furthermore, the same phenomenon as above was observed in U937 cells, HL-60 cells, THP-1 cells and Hos cells in which the expression of CD13 was U937 cells (not shown).
  • Example 5A Nuclear migration test of Example 2 in Test Example 5A cancer cells Culture of Example 2 in 200 ⁇ l of serum-added medium ( ⁇ -MEM + 10% FBS) for 3 or 9 days so as to have a final concentration of 50 ⁇ g / ml. did. No cell death was observed after 3 days of culturing. On the other hand, since cell death was observed in 9 days of culture, the test was performed using the above number of cell culture days. Each of the above cells was peeled off and transferred to a Cellview glass bottom petri dish (35 ⁇ 10 mm) (Greener). Cells on day 3 of culture were fixed with 10% formalin ethanol and then stained with DAPI. Cells on day 9 of culture were stained with DAPI without fixation. Further, it was observed with a confocal laser scanning microscope LSM800 over time.
  • FIG. 4 is a photograph of Example 2 (green), DAPI (blue), superposition of Example 2 (green) and DAPI (blue), and differential interference contrast images on the 3rd and 9th days of HT1080 cell culture. is there.
  • Example 2 green
  • Example 2 blue
  • the color of the superposed image of Example 2 and DAPI staining in HT1080 cells on the 9th day was light blue, it was confirmed that Example 2 translocated to the nucleus and bound to the chromosomal DNA. ..
  • Example 2 was added to Gin-1 cells or the above cancer cells at a concentration of 50 ⁇ g / ml, cultured for 9 days, stained with DAPI, and then Z-scanned with a confocal laser scanning microscope LSM800.
  • FIG. 5A is a superposed photograph of XY, XZ and YZ cross sections of Example 2 (green) and DAPI (blue) in Gin-1 cells or the cancer cells. The nuclei of Gin-1 cells were not stained by DAPI, and it was confirmed from the XZ and YZ cross sections that Example 2 remained in the cytoplasm.
  • Example 2 translocated to the nucleus from the XZ and YZ cross sections of each cell and bound to the chromosomal DNA.
  • FIG. 5B is a superposed photograph of Example 2 (green) and DAPI (blue) in various cancer cells, respectively, of XY, XZ and YZ cross sections.
  • the color of the superposed image of Example 2 and DAPI staining was light blue. Further, from the XZ cross section and the YZ cross section of each cell, it was confirmed that Example 2 translocated to the nucleus and bound to the chromosomal DNA.
  • Example 5B Analysis test of intracellular and nuclear proteins to which Example 2 binds
  • Example 2 was adjusted to 4 ml of serum-added medium ( ⁇ -MEM + 10% FBS) so as to have a final concentration of 50 ⁇ g / ml, and HT1080 cells. (20 million cells) were cultured at 37 ° C. in a 5% CO2 cell incubator for 5 days. After washing with PBS and collecting cells, proteins were recovered from the cytoplasm and nucleus by NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (PIERCE), respectively. 80 ⁇ l of A / G agarose was added to 1 mg of cytoplasmic and nuclear proteins, respectively, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 1 hour to pretreat the sample.
  • PIERCE NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents
  • the table below shows the proteins identified from the cytoplasm and nucleus, excluding the antibody used for immunoprecipitation and Example 2 from the detected proteins, with the accession number, protein name, number of identified peptides detected, and specificity. The number of identified peptides, reliability score, amount of protein in cytoplasm (fmol) and amount of protein in nucleus (fmol) were shown.
  • Example 2 binds to the 40S and 60S ribosome proteins also present in the nucleus after translocation to the nucleus.
  • the above analysis also biochemically demonstrated that Example 2 can be translocated into the nucleus.
  • Example 6 Cancer cell growth suppression and apoptosis test of Example 2 in cancer mice Dissolve Example 2 in sterile water, add 2-fold concentration ⁇ -MEM (without glutamine and antibiotics), and add 200 ⁇ g / g. It was adjusted to 200 ⁇ l. This was administered intraperitoneally to cancer mice at 10 mg / kg every 3 days. In the control administration group, 200 ⁇ l of 1-fold concentration ⁇ -MEM was used, and this was administered intraperitoneally to cancer mice every 3 days.
  • the vertical axis shows the mean value of tumor size ⁇ SD (standard deviation), and the horizontal axis shows the number of days after administration.
  • the example 2 group from the 12th day to the 24th day showed a significant difference in tumor growth inhibition at the 1% level.
  • it exceeded 1500 mm 3 on the 24th day.
  • its tumor growth inhibitory effect was confirmed at about 600 mm 3 . After that, a tendency of tumor shrinkage was confirmed until the 33rd day.
  • Example 7 Anti-cancer drug delivery test of Example 3 in cancer mice Same as Example 2 so that Example 3 is 5 mg / kg and Comparative Example 4 (Dox) is 1.2 mg / kg, respectively. After being treated with cancer mice, the size of the tumor was measured by the same method.
  • the vertical axis represents the mean value of tumor size ⁇ SD (standard deviation), and the horizontal axis represents the number of days after administration. From the 18th day to the 24th day, a significant difference was observed in the tumor growth suppression at the 1% level between the control administration group and the comparative example 4 administration group in the example 3 administration group. In the control administration group and the comparative example 4 administration group, the size increased to about 2000 mm 3 on the 24th day.
  • the size of tumor 18 days decreased from 800 mm 3 to 500 mm 3, the suppression effect was confirmed up to 24 days. That is, not only the anticancer effect of the peptide itself but also the effect of the anticancer agent overlapped, and the tumor was greatly shrunk. It was shown that the peptide of the present invention acts specifically on target cells and has high toxicity to cancer cells as compared with administration of an anticancer drug alone. The above results also demonstrate that the peptide of the present invention is also effective as a delivery carrier for activators such as anticancer agents.
  • the cell-permeable peptide of the present invention can be applied to a new means different from the conventional therapeutic method, which has high selective toxicity. It can be applied not only as a pharmaceutical product but also for diagnosis of lesions, and is expected to be used as a carrier peptide that carries various active agents into the nucleus.

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Abstract

【課題】　本発明は、標的細胞に対し、選択毒性がより高い細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。また活性剤送達キャリアとしての細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。 【解決手段】　ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。

Description

細胞透過性ペプチド
関連出願の相互参照
　この出願は、２０１９年６月２１日に出願された日本国特許出願番号２０１９－１１５２２２の出願日の利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
　本発明はペプチドに関し、特に細胞透過性ペプチドまたは送達キャリアに関する。
　近年がんへの対策は急がれており、ニーズに合わせた種々の抗がん剤が開発され、目覚ましい効果をもたらしている。
　例えば微小管に結合し、安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害する、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン系や、微小管の重合を阻害し細胞分裂を停止させる、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系の化合物などが知られている。またＤＮＡと結合して抗がん効果を発揮する、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンなどの白金製剤などは、注射または点滴静注によりに簡単に用いることができる（非特許文献１～３）。
　さらに抗がん剤の作用効果を高めるために、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）を利用し、内部に抗がん剤など医薬品を封入させたミセル複合体やリポソームに封入した抗がん剤などの開発がすすめられている（非特許文献４）。またＮＧＲモチーフが糖タンパク質に結合することで、融合ポリペプチド－抗がん剤が、効率的にがん細胞を標的とすることができるという報告もある（特許文献１）。
米国特許第８，６３６，９７８号明細書
Beth A. Weaver、How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014 Sep 15; 25(18): 2677-2681. Maryam Moudi et al、Int J Prev Med. 2013 Nov; 4(11): 1231-1235. Cara A. Rabik et al、 Molecular Mechanisms of Resistance and Toxicity Associated with Platinating Agents. Cancer Treat Rev. 2007 Feb; 33(1): 9-23. Bruno F. O. Nascimento et al、A Review on (Hydro)Porphyrin-Loaded Polymer Micelles: Interesting and Valuable Platforms for Enhanced Cancer Nanotheranostics Pharmaceutics 2019, 11(2), 81.
　ところですべての抗がん剤化合物などの活性剤は、選択毒性の問題、つまり正常細胞への影響に直面する。上記した白金製剤もまた、腎毒性の議論を避けては通れない。さらにＤＤＳを利用した抗がん剤でさえも細胞毒性の問題は無視できない。すなわち、いかに標的細胞のみに抗がん剤などの薬剤または活性剤を作用せるかが大きな問題の一つとなっている。またがんなどの重篤な疾患において、疾患を有する者の病状や状態に合わせた種々の治療選択肢を提供することは非常に重要である。それゆえ、標的細胞に対し選択毒性（標的細胞へ特異的に作用する）がより高い、細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。また活性剤送達キャリアとしての細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を続けたところ、細胞表面に結合するリガンド分子のＮＧＲモチーフから、細胞表面に結合するためには、構造上、別なモチーフも必要ではないかとの着想に基づき、結合に必要な独自のモチーフを見出した。ついで上記独自のモチーフを有するペプチドが、細胞質内に取り込まれて核へ移動した後、アポトーシスを誘導するという驚くべき知見を突き止め、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に関する：
　〔１〕ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチド。
　〔２〕糖タンパク質に特異的に結合する、〔１〕に記載の細胞透過性ペプチド。
　〔３〕前記細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、〔１〕または〔２〕に記載の細胞透過性ペプチド。
　〔４〕配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
　〔５〕配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
　〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
　〔７〕〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを核内の薬剤送達キャリアとして含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
　〔８〕薬剤が、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端部分および／またはＣ末端部分に結合する、〔６〕または〔７〕に記載の医薬組成物。
　〔９〕薬剤が、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ビンデシン、メトトレキサート、レチノイン酸、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビンおよびオテラシルカリウムからなる群から選択される、〔８〕に記載の医薬組成物。
　〔１０〕がんが、上皮細胞がんまたは癌腫、非上皮性がんまたは肉腫または血液がんである、〔６〕～〔９〕のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　〔１１〕がんが、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、すい臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、骨肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、〔１０〕に記載の医薬組成物。
　本発明の細胞透過性ペプチドは、単に細胞膜を通過するのではなく、細胞膜受容体を介し、細胞膜を透過して細胞質内に移行することができる。またそれのみならず、核へ移行することもできる。さらに正常細胞には影響が少なく、標的細胞におけるアポトーシスを誘導し、腫瘍等を抑制・縮小することから、選択毒性がより高い（標的細胞へ特異的に作用する）、細胞透過性ペプチドの提供を提供することができる。細胞核内へ、活性剤送達キャリアとしての細胞透過性ペプチドも提供することができる。
図１は、正常細胞とがん細胞に対する、実施例１のアポトーシス誘導作用を示すグラフである。 図２Ａは、正常細胞と各種がん細胞に対する、実施例２の細胞死誘導作用を示すグラフである。 図２Ｂ～Ｅは、がん細胞に対する、実施例の細胞死誘導作用を示すグラフである。 図３は、実施例２とＣＤ１３が結合していることを示す、免疫沈降の画像である。 図４は、実施例２をがん細胞に投与した、共焦点顕微鏡の画像写真である。 図５ＡおよびＢは、実施例２を正常細胞または各種がん細胞に投与した、共焦点顕微鏡の画像写真である。 図６は、対照または実施例２を投与した後の腫瘍の大きさと投与日数を示すグラフである 図７は、対照、比較例４または実施例３を投与した後の腫瘍の大きさと投与日数を示すグラフである。
　本明細書で特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似したまたは均等な任意の方法および材料の使用が発明の態様において見出されるが、一部の好適な方法および材料を本明細書に記載するものとする。本発明は、記載される特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、当業者によりこれらが使用される文脈に依存して変更されてもよいことが理解されよう。また特に示さない限り、アミノ酸は左から右にアミノ基末端（Ｎ末端）→カルボキシル基末端（Ｃ末端）の向きで記述される。
　本開示を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「～を含む」、「～を含む」、および「～を含むこと」という語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は含意しないことが理解されるであろう。
　本明細書で用いられている、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明らかに別の指示がない限り複数形を含む。
　本明細書で使用される「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって接合された少なくとも２アミノ酸残基のポリマーを指すために、可換的に使用される。この用語は、特定な長さのポリマーを意味せず、そのペプチドが組換え技術を使って生産されるか、化学合成または酵素合成を用い産生されるか、天然物であるかどうかまたは単離されたかどうかを、区別することは意図されない。
　本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、その広い意味で、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に組み込まれうる任意の化合物および／または物質を指す。一部の態様において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の態様において、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、Ｄ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸である。
　本明細書で使用される「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ：ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ）という用語は、互換的に使用され、「輸送ペプチド」または「担体ペプチド」とも呼ばれる。細胞透過性ペプチドは、限定されないが、生物学的応答を引き起こすまたはその機能に影響を及ぼしうる細胞に対し、細胞膜を横断し、細胞に侵入するまたは細胞内に移行する能力を有する公知またはそれが実証されうる可変長のペプチド鎖を指す。
　本明細書で使用される「モチーフ」という用語は、特定の細胞の受容体分子によって認識されうる、または特定の構造または機能を有するペプチドを指す。
　第一の態様において、本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ）、ＲＧＨ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ＲＹＮ（Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）、ＬＹＮ（Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）、ＦＦＮ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ）およびＱＹＮ（Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）からなる群から選択される第一のモチーフと、ＮＧＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）、ＮＧＱＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ）（配列番号４４）およびＮＧＹＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ）（配列番号４５）からなる群から選択される第二のモチーフとを含み、前記第一および第二のモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。また本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ）またはＬＹＮ（Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）のどちらかで表されるモチーフと、ＮＧＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）または配列番号４４のどちらかで表されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有し、単離された細胞透過性ペプチドである。さらに本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ）モチーフおよびＮＧＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）モチーフを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。一態様において、第一または第二のモチーフは、糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合する能力があればよく、例えばβターン構造を構成するアミノ酸配列であればよい。
　本発明の一部の態様において、βターン構造を構成するアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、ＬＹＮ（Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）またはＬＹ（Ｌｅｕ－Ｔｙｒ）を有するペプチドであってよい。標的細胞の細胞質内または核内タンパク質に特異的に結合する能力があればよく、βストランド構造を構成するアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３８または配列番号４２を有するペプチドであってよい。
　また一部の態様によれば、さらにＮ末端またはＣ末端にランダムコイル構造が付加されてもよい。ランダムコイル構造を構成するアミノ酸配列は、親水性を高めるアミノ酸配列であればよい。例えば、限定されないが、Ｎ末側のアミノ酸配列は、ＫＤ（Ｌｙｓ－Ａｓｐ）、ＴＤ（Ｔｈｒ－Ａｓｐ）、ＫＴ（Ｌｙｓ－Ｔｈｒ）、ＫＨ（Ｌｙｓ－Ｈｉｓ）、ＫＲ（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）、ＫＮ（Ｌｙｓ－Ａｓｎ）またはＫＨＧ（Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ）を有するペプチドであってよい。Ｃ末側のアミノ酸配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号４３を有するペプチドであってよい。
　本発明の一部の態様によれば、細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、細胞透過性ペプチドであってよい。一部の態様において、細胞透過性ペプチドの完全長は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０アミノ酸残基以下のペプチドであってよい。さらに任意で、細胞透過性ペプチドの細胞透過能力を抑制することなしに１、２、３、４または５個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されている断片、またはかかる断片の配列変異体を含むアミノ酸配列を有してもよい。また細胞透過性ペプチド中のアミノ酸の欠失、他のアミノ酸で置換または付加は、それぞれ独立して、または同時に起こってもよい。
　一態様において、限定されないが、ＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＶＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号１）、ＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＩＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号２）、ＴＤＴＲＧＮＬＬＱＣＩＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号３）、ＫＴＤＳＲＧＨＶＬＱＣＬＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号４）、ＫＨＧＲＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号５）、ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号６）、ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号７）、ＫＮＧＦＦＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号８）、ＫＲＧＱＹＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＹＲＧＥＣＷＣ（配列番号９）およびＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＬＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号３４）からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、単離された細胞透過性ペプチドであってよい。また一態様において、細胞透過性ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
　また一部の態様において、限定されないが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってよいし、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってもよい。一態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択される、アミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってもよい。
　本明細書で使用される「特異的に」という用語は、非特異的である糖タンパク質の親和性と比べ、特異的である糖タンパク質に対し有意に高い結合親和性（例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０倍高い結合親和性）を有する糖タンパク質を指す。
　本明細書で使用される「糖タンパク質」という用語は、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものを指す。
　本明細書で使用される「細胞膜受容体」という用語は、細胞膜に表面に存在するタンパク質（複合タンパク質を含む）だけでなく、細胞膜を貫通し細胞質中にもそのタンパク質の一部が存在するタンパク質をも指す。
　本発明の別の態様によれば、本発明は、標的細胞の糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合する、細胞透過性ペプチドでよい。一部の態様において、細胞表面の糖タンパク質または細胞膜受容体は、細胞マーカーであってよく、例えば、限定されないが、細胞マーカーは、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、骨髄系、赤芽球系または巨核球系のマーカー、またはがん幹細胞マーカーであってよい。一態様において、細胞表面の糖タンパク質または細胞膜受容体は、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６、ＣＤ３３８またはＣＤ３４０であってよい。
　本明細書において、「アポトーシスを誘導する」は、標的細胞を死滅させるまたは細胞死させると言い換えてよい。
　本発明の別の態様によれば、細胞透過性ペプチドは、標的細胞におけるアポトーシスを誘導する。
　本発明の別の態様において、標的細胞は、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、骨髄系、赤芽球系または巨核球系のマーカー、またはがん幹細胞マーカーを発現する細胞であってよい。また標的細胞は、例えば、限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６、ＣＤ３３８またはＣＤ３４０を発現する細胞であってよい。標的細胞は、障害または状態に罹患しているそれらの細胞を指し、細胞増殖障害に罹患したこれらの細胞、限定されないが、例示的には、悪性腫瘍、すなわち、上皮細胞がんまたは癌腫、非上皮性がんまたは肉腫または血液がん（血液性細胞がん）などのがん細胞または腫瘍細胞であってよく、かかるがん細胞または腫瘍細胞は、肝細胞癌（肝細胞癌または胆管癌）、すい臓癌、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌または肺癌（小細胞肺癌または非小細胞性肺癌）、喉頭癌、咽頭癌または舌癌などの上皮細胞がんまたは癌腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫または血管肉腫などの肉腫（非上皮細胞がん）、または白血病、すなわち、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫または多発性骨髄腫などの血液がんであってもよい。
　本発明の別の態様によれば、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤が、細胞透過性ペプチドの末端部分に直接またはリンカーにより結合または付加されてよい。別の態様において、リンカーは、水溶性高分子であってよい。また一部の態様において、例えば限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または、アジド－アルキン付加環化反応を起こすアジ化物（Ａｚｉｄｅ）またはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）などのクリックケミストリー試薬であってよい。一部の態様によれば、活性剤または薬剤が、細胞透過性ペプチドのアミノ基末端（Ｎ末端）部分および／またはカルボキシル基末端（Ｃ末端）部分に直接結合されてよい。
　本発明の一部の態様によれば、活性剤または薬剤は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカリド、脂質、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、小分子薬物、またはその他のいずれの生物学的活性物質であってよい。一部の態様において、活性剤または薬剤は、細胞内で作用してもよく、または標的細胞内部の成分に対して特異的であってよく、さらに、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤であってもよい。一態様において、活性剤または薬剤としては、細胞毒性放射性核種、化学毒素、またはタンパク質毒素であってもよい。また一態様において、活性剤または薬剤は、抗がん剤または抗腫瘍剤であってよく、例えば限定されないが、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、レチノイン酸、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ドセタキセル、ブレオマイシン、フルオロウラシル、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビン、オテラシルカリウムまたは酸化鉄ナノ粒子であってもよい。
　本発明の別の側面によれば、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、医薬または医薬組成物であってよい。また本発明は、ＲＧＮモチーフおよびＮＧＲモチーフを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、医薬または医薬組成物であってよい。本発明の医薬または医薬組成物においては、有効成分の効果を妨げない限り、有効成分を他の任意成分と組み合わせてよい。一部の態様において、医薬組成物には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤を含んでよく、さらに不活性希釈剤、平滑剤、緩衝剤、またはアジュバント、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤またはバッファーなどを含んでもよい。医薬組成物は、例えば、限定されないが、経口投与、非経口投与または直腸投与などであってよい。また本発明の医薬組成物は、固形形態（制限されずに、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末または坐薬を含む）、または、液体形態（制限されずに、溶液、懸濁液またはエマルションを含む）であってよい。さらに、投与経路や薬物放出様式などに応じて、本発明の医薬または医薬組成物を、適切な材料、例えば時限崩壊性の材料等で被覆してよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
　本明細書に記載され本発明の医薬または医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
　本明細書で使用される「処置」または「予防」という用語は、状態、病気、症状または望ましくないその副作用の抑制、軽減、遅延、緩和および除去を含む。
　本発明の一部の態様において、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための組成物、医薬組成物もしくは医薬である。また本発明は、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための細胞透過性ペプチドまたは組成物、医薬組成物もしくは医薬である。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍は、肝細胞癌（肝細胞癌または胆管癌）、すい臓癌、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌（小細胞肺癌または非小細胞性肺癌）、喉頭癌、咽頭癌または舌癌などの上皮細胞がんまたは癌腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫または血管肉腫などの肉腫（非上皮細胞がん）、または白血病、悪性リンパ腫または多発性骨髄腫などの血液がんであってよい。
　本発明の一部の態様において、本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドであってもよい。
　本明細書で使用される「キャリア」という用語は、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤輸送体を言い、それ自身輸送される活性剤または薬剤と相互または補助作用を有していてよく、およびそれ自身何らかの活性を有していてもよい。
　本発明の一部の態様において、本発明は、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアであって、前記キャリアが、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。本発明は、キャリアが、糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合してよい。また、ある態様において、本発明は、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のための細胞透過性ペプチドまたはキャリアペプチドもしくはキャリアであってよい。さらに、本発明のキャリアの標的細胞（または悪性腫瘍）が、上皮細胞がんまたは癌腫、肉腫または血液がんであってよく、例示的には、限定されないが上記した通りである。また細胞透過性ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択される、アミノ酸配列であってよく、例示的な、標的細胞の糖たんぱく質または細胞膜受容体、標的細胞、およびキャリアに付加し得る活性剤または薬剤などは上記した通りである。
　本発明の一部の態様において、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドを、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのまたはキャリアペプチドもしくはキャリアとして含有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物であってよい。また限定されないが、例示的なアミノ酸配列、標的細胞の糖タンパク質または細胞膜受容体、標的細胞（または悪性腫瘍）、および活性剤または薬剤などは上記した通りである。さらに上記組成物に含まれてよい、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤、または不活性希釈剤などは、限定されないが、上記した通りである。
　本発明のまた別の側面によれば、本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物の製造における、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチド、または薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアの使用であってよい。また本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物の製造における、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドの使用であってよい。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍、医薬または医薬組成物の用途、細胞透過性ペプチドまたは薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアが有してよいアミノ酸配列、標的細胞の糖たんぱく質または細胞膜受容体、標的細胞（または悪性腫瘍）、および活性剤または薬剤、含んでよい薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤、さらに不活性希釈剤、平滑剤または緩衝剤などは、上記した通りである。
　本発明のさらなる別の側面によれば、本発明は、対象において、がんまたは腫瘍を処置または予防するための方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象へ、治療的に有効量の、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドまたは、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアを投与することを含む、前記方法である。また本発明は、対象において、がんまたは腫瘍を処置または予防するための方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象へ、治療的に有効量の、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを投与することを含む、前記方法である。一態様によれば、対象が、ヒトまたは、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、トリ、カメ、スッポンまたはゼブラフィッシュなどの非ヒト哺乳類対象であってよい。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍は、上記した通りである。
　本明細書に記載される本発明の各種方法における有効量とは、例えば、がんに関しては、がん細胞の死滅を促進し、または、がん細胞を死滅させる量であってよく、がん細胞の増殖に関しては、細胞の増殖を抑制、または、細胞増殖を遅延する量であってよい。疾患の処置に関しては、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であってよく、疾患を抑制し、または治癒する量でもある。かかる量は、培養細胞などを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験や、マウス、ラット、イヌ、ブタまたはサルなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する有効成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、がんの状態やステージ、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　また一部の態様において、本発明は、少なくとも４、３、２または１日ごと、または１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）で、経口、門脈内、静脈内、筋肉内、皮下、経鼻、経肺、経皮、局所、腫瘍内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内、子宮内、舌下または直腸投与で、約２．５、５、７．５、１０．０、１２．５または１５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５～１５ｍｇ／ｋｇの範囲内で対象に投与されてよい。また本発明の１日総投与量は、限定されずに、例えば、約１μｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約１００μg／ｋｇ～約１０ｍｇ／体重ｋｇなどであってよい。例示的ながんまたは腫瘍、細胞透過性ペプチドまたは薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアが有してよいアミノ酸配列、標的細胞（または悪性腫瘍）などは、上記した通りである。
　本発明を以下の例でさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず、本発明を決して限定するものではない。
　図１、２Ａ－Ｅ、６および７において、有意差検定は、両側ｔ－検定を行った。５％または１％水準で有意差が認められた場合、それぞれ＊または＊＊印で示した。
　ペプチドの作成
　本発明で用いるペプチドは、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。本発明で用いるペプチドまたは薬剤を付加したペプチドは、当業者に公知の一般法に従って調製され得る。なおペプチドは、株式会社医学生物学研究所（日本）またはジェンスクリプトジャパン株式会社（日本）に委託により作成した。合成方法を簡単に述べると、Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－クロトトリチルクロライド（ＣＴＣ）樹脂（Ｍｅｒｃｋ）を、ＤＭＦで膨潤した。次に、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（４当量）、ＤＩＣ（４当量）およびＨＯＢｔ（４当量）の条件下で１時間撹拌し、カップリング反応により、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｖａｌ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）をそれぞれ順次導入した。さらに樹脂を２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理した後、メタノールで洗浄および乾燥し、ペプチド－樹脂を得た。得られたペプチド－樹脂１００ｍｇを、３ｍＬのクリーベイジカクテル（ＴＦＡ／１，２ーエタンジチオール／チオアニソール／フェノール／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン＝６８．５／１０／１０／５／３．５／１Ｖ／Ｖ）で、３０℃で４時間処理した。さらに、これに冷ジエチルエーテルを添加し、室温で乾燥させた。続いて、得られたペプチドを、逆相－ＨＰＬＣにより、カラム：Ｃ１８、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出：Ａ液（１００％水、０．１％ＴＦＡ）とＢ液（１００％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）の直線的勾配および検出：２１０ｎｍの条件下で、分取精製したペプチドを実施例１（配列番号１）（株式会社医学生物学研究所）とした。
　また上記ペプチド－樹脂に、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、上記同様に精製したペプチドを実施例２（配列番号３２）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。
　さらに上記ペプチド－樹脂を、ＤＭＦ溶媒中において、Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（ＣＬＩＣＫ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＴＯＯＬＳ）を当量で混合した。さらに、この溶液に１０倍当量のＤＩＥＡを加え、室温で１時間撹拌し、得られたペプチド（Ｍ．Ｗ．２７２５．０９、９５％、１００．５ｍｇ、ＴＦＡ　ｆｒｅｅ）（株式会社ピーエイチジャパン）を、滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で、５０ｍｇ／ｍｌ（１７．５ｍＭ）に調整した。滅菌したＭｉｌｌｉ－Ｑ水で溶解したＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（Ｄｏｘ）（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）４ｍｌ（１１ｍｇ／ｍｌ）に１ｍｌの０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ５．５）を添加した後、２０ｍｌの滅菌したＭｉｌｌｉ－Ｑ水を添加し、これをＤｏｘ溶解液とした。その一方で、ＤＭＳＯで溶解したＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒ（Ｃｌｉｃｋ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｔｏｏｌｓ、ＡＺ、ＵＳＡ）溶液（２５ｍｇ/ｍｌ）０．５ｍｌと、７．５ｍｌのＤｏｘ溶解液を室温で３時間混和した。反応液を、Ａバッファー（０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸（富士フィルム和光純薬））で平衡化した１ｍｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　１５　ＲＰＣカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させた。その後ＡバッファーとＢバッファー（０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸を含むアセトニトリル（ＡＮＣ）（富士フィルム和光純薬）９０：水１０）の３０～４４％線状勾配で、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、Ｄｏｘ－ＰＥＧ５－ＤＢＣＯ画分を分画した。同時に２１０ｎｍから５００ｎｍまでの吸光度をモニタリングした。分取した上記画分を、遠心式濃縮機で濃縮し、ＤＭＳＯで６７ｍｇ／ｍｌ（５２．６ｍＭ）の濃度になるように溶解した。上記の得られたペプチドと調整したＤｏｘ－ＰＥＧ５－ＤＢＣＯ溶液を、モル比１：１の割合で、ＤＭＳＯ中で室温３時間混和した。得られた反応溶液を上記カラムに吸着させた後、ＡバッファーとＢバッファーを用い、２０～４５％線状勾配で、上記と同様に分画した。さらに上記同様に濃縮した後、滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で溶解し、これを実施例３（配列番号３３）とした。
　また上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、ＶａｌおよびＣｙｓ（Ｔｒｔ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを比較例１（配列番号２９）（株式会社医学生物学研究所）とした。
　さらに上記ＣＴＣ樹脂にＡｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＣｙｓ（Ｔｒｔ）を、実施例１と同様の手順で順次導入した。次に、得られたペプチド－樹脂を、ペプチド濃度１ｍｇ/ｍｌ下で、水：ＤＭＳＯ＝１：１の溶媒で２４時間の酸化反応した後、上記同様、分取精製したペプチドを比較例３（配列番号３１）（株式会社医学生物学研究所）とした。
　また上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号３４）。また、結果として得られたペプチド－樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例４（配列番号３５）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。
　さらに上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｉｌｅ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号２）。また、結果として得られたペプチド－樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例５（配列番号３６）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。
　また上記ＣＴＣ樹脂にＴｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号６）。また、結果として得られたペプチド－樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例６（配列番号３７）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。
　Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｗａｎｇ樹脂（Ｍｅｒｃｋ）を用い、５％のピペリジン含有のＤＭＦ（０．１％ＨＯＢｔ）でＮ末端Ｆｍｏｃを脱保護した後、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＧｌｙを、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを比較例２（配列番号３０）（株式会社医学生物学研究所）とした。
　実施例１～６および比較例１～３のアミノ酸配列一次構造情報は、マトリクス支援レーザー励起イオン化法スペクトルで確認し、精製度は逆相－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）で解析し、９８％以上であることを確認した。
　細胞培養
　ミトコンドリア膜電位の変化測定試験では、ヒト線維肉腫由来ＨＴ－１０８０細胞（ＨＴ－１０８０細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）を、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験および実施例２の核移行試験では、ＨＴ－１０８０細胞、ヒト骨肉腫細胞株Ｈｏｓ細胞（Ｈｏｓ細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト組織球性リンパ腫・マクロファージＵ９３７細胞（Ｕ９３７細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ－６０細胞（ＨＬ－６０細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、急性単球性白血病ＴＨＰ－１細胞（ＴＨＰ－１細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９細胞（Ａ５４９細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）、ヒト膵臓がん細胞ＭＩＡ　Ｐａｃａ２細胞（ＭＩＡ　Ｐａｃａ２細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）および高分化型ヒト肝癌由来細胞株ＨｕＨ７細胞（ＨｕＨ７細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）を、がん細胞として用いた、また、対照として正常ヒト歯肉線維芽細胞Ｇｉｎ－１（Ｇｉｎ－１細胞、（株）ＤＳファーマバイオメディカル）を用いた。上記細胞を、それぞれ９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に５０００個／１００μｌで播種し、以下の試験に供した。
　がんマウスの作成
　ＨＴ－１０８０細胞（１×１０７個／２００μｌ）を５週齢ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールス・リバー）の背中へ皮下移植した。さらに、移植後の腫瘍が３０～６０ｍｍ３に達したことを確認した後、これを以下の試験に供した。
　試験例１　ミトコンドリア膜電位の変化測定試験
　実施例１、比較例１～３の合成ペプチドをそれぞれ細胞に添加して、血清添加培地（α－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で培養し、またコントロールとして血清添加培地（α－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）のみで培養した。７日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄し、２μＭのＪＣ－１で、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器中で３０分間染色した。さらにＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳを１００μｌ添加し、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００（Ｚｅｉｓｓ）で画像を取得した後、ＩｍａｇｅＪで解析した。
　図１は、縦軸にアポトーシス率（ＪＣ１染色グリーン細胞数／全細胞数×１００（％））の平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸に、実施例１、比較例１、比較例２および比較例３を示す。実施例１の左中央右のバーにおいて、左側のバーは２５μｇ／ｍｌ、中央のバーは５０μｇ／ｍｌ、右側のバーは１００μｇ／ｍｌのそれぞれの添加したペプチド濃度を示す。比較例１、比較例２および比較例３の左右のバーにおいて、左側のバーは５０μｇ／ｍｌ、右側のバーは１００μｇ／ｍｌのそれぞれの添加したペプチド濃度を示す。実施例１で刺激したときのみ、ＨＴ－１０８０細胞に対してアポトーシス率の上昇が認められた。その一方で、比較例１、比較例２、および比較例３では、ＨＴ－１０８０細胞のアポトーシス率の上昇は観察されなかった。またＧｉｎ－１細胞へ、実施例１の５０μｇ／ｍｌ投与では、アポトーシス率の上昇は観察されなかった。本発明の細胞透過性ペプチドが、正常細胞には影響を及ぼさないが、がん細胞においてアポトーシス誘導作用を有することが実証された。
　試験例２Ａ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験をするために、配列番号１のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチド（実施例２）用いた。実施例２を１００μｌ添加し、さらに１０％ＦＢＳを加え、血清添加培地（Ａｌｐｈａ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ（α－ＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ＦＢＳ）２００μｌの条件下で９日間、培養した試験例を作成した。さらに実施例２添加培地を７日間ごとに全量交換し２１日間培養した試験例も作成した。また対照としは血清添加培地（α－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）のみで培養した細胞を用いた。培養終了後、上清を除きＰＢＳで一回洗浄、生細胞染色用蛍光色素Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学研究所）（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）と死細胞染色用蛍光色素Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（同仁化学研究所）（最終濃度０．３μｇ／ｍｌ）添加したＰＢＳ中で、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器内で３０分間染色した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭとＰＩで生細胞と死細胞を染め分けた画像を取得した。次に、ＩｍａｇｅＪを用い、全細胞数に対する死細胞の比率の解析を行った。
　結果は、死細胞率（ＰＩ染色赤色細胞数／全細胞数×１００（％））の平均値±ＳＤ（標準偏差）で示された。図２Ａは、縦軸に各細胞に対する実施例２（５０μｇ／ｍｌ）で９日間培養した時点の死細胞率、横軸に各種細胞を示す。Ｇｉｎ－１細胞に対する死細胞率の上昇は観察されなかった。一方、ＨＴ－１０８０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨＬ－６０細胞およびＨｏｓ細胞に対する死細胞率の上昇は１％水準で有意差が認められた。ＴＨＰ－１細胞に対しては５％水準で有意差が認められた。培養２１日目ＨＴ－１０８０細胞へ、６．２５および１２．５μｇ／ｍｌの実施例２投与では、約７５％以上の死細胞率の上昇がそれぞれ観察された。さらに、２５、５０および１００μｇ／ｍｌ投与結果は９５％以上の死細胞率の上昇が認められた（図示せず）。本発明の細胞透過性ペプチドは、正常細胞においては細胞死誘導作用を有さないが、がん細胞においては細胞死誘導作用を有することから、非常に高い選択毒性が実証された。
　試験例２Ｂ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験をするために、配列番号３４のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例４、配列番号２のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例５、および配列番号６のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例６として用いた。
　実施例２および４～６をそれぞれ１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌとなるよう調整し、上記試験例２Ａと同じ方法でＨＴ－１０８０細胞を用い、９日間の投与試験を行った。細胞染色および、その後の全細胞数に対する死細胞の比率解析は上記試験例２Ａと同様に行った。
　図２Ｂは、縦軸にＨＴ１０８０細胞に対する実施例２または実施例４～６（それぞれ、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌ）で９日間培養した時点の死細胞率、横軸に各実施例およびその投与濃度、または対照を示す。ＨＴ－１０８０細胞に対する死細胞率の上昇は１％水準で有意差が認められた。実施例２の５０および１００μｇ／ｍｌ投与では、少なくとも６０％以上を示した。実施例４および５の同様の投与濃度では、それぞれ少なくとも６０％および５０％以上の死細胞率を示した。また投与濃度が、２５および１２．５μｇ／ｍｌである、実施例２、４および５では、それぞれおよそ５０％～４０％の死細胞率を示した。とりわけ実施例６は、その投与濃度が１２．５μｇ／ｍｌであっても、１００μｇ／ｍｌの投与濃度とほぼ同等な死細胞率を示し、約３５％の死細胞率を維持した。本実験によって、実施例２、４～６が、１２．５μｇ／ｍｌの投与濃度でも有効であることが示された。
　試験例２Ｃ～Ｅ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
　実施例２の投与量を５０μｇ／ｍｌになるよう調整し、上記試験例２Ａと同じ方法でＡ５４９細胞、ＭＩＡ　Ｐａｃａ２細胞またはＨｕＨ７細胞を用い、９日、１６日または２３日間の投与試験を行った。細胞染色および、その後の全細胞数に対する死細胞の比率解析は上記試験例２Ａと同様に行った。
　図２Ｃ～Ｅは、縦軸に各種細胞に対する実施例２（５０μｇ／ｍｌ）で９、１６日または２３日間培養した時点の死細胞率を、横軸に実施例２または対照を示す。各いずれの細胞においても死細胞率の上昇は、１％水準で有意差が認められた。図２Ｃに示されるＡ５４９細胞への投与試験では、培養９日目では、約５０％近く、１６日目では、約６０％近く、２１日目では、約８０％以上の死細胞率がそれぞれ確認された。また図２Ｄに示されるＭＩＡ　Ｐａｃａ２細胞への投与試験では、９日目では約１０％程度の死細胞率であったが、１６日目では約５０％程度、２３日目では、約８０％の死細胞率を実証した。これは、有効手立ての少ないすい臓癌に対し、本発明が有効であることを示す。またこれらのがん細胞に対し、日を追うごとに実施例２の効果があることを示す。これに対し、図２Ｅに示されるＨｕＨ７細胞への投与試験では、投与９日目と１６および２３日目の効果がほぼ同じであり、投与初期から、がん細胞死滅効果が実証された。これにより、本発明の上皮細胞がんへの有効性が確認された。
　試験例３　免疫沈降による結合タンパク質解析試験
　実施例２（８０μｇ／４００μｌ）をＨＴ１０８０細胞（４０００万個）に４℃で２時間作用させた。次いでＰＢＳで洗浄後、遠心した細胞を、Ｈａｌｔ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　＆　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ，ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１０μｌ）添加したＩＰ　Ｌｙｓｉｓ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ　１０００μｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４℃、５分間の条件で溶解した。４℃で１０分間遠心分離し、上清を採取した。タンパク質１ｍｇとした上清に、８０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で１時間撹拌し、さらに１分間遠心分離し、これを前処理溶解液とした。前処理溶解液（１ｍｇ／６００μｌ）に、ＩｇＧ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１０μｇ、またはＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μｇをそれぞれ添加して、４℃で一晩振とうした。その後、２０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で２時間振とうした。上記洗浄バッファーで３回洗浄後、Ａ／Ｇアガロースに２×Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｌａｎｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２０μｌを添加した。これを１００℃で５分間加熱し、１分間遠心分離した後、サンプルを回収した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（８％）にロードした。ウェスタンブロティングでは、１次抗体として、ＰＥ標識ヒトＣＤ１３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＷＭ－１５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩｇＧ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）またはＨＲＰ－標識抗ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＭＢＬライフサイエンス）、２次抗体としてＨＲＰ－標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いた。
　図３の左のレーンには、免疫沈降に用いた溶解液の１０％をロードした。中央のレーンには、ＩｇＧ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　（ＦＩＴＣ）で免疫沈降したサンプルをロードした。右のレーンには、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌで免疫沈降したサンプルをロードした。右のレーンではＣＤ１３が検出されなかったが、中央のレーンでは、ＣＤ１３が検出された。すなわち、実施例２が細胞膜上のＣＤ１３に特異的に結合することが証明された。
　試験例４　実施例２における、細胞膜への結合試験
　ＰＥ標識ヒトＣＤ１３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＷＭ－１５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（１μｇ／１００μｌ）と実施例２（１μｇ／１００μｌ）を各細胞（５０万個／１００μｌ）に添加し、４℃で１時間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＴ１０８０細胞の蛍光強度を基準に各細胞のＣＤ１３発現と実施例２の結合部位を、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で観察した。ＨＴ１０８０細胞とＧｉｎ－１細胞には、最もＣＤ１３（赤色）発現が強く、実施例２（緑色）の発光も強かった。さらに重ね合わせ写真では、強い黄色が観察されたことから、実施例２とＣＤ１３は共局在していることが観察された。さらに、ＣＤ１３の発現がＵ９３７細胞、ＨＬ－６０細胞、ＴＨＰ－１細胞およびＨｏｓ細胞でも上記と同様の現象が認められた（図示せず）。
　試験例５Ａ　がん細胞における、実施例２の核移行試験
　実施例２を最終的濃度５０μｇ／ｍｌになるように、血清添加培地（α－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）２００μｌ下で、３日または９日間培養した。なお培養３日間では、細胞死が認められなかった。一方で、培養９日間では細胞死が認められたため、上記細胞培養日数で試験した。上記それぞれの細胞をはがして、Ｃｅｌｌｖｉｅｗガラスボトムシャーレ（３５×１０ｍｍ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。培養３日目の細胞は、１０％ホルマリンエタノールで固定した後、ＤＡＰＩ染色した。培養９日目の細胞は、固定せずに、ＤＡＰＩ染色した。さらに経時的に共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で観察した。
　図４は、ＨＴ１０８０細胞培養３日目および９日目における、実施例２（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）、実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせ、および微分干渉像の写真である。３日目のＨＴ１０８０細胞では、実施例２（緑色）が核染色のＤＡＰＩ（青色）の周りの細胞質に存在していた。しかし、９日目のＨＴ１０８０細胞中の実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈することから、実施例２は核に移行し染色体ＤＮＡと結合していることが確認された。
　さらにＧｉｎ－１細胞または上記がん細胞に、５０μｇ／ｍｌの濃度で実施例２を添加し９日間培養後、ＤＡＰＩ染色後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００でＺスキャンを行った。図５Ａは、Ｇｉｎ－１細胞または上記がん細胞における実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせた、ＸＹ、ＸＺおよびＹＺ断面のそれぞれの写真である。Ｇｉｎ－１細胞の核は、ＤＡＰＩによって染色されず、実施例２が、細胞質に留まっていることがＸＺ断面、ＹＺ断面からも確認された。一方、Ｕ９３７細胞、ＨＬ－６０細胞、ＴＨＰ－１細胞およびＨｏｓ細胞は、実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈した。さらにそれぞれの細胞のＸＺ断面，ＹＺ断面から実施例２が核に移行し、染色体ＤＮＡと結合していたことが確認された。
　同様に、Ａ５４９細胞、ＭＩＡ　Ｐａｃａ２細胞およびＨｕＨ７細胞でも５０μｇ／ｍｌの濃度で実施例２を添加し２３日間培養後、ＤＡＰＩ染色後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００でＺスキャンを行った。図５Ｂは、各種がん細胞における実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせた、ＸＹ、ＸＺおよびＹＺ断面のそれぞれの写真である。結果は、実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈した。またそれぞれの細胞のＸＺ断面、ＹＺ断面から、実施例２が核に移行し、染色体ＤＮＡと結合していたことが確認された。
　試験例５Ｂ　実施例２が結合する細胞質内および核内タンパク質の解析試験
　実施例２を最終的濃度５０μｇ／ｍｌになるように、血清添加培地（α－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）４ｍｌに調整し、ＨＴ１０８０細胞（２０００万個）を、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器中で５日間培養した。ＰＢＳで洗浄、細胞を回収後、ＮＥ－ＰＥＲ　Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（ＰＩＥＲＣＥ）で、細胞質と核からタンパク質をそれぞれ回収した。細胞質および核のタンパク質１ｍｇに、８０μｌのＡ／Ｇアガロースをそれぞれ加え、４℃で１時間撹拌し試料の前処理を行った。前処理溶解液（１ｍｇ／６００μｌ）に、ＩｇＧ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１０μｇを添加して、４℃で一晩振とうした。その後、２０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で２時間振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、Ａ／ＧアガロースにＥｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加しサンプルを回収、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌを添加しｐＨを中性に調整し、これを実施例２に結合するタンパク質同定のための試料として用いた。Ｗａｔｅｒｓ　Ｘｅｖｏ　Ｇ２－ＸＳ　Ｑｔｏｆ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｘｅｖｏ　Ｇ２－ＸＳ）を用い、ショットガン解析により網羅的にタンパク質を同定した。
　下表は、検出されたタンパク質から免疫沈降に用いた抗体と実施例２を除いた、細胞質および核から同定されたタンパク質を、アクセッション番号、タンパク質名称、検出されたペプチドの同定数、特異的なペプチドの同定数、信頼性スコア、細胞質内タンパク質量（ｆｍｏｌ）および核内タンパク質量（ｆｍｏｌ）で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　解析の結果、リンカー・ヒストンＨ１―３、コア・ヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３－２、Ｈ４）および、４０Ｓを構成する２２種類および６０Ｓを構成する２８種類のリボソームタンパク質が、それぞれ同定された。さらに４０Ｓおよび６０Ｓリボゾームタンパク質が細胞質内より、核内で多く検出された。これは、実施例２が、核に移行後、核内にも存在する４０Ｓおよび６０Ｓリボゾームタンパク質に結合することを示す。上記解析により、実施例２が核内に移行し得ることが、生化学的にも実証された。
　試験例６　がんマウスにおける、実施例２のがん細胞増殖抑制およびアポトーシス試験
　実施例２を無菌水で溶解し、２倍濃度α－ＭＥＭ（グルタミンおよび抗生物質を含まない）を加え、２００μｇ／２００μｌへ調整した。これを、がんマウスの腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇになるように３日ごとに投与した。対照投与群には、２００μｌの１倍濃度α－ＭＥＭを用い、これをがんマウスの腹腔内に３日ごとに投与した。３日ごとにＤＲＥＴＥＣ体重計（株式会社ドリテック、Ｊａｐａｎ）で体重を測定し、ノギス（最大１５０ｍｍ、最小０．０５ｍｍ）（ＭＩＴＵＴＯＹＯ、Ｊａｐａｎ）で腫瘍の大きさ（推定体積（短径×長径×高さ×π／６ｍｍ３））を測定した。
　図６に実施例２投与群（Ｎ=６）と対照投与群（Ｎ＝６）の腫瘍の大きさの変遷をグラフに表した。縦軸は腫瘍の大きさの平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸は投与後の日数を示す。対照投与群と比べ、１２日目から２４日目まで実施例２投与群は、腫瘍の増殖抑制が１％水準で有意差が認められた。対照投与群では、２４日目で１５００ｍｍ３を超えた。その一方で、実施例２を用いたマウスでは、約６００ｍｍ３で、その腫瘍成長抑制効果が確認された。さらにその後、３３日まで、腫瘍の縮小傾向が確認された。
　試験例７　がんマウスにおける、実施例３の抗がん剤送達試験
　実施例３を５ｍｇ／ｋｇ、および比較例４（Ｄｏｘ）を１．２ｍｇ／ｋｇにそれぞれなるように、実施例２と同様に処理し、これをがんマウスに供した後、同様の手法で、腫瘍の大きさを測定した。
　図７は、対照投与群（Ｎ=２）、比較例４投与群（Ｎ＝２）および実施例３投与群（Ｎ=２）の腫瘍の大きさの変遷をグラフとして示す。縦軸は腫瘍の大きさの平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸は投与後の日数をそれぞれ表す。１８日目から２４日目まで実施例３投与群は対照投与群と比較例４投与群と比べて腫瘍の増殖抑制が１％水準で有意差が認められた。対照投与群と比較例４投与群では、２４日目で約２０００ｍｍ３まで大きくなった。その一方で、実施例３投与群では、腫瘍の大きさが１８日目で８００ｍｍ３から５００ｍｍ３まで減少し、２４日までその抑制効果が確認された。すなわち、ペプチドそのものの抗がん効果だけでなく、抗がん剤の効果も重複し、大きく腫瘍を縮小させた。本発明のペプチドが、抗がん剤単独投与に比べ、標的細胞に特異的に作用し、がん細胞への高い毒性を有することを示した。また上記結果は、本発明のペプチドが、抗がん剤などの活性剤の送達キャリアとしても有効であることを実証するものである。
　本発明の細胞透過性ペプチドは、選択毒性の高い、従来の治療法とは異なる新たな手段に応用することができる。また医薬品としてだけでなく、病巣の診断にも応用でき、さらに核内に種々の活性剤を運ぶキャリアペプチドとしての使用も期待される。

Claims (11)

  1. 　ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチド。
  2. 　糖タンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
  3. 　前記細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチド。
  4. 　配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
  5. 　配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
  7. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを核内の薬剤送達キャリアとして含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
  8. 　薬剤が、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端部分および／またはＣ末端部分に結合する、請求項６または７に記載の医薬組成物。
  9. 　薬剤が、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ビンデシン、メトトレキサート、レチノイン酸、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビンおよびオテラシルカリウムからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　がんが、上皮細胞がんまたは癌腫、肉腫または血液がんである、請求項６～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 　がんが、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、すい臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、骨肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
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