CN114206372A - 未活化多肽trp的药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含未活化多肽TRP和磷脂分散剂的药物制剂。使用根据本发明的药物制剂产生抑制未活化TRP聚集、增加细胞内药物递送和降低细胞毒性以及增加药物安全性和改善治疗功效的作用。

Description

未活化多肽TRP的药物制剂

技术领域

本发明涉及一种包含未活化多肽TRP的药物制剂，且更特别地涉及一种包含未活化多肽TRP和磷脂分散剂的药物制剂。

背景技术

未活化多肽(TRP：组织再生多肽)是具有能够促进组织如骨、软骨等形成或再生，或预防器官如肾、肝、肺、心脏等纤维化和硬化的新机制的物质，并且具有含有以下的结构：PTD(蛋白转导结构域)，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD(弗林蛋白酶活化结构域)，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD(组织再生结构域)；和TRD，其通过被FAD的蛋白质原转换酶切割而活化以促进细胞中的组织生长或形成或诱导组织再生(韩国专利号10-00775958和美国专利号8,268,590)。

未活化TRP具有与常规已知的活性蛋白质如rhBMP或TGF-β完全不同的结构和特性。具体地，所有常规已知的rhBMP和TGF-β在引入人或哺乳动物细胞之前都是生物化学上活化的，并且具有三维结构(Eur.J.Biochem.,237:295,1996；J.Mol.Biol.,287:103,1999)。

因此，为了产生作为常规活化剂的rhBMP和TGF-β，存在的问题是必须依赖于如CHO等哺乳动物细胞的重组培养，这些哺乳动物细胞具有非常低的生产率。一些rhBMP，如来自BioPharm的rhBMP14(MP-52)，通过培养廉价的重组大肠杆菌而不是动物细胞来产生，但是即使在这种情况下，对要产生的BMP的生物化学结构也有许多限制。具体地，活性MP-52可以使用重组大肠杆菌产生，但使用重组大肠杆菌不易产生可以施用于人体以促进骨或软骨形成并使各种组织再生的其他活性BMP或活性TGF-β，如活性rhBMP2、rhBMP4、rhBMP7等，并且其三级或四级结构是药理作用所需的。此外，这些常规重组生长因子对温度变化敏感，并且具有室温下稳定性低的缺点(表1(重组生长因子与TRP之间差异的比较))。

相比之下，未活化TRP以弱溶性包涵体的形式存在，因此即使在室温下也具有非常高的稳定性，并且即使在酸度变化的情况下也非常稳健(表1)。

[表1]

然而，为了使用未活化TRP作为治疗剂，常规上存在的问题在于，必须通过抑制由于TRP的溶解性差而引起的聚集和沉淀来改善分散性，并且必须克服低细胞渗透性和当以高剂量施用时的细胞毒性。此外，当使用PTD将蛋白质递送到细胞中时，蛋白质递送系统(货物)的大小非常有限，并且难以递送10kd或更大的蛋白质(J.Cell Sci.,129:893-897,2016)。例如，TRP中的TRD和FAD对应于蛋白质货物，并且BMP-2为44.7kd，BMP-7为49.3kd，且HGF为83.1kd，因此使用PTD的治疗性蛋白的细胞内渗透非常有限。因此，当开发出防止疏水性蛋白聚集和增加大尺寸货物的细胞内渗透性的方法时，将可能增加TRP对治疗疾病的作用。

因此，诸位发明人已经进行了大量的努力来开发出于治疗目的而使用未活化TRP的新制剂，并且因此确定，当将未活化TRP与磷脂分散剂如蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、甘油三酯(三油酸甘油酯)、LysoPC(L-α-溶血磷脂酰胆碱)、Cremophor等一起使用时，(1)TRP聚集被抑制，(2)具有大蛋白质货物大小的TRP的细胞渗透性增加，(3)细胞毒性降低，(4)蛋白质稳定性增加，和(5)治疗作用也改善，由此完成本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种药物制剂，其能够通过抑制未活化TRP的聚集而确保分散性，增加蛋白质药物的稳定性，和改善细胞渗透性，因此提高治疗效率。

本发明的另一个目的是提供一种包含TRP2和磷脂分散剂的用于治疗纤维化疾病的组合物。

本发明的再另一个目的是提供一种治疗或预防纤维化疾病的方法，其包括施用包含TRP2和磷脂分散剂的组合物。

本发明的又另一个目的是提供一种包含TRP2和磷脂分散剂的组合物用于治疗或预防纤维化疾病的用途。

本发明的再又另一个目的是提供一种包含TRP2和磷脂分散剂的组合物用于制造用于治疗或预防纤维化疾病的药物的用途。

为了实现上述目的，本发明提供了一种药物制剂，其包含(a)含有以下结构域的未活化多肽TRP：PTD(蛋白转导结构域)，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD(弗林蛋白酶活化结构域)，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD(组织再生结构域)；和TRD，其通过被FAD的所述蛋白质原转换酶切割而活化以促进细胞中的组织生长或形成或诱导组织再生，和(b)磷脂分散剂。

另外，本发明提供了一种用于治疗纤维化疾病的组合物，其包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂。

另外，本发明提供了一种治疗或预防纤维化疾病的方法，其包括施用包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物。

另外，本发明提供了一种包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物用于治疗或预防纤维化疾病的用途。

另外，本发明提供了一种包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物用于制造用于治疗或预防纤维化疾病的药物的用途。

附图说明

图1示出TRP的DLS分析的结果(A)和使用共聚焦荧光显微镜证实的其细胞内渗透性的结果(B和C)；

图2示出通过DLS证实的当不使用分散剂时TRP的聚集(B)和使用分散剂时对TRP2的分散作用的结果；

图3示出不使用分散剂时的TRP2颗粒(TRP2)和使用蛋卵磷脂分散的TRP2颗粒(TRP2-EL)、使用大豆卵磷脂分散的TRP2颗粒(TRP2-SL)、使用LysoPC分散的TRP2颗粒(TRP-LysoPC)、使用甘油三酯分散的TRP2颗粒(TRP2-三油酸甘油酯)和使用DSPE-PEG-胺分散的TRP2颗粒(TRP2-DSPE-PEG-胺)的扫描电子显微镜图像；

图4示出在用实施例3中使用的TRP和在分散体制剂中的TRP2处理293细胞4小时后使用共聚焦显微镜在三维空间中观察到的在实施例3中使用的TRP和在分散体制剂中的TRP2的图像(上面的图像)，和通过Z堆叠(Z-stack)证实TRP2分布的图像(下面的图像)；

图5示出证实实施例3中使用的TRP和分散体制剂中的TRP2的细胞内渗透性的图像，所述图像是在用其处理293细胞4小时后使用透射电子显微镜拍摄的；

图6示出在用在实施例3中使用的TRP和在分散体制剂中的TRP2处理293细胞4小时后使用共聚焦显微镜对于内体标记物Rab7-mCherry荧光观察到的在实施例3中使用的TRP和在分散体制剂中的TRP2的图像；

图7示出证实包含磷脂乳化剂作为分散剂的TRP制剂的细胞毒性的结果；

图8示出证实当不使用分散剂时TRP快速聚集的结果(A)和当使用各种分散剂时根据时间和储存温度的聚集抑制作用的DLS测量结果(B至D)；

图9示出TRP2根据蛋卵磷脂浓度变化且根据储存时间和温度的稳定性的DLS测量结果；

图10示出在使用蛋卵磷脂分散各种量的TRP2后TRP2根据储存时间和温度的稳定性的DLS测量结果；

图11示出在使用蛋卵磷脂以各种方法分散后在冷藏状态下储存108天的TRP2的细胞内渗透性的共聚焦显微镜图像(A)和蛋白质印迹结果(B)；

图12示出在体内动物模型中根据不含分散剂的TRP2的剂量，对腹膜纤维化的抑制功效的观察结果；

图13示出在体内动物模型中根据包含Cremophor的TRP2制剂的剂量，对腹膜纤维化的抑制功效的观察结果；

图14示出在体内动物模型中根据包含蛋卵磷脂的TRP2制剂的剂量，对腹膜纤维化的抑制功效的观察结果；

图15示出在体内动物模型中根据包含大豆卵磷脂的TRP2制剂的剂量，对腹膜纤维化的抑制功效的观察结果；以及

图16示出基于对动物使用不含分散剂的TRP2和包含分散剂的TRP2的实验结果的50％有效剂量(ED50)结果。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域熟知的，并且是典型的。

本发明的未活化多肽(TRP：组织再生多肽)具有含有以下的结构：PTD(蛋白转导结构域)，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD(弗林蛋白酶活化结构域)，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD(组织再生结构域)；和TRD，其通过被FAD的所述蛋白质原转换酶切割而活化以促进细胞中的组织生长或形成或诱导组织再生，并且本发明的未活化多肽是具有能够促进组织如骨、软骨等形成或再生，或预防器官如肾、肝、肺、心脏等纤维化和硬化的新机制的物质(韩国专利号10-00775958和美国专利号8,268,590)。

未活化TRP以弱溶性包涵体的形式存在，因此即使在室温下也具有非常高的稳定性，并且即使在酸度变化的情况下也非常稳健。为了使用未活化TRP作为治疗剂，应当抑制由于TRP的溶解性差引起的聚集和沉淀，并且应当克服低细胞渗透性和当以高剂量施用时的细胞毒性。

TRP是具有渗透细胞的机制的物质，并通过在细胞质中重折叠和加工而活化。为了增加其药理作用，绝对需要通过抑制肽制剂的聚集来确保物理化学均匀性，并增加具有非常大分子量(约50kd)的蛋白质如TRP2的细胞内渗透性。

在本发明中，以开发抑制未活化TRP聚集的制剂为目标，证实了各种聚集抑制剂和分散剂的TRP聚集抑制作用。结果，证实了含有磷脂分散剂如蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、甘油三酯(三油酸甘油酯)、LysoPC(L-α-溶血磷脂酰胆碱)、Cremophor等的TRP制剂赋予高聚集抑制作用，改善TRP的细胞渗透性，降低细胞毒性，并增加体内功效。

因此，本发明的一方面涉及一种药物制剂，其包含(a)含有以下的未活化多肽TRP：PTD(蛋白转导结构域)，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD(弗林蛋白酶活化结构域)，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD(组织再生结构域)；和TRD，其通过被FAD的所述蛋白质原转换酶切割而活化以促进细胞中的组织生长或形成或诱导组织再生，和(b)磷脂分散剂。

在本发明中，磷脂分散剂可以选自大豆卵磷脂、甘油三酯(三油酸甘油酯)、LysoPC(L-α-溶血磷脂酰胆碱)和Cremophor，但不限于此。

在本发明中，卵磷脂可以是蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、葵花油卵磷脂、油菜籽卵磷脂(canola lecithin)、棉籽卵磷脂或从动物脂肪中提取的卵磷脂，但不限于此。优选地，使用蛋卵磷脂或大豆卵磷脂，并且更优选使用蛋卵磷脂。

在本发明的一个实施方案中，TRP的聚集通过DLS(动态光散射，Otsuka，ELSZ-2000Zs)和共聚焦荧光显微术证实。大多数TRP颗粒由于聚集而以300μm或更大的大小存在，并且即使在使用共聚焦显微镜时，也以非常大的聚集体被观察到。因此，这些颗粒展现出低细胞内渗透效率，并且大部分倾向于存在于细胞膜外部(图1)。

TRP是具有渗透细胞的机制的物质，并通过在细胞质中重折叠和加工而活化。为了增加其药理作用，证实了需要通过抑制肽制剂的聚集来确保物理化学均匀性，并增加具有非常大分子量(约50kd)的蛋白质如TRP2的细胞内渗透性。

由于正常细胞具有10-20μm的大小，因此有必要制备具有5μm或更小的均匀大小的制剂以便将TRP用于治疗目的。从用于患者治疗的药理学观点来看，优选具有0.5μm或更小的均匀大小的制剂。

在本发明的另一个实施方案中，使用常规用于配制肽或抗体的糖、氨基酸、硫酸铵和乳化剂证实TRP2聚集抑制作用。对于常规的聚集抑制剂，证实了TRP聚集抑制作用不显著(表2)，并且当使用10％甘油时，证实了略微减小TRP聚集体的大小的作用。然而，即使在这种情况下，TRP大部分仍以非常大的大小存在，并且TRP存在于细胞膜外部而不是渗透细胞(图2)。

在本发明的另一个实施方案中，证实了TRP制剂的TRP聚集抑制作用，所述TRP制剂包含分散剂如Cremophor、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、LysoPC(溶血磷脂酰胆碱)、三油酸甘油酯、DOTAP、DSPE-PEG-胺和大豆油，并且磷脂乳化剂如Cremophor、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、LysoPC和三油酸甘油酯有效抑制TRP2的聚集并使得TRP2保持为胶束形式。然而，证实了主要用于弱溶性低分子量化合物的大豆油没有聚集抑制作用(表3以及图2和图3)。

在本发明的另一个实施方案中，对于已证实展现出聚集抑制作用的Cremophor、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、LysoPC和三油酸甘油酯，通过共聚焦荧光显微术和透射电子显微术证实了增加TRP的细胞膜渗透性的作用。对于仅施用TRP的细胞，TRP大部分存在于细胞膜上，但添加有乳化剂(Cremophor、蛋卵磷脂(EL)、大豆卵磷脂(SL)、LysoPC和三油酸甘油酯)的TRP2制剂由于粒度减小而呈大致均匀的形式，因此其通过细胞膜并因此在细胞质中观察到(图4和图5)，表明由于聚集抑制作用，通过减小TRP2制剂的粒度，TRP的细胞膜渗透性大大增加。证实了含有这种分散剂的TRP2制剂通过内体有效递送到细胞质中(图6)。

在本发明的另一个实施方案中，使用JuLI Stage自动细胞成像系统分析293A细胞中包含Cremophor或蛋卵磷脂的TRP制剂的细胞毒性，并且当不使用分散剂时，细胞毒性随着所用制剂的量(1μg和5μg)的增加而出现，并且蛋卵磷脂(EL)、大豆卵磷脂(SL)、甘油三酯(三油酸甘油酯)和LysoPC即使在所用制剂的量增加时也没有展现出细胞毒性(图7)。与不使用分散剂时相比，Cremophor展现出低细胞毒性，但在高剂量(5μg)下出现细胞毒性。因此，证实了蛋卵磷脂、大豆卵磷脂(SL)、甘油三酯(三油酸甘油酯)和LysoPC适用于TRP制剂。

在本发明的另一个实施方案中，为了证实包含TRP2和蛋卵磷脂的制剂的稳定性，将制剂在-20℃下冷冻，然后使其在室温下静置以评价聚集抑制能力是否随时间而保持。不含分散剂的TRP2在几分钟内快速聚集，并且聚集体的大小随时间而增加。即使在56天后，含有蛋卵磷脂的TRP2制剂的平均大小也为150nm或更小，表明聚集抑制能力保持恒定(图8)。另外，证实了包含分散剂的制剂在TRP的各种储存温度下在非常久的时间内是稳定的。

在本发明的另一个实施方案中，当使用各种浓度的蛋卵磷脂和使用各种浓度的TRP2时，证实了根据储存条件和长期储存，分散性得以保持(图9和图10)。此外，证实了在各种储存条件下，包含分散剂的TRP2的增加的细胞内渗透性得以保持(图11)。

在本发明的另一个实施方案中，当将包含分散剂(Cremophor、蛋卵磷脂或大豆卵磷脂)的TRP制剂施用于动物模型时，证实了包含分散剂的TRP2制剂在腹膜透析(PD)动物模型中的体内作用。关于对动物模型中腹膜纤维化的抑制，与不含分散剂的TRP2相比，包含分散剂的制剂显示出非常低的ED50(表5至表9以及图12至图16)。

本发明的制剂可以适用于注射，并且分散剂如蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、甘油三酯或Cremophor以基于100重量份的未活化多肽TRP计100至50,000重量份的量被包含，优选以基于100重量份TRP计200至10,000重量份的量被包含，且更优选以基于100重量份TRP计500至5,000重量份的量被包含。

本发明的未活化TRP可以如下方式制备，其中构建重组载体，其中在编码TRD的DNA的5'上游插入编码FAD的核苷酸序列、PTD的核苷酸序列、用于标记的核苷酸序列和用于分离和纯化的编码四个或更多个组氨酸的核苷酸序列，并且培养用重组载体转化的细菌并因此表达[PTD-FAD-TRD]多肽，然后向培养液中添加尿素溶液，从而去除多肽的二维结构和三维结构或者将多肽转化为一维线性结构，随后纯化[PTD-FAD-TRD]多肽。例如，其可以通过韩国专利申请公开号2006-0106606中披露的方法制备。

在本发明中，TRD可以由选自SEQ ID NO:1至13的氨基酸序列表示，但TRD不限于此，只要它是具有促进细胞中组织生长或形成或诱导组织再生的活性的蛋白质即可。这样的TRD的例子是选自BMP、TGF-β超家族、β-NGF(β-神经生长因子)、β-淀粉样蛋白、ADAM(解整合素样金属蛋白酶)、TNF-α、MMP(基质金属蛋白酶)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肝细胞生长因子和Dickkopf的多肽。

在本发明中，FAD可以由选自SEQ ID NO:14至26的氨基酸序列表示，但FAD不限于此，只要它具有蛋白质原转换酶切割位点且被细胞中的蛋白质原转换酶切割，因此活化TRD即可。此外，PTD可以选自TAT、源自果蝇的Antp肽、VP22肽和mph-1-btm，但不限于此。

本发明中使用的PTD是TAT(YGRKKRRQRRR：SEQ ID NO:27)，但本发明不限于此。PTD的例子可以包括源自果蝇的Antp肽、VP22肽(Gene Therapy,8:1,Blackbirch Press,2001)、mph-1-btm(US 2005/0147971)、PTD-3、PTD-4(Cancer Research,2001,61,474-477)、TAT48-60、穿透素(Penetratin)、聚精氨酸、CADY(FEBS Letters 2013,587-1702)等。另外，所用的用于标记的核苷酸序列是X-press标签，但是可以替代地使用Flag、Myc、Ha、GST等。

在根据本发明的产生未活化TRP的方法中，纯化步骤包括将多肽结合到镍-钛珠粒，随后用相同的溶液洗涤，然后用咪唑和高盐缓冲溶液洗脱，但是本发明不限于此。

在本发明中，蛋白质原转换酶可以是弗林蛋白酶，但不限于此。其例子可以包括PC7、PC5/6A、PC5/6B、PACE4、PC1/3、PC2、PC4等。

根据本发明的未活化TRP不具有常规活性BMP所共有的三维立构有规性，并且其自身不具有生物化学活性，但是当在人或哺乳动物体内施用时，FAD的蛋白质原转换酶切割位点在体内被细胞中存在的蛋白质原转换酶切割，从而活化TRD，并且活化的TRD分泌到细胞外，由此展现出预期效力。根据本发明的TRP优选采取其中融合有PTD、FAD和TRD的多肽的形式。根据本发明的TRP具有促进人体中的组织如骨、软骨等的形成或再生，或预防器官如肾、肝、肺、心脏等的纤维化和硬化的功能，并且进一步诱导原始组织的再生。

根据本发明的TRP可以出于实际用途通过培养细菌如重组大肠杆菌而大量生产，而不受蛋白质的生物化学结构限制，并且因为其生物化学非活性状态在体内施用前得以保持，因此其生产成本仅为用于相似用途的常规已知的活性蛋白质(rhBMP、TGF-β等)的十分之几，并且其分离、纯化、处理、储存及施用极其简单且便利。

另外，根据本发明的未活化TRP是含有以下的多肽：PTD，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD；和TRD，其通过被FAD的所述蛋白质原转换酶切割而在所述细胞中活化以促进组织生长或形成或组织再生。尽管TRP自身没有活性，但其渗透生物或细胞，然后FAD被在几乎所有细胞内大量存在的蛋白质原转换酶切割，从而活化TRD，并且活化的蛋白质分泌到细胞外，因此发挥其效力。根据本发明的TRP能够解决常规活性BMP样蛋白的所有问题，所述常规活性BMP样蛋白制备昂贵、难以储存和处理并且本质上需要受体。

根据施用方法、剂型和治疗目的，优选通过将活性成分与作为载体的药学上可接受的赋形剂或基质混合并稀释，或者通过将活性成分包封在容器形式的载体中，制备含有根据本发明的未活化TRP作为活性成分的组合物。此外，所述组合物可以与其他有益于治疗其他骨缺损的药物组合使用。在此，具有所需pH、等渗性、稳定性等的生理学上可接受的蛋白质组合物的制备可以使用本发明所属领域中已知的任何典型方法进行。

在本发明中，根据生物相容性、生物降解性、机械特性、装饰外观和界面特性，基质的优选例子包括可生物降解的化学材料，如硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸或聚酐；可生物降解的生物材料，如骨或皮肤胶原蛋白、其他纯蛋白质或细胞基质组分；不可生物降解的化学材料，如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶瓷；以及上述材料的组合，如聚乳酸、羟基磷灰石、胶原蛋白和磷酸三钙。然而，本发明不限于上面描述的载体。

在本发明中，赋形剂的例子可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、矿物油等。

同时，优选通过以粘性形式包囊或注射来使用根据本发明的含有未活化TRP的组合物，以便施用于骨损伤部位。根据本发明的组合物的剂量不受限制，因为它可以考虑所用的赋形剂或载体的类型如基质等，患者的骨重，骨损伤部位，伤骨的状况，患者的年龄、性别和饮食，怀疑感染的程度，施用时间和其他临床因素进行调整。然而，对于组合物的通常已知的有效量，考虑到骨重，可以连续或分开施用适当的量，并且可以在观察骨生长的同时确定另外的施用。

在本发明的另一个实施方案中，当将包含磷脂分散剂(Cremophor、蛋卵磷脂或大豆卵磷脂)的TRP制剂施用于动物模型时，证实了包含分散剂的TRP2制剂在腹膜透析(PD)动物模型中的体内作用。关于对动物模型中腹膜纤维化的抑制，与不含分散剂的TRP2相比，包含分散剂的制剂显示出非常低的ED50(表5至表9以及图12至图16)。

相应地，本发明的另一方面涉及一种用于治疗纤维化疾病的组合物，其包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂。

本发明的再另一方面涉及一种治疗或预防纤维化疾病的方法，其包括施用包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物。

本发明的又另一方面涉及一种包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物用于治疗或预防纤维化疾病的用途。

本发明的再又另一方面涉及一种包含100重量份的TRP2和100至50,000重量份的磷脂分散剂的组合物用于制造用于治疗或预防纤维化疾病的药物的用途。

在本发明中，纤维化疾病可以包括肝纤维化、肌肉纤维化、肺纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、腹膜纤维化、由纤维化引起的各种眼病等。这种纤维化抑制作用可以应用于各种癌症如肝癌以及慢性疾病。此外，由于BMP-7抑制TGF-β信号传导(Nature Med.2003,9,964-968)，它可以与免疫检查点抗癌药物如PD1/PDL-1抗体组合使用(Nature 2018,554,538-543)。它还可以用于各种代谢性疾病、炎症、高磷血症、和Alport综合征。

在本发明中，磷脂分散剂可以选自卵磷脂、Cremophor、甘油三酯和LysoPC(溶血磷脂酰胆碱)，其中卵磷脂可以是蛋卵磷脂或大豆卵磷脂。

实施例

通过以下实施例可以获得对本发明的更好理解。这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围，如对于本领域技术人员而言将清楚的。

特别地，在以下实施例中，作为构成TRP的TRD，仅举例说明了hBMP2和hBMP7，但是对于本领域技术人员将清楚的是，不仅可以使用源自人的BMP如hBMP3、hBMP4、hBMP6和hBMP14(MP-52)，而且还可以使用源自哺乳动物如大鼠、牛、猪等和其他高等动物的BMP。除BMP之外，本领域技术人员将清楚的是也可以使用多肽，如TGF-β超家族、β-NGF(β-神经生长因子)、β-淀粉样蛋白、ADAM(解整合素样金属蛋白酶)、TNF-α家族(包括外异蛋白-A(Eda-1))、MMP(包括MT1-MMP(膜型-基质金属蛋白酶)和MMP-2)、和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。

另外，在以下实施例中，作为构成TRP的FAD，仅举例说明了BMP的前结构域，但本领域技术人员将清楚的是FAD不受限制，只要其具有蛋白质原转换酶的切割位点且被细胞中的蛋白质原转换酶切割以活化TRD即可。

另外，在以下实施例中，使用磷脂和超声分散TRP蛋白，但是本领域技术人员将清楚的是可以使用通常用于药物制造的高压均化器或分散器。

实施例1：TRP聚集和细胞渗透性的证实

为了证实TRP的聚集，进行了DLS(动态光散射，Otsuka，ELSZ-2000Zs)和共聚焦荧光显微术。

所用的TRP是具有BMP7序列作为TRD的下列TRP2。

TRP2氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：

粗体：PTD，斜体下划线：人BMP-7，下划线：FAD

使用DLS测量从转化的大肠杆菌的包涵体分离和纯化的TRP2的粒度。结果如图1A中所示，由于聚集，大多数TRP颗粒展现出非常大且各种各样的粒度，并且在一些情况下，TRP以300μm或更大的大小存在。

将293A细胞用100ng的这种TRP2处理4小时，并将细胞固定在10％福尔马林中，用X-press单克隆抗体(Thermo Fisher R910-25)和Alexa-594标记的二抗(Thermo FisherA32744)染色，以观察TRP2，并且使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss，LSM700)观察。

基于其结果，即使在图1B的低放大率共聚焦显微镜上也观察到非常大的聚集体，并进行多层成像和立体分析(Z堆叠)以观察三维分布图。基于其结果，如图1C中所示，大多数TRP2在细胞膜外部而不是在细胞内部以聚集形式存在。因此，TRP2展现出低细胞内渗透效率，并倾向于在细胞膜外部存在。

TRP是具有渗透细胞的机制的物质，并通过在细胞质中重折叠和加工而活化。为了增加其药理作用，需要通过抑制肽制剂的聚集来确保物理化学均匀性，并增加具有非常大分子量(约50kd)的蛋白质如TRP2的细胞内渗透性。

实施例2：使用常规肽和抗体药物制剂对TRP聚集抑制作用的分析

使用常规用于配制肽或抗体的糖、氨基酸、硫酸铵和乳化剂评价TRP2聚集抑制作用。

[表2]

为此，用表2中所示浓度的各种分散剂稀释PBS中浓度为1mg/ml的重组蛋白TRP2，得到100μg/ml的TRP2，然后使其在室温下静置1小时，随后进行DLS测量。在此，基于DLS中稳定化颗粒的平均大小以半定量方式评价每种分散剂的作用(0：＞4μm；1+：＜4μm；2+：＜3μm；3+：＜2μm；4+：＜1μm；和5+：250μm)。此外，当确定存在分散作用时，通过另外测量ζ电位评价颗粒的稳定性。

[表3]

基于其结果，如表3中所示，对于重组蛋白或抗体中常规使用的聚集抑制剂，证实了TRP聚集抑制作用不显著，并且对于吐温80，证实了存在聚集作用，但是ζ电位非常低(1.63mV)，表明颗粒稳定性非常差。

此外，最常用于防止重组蛋白或抗体聚集的10％甘油略微降低TRP的聚集大小，但是即使在这种情况下，TRP2大部分仍以非常大的大小存在，由此发现10％甘油不适合用作TRP2的主要分散剂。

实施例3：使用磷脂乳化剂作为分散剂的TRP制剂的聚集抑制作用的分析

评价了TRP制剂的TRP聚集抑制作用，所述TRP制剂包含作为乳化剂的CremophorEL(Merck，238470)、蛋卵磷脂(BOC Sciences，BS18J04211)、大豆卵磷脂(TCI，L0023)、LysoPC(溶血磷脂酰胆碱)(Avanti，830071P)、三油酸甘油酯(Sigma，T7140)、DOTAP(Avanti，890890P)、DSPE-PEG-胺(Avanti，880128P)和大豆油(CJ Cheiljeang)。

为此，将PBS中浓度为1mg/ml的重组蛋白TRP2在10％甘油溶液中超声处理，并使用表3中所示的各种分散剂分散，然后使用弱超声诱导其胶束的形成。在此，使用浓度为0.1％的乳化剂确定分散乳化剂的适当浓度。使分散的TRP2在室温下静置1小时以诱导聚集，并且通过DLS测量颗粒的平均大小和分散。此外，使用扫描电子显微镜(Carl Zeiss，型号名称：Merlin)观察这些分散剂的聚集抑制作用。

[表4]

基于其结果，如表4中和图2中所示，在使用10％Cremophor(TRP-Cre)、0.1％蛋卵磷脂(TRP2-EL)、大豆卵磷脂(TRP2-SL)、LysoPC(TRP2-LysoPC)或三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)作为磷脂乳化剂分散时，TRP2的聚集被有效地抑制，并且保持了平均大小为250nm或更小的胶束形式，由此展现出优异的分散作用，如通过DLS所测量。然而，证实了主要用于弱溶性低分子量化合物的大豆油没有聚集抑制作用。

另外，如图3中所示，通过扫描电子显微术直接证实使用磷脂乳化剂的一定大小的稳定分散体(TRP2/TRP2-LysoPC制剂×10,000，标度增量为1μm；其他制剂×20,000，标度增量为20nm)。

因此，证实了磷脂乳化剂可以用作聚集抑制剂和分散剂，不同于常规的重组蛋白或抗体，磷脂乳化剂能够有效地分散TRP。

实施例4：增加包含分散剂的TRP制剂的细胞膜渗透性的作用的分析

TRP作为BMP-7的前体蛋白前药而被开发。因此，为了使TRP展现出有效的药理学活性，非常重要的是将其通过内体转运有效地递送到细胞质中。因此，试图证实显示TRP2的优异分散作用的制剂增强TRP2的胞质内渗透性。对于在实施例3中证实了展现出聚集抑制作用的Cremophor、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、LysoPC和三油酸甘油酯，通过共聚焦荧光显微术评价增强TRP的细胞膜渗透性的作用。为此，制备浓度为0.1％的蛋卵磷脂(EL)、大豆卵磷脂(SL)、LysoPC和三油酸甘油酯分散剂，并且使用10％的Cremophor(Cre)。使用每种分散剂和超声来分散TRP2，使得TRP2的浓度为100μg/ml，并且以与实施例1相同的方式，将293A细胞用其处理6小时，固定并使用X-press单克隆抗体(Thermo Fisher R910-25)和用Alexa-594标记的二抗(Thermo Fisher A32744)染色，随后使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss，LSM700)进行多层成像和立体分析。

基于其结果，如图4A中所示，在不包含分散剂的TRP2的情况下，与实施例1相似，聚集的蛋白质大部分附着到细胞膜的外部。当将25％甘油用作分散剂时，胞质内渗透略微增加，但蛋白质大部分存在于细胞膜外部，因此没有显著的作用(图4B)。但是，对于作为实施例3中显示优异蛋白质分散作用的磷脂乳化剂的蛋卵磷脂(TRP2-EL)、大豆卵磷脂(TRP2-SL)、三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)、Cremophor(TRP-Cre)和LysoPC(TRP2-LysoPC)，证实了非常大量的蛋白质被递送到细胞质中(图4C至图4G)。然而，常用于分散水不溶性药物的大豆油未增加胞质内渗透性(图4H)。

另外，为了直接证实TRP蛋白的细胞渗透性，如实施例1中那样，用2.5％乙酸双氧铀(Electron Microscopy Sciences，#22400)染色蛋白质，并使用每种分散体制剂分散蛋白质。将293A细胞用50ng在各分散体制剂中所含的TRP2处理，包埋在树脂中，并且使用电子显微镜(JEOL，JEM1011)观察。

基于其结果，如图5中所示，不含分散剂的TRP(TRP2)以聚集形式存在于细胞膜的外表面上，并且当使用分散体制剂时，证实了蛋白质通过内体很好地递送到细胞质中(以红圈表示)。

这些结果表明，含有Cremophor、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、LysoPC或三油酸甘油酯的TRP2制剂显著改善TRP的细胞膜渗透性以及聚集抑制作用。

实施例5：包含分散剂的TRP制剂对于增加使用内体进行的细胞内蛋白递送的作用的证实

在实施例3和实施例4中证实磷脂分散剂显著增加TRP2向细胞的递送以及聚集抑制作用。此外，从扫描电子显微照片可以观察到，递送到细胞质中的TRP被双层膜结构包围。这表明使用磷脂分散剂的TRP2的有效胞质内递送将利用内体途径的可能性。为此，根据生产商的说明书，使用Alexa Fluor 488(激发：494nm，发射：519nm)蛋白标记试剂盒(Invitrogen，MP10235)对TRP蛋白进行荧光标记。如实施例4中那样，使用蛋卵磷脂(TRP2-EL)、大豆卵磷脂(TRP2-SL)、三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)和LysoPC(TRP2-LysoPC)，使荧光标记的TRP分散并形成胶束。此外，为了通过荧光检测内体，将mCherry(激发：587nm，发射：610nm)荧光基因和内体标记物Rab7a(Ras相关蛋白Rab-7a)基因的融合表达载体插入pcDNA3.1(Invitrogen)中，以构建含有mCherry荧光和人Rab7a基因的mCherry-Rab7a表达载体(SEQ ID NO:29)。

将如此构建的mCherry-Rab7a表达载体转染到293A细胞以诱导表达，并且在48小时后，将细胞用100ng荧光标记的TRP2处理4小时，并且使用共聚焦显微镜观察。在此，将细胞核用NucBlue(nvitrogen，NucBlue Live ReadyProbes，R37605)染色。

基于其结果，如图6A中所示，在不含分散剂的TRP2的情况下，非常少量的TRP2被递送到细胞质中，发现其几乎不与内体标记物Rab7结合(标度增量为5μm)。然而，发现由各种磷脂制剂分散的TRP以大量递送到细胞质中，并且与实施例4相似，在与Rab7a相同的位点处存在(共定位)(图6B)。因此，可以得出结论，与常规TRP2不同，使用蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、三油酸甘油酯和LysoPC的胶束分散体使得TRP能够通过内体有效地递送到细胞质中。

实施例6：包含分散剂的TRP制剂的细胞毒性的分析

在实施例1和实施例4中发现，水不溶性TRP蛋白以附着到细胞膜表面的形式存在。此外，在实施例5中发现，使用分散体制剂形成的胶束通过内体递送到细胞质中。细胞毒性由于过量施用不含分散剂的TRP时细胞膜的破坏而出现，而当使用分散体制剂时，通过内体再循环防止细胞膜损坏成为可能。因此，使用JuLI Stage自动细胞成像系统分析293A细胞(Thermo Fisher，R70507)中每种TRP制剂的细胞毒性，以证实由于分散剂引起的细胞毒性降低作用。在此，使5000个293A细胞铺展在24孔板中，并使细胞粘附16小时。然后，用以各种浓度以各种形式分散的TRP2处理细胞，并使用安装在JuLI Stage上的实时显微镜观察细胞增殖以分析细胞毒性。

基于其结果，如图7A中所示，当在面积为约2cm²的24孔细胞培养板中以1μg或更大的高剂量使用时，未分散的TRP2引起细胞毒性。然而，0.25％蛋卵磷脂(TRP2-EL)、大豆卵磷脂(TRP2-SL)、三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)和LysoPC(TRP2-LysoPC)即使在以20μg的量使用时也未引起细胞毒性。然而，使用10％Cremophor分散的TRP2在以5μg或更大的量使用时展现出轻微毒性。因此，证实了蛋卵磷脂(TRP2-EL)、大豆卵磷脂(TRP2-SL)、三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)和LysoPC(TRP2-LysoPC)降低了细胞毒性。

实施例7：包含蛋卵磷脂的TRP制剂的稳定性的证实

在蛋白质药物中，蛋白质稳定性是影响重现性、批准、安全性和药物功效的非常重要的问题。为了证实常规TRP2的稳定性，将其在-20℃下冷冻并且使其在室温下静置，以评价聚集抑制能力是否随时间而保持。结果是，由于根据TRP的疏水物理化学特性的聚集作用，蛋白质聚集非常迅速地发生(在10分钟内)，如表1中所述(图8A)。

为了评价分散体制剂对蛋白质稳定性的影响，除实施例3至5中描述的分散体制剂作用之外，使用0.1％蛋卵磷脂分散TRP2(TRP2-EL)，并且通过DLS测量蛋白质药物随时间的稳定性。

基于其结果，如图8A中所示，使用蛋卵磷脂分散的TRP2保持非常稳定的状态达56天或更久。

储存温度对蛋白质药物的稳定性具有很大影响。为了证实这种影响，使用0.1％蛋卵磷脂分散浓度为100μg/ml的TRP2，并且测量其根据各种储存温度和时间段的稳定性。

基于其结果，如图8C中所示，证实了平均粒度为200nm或更小的非常稳定的制剂在-70℃至25℃的不同温度下保持不同的储存时间段。特别地，证实了蛋卵磷脂对抑制TRP2蛋白聚集的分散作用是持久且稳定的，因为非常稳定的形式在4℃的冷藏状态下可以维持108天或更久。

为了证实除蛋卵磷脂外的分散剂的TRP2稳定性，使用10％Cremophor、0.1％大豆卵磷脂(TRP2-SL)、0.5％三油酸甘油酯(TRP2-三油酸甘油酯)和0.5％LysoPC(TRP2-LysoPC)分散TRP2，并且在分散后立即(第0天)和在4℃的冷藏状态下储存30天和70天后通过DLS测量颗粒的稳定性。

基于其结果，如图8D中所示，发现与蛋卵磷脂相似，每种制剂保持非常稳定的状态达70天或更久。

蛋卵磷脂在药物中以各种浓度使用。为了证实制剂根据蛋卵磷脂的浓度的稳定性，使用0.5％蛋卵磷脂分散浓度为100μg/ml的TRP2，并且通过DLS测量蛋白质颗粒根据各种储存温度和时间段的稳定性。

基于其结果，如图9中所示，即使在使用0.5％蛋卵磷脂时，蛋白质分散性也是稳定的，与储存条件无关，与使用0.1％蛋卵磷脂的图8C的结果非常相似。

另外，为了证实根据蛋白质药物剂量的聚集抑制作用，使用0.1％蛋卵磷脂分散以100至500μg/ml的各种浓度的TRP2，并将其在4℃下的冷藏状态下储存各种时间段，并且测量根据TRP浓度的蛋卵磷脂分散性。

基于其结果，如图10中所示，当使用0.1％蛋卵磷脂时，即使在400μg/ml的浓度下，TRP也保持在非常稳定的状态下达20天或更久。然而，500μg/ml或更大浓度的TRP在7天后引起一些聚集。

为了评价使用分散剂的情况下甚至在长期储存后TRP的细胞渗透性是否得以保持，用使用0.1％蛋卵磷脂分散并在冷藏状态下储存108天的TRP2处理293A细胞4小时，随后使用共聚焦显微镜观察。

基于其结果，如图11A中所示，发现使用蛋卵磷脂分散并储存108天的TRP的细胞内渗透性保持不变。此外，为了评价TRP2蛋白是否根据各种蛋卵磷脂浓度和储存温度而变性，证实了分散蛋白(TRP2)和在细胞中处理的TRP2(TRP2转导)。

基于其结果，如图11B中所示，发现TRP2蛋白在各种储存温度和蛋卵磷脂浓度下根本不变性。

实施例8：TRP2制剂的体内作用的证实

当将包含分散剂(Cremophor、蛋卵磷脂或大豆卵磷脂)的TRP制剂施用于动物模型时，证实了其治疗作用的变化。在上述实施例中，证实了增加包含磷脂如蛋卵磷脂、Cremophor、大豆卵磷脂、三油酸甘油酯和LysoPC的TRP2蛋白的分散性、改善安全性、由于细胞渗透效率增加而增强药物功效、和改善稳定性的作用。使用腹膜纤维化模型来证实基于这些作用的治疗作用的增强。

对于动物实验，将腹膜透析导管(Access technologies，大鼠-O-开口，具有圆形尖端的7fr x 24”有机硅导管)插入体重为250-280g的雄性Sprague-Dawley大鼠的腹腔中。在术后一周后每天，向对照组施用20ml盐水，并且向实验组施用包含4.25％高浓度葡萄糖的腹膜透析液。为了证实TRP2制剂治疗腹膜纤维化的作用，将各种剂量的TRP2与腹膜透析液混合并注射。因此，每周施用TRP2蛋白药物一次。施用腹膜透析液后四周，处死每只动物，并且收集腹膜，将其固定在10％中性福尔马林中，包埋在石蜡中，且用Masson’s Trichrome染色，因此通过测量至少30个位点的纤维化厚度来确定组织学纤维化的程度。

在常规未分散的TRP2的情况下，如表5中和图12中所示，正常对照(con)的腹膜具有约32μm的厚度，但当施用高浓度腹膜透析液(PDF)4周时，由于腹膜纤维化，腹膜厚度经测定为230μm或更厚。在这个程序中，当混合并施用常规TRP2时，在500μg/kg的剂量下，纤维化降低约1/2。

为了证实使用分散剂如Cremophor、蛋卵磷脂或大豆卵磷脂的治疗作用，将TRP2使用10％Cremophor、0.1％蛋卵磷脂和0.1％大豆卵磷脂分散，并且将其各种剂量与腹膜透析液混合，并每周施用一次。

基于其结果，如下表6至表8中和图13至图15中所示，当使用分散剂时，TRP2的腹膜纤维化抑制作用大大增加。对于使用这些分散剂的TRP2的治疗作用，如下表9中和图16中所示，当使用Cremophor、蛋卵磷脂和大豆卵磷脂作为分散剂时，对于50％有效剂量(有效剂量50，ED50)，治疗作用分别增加约37倍、约18倍和约8倍。

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

实用性

当使用根据本发明的药物制剂时，通过抑制未活化TRP的聚集，分散性改善，细胞渗透性增加，细胞毒性降低，蛋白质药物的稳定性增加，并且治疗作用也改善。

尽管已如上所述详细地公开了本发明的具体实施方案，但是对于本领域的普通技术人员将显而易见的是描述仅仅是优选的示例性实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。

序列表自由文本

附有电子文件。

<110> 大都会生命科学有限公司

<120> 未活化多肽TRP的药物制剂

<130> PP-B2415

<150> KR 10-2019-0076443

<151> 2019-06-26

<160> 29

<170> KopatentIn 2.0

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Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys

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Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu

35 40 45

Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

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<400> 17

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<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

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<212> PRT

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<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

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<211> 318

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 21

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20 25 30

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<211> 316

<212> PRT

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<400> 22

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<212> PRT

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<400> 23

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<211> 346

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

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Asp Ala Gly Glu Ala Glu Ala Arg Ala Arg Gly Pro Gln Gln Pro Pro

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Gln Glu Arg Ala Leu Leu Val Val Phe Thr Arg Ser Gln Arg Lys Asn

275 280 285

Leu Phe Ala Glu Met Arg Glu Gln Leu Gly Ser Ala Glu Ala Ala Gly

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Ala Glu Gly Ser Trp Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro

305 310 315 320

Asp Ala Arg Pro Trp Leu Pro Ser Pro Gly Arg Arg Arg Arg Arg

325 330 335

<210> 26

<211> 381

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp

1 5 10 15

Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly

20 25 30

Gln Arg Pro Gln Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys

35 40 45

Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser

50 55 60

Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr

65 70 75 80

Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys

85 90 95

Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro

100 105 110

Gln Thr Arg Gln Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu

115 120 125

Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe

130 135 140

Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu

145 150 155 160

Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu

165 170 175

Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val

180 185 190

Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys

195 200 205

Gly Gln Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe

210 215 220

Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg

225 230 235 240

Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly

245 250 255

Gly Gly Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg

260 265 270

Gln Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly

275 280 285

Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys

290 295 300

Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg

305 310 315 320

Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val

325 330 335

His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp

340 345 350

Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr

355 360 365

Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg

370 375 380

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PTD

<400> 27

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 28

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TRP2

<400> 28

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr

1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Ser Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

35 40 45

Arg Arg Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly

50 55 60

Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Ser Thr Met Ala Gly Thr Met His

65 70 75 80

Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala Leu Trp

85 90 95

Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser Leu Asp

100 105 110

Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser Gln Glu

115 120 125

Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu Pro His

130 135 140

Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro Met Phe

145 150 155 160

Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly Gly Pro

165 170 175

Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser Thr Gln

180 185 190

Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr Asp Ala

195 200 205

Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys Glu Phe

210 215 220

Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu Ser Lys

225 230 235 240

Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile Tyr Lys

245 250 255

Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile Ser Val

260 265 270

Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu Phe Leu

275 280 285

Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu Val Phe

290 295 300

Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg His Asn

305 310 315 320

Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser Ile Asn

325 330 335

Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn Lys Gln

340 345 350

Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe Arg Ser

355 360 365

Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr

370 375 380

Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser

385 390 395 400

Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser

405 410 415

Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr

420 425 430

Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr

435 440 445

Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile

450 455 460

Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn

465 470 475 480

Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys

485 490 495

Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His His Tyr Pro

500 505 510

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

515

<210> 29

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCherry-Rab7a vector

<400> 29

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaaggg aggtaagggt 720

aaaggtggta tgacctctag gaagaaagtg ttgctgaagg ttatcatcct gggagattct 780

ggagtcggga agacatcact catgaaccag tatgtgaata agaaattcag caatcagtac 840

aaagccacaa taggagctga ctttctgacc aaggaggtga tggtggatga caggctagtc 900

acaatgcaga tatgggacac agcaggacag gaacggttcc agtctctcgg tgtggccttc 960

tacagaggtg cagactgctg cgttctggta tttgatgtga ctgcccccaa cacattcaaa 1020

accctagata gctggagaga tgagtttctc atccaggcca gtccccgaga tcctgaaaac 1080

ttcccatttg ttgtgttggg aaacaagatt gacctcgaaa acagacaagt ggccacaaag 1140

cgggcacagg cctggtgcta cagcaaaaac aacattccct actttgagac cagtgccaag 1200

gaggccatca acgtggagca ggcgttccag acgattgcac ggaatgcact taagcaggaa 1260

acggaggtgg agctgtacaa cgaatttcct gaacctatca aactggacaa gaatgaccgg 1320

gccaaggcct cggcagaaag ctgcagttgc tga 1353

Claims (14)

1.一种药物制剂，其包含：

(a)含有以下的未活化多肽TRP：PTD(蛋白转导结构域)，其无需细胞膜受体的帮助而实现细胞膜渗透；FAD(弗林蛋白酶活化结构域)，其具有至少一个蛋白质原转换酶切割位点且被蛋白质原转换酶切割以活化细胞中的未活化TRD(组织再生结构域)；和TRD，其通过被FAD的所述蛋白质原转换酶切割而活化以促进细胞中的组织生长或形成或诱导组织再生；和

(b)磷脂分散剂。

2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述磷脂分散剂选自卵磷脂、Cremophor、甘油三酯和LysoPC(溶血磷脂酰胆碱)。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述卵磷脂选自蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、葵花油卵磷脂、油菜籽卵磷脂、棉籽卵磷脂和源自动物脂肪的卵磷脂。

4.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述蛋白质原转换酶是弗林蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述TRD选自BMP、TGF-β、β-NGF(β-神经生长因子)、β-淀粉样蛋白、ADAM(解整合素样金属蛋白酶)、TNF-α、MMP(基质金属蛋白酶)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其中所述BMP选自BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7和BMP14。

7.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述TRD由选自SEQ ID NO:1至13的氨基酸序列表示。

8.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述FAD由选自SEQ ID NO:14至26的氨基酸序列表示。

9.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述PTD选自TAT、源自果蝇的Antp肽、VP22肽、PTD-3、PTD-4和mph-1-btm。

10.根据权利要求1所述的药物制剂，其用于口服施用或注射。

11.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述分散剂以基于100重量份的所述未活化多肽TRP计100至50,000重量份的量被包含。

12.一种用于治疗纤维化疾病的组合物，其包含TRP2和基于100重量份TRP2计100至50,000重量份的磷脂分散剂。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述磷脂分散剂选自卵磷脂、Cremophor、甘油三酯和LysoPC(溶血磷脂酰胆碱)。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述卵磷脂是蛋卵磷脂或大豆卵磷脂。

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