WO2019151444A1 - 椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材 - Google Patents

椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材 Download PDF

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WO2019151444A1
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collagen
nucleus pulposus
cells
atelocollagen
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崇 由留部
由樹 武岡
康一 森本
沙織 國井
薫 尾前
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国立大学法人神戸大学
学校法人近畿大学
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent and a method for use in treating spinal disc degeneration.
  • the present invention also includes an intervertebral disc cell culture material.
  • intervertebral disc In the human spine, vertebrae composed of vertebral bodies, vertebral arches, spinous processes and the like are vertically connected.
  • An intervertebral disc is disposed as a cushioning material between the vertebrae, and the entire spine can be bent, extended, and rotated.
  • the intervertebral disc is composed of a layered annular fiber called annulus fibrosus and a jelly-like nucleus pulposus that contains chondrocytes that produce collagen and proteoglycans.
  • intervertebral disc herniation the normal positional relationship between the nucleus pulposus and the annulus fibrosus for some reason is called intervertebral disc herniation. Loss of normal cushioning causes local pain such as back pain. Further, when the prolapsed nucleus pulposus presses the nearby nerve tissue, it causes radiation pain to the innervation region, and sciatica is a typical symptom.
  • the extracellular matrix of nucleus pulposus is mainly aggrecan and type II collagen, and the constituent cells are derived from notochord.
  • the extracellular matrix of the annulus is mainly aggrecan and type I collagen, and the constituent cells are derived from mesenchyme. Therefore, it has been conventionally performed to use collagen as a substitute for damaged nucleus pulposus (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 is a matrix for treating patients with degenerative disc disease: injectable, containing digestible resistant and remodelable collagen crosslinked by photooxidation catalysis and irradiation with visible light A plurality of living cells having an inherent ability to synthesize proteoglycans in vivo dispersed within said injectable fluid to form an injectable cell matrix for treating degenerative disc disease; A matrix comprising is disclosed.
  • the invention of Patent Document 2 promotes regeneration of nucleus pulposus cells, not merely for maintaining the distance between vertebrae.
  • Collagen is a material that is biocompatible and easily available. It is known that there are many types of collagen. Collagen has a triple helical structure of ⁇ chain. Patent Document 3 describes a low-adhesive collagen (Low Adhesive Scaffold Collagen: hereinafter referred to as “LASCol”) prepared by cleaving the end of this ⁇ chain with a predetermined enzyme. LASCol is known as a scaffold material for cell culture (Patent Document 4).
  • LASCol Low Adhesive Scaffold Collagen
  • Patent Document 2 it is assumed that the matrix to be injected instead of the nucleus pulposus is obtained from a donor vertebrate, for example, nucleus pulposus tissue aseptically excised from the intervertebral disc of a porcine spinal column.
  • the matrix is also contaminated with live cells that produce proteoglycans.
  • the nucleus pulposus tissue from the donor cannot deny the risk of virus and some other contamination the donor had.
  • Patent Document 1 uses collagen, which is a material that has biocompatibility and has been used for the human body, but has no effect of regeneration of nucleus pulposus cells. Therefore, a safer material capable of regenerating nucleus pulposus cells has been desired as a filler to be injected instead of the nucleus pulposus.
  • the present invention has been conceived in view of the above problems, and provides a composition (a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration) that is injected into the annulus instead of the nucleus pulposus for the treatment of intervertebral disc degeneration.
  • disc degeneration includes hernia. More specifically, it is a therapeutic agent used for the treatment of intervertebral disc degeneration including LASCol.
  • the present invention may be referred to as a method for treating disc degeneration using LASCol.
  • the present invention also provides an intervertebral disc cell culture material containing LASCol.
  • the disc cell culture material is a culture material capable of culturing nucleus pulposus cells and / or annulus fibrosus cells.
  • the present invention also provides a method for producing a therapeutic agent and a culture material, a method for treating non-human animals using a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration, and nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells regenerated by the therapeutic agent. .
  • the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration contains LASCol, and can maintain the distance between vertebrae from which the nucleus pulposus has been removed over a long period of time.
  • LASCol itself is made of collagen that is naturally present in the intervertebral disc, and has a high affinity with the intervertebral disc, contributing to high safety.
  • LASCol can migrate and infiltrate cells that produce proteoglycan, a component of the nucleus pulposus, from surrounding cells, and the nucleus pulposus regenerates without injecting nucleus pulposus cells or living cells from the outside. An effect can be obtained.
  • 14 to 17 are graphs showing the results of counting the number of cells invading the nucleus pulposus region. It is the photograph which processed in black and white the image which carried out multiple fluorescence immunostaining of the nucleus pulposus area
  • LASCol used as a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration and a disc cell culture material according to the present invention contains collagen or a degradation product of atelocollagen.
  • This degradation product has the property that collagen has weak adhesion to cells and changes to low adhesion.
  • the therapeutic agents for intervertebral disc degeneration include hydrogel, gelatin gel, chitosan gel, hyaluronic acid / collagen hydrogel, hyaluronic acid polymer, hyaluronic acid / PEG polymer, collagen / hyaluronic acid / PEG hydrogel, high
  • a substance such as a pure alginic acid gel (UPAL) or a solvent compatible with the human body (collectively referred to as “auxiliary substance”) may be included.
  • UPAL pure alginic acid gel
  • auxiliary substance a solvent compatible with the human body
  • LASCol is obtained by degrading collagen or atelocollagen with an enzyme. And the peptide sequence contained differs according to the conditions at the time of decomposition
  • the characteristic of LASCol that can be used in the present invention is that the chemical bond between Y 1 and Y 2 is cleaved in the amino terminal amino acid sequence shown in the following (A: SEQ ID NO: 1) of the triple helical domain of collagen or atelocollagen. The combination of ⁇ chains.
  • A SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • G G is glycine
  • Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
  • the triple helical domain of collagen is known to have a sequence of -GXY- (G is glycine, and X and Y are arbitrary amino acids).
  • G in “—Y 3 -GY 4 -Y 5 —” represents glycine on the N-terminal side of the triple helical domain.
  • LASCols used in the present invention is LASCol in which cleavage occurs outside the triple helical domain.
  • this is referred to as LASCol-A.
  • a chemical bond between X 1 and X 2 in the amino terminal amino acid sequence shown below (B: SEQ ID NO: 2) of the triple helical domain of collagen or atelocollagen; a chemical bond between X 2 and G; It consists of a combination of ⁇ chains in which the chemical bond between X 3 , the chemical bond between X 4 and G, or the chemical bond between X 6 and G is cleaved.
  • LASCol-B (B) -GX 1 -X 2 -GX 3 -X 4 -GX 5 -X 6 -G- (SEQ ID NO: 2): (where G is glycine, and X 1 to X 6 is any amino acid).
  • G is glycine, and X 1 to X 6 is any amino acid.
  • LASCol-B is cleaved inside the triple helical domain.
  • G in “-GX 1 -X 2 -G-” is glycine on the N-terminal side of the triple helical domain.
  • LASCol-A is the most suitable among currently known LASCols as a therapeutic agent for disc degeneration. However, it does not exclude other LASCols.
  • LASCol used as a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration according to the present invention can be stored as a solution in an acidic state. And it adjusts pH and a density
  • the elastic modulus when the gel is formed is proportional to the concentration, pH, and temperature of LASCol in the solution.
  • LASCol used as a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration according to the present invention may be in the form of a film or sponge and embedded in the affected area.
  • the film form and the sponge form refer to those obtained by drying LASCol into a predetermined shape (also referred to as a shape body).
  • LASCol may be used together with an auxiliary substance as a therapeutic agent for disc degeneration.
  • the mechanical strength of intervertebral maintenance is borne by auxiliary substances, and LASCol plays a role of regenerating nucleus pulposus cells by migrating and infiltrating cells that produce proteoglycan, which is a component of nucleus pulposus, from surrounding cells. This is because it becomes a therapeutic agent for disc degeneration.
  • LASCol used in the present invention exhibits a gel form when the concentration is 3.5 mg / ml (“Practical Elastic Modulus” described later is 20 Pa) or more. Therefore, LASCol at this concentration or higher can be mixed with an auxiliary substance to obtain a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration that regenerates nucleus pulposus cells and an intervertebral disc cell culture material.
  • the concentration when the concentration is 7 mg / ml or more, it has intervertebral maintenance ability alone, and when it is 21 mg / ml or more, it has intervertebral maintenance ability more than atelocollagen.
  • LASCol which can be used in the present invention can be used at 3.5 mg / ml or more, preferably 7 mg / ml or more, more preferably 21 mg / ml or more.
  • the upper limit of the gel concentration is at least 42 mg / ml or more, but even higher concentrations can be used as a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration.
  • LASCol-B and LASCol-A are almost the same. Therefore, the knowledge common to both is described simply as LASCol.
  • “decomposed product” means LASCol.
  • Collagen or atelocollagen used as the material for LASCol is not particularly limited, and may be known collagen or atelocollagen.
  • Collagens include mammals (eg, cows, pigs, rabbits, humans, rats or mice), birds (eg, chickens), or fish (eg, shark, carp, eel, tuna (eg, yellowfin tuna), tilapia , Thailand, salmon, etc.) or reptile (eg, suppon) collagen.
  • mammals eg, cows, pigs, rabbits, humans, rats or mice
  • birds eg, chickens
  • fish eg, shark, carp, eel, tuna (eg, yellowfin tuna), tilapia , Thailand, salmon, etc.) or reptile (eg, suppon) collagen.
  • Collagens used in the present invention include, for example, collagen derived from the dermis, tendon, bone or fascia of mammals or birds, collagen derived from the skin or scales of fish, dermis, tendon, bone of the reptile, etc. Derived collagen can be used.
  • telopeptide is obtained from the amino terminus and / or carboxyl terminus of the collagen molecule obtained by treating the above-mentioned mammalian, avian, fish or reptile collagen with a protease (for example, pepsin).
  • a protease for example, pepsin
  • chicken, pig, cow, human or rat collagen or atelocollagen can be preferably used.
  • porcine, bovine or human collagen or atelocollagen can be more preferably used as a material for LASCol.
  • LASCol a virus-free safe collagen or atelocollagen degradation product
  • tuna eg, yellowfin tuna
  • tilapia black bass
  • bluegill Thai or salmon collagen or atelocollagen.
  • tuna, tilapia, Thai or salmon collagen or atelocollagen is used.
  • telocollagen When using atelocollagen as the LASCol material, it is preferable to use atelocollagen having a heat denaturation temperature of preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher.
  • telo eg, yellowfin tuna
  • atelocollagen such as carp and tilapia
  • the temperature at which the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration of the present embodiment becomes a gel can be adjusted to preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher.
  • collagens or atelocollagen can be obtained by a known method.
  • collagen can be eluted by putting a tissue rich in collagen of mammals, birds or fish into an acidic solution of about pH 2-4.
  • a protease such as pepsin is added to the eluate to partially remove the amino terminal and / or carboxyl terminal telopeptide of the collagen molecule.
  • atelocollagen can be precipitated by adding a salt such as sodium chloride to the eluate.
  • LASCol these materials are decomposed by causing an enzyme to act on collagen or atelocollagen.
  • LASCol can also be obtained by preparing a degradation product of collagen or atelocollagen in which the chemical bond in the triple helical domain has already been cleaved (for example, chemical synthesis, expression of recombinant protein).
  • the enzyme is not particularly limited, but for example, cysteine protease is preferably used.
  • cysteine protease it is preferable to use a cysteine protease having a larger amount of acidic amino acids than a basic amino acid amount, or a cysteine protease active at a hydrogen ion concentration in an acidic region.
  • cysteine proteases include actinidin [EC 3.4.22.14], papain [EC 3.4.22.2], ficin [EC 3.4.22.3], bromelain [EC 3.4. .22.32], cathepsin B [EC 3.4.22.1], cathepsin L [EC 3.4.22.15], cathepsin S [EC 3.4.22.27], cathepsin K [EC 3 4.2.38], cathepsin H [EC 3.4.22.16], alloline, calcium-dependent protease, and the like. Enclosed in brackets are enzyme numbers.
  • actinidine it is preferable to use actinidine, papain, ficin, cathepsin K, alloline or bromelain, and it is more preferable to use actinidine, papain, ficin, cathepsin K.
  • the enzyme described above can be obtained by a known method.
  • it can be obtained by preparation of an enzyme by chemical synthesis; extraction of an enzyme from cells or tissues of bacteria, fungi, various animals and plants; preparation of an enzyme by genetic engineering means;
  • commercially available enzymes can also be used.
  • the cutting step can be performed according to the following methods (i) to (iii).
  • the following methods (i) to (iii) are merely examples of the cutting step, and the production method of LASCol is not limited to these methods (i) to (iii).
  • LASCol-B can be obtained by the following methods (i) and (ii). In addition, the following method (iii) can obtain LASCol-A and LASCol-B.
  • (Iii) A method of bringing collagen or atelocollagen into contact with an enzyme in the presence of a low concentration of salt.
  • Specific examples of the method (i) described above include a method of bringing collagen or atelocollagen into contact with an enzyme in an aqueous solution containing a high concentration of salt.
  • Specific examples of the method (ii) described above include, for example, a method in which an aqueous solution containing a high concentration salt and an enzyme are contacted in advance, and then the enzyme is contacted with collagen or atelocollagen.
  • Specific examples of the method (iii) described above include a method of bringing collagen or atelocollagen into contact with an enzyme in an aqueous solution containing a low concentration salt. Although it does not specifically limit as a specific structure of the said aqueous solution, For example, it is possible to use water.
  • the specific structure of the salt is not particularly limited, but chloride is preferably used.
  • the chloride is not particularly limited, but for example, it is possible to use NaCl, KCl, and LiCl or MgCl 2.
  • the concentration of the salt in the aqueous solution containing the high concentration salt is not particularly limited, but it can be said that a higher concentration is preferable.
  • the concentration is preferably 200 mM or higher, more preferably 500 mM or higher, more preferably 1000 mM or higher, more preferably 1500 mM or higher, and most preferably 2000 mM or higher.
  • the concentration of the salt in the aqueous solution containing the low-concentration salt is not particularly limited.
  • the concentration is preferably lower than 200 mM, more preferably 150 mM or less, more preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, and most preferably about 0 mM.
  • the amount of collagen or atelocollagen dissolved in the aqueous solution is not particularly limited.
  • the amount of the enzyme to be added to the aqueous solution is not particularly limited. For example, it is preferable to add 10 to 20 parts by weight of the enzyme with respect to 100 parts by weight of collagen or atelocollagen.
  • conditions for contacting collagen or atelocollagen with an enzyme in an aqueous solution are not particularly limited, and can be set as appropriate, but within the following ranges. Is preferred. In addition, the preferable range of these conditions is illustrated below.
  • the pH of the aqueous solution is preferably pH 2.0 to 7.0, more preferably pH 3.0 to 6.5.
  • a known buffer can be added to the aqueous solution. If it is the said pH, collagen or atelocollagen can be melt
  • the temperature is not particularly limited, and the temperature may be selected according to the enzyme used.
  • the temperature is preferably 15 ° C. to 40 ° C., and more preferably 20 ° C. to 35 ° C.
  • the contact time is not particularly limited, and the contact time may be selected according to the amount of enzyme and / or the amount of collagen or atelocollagen.
  • the time is preferably 1 hour to 60 days, more preferably 1 day to 7 days, and even more preferably 3 days to 7 days.
  • the step of removing the impurities can be performed by a general method for separating substances.
  • the step of removing the impurities can be performed, for example, by dialysis, salting out, gel filtration chromatography, isoelectric precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or the like.
  • the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration according to the present invention is administered by injection or the like into the intervertebral disc mainly by surgical operation.
  • the LASCol contained in the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration desirably has a predetermined elastic modulus (a practical elastic modulus described later). This is because LASCol may flow out of the intervertebral disc when the elastic modulus is low.
  • the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration or intervertebral disc cell culture material according to the present invention is supplied in a gel state or a dry state (including powder and shape).
  • a gel state or a dry state including powder and shape.
  • an instruction to add a certain solvent to the dry LASCol is attached or notified.
  • concentration of LASCol is suitable is also included.
  • “administration” means giving a therapeutic agent to a patient via an affected part (intervertebral disc).
  • the disc disorder treated using the present invention can be applied to diseases related to intervertebral disc degeneration such as low back pain, spinal canal stenosis and spinal deformity in addition to typical herniated disc herniation.
  • the present invention can be said to be a method for treating intervertebral disc degeneration using the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration according to the present invention. It can also be said to be a method for culturing intervertebral disc cells using the intervertebral disc cell culture material according to the present invention.
  • actinidine was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and 5 mM EDTA (Ethylenediaminetetic acid), and left at 25 ° C. for 90 minutes. did.
  • actinidine what was refine
  • porcine type I collagen was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing salt. An aqueous solution containing actinidine and the solution containing porcine type I collagen were contacted at 20 ° C. for 10 days or longer to prepare a degradation product of type I collagen.
  • porcine type I collagen was purified based on a well-known method (for example, refer nonpatent literature 1).
  • the degradation product described above was subjected to sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate the degradation product of type I collagen.
  • SDS-PAGE sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the degradation product of type I collagen was transferred to a PVDF (Polyvinylidene Fluoride) membrane by a conventional method.
  • the amino terminal amino acid sequence of the ⁇ 1 chain degradation product transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
  • Table 1 shows the amino terminus and the amino acid sequence in the vicinity of the ⁇ 1 chain degradation product when the salt concentration is 0 mM and 1500 mM.
  • the triple helical domain starts from the third glycine (G) from the left toward the C-terminus.
  • the solution produced at 0 mM is the LASCol-A solution
  • the solution produced at 1500 mM is the LASCol-B solution.
  • the LASCol-A solution was used as the LASCol solution.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid terminal portion of the ⁇ 2 chain.
  • the triple helical domain starts from the glycine (G) at the left end of “•• GPMGLMMG.
  • the end of the ⁇ 2 chain is shown in SEQ ID NO: 6 when the salt concentration, which is the production condition of LASCol-A, is 0 mM. This refers to the SEQ ID NO: 2, a chemical bond between G and X 3 correspond to being cut.
  • LASCol-A is cleaved outside the triple helical domain in the ⁇ 1 chain, but cleaved inside the triple helical domain in the ⁇ 2 chain. LASCol-A only needs to have a cleavage of either SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6.
  • FIG. 1 shows elastic properties (storage elastic modulus G ′ in complex elastic modulus) of a solution containing LASCol.
  • the horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents storage elastic modulus G ′ (Pa).
  • 1A and 1B have the same horizontal axis but different vertical axes. The scale of the vertical axis in FIG. 1B is larger than that in FIG.
  • Each curve in FIG. 1 (a) and FIG. 1 (b) represents the difference in the concentration of LASCol.
  • LASCol solutions with different concentrations are 5 mM so that the final concentrations are 2.1 mg / mL, 3.5 mg / mL, 4.9 mg / mL (above FIG. 1 (a)), 21 mg / ml (FIG. 1 (b)).
  • a hydrochloric acid solution In a hydrochloric acid solution.
  • LASCols are stored at 5 to 10 ° C. in an acidic solution. In this state, LASCol can be stored in liquid form.
  • Fig. 1 shows that after adding a pH adjusting agent and a concentration adjusting solution to LASCol and adjusting the pH to about 7.4, it is set in a dynamic viscoelasticity measuring device (rheometer, HAAKE MARS III, Thermo Fisher Scientific) It is the result measured after raising the temperature to 37 ° C.
  • the measurement conditions were a frequency of 1 Hz, a swing width of 6 ° / second, and a strain amount of 1%.
  • the temperature increase is completed in a few seconds.
  • the storage elastic modulus G 'immediately after the start of measurement was low at any concentration. Thereafter, at any concentration, the storage modulus G 'increased and approached the saturation value after about 10 minutes.
  • the storage elastic modulus G ′ increased to the saturation value in 1 minute from the start of measurement, and then gradually decreased and saturated. As is clear from FIG. 1 and FIG. 2, the time until the storage elastic modulus G ′ increases as the concentration increases is shortened.
  • the storage elastic modulus G ′ of the solution containing LASCol increased to a predetermined value corresponding to the concentration. Further, it was found that when the LASCol was prepared at a predetermined concentration and the temperature was changed to 37 ° C. and 30 minutes passed, the storage elastic modulus almost became a stable value. Therefore, the storage elastic modulus at this time is referred to as “practical elastic modulus” of LASCol.
  • LASCol changes from a sol in which the elastic modulus cannot be measured to a gel in which the elastic modulus can be quantified when exposed to appropriate conditions, and can be used as an injectable gel particularly when injected into a living body.
  • FIG. 2 shows the relationship between “strain (displacement in the rotational direction on the rheometer drive side)” and “stress (stress on the passive side of the rheometer)” after 30 minutes at 37 ° C. with a rheometer.
  • the left vertical axis is strain ⁇ (rad)
  • the right vertical axis is stress M ( ⁇ Nm)
  • the horizontal axis is the number of machine steps and is unitless, but 500 steps corresponds to 1 second. That is, each figure in FIG. 2 is a measurement of a round trip from 5 ⁇ 10 ⁇ 4 rad to ⁇ 5 ⁇ 10 ⁇ 4 rad over 1 second.
  • Fig. 2 (a) shows a case where the LASCol concentration is 2.1 mg / ml
  • Fig. 2 (b) shows a LASCol concentration of 3.5 mg / ml
  • Fig. 2 (c) shows a LASCol concentration of 5.6 mg / ml. ml.
  • the practical elastic moduli were 8 Pa, 20 Pa, and 70 Pa, respectively.
  • 20 Pa is considered to be the lower limit of the storage elastic modulus when gelled. Since LASCol also has a function as a cell scaffold, it needs to be stored to some extent in one place. This is because LASCol does not behave as a gel when the elasticity is lower than 20 Pa, and it is considered difficult to store it in the intervertebral disc.
  • n number Human nucleus pulposus and annulus fibrosus samples were removed from the patient by lumbar discectomy or interbody fusion.
  • the number of patients (n number) was 15.
  • the patient's age was 46.1 ⁇ 24.1 years, 8 males and 7 females.
  • the median value was 2 in the Pfiremann classification indicating the degree of intervertebral disc degeneration.
  • SD rats 12-week-old sprag-Dawley rats
  • a 24-well plate with 7.0 mg / ml LASCol gel fixed and 2.1 mg / ml atelocollagen gel fixed was prepared.
  • Each sample was cultured for 192 hours in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) supplemented with 10% FBS in each plate.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the cells cultured on the LASCol gel are referred to as the LASCol gel group, and the cells cultured on the atelocollagen gel are referred to as the AC gel group.
  • FIG. 3 is a photograph showing a state in which the cultured cells have become spheroids.
  • FIG. 3 (a) shows spheroids on LASCol gel
  • FIG. 3 (b) shows spheroids on atelocollagen gel.
  • the scale bar in the photograph indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 3A many cells are densely formed to form a spheroid (triangular arrow)
  • FIG. 3B only a few cells are gathered (triangular arrow). .
  • FIG. 4 and 5 show rat disc nucleus pulposus cells (FIG. 4 (a)), annulus fibrosus cells (FIG. 4 (b)), human intervertebral disc nucleus pulposus cells (FIG. 5 (a)), annulus fibrosus, respectively.
  • It is a graph which shows transition of culture time and spheroid number in a cell (Drawing 5 (b)).
  • the horizontal axis represents the culture time (hour), and the vertical axis represents the number of spheroids.
  • the spheroid is obtained by aggregating 3 or more cells, and counting the number in a field of view of 100 times magnification.
  • the state indicated by the triangular arrow in FIG. 3B was counted as a spheroid.
  • Fig.3 (a) when many cells gathered, it was set as the spheroid.
  • the solid line is the LASCol gel group
  • the dotted line is the AC gel group.
  • the mean ⁇ standard deviation was described, and two-way ANOVA and Tukey-Kramer post-hoc test were used for statistical analysis.
  • the number of spheroids was increased in the LASCol gel group. However, no increase in the number of spheroids was observed in the AC gel group. The number of spheroids was significantly higher in the LASCol gel group from 48 hours to 192 hours after initiation of culture in nucleus pulposus cells and from 24 hours to 192 hours in annulus fibrosus cells.
  • LASCol when cells are cultured in the LASCol gel environment, the number of spheroids and the number of cells constituting the spheroids increase in both nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells as compared to the culture in the atelocollagen gel environment.
  • LASCol was gelled at a concentration of 3.5 mg / ml or more (practical elastic modulus of 20 Pa or more). Therefore, if the LASCol concentration is 3.5 mg / ml or more (at least 7.0 mg / ml or more), it can be said that cells are cultured in vivo and exert spheroid-forming ability.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of staining the LASCol gel group of human intervertebral disc nucleus pulposus cells, with only the stained portion blackened and the others imaged white. Each lower right scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIGS. 6A to 6D show the results of DAPI, Brachyury, Tie2, and Aggrecan, respectively.
  • FIG. 6E is a diagram in which all are combined (denoted as “Merge”).
  • FIG. 7 is a photograph showing the staining results of AC gel group of human intervertebral disc nucleus pulposus cells. In the same manner as in FIG. 6, only the stained portion is black, and the other is a white image processed. Each lower right scale bar is 100 ⁇ m.
  • DAPI FIG. 7 (a)
  • uniform cell distribution was observed. Spheroid formation in which cells aggregated as shown in FIG. 6A was not observed.
  • Brachyury (FIG. 7 (b)) and Tie2 FIG. 7 (c)
  • almost no expression was observed. In other words, the presence of nucleus pulposus, notochord and progenitor cells was not observed.
  • Aggrecan FIG. 7 (d)
  • weak expression consistent with cell distribution FIG. 7a) was observed.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of staining the LASCol gel group of human intervertebral disc annulus cells. In the same manner as in FIG. 6, only the stained portion is black, and the other is a white image processed. Each lower right scale bar is 100 ⁇ m.
  • DAPI FIG. 8 (a)
  • formation of a plurality of spheroids was observed. Strong expression consistent with spheroids (FIG. 8 (a)) was observed in PAX1 (FIG. 8 (b)) and Aggrecan (FIG. 8 (c)), which are annulus fibrosus markers.
  • FIG. 9 is a photograph showing the staining result of AC gel group of human intervertebral disc annulus cells. In the same manner as in FIG. 6, only the stained portion is black, and the other is a white image processed. Each lower right scale bar is 100 ⁇ m.
  • DAPI (FIG. 9 (a)) showed a uniform cell distribution but no spheroid formation. Weak expression consistent with cell distribution (FIG. 9 (a)) was observed in PAX1 (FIG. 9 (b)) and Aggrecan (FIG. 9 (c)), which are annulus fibrosus markers.
  • LASCol promotes spheroids of nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells, whereby nucleus pulposus cells, progenitor cells and annulus cells that regenerate tissues migrate, infiltrate, and colonize, and are specific to tissues. Extracellular matrix (Aggrecan) is expressed.
  • atelocollagen increases the number of cells, nucleus pulposus cells, progenitor cells, and annulus fibrosus cells are hardly detectable, and the extracellular matrix of the tissue is hardly expressed. That is, LASCol can be used as a culture material that maintains and further enhances the functions of nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells.
  • LASCol can migrate and infiltrate cells that produce proteoglycan, which is a component of nucleus pulposus, from surrounding cells between vertebrae from which nucleus pulposus cells have been removed.
  • % DHI % Disc Height Index
  • FIG. 10 illustrates a simple X-ray photograph (Fig. 10 (a)) and a T2-weighted image (Fig. 10 (b)) of MRI (Magnetic Resonance Imaging) 4 weeks after the operation.
  • FIG. 10A is a simple X-ray photograph for each elapsed day after the operation.
  • the arrows indicate LASCol (between eighth and ninth tail vertebrae), atelocollagen (labeled “AC”, between ninth and tenth vertebrae) and control (labeled “Control”. Tenth and eleventh. This represents the place where the intercostal vertebrae were administered.
  • the luminance was lower in the LASCol administration group, AC administration group, and control group than in the normal intervertebral disc (indicated as “Normal” in FIG. 10B).
  • the luminance of the LASCol administration group was higher than that of the AC administration group and the control group. Therefore, after the nucleus pulposus is removed, it can be said that the LASCol administration group has reduced degeneration compared to the AC administration group and the control group.
  • FIG. 11 is a graph showing% DHI and elapsed time obtained from this simple X-ray photograph.
  • the horizontal axis represents elapsed time (week after operation), and the vertical axis represents% DHI.
  • % DHI decreased until 7 days after the operation. However, the level of the decrease stopped when LASCol was significantly higher than the control. In addition, there was no significant difference between the LASCol administration group and the AC administration group, or between the AC administration group and the control group. Thereafter,% DHI in the LASCol administration group, the AC administration group, and the control group all showed a decreasing tendency.
  • LASCol As samples having different concentrations, LASCol of 7 mg / ml, 14 mg / ml, 21 mg / ml, and 42 mg / ml were prepared. For comparison, 7 mg / ml atelocollagen and a control solvent were also prepared.
  • Rats using 7 mg / ml concentration of LASCol were “7 mg LASCol administration group”, rats using 14 mg / ml concentration of LASCol were “14 mg LASCol administration group”, and rats using LASCol of 21 mg / ml concentration were “21 mg LASCol administration group”
  • the rats using LASCol at a concentration of 42 mg / ml are referred to as “42 mg LASCol administration group”.
  • a rat given 7 mg / ml atelocollagen is used as a 7 mg AC administration group.
  • the horizontal axis is the elapsed time after surgery (week after surgery), and the vertical axis is% DHI.
  • the number of rats used in each group is shown in FIG.
  • the 42 mg LASCol-administered group, 21 mg LASCol-administered group, and 7 mg AC-administered group showed significantly higher% DHI values than the control. Therefore, it can be said that LASCol at least 21 mg / ml or more has intervertebral maintenance ability alone.
  • OP-1 Ostogenic Protein-1
  • bFGF bFGF
  • TGF- ⁇ 1, GDF-5, BMP2, VEGF, IGF-1, and the like may be used as growth factors.
  • the concentration of OP-1 was 2 ⁇ g of OP-1 mixed with 15 ⁇ l of LASCol at a concentration of 21 mg / ml. This is called the OP-1 + LASCol administration group.
  • FIG. 13 (a) shows the% DHI results for the OP-1 + LASCol administration group, the 21 mg LASCol administration group, the 7 mg AC administration group, and the control.
  • the horizontal axis is the week after surgery, and the vertical axis is% DHI.
  • the number of rats used in each group is shown in FIG.
  • LASCol at least 21 mg / ml or more has intervertebral intervertebral maintenance ability equal to or higher than that of atelocollagen.
  • LASCol is preferably at a concentration of 21 mg / ml or more.
  • the concentration of 42 mg / ml is close to the upper limit as the handling concentration.
  • higher concentrations including the dry state can be used by devising the administration method and form.
  • FIG. 14 is a photograph of a tissue sample of rat nucleus pulposus nucleus region 1 week after surgery stained with safranin-O. More specifically, the rat's tail intervertebral disc and the caudal vertebra on both sides of the intervertebral disc were removed, fixed in formalin, embedded in paraffin, a cut surface was prepared, and stained with safranin-O. In safranin-O, proteoglycan, which is a typical extracellular matrix, is stained red.
  • Each photograph in FIG. 14 is a black and white image processed from a stained photograph. Both photographs have caudal vertebrae on the left and right, and a sample between the caudal vertebrae.
  • FIG. 14 (e) shows the caudal vertebra and nucleus pulposus region. The same applies to other photographs and the subsequent photographs shown in FIGS.
  • FIGS. 14 (a) and 14 (b) show the case where the nucleus pulposus nucleus (referring to the part where the nucleus pulposus was present) was filled with LASCol at a concentration of 21 mg / ml after excision of the rat caudal nucleus pulposus. (This is the LASCol administration group.) 14 (c) and 14 (d) show the case where the nucleus pulposus region is filled with atelocollagen at a concentration of 7 mg / ml (this is an AC administration group). FIGS. 14 (e) and 14 (f) show a case where the nucleus pulposus region is filled with a solvent (in FIG. 14, “control” is indicated).
  • FIGS. 14 (a) and 14 (b), FIG. 14 (c) and FIG. 14 (d), FIG. 14 (e) and FIG. It is a photograph of the same part with a different magnification.
  • the scale bar is shown in FIG. 14 (e) and FIG. 14 (f). The same applies to other photographs and the subsequent photographs shown in FIGS.
  • FIG. 16, and FIG. 17 are photographs of tissue samples of rat caudal nucleus pulposus stained with safranin-O at 2 weeks after surgery, 4 weeks after surgery, and 8 weeks after surgery, respectively.
  • (a) and (b) show a case where the nucleus pulposus region is filled with LASCol after excision of rat nucleus pulposus nucleus.
  • (C) and (d) show the case where the nucleus pulposus region is filled with atelocollagen.
  • E) and (f) show the case where the nucleus pulposus region is filled with a solvent (in each figure, indicated as control).
  • the nucleus pulposus region was darkly stained red in the case of LASCol administration. This indicates that proteoglycan is abundant. Cell infiltration into the nucleus pulposus region was also confirmed.
  • FIG. 17 (c) and FIG. 17 (d) a red stained portion was observed in the nucleus pulposus region even when atelocollagen was administered.
  • the color tone was lighter than in the case of LASCol administration in FIGS. 17 (a) and 17 (b), and very few cells were infiltrated.
  • FIG. 18 shows the result of more quantitative examination of FIGS. 14 to 17.
  • the horizontal axis represents the week after the operation, and the vertical axis represents the area ( ⁇ 10 3 ⁇ m 2 ) of the red portion showing positive proteoglycan.
  • the LASCol administration group, the AC administration group, and the control group are shown.
  • the LASCol administration group was represented by “L”
  • the atelocollagen administration group was represented by “AC”
  • the control group was represented by “Cont”.
  • the LASCol administration group was significantly larger in area than the other two groups, and the atelocollagen administration group was significantly larger than the control group. In addition, no significant change was observed in any of the administration groups from 1 week to 8 weeks after the operation.
  • FIG. 19 shows the results of counting the number of cells infiltrating the nucleus pulposus region in FIGS. 14 to 17.
  • the horizontal axis is the week after the operation, and the vertical axis is the number of cells per intervertebral disc infiltrating the nucleus pulposus region (number / disc).
  • the LASCol administration group, the AC administration group, and the control group are shown.
  • the LASCol administration group was represented by “L”
  • the atelocollagen administration group was represented by “AC”
  • the control group was represented by “Cont”.
  • the average number of cells in the LASCol administration group was 66.3 ⁇ 9.4, the atelocollagen administration group was 20.4 ⁇ 7.1, and the control group was 2.3 ⁇ 2.2.
  • the control group was 2.3 ⁇ 2.2.
  • they were 62.4 ⁇ 17.4, 19.2 ⁇ 5.6, and 1.0 ⁇ 0.7, respectively.
  • they were 77.8 ⁇ 23.2, 23.3 ⁇ 5.3, and 2.0 ⁇ 2.2, respectively.
  • the LASCol administration group had significantly more cells than the other two groups, and the atelocollagen administration group was significantly more than the control group. In addition, no significant change was observed in any group from 1 week to 8 weeks after the operation.
  • FIG. 20 is a photograph of a black and white processed image obtained by multiple fluorescent immunostaining of the nucleus pulposus region 1 week after the operation. Multiple fluorescence immunization was performed with DAPI, Brachyury, Tie2 and Aggrecan. More specifically, the rat intervertebral disc and the caudal vertebra on both sides of the disc were taken out, fixed with formalin, and embedded in paraffin to create a cut surface. Next, it was deparaffinized using xylene, activated by a warm bath method using a buffer, and blocked with hydrogen peroxide. Then, a primary antibody reaction was carried out with each marker, a labeled secondary antibody reaction was carried out for each animal species, and encapsulated.
  • FIG. 21, FIG. 22, and FIG. 23 show the results of black and white processing of images obtained by multiple fluorescent immunostaining of the nucleus pulposus area at 2 weeks after surgery, 4 weeks after surgery, and 8 weeks after surgery, respectively.
  • the results of multiple fluorescent immunostaining showed the same tendency as in FIG.
  • FIG. 24 shows photographs of the results of staining of the nucleus pulposus with safranin-O immediately after surgery, 3 days after surgery, and 1 week after surgery.
  • 24 (a) to 24 (c) show the LASCol administration group (denoted “LASCol”), and FIGS. 24 (d) to 24 (f) represent the atelocollagen administration group (“AC”).
  • 24 (g) to 24 (i) show a control group (denoted as “Control”).
  • LASCol a LASCol gel stained in green was observed in the nucleus pulposus region immediately after the operation. On the 3rd day and 1 week after the operation, numerous cell infiltrations were observed in the gel.
  • a green collagen gel was observed in the nucleus pulposus region one week after the operation, but only a few cells were observed on the gel surface 3 days and 1 week after the operation.
  • the nucleus pulposus area was void immediately after surgery and 3 days after surgery. One week after the operation, the nucleus pulposus region was in a collapsed state and no cell infiltration was observed. Thus, LASCol showed cell infiltration 3 days after administration.
  • 25 to 30 show photographs of multiple fluorescent immunostaining of the nucleus pulposus region.
  • 25 shows the case immediately after the operation
  • FIG. 26 shows the case 3 days after the operation
  • FIGS. 27 to 29 show the case 1 week after the operation.
  • the LASCol administration group was described as “LASCol”, the atelocollagen administration group as “AC”, and the control group as “Control”.
  • FIG. 25 (immediately after the operation).
  • 25 (a) to 25 (d) are LASCol administration groups
  • FIGS. 25 (e) to 25 (h) are atelocollagen administration groups
  • FIGS. 25 (i) to 25 (l) are control groups.
  • the nucleus pulposus region had an area that was darkly stained with Col1, indicating the presence of each injected collagen gel. Moreover, Col2 was negative for both LASCol and atelocollagen. In addition, in all three groups, there was almost no portion stained by staining with DAPI, and it was found that nucleus pulposus cells were almost removed.
  • FIG. 26 3 days after surgery.
  • 26 (a) to 26 (d) are LASCol administration groups
  • FIGS. 26 (e) to 26 (h) are atelocollagen administration groups
  • FIGS. 26 (i) to 26 (l) are control groups.
  • FIG. 27 (1 week after operation).
  • 27 (a) to 27 (d) are LASCol administration groups
  • FIGS. 27 (e) to 27 (h) are atelocollagen administration groups
  • FIGS. 27 (i) to 27 (l) are control groups.
  • FIG. 28 (1 week after operation).
  • 28 (a) to 28 (e) are the LASCol administration group
  • FIGS. 28 (f) to 28 (j) are the atelocollagen administration group
  • FIGS. 28 (k) to 28 (o) are the control group.
  • LASCol administration group cell aggregation was observed with DAPI. A small amount of Brachyury and Tie2 positive cells were observed in the nucleus pulposus region. In the atelocollagen administration group, cells considered to be residual cells were observed, but both Brachyury and Tie2 were negative. In the control group, the nucleus pulposus region was crushed by compression of the annulus fibrosus region.
  • the therapeutic agent used for the treatment of intervertebral disc degeneration according to the present invention can regenerate the nucleus pulposus by filling the nucleus pulposus region from which nucleus pulposus cells have flowed out.
  • the single substance has intervertebral maintenance ability at a concentration of 21 mg / ml or more. Accordingly, the nucleus pulposus can be regenerated while maintaining the intervertebral distance. If the concentration is at least 3.5 mg / ml or more, LASCol exhibits a gel form, and the same therapeutic effect can be expected by using it together with other auxiliary substances having intervertebral maintenance ability.
  • This therapeutic agent is safe because it does not use living cells or donor nucleus pulposus cells.
  • the intervertebral disc cell (nucleus nucleus cells and / or annulus cells) culture material promotes spheroids of nucleus pulposus cells and annulus cells, and also cultures spheroids having a large number of spheroids. can do.
  • the therapeutic agent for intervertebral disc degeneration according to the present invention can be suitably used for the treatment of intervertebral disc degeneration.
  • the disc material culture medium according to the present invention can culture nucleus pulposus cells and / or annulus fibrosus cells.

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Abstract

椎間板変性を治療する際に髄核を再生する方法が提案されているが、コラーゲン若しくはアテロコラーゲンでは椎骨間距離をある程度維持できるものの、髄核細胞の再生はない。一方、生細胞やドナーからの髄核細胞を移植するのは安全とはいえない。　本発明に係るコラーゲンの末端を酵素で切断したＬＡＳＣｏｌを含有する椎間板変性の治療剤は、髄核が失われた髄核領域に投与することで、椎骨間距離の維持と髄核細胞及び／又は線維輪細胞の再生を促進させることができる。

Description

椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材
　本発明は、脊椎椎間板変性を治療する際に用いる治療剤およびその方法に関するものである。また、本発明は、椎間板細胞培養材も含む。
　ヒトの脊椎は、椎体、椎弓および棘突起等で構成される椎骨が縦に連なる。椎骨間には、クッション材として椎間板が配置され、脊椎全体の屈曲、伸展、回旋といった動作を可能にしている。椎間板は、線維輪と呼ばれる層状をなす環状の線維と、その中にあるコラーゲンとプロテオグリカンを産生する軟骨細胞を含むゼリー状の髄核で構成されている。
　この椎間板に於いて何らかの原因で髄核と線維輪の正常な位置関係が破綻した状態のことを椎間板ヘルニアと呼ぶ。正常なクッション性が失われることで背部痛などの局所痛を生じる。さらに脱出した髄核が近傍の神経組織を圧迫すると、神経支配領域への放散痛を生じ、坐骨神経痛がその代表的な症状として挙げられる。
　例えば、椎間板ヘルニアを治療する際には、外科的に漏れ出た髄核を取り除く手術療法がある。しかし、手術療法後は髄核の損失により椎骨間は狭まり、継時的には脊柱の加齢性変化、すなわち変性が進行するとされている。
　椎骨間距離が縮まると衝撃吸収性が減少して局所痛を誘発する。また、脊柱の安定性が減少することで椎骨のずれを生じて脊柱管狭窄が起こり、坐骨神経痛などの神経障害を来すようになる。したがって、椎間板を維持できる充填剤が長く求められた。しかし、単に充填するだけでは、その充填剤が飛び出し、ヘルニアと同様の障害が再発する。そこで、髄核があった部分に定着して組織を再生することで椎骨間距離を長期に渡って維持することが期待できるような充填剤が切望された。
　髄核の細胞外マトリックスは主にアグリカンとＩＩ型コラーゲンで、構成する細胞は脊索由来である。線維輪の細胞外マトリックスは主にアグリカンとＩ型コラーゲンで、構成する細胞は間葉由来である。そこで、傷んだ髄核の代用材としてコラーゲンを使うということが従来から行われていた（特許文献１）。
　一方、特許文献２には、変性椎間板疾患を有する患者を治療するためのマトリックスであって：光酸化触媒反応および可視光線の照射によって架橋された消化耐性で改造可能なコラーゲンを含有する、注射可能な流体；および変性椎間板疾患を治療するための注射可能な細胞マトリックスを形成するように前記注射可能な流体内に分散された、生体内でプロテオグリカンを合成する固有の能力を有する複数の生細胞；を含んで成るマトリックスが開示されている。特許文献２の発明は、単に椎骨間の距離を維持するためでなく、髄核細胞の再生を促すものである。
　コラーゲンは生体親和性があり、また入手も容易な材料である。コラーゲンには多くのタイプがあることが知られている。コラーゲンは、α鎖の３重らせん構造を有している。特許文献３には、所定の酵素によりこのα鎖の末端を切断することにより作製した低接着性コラーゲン（Ｌｏｗ　Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ：以下「ＬＡＳＣｏｌ」と呼ぶ。）が記載されている。また、ＬＡＳＣｏｌは、細胞培養のための足場の材料として知られている（特許文献４）。
　従来のコラーゲンを用いている足場と比べて、ＬＡＳＣｏｌを用いている足場を利用することにより、培養したい細胞は凝集塊（スフェロイド）を形成し、培養したい細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養することができる。また、このＬＡＳＣｏｌは、幹細胞の分化誘導の促進に効果がある（特許文献４）。
特表２００６－５０８７７１号公報 特表２００３－５３０３６４号公報 国際公開第２０１５／１６７００３号 国際公開第２０１５／１６７００４号
Ｋ．　Ｍｏｒｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．６８，　ｐｐ．８６１－８６７，　２００４ Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．，　Ｉｍａｉ，Ｙ．，Ｏｋｕｍａ，Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００６）：Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１　ｉｎｊｅｓｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ａ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｄｉｓｃ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｓｃ　ｈｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｕｌａｒ　ｐｕｎｃｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌ．　Ｓｐｉｎｅ，３１，７４２－７５４
　特許文献２では、髄核の代わりに注入するマトリックスはドナー脊椎動物から得られるとされ、例えばブタの脊柱の椎間板から無菌で切除された髄核組織である。また、このマトリックスにはプロテオグリカンを産生する生細胞も混入されている。ドナーからの髄核組織はドナーの有していたウイルスや他の何らかのコンタミネーションの危険性が否定できない。また、種の異なる生細胞の導入も移植を受けたヒトにどのような影響があるか、不明な点が多い。
　一方、特許文献１は、生体親和性があり、人体に使用された実績もある材料であるコラーゲンが使用されるが、髄核細胞の再生という効果はない。したがって、髄核の代わりに注入される充填材として、より安全で、髄核細胞の再生が可能なものが望まれていた。
　本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、椎間板変性の治療のために、線維輪中に髄核の代わりに注入される組成物（椎間板変性の治療剤）を提供するものである。ここで、椎間板変性にはヘルニアを含む。より具体的には、ＬＡＳＣｏｌを含む椎間板変性の治療に用いる治療剤である。なお、本発明はＬＡＳＣｏｌを用いた椎間板変性の治療方法といってもよい。
　また、本発明はＬＡＳＣｏｌを含む椎間板細胞培養材も提供する。ここで椎間板細胞培養材とは、髄核細胞及び／又は線維輪細胞を培養することのできる培養材である。また、本発明は、治療剤および培養材の製造方法、椎間板変性の治療剤を用いたヒト以外の動物への治療方法、および治療剤によって再生された髄核細胞および線維輪細胞をも提供する。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤は、ＬＡＳＣｏｌを含有し、髄核の抜けた椎骨間の距離を長期に渡って維持することができる。ＬＡＳＣｏｌ自体は椎間板に生来存在するコラーゲンを材料としており椎間板での親和性が高く、高い安全性に寄与する。さらに、ＬＡＳＣｏｌは、周囲の細胞から髄核の成分であるプロテオグリカンを産生する細胞を遊走・浸潤することができ、外部から髄核細胞や生細胞を注入しなくても、髄核が再生するという効果を得ることができる。
ＬＡＳＣｏｌ濃度と貯蔵弾性率の関係を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌのひずみと応力の関係を示すグラフである。 培養されたラット線維輪細胞が凝集し、スフェロイドの形成を示す写真である。 ラットの椎間板髄核細胞（図４（ａ））、ラットの椎間板線維輪細胞（４図（ｂ））における培養時間とスフェロイド数の推移を示すグラフである。 ヒトの髄核細胞（図５（ａ））、ヒトの線維輪細胞（図５（ｂ））における培養時間とスフェロイド数の推移を示すグラフである。 ヒト椎間板髄核細胞のＬＡＳＣｏｌゲル上で培養したＬＡＳＣｏｌゲル群の染色結果を表す写真である。 ヒト椎間板髄核細胞のＡＣゲル上で培養したアテロコラーゲンゲル群（ＡＣゲル群）の染色結果を示す写真である。 ヒト椎間板線維輪細胞のＬＡＳＣｏｌゲル群の染色結果を示す写真である。 ヒト椎間板線維輪細胞のＡＣゲル群の染色結果を示す写真である。 椎骨間距離の維持試験を行ったラットの尾部のレントゲン写真（図１０（ａ））とＭＲＩのＴ２強調像の写真（図１０（ｂ））である。 ラットを用いた椎骨間距離の維持試験の結果を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌの濃度違いによる椎骨間距離（％ＤＨＩ）の影響を示すグラフである。 ＬＡＳＣｏｌに成長因子を加えた効果を示すグラフである。 術後１週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。 術後２週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。 術後４週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。 術後８週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。 図１４から図１７において、プロテオグリカン陽性（サフラニン－Ｏ陽性）を示す赤色部分の面積を術後週毎に測定した結果を示すグラフである。 図１４から図１７において、髄核領域に浸潤している細胞数をカウントした結果を示すグラフである。 術後１週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後２週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後４週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後８週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術直後、術後３日、術後１週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。 術直後の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後３日の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後１週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。 術後１週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。
　以下に本発明に係る椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材として用いられるＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む。この分解物は、コラーゲンが持つ細胞との接着性が弱くなり、低接着性に変わる性質を有する。また、本発明に係る椎間板変性の治療剤としては、ハイドロゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ヒアルロン酸・コラーゲンハイドロゲル、ヒアルロン酸ポリマー、ヒアルロン酸・ＰＥＧポリマー、コラーゲン・ヒアルロン酸・ＰＥＧハイドロゲル、高純度アルギン酸ゲル（ＵＰＡＬ）といった物質や、人体親和性のある溶媒（これらをまとめて「補助物質」と呼ぶ。）を含ませてもよい。もちろん、ＬＡＳＣｏｌのみであってもよい。また、緩衝液、ｐＨ調製液、塩、細胞成長因子を加えることもできる。
　ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素で分解することによって得られる。そして、分解する際の条件によって、含まれるペプチド配列が異なる。すなわち、ＬＡＳＣｏｌは、分解の条件によって、異なる種類のＬＡＳＣｏｌが得られる。
　本発明で利用できるＬＡＳＣｏｌの特徴は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ：配列番号１）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列において、Ｙ１とＹ２の間の化学結合が切断されているα鎖の組み合わせからなる点にある。
（Ａ）－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｇ－Ｙ４－Ｙ５－Ｇ－Ｙ６－Ｙ７－Ｇ－Ｙ８－Ｙ９－Ｇ－（配列番号１）：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｙ１～Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
　コラーゲンのトリプルヘリカルドメインは、－Ｇ－Ｘ－Ｙ－（Ｇはグリシンで、ＸおよびＹは任意のアミノ酸）という配列が連続していることが知られている。上記の配列では、「－Ｙ３－Ｇ－Ｙ４－Ｙ５－」中の「Ｇ」がトリプルヘリカルドメインのＮ末端側のグリシンを表している。上記の配列をみてわかるように、Ｙ１とＹ２との間の化学結合の切断とは、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が行われていることがわかる。後述するように、分解条件が異なるとトリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じる。本発明で用いられるＬＡＳＣｏｌの１つは、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じているＬＡＳＣｏｌである。以下これをＬＡＳＣｏｌ－Ａと呼ぶ。
　なお、分解の条件によって、以下のＬＡＳＣｏｌが得られることが知られている。コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ｂ：配列番号２）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてＸ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合若しくはＸ６とＧとの間の化学結合が切断されているα鎖の組み合わせからなる。
　（Ｂ）－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｇ－Ｘ３－Ｘ４－Ｇ－Ｘ５－Ｘ６－Ｇ－（配列番号２）：（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１～Ｘ６は、任意のアミノ酸である）。これをＬＡＳＣｏｌ－Ｂと呼ぶ。ＬＡＳＣｏｌ－Ｂは、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じている。配列番号２番では「－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｇ－」のＧがトリプルヘリカルドメインのＮ末端側のグリシンである。もちろん、他のペプチドが含まれるＬＡＳＣｏｌもあり得る。椎間板変性の治療剤としてＬＡＳＣｏｌ－Ａは、現在知られているＬＡＳＣｏｌ中で最も好適である。しかし、他のＬＡＳＣｏｌを排除するものではない。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤として利用されるＬＡＳＣｏｌは、酸性状態で溶液として保存が可能である。そして、ｐＨおよび濃度を調整し、体温まで温度を上げることで、ゲル状となる。ゲル状になることで、ＬＡＳＣｏｌは、線維輪内での拡散が抑制され、細胞の誘導及び／又は細胞外基質の産生をもたらし、組織再生を達成することで椎骨間距離を維持するという効果（「椎骨間維持能」と呼ぶ。）を発揮する。
　ゲル状となったときの弾性率は、溶液中のＬＡＳＣｏｌの濃度およびｐＨ、温度に比例する。後述する実施例では、ｐＨおよび濃度を調整し、液体の状態でシリンジに吸引し、線維輪内に注射で投与し、線維輪内でゲル状にさせる例を示す。しかし、本発明に係る椎間板変性の治療剤として利用されるＬＡＳＣｏｌは、膜状や、スポンジ状にして、患部に埋め込んでもよい。なお、膜状、スポンジ状とは、ＬＡＳＣｏｌを所定の形状に乾燥したもの（形状体ともいう。）をいう。
　また、椎間板変性の治療剤として、ＬＡＳＣｏｌを補助物質と共に利用してもよい。椎骨間維持能という機械的な強度は補助物質が担い、ＬＡＳＣｏｌは、周囲の細胞から髄核の成分であるプロテオグリカンを産生する細胞を遊走・浸潤し、髄核細胞を再生する役目を担うことで、椎間板変性の治療剤となるからである。
　後述するように本発明で用いるＬＡＳＣｏｌは、濃度３．５ｍｇ／ｍｌ（後述する「実用弾性率」で２０Ｐａ）以上であれば、ゲル状を呈するといえる。したがって、この濃度以上のＬＡＳＣｏｌは、補助物質と混ぜることで、髄核細胞を再生する椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材を得ることができる。
　また、濃度が７ｍｇ／ｍｌ以上であれば単体で椎骨間維持能を有し、２１ｍｇ／ｍｌ以上になれば、単体でもアテロコラーゲン以上の椎骨間維持能を有する。
　したがって、本発明で用いることのできるＬＡＳＣｏｌは、３．５ｍｇ／ｍｌ以上で利用でき、好ましくは７ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で用いることができる。なお、ゲルとしての濃度の上限は少なくとも４２ｍｇ／ｍｌ以上であるが、それ以上の濃度であっても椎間板変性の治療剤として利用することができる。
　ＬＡＳＣｏｌの作製方法に関する知見としては、ＬＡＳＣｏｌ－ＢもＬＡＳＣｏｌ－Ａもほぼ同じである。そこで、どちらにも共通する知見については、単にＬＡＳＣｏｌとして説明する。また、以下の説明で「分解物」とはＬＡＳＣｏｌを意味する。
　＜ＬＡＳＣｏｌの材料＞
　ＬＡＳＣｏｌの材料になるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、特に限定されず、周知のコラーゲンおよびアテロコラーゲンであればよい。
　コラーゲンとしては、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒト、ラットまたはマウスなど）、鳥類（例えば、ニワトリなど）、または、魚類（例えば、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイ、サケなど）または爬虫類（例えば、スッポン）のコラーゲンを用いることができる。
　本発明で用いるコラーゲンは、例えば、上記哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜などに由来するコラーゲン、上記魚類の皮膚または鱗などに由来するコラーゲン、上記爬虫類の真皮、腱、骨などに由来するコラーゲンを用いることができる。
　また、ＬＡＳＣｏｌの作製に用いるアテロコラーゲンとしては、上記哺乳類、鳥類、魚類または爬虫類のコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンなど）によって処理して得られる、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端からテロペプチドが部分的に除去されているアテロコラーゲンを用いることができる。
　これらの中では、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒトまたはラットのコラーゲンまたはアテロコラーゲンが好ましく用いることができる。また、ブタ、ウシまたはヒトのコラーゲンまたはアテロコラーゲンをＬＡＳＣｏｌの材料として更に好ましく用いることができる。
　また、ＬＡＳＣｏｌの材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることもできる。魚類を用いれば、材料を簡便に、安全に、かつ大量に入手可能であり、ヒトに対してよりウイルスフリーの安全なコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物（ＬＡＳＣｏｌ）を提供することができる。
　なお、ＬＡＳＣｏｌの材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いる場合には、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、ブラックバス、ブルーギル、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが好ましく、マグロ、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが更に好ましい。
　ＬＡＳＣｏｌの材料としてアテロコラーゲンを用いる場合、熱による変性温度が、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であるアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、分解物の材料として魚類のアテロコラーゲンを用いる場合、マグロ（例えば、キハダマグロ）またはコイ、ティラピアなどのアテロコラーゲンは熱変性温度が２５℃以上であるので、これらのアテロコラーゲンを用いることが好ましい。
　上記構成であれば、本実施の形態の椎間板変性の治療剤のゲル状になる温度を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上に調節することができる。その結果、上記構成であれば、貯蔵時の安定性、利用時の安定性に優れた椎間板変性の治療剤を実現することができる。
　これらのコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、周知の方法によって入手することができる。例えば、哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンに富んだ組織をｐＨ２～４程度の酸性溶液に投入することによって、コラーゲンを溶出することができる。更に、当該溶出液にペプシンなどのプロテアーゼを添加して、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端のテロペプチドを、部分的に除去する。更に、当該溶出液に塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿させることができる。
　ＬＡＳＣｏｌを得るには、コラーゲンまたはアテロコラーゲンに酵素を作用させて、これらの材料を分解する。しかし、既にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合が切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を作製する（例えば、化学合成法、組み換えタンパク質の発現）ことでＬＡＳＣｏｌを得ることもできる。
　以下に、上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解しＬＡＳＣｏｌを得る方法について説明する。
　上記酵素としては特に限定されないが、例えば、システインプロテアーゼを用いることが好ましい。
　システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。
　このようなシステインプロテアーゼとしては、アクチニダイン［ＥＣ　３．４．２２．１４］、パパイン［ＥＣ　３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ　３．４．２２．３］、ブロメライン［ＥＣ　３．４．２２．３２］、カテプシンＢ［ＥＣ　３．４．２２．１］、カテプシンＬ［ＥＣ　３．４．２２．１５］、カテプシンＳ［ＥＣ　３．４．２２．２７］、カテプシンＫ［ＥＣ　３．４．２２．３８］、カテプシンＨ［ＥＣ　３．４．２２．１６］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。なお、鍵括弧内は酵素番号である。
　これらの中では、アクチニダイン、パパイン、フィシン、カテプシンＫ、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、アクチニダイン、パパイン、フィシン、カテプシンＫを用いることが更に好ましい。
　上述した酵素は、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製；細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出；遺伝子工学的手段による酵素の作製；などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。
　コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解することによって切断を行う場合には、例えば、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法にしたがって切断工程を行うことができる。以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法は、あくまでも切断工程の一例であって、ＬＡＳＣｏｌの製造方法は、これら（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法に限定されない。
　なお、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の方法で、ＬＡＳＣｏｌ－Ｂを得ることができる。また、以下の（ｉｉｉ）の方法は、ＬＡＳＣｏｌ－ＡとＬＡＳＣｏｌ－Ｂを得ることができる。
（ｉ）高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
（ｉｉ）高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。
（ｉｉｉ）低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
　上述した（ｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。
　上述した（ｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液と酵素とを予め接触させ、その後、当該酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法を挙げることができる。
　上述した（ｉｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、低濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。上記水溶液の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、水を用いることが可能である。
　上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌまたはＭｇＣｌ２を用いることが可能である。
　上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、高いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭ以上であることが好ましく、５００ｍＭ以上であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上であることが最も好ましい。
　上記低濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、低いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭよりも低いことが好ましく、１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることがより好ましく、略０ｍＭであることが最も好ましい。
　上記水溶液（例えば、水）に溶解させるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの量は特に限定されないが、例えば、１０００重量部～１００００重量部の水溶液に対して、１重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを溶解させることが好ましい。
　上記構成であれば、水溶液に対して酵素が加えられた場合、当該酵素とコラーゲンまたはアテロコラーゲンとを効率よく接触させることができる。そして、その結果、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素によって効率よく分解することができる。
　上記水溶液に加える酵素の量は特に限定されないが、例えば、１００重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンに対して、１０重量部～２０重量部の酵素を加えることが好ましい。
　上記構成であれば、水溶液中の酵素の濃度が高いので、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。
　水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させるときの他の条件（例えば、水溶液のｐＨ、温度、接触時間など）も特に限定されず、適宜、設定することができるが以下の範囲であることが好ましい。なお、以下にこれらの条件の好ましい範囲について例示する。
　１）水溶液のｐＨは、ｐＨ２．０～７．０が好ましく、ｐＨ３．０～６．５が更に好ましい。水溶液のｐＨを上述した範囲に保つために、水溶液に対して周知のバッファーを加えることが可能である。上記ｐＨであれば、水溶液中にコラーゲンまたはアテロコラーゲンを均一に溶解することができ、その結果、酵素反応を効率よく進めることができる。
　２）温度は特に限定されず、用いる酵素に応じて温度を選択すればよい。例えば、当該温度は、１５℃～４０℃であることが好ましく、２０℃～３５℃であることがより好ましい。
　３）接触時間は特に限定されず、酵素の量、および／または、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの量に応じて接触時間を選択すればよい。例えば、当該時間は、１時間～６０日間であることが好ましく、１日間～７日間であることがより好ましく、３日間～７日間であることがさらに好ましい。
　なお、水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させた後、必要に応じて、ｐＨを再調整する工程、酵素を失活させる工程、および、不純物を除去する工程からなる群より選択される少なくとも１つの工程を経てもよい。
　また、上記不純物を除去する工程は、物質を分離するための一般的な方法によって行うことができる。上記不純物を除去する工程は、例えば、透析、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、または、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって行うことができる。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤は、主として外科的手術によって、椎間板中に注射などにより投与される。なお、この際には、椎間板変性の治療剤に含まれるＬＡＳＣｏｌは、所定以上の弾性率（後述する実用弾性率）を有するのが望ましい。弾性率が低い状態であると、椎間板からＬＡＳＣｏｌが流れ出てしまうおそれがあるからである。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤若しくは椎間板細胞培養材は、ゲル状態や乾燥状態（粉末および形状体を含む）などで供給される。また、本発明に係る椎間板変性の治療剤若しくは椎間板細胞培養材を所定の濃度で使用するとは、乾燥状態のＬＡＳＣｏｌに対して一定の溶媒を加える指示が添付若しくは通知され、その結果、本発明に係る好適な濃度のＬＡＳＣｏｌになる場合も含まれる。
　本明細書で「投与」とは、患部（椎間板）を介して患者に治療剤を与えること、をいう。また、本発明を用いて治療する椎間板障害は、代表例である椎間板ヘルニアに加えて腰痛症、脊柱管狭窄症、脊柱変形といった椎間板変性に関連した疾患等に適用することができる。言い換えると本発明は、本発明に係る椎間板変性の治療剤を用いた、椎間板変性の治療方法と言える。また、本発明に係る椎間板細胞の培養材を用いた椎間板細胞の培養方法とも言える。
　＜ＬＡＳＣｏｌを含む溶液の作製＞
　塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭと１５００ｍＭである５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒として、水を用いた。
　アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭのジチオスレイトールおよび５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献１参照）。
　次いで、塩を含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献１参照）。
　上述した分解物をラウリル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。
　次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。
　なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。
　表１に、塩濃度が０ｍＭと１５００ｍＭの場合のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。
　表１に示すように、塩濃度が低いと（０ｍＭ）、「ＧＰＭＧＰＳＧＰＲＧ・・・」で表されるトリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと（１５００ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じる。配列番号３では、左から３番目のグリシン（Ｇ）からＣ末端に向かってトリプルヘリカルドメインが始まる。０ｍＭの時に生成したものがＬＡＳＣｏｌ－Ａの溶液であり、１５００ｍＭで生成したものがＬＡＳＣｏｌ－Ｂの溶液である。以下の実施例ではＬＡＳＣｏｌ－Ａの溶液をＬＡＳＣｏｌの溶液として使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、ＬＡＳＣｏｌ－Ａは、α２鎖でも切断が生じる。表２において、配列番号５は、α２鎖のアミノ酸末端部分を示す。配列番号５では「・・ＧＰＭＧＬＭＧ・・・」の左端のグリシン（Ｇ）からＣ末端に向かってトリプルヘリカルドメインが始まる。そしてＬＡＳＣｏｌ－Ａの作成条件である塩濃度が０ｍＭの時のα２鎖の末端を配列番号６に示す。これは配列番号２を参照し、ＧとＸ３との間の化学結合が切断されていることに相当する。
　つまり、ＬＡＳＣｏｌ－Ａはα１鎖ではトリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じているが、α２鎖ではトリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じている。ＬＡＳＣｏｌ－Ａは配列番号３若しくは配列番号６のいずれかの切断を有していればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１には、ＬＡＳＣｏｌを含む溶液の弾性特性（複素弾性率における貯蔵弾性率Ｇ’）を示す。横軸は時間（分）であり、縦軸は貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）である。図１（ａ）と図１（ｂ）は、横軸は同じであるが、縦軸が異なる。図１（ｂ）の縦軸のスケールは図１（ａ）より大きい。図１（ａ）および図１（ｂ）のそれぞれの曲線はＬＡＳＣｏｌの濃度の違いを表す。濃度の異なるＬＡＳＣｏｌ溶液は、最終濃度が２．１ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．９ｍｇ／ｍＬ（以上図１（ａ））、２１ｍｇ／ｍｌ（図１（ｂ）になるように５ｍＭの塩酸溶液で調製した。
　これらＬＡＳＣｏｌは、酸性溶液中に５℃から１０℃で保存される。この状態ではＬＡＳＣｏｌは液状で保存できる。図１は、ＬＡＳＣｏｌにｐＨ調整剤と濃度調整液を加え、ｐＨをほぼ７．４に調整した後に、動的粘弾性測定装置（レオメーター、ＨＡＡＫＥ　ＭＡＲＳ　ＩＩＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にセットし、３７℃に昇温後測定した結果である。測定条件は、周波数１Ｈｚ、振り幅６°／秒、ひずみ量１％とした。なお、昇温は数秒で完了する。
　図１（ａ）を参照して、何れの濃度の場合も、測定開始した直後の貯蔵弾性率Ｇ’は低かった。その後、どの濃度においても、貯蔵弾性率Ｇ’は上昇し、約１０分後で飽和値に近くなった。一方、図１（ｂ）では、測定開始１分で飽和値まで貯蔵弾性率Ｇ’は上昇し、その後緩やかに下降し飽和した。図１および図２より明らかなように、濃度を高くすることで貯蔵弾性率Ｇ’が上昇するまでの時間も短くなった。
　このことから、ｐＨおよび濃度を調整し、温度を上昇させるとＬＡＳＣｏｌを含む溶液の貯蔵弾性率Ｇ’は、濃度に応じた所定の値まで上昇することがわかった。また、ＬＡＳＣｏｌを所定濃度に調製し、３７℃にしてから３０分経過するとほぼ貯蔵弾性率は安定した値となることがわかった。そこで、この時の貯蔵弾性率をＬＡＳＣｏｌの「実用弾性率」と呼ぶ。
　ＬＡＳＣｏｌは適切な条件に暴露することで、弾性率が測定できないゾルから弾性率を定量できるゲルに性状が変化し、特に生体に注入する上でインジェクタブルゲルとして利用できることが示された。
　図２はレオメーターで３７℃で３０分経過した後の「ひずみ（レオメーターの駆動側の回転方向の変位）」と「応力（レオメータの受動側が受ける応力）」の関係を表すものである。左縦軸はひずみφ（ｒａｄ）であり、右縦軸は応力Ｍ（μＮｍ）であり、横軸はマシンステップ数であり無単位であるが、５００ステップで１秒に相当する。すなわち、図２の各図は、５×１０－４ｒａｄから－５×１０－４ｒａｄまでの往復を１秒かけて測定したものである。
　図２（ａ）は、ＬＡＳＣｏｌ濃度が２．１ｍｇ／ｍｌの場合であり、図２（ｂ）はＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌであり、図２（ｃ）はＬＡＳＣｏｌ濃度が５．６ｍｇ／ｍｌである。それぞれの実用弾性率は、８Ｐａ、２０Ｐａ、７０Ｐａであった。ＬＡＳＣｏｌ濃度が２．１ｍｇ／ｍｌ（図２（ａ））では、ひずみに対して応力の応答性はほとんどなかった。つまりＬＡＳＣｏｌは、液体に近い状態といえる。ＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌ（図２（ｂ））に上昇すると、ひずみに相当する応力の応答性が見られた。
　ＬＡＳＣｏｌの濃度がさらに上がると（図２（ｃ））、応力は加えられたひずみと同期するようになった。なお、ひずみと応力の位相がずれるのは、ゲルが損失弾性率を持つからである。したがって、図２（ｂ）のＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌの時点でゲル状を呈するようになると判断できた。これは実用弾性率では、２０Ｐａに相当した。
　椎間板変性の治療剤として利用する場合は、ゲル状になった際の貯蔵弾性率は、２０Ｐａが下限であると考えられる。ＬＡＳＣｏｌは細胞の足場としての機能も有しているため、１か所にある程度貯留している必要がある。２０Ｐａより低い弾性では、ＬＡＳＣｏｌはゲルとしての挙動をしないため、椎間板中に貯留することが困難と考えられるからである。
　以下に本発明に係る椎間板変性の治療剤の実施例について説明する。なお、以下の実験は、全て神戸大学医学倫理委員会ならびに同動物実験委員会の承認を得て行われたものである。
　ヒトの椎間板の髄核と線維輪のサンプルを腰椎椎間板切除または椎体間固定術で患者から取り出した。患者数（ｎ数）は１５であった。患者の年齢は４６．１±２４．１歳であり、男性８名、女性７名であった。また、椎間板変性の度合いを表すＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類では中央値が２であった。
　また、１２週齢のスプラグ・ダウリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔ：以下「ＳＤラット」と呼ぶ。）の椎間板髄核細胞と線維輪細胞も取り出した。
　次に２４ウエルプレートに、７．０ｍｇ／ｍｌのＬＡＳＣｏｌゲルを固定したもの、２．１ｍｇ／ｍｌのアテロコラーゲンゲルを固定したものを用意した。培養したサンプル細胞は、ラットおよびヒトそれぞれｎ＝６とした。各サンプルは、それぞれのプレートに入れられた、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で１９２時間培養した。
　なお、ＬＡＳＣｏｌゲル上で培養された細胞は、ＬＡＳＣｏｌゲル群と呼び、アテロコラーゲンゲル上で培養された細胞はＡＣゲル群と呼ぶ。
　その結果、アテロコラーゲンゲル上では、ヒト椎間板髄核細胞及びヒト線維輪細胞は共に有意に増殖した。一方、ＬＡＳＣｏｌゲル上では、明らかにこれらの細胞は増殖しなかった。しかしながら、細胞の凝集であるスフェロイドはＬＡＳＣｏｌの方が多く観察された。なお、図３は、培養された細胞がスフェロイドになった状態を示す写真である。
　図３を参照する。図３（ａ）は、ＬＡＳＣｏｌゲル上でのスフェロイドを示し、図３（ｂ）はアテロコラーゲンゲル上でのスフェロイドを示す。写真中のスケールバーは１００μｍを示す。図３（ａ）では、多くの細胞が密集しスフェロイド（三角矢印）を形成しているのに対して、図３（ｂ）では、数個の細胞が集まっているだけである（三角矢印）。
　図４および図５は、それぞれ、ラットの椎間板髄核細胞（図４（ａ））、線維輪細胞（図４（ｂ））、ヒトの椎間板髄核細胞（図５（ａ））、線維輪細胞（図５（ｂ））における培養時間とスフェロイド数の推移を示すグラフである。それぞれ横軸は培養時間（時間）であり、縦軸はスフェロイド数である。なお、スフェロイドは細胞が３個以上凝集したものとし、１００倍の倍率の視野内での個数をカウントしたものである。
　例えば図３（ｂ）の三角矢印で示した状態のものをスフェロイドとしてカウントした。もちろん、図３（ａ）に示したように、多数の細胞が集まっている場合はスフェロイドとした。図４及び図５のいずれのグラフでも実線がＬＡＳＣｏｌゲル群であり、点線がＡＣゲル群である。それぞれのグラフでは、平均±標準偏差で記載し、統計学的解析にはＴｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｐｏｓｔ－ｈｏｃ　ｔｅｓｔを使用した。
　図４（ａ）、図４（ｂ）のラット細胞の結果を参照する。どちらの細胞種でも、ＬＡＳＣｏｌゲル群ではスフェロイドは増加していた。しかし、ＡＣゲル群では増加は見られなかった。スフェロイド数は、培養開始後１２時間から１９２時間までＬＡＳＣｏｌゲル群で有意に多かった。
　図５（ａ）、図５（ｂ）のヒト細胞の結果を参照する。いずれの細胞種でもＬＡＳＣｏｌゲル群はスフェロイド数が増加していた。しかし、ＡＣゲル群ではスフェロイド数の増加は見られなかった。スフェロイド数は、髄核細胞では培養開始後４８時間から１９２時間まで、線維輪細胞では２４時間から１９２時間までＬＡＳＣｏｌゲル群で有意に多かった。
　以上のことから、ＬＡＳＣｏｌゲル環境で細胞を培養すると、アテロコラーゲンゲル環境で培養する場合と比べ、髄核細胞でも線維輪細胞でも、スフェロイドの数が多く、またスフェロイドを構成する細胞も多くなるといえる。すでに述べたようにＬＡＳＣｏｌがゲル状になるのは、濃度が３．５ｍｇ／ｍｌ以上（実用弾性率で２０Ｐａ以上）であった。したがって、ＬＡＳＣｏｌ濃度が３．５ｍｇ／ｍｌ以上（少なくとも７．０ｍｇ／ｍｌ以上）であれば、生体内で細胞を培養しスフェロイド形成能を発揮するといえる。
　次に細胞の表現型毎に免疫染色を行う培養細胞多重蛍光免疫染色を行った。髄核細胞については、ＤＮＡと結合するＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、髄核・脊索マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙ、前駆細胞のマーカーであるＴｉｅ２、および細胞外マトリックスであるアグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）を用いた。線維輪細胞に対しては、ＤＡＰＩ、線維輪のマーカーであるＰＡＸ１、Ａｇｇｒｅｃａｎを用いた。
　図６はヒト椎間板髄核細胞のＬＡＳＣｏｌゲル群の染色結果を表す写真において、染色された部分だけを黒色にし、他を白色に画像処理した写真である。右下のスケールバーはそれぞれ１００μｍである。図６（ａ）から図６（ｄ）はそれぞれＤＡＰＩ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｉｅ２、Ａｇｇｒｅｃａｎの結果である。図６（ｅ）は全てを合わせた図である（「Ｍｅｒｇｅ」と記した。）。
　ＤＡＰＩ（図６（ａ））では複数のスフェロイド形成が認められた。また、髄核・脊索マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙ（図６（ｂ））、前駆細胞マーカーのＴｉｅ２（図６（ｃ））、細胞外マトリックスを構成するＡｇｇｒｅｃａｎ（図６（ｄ））ではスフェロイドに一致した強い発現が観察された。
　図７はヒト椎間板髄核細胞のＡＣゲル群の染色結果を示す写真である。図６と同様に染色された部分だけを黒色とし、他は白色に画像処理した写真である。右下のスケールバーはそれぞれ１００μｍである。ＤＡＰＩ（図７（ａ））では一様な細胞の分布が認められた。図６（ａ）のような細胞が凝集したスフェロイド形成は認められなかった。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（図７（ｂ））およびＴｉｅ２（図７（ｃ））ではほとんど発現が認められなかった。つまり、髄核・脊索および前駆細胞の存在は認められなかった。Ａｇｇｒｅｃａｎ（図７（ｄ））では細胞の分布（図７ａ））に一致した弱い発現が認められた。
　図８はヒト椎間板線維輪細胞のＬＡＳＣｏｌゲル群の染色結果を示す写真である。図６と同様に染色された部分だけを黒色とし、他は白色に画像処理した写真である。右下のスケールバーはそれぞれ１００μｍである。ＤＡＰＩ（図８（ａ））では複数のスフェロイド形成が認められた。線維輪マーカーであるＰＡＸ１（図８（ｂ））およびＡｇｇｒｅｃａｎ（図８（ｃ））ではスフェロイド（図８（ａ））に一致した強い発現が認められた。
　図９はヒト椎間板線維輪細胞のＡＣゲル群の染色結果を示す写真である。図６と同様に染色された部分だけを黒色とし、他は白色に画像処理した写真である。右下のスケールバーはそれぞれ１００μｍである。ＤＡＰＩ（図９（ａ））では一様な細胞の分布が認められたが、スフェロイド形成は見られなかった。線維輪マーカーであるＰＡＸ１（図９（ｂ））とＡｇｇｒｅｃａｎ（図９（ｃ））では細胞分布（図９（ａ））に一致した弱い発現が認められた。
　以上のことより、ＬＡＳＣｏｌは髄核細胞および線維輪細胞のスフェロイドを促進させ、それによって、組織を再生させる髄核細胞、前駆細胞、線維輪細胞が遊走・浸潤・定着し、組織に特異的な細胞外マトリックス（Ａｇｇｒｅｃａｎ）が発現される。この点アテロコラーゲンでは細胞数は増えるものの、髄核細胞、前駆細胞、線維輪細胞はほとんど検出できず、組織の細胞外マトリックスはほとんど発現されない。すなわち、ＬＡＳＣｏｌは、髄核細胞および線維輪細胞の機能を維持してさらに高める培養材として利用することができる。
　これはＬＡＳＣｏｌが単体での椎骨間維持能が低い場合でも、補助物質と混ぜて使用すれば、椎骨間を維持しながら、髄核細胞、前駆細胞、線維輪細胞の再生を期待できることを示している。なお、後述する実施例において実際にＬＡＳＣｏｌが髄核細胞を取り去った椎骨間に周囲の細胞から髄核の成分であるプロテオグリカンを産生する細胞を遊走・浸潤させることができることを示す。
　次にラットを用いたｉｎ　ｖｉｖｏの実験結果について説明する。実験には、１２週齢のＳＤラットを用いた。全身麻酔下にＳＤラットの尾の皮膚に小切開を加え、８－９、９－１０および１０－１１番の尾椎骨の間の椎間板から髄核摘出を行った後、２１．０ｍｇ／ｍｌのＬＡＳＣｏｌを１５μｌ、７．０ｍｇ／ｍｌのアテロコラーゲン、コントロールとしての溶媒をそれぞれの椎間板の髄核部分に注入した。小切開はナイロン糸にて縫合した。
　そして術後０、７、１４、２８、そして５６日後の単純Ｘ線写真を撮影した。椎骨間距離を術前値で補正した値（％　Ｄｉｓｃ　Ｈｅｉｇｈｔ　Ｉｎｄｅｘ：以後「％ＤＨＩ」と呼ぶ。）は、Ｍａｓｕｄａらの方法（非特許文献２）で算出した。ＬＡＳＣｏｌ、アテロコラーゲンおよび溶媒を注入した各群を、ＬＡＳＣｏｌ投与群、ＡＣ投与群およびコントロール群と呼ぶ。
　図１０に単純エックス線写真（図１０（ａ））と術後４週のＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｍａｇｉｎｇ）のＴ２強調像（図１０（ｂ））を例示する。図１０（ａ）は、術後の経過日毎の単純エックス線写真である。矢印は、ＬＡＳＣｏｌ（第８、第９番尾椎骨間）、アテロコラーゲン（「ＡＣ」と記した。第９、第１０番尾椎骨間）およびコントロール（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と記した。第１０、第１１番尾椎骨間）を投与した箇所を表す。
　図１０（ｂ）を参照する。ＭＲＩのＴ２強調像では、ＬＡＳＣｏｌ投与群、ＡＣ投与群、コントロール群ともに、正常椎間板（図１０（ｂ）では「Ｎｏｒｍａｌ」と記した。）より輝度が低かった。しかし、ＬＡＳＣｏｌ投与群は、ＡＣ投与群やコントロール群と比較して輝度は高かった。したがって、髄核が除去された後、ＬＡＳＣｏｌ投与群は、ＡＣ投与群、コントロール群と比較して変性が低減しているといえる。
　図１１は、この単純エックス線写真より求めた％ＤＨＩと経過時間を示すグラフである。図１１を参照して、横軸は経過時間（術後週）を表し、縦軸は％ＤＨＩである。また、術後１週、術後２週そして術後４週はｎ＝８のデータに基づき、術後８週はＬＡＳＣｏｌ投与群とＡＣ投与群はｎ＝８のデータであるが、コントロールはｎ＝６のデータである。
　図１１を参照して、全ての場合について、術後７日までは％ＤＨＩは低下した。しかし、その低下の程度は、ＬＡＳＣｏｌは有意にコントロールよりも高い値で低下が止まった。また、ＬＡＳＣｏｌ投与群とＡＣ投与群およびＡＣ投与群とコントロール群の間に優位な差は認められなかった。その後はＬＡＳＣｏｌ投与群、ＡＣ投与群およびコントロール群の％ＤＨＩは全て低下傾向を示した。
　次に％ＤＨＩに対するＬＡＳＣｏｌの濃度の違いによる効果を調べた。濃度違いのサンプルとして、７ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、４２ｍｇ／ｍｌのＬＡＳＣｏｌを用意した。また、対比として、７ｍｇ／ｍｌのアテロコラーゲンとコントロールの溶媒も用意した。
　７ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＡＳＣｏｌを用いたラットを「７ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群」、１４ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＡＳＣｏｌを用いたラットを「１４ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群」、２１ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＡＳＣｏｌを用いたラットを「２１ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群」、４２ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＡＳＣｏｌを用いたラットを「４２ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群」とする。また、７ｍｇ／ｍｌのアテロコラーゲンを与えたラットを７ｍｇＡＣ投与群とする。
　結果を図１２（ａ）に示す。横軸は術後の経過時間（術後週）であり、縦軸は％ＤＨＩである。また、各群のラットの使用匹数を図１２（ｂ）に示す。術後８週の時点で、４２ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群、２１ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群および７ｍｇＡＣ投与群はコントロールに対して有意に高い％ＤＨＩの値を示した。したがって、少なくとも２１ｍｇ／ｍｌ以上のＬＡＳＣｏｌは単独で椎骨間維持能を有するといえる。
　次にＬＡＳＣｏｌに成長因子を加えた場合の効果について調べた。成長因子の混合で、髄核部分での細胞再生が期待できる。成長因子としては、ＯＰ－１（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－１）を入れたものを用意した。なお、成長因子としては、ＯＰ－１の他、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β１、ＧＤＦ－５、ＢＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ－１といったものを使用してもよい。ＯＰ－１の濃度は、２１ｍｇ／ｍｌの濃度のＬＡＳＣｏｌ１５μｌに対して２μｇのＯＰ－１を混合した。これをＯＰ－１＋ＬＡＳＣｏｌ投与群と呼ぶ。
　図１３（ａ）には、ＯＰ－１＋ＬＡＳＣｏｌ投与群、２１ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群、７ｍｇＡＣ投与群およびコントロールの％ＤＨＩの結果を示す。横軸は術後週であり、縦軸は％ＤＨＩである。また、各群のラットの使用匹数は図１３（ｂ）に示す。
　図１３（ａ）を参照して、ＯＰ－１＋ＬＡＳＣｏｌ投与群、２１ｍｇＬＡＳＣｏｌ投与群ともに術後４週までの間、コントロールよりも％ＤＨＩは有意に高かった。したがって、この結果からも、少なくとも２１ｍｇ／ｍｌ以上のＬＡＳＣｏｌは単独でアテロコラーゲンと同等以上の椎骨間維持能を有するといえる。
　したがって、椎間板変性の治療剤としてヒトに単体で適用する場合、ＬＡＳＣｏｌは２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度であるのが好適であると考えられる。
　なお、ラットの尾骨の髄核領域に投与するＬＡＳＣｏｌの量は微量（１５μｌ）であるので、４２ｍｇ／ｍｌという濃度は、取扱濃度としては、上限に近い。しかし、ヒトに適用する場合は、投与方法や形態の工夫により、乾燥状態を含むより高い濃度まで使用できると考えられる。
　図１４は術後１週のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。より具体的には、ラットの尾の椎間板とその椎間板の両側にある尾椎骨を取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋して、切断面を作成し、サフラニン－Ｏで染色した。サフラニン－Ｏでは代表的な細胞外基質であるプロテオグリカンが赤色に染色される。図１４の各写真は、染色した写真を白黒に画像処理したものである。いずれの写真も左右に尾椎骨があり、尾椎骨の間を標本にしたものである。図１４（ｅ）に尾椎骨および髄核領域を示した。他の写真および以後の図１５から図１７の写真も同じである。
　図１４（ａ）及び図１４（ｂ）はラット尾椎髄核を摘出した後、髄核領域（髄核があった部分をいう。）に２１ｍｇ／ｍｌの濃度のＬＡＳＣｏｌを充填した場合を示す（これはＬＡＳＣｏｌ投与群である。）。図１４（ｃ）及び図１４（ｄ）は髄核領域に７ｍｇ／ｍｌの濃度のアテロコラーゲンを充填した場合（これはＡＣ投与群である。）を示す。図１４（ｅ）及び図１４（ｆ）は髄核領域に溶媒を充填した場合を示す（図１４中では「コントロール」と記した。）。
　各写真において右下のスケールバーは１００μｍを示し、図１４（ａ）と図１４（ｂ）、図１４（ｃ）と図１４（ｄ）、図１４（ｅ）と図１４（ｆ）はそれぞれ同一部分の倍率違いの写真である。図１４（ｅ）および図１４（ｆ）にスケールバーを示した。他の写真および以後の図１５から図１７の写真も同様である。
　図１４（ａ）及び図１４（ｂ）を参照して、ＬＡＳＣｏｌ投与の場合では、髄核領域において赤色に濃染された部分が観測され、プロテオグリカンが豊富な領域（矢頭）があった。また、プロテオグリカンが豊富な領域には細胞の浸潤が認められた。
　図１４（ｃ）及び図１４（ｄ）を参照して、アテロコラーゲン投与の場合も髄核領域において赤色に染色された部分（矢頭）が認められた。しかし、その色調は図１４（ａ）及び図１４（ｂ）のＬＡＳＣｏｌ投与した場合と比較して淡く、浸潤した細胞もごくわずかであった。
　図１４（ｅ）及び図１４（ｆ）を参照して、溶媒投与の場合では髄核領域において赤色に染色された部分はなく、細胞も認められなかった。
　図１５、図１６、図１７はそれぞれ、術後２週、術後４週、術後８週の場合のラット尾椎髄核領域の組織標本をサフラニン－Ｏで染色した写真である。それぞれの写真において、（ａ）及び（ｂ）はラット尾椎髄核を摘出した後、髄核領域にＬＡＳＣｏｌを充填した場合を示す。（ｃ）及び（ｄ）は髄核領域にアテロコラーゲンを充填した場合を示す。（ｅ）及び（ｆ）は髄核領域に溶媒を充填した場合を示す（各図中ではコントロールと記した。）。
　図１７（ａ）及び図１７（ｂ）を参照して、ＬＡＳＣｏｌ投与の場合では髄核領域が赤く濃染された。これはプロテオグリカンが豊富であることを示している。また、髄核領域への細胞浸潤も確認された。
　図１７（ｃ）及び図１７（ｄ）を参照して、アテロコラーゲン投与の場合も髄核領域において赤色に染色された部分が認められた。しかし、その色調は図１７（ａ）及び図１７（ｂ）のＬＡＳＣｏｌ投与した場合と比較して淡く、浸潤した細胞もごくわずかであった。
　図１７（ｅ）及び図１７（ｆ）を参照して、溶媒投与の場合では髄核領域において赤色に染色された部分はなく、細胞も認められなかった。結果、術後１週の場合とほぼ同じ結果が得られた。
　図１８は、図１４から図１７をより定量的に調べた結果を示す。横軸は術後週であり、縦軸はプロテオグリカン陽性を示す赤色部分の面積（×１０３μｍ２）である。各術後週において、ＬＡＳＣｏｌ投与群、ＡＣ投与群およびコントロール群が併記されている。術後１週の部分に、ＬＡＳＣｏｌ投与群を「Ｌ」で表し、アテロコラーゲン投与群を「ＡＣ」で表し、コントロール群を「Ｃｏｎｔ」で示した。
　術後１週ではＬＡＳＣｏｌ群では（３．３３±０．８９）×１０５μｍ２、アテロコラーゲン群は（１．２７±０．２９）×１０５μｍ２、コントロール群は（７．４７±３．６７）×１０３μｍ２であった。術後２週ではそれぞれ、（２．８３±０．３０）×１０５μｍ２、（１．３６±０．３７）×１０５μｍ２、（５．０３±２．７０）×１０３μｍ２であった。術後４週ではそれぞれ、（２．６４±０．７３）×１０５μｍ２、（６．５５±１．５３）×１０４μｍ２、（３．５０±１．３９）×１０３μｍ２であった。術後８週ではそれぞれ、（２．４４±０．５９）×１０５μｍ２、（７．８０±５．０３）×１０４μｍ２、（２．５２±１．６８）×１０３μｍ２であった。
　いずれの時点でもＬＡＳＣｏｌ投与群は他の２群より有意に面積が大きく、アテロコラーゲン投与群はコントロール群より有意に大きかった。また、術後１週から８週にかけて、いずれの投与群でも有意な変化は認められなかった。
　図１９は、図１４から図１７において、髄核領域に浸潤している細胞数をカウントした結果を示す。横軸は術後週であり、縦軸は髄核領域に浸潤している椎間板あたりの細胞の数（個／椎間板）である。各術後週において、ＬＡＳＣｏｌ投与群、ＡＣ投与群およびコントロール群が併記されている。術後１週の部分に、ＬＡＳＣｏｌ投与群を「Ｌ」で表し、アテロコラーゲン投与群を「ＡＣ」で表し、コントロール群を「Ｃｏｎｔ」で示した。
　術後１週ではＬＡＳＣｏｌ投与群では細胞数は平均６６．３±９．４個、アテロコラーゲン投与群は２０．４±７．１個、コントロール群は２．３±２．２個であった。術後２週ではそれぞれ６２．４±１７．４個、１９．２±５．６個、１．０±０．７個であった。術後４週ではそれぞれ７７．８±２３．２個、２３．３±５．３個、２．０±２．２個であった。術後８週ではそれぞれ６５．８±１８．０個、２８．８±８．７個、２．６±２．４個であった。
　いずれの時点でもＬＡＳＣｏｌ投与群は他の２群より細胞数が有意に多く、アテロコラーゲン投与群はコントロール群より有意に多かった。また、術後１週から８週にかけて、いずれの群でも有意な変化は認められなかった。
　図２０は、術後１週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した写真である。多重蛍光免疫はＤＡＰＩ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｉｅ２およびＡｇｇｒｅｃａｎで行った。より具体的には、ラットの尾の椎間板とその椎間板の両側にある尾椎骨を取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋して、切断面を作成した。次にキシレンを用いて脱パラフィン処理をし、緩衝液を用いた温浴法で賦活化、過酸化水素水にてブロッキングした。そして、各マーカーで一次抗体反応させ、動物種ごとに標識二次抗体反応を行い、封入した。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群では髄核領域にＢｒａｃｈｙｕｒｙ，Ｔｉｅ２陽性細胞を認め、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現も強く見られた。一方、アテロコラーゲン投与群とコントロール群ではＢｒａｃｈｙｕｒｙ，Ｔｉｅ２陽性細胞はほとんどなく、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現も弱かった。
　図２１、図２２、図２３は、それぞれ術後２週、術後４週、術後８週の髄核領域を多重蛍光免疫染色した画像を白黒に処理した結果である。多重蛍光免疫染色の結果は、図２０の場合と同じ傾向であった。
　図２４には、術直後、術後３日、術後１週における髄核部分のサフラニン－Ｏによる染色の結果写真を示す。図２４（ａ）～図２４（ｃ）はＬＡＳＣｏｌ投与群（「ＬＡＳＣｏｌ」と記した。）であり、図２４（ｄ）～図２４（ｆ）はアテロコラーゲン投与群（「ＡＣ」と記した。）であり、図２４（ｇ）～図２４（ｉ）はコントロール群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と記した。）である。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群では術直後は髄核領域に緑色に染色されたＬＡＳＣｏｌゲルが認められた。術後３日、１週ではゲル内に多数の細胞浸潤が認められた。アテロコラーゲン投与群でも術直後から１週で髄核領域に緑色のコラーゲンゲルが認められたが、術後３日、１週では細胞はゲル表面にわずかに認めるのみであった。コントロール群は術直後および術後３日では、髄核領域は空隙であった。術後１週では髄核領域は圧潰した状態であり、細胞浸潤も認められなかった。このように、ＬＡＳＣｏｌは、投与後３日で細胞浸潤が認められた。
　図２５～図３０には、髄核領域の多重蛍光免疫染色の写真を示す。図２５は術直後、図２６は術後３日、図２７～図２９は術後１週の場合である。それぞれＬＡＳＣｏｌ投与群を「ＬＡＳＣｏｌ」、アテロコラーゲン投与群を「ＡＣ」、コントロール群を「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と記した。
　図２５（術直後）を参照する。図２５（ａ）～図２５（ｄ）はＬＡＳＣｏｌ投与群、図２５（ｅ）～図２５（ｈ）はアテロコラーゲン投与群、図２５（ｉ）～図２５（ｌ）は、コントロール群である。各群に対して、ＤＡＰＩ、Ｃｏｌ１（Ｉ型コラーゲンに反応する。）、Ｃｏｌ２（ＩＩ型コラーゲンに反応する。）による染色結果である。Ｍｅｒｇｅは、図２５内での併合を表す。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群、アテロコラーゲン投与群では髄核領域にＣｏｌ１で濃染する領域があり、注入した各コラーゲンゲルの存在を示していた。また、ＬＡＳＣｏｌ、アテロコラーゲンともＣｏｌ２は陰性であった。また、３群ともＤＡＰＩによる染色で染色される部分がほとんどなく、髄核細胞はほとんど除去されていることが分かった。
　図２６（術後３日）を参照する。図２６（ａ）～図２６（ｄ）はＬＡＳＣｏｌ投与群、図２６（ｅ）～図２６（ｈ）はアテロコラーゲン投与群、図２６（ｉ）～図２６（ｌ）は、コントロール群である。各群に対して、ＤＡＰＩ、Ｃｏｌ１（Ｉ型コラーゲンに反応する。）、Ｃｏｌ２（ＩＩ型コラーゲンに反応する。）による染色結果である。Ｍｅｒｇｅは図２６内での併合を表す。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群ではＤＡＰＩで細胞が集簇している部分にＣｏｌ１陽性領域が認められ、ＬＡＳＣｏｌゲル内に細胞が浸潤していることが示された。Ｃｏｌ２陽性部分は髄核領域内にほとんどなかった。アテロコラーゲン群ではＣｏｌ１陽性のアテロコラーゲンを認めたが、ゲル表面に留まっており、ゲル内への細胞浸潤はなかった。
 
　図２７（術後１週）を参照する。図２７（ａ）～図２７（ｄ）はＬＡＳＣｏｌ投与群、図２７（ｅ）～図２７（ｈ）はアテロコラーゲン投与群、図２７（ｉ）～図２７（ｌ）は、コントロール群である。各群に対して、ＤＡＰＩ、Ｃｏｌ１（Ｉ型コラーゲンに反応する。）、Ｃｏｌ２（ＩＩ型コラーゲンに反応する。）による染色結果である。Ｍｅｒｇｅは図２７内での併合である。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群では細胞が集簇している部分がＣｏｌ２陽性となっていた。一方Ｃｏｌ１は弱い発現が見られるのみであった。アテロコラーゲン投与群ではＣｏｌ１陽性のアテロコラーゲンゲルが残存していることが分かった。Ｃｏｌ２陽性領域は認められなかった。コントロール群では線維輪細胞領域に部分的にＣｏｌ１陽性部分を認めた。
　図２８（術後１週）を参照する。図２８（ａ）～図２８（ｅ）はＬＡＳＣｏｌ投与群、図２８（ｆ）～図２８（ｊ）はアテロコラーゲン投与群、図２８（ｋ）～図２８（ｏ）は、コントロール群である。各群に対して、ＤＡＰＩ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｉｅ２、Ａｇｇｒｅｃａｎによる染色結果である。Ｍｅｒｇｅは図２８内での併合である。
　ＬＡＳＣｏｌ投与群ではＤＡＰＩで細胞の集簇が見られた。また髄核領域内にＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｉｅ２陽性の細胞が少量ながら見られた。アテロコラーゲン投与群では残存細胞と考えられる細胞を認めたが、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｉｅ２とも陰性であった。コントロール群では線維輪領域の圧迫により、髄核領域が圧潰していた。
　以上のように、本発明に係る椎間板変性の治療に用いる治療剤は髄核細胞が流出した髄核領域に充填することで髄核を再生することができる。また、単体では２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、椎骨間維持能を有する。したがって、椎骨間距離を維持しつつ、髄核を再生することができる。また、少なくとも３．５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度であれば、ＬＡＳＣｏｌはゲル状を呈するので、椎骨間維持能を有する他の補助物質と共に用いることで、同様の治療効果を期待できる。本治療剤は生細胞やドナーの髄核細胞を使用しないので安全性が高い。
　また、本発明に係る椎間板細胞（髄核細胞及び／又は線維輪細胞）の培養材は、髄核細胞や線維輪細胞のスフェロイドを促し、また１つ１つのスフェロイドの細胞数も多いスフェロイドを培養することができる。
　本発明に係る椎間板変性の治療剤は椎間板変性の治療に対して好適に利用することができる。本発明に係る椎間板細胞の培養材は、髄核細胞及び／又は線維輪細胞を培養することができる。

Claims (10)

  1. 　ＬＡＳＣｏｌを含有する椎間板変性の治療剤。
  2. 　前記ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα１鎖のＹ１とＹ２との間の化学結合が切断されている若しくは、下記（Ｂ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα２鎖のＧとＸ３との間の化学結合が切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、請求項１に記載された椎間板変性の治療剤。
    （Ａ）－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｇ－Ｙ４－Ｙ５－Ｇ－Ｙ６－Ｙ７－Ｇ－Ｙ８－Ｙ９－Ｇ－（配列番号１）；
    （但し、Ｇはグリシンであり、Ｙ１～Ｙ９は、任意のアミノ酸である）
    （Ｂ）－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｇ－Ｘ３－Ｘ４－Ｇ－Ｘ５－Ｘ６－Ｇ－（配列番号２）；
    （但し、Ｇはグリシンであり、Ｘ１～Ｘ６は、任意のアミノ酸である）
  3. 　ハイドロゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ヒアルロン酸・コラーゲンハイドロゲル、ヒアルロン酸ポリマー、ヒアルロン酸・ＰＥＧポリマー、コラーゲン・ヒアルロン酸・ＰＥＧハイドロゲル、高純度アルギン酸ゲル、人体親和性のある溶媒の少なくとも一つをさらに含む請求項１または２の何れかに記載された椎間板変性の治療剤。
  4. 　コラーゲン及びアテロコラーゲンの少なくともいずれかのアミノ酸配列のＮ末端を切断する工程と、酵素を用いて切断しＬＡＳＣｏｌを得る工程と、
    　前記ＬＡＳＣｏｌにハイドロゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ヒアルロン酸・コラーゲンハイドロゲル、ヒアルロン酸ポリマー、ヒアルロン酸・ＰＥＧポリマー、コラーゲン・ヒアルロン酸・ＰＥＧハイドロゲル、高純度アルギン酸ゲル、人体親和性のある溶媒の少なくとも一つを添加する工程を有する椎間板変性の治療剤の製造方法。
  5. 　ＬＡＳＣｏｌを含有する椎間板細胞培養材。
  6. 　前記ＬＡＳＣｏｌは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの下記（Ａ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα１鎖のＹ１とＹ２との間の化学結合が切断されている若しくは、下記（Ｂ）に示されるアミノ末端のアミノ酸配列においてα２鎖のＧとＸ３との間の化学結合が切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、請求項５に記載された椎間板細胞培養材。
    （Ａ）－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｇ－Ｙ４－Ｙ５－Ｇ－Ｙ６－Ｙ７－Ｇ－Ｙ８－Ｙ９－Ｇ－（配列番号１）；
    （但し、Ｇはグリシンであり、Ｙ１～Ｙ９は、任意のアミノ酸である）
    （Ｂ）－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ｇ－Ｘ３－Ｘ４－Ｇ－Ｘ５－Ｘ６－Ｇ－（配列番号２）；
    （但し、Ｇはグリシンであり、Ｘ１～Ｘ６は、任意のアミノ酸である）
  7. 　ハイドロゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ヒアルロン酸・コラーゲンハイドロゲル、ヒアルロン酸ポリマー、ヒアルロン酸・ＰＥＧポリマー、コラーゲン・ヒアルロン酸・ＰＥＧハイドロゲル、高純度アルギン酸ゲル、人体親和性のある溶媒の少なくとも一つをさらに含む請求項５または６の何れかに記載された椎間板細胞培養材。
  8. 　コラーゲン及びアテロコラーゲンの少なくともいずれかのアミノ酸配列のＮ末端を切断する工程と、酵素を用いて切断しＬＡＳＣｏｌを得る工程と、
    　前記ＬＡＳＣｏｌにハイドロゲル、ゼラチンゲル、キトサンゲル、ヒアルロン酸・コラーゲンハイドロゲル、ヒアルロン酸ポリマー、ヒアルロン酸・ＰＥＧポリマー、コラーゲン・ヒアルロン酸・ＰＥＧハイドロゲル、高純度アルギン酸ゲル、人体親和性のある溶媒の少なくとも一つを添加する工程を有する椎間板細胞培養材の製造方法。
  9. 　請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された脊椎椎間板変性の治療剤を、髄核領域に注入することで、再生された髄核細胞。
  10. 　請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された脊椎椎間板変性の治療剤を、髄核領域に注入することで、再生された線維輪細胞。

     
     
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