JP6042038B2 - 骨形成促進材 - Google Patents
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Description
1つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドは、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである。
アミノ酸配列:a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(該アミノ酸配列中、a1〜a4は、塩基性アミノ酸残基であり;b1〜b6は、非電荷極性アミノ酸残基および/または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも5個は、疎水性アミノ酸残基であり;c1およびc2は、酸性アミノ酸残基であり;dは、疎水性アミノ酸残基である)。
1つの実施形態において、上記骨形成促進材は血液および/または血液由来成分をさらに含む。
1つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成因子をさらに含む。
1つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と組み合せて用いられる。
本発明の別の局面においては、骨形成促進材用保持器具が提供される。本発明の骨形成促進材用保持器具は、上記骨形成促進材と共に用いられる。
1つの実施形態においては、上記骨形成促進材用保持器具は炭素系材料、エンジニアリング樹脂、または、スーパーエンジニアリング樹脂で構成される。
本発明の骨形成促進材は、中性pHの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドと骨片とを含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のpH7.0における電荷の総和は0ではない。1つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は血液および/または血液由来成分をさらに含む。また、他の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、骨形成因子をさらに含む。
自己組織化ペプチドとしては、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合してゲルを形成し得る任意の適切なペプチドが用いられ得る。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、中性pHでβシート構造を形成し得るものである。より具体的には、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状分子集合体を形成し、当該分子集合体間の相互作用により三次元網目構造を発達させてゲルを形成し得るペプチドが好ましく用いられ得る。ペプチド分子同士の相互作用としては、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。なお、本明細書において、「中性pH(中性領域)」とは、pH5.0〜8.0、好ましくはpH5.5〜7.5、より好ましくはpH6.0〜7.0、さらに好ましくはpH7.0の領域をいう。
a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4 (I)
(上記アミノ酸配列中、a1〜a4は、塩基性アミノ酸残基であり;b1〜b6は、非電荷極性アミノ酸残基および/または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも5個は、疎水性アミノ酸残基であり;c1およびc2は、酸性アミノ酸残基であり;dは、疎水性アミノ酸残基である。)
n−RLDLRLALRLDLR−c(配列番号1)
n−RLDLRLLLRLDLR−c(配列番号2)
n−RADLRLALRLDLR−c(配列番号3)
n−RLDLRLALRLDAR−c(配列番号4)
n−RADLRLLLRLDLR−c(配列番号5)
n−RADLRLLLRLDAR−c(配列番号6)
n−RLDLRALLRLDLR−c(配列番号7)
n−RLDLRLLARLDLR−c(配列番号8)
n−RASARADARASARADA−c(配列番号9)
n−RANARADARANARADA−c(配列番号10)
n−RAAARADARAAARADA−c(配列番号11)
n−RASARADARADARASA−c(配列番号12)
n−RADARASARASARADA−c(配列番号13)
n−RASARASARASARADA−c(配列番号14)
n−RASARADARASA−c (配列番号15)
n−KASAKAEAKASAKAEA−c(配列番号16)
n−SAEAKAEASAEAKAEA−c(配列番号17)
n−KLSLKLDLKLSL−c (配列番号18)
n−KLALKLDLKLAL−c (配列番号19)
本発明で用いる骨片は、本発明の骨形成促進材を用いて治療を行う患者自身の骨であってもよく、他者の骨であってもよい。また、骨形成促進材を適用しようとする部位から採取した骨であってもよく、他の部位から採取した骨であってもよい。骨片として用いる骨としては、例えば、除圧のために切除した骨片等を用いることができる。
本発明の骨形成促進材は好ましくは、血液および/または血液由来成分をさらに含む。血液および/または血液由来成分をさらに含むことにより、軟骨形成の誘導の促進という効果を得ることができる。血液由来成分としては、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿等が挙げられる。これらの血液由来成分は単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明の骨形成促進材は、骨形成因子(Bone Morphogenetic Protein, BMP)をさらに含むことが好ましい。骨形成因子をさらに含むことにより、本発明の骨形成促進材は骨形成をさらに促進し得る。骨形成因子の具体例としては、BMP2、BMP4等のBMP2/4系BMP、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b等のOP-1系BMP、BMP9、BMP10等のBMP9系BMP、GDF5、GDF6、GDF7等のGDF5系のBMP等が挙げられる。上記骨形成因子としては、骨形成を好適に促進することができる点から、BMP−2が好ましい。なお、上記骨形成因子と同等の骨形成促進作用を有する範囲において、骨形成因子が適宜修飾されていてもよい。また、骨形成因子としてヒト組み換え骨形成因子(rhBMP)を用いてもよい。骨形成因子は単独で用いてもよく、2種以上を組み合せて用いてもよい。これらのヒトBMPは、すでにクローニングされているので、その塩基配列に基づいて遺伝子工学的手法によって得ることができる。
本発明の骨形成促進材は、上記骨形成因子以外の生理活性物質をさらに含んでいてもよい。本発明の骨形成促進材が含み得る生理活性物質としては、骨もしくは軟骨の分化を誘導または促進する分化制御因子(例えば、TGF−β);成長ホルモン;EGF、FGF等の細胞機能制御因子;インターフェロン、インターロイキン等の免疫または炎症関連因子;等が挙げられる。
本発明の骨形成促進材は、必要に応じて任意の適切な添加物をさらに含み得る。添加物の具体例としては、pH調整剤;緩衝剤;等張化剤;塩類;アミノ酸類;ビタミン類;アルコール類;蛋白質;薬物等が挙げられる。これらの添加物は、単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明の骨形成促進材は、任意の適切な方法により調製され得る。例えば、自己組織化ペプチドと水と他の任意成分とを混合した後、静置することにより自己組織化ペプチドゲルを調製し、該ゲルと骨片とを混合することにより調製することができる。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状の分子集合体を形成し、さらに静置を続けることにより、当該分子集合体間の相互作用によって三次元網目構造が発達してゲルの形態となる。静置時間および静置温度は、投与対象、自己組織化ペプチドの濃度および種類等に応じて適切に設定され得る。上記水としては、イオン交換水、蒸留水等の精製された水が好ましく用いられ得る。
1つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と共に用いられる。上記骨形成促進材は、生体内環境に近い中性pHで十分な強度を有する。この骨形成促進材を本発明の保持器具で固定することにより、骨形成促進材を投与対象部位に保持することができる。これにより、目的とする投与対象部位において、骨形成を促進することができ、例えば、骨癒合を促進することができる。
本発明の骨形成促進材は、1つの実施形態においては、ゲルの形態で投与され、サイズの小さい骨片(例えば、粉末状の骨片)を好適に用いることができる。そのため、シリンジ等で容易に投与することができ、複雑または狭小な投与対象部位(例えば、骨のひび割れの間隙)にも充填することができる。
自己組織化ペプチドゲル1(株式会社メニコン製、商品名:Panacea Gel SPG−178−208(N末端がアセチル化され、C末端がアミド化された配列番号1のペプチド(SPG−178)(自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域(pH7.0)における電荷の総和:+2)を含むペプチドゲル、ペプチド濃度:0.8w/w%)6μlを4℃で1.5時間静置した。次いで、培地(MEMαに10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(PenStrep)溶液を添加したもの)500μlを添加し、37℃で1時間静置した後、培地を交換し、24ウェルプレートに添加した。添加した24ウェルプレートにMC3T3−E1細胞を50,000cells/ウェルとなるよう播種し、室温で24時間培養した後、培地を分化誘導培地(上記培地にさらに1%アスコルビン酸、0.2%ヒドロコルチゾン、2%β‐グリセロリン酸塩を添加したもの)に交換し、室温にて細胞培養を行った。また、比較として、自己組織化ペプチドゲル1に代えて、自己組織化ペプチドゲルC1(3Dマトリックス社製、製品名「PuramatrixTM」、Ac−RADARADARADARADA−CONH2のペプチド濃度1重量%のゲル)を用いた以外は同様にして、細胞培養を行った。さらに、自己組織化ペプチドゲルを添加せず、細胞のみの培養も同様に行った。培養から1日後、7日後、14日後、28日後に細胞のALP染色およびRNA抽出を行った。RNAでの発現量はRT−PCRにより測定した。アルカリフォスファターゼ(ALP)染色については、以下の方法で行った。
ヒストファインSAB−PO(R)キット(ニチレイバイオサイエンス社製)を用いて、染色処理を行った。各ウェルから培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。次いで、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、10分間静置した後、PBSで3回洗浄した。その後、0.2%トリトンX(登録商標)−PBS溶液で透過処理を行い、10分間静置し、PBSで3回洗浄した。ブロッキング試薬I(3%過酸化水素加メタノール)を添加した後、10分〜15分間静置し、PBSで3回洗浄した。その後、ブロッキング試薬II(10%ヤギ正常血清)を添加した後、10分間静置し、第一抗体(ALP抗体:abcam Anti−Alkaline Phosphatase, Tissue Non−Specific [EPR4477] antibody ab 108337)を添加し、2時間静置した後、PBSで3回洗浄した。次いで、第二抗体(ビオチン標識抗ウサギIgG抗体)を添加して、10分間静置し、PBSで3回洗浄した。次いで、酵素試薬(ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン)を添加し、5分間静置した後、PBSで3回洗浄した。次いで、基質溶液(DAB基質キット:発色基質(試薬A)2滴(約40μl)と基質緩衝液(試薬B)2滴(約40μl)を精製水1mlに加え、泡立てないように混合し、発色試薬(試薬C)を1滴(約40μl)を加え泡立てないように混合した溶液)を加え、5分〜20分間静置し、精製水で3回洗浄した。次いで、対比染色(ヘマトキシリン)し、2分間静置し、水で色出しし、10分間静置し、顕微鏡で観察した。
培養0日後、1日後、7日後、14日後、28日後の細胞の顕微鏡写真およびALP染色した写真を図1A〜図1Dに示す。ALP染色により、骨形成マーカーであるALPが染色される。自己組織化ペプチドゲル1を用いた場合、ALP染色される骨芽細胞が凝集しており、骨形成を十分に誘導し得ると考えられた(図1)。一方、細胞のみを培養した場合、細胞分化していないため、ALP染色による発現は少なかった。自己組織化ペプチドゲルC1を用いた場合にも、ALP染色された範囲が確認された(図1)。
マウスの大腿骨を粉砕機を用いて砕くことにより、骨片(1mm〜2mm)を得た。得られた骨片に自己組織化ペプチドゲル2(株式会社メニコン製、商品名:Panacea Gel SPG−178−204、ペプチド濃度:0.4w/w%)をのせて、静置することによりゲル状の骨形成促進材1を得た。自己組織化ペプチドゲル2の組成を表1に示す。
得られた骨形成促進材を培地MEMαと10m%FBSと1%Anti−Antiを用いて培養した。培養14日後、および28日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をALP染色した写真を図3に示す。
自己組織化ペプチドゲル2に代えて、自己組織化ペプチドゲルに1を用いた以外は実施例1と同様にして、骨形成促進材2を得た。得られた骨形成促進材2を実施例1と同様に培養した。培養14日後、および28日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をALP染色した写真を図3に示す。
自己組織化ペプチドゲル2に代えて、自己組織化ペプチドゲル3を用いた以外は実施例1と同様にして、骨形成促進材3を得た。自己組織化ペプチドゲル3の組成を表1に示す。得られた骨形成促進材3を実施例1と同様に培養した。培養14日後、および28日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をALP染色した写真を図3に示す。
自己組織化ペプチドゲル2に代えて、自己組織化ペプチドゲルC1(3Dマトリックス社製、製品名「PuramatrixTM」、Ac−RADARADARADARADA−CONH2のペプチド濃度1重量%のゲル)を用いた以外は実施例1と同様にして、骨形成促進材C1を得た。自己組織化ペプチドゲルC1の組成は表1に示す。得られた骨形成促進材C1を用いた以外は実施例1と同様にして培養した。培養14日後、および28日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をALP染色した写真を図3に示す。
骨形成促進材1〜3では、ALP染色された骨芽細胞が確認された。一方、骨形成促進材C1では骨片が腐骨化し、骨芽細胞は確認されなかった。
マウス大腿骨にドリルを用いて1mm×3mmの骨欠損部を作製し大腿骨欠損マウスを得た。
得られた大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部分に実施例1で得られた骨形成促進材1を移植した。移植2日後、7日後、9日後、14日後、21日後のマウスの大腿骨部分を切開し、骨形成の様子を観察した。骨形成促進材1を移植したマウスにおいて、欠損部分の骨癒合が進行していた。通常の骨癒合の進行に比べて、本発明の骨形成促進材1では、明らかに骨形成が促進されていた。
大腿骨欠損マウスを用いて、以下の手順により大腿骨再生試験を行った。創外固定後、56日経過後の大腿骨欠損部をX線撮影およびCT撮影し、大腿骨の再生性能を評価した。X線撮影およびCT撮影の条件は、以下に示す。また、CT撮影の結果から、骨再生量を算出した。なお、骨形成促進材ごとに4検体のマウスを用いて試験を行った。
(1)大腿骨欠損モデルの作製
10週齢のメスのラット(中部科学資材から入手)の腹腔内にソムノペンチル(共立製薬(株)社製)を0.1ml〜0.15ml注射して麻酔をかけた後、大腿部を切開し、大腿骨に創外固定具(図4)を装着した。次いで、創外固定具を装着した部分の中間の大腿骨をエアトームで削り、約5mmの骨欠損部を作製した。
(2)born chipの作製
上記ラットから採取した大腿骨をエアトームで削り、骨片(born chip)を採取した。採取したborn chipは使用まで−80℃で保存した。
(3)骨形成促進材の調製
自己組織化ペプチドゲル1(株式会社メニコン製、商品名:Panacea Gel SPG−178−208、ペプチド濃度:0.8w/w%)80μLに、上記born chip0.05gを混ぜ、骨形成促進材を得た。自己組織化ペプチドゲル1に代えて、自己組織化ペプチドゲルC1(3Dマトリックス社製、製品名「PuramatrixTM」)、または、生理食塩水を用いた以外は同様にして、骨形成促進材を得た。
(4)大腿骨欠損部への創外固定
上記(3)で調製した各骨形成促進材をPEEK製のケージ(八十島プロシード(株)社製、長さ:5mm、外径:5mm、内径:3mm、図5)に注入した。次いで、大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部に骨形成促進材を注入したケージを挿入し、図6に示すように創外固定した。
X線撮影装置:SOFTEX/CMB−2(ソフテックス(株)製)
(撮影条件)
電圧:50KVp
電流:10mA
時間:15秒
撮影距離:60cm
フィルム:FUJIFILM
<CT撮影>
CT撮影装置:高分解能in vivoマイクロX線CTスキャナ(SKYSCAN 1176)
(撮影条件)
Filter:Cu+AL
Source Voltage:80KV
Source Current:313μA
Number of Rows:1336
Number of Columns:2000
Image Pixel Size:17.6μm
(Reconstruction条件)
Reconstruction Program:NRecon
Pixel Size:17.60223μm
Minimum for CS to Image Conversion:0.002
Maximum for CS to Image Conversion:0.03
<骨再生量算出方法>
SKYSCAN社製の数値解析ソフト「CTAn」を用いて骨形態解析を行い、骨再生量の定量化を行った。
各骨形成促進材を用いて創外固定を行った大腿骨欠損部のX線写真を図7に、CT写真を図8にそれぞれ示す。実施例1で得られた骨形成促進材1を大腿骨欠損部に適用したマウスでは、欠損部全体で骨再生が確認された(図7および図8中のSPG−178)。また、全てのマウスで骨再生量が50%以上であった(骨再生量の平均値:66.68%、p=0.01)。一方、骨形成促進材C1を適用したマウスでは、骨再生は大腿骨の両端からでのみ確認された(図7および図8中のPuraMatrix)。また、骨形成促進材1を用いたものに比べて骨再生量が小さかった(骨再生量の平均値:31.54%、p=0.01)。さらに、対照として生理食塩水を用いたものよりも骨再生量が小さかった(骨再生量の平均値:44.18%、p=0.01)。また、骨形成促進材1を用いたマウスでの骨再生量は、骨形成促進材C1を用いたマウスよりも有意に高い値であった。
自己組織化ペプチドゲル3をMilli−Q水で希釈し、1.0w/w%の水溶液を得た。得られた水溶液を24ウェルプレートに滴下し、ゲルの性状を実体顕微鏡(倍率100倍)で観察した。また、ゲルのpHをpH試験紙で測定した。
試験管に上記試験例2で得られたborn chip(ラット大腿骨)5mgを入れた後、得られた水溶液5μLを滴下した。次いで、ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離機により気泡を除去し、骨形成促進材5を得た。得られた骨形成促進材5の性状を実体顕微鏡(倍率100倍)で観察した。また、得られた骨形成促進材のpHをpH試験紙で測定した。
自己組織化ペプチドゲル4を用いた以外は実施例5と同様にして骨形成促進材6を得た。自己組織化ペプチドゲル4の組成を表1に示す。born chip添加前のゲルの性状およびpH、ならびに、骨形成促進材6の性状およびpHを実施例5と同様に評価した。
自己組織化ペプチドゲルC1を用いた以外は実施例5と同様にして骨形成促進材C2を得た。born chip添加前のゲルの性状およびpH、ならびに、骨形成促進材C2の性状およびpHを実施例5と同様に評価した。
実施例5〜6および比較例2のborn chip添加前のゲルの写真を図9に、born chip添加後のゲル(骨形成促進材)の写真を図10にそれぞれ示す。図9に示すように、born chip添加前のゲルはいずれも均一なゲル(ホモジニアス)であった。実施例5および6の骨形成促進材を実体顕微鏡で観察したところ、いずれも均一にborn chipが分散したホモジニアスな状態であった(図10(a)および(b))。一方、比較例2の骨形成促進材では、ゲル状の析出物が確認され、不均一な状態(ヘテロジニアス)な状態であった(図10(c))。
Claims (4)
- 中性pHの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチド、および、骨片を含む、骨形成促進材であって、
該自己組織化ペプチドが、配列番号1〜19のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および、これらのペプチドのN末端アミノ基およびC末端カルボキシル基に保護基が導入されたペプチドから選択される、骨形成促進材。 - 血液および/または血液由来成分をさらに含む、請求項1に記載の骨形成促進材。
- 骨形成因子をさらに含む、請求項1または2に記載の骨形成促進材。
- 骨形成促進材用保持器具と共に用いられる、請求項1から3のいずれかに記載の骨形成促進材。
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