PT87150B

PT87150B - Processo para a preparacao de materiais injectaveis apropriados para aumentar o tecido mole a partir da placenta

Info

Publication number: PT87150B
Application number: PT87150A
Authority: PT
Inventors: Carl Randall Harrell
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1992-07-31
Also published as: KR880012234A; NO881406D0; JP2643976B2; IE880946L; AU609108B2; CA1308033C; FI881518A0; DK178988D0; NO176551C; KR960016207B1; IL85923A; FI92906C; HK1006677A1; IL85923A0; ES2052709T5; IE64226B1; EP0285370A2; ZA882306B; GB8708009D0; NO176551B

Description

CLAYTON FOUNDATION FOR RESEARCH '•Processo para a preparação de materiais injectáveis apropriados para aumentar o tecido mole a partir da placenta

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se a material injectável para aumentar o tecido mole.

Antecedentes da Invenção

A ideia de se utilizar material injectável para aumentar o tecido mole foi desenvolvida pouco tempo depois da invenção da agulha hipodérmica. Têm eido injectados diversos produtos do corpo humano para correcção de defeitos do tecido mole, incluindo a parafina, petrolato, óleos vegetais, lanolina, cera de abelhas, silicone, e mais recentemente colagénio.

A parafina foi primeiramente utilizada por Gersury em 1899¹ que a injectou no escroto de um homem para substituir os testículos resseccionados. Posteriormente utilizou a parafina para corrigir defeitos do contorno da face. No período entre 1900 e 1914 a utilização de injecções de parafina popularizou-se.

Heidingsfeld em 1906 descreveu o parafinoma.

Muitas formas de parafina injectada difundiram largamente gotícolas nos tecidos. Deu-se a fagocitose pelos macrófagos e pelas células gigantes seguida de necrose hialina do septo fibrovascular, nroliferação de fibroblasto e desenvolvimento de tecido cicatricial contendo glóbulos de óleo e quistos formados por células gigantes corporais estranhas.

Clinicamente ocorreu um edema e formação de escoriações muitas vezes seguidos por ulceração. A utilização de parafina injectável foi suspensa nos Estados Unidos por cer ca da lê guerra mundial, mas continuou a utilizar-se no leste até 1950.

Em seguida, os silicones foram os materiais injectados nos seres humanos em larga escala. Conway e Goulian referem a utilização de injecçoes de silicone no peito e na face, em 1963^. Algumas pessoas utilizaram a fórmula Sakurai, um silicone fluido, adulterado com um aditivo para melhor fixação^. A Dow Corning desenvolveu um silicone líquido de grau médico 360 mais puro e embora este produto não se destinasse originariamente a ser injectado, rapidamente foi utilizado para injecções em seres humanos em todo 0 mundo.

Os primeiros relatórios de complicações provenientes de silicone injectado incluindo granulomas de corpos es5 6 trarihos, ocorreram em 1964 . Em 1965, Ben-Hur e Neuman descre veram um siliconoma que era uma formação semelhante a um tumor que se desenvolvia após a injecção de silicone 360 nos ratos.

Em 1965, a Pood and Drug Administration dos Estados Unidos da América do Norte (F.D.A.) determinou que a uti lização clínica do silicone injectável era uma drug use e au torizou sete investigadores a utilizarem silicone líquido como

i *» um substituto do tecido mole. Após uma revisão das suas expe riências clínicas com silicone injectável -Dow Gorning - íuDX

4,4011, concluíram que o silicone MDX 4,4011 podia provocar uma reacção inflamatória resultando em vermelhidão e equimose que podiam ser controladas com antibióticos e corticoesteróides. A reabsorção parcial e migração podia ocorrer mas deviam ser evitadas injecções repetidas com pequenas doses^k^lO, 11 12 13 o-j.o.q_Ue tivessem sido referidas poucas complicações com MDX 4,4011, foram descritas muitas complicações após injecções de silicone líquido com um grau de pureza não conheoido¹*.

Ainda que alguns indivíduos sejam injectados ago. ra com silicone com bons resultados e poucas complicações, a natureza implacável do material se utilizado incorrectamente, impedirá provavelmente a sua utilização alargada.

colagénio bovino adquiriu recentemente uma utilização generalizada como material injectável para aumento de tecido mole.

colagénio é a proteína estrutural extracelular principal do corpo humano. Têm sido descritos, pelo menos, sete tipos de colagénio de mamíferos. A sua característica comum consiste numa hélice de cadeia tripla, constituída por três ca cadeias polipeptídicas designadas por cadeias-alfa. Todas as cadeias têm a mesma configuração, mas diferem na composição da sequência dos seus aminoácidos. Este facto conduz a diferentes tipos de cadeias-alfa, mas todas possuem glicina em cada uma das posições três da sequência de aminoácidos, o que permite a ocorrência de uma conformação helicoidal. 0 colagénio de tipo I é composto por duas cadeias alfa 1 e uma cadeia alfa 2 e é *

o material extracelular princioal da pele, tendões e ossos

Quando os médicos falam rir o colagénio do tipo no tecido cartilagíneo de colagénio usualmente querem refe

1. 0 colagénio do tipo II encontra-se e no humor vítreo. 0 colagénio do tipo III está presente nos tecidos de crescimento rápido, particularmente na pele jovem e na pele em cicatrização. Os tipos

IV e V de cologénio encontram-se na membrana epiteliaT¹^.

Além das espécies moleculares principais de colagénio, encontram-se na matriz extracelular glicoproteínas estruturais não colagenosas, elastina e proteoglicanos. As glicoproteínas estruturais consistem em fibronectina e laminina.

A fibronectina encontra-se no plasma e em tecidos em formação e é capaz de interagir com outros componentes da matriz extracelular. Recentemente, Wartiovaara propôs que a outra função da fibronectina consiste em opsonizar o colagénio ou a fibrina e através deste mecanismo regular a digesΊ R tão celular daqueles substratos . A laminina encontra-se em todas as membranas. Os proteoglicanos são caracterizados por uma proteína nuclear ligada às cadeias laterais 15, 16, 17, 18 do glicoaminoglicano.

Quando se utiliza como biomaterial o colagénio é importante utilizá-lo na forma cristalina mais pura para eliminar as proteínas não colagenosas, tanto quanto estas são antigénicas potentes. Uma vez o ciclo inflamatório estimulado, a reabsorção de colagénio ocorre por infiltração de células inflamatórias principalmente macrófagos e, numa, extensão menor, granulócitos. Estas células contêm colagenase que actua para z 19 digerir o colagénio .

- 5 Houche e Ch.ang demonstraram que o colagénio da

pele era ele próprio um quimioestático e torna-se, por vezes, mais activo por digestão com colagenase tecidular em fragmen20 tos pentídicos menores .

quimiotropismo consiste na atracção de protoplasma vivo para estímulos químicos, pelo que as células são atraídas (hemotaxia positiva) ou repelidas (quimiotaxia negativa) por ácidos, agentes alcalinos ou outros corpos que exibem propriedades químicas. Postletwaite et al. mostraram que vários tipos de colagénio, as suas cadeias-alfa, assim como pequenos péptidos formados por digestão com colagenase sao todos quimioestáticos para os fibroblastos térmicos. Eles concluíram que a migração quimiotáctica de fibroblastos para os sítios de tecidos danificados ou teoricamente infectados com co lagénio pode ser regulada pelo colagénio solubilizado ou seus produtos de degradação. Assim, um implante de colagénio pode nao permanecer inactivo no tecido, mas pode ocorrer uma complexa série de factos. Primeiro, o implante de colagénio pode ser invadido por agentes inflamatórios e fibroblastos e ser continuamente reabsorvido podendo oromover uma reacção inflamatória pelas propriedades quimiotáticas dos seus produtos de degradação. Assim, a área de metabolismo de colagénio é não somente importante para o colagénio e outros materiais infectáveis de tecido mole, mas também para a cura de feridas normais e anormais (isto é, cicatrizes hipertróficas e quelóides)¹^, 20,21.

colagénio infectável que recentemente se tem generalizado, foi libertado para o mercado coâio um utensílio (não um fármaco) pela Pood and Âdministration, em 1981.

Este material, vendido sob o nome de Zyderm

Collagen Im.plant é constituído por colagénio bovino purificado. Composto por cerca de 95% de colagénio do Tipo I e os restantes 5% por colagénio do Tipo III. 0 colagénio é submetido a hidrólise proteolítica de uma fracção telopeptídica para diminuir a antigenicidade, 0 material é suspenso em solução de cloreto de sódio fisiológica e 0,3% de lidocaína é adicionada, sendo o material acondicionado em seringas prontas para injecção através de agulhas de pequeno calibre,

Λ preocupação mais imediata para a maior parte dos cirurgiões plásticos é o destino do colagénio bovino após injecção. A Ziderm I® com 35 mg/ml de colagénio é rapidamen te degradada pelas colagenases dos tecidos e reabsorvida dentro de meses. A Ziderm II com 65 mg/ml de colagénio e, portanto, aproximadamente duas vezes a concentração de colagénio, tem uma duração maior mas segue o mesmo destino aue a Ziderm (6) fp)

I ^w . 0 Zyplast foi mais recentemente introduzido no mercado, contendo 35 mg/ml de colagénio com ligação cruzada com glutaraldeído. 0 Zyplast ® também é, por último, degradado com o tempo. Kligman comparou recentemente a gordura biológica do colagénio de Ziderm ® e do colagénio de Ziplast ® quando implantado no dorso de voluntários humanos. Aquele autor referiu que enquanto o colagénio Ziderm ® foi aparentemente reabsorvido pelos tecidos hospedeiros em meses depois da implantação, o Ziplast ® foi mais persistente* Fibroblastos infiltraram o colagénio dô Ziplast e depositaram o colagénio do hospedeiro. Burke et al.^3 referem que o colagénio de Ziderm® estimula uma resposta que resulta na degradação do implante e substituição por colagénio hospedeiro gerado novamente.

Uma

área adicional de confusão sobre o colagénio de Ziderm I ® , colagénio de Ziderm II ® e colagénio de Ziplast ® consiste na percentagem de colagénio em cada um. 0 colagénio Ziderm I® e colagénio Ziplast ® tem 35 mg/ml (3,5% de colagénio) enquanto que Ziderm II® possui 65 mg/ml (6,5% de colagénio).

Uma pequena percentagem de doentes que receberam quer colgénio de Ziderm I ® , quer colagénio Ziderm II ® ou colagénio Zyplast , doravante referidos como implantes de colagénio bovino (BCI), desenvolveram reacções adversas de natureza imunológica, A utilização segura destes implantes é fundamentada na baixa imunogenicidade referida do colagénio bovino. Contudo está contra indicado nos doentes cora uma história de doença auto-imune. Os ensaios da pele são necessários antes de se receber os BCI. Somente doentes com ensaios da pele negativos, após 4 semanas podem submeter-se a. injecçÕes de tratamento. A Collagen Corporation indica que aproximada— mente 3% dos doentes têm testes de pele com reacção positiva caracterizada por edema e sensibilidade, eritema, prurido ou maciez no sítio da injecção. Têm sido referidas reacções de tratamento generalizadas adversas de menos do que 1% até mais de 5%. São caracterizadas por urticária, mialgias, artralgias e uma reacção anafilactóide ^3,24^ ijêm-se verificado um aumen to dramático na incidência de anticorpos de anti-BCI na circulação de doentes com reacções ao tratamento com BCI adversas, quando se compararam amostras de soro de indivíduos não tratados com as amostras de soro de doentes tratados sofrendo de reacções adversas. BCI é um antigénio fra.co, mas apesar disso é uma proteína estranha. Tem-se considerado de um certo modo

a cisão de telopéptidospara os tornar menos imunogénicos, mas a fracçao helicoidal da molécula retém os seus sítios antigé nicos. As estruturas dominantes reconhecidas pelos mecanismos imunológicos mediados pelas células parecem residir na estrutura helicoidal tripla das moléculas de colagénio. Tem constituído uma preocupação principal a. exposição repetida dos do qa OPÍ OA entes a estes antigénios e os seus efeitos a longo prazo

Em resumo, devido aos efeitos de BCI que incluem a pouca persistência, necessidade de injecções repetidas e reacçÕes adversas relativamente graves, necessita-se de novos ma teria injectáveis para aumento do tecido mole. A presente invenção diz respeito a materiais injectáveis para aumento do te eido mole e ao seu método de preparação, que superem as deficiências de BCI e outros materiais injectáveis conhecidos nesta área.

Descrição da Técnica Anterior

Em adição à técnica anterior comentada atrás, a patente de invenção norte-americana 4.361.552 descreve um método de tratamento de uma ferida ou queimadura com um tecido amniótico proveniente de uma espécie animal adequada (humana, vacum, porcina, etc.) fixada ou estabilizada por agentes químicos tóxicos, tais como soluções de glutaraldeído ou outros agen tes de fixação ou soluções de coloração por forma a que as suas proteínas sejam reticuladas. Nesta patente é referido e listado um certo número de patentes norte-americanas.

pedido de patente de invenção Britânica n2 8133375, publicada em 22 de Junho de 1983, descreve uma preparação substancialmente isenta de âmnio para uso no tratamento de feridas derivadas de um meio de cultura em que o âmnio foi cultivado, de preferência com amnio humano.

Resumo da Invenção

A presente invenção refere-se a um material de tecido mole injectável em que os problemas associados com origens bovinas xenogénicas foram eliminados, o problema de falta de persistência e da necessidade de injecçÕes repetidas foi pois orientado para o tornar menos susceptível à degradação e para que o material inicial esteja disponível em quantidades limitadas e com baixo custo.

material de aumento do tecido mole injectável é proveniente de placenta humana e consiste em amnio insolúvel, âmnio solúvél, cório solúvel e as suas combinações, homogeneizadas para passar através de uma agulha cirúrgica. De preferên cia, o material homogeneizado deve passar através de uma agulha cirúrgica de calibre 30 para evitar desconforto e, se adequado, poderá adicionar-se um agente analgésico.

Num aspecto da presente invenção, o material é irradiado a um mínimo de 0,20 M. rads para esterilização e reticulação com uma graduação preferida entre cerca de 0,25 ii rads e 2,0 «I rads. Presentemente, o material de aumento de tecido mole injectável preferido consiste em amnio solúvel irradiado.

processo da presente invenção para a preparação daquele material de tecido mole injectável compreende a homogeneização suficiente de material proveniente da placenta humana, constituída por amnio insolúvel, amnio solúvel, cório so lúvel e as suas combinações de tal modo que ele passará através de uma agulha cirúrgica de preferência uma agulha cirúrgi7°ύΖ ca de cerca de calibre 3θ, esterilização das moléculas de colagénio, de preferência por radiação gama que também as reticuia, fí necessário um mínimo de 20 H rads para esterilizar estes materiais e presentemente a proporção preferida, é entre cerca de 0,25 II rads e 2,0 M rads. Se apropriado, pode-se adicionar o analgésico ao material de tecido mole injectável homogeneizado.

processo da presente invenção para corrigir os defeitos do contorno do tecido mole utiliza injecção de material de tecido mole injectável da presente invenção num doente. De um modo vantajoso, um número de injecções de pequenas quantidades de material de tecido mole é possível uma· vez que mesmo pequenas quantidades persistem. Assim, proporciona-se uma maior interface de implante no hospedeiro e permite-se uma assimilação mais rápida no tecido uma vez que o centro do implan te não está longe da influência do tecido hospedeiro.

Assim, constitui um objectivo da. presente invenção proporcionar o material de tecido mole utilizado injectável em que as reacções alérgicas adversas estão eliminadas, que possui persistência, a longo termo e pouca inflamação, que pode ser injectado através de uma agulha de calibre 30 e, num aspecto da presente invenção, é utilizada a radiação gama para esterilizar o material e aumentar a reticulação do colagénio sem a presença de agentes de reticulação tóxicos.

áinda um outro aspecto da presente invenção, é proporcionar o material de tecido mole injectável esterilizado de placenta humana que consiste em âmnio insolúvel, âmnio solúvel, cório solúvel e as suas combinações homogenzizadas de um modo suficiente para passar através de uma agulha cirúrgica, tal como uma agulha de calibre 30 e que ainda num aspecto da

presente invenção é purificada por irradiação gama que produz reticulação sem a utilização de agentes químicos tóxicos.

^?inda um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um material de tecido mole injectável em que foram eliminadas as reacções alérgicas adversas, em que a irradiação gama é utilizada, para esterilizar o material e aumentar a quantidade de reticulação e em que, mediante a variação da quantidade da reticulação, a quantidade de tecido persistente pode ser regulada.

Ainda um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para a preparação de material para aumentar o tecido mole injectável que possui as vantagens anteriormente referidas mediante homogeneização de âmnio insolúvel, ânmo solúvel,cario solúvel ou das suas combinações provenientes de placenta humana, de tal modo que o material passe através de uma. agulha cirúrgica de preferência uma agulha cirúrgica de calibre 3θ θ moléculas de colagénio reticuladas do material por irradiação gama de, pelo menos, 0,20 u rads e de preferência numa escala de 0,25 II rads a 2,0 M rads.

Consiste ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para refazer 0 contorno do tecido mole mediante injecção em seres humanos de material proveniente de placenta humana que consiste em âmnio insolúvel, âmnio solúvel, cório solúvel ou as suas associações, esterilizado e homogeneizado por forma a poder ser injectado através de uma agulha cirúrgica de preferência com 0 calibre 30 e, num aspecto da presente invenção, esterilizado com as suas molécula de colagénio reticuladas por irradiação gama.

Um outro objectivo da oresente invenção é propor

cionar um método de refazer o contorno do tecido mole mediante injecção em seres humanos de um tal material injectável, em pequenas quantidades, para proporcionar uma boa interface de implante do hospedeiro, e permitir uma assimilação mais rápida no tecido e ainda com uma boa persistência.

Outros objectivos, aspectos e vantagens da. presente invenção tornar-se-ão evidentes através da memória descritiva e reivindicações.

Aspectos Preferidos Presentemente Desta Invenção

Membranas fetais humanasforam escolhidas como material inicial para material que aumenta o tecido mole, injectável, em seres humanos, para refazer o contorno do tecido uma vez que estas eliminam os problemas alérgicos verificados com fontes xenogenéticas, isto é, de bovino; as placentas humanas estão disponíveis em quantidades relativamente ilimitadas e são ricas em colagénio, a um custo baixo e âmnio tem tido uma longa história de utilizações médicas que começa há cerca de 90 anos atrás para uma grande variedade de aplicações médicas e cirúrgicas.

As membranas fetais são estruturas bioquímicas complexas que podem ser desenvolvidas num ou mais materiais in jectáveis de tecido mole. Estas têm características físicas e biológicas que podem ser modificadas para preencher necessidades clínicas várias.

As membranas fetais humanas preferidas são âmnio insolúvel, âmnio solúvel, cório solúvel ou suas associações. Elas são homogeneizadas para, passar através de uma agulha cirúrgica. Enquanto que a injecção de materiais para aumentar

tecido mole, através de uma agulha cirúrgica de calibre 25 é satisfatória para utilização clínica, é preferível, para evitar desconforto que o material seja homogeneizado de tal forma que possa ser injectado através de uma agulha cirúrgica de calibre 30.

Num aspecto desta invenção, o material injectável é reticulado por meio de irradiação de gama sem utilização de agentes químicos de reticulação, tais como glutaraldeído, que são tóxicos. A radiação gama deve ter um mínimo de 20 LI rads para esterilizar o material, uma vez que todas as bactérias, fungos e vírus, incluindo o vírus da SIDA, são destruídos com 0,20 LI rads. De preferência, o material é irradiado com 0,25 a 2,0 1T rads para esterilizar e estabelecer a reticulação das moléculas de colagénio.

Se apropriado pode ser adicionado ao material injectável um analgésico, tal como a lidocaína.

Para a preparação do material injectável mole, recolhe-se placenta fresca e separa-se manualmente o âmnio do cório. Quer o âmnio quer o cório são em seguida desembaraçados de qualquer quadro sanguíneo ou fragmentos remanescentes. Para armazenagem a curto prazo, o âmnio e cório são colocados numa solução antibiótica, por exemplo num litro de solução de cloreto de sódio normal contendo 3 g/10 ml de linomicina, 50 mg/10 ml de anfotericina B, 0,5 g/10 ml de sulfato de neomicina, 500.000 unidades/10 ml de sulfato de polimixina B, até ao seu processamento.

colagénio é extraído utilizando-se pepsina para a digestão proteolítica limitada. Em resumo, o tecido é homogeneizado com ácido acético 0,5 LI, o valor do pH corrigido

- U -

para 2,5 com HC1 e a oreparação digerida duas vezes com pepsina durante a noite (10 mg de pepsina/g de peso de tecido húmido). Para purificação do colagénio utilizou-se uma associação de um método de precipitação selectiva a partir de um sol vente dum sal neutro e de solventes ácidos. 0 colagénio purificado foi reconstruído por meio de diálise contra tanpão de fosfato de sódio de força iónica baixa (pH 7,2) a uma temperatura compreendida entre 15-17°C. A lidocaína foi adicionada numa concentração final de 0,3%. Todos os processos foram rea· lizados à temperatura de 4-8°C ainda que outras temperaturas apropriadas se possam utilizar.

Processamento de Âmnio Insolúvel método preferido presentemente para o processamento de âmnio consiste em decantar o âmnio do antibiótico, adicionar 20 ml de água destilada arrefecida a cada âmnio e homogeneizar o âmnio aproximadamente durante 15 min. em politrom. 0 âmnio homogeneizado é centrifugado em seguida a 8.000 x 5 durante 15 minutos à temperatura de 4°C, o sobrenadante removido e o precipitado lavado para eliminar os lípidos, por exemplo 5 vezes com acetona. 0 precipitado é em seguida pesado e adicionado com oepsina (Sigma, 1 : 10.000 de mucosa de estômago porcino) em ácido acético 3,0 molar por âmnio, 15 ml ou mais se se trata de âmnios grandes, e o precipitado homogeneizado durante aproximadamente 20 min. em politrons.

A mistura é deixada em repouso durante 18 horas à temperatura de 4°C, centrifugada a 100.000 x g durante 1 hora à temperatura de 4°C, retirado o sobrenadante, o pre- 15 -

cipitado pesado e em seguida repetem-se as fases de pepsina e homogeneização e o sobrenadante eliminado.

Processamento do Âmnio Solúvel

Uma forma preferida presentemente para o proce£ sarnento dos âmnios soláveis consiste em limpar os antibióticos dos *mnios com água de s ionizada.,, adicionar 5 ml de água destilada arrefecida a cada âmnio, homogeneizar durante aproximadamente 15 minutos em politrom e centrifugar a 8000 x g durante 15 min. à temperatura de 4°C. 0 sobrenadante é eliminado e os lípidos removidos do precipitado mediante lavagem por três vezes com acetona e o precipitado pesado.

Adiciona-se ao precipitado pepsina (Sigma, : 10.000 de mucosa de estômago de porcino), (1 : 100 p/p) e a cada âmnio 100 ml de ácido acético 0,5 molar ou mais se os âmnios sao muito grandes, e homogeinizam-se em seguida durante aproximadamente 10 minutos em politrom. A pepsina extrai o colagénio do precipitado durante 18 horas, à temperatura de 4°C e em seguida centrifuga-se a 100.000 g durante 1 hora, à temoeratura de 4°C retendo-se o precipitado e o sobrenadante. 0 sobrenadante é novamente pesado e repetem-se as fases de adição de pepsina e ácido acético, homogeneização, extracção do colagénio com pepsina e centrifugação.

Os sobrenadantes da primeira e segunda extracções são reunidos e adicionados com HaOH 10 molar gota a gota para se corrigir o pH para um valor compreendido entre 7,0 e 7,2. A mistura permanece em repouso durante duas horas à temperatura de 4°C e em seguida é centrifugada a 100.000 x g durante 45 min. ã mesma temperatura e o precipitado retirado.

Adiciona-se ao sobrenadante NaCl 3,0 molar e deixa-se eni repouso durante 2 horas, à temperatura de 4°C, centrifuga-se a 100.000 x g durante 45 min. à mesma temperatura e pesa-se o precipitado para se adicionar lidocaína a 0,3%·

Processamento do Âmnio Solúvel

Seguido de Purificação método preferido presentemente para o processamento do âmnio solúvel e posterior purificação consiste em retirar o antibiótico do âmnio com água desionizada, cortar os âmnios aproximadamente em fracçoes de 2 cm x 2 cm e lavar rapidamente com acetona, mergulhar em ácido acético 0,5 X (ajustar o pH para 2,5 com H01), homogeneizar com politrom durante cerca de 15 min., adicionar pepsina (1 : 100 pepsina/por conjunto de tecido) (1 mg de oepsina/1 ml de solução) e agitar ã temperatura de 4°C durante a noite, centrifugar como se referia antes e reter a fracção sobrenadante. Adiciona-se oepsina novamente como se indicou anteriormente e agita-se durante a noite à temperatura de 4°C, centrifuga-se e combina-se o sobrenadante proveniente de ambas as partes de centrifugação e adiciona-se com cloreto de sódio 2LÍ, e deixa-se em repouso durante a noite à temperatura de 4°C e centrifuga-se novamente a fracção sobrenadante retirada e aproveita-se o precipitado.

precipitado foi purificado mediante dissolução em ácido acético 0,5 X, centrifugação, remoção do precipitado, adição de NaCl 2&I ao sobrenadante e deixado em repouso durante a noite à temperatura de 4°C, centrifugado novamente e retirado o sobrenadante. 0 precipitado resultante é dissolvido em ácido acético 0,5 íí, centrifugado de novo e o precipitado eliminado. A fracção sobrenadante é dialisada contra NagHPO^ 0,02 lí, cuidadosamente durante 4δ horas, com trocas do líquido de diálise frequentes, centrifugada, o sobrenadante retirado, o precipitado pesado e adicionado com cloridrato de lidocaína sólido a 0,30/ sob agitação mecânica.

Pr oc es samento do Cório

No método preferido para o processamento do cório solúvel retiraram-se os ?.ntibióticos do cório com água desionizada, o cório foi cortado em unidades de 2 cm x 2 cm aproximadamente e lavado rapidamente com acetona e em seguida mergulhado em ácido acético 0,5 molar, com um oH corrigido para 2,5 cam HC1.

tecido foi em seguida homogeneizado com politrom para se obterem partículas pequenas durante cerca de 15 min., adicionado com pepsina e centrifugado como se referiu anteriormente, retendo-se a fracçao sobrenadante. Em seguida reoetiram-se as fases de peosina e centrifugação, reuniram-se as fracçoes sobrenadantes de cada fase e adicionou-se NaCl 2M deixajido-se em repouso durante a noite à temperatura de 4°C, depois do que se centrifugou novamente, retirando-se o sobrenadante.

Para purificação o precipitado foi dissolvido em ácido acético 0,5 w, centrifugado e o precipitado retirado. Idicionou-se NaCl 21.' à fracção sobrenadante, deixou-se em repouso durante a noite à temperatura de 4°C, centrifugou-se novamente e retirou-se a fracção sobrenadante, 0 precipitado foi dissolvido em ácido acético 0,5 rolar, centrifugado, dializado contra Γ^ΗΡΟ^ 0,02 íl cuidadosamente durante 4θ horas,

com trocas frequentes de líquido da diálise, centrifugado novamente e a fracção sobrenadante retirada e o precipitado pesado. Adicionou-se cloridrato de lidocaína, sob a forma sólida, a 0,30% ao precipitado sob agitação mecânica.

Reticulaç_ão_ e jlsterilizaçao

De cada um dos precipitados obtidos anteriormente retiraram-se 15 cc e colocaram-se em garrafas de soro de 20 cc com fecho metálico e colocados numa fonte de radioacti137 vidade de GE durante tempos de duraçao diversa para receberem 0,25 M rads, 0,5 E rads, 1,0 E rads e 2,0 E rads os quais têm duas finalidades: esterilização do material e reticulação do colagénio.

Exemplo 1

Vários grupos de extractos de colagénio foram reconstituídos com cloreto de sódio tamponado com fosfato, colocados em tubos de vidro e irradiados com uma fonte de raios gama de Gésio de 1779 fruries a uma dose de 1000 rads/minuto. A dose foi de 0,25 M rads.

Λ radiação foi realizada à temperatura ambiente.

Quadro 1

Os grupos examinados foram os seguintes’

Grupo

1. Amnio solúvel com 0,25 E rads.

2. Âmnio solúvel sem radiação.

3. Amnio insolúvel com 0,25 E rads.

4. Amnio insolúvel sem radiação.

5. Âmnio insolúvel+ âmnio solúvel a

1:1, com 0,25 E rads.

Quadro 1 (continuação)

6. Âmnio insolúvel 4-ãmnio solúvel a · 1, sem radiação.

7. Cório solúvel com 0,25 -T rads.

8. Cório solúvel sem radiação.

9. Cório solúvel + ãmnio solúvel a

1:1, com 0,25 M rads.

10. Cório solúvel-t- ãmnio solúvel a r 1, sem radiação.

As amostras de cada grupo foram submetidas a culturas aeróbicas, anaeróbicas e fúngicas. Quer antes, quer após radiação não houve desenvolvimento em qualquer dos grupos.

Para injecções em animais, utilizaram-se 120 ratos Sprague-Dawley, jovens, com peso compreendido entre 200 e 300 gramas. Estudaram-se 12 grupos animais, incluindo grupos injectados com Zyderm II® e Zyplast ® . Cada grupo era constituído por 10 ratos era que se injectaram por via percutânea com material injectável na quantidade de 0,2 ml no dorso traseiro abaixo do paniculus carnunoso em três sítios separados. As amostras foram colhidas de cinco ratos de cada grupo, após um mês e após 6 meses.

Espécimes foram fixados em formalina tamponada a 10% e mais tarde incluídos em parafina. Fizeram-se secções em série e coraram-se com hematoxilina-eosina (H&E). Para comparação dos resultados utilizaram-se grupos de patologistas independentes.

A avaliação histológica dos implantes revelou semelhanças em todos os grupos experimentais com excepção do

- 20 âmnio insolúvel que será subsequentemente comentado. Especificamente, não se detectou qualquer reacção inflamatória ou ocor rência de encansulação. Aos trinta dias estava presente desenvolvimento interno fibrocístico e aos cento e oitenta dias estava mais avançado de um modo centrípeto. Numa extensão variável apresentava-se neovascularização aos 18o dias. Aos 180 dias o grau de desenvolvimento fibrocístico e de neovascularização era maior do que o encontrado com Zyderm II® e Zyplast ®.

No grupo do âmnio insolúvel também não se verificou qualquer reacção de inflamação ou encapsularizaçao, mas neovascularização acentuada e desenvolvimento fibrocístico. Observou-se adicionalmente a presença de alguns adipécitos aos 30 dias. Aos 18o dias os adipécitos que apareceram primeiro na oeriferia do implante tinham começado a dispersar através des27 28 tes. Este fenómeno também foi observado por outros '» , autores.

Era muito difícil realizar uma análise quantitativa (medir exactamente as dimensões da permanência do implante). Portanto, foi realizado 0 estudo qualitativo preliminar de persistência.Simplesmente, contou-se o número de implantes visivelmente presentes nos ratos que sobreviveram durante 6 meses. 0 quadro 2 representa o grupo de âmnio solúvel que mostrou uma muito boa nersistência aos 6 meses. Aos 6 meses 0 âmnio solúvel não irradiado tinha todos os implantes presentes e 0 âmnio de 15 apenas tinha 4. 0 grupo insolúvel também mostrou boa persistência quer nos grupos irradiado quer no grupo nao irradiado. Alguns dos grupos que tinham associações de materiais, especialmente cório solúvel, apresentavam menor persistência após irradiação.

	PERSISTÊNCIA DE INJECÇÓES PARA AU^NTO DE TECIDO iuODE APÓS 6 MESES
GRUPO	EXPERIMENTAL ANIMAL 1-10, ZYDERM II ® e ZYPLAST

1	2	3	4
Grupo	Concentração de Colagénio (mg/ml)	Número de Ratos Sobreviventes/lnjectados	Injecções presentes Após 6 meses/ Número Total de Injectados
1* Sol. Am	51	5/5	11/15
2 Sol. Am	37,2	5/5	15/15
3 * Ins. Am	23,5	5/5	9/15
4 Ins. Am	22,2	5/5	13/15
5 tf Ins. Am &	40,4	4/5	3/12
Sol. Am
6 Ins. Am &	40,5	5/5	15/15
7* Sol. Ch.	40,3	5/5	2/15
8 Sol. Ch.	55,8	2/5	6/6
9* Sol. Am &	52,8	3/5	0/9
Sol. Ch.
10 Sol. Am &	58,6	5/5	15/15
Sol. Ch.
11 Zyderm II ™	65	2/5	6/6
12 Zyplast ®	35	4/5	12/12

Nota: A amostra foi irradiada com uma irradiação gama de 0,25 M rads.

Numerosos estudos histológicos, a intervalos de a 6 meses, mostraram desenvolvimento fibrocístico assim como neovascularização sem a presença de inflamação. A observação da incorporação dos adipocitos nos implantes de âmnio insolúvel é muito interessante, mas nao se está apto a explicar porque ocorre. Observou-se infiltração de estroma de gordura

de natureza obscura. A acumulação de quantidades aumentadas de gordura ocorre ocasionalmente no tecido intesticial de cer· tos tecidos e orgãos. Robbins e Angel explicam que presumivelmente os fibroblastos multipotenciais no interstício tornam-se cheios de lípidos e são convertidos em células gordas obesas. A infiltração de estroma nor gorduras tende a ser associada com a obesidade ou com a atrofia das células do narênquima, mas as correlações não são perfeitas. 0 coração e o pâncreas estão muitas vezes envolvidos.

facto de haver apenas alguns adipo^itos aos dias e um número aumentado aos 100 dias, parece querer implicar o fenómeno ocorrido senelhantemente ao que se descreveu antes. A estimulação da deposição de novos adipócitos oferece um campo interessante e uma nova possibilidade para o aumento do tecido mole.

A análise bioquímica demonstrou a pureza do co lagénio de âmnio e cório humano injectável. Λ electroforese PAGE e o ensaio de aminoácidos mostraram que o CAH possui um sistema electroforético de colagénio típico e uma composição de aminoácidos de uma mistura de colagénio do tipo I e do tipo III. Os resultados de digestão por colagenase bacteriana demonstraram que não existia qualquer proteína não colagenosa no colagénio de cório e de âmnio humano injectável. O exame por imunocoloração, (immunoblotting) nao detectou fibronec tina residual e laminina no produto de colagénio da presente invenção. Aceita-se que a pureza elevada de CAH contribuiu para a reduzida resposta imunológica na experiência no rato.

A proporção de colagénio do tipo III para cola- 23 / ~Λ génio do tipo I é muito maior no colagénio de âmnio humano injectável (43:57) de que no Zyderm ® e Zyplast ® (5:95). Contrariamente ao colagénio do tipo I, o colagénio do tipo

III aoresenta ligações dissulfato entre as cadeias, portanto após o tratamento por extracção com pepsina, existe o colagénio do tipo I sob a forma de uma mistura de cadeias alfa, beta e gama enquanto que o colagénio de tipo III existe prin cipalmente sob a forma gama. Está postulado que quanto maior for a reticulaçao, maior se apresentará a persistência do colagénio do tipo III no colagénio de âmnio que apareceria com o factor de importância em consideração ao colagénio mais eficaz para aumento de tecido mole.

Os estudos de biologia celular demonstraram que colagénio de âmnio humano irradiado com irradiações gama nao exerce efeito citotóxico no desenvolvimento celular e no comportamento das células. As células que se desenvolvem no substrato de colagénio de âmnio humano irradiado apresentam uma morfologia normal e uma pseudopodia activa. No número de células e H3 incorporados na experiência não se descobriram diferenças significativas entre o desenvolvimento das células no colagénio de âmnio humano irradiado e Vitrogenio ^w , Zyderm® e colagénio de âmnio humano não irradiado.

A caracterização bioquímica de vários colagénios de âmnio humano infectáveis relativamente ao grau de pureza e à proporção dos tipos de colagénio, incluiu electroforese de gel de poliacrilamida (IAG-E), densitometria, digestão por colegenase, análise de aminoácidos (ΛΑΑ), imunomarcação, microscopia electrónica (ΞΓ), ensaio de sensibilidade ' à colagenase e ensaio de hidroxiprolina. Nao se fornece des- 24 /

L.

í crição detalhada nem se julga necessário, destes vários processos uma vez que todos são convencionais.

São obteníveis bons resultados com a irradiação gama com um mínimo de 20 N rads e numa escala compreendida entre 25 M rads e 2,0 Π rads. Também se pode utilizar qualquer associação de âmnio e cório com bons resultados.

estudo em animais, anterior, é um excelente modelo experimental para a injecçao de material injectável em seres humanos.

A presente invenção, portanto, está bem adequada e adaptada para qualquer dos objectivos e fins e tem os aspectos e vantagens mencionados, assim como outros que lhe são inerentes.

Os exemplos preferidos presentemente ainda que apresentados com a finalidade de descrição, podem sofrer alterações que sejam abrangidas pelo âmbito da presente invenção tal como definido pelas reivindicações apensas.

Claims

1. - Processo para a preparação de um material injectãvel de tecido mole, caracterizado pelo facto de se esterilizar um material escolhido de placenta humana constituído por âmnio insolúvel, âmnio solúvel, cório solúvel e suas combinações e de se homogeneizar suficientemente o material por forma a passar através de uma agulha cirúrgica com um calibre pelo menos igual a 25.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dc sc homogeneizar o material suficientemente para passar através de uma agulha cirúrgica de calibre 30.

3. - Processo para a preparação de um material injectãvel de tecido mole de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se reticular moléculas de colagénio do material mediante irradiação gama.

4.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a irradiação gama ser um mínimo de 0,20 Mrads.

)

5.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a irradiação gama se encontrar na gama de 0.25Mrads a 2,0 Mrads.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar um analgésico ao material homogeneizado.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o material escolhido ser âmnio solúvel.