CN106544318A - 促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：1）将脐带间充质干细胞经培养后，取第三代稳定生长密度为80％‑95％的脐带间充质干细胞，保证了有足够多的基础干细胞，也更便于观察脐带间充质干细胞的分化增殖情况，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，除去死细胞，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养15‑24h；2）加入脂肪诱导培养基，培养2‑4天；3）更换新鲜脂肪诱导培养基，培养6‑14天。其具有可定向分化、增殖为脂肪细胞，温和无毒，且分化增殖率高的特点。

Description

促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术及细胞工程技术领域，尤其涉及促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的细胞。
脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化为软骨细胞( chondrocyte )、成骨细胞( osteoblast)、脂肪细胞( adipocyte )、肌细胞( myocyte )、神经细胞( neuron )等多种组织细胞。
然而怎样才能将其高效诱导分化成脂肪细胞，用于细胞生物治疗，其中仍存在许多问题亟需解决:1）采用的诱导因子复杂，不能保证干细胞沿预期方向分化、增殖，获得分化后的细胞不纯；2) 脐带间充质干细胞沿脂肪细胞方向分化率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其具有可定向分化、增殖为脂肪细胞，温和无毒，且分化增殖率高的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞，保证了有足够多的基础干细胞，也更便于观察脐带间充质干细胞的分化增殖情况，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，除去死细胞，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养15-24h；
2）加入脂肪诱导培养基，培养2-4天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基，培养6-14天。
本发明的有益效果在于：更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM后培养15-24h再加入脂肪诱导培养基是为了使脐带间充质干细胞在分化之前获得一个较好的过渡，激发脐带间充质干细胞的活性，本发明促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法分两段加入脂肪诱导培养基，第一次加入脂肪诱导培养基进行初步诱导，诱发脐带间充质干细胞沿脂肪细胞的分化方向，第二次加入脂肪诱导培养基使发脐带间充质干细胞沿脂肪细胞方向充分分化增殖，并获得分化增殖率和纯度高的脂肪细胞。
优选的，脂肪诱导培养基包括葡萄糖、地塞米松、青霉素、异丁基-甲基黄嘌呤、L-DMEM培养基。
葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，在干细胞分化增殖过程中提供能量。
地塞米松是肾上腺皮质激素类药物，在干细胞分化培养过程中起到生长因子的作用，促进细胞的增殖分化。
青霉素和异丁基-甲基黄嘌呤共同作用，刺激脐带间充质干细胞分裂增殖。
优选的，脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 5-15mM
地塞米松 0.1-0.5mM
青霉素 35-60U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 0.8-1.2mM
L-DMEM培养基 余量。
在此浓度的地塞米松、青霉素和异丁基-甲基黄嘌呤中，脐带间充质干细胞沿脂肪细胞方向分化率最佳。
优选的，脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 10mM
地塞米松 0.3mM
青霉素 45U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 1.0mM
L-DMEM培养基 余量。
优选的，步骤2）所述脐带间充质干细胞与脂肪诱导培养基的体积比为1:2-1:5。
优选的，步骤3）所述脐带间充质干细胞与脂肪诱导培养基的体积比为1:4-1:10。
具体实施方式
脐带间充质干细胞的分离培养
以下实施例的脐带间充质干细胞的分离培养方法包括以下步骤：
a）取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，剔去血管等杂质组织，剥出里面的华氏胶组织；
b）将所得组织充分剪碎至1-3mm3大小，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养；
c）脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
实施例1
本实施例的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经上述方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养15h；
2）加入脂肪诱导培养基60ml，培养2天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基120，培养6天。
所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 5mM
地塞米松 0.1mM
青霉素 35U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 0.8mM
L-DMEM培养基 余量。
实施例2
本实施例的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经上述方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养18h；
2）加入脂肪诱导培养基90ml，培养3天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基150，培养8天。
所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 8mM
地塞米松 0.2mM
青霉素 40U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 0.9mM
L-DMEM培养基 余量。
实施例3
本实施例的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经上述方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养20h；
2）加入脂肪诱导培养基60ml，培养3天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基150，培养10天。
所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 10mM
地塞米松 0.3mM
青霉素 45U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 1.0mM
L-DMEM培养基 余量。
实施例4
本实施例的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经上述方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养20h；
2）加入脂肪诱导培养基120ml，培养4天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基240，培养10天。
所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 12mM
地塞米松 0.4mM
青霉素 55U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 1.1mM
L-DMEM培养基 余量。
实施例5
本实施例的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经上述方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养24h；
2）加入脂肪诱导培养基150ml，培养4天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基300，培养14天。
所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 15mM
地塞米松 0.5mM
青霉素 60U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 1.2mM
L-DMEM培养基 余量。
分化率的检测
对实施例1至实施例5分别检测其在第一次添加脂肪诱导培养基培养后和第二次添加脂肪诱导培养基培养后的脂肪细胞转化率。取一例脐带间充质干细胞按上述分离培养方法培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞30ml，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养20h，不添加脂肪诱导培养基，自然分化培养14天，作为对照例，以培养第5天的结果作为与实施例的第一次脂肪细胞转化率对照，培养第14天作为与实施例的第二次脂肪细胞转化率对照。检测结果如表1。
观察脂肪细胞的生成情况，第一次添加脂肪诱导培养基培养后，可见大量内部有脂滴形成的圆形细胞，第一次添加脂肪诱导培养基培养后，采用油红O染色，可见大量密集小红色脂滴，诱导成脂分化成功。
由检测结果可知，本发明促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法成脂分化率达92%-96%，分化增殖率高，且本方法在诱导培养过程中无添加有毒物质，温和无毒，值得推广。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将脐带间充质干细胞经培养后，取第三代稳定生长密度为80％-95％的脐带间充质干细胞，PBS洗脐带间充质干细胞三遍，更换新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM，培养15-24h；
2）加入脂肪诱导培养基，培养2-4天；
3）更换新鲜脂肪诱导培养基，培养6-14天。
2.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：所述脂肪诱导培养基包括葡萄糖、地塞米松、青霉素、异丁基-甲基黄嘌呤、L-DMEM培养基。
3.根据权利要求2所述的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 5-15mM
地塞米松 0.1-0.5mM
青霉素 35-60U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 0.8-1.2mM
L-DMEM培养基 余量。
4.根据权利要求3所述的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：所述脂肪诱导培养基的组分含量为：
葡萄糖 10mM
地塞米松 0.3mM
青霉素 45U/L
异丁基-甲基黄嘌呤 1.0mM
L-DMEM培养基 余量。
5.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：步骤2）所述脐带间充质干细胞与脂肪诱导培养基的体积比为1:2-1:5。
6.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的方法，其特征在于：步骤3）所述脐带间充质干细胞与脂肪诱导培养基的体积比为1:4-1:10。
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