CN111712270B - 弹性蛋白的减少实现软骨植入物的再细胞化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产弹性蛋白减少的，包含通道和/或陷窝的软骨支架的方法，该方法包括提供弹性软骨样品，和从所述的软骨样品中减少弹性蛋白，以产生所述的通道和/或陷窝的步骤。本发明还涉及弹性蛋白减少的软骨支架。所述的弹性蛋白减少的软骨支架可用于体内植入方法中，用于软骨的修复、骨软骨缺陷的修复和骨缺陷的修复。

Description

弹性蛋白的减少实现软骨植入物的再细胞化
技术领域
本发明涉及组织植入物领域。更具体地，本发明属于改进软骨移植物领域。特别地，本发明涉及用于减少含有通道和/或陷窝的软骨支架的弹性蛋白的方法，所述的通道和/或陷窝允许支架的再细胞化。
背景技术
身体器官可能由于先天性紊乱、后天疾病、事故和年老而衰退。供体器官的稀缺性和抑制免疫系统以防止器官排斥的必要性都使得器官移植变得困难。在过去的几十年中，我们对构成器官的细胞的知识迅速扩展，使得从零开始移植器官的创建(所谓的组织工程化)变得日益现实。器官是细胞和基质的组合，后者提供了将细胞固定在适当位置的3维结构。细胞带有每个人独特的标记，使身体能够识别异物组织并通过阐明免疫反应来排斥它，从而需要在不同个体之间进行器官移植后抑制免疫。但是，形成基质的分子，在人与人之间，甚至有些分子在人类与其他动物之间，即使不相同，都是相似的。由于基质提供了组织的结构，因此将它们用作支架作为工程化器官的开始似乎很是有吸引力的。为此，在称为脱细胞化的第一步中，将细胞从器官中去除，留下支架。在称为再细胞化的第二步中，来自受体的细胞，即需要器官的患者，可以输注以重新定殖支架。对于心脏和膀胱等器官来说，这种方法已显示出了希望，尽管比起临床，组织工程化更像实验室的学科。
软骨使刚性结构变得柔韧。软骨是更坚固的例如与肌肉相比，但是与骨骼相比，却能够实现变形而不破裂。因此，在需要柔韧性的任何地方都存在软骨。在气管和鼻子中，其足够坚硬以保持气道开放，但也能够变形以适应呼吸和说话所需的动作。它的柔韧性还使软骨能够像自行车轮胎一样起到减震器的作用，例如，当在关节的骨表面上以薄层存在，或在脊柱中作为椎间盘存在时。软骨的柔韧性归因于一个简单的原理：与牢固而有弹性的基质进行结合的可逆的水结合。
软骨支架是与水结合分子交错的结构纤维的网络。当施加力时，水从软骨中被挤出，并且组织收缩。当消除力时，水返回并且软骨膨胀到其原始尺寸。
与大多数其他组织不同，软骨无法愈合。当例如在创伤之后或在手术过程中被损伤时，软骨解体，由此通常地由软骨吸收的机械力通常会加速衰退。软骨损伤是主要的医疗保健问题，尤其是在骨科和头颈外科的医学领域。由于身体无法修复受损的软骨，因此必须更换组织。软骨是科学家试图进行工程化的最初的组织之一，因为软骨仅包含一种细胞类型，即软骨细胞，从理论上讲，当与等更复杂的器官(例如心脏)相比时，它对工程化的挑战较小。
尽管已经开发出许多方案来使软骨脱细胞，但是第二步，已证明再细胞化是不可能的。由于胶原蛋白纤维的致密网络和血管的缺乏，软骨对于细胞的侵入是无法修复的。同时存在于软骨支架中的软骨细胞当破碎成小的片块而足以通过密集的胶原蛋白网络中的孔冲走时可以被去除，但通常新细胞太大而不能进入网络。此外，糖胺聚糖(GAG)的存在可以防止细胞粘附于细胞外基质(Bara et al.,2012.Connect Tissue Res 53:220-8)。未发表的观察表明，软骨细胞、骨髓源性基质细胞(BMSC)，甚至是高侵入性癌细胞系，都无法迁移到脱细胞的软骨中。此外，在小鼠皮肤下植入的脱细胞天然软骨是高度血管化的环境，其中植入物易于受到免疫细胞的侵入，但并未显示出任何细胞侵入的迹象(未发表的数据)。
US2008/077251公开了一种通过清洁和消毒软骨移植物生产清洁、消毒和失活的软骨移植物的方法；在预处理溶液中处理软骨移植物；在提取液中处理软骨移植物；用冲洗溶液洗涤提取的软骨移植物；然后将失活的软骨移植物浸泡在储存溶液中。通过包含软骨素酶ABC的预处理溶液来修饰软骨基质的细胞外基质。然后可以用活细胞使失去活力的软骨移植物再细胞化，使得组织在植入之前或之后至关重要。WO2009/149224公开了一种从无细胞组织基质(ATM)生产修饰的无细胞组织基质(mATM)的方法，其中mATM相对于ATM具有降低的拉伸性，而基本上不损害其相关的结构或功能完整性。该方法包括使软骨脱细胞，并用0.1-0.5U/ml的猪胰弹性蛋白酶处理12-24小时，因此除去存在的至少一部分弹性蛋白。然后用自体或同种异体骨髓细胞接种支架。
尽管现有的用于使软骨样品脱细胞的方法不允许细胞侵入和再细胞化软骨支架，同时还保持结构和机械性能，但软骨支架的再细胞化对于移植后确保软骨的功能正常，维持基质和防止支架降解至关重要。因此，成功实现软骨支架的再细胞化将大大提高软骨移植物的质量。
发明内容
本发明提供了生产弹性蛋白减少的软骨支架的方法，其包括以下步骤：a)提供弹性软骨样品，和b)从所述的软骨样品中减少弹性蛋白，以生产弹性蛋白减少的软骨支架。与透明软骨和纤维软骨相反，弹性软骨包含弹性蛋白的大纤维束，其穿过胶原蛋白网络，并围绕软骨细胞所在的口袋(称为陷窝)。本发明通过从弹性软骨样品中去除弹性蛋白纤维来解决该问题，该弹性蛋白样品使细胞能够侵入并附着在弹性蛋白减少的弹性软骨支架上。
软骨支架可获取自人类，例如患有软骨缺陷的人类，该类人将接受作为植入物的软骨支架、同种异体供体，即不来自植入物的受体，或来自异种来源。所得的弹性蛋白减少的软骨支架主要由在哺乳动物物种中保守的蛋白质和纤维组成。因此，预期在来自同种异体来源或异种来源的支架植入人体受体后，不会引起免疫反应。
在本发明的方法中，在减少软骨支架中的弹性蛋白纤维的步骤之前，将弹性蛋白纤维从软骨支架减少至弹性蛋白纤维的量的约50％，优选地约25％，优选地约10％，优选地1％，优选地完全去除。该减少优选地通过将软骨支架与一种或多种酶孵育而获得，所述的酶优选包含弹性蛋白酶，例如猪胰弹性蛋白酶。为此，在一个实施方案中，可将软骨支架与1-12U/ml的酶一起孵育，或在一个实施方案中，可与2-10U/ml的酶一起孵育，或在另一实施方案中，与3-5U/ml的酶一起孵育，或在进一步的实施方案中，与3U/ml的酶一起孵育。在一个实施方案中，所述酶是弹性蛋白酶，具体地是胰弹性蛋白酶。
可替代地，可以将软骨支架与弹性蛋白酶和至少一种其他蛋白水解酶组合孵育。在一个实施方案中，孵育溶液包含0.01-10U/ml的弹性蛋白酶和0.05-5mg/ml的胃蛋白酶，优选地，约1mg/ml的胃蛋白酶。所述的与一种或多种酶的孵育，优选地，其包括弹性蛋白酶，优选地，包括将软骨支架孵育0.5-80h的时间段，优选地，至少约24-48h，优选地，约24h，以去除弹性蛋白，并由此产生软骨支架中的通道和/或陷窝。
可选地，在减少弹性蛋白之前或之后，对软骨样品进行脱细胞化步骤。
如果软骨样品不是无菌的，则可以在减少弹性蛋白之前或之后，对软骨样品进行去污步骤。
弹性蛋白减少的弹性软骨基质可用于修复弹性软骨缺陷，例如耳朵缺陷或耳朵畸形。然而，令人惊讶地发现，弹性蛋白减少的弹性软骨还可以用于修复透明软骨缺陷，例如关节缺陷、鼻缺陷、气道缺陷和肋骨缺陷，还可以用于修复纤维软骨缺陷，例如椎间盘缺陷，甚至用于修复骨软骨缺陷和骨缺陷。
软骨支架的脱细胞化可以通过植入之后来自受体的细胞，或通过在植入之前提供到软骨支架中的细胞来完成。
本发明的方法可以包括通过使细胞粘附到弹性蛋白减少的软骨支架中使弹性蛋白减少的软骨支架再细胞化的步骤。这可以通过将细胞接种到弹性蛋白减少的软骨支架上，或通过将细胞注射入弹性蛋白减少的软骨支架中，并允许所述细胞迁移到弹性蛋白减少的软骨支架的空的通道和陷窝中来实现。为了将细胞注射到软骨支架中，可以使用针。
用于软骨支架的再细胞化的细胞，优选地，是具有软骨形成或成骨潜能的细胞。这样的细胞包括软骨细胞、软骨膜细胞、骨膜细胞和干/祖细胞，例如脂肪来源的基质血管干细胞、滑膜来源的细胞、具有或不具有其原始基质的羊膜来源的细胞，以及骨髓来源的基质细胞。所述细胞优选地是自体人类细胞，即来自植入物受体的细胞，或同种异体人类细胞，即来自不是植入物受体的个体的细胞。所述的同种异体人类细胞优选地在遗传上与植入物的受体匹配，优选地，通过人类白细胞抗原(HLA)匹配，和/或血型匹配，或免疫逃避，即不导致任何不利的影响。
本发明进一步提供了可通过本发明的方法获得的弹性蛋白减少的软骨支架，或再细胞化的弹性蛋白减少的软骨支架。所述的软骨支架可用于修复软骨的方法。
本发明的一个实施方案涉及弹性蛋白减少的软骨支架，其包括通道和/或陷窝。具体地，通过酶处理，特别是弹性蛋白酶处理，获得软骨支架的通道和/或陷窝。
在本发明的一个实施方案中，弹性蛋白减少的软骨支架还可以是再细胞化的软骨支架。这样，在本发明的一个实施方案中，已经将弹性蛋白减少的软骨支架接种了细胞，特别地，采用选自由以下组成的组的细胞：软骨细胞、软骨膜细胞、骨膜细胞和干/祖细胞，例如脂肪来源的基质血管干细胞、滑膜来源的间充质细胞和骨髓来源的基质细胞。
弹性蛋白减少的弹性软骨支架不仅可以用于修复弹性软骨(例如耳软骨)，而且可以用于修复透明软骨和纤维软骨(例如关节、鼻和气道软骨)的方法中。所述的软骨支架还可以用于修复骨软骨缺陷和修复骨缺陷的方法中。
附图简述
图1A-1G：弹性纤维束的间苯二酚-品红(Rescorcin-fuchsin)染色示出了在用弹性蛋白酶处理后，在牛耳软骨中存在弹性蛋白纤维(A，放大在B中)，纤维的去除以及通道和陷窝的打开(C，D)。培养6天后，用BMSC接种的经弹性蛋白酶处理的牛耳软骨用苏木精-伊红染色(E)，细胞迁移到组织中，以及(F，放大)通过通道迁移，显示出细长的形状。(G)用BMSC重新接种并且软骨分化35天的弹性蛋白减少的耳软骨的硫蛋白染色。深色染色示出了糖胺聚糖，表明在现有软骨支架内新形成的软骨。示出了四个不同的样本。
图2A-2D：弹性蛋白减少的耳软骨用苏木精-伊红染色后，注射人类关节软骨细胞，并在软骨形成培养基中培养六天，示出了(A)远离注射部位的细胞分布(用黑色星星表示)和(B，从A放大)高的细胞密度。(C，D)注射人类关节软骨细胞并在软骨形成培养基中培养35天的弹性蛋白减少的耳软骨用硫蛋白染色，示出了原位形成软骨样基质，并用深色区域标记，(C)远离注射位置(用黑色星星表示)和(D)迁移的软骨细胞周围。
图3A-3F：将弹性蛋白减少的耳软骨放入皮下植入小鼠的牛关节缺陷模型中。(A，B)骨软骨缺陷中无接种细胞的软骨移植(A放大在B中)。在新的软骨中原位形成，经硫脲染色后以深色区域为标记，这是由于牛关节缺陷模型的骨部分以及少量软骨部分，侵入了细胞；白色箭头表示弹性蛋白减少的软骨基质中新形成的软骨；黑色箭头表示原生的完整牛软骨。(C，在D中放大)当缺陷(软骨缺陷)下方完整的钙化软骨层限制了进入关节模型的骨部分时，只有来自牛关节缺陷模型的软骨部分的细胞侵入了软骨移植物，形成了新的软骨。白色箭头表示在弹性蛋白减少的软骨基质中新形成的软骨；黑色箭头表示原生完整的牛软骨；阴影箭头表示天然钙化的牛软骨。(E，在F中放大)用白线划定的弹性蛋白减少的耳软骨接种人类关节软骨细胞，置于牛关节缺陷模型中，并皮下植入至小鼠中。当防止细胞从牛关节缺陷模型的骨部分侵入时，在耳软骨内也会形成软骨样基质，表明接种的细胞也可以使移植物恢复活力。白色箭头表示在弹性蛋白减少的软骨基质中新形成的软骨；阴影箭头表示天然钙化的牛软骨。
图4：在体内的骨软骨栓塞模型中，用共培养的hAC和ASC-TERT1重新接种了耳软骨和对照支架。在裸鼠模型中6周后，可以在支架内深处的通道和陷窝中观察到胶原蛋白II型的合成(箭头)，但是在其他通道中，胶原蛋白I型仍然强烈地表达(箭头)；n＝6。
图5：在体内的骨软骨栓塞模型中，单独或以共培养物用牛软骨细胞重新接种的耳软骨。细胞侵入由弹性纤维耗尽产生的空的陷窝和通道，并在支架内部合成了新的胶原蛋白II型(箭头)。共培养组中移植物重塑的迹象是可见的(箭头)。胶原蛋白I型在软骨细胞组中仅由单细胞弱表达，而在共培养组中则完全缺失；n＝3。
具体实施方式
如本文所用，术语‘脱细胞化’是指从软骨细胞外基质中去除细胞和细胞残余物而留下原始组织的软骨支架的过程。
如本文所用，术语‘再细胞化’是指在所述的软骨支架脱细胞化后允许细胞侵入软骨支架的过程。
如本文所用，术语‘软骨支架’是指主要由胶原蛋白纤维、非胶原糖蛋白和蛋白聚糖组成的软骨的细胞外物质。如本文所用，术语‘同种异体’是指源自不是植入物的受体的个体。
如本文所用，术语‘弹性蛋白’是指软骨组织中的高弹性蛋白，其允许体内的软骨组织在拉伸或收缩后恢复其形状。
如本文所用，术语‘弹性蛋白纤维’是指在软骨组织的细胞外支架中发现的弹性蛋白蛋白束。
如本文所用，术语‘弹性蛋白酶’是指肽酶S1家族的丝氨酸内肽酶(参见http://enzyme.expasy.org/peptidas.txt)。优选的弹性蛋白酶是EC编号为3.4.21.36、3.4.21.37或3.4.21.71的一类酶。弹性蛋白酶水解蛋白质，包括弹性蛋白。一个单位的弹性蛋白酶定义为在pH为8和25℃下，每分钟水解1.0μm的N-琥珀酰-L-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺的酶的量。弹性蛋白酶可以选自由胰腺弹性蛋白酶、胰腺弹性蛋白酶II、白细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶组成的组。在本发明的一个实施方案中，弹性蛋白酶是胰腺弹性蛋白酶。
术语‘弹性软骨’是指在紧邻胶原蛋白纤维包含弹性纤维的软骨，例如存在于耳朵、咽鼓管和会厌中。术语‘透明软骨’是指主要包含胶原蛋白II型纤维的软骨，例如关节软骨、滑膜关节内骨骼的相对表面、肋骨的腹侧末端、喉、气管、支气管、鼻中隔和鼻翼。
如本文所用，术语‘纤维软骨’是指紧邻胶原蛋白II型纤维的、包含胶原蛋白I型的软骨，其存在于半月板、椎间盘的环状纤维环、颞下颌关节和耻骨组合中。
如本文所用，术语‘耳软骨’是指耳朵的耳廓，即耳朵的最外部的软骨。
如本文所用，术语‘关节软骨’是指覆盖滑膜关节内的骨的铰接的、相对的表面的软骨。
如本文所用，术语‘软骨膜’是指密集的不规则结缔组织层，其围绕软骨，除了关节的末端，并且由两个单独的层组成；外层的纤维层和内层的软骨形成层，外层的纤维层包含产生胶原蛋白的成纤维细胞，内层的软骨形成层包含可以形成软骨细胞和软骨细胞的祖细胞。
如本文所用，术语‘软骨母细胞’是指未成熟的软骨产生细胞。
如本文所用，术语‘软骨细胞’是指构成并产生软骨的专门细胞。
如本文所用，术语‘骨膜’是指专门的结缔组织，其覆盖除了关节之外的身体的所有骨骼。骨膜具有软骨和骨形成的潜能。
如本文所用，术语‘源自骨髓的基质细胞’，或BMSC，是指源自骨髓的间充质细胞，并通过粘附于塑料和缺乏造血标志物(如CD45和CD14的表达)而被识别。
如本文所用，术语‘滑膜来源的间充质细胞’是指源自滑膜组织并通过粘附于塑料而识别的间充质细胞。所述的细胞缺乏诸如CD45和CD14的造血标记物的表达。
如本文所用，术语‘脂肪来源的基质血管干细胞’是指源自脂肪组织的基质血管部分的间充质祖细胞/干细胞，其通过缺乏造血标记物，如CD45和CD14的表达而识别。
如本文所用，术语‘软骨形成潜能’是指细胞产生软骨的能力。
如本文所用，术语‘成骨潜能’是指细胞产生骨骼的能力。
如本文所用，术语‘超声处理’是指施加声音能量以搅动样品中的颗粒的动作。
如本文所用，术语‘紊乱’是指功能、结构或两者的异常，其是由于发育中的遗传或胚胎衰退，或由于诸如创伤或疾病的外源性因素而引起的。
如本文所用，术语‘治疗(treatment)’或‘治疗(treating)’是指试图改变待治疗个体的自然病程的临床干预。治疗的期望的效果包括预防紊乱的发生或复发，减轻症状以及减轻紊乱的任何直接或间接后果，和/或改善或减轻紊乱的状态。在本发明中，‘治疗’或‘治疗’被理解为是指通过给药于包含具有或不具有重新细胞化的细胞的软骨支架的组合物，使得患有软骨病，例如关节软骨受损，或软骨组织(例如鼻子或外耳)畸形或缺失的人的改善或减轻。
如本文所用，术语‘修复’是指部分或完全修复组织，优选软骨组织的动作。
提供软骨支架
基于组织学外观，软骨通常分为三种类型：a)透明软骨，其可源自关节、肋骨、鼻子或气管；b)纤维软骨，其可存在于椎间盘、疤痕组织和半月板中；以及c)弹性软骨，其可以从会厌、外耳和咽鼓管获得。优选的软骨样品是弹性软骨样品。
软骨样品可以从供体获得，例如通过去除周围的组织(例如皮肤和切除)，优选地，采用确保所得软骨样品为无菌的方法。
软骨样品可以从动物获得，例如但不限于，母牛或猪，以及人类。人类软骨样品可以从例如死后供体中获得，或者从作为相关过程产生的外科手术样品获得，例如在耳整形期间(耳成形术)。动物软骨例如来自母牛或猪，例如成年牛(母牛)和未成熟牛(小牛)，软骨可从屠宰场获得。
软骨样品可选地脱细胞。在该脱细胞化步骤期间，通过使样品经受至少一个冻融循环，优选地，经历至少三个冻融循环，例如3个冻融循环、4个冻融循环、5个冻融循环或6个冻融循环，以杀死和去除软骨样品中的固有软骨细胞。冻融循环杀死细胞并帮助去除细胞颗粒。
所述的冻融循环可以干燥，或者在低渗缓冲溶液中孵育软骨样品之后进行(例如在pH＝8的10mM的Tris-HCl中，或在去离子水中(ISO 3696I级)。一种优选的方法包括至少一个干燥冻融循环，和在低渗缓冲溶液中孵育软骨样品之后的至少一个冻融循环，例如两个干燥冻融循环，随后在低渗缓冲液中进行两次软骨样品的冻融循环。每个所述的冻融循环可以独立地在-200℃和+60℃之间的温度下进行。
如果软骨样品不是无菌的，则可以在减少弹性蛋白之前或之后，对所述的软骨样品进行去污染，例如通过在包含乙醇、过氧乙酸、碘溶液、氢氧化钠溶液、氯化氢溶液和/或过氧化氢的至少一种(优选过氧化氢)的缓冲溶液中孵育，持续0.2–10h，优选1-3h。例如，可以通过将软骨样品在0.1％过氧乙酸的PBS中在室温孵育3小时进行去污步骤，如Utomo等人2015年(Utomo et al.,2015.Biomed Mater 10:015010)所示。在优选的去污步骤中，通过在5％的过氧化氢中在37℃孵育60分钟对软骨样品进行去污。
减少软骨支架中的弹性蛋白
尤其是弹性软骨，其包含弹性蛋白的大纤维束，使其具有出色的柔韧性。弹性蛋白纤维穿过胶原蛋白网络，并包围软骨细胞所在的被称为陷窝的口袋。从软骨支架中去除这些弹性蛋白纤维将留下穿过胶原蛋白网络的空的通道。
所述的弹性蛋白纤维优选地通过蛋白酶，例如弹性蛋白酶，从软骨支架上减少，或甚至完全除去。虽然其他弹性蛋白酶也可用于减少或去除软骨支架中的弹性蛋白，但它们可能会对胶原蛋白网络造成一些损伤。为了减少弹性蛋白，优选地，将软骨支架与蛋白酶如弹性蛋白酶以1-12U/ml，优选地以3U/ml的浓度，孵育时间为1-80h，优选地为24-48h。所述的孵育时间可以部分地由样品尺寸和厚度，和/或酶浓度确定。例如，对于小于1cm2且厚度为3mm的样品，孵育时间优选地为大约24h，对于大于1cm2的样品，孵育时间优选地为48至72h。在Utomo等人2015年中，将样品与0.03U/ml的弹性蛋白酶在37℃下孵育24h。但是，该程序并未显著地改变软骨组织中的弹性蛋白含量以允许再细胞化。如果软骨样品的弹性蛋白酶处理与其他蛋白水解酶的处理相结合，则所述的弹性蛋白浓度可以较低，优选地，约为0.01-1U/ml。这些其他蛋白水解酶可以包含胃蛋白酶，优选地，以约为0.5-5mg/ml的胃蛋白酶的浓度，优选地，以约为1mg/ml的胃蛋白酶的浓度。所有酶优选地，具有大于90％的纯度，和/或根据生产质量管理规范(GMP)生产。
样品可以在低渗缓冲液中，进行2×干燥冻融循环和2×冻融循环，然后在0.5M的乙酸中的1mg/mL的胃蛋白酶中孵育过夜，并用在pH为8.6的Tris缓冲液中的0.03U/ml的弹性蛋白酶孵育过夜，然后将样品用PBS洗涤2×30min，然后过夜洗涤。所述的减少或完全从软骨支架中去除弹性蛋白的步骤，优选地，可以随后通过在核酸酶溶液中孵育软骨支架以去除支架中的所有核酸物质。为此，所述的支架可以在无毒的缓冲盐溶液中孵育，该无毒的缓冲盐溶液包含1-100U/ml，优选地约50U/ml的DNase，和/或0.1-10U/ml，优选地约1U/ml的RNase，然后，在存在或缺失蛋白酶抑制剂(例如竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂)的情况下，在无毒的缓冲盐水溶液中反复洗涤。
体外软骨细胞再细胞化的方法
从软骨支架中减少或完全去除弹性蛋白后，陷窝将会打开，并且在弹性蛋白纤维穿过基质的地方出现通道，从而有助于去除细胞残余物。所述的弹性蛋白的减少或完全去除还可导致软骨支架中糖胺聚糖(GAG)的减少。由于据报道，GAG可以防止细胞(如软骨细胞)的粘附(Bara.et.al.,2012.Connect Tissue Res 53:220-8)，软骨支架中GAG的减少可能有益于支架的再细胞化。通道和可进入的陷窝现在允许细胞侵入支架，从而允许软骨再细胞化。
减少或去除的弹性蛋白束让位于弹性软骨(例如耳廓中的弹性软骨)中的通道。在含有分散的弹性蛋白纤维但缺乏弹性蛋白束的透明软骨中，减少或去除的弹性蛋白不会让位于通道。
适用于使弹性蛋白减少的软骨支架再细胞化的细胞，是具有软骨形成潜能的细胞，例如软骨细胞、软骨膜细胞、骨膜细胞和间充质干/祖细胞，例如脂肪来源的基质血管干细胞、骨髓来源的基质细胞，或滑膜来源的细胞，和羊膜来源的细胞。
培养具有软骨形成潜能的细胞的方法是本领域技术人员已知的。例如，BMSC细胞可以在37℃和5％的CO2下，密度为2300个细胞/cm2的培养基中培养，在这里称为扩增培养基，其包括MEM-α(Gibco，卡尔斯巴德，美国)，其含有10％的热灭活的FCS(Lonza，韦尔维耶，比利时)、50μg/mL的庆大霉素、1.5μg/ml的二性霉素B、25μg/ml的L-抗坏血酸2-磷酸酯和1ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子2(bFGF2；安迪系统公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯，美国)，如Johnstone等人1998年(Johnstone et al.,1998.Exp Cell Res 238:265-72)所述，或此方法的适用可以改善细胞增殖和/或软骨形成能力，例如Narcisi等人2015年(Narcisi et al.,2015.Stem Cell Reports 4:459-7)中所描述的。
可以使用本领域技术人员已知的以下方法之一，将所述的软骨形成细胞，优选人类细胞，接种到软骨支架中：
a)静态接种；可以将软骨支架放置在培养孔的底部，然后在扩增培养基中填充细胞(通常地约1,000个细胞/mm3支架至10,000个细胞/mm3)。细胞将沉降并附着在软骨支架上。
b)动态接种；可以将软骨支架放置在装有在扩增培养基中的细胞(通常地约5,000个细胞/mm3支架至约20,000个细胞/mm3)的密闭管中，并在以45°或90°角旋转时孵育。
c)注射；可以用针将大约1000个细胞/mm3支架至大约10,000个细胞/mm 3的细胞悬浮液注射到软骨支架中。
当通过静态接种将软骨形成细胞(例如BMSC)接种到软骨支架表面时，软骨形成细胞将迁移到支架中并分布在其中。这里使用的培养基可以包含提高迁移率的血清梯度或趋化因子，或者优选地，增强软骨分化，例如DMEM-高葡萄糖GlutaMAX+(GIBCO)、1：100胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸(ITS+，BD Biosciences)、40μg/ml的L-脯氨酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、1mM的丙酮酸钠(GIBCO)、100nM的地塞米松(西格玛奥德里奇公司)、10ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1，安迪系统公司)、2μM的WNT抑制剂IWP2(西格玛奥德里奇公司)、1.5μg/ml的二性霉素B(GIBCO)和50μg/ml的庆大霉素(GIBCO)，如Narcisi等人2015年所述。迁移的细胞可能不均匀地分布在软骨支架上，并且可能在支架内的密集斑点中生长。可替代地，可将细胞注射入软骨移植物中，并从注射部位在随后的培养期间或体内植入后进一步分布。优选地，根据生产质量管理规范(GMP)培养所有细胞。
可以在细胞接种后或在进一步的细胞培养后，立即将移植物与细胞同时植入，以刺激迁移和软骨形成。当被诱导经历软骨形成分化时，细胞将在支架内形成软骨。与胶原蛋白支架不同，弹性蛋白减少的软骨支架在细胞接种和软骨形成分化过程中在体内保持其形状。
再细胞化的软骨支架的植入
再细胞化的软骨支架可用于植入宿主。
再细胞化的软骨支架可用于软骨修复，例如关节、鼻、气道、半月板和耳软骨。软骨支架可用于修复先天性软骨缺陷以及受损的软骨组织。因为软骨支架在弹性蛋白减少和再细胞化后保留了其尺寸和形状，所以这种支架可用于重建具有复杂形状的软骨组织(例如外耳软骨)的大型软骨缺陷。
在运输过程中，优选地，通过使用无菌运输容器将再细胞化的软骨支架，优选地保持无菌和湿润。要修复的软骨组织可通过在皮肤上切开切口，露出软骨组织，或在关节处开孔来达到。仅在植入前，将软骨支架或再细胞化的软骨支架从无菌运输容器中取出，并且如果需要，根据模板，例如用剪刀使其尺寸适合。可以植入再细胞化的支架，以替换受损伤或缺失的软骨组织或其一部分。可以通过在软骨缺陷的边界处压入、缝合或(血纤蛋白)粘合，将再细胞化的软骨支架插入，优选地，使用无菌操作的方法。在实现控制出血后，可以关闭关节或切口的开口。
弹性蛋白减少的软骨支架的植入
尽管对于全耳重建来说，植入前再细胞化可能是优选的，但无细胞方法可能适用于治疗关节软骨缺陷、骨软骨缺陷，或鼻或耳软骨缺陷，其中软骨膜仍完整。该方法涉及将弹性蛋白减少的、未再细胞化的软骨支架植入宿主。未再细胞化的软骨支架的植入过程，将类似于本文上文中针对再细胞化的软骨支架所述的过程。
弹性蛋白减少的软骨支架的再细胞化可以通过自体宿主细胞从环境向支架内的生长而在体外或体内实现。这可以被激发，例如，通过添加生长因子、趋化因子或其他软骨修复刺激剂，例如富含血小板的血浆。
实施例
提出以下实施例以帮助理解本发明，但并不旨在并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括常规方法的详细描述。这样的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
实施例1：通过动态接种用BMSC再细胞化
用水洗涤12周龄小牛的外耳，并用手术刀去除软骨膜、皮肤和肌肉，直到仅剩下软骨。随后，使用活检穿孔器从耳软骨获得直径为6mm、高度约为1mm的活检样本，因此每个样本的体积约为30mm3。
然后采用以下方案去除细胞和弹性蛋白纤维，除非另有说明，否则给出的体积适用于大约20个样品的批次。首先，将样品用40ml简单漂洗三次。在本发明的一些实施方案中，将3696I级去离子水(以下称为去离子水)，以从分离物中去除碎屑，例如皮肤松散的碎片。如有必要，将样品在-20℃的20ml的去离子水中冷冻保存。然后将样品用20ml的5％的过氧化氢在37℃下灭菌60分钟。随后，将样品用40ml的去离子水简单漂洗三次，并在-80℃至37℃的去离子水中冻融三次，时间分别足以完全地冷冻和融化样品。通过与3U/ml的弹性蛋白酶(西格玛奥德里奇公司)，在2M的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)HCl的水溶液中孵育样品的条件下消化弹性纤维束，该水溶液设定pH为8.6，每个样品1ml，在37℃下以30RPM旋转24h，样品在旋转过程中不断浸没。随后通过与50ml的去离子水一起孵育，每次在室温(RT)下，以30RPM旋转5min，共三次，然后洗涤掉弹性蛋白酶溶液。为了促进陷窝的打开，并增加从软骨基质中清除细胞碎片的过程，将样品暴露于物理应变下：快速冷冻-解冻循环(从-190℃到37℃)，在42kHz(70瓦特的水浴超声仪)下超声8分钟，共两次，并且在没有液体的情况下，以2500RPM的速度涡旋约30秒钟，共三次。
随后，通过在40ml的MEM-α(Gibco，卡尔斯巴德(Carlsbad)，美国)中孵育涂有血清的样品来测试无菌性，所述的MEM-α含有10％的热灭活的FCS(Lonza，韦尔维耶，比利时)，在37℃下孵育24h，以30RPM旋转。然后将无菌样品置于2ml的聚丙烯微量离心管中，每个样品置于一个管中，并在1.5ml的扩增培养基中(MEM-α(Gibco，卡尔斯巴德，美国)，以每个样品250,000个细胞(约8,500细胞/mm3)接种人类成年骨髓源性基质细胞(BMSC)，所述的扩增培养基含有10％的热灭活的FCS(Lonza，韦尔维耶，比利时)、50μg/mL的庆大霉素(英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)、1.5μg/ml的二性霉素B(英杰生命技术公司)、25μg/ml的L-抗坏血酸2-磷酸酯和1ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子2(bFGF2；安迪系统公司，明尼阿波利斯，美国)。然后将样品与微量离心管中的细胞于37℃下，在45°角下，以30RPM旋转的条件下孵育24h。接种后，将样品在扩增培养基中轻轻漂洗两次，并转移至2cm2的孔中(每个样品占据一孔)，并在1ml/孔的扩增培养基中培养六天，并在第二天和第四天对培养基进行更换，或者培养35天，并且每三天，在软骨形成培养基(DMEM-高葡萄糖GlutaMAX+(GIBCO)、1：100胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸(ITS+，BD Biosciences)、40μg/ml的L-脯氨酸(西格玛奥德里奇公司)、1mM的丙酮酸钠(GIBCO)、100nM的地塞米松(西格玛奥德里奇公司)、10ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1，安迪系统公司)、1.5μg/ml的二性霉素B(英杰生命技术公司)和50μg/ml的庆大霉素(英杰生命技术公司))中更换培养基。
培养后，用镊子小心收集样品，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤，并在3.7％的福尔马林中固定24h。根据制造商的方案，如Narcisi等人2015年和Utomo等人2015年所述，然后将固定的样品包埋在琼脂糖中，脱水，包埋在石蜡中，并以6μm的厚度切片，将切片置于载玻片上，然后干燥、重新水化、用苏木精(西格玛奥德里奇公司)和2％的曙红(默克公司(Merck))或0.4％的硫蛋白溶液(西格玛奥德里奇公司)或间苯二酚-品红溶液(RF，Klinipath，德伊芬，荷兰)染色，脱水，并密封在玻璃盖玻片上。
显微照片(图1A-D)示出了经弹性蛋白酶处理的脱细胞软骨具有通道和打开的陷窝。然后，BMSC可以在7天之内迁移到组织中(图1E)，并且可以看出，当细胞通过去除的弹性蛋白纤维留下的通道迁移时，细胞呈伸长的形状(图1F)。当软骨分化时，BMSC在脱细胞基质内的组织内形成新的软骨样基质(图1G)。
实施例2：注射后原位软骨形成
软骨的某些区域难以通过迁移到达细胞，例如，外耳的软骨被致密的软骨膜层包围。如Utomo等人2015年所示，可以使用弹性蛋白酶使整个耳朵脱细胞。软骨膜紧密地附着在软骨上，并且在不损伤软骨结构的情况下将其去除是不可行的。
为了测试整个耳朵的再细胞化是否可行，通过软骨膜注射，用软骨形成细胞再细胞化牛耳软骨样品，而不必去除软骨膜。
用水清洗12周龄小牛的外耳，并用手术刀除去皮肤和肌肉，直到仅剩下完整软骨膜的软骨为止。随后，使用手术刀从耳软骨获得边长为15mm的方形活检样品，每个样品的高度约为2-4mm(包括软骨膜)，因此体积约为450-900mm3。
然后采用以下方案去除细胞和弹性蛋白纤维，给出的体积适用于一个样品。首先，将样品用10ml的ISO 3696I级去离子水(以下称为去离子水)，简单漂洗三次，以从分离物中去除碎屑，例如皮肤松散的碎片。如有必要，将样品在-20℃的5ml的去离子水中冷冻保存。然后将样品分别用10ml的5％的过氧化氢，在37℃下灭菌120分钟，共两次。随后，将样品用10ml的去离子水简单漂洗三次，并在-80℃至37℃的去离子水中冻融三次，时间分别足以完全地冷冻和融化样品。弹性蛋白束通过与12U/ml的弹性蛋白酶(GoldBio)，在2M的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)HCl水溶液中孵育样品的条件下消化弹性纤维束，该水溶液设定pH为8.6，每个样品2ml，在37℃下以30RPM旋转72h，每24h更换溶液，样品在旋转过程中样品不断浸没。随后通过与10ml的去离子水一起孵育，每次在室温下，以30RPM旋转5min，共三次，来洗涤掉弹性蛋白酶溶液。为了促进陷窝的打开，并增加从软骨基质中清除细胞碎片的过程，将样品置于物理应变下：快速冷冻-解冻循环(从-190℃到37℃)，在42kHz(70瓦特的水浴超声仪)下超声8分钟，共两次，并且在没有液体的情况下，以2500RPM的速度涡旋约30秒钟，共三次。
随后，通过在5ml的MEM-α(Gibco，卡尔斯巴德(Carlsbad)，美国)中孵育涂覆有血清的样品来测试无菌性，所述的MEM-α含有10％的热灭活的FCS(Lonza，韦尔维耶，比利时)，在37℃下孵育24h，以30RPM旋转。然后用镊子将无菌样品固定在适当的位置，然后使用30规格的针头，以最中心区域为目标，如下所述，将含约1,500,000个细胞的150μl的MEM-α(Gibco，卡尔斯巴德，美国)，注入三个不同的部位，所述的MEM-α包括10％的热灭活FCS(Lonza，韦尔维耶，比利时)。细胞可以是成人成年骨髓源性基质细胞(BMSC)，或从接受全膝关节置换的患者的骨关节炎膝关节中，分离的人类关节软骨细胞，其在含有10％的热灭活的FCS(Lonza)、庆大霉素(50mg/mL；英杰生命技术公司)和1.5mg/mL的两性霉素B(二性霉素B；英杰生命技术公司)的DMEM(Lonza)中扩增10天。注射后，将样品在磷酸盐缓冲液中轻轻漂洗三次，并转移至10cm2的孔中(每个样品占据一孔)，并且培养35天，并且每三天，在4ml/孔的软骨形成培养基(DMEM-高葡萄糖GlutaMAX+(GIBCO)、1：100胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸(ITS+，BD Biosciences)、40μg/ml的L-脯氨酸(西格玛奥德里奇公司)、1mM的丙酮酸钠(GIBCO)、100nM的地塞米松(西格玛奥德里奇公司)、10ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1，安迪系统公司)、1.5μg/ml的二性霉素B(英杰生命技术公司)和50μg/ml的庆大霉素(英杰生命技术公司))中更换培养基。但是，取决于细胞类型和偏好，任何软骨分化方案都应起作用。
培养后，用镊子小心收集样品，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤，并在3.7％的福尔马林中固定24h。如Narcisi等人2015年所述，然后将固定的样品包埋在琼脂糖中，脱水，包埋在石蜡中，并以6μm的厚度切片，将切片置于载玻片上，然后干燥、复水、用苏木精(西格玛奥德里奇公司)和2％的曙红(默克公司)或0.4％的硫蛋白溶液(西格玛奥德里奇公司)染色，脱水，并密封在玻璃盖玻片下。
脱细胞和重新接种的样品的显微照片(图2)，示出了细胞已从注射部位迁移到周围的软骨基质中，并经历了软骨形成分化，形成了新的软骨样基质，其可通过使用硫蛋白染色糖胺聚糖来显现。
实施例3：关节模型的体内软骨形成
为了确定弹性蛋白酶处理的弹性软骨是否适合修复软骨缺陷，将其用于填充关节软骨损伤模型中的缺陷。首先，用水清洗12周龄小牛的外耳，并用手术刀去除软骨膜、皮肤和肌肉，直到仅剩下软骨。
随后，使用活检穿孔器从耳软骨获得直径为6mm的活检，并切成约0.4或1.2mm的高度。
用于去除细胞和弹性蛋白纤维的方案与实施例1中描述的方案相同。除非另有说明，否则给出的体积适用于约20个样品的批次。
去除细胞和弹性蛋白纤维后，将一半样品置于0.3cm2孔的底部(一个样品/孔，96孔板)，并在每个样品中覆盖500,000个软骨细胞，作为溶液，加至200μl的软骨细胞扩增培养基中，所述的扩增培养基中含有10％的热灭活的FCS(Lonza)、50mg/mL的庆大霉素(英杰生命技术公司)，以及1.5mg/mL的两性霉素B(二性霉素B；英杰生命技术公司)。在这种情况下，软骨形成细胞是从接受全膝关节置换的患者的骨关节炎膝关节，分离的人类关节软骨细胞，并在软骨细胞扩增培养基中扩增至少10天。另一半样品覆盖在无细胞的软骨细胞扩增培养基中。随后，将样品在37℃下静态孵育24h，并于8h后小心更换培养基。为了诱导软骨形成分化，将样品用PBS漂洗两次，并且培养18天，并且每三天，在200μl/孔的软骨形成培养基(DMEM-高葡萄糖GlutaMAX+(GIBCO)、1：100胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸(ITS+，BDBiosciences)、40μg/ml的L-脯氨酸(西格玛奥德里奇公司)、1mM的丙酮酸钠(GIBCO)、100nM的地塞米松(西格玛奥德里奇公司)、10ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1，安迪系统公司)、1.5μg/ml的二性霉素B(英杰生命技术公司)和50μg/ml的庆大霉素(英杰生命技术公司)中更换培养基。
对于关节软骨损伤的模型，我们按照de Vries-van Melle等人2011年(de Vries-van Melle et al.,2011.Tissue Eng Part C Methods 18:45-53)的描述，使用涂有金刚石的环钻(Synthes)和活检穿孔器，从12周龄小腿的掌指骨关节的关节表面进行了8mm的直径的活检。随后，将关节骨-软骨活检组织切成4mm高，并产生6mm的缺陷，深度大约为0.4mm，其仅影响到软骨的软骨层(软骨缺陷)，或至骨中大约1mm的深的缺陷(骨软骨缺陷)。然后将这些关节软骨和骨活检样品(以下称为关节模型)，在PBS中彻底漂洗，在37℃下静态孵育24h。第二天，将弹性蛋白酶处理过的耳软骨样品(用软骨细胞接种或未接种)，根据匹配的高度放置在关节缺陷模型中。
然后将结合了脱细胞软骨样品的组合关节模型，在神经补片膜(Neuro-Patchmembrane)(Braun，梅尔松根，德国)下皮下植入雌性NMRI nu/nu小鼠(查尔斯河(CharlesRiver)，威尔明顿，马塞诸塞)中，以防止鼠类皮肤细胞的侵入，如de Vries-van Melle等人2014年(de Vries-van Melle et al.,2014.Eur Cell Mater 27:112-23)所述，并在2、4、8或10周后收获。
如Narcisi等人2015年所述，随后将样品在室温下，使用4％的福尔马林固定5天，并使用10％的甲酸脱钙至少7天，每3天更换一次溶液。然后将样品用去离子水洗涤至中性的pH，并包埋在琼脂糖中，脱水，包埋在石蜡中并切成6μm的厚度。将切片放置在载玻片上，然后干燥、重新水化，用苏木精(西格玛奥德里奇公司)和2％的曙红(默克公司)，或0.4％的硫蛋白溶液(西格玛奥德里奇公司)染色，脱水，并密封在玻璃盖玻片下。
显微照片示出了在骨软骨缺陷中，来自牛关节缺陷模型骨部分的细胞，以及少量的来自牛关节缺陷模型软骨部分的细胞，侵入了非接种的去细胞弹性蛋白减少的弹性软骨，在2-4周内形成软骨(白色箭头)(图3A、B)。
在软骨缺陷中(如图3C和D所示)，由于剩余的钙化软骨层(用阴影箭头指示)阻止了细胞迁移，因此可以防止细胞从牛关节缺陷模型的骨部分侵入。在这里，只有来自牛关节缺陷模型的软骨部分的细胞，会侵入未接种的去细胞弹性蛋白减少的弹性软骨，并形成新的软骨(白色箭头)，并在10周时保持稳定。
当在植入前，用人类关节软骨细胞接种弹性蛋白降低的弹性软骨时，接种的人类关节软骨细胞似乎在植入后阻止了细胞的进一步侵入。图3E和F示出，接种有人类关节软骨细胞的弹性降低的弹性软骨样品(虚线白色轮廓)，示出了局部软骨形成(白色箭头)，并在软骨缺陷中形成了软骨样基质。
准备直径为1cm，全厚度缺陷为4mm的骨软骨栓塞，作为人造软骨缺陷。缺陷处以支架(用活检打孔器切成4mm)，以及(老年人股骨颈骨折患者的)6,25*10^6的人类关节软骨细胞，和18,75*10^6的永生化脂肪来源的干细胞(ASC/TERT1)混合的群体，进行填充。同样作为对照，重新接种商用的ChondroGide。将支架放置在缺陷处，用纤维蛋白密封剂(ARTISS，巴克斯特，美国)固定，并用神经补片(Aesculap，德国)覆盖，以防止细胞从周围的小鼠组织浸润。
将栓塞皮下植入10周龄的雌性NMRI裸鼠(查尔斯河，苏尔茨费尔德，德国)中6周，然后提取，固定在4％的中性的福尔马林中过夜，在PBS中洗涤，并用USEDECALC(Medite，美国)脱水并脱钙。然后将样品包埋在石蜡中，切片成3-4μm的厚度。脱石蜡后，将切片用AZAN染色作为综合染色，并进行免疫染色，以区分胶原蛋白I型(Abcam，英国)和胶原蛋白II型(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国，克隆2B1.5或6B3)。
图4示出了在体内骨软骨模型中，用共培养的hAC和ASC-TERT1重新接种的耳软骨和对照支架。
如上所述的制备骨软骨栓塞，集中在软骨较厚的区域以测试支架堆叠。为了测试较年轻的软骨细胞(几乎不能从人类供体获得)的性能，收集牛软骨细胞并单独使用或与ASC/TERT1结合使用。用标准的4mm的支架填充缺陷，每个支架接种0.25*106个细胞，或者单独使用牛关节软骨细胞，或者与ASC/TERT1共培养。如上所述，将栓塞皮下植入裸鼠中6周，并进行组织学分析。
图5显示了在体内骨软骨栓塞模型中单独或以共培养物用牛软骨细胞重新接种的耳软骨。

Claims (21)

1.一种生产包含通道和/或陷窝的软骨支架的方法，其包括以下步骤：
提供弹性软骨样品，
将所述的软骨样品与由弹性蛋白酶和任选的一种或多种其他蛋白水解酶组成的水溶液一起孵育，从而
减少所述的软骨样品的弹性蛋白纤维以在软骨支架中产生通道和/或陷窝，其中所述弹性蛋白纤维降低至弹性蛋白纤维量的10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述弹性蛋白纤维降低至弹性蛋白纤维量的1％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述溶液包含1-12U/ml弹性蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述弹性蛋白酶是胰弹性蛋白酶，所述其他蛋白水解酶是胃蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述溶液包含0.01-10U/ml弹性蛋白酶和0.05-5mg/ml胃蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中对所述软骨支架进行脱细胞化的步骤。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中对所述软骨支架进一步进行去污步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，其中孵育步骤进行的时间为0.5至80h。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括通过使细胞粘附于所述支架使弹性蛋白纤维减少的软骨支架再细胞化的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过使细胞迁移到所述软骨支架的通道和/或陷窝中使得软骨支架再细胞化。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将细胞接种到所述软骨支架上，和/或将细胞通过注射至所述软骨支架的通道和/或陷窝中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中用于软骨支架的再细胞化的细胞是具有软骨或成骨潜能的细胞，以及干/祖细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述具有软骨或成骨潜能的细胞选自软骨细胞、软骨膜细胞、骨膜细胞和干/祖细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述干/祖细胞选自脂肪来源的基质血管干细胞、滑膜来源的间充质细胞和骨髓来源的基质细胞。
15.根据权利要求9所述的方法，其中用于软骨支架的再细胞化的细胞是从所述软骨支架的受体中获得的自体人类细胞。
16.根据权利要求9所述的方法，其中用于软骨支架的再细胞化的细胞是同种异体人类细胞，获得自不是所述软骨支架受体的个体。
17.一种弹性蛋白纤维减少的软骨支架，其包括通道和/或陷窝，其中在从软骨支架减少弹性蛋白纤维的步骤之前，弹性蛋白纤维被减少到弹性蛋白纤维量的10％或更少，
并且其中所述软骨支架是通过提供弹性软骨样品并将所述软骨样品与由弹性蛋白酶和任选的一种或多种其他蛋白水解酶组成的水溶液孵育而产生的。
18.根据权利要求17所述的软骨支架，还包含选自由以下组成的组的细胞：软骨细胞、软骨膜细胞、骨膜细胞和干/祖细胞。
19.根据权利要求18所述的软骨支架，其中所述干/祖细胞选自脂肪来源的基质血管干细胞、滑膜来源的间充质细胞和骨髓来源的基质细胞。
20.根据权利要求17或18所述的软骨支架，所述软骨支架用于软骨的修复，骨软骨缺陷的修复和骨缺陷的修复的方法中。
21.根据权利要求20所述的软骨支架，其中所述软骨选自关节、鼻、气道和耳软骨。
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