JP2017171654A - 組織分化促進用組成物、肝機能改善用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
テクトリゲニン類は植物に含まれていることから、安全性が比較的に高く日常的に摂取しやすいと考えられるが、その活性や機能については未だ不明な点も多い。
本発明によれば、優れた脂肪分解促進作用を有する脂肪分解促進用組成物を提供することができる。
本発明によれば、優れた肝機能改善作用を有する肝機能改善剤及び肝機能改善用組成物を提供することができる。
本発明によれば、角層水分量向上、皮膚弾力向上又は皮膚水分蒸散抑制について優れた作用を有し、これら角層水分量向上、皮膚弾力向上又は皮膚水分蒸散抑制に用いられる組成物を提供することができる。
本発明によれば、上記の各作用に優れた組成物を提供することができる。
本発明で使用するテクトリゲニンは分子式C16H12O6で表され、5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-4H-1-benzopyran-4-one又は6-Methoxy-5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-oneと呼ばれる場合もある。本明細書中で単にテクトリゲニンという場合、このようにアグリコンの形態のものをいう。以下テクトリゲニンをTGEとも記載する。テクトリゲニンの化学式は下記の通りである。
テクトリゲニン配糖体(以下TGE配糖体ともいう)としては、上記のTGEに、グルコース、キシロース、ソルボース、ガラクトース、アピオース、ラムノースから選ばれる1種又は2種以上の糖を結合させたものが挙げられる。組織分化促進、脂肪分解促進、肝機能改善、肌質改善といった本発明の効果を高める観点から、TGEに、グルコース、キシロースから選ばれる1種又は2種以上の糖を結合させたものが好ましい。配糖体においてこれらの糖は、通常TGEの4位及び/又は7位のヒドロキシル基と結合しているが、前記の効果がより確実に得られる点や配糖体の入手しやすさの点から、7位のヒドロキシル基と結合しているものが好ましい。TGE配糖体中の糖の数(糖の結合数ともいう)は、例えば1個以上が挙げられる。前記の効果を高める観点から、糖の結合数は好ましくは1個又は2個であるが、3個以上であってもよい。ここでいう糖の数とは、単糖単位の数をいう。TGE配糖体としては、1種のみを用いてもよいが、2種以上を組み合わせることが好ましい。TGE及びTGE配糖体は、本発明の組成物において、有機合成品であってもよく、植物等から抽出したものであってもよい。TGE及びTGE配糖体は、粉末状等の固形状であってもよく、水や有機溶媒に溶解した状態であってもよい。TGE及びTGE配糖体は、それらの混合物のみで存在していてもよく、その他の物質に溶解、分散ないし混合した状態であってよい。
TGE配糖体が、TGEに糖が1個結合した配糖体とTGEに糖が2個結合した配合体とを含む場合、TGEに糖が1個結合した配糖体とTGEに糖が2個結合した配糖体との質量比は、前者:後者が1:0.01以上7.5以下であることが好ましい。この質量比が1:0.01以上であることには本発明の高い作用を得ながらTD等のTGEに糖が1個結合した配糖体の量を一定量に制限できる利点がある。またこの質量比が、1:7.5以下であることで、前記の効果を更に一層高めることができる。これらの観点からTGEに糖が1個結合した配糖体とTGEに糖が2個結合した配糖体との量比は、前者:後者が1:0.01以上5以下であることが好ましく、0.1以上2.5以下であることが特に好ましい。
本発明者らは、TGE又は/及びTGE配糖体等のTGE類における作用について鋭意検討した。その結果、TGEとTGE配糖体とを特定の比率で組み合わせた場合に、質量比が1:1の組み合わせと比べて、飛躍的に脂肪分解促進作用が高まり、肝機能改善作用も高まることを見出した。具体的には、本発明の組成物において、TGEとTGE配糖体とは、前者:後者の質量比が1:10以上である必要がある。更に、本発明者らは、脂肪分解促進作用や肝機能改善効果をとりわけ優れたものとする観点から、TGEとTGE配糖体の質量比は、1:13以上であることがより好ましく、とりわけ、1:18以上であることが好ましいことを見出した。TGEとTGE配糖体との質量比の下限値が前記の値である本発明の組成物は、組織分化促進、角層水分量向上、皮膚弾力向上又は皮膚水分蒸散抑制といった効果においても優れていることが判った。TGEとTGE配糖体との質量比の下限値が前記の値である本発明の組成物は、アヤメ科のヒオウギ(Belamcanda chinensis)やマメ科のクズ(Pueraria thomsonii、Pueraria lobata、Pueraria thunbergiana等)の花部などの植物の抽出物であってもよく、植物の抽出物に有機合成品を添加して調製してもよく、植物からの抽出物を組み合わせて調製してもよく、有機合成品を組み合わせて調製してもよい。
HPLCに供するための試料は、適宜不純物の除去や濃度調整等、公知の方法により調製される。
また本発明の組成物はTGE及びTGE配糖体を特定比率で含有することによりこれを摂取することで、優れた脂肪分解作用を得ることができる。
例えば、後述する実施例の記載から明らかな通り、特定比率のTGE及びTGE配糖体は、これを摂取することにより、体脂肪を分解する酵素の遺伝子の発現を促進して、体脂肪分解を促進することができる。
実施例1の被験物質として、質量比が、テクトリゲニン(TGE):テクトリゲニン配糖体=1:21(配糖体の内訳は質量比でTD:TGXG=1:1.9)の粉末状組成物を用いた。
これを下記の(1)〜(3)の手順の筋肉分化試験、及び、下記(ア)〜(オ)の手順の骨分化試験にそれぞれ供した。
(1)マウス横紋筋由来筋芽細胞C2C12(理化学研究所より入手)を、10%FBS含有DMEMで所定の数になるまで、5容量%CO2インキュベーターにて、37℃、湿潤条件で培養した。
次いで、培地を取り除き、DPBSで3度洗浄したのち、Trypsin−EDTAで細胞を剥離した。
新鮮な10%FBS含有DMEMを加えてトリプシン反応を停止したのち、細胞をチューブへ集め、遠心機で800rpm、3分間遠心して細胞を沈殿させた。
2×104 cells/mLになるように新鮮な10%FBS含有DMEMに細胞を懸濁し、96well plateに100μL/wellで播種して、2日間、5容量%CO2インキュベーターにて、37℃、湿潤条件で前培養した。
24時間後、培地を除き、細胞からRneasy mini(Qiagen社製)を用いてRNAを精製した。
精製したRNAよりReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(東洋紡社製)でcDNAを合成した。
内部標準としてGAPDH(Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay、Qiagen社製)、測定遺伝子としてMyogenin(Mm_Myog_1_SG QuantiTect primer assay、Qiagen社製)のプライマー、QuantiNOVA SYBR GREEN(Qiagen社製)を用いて、Rotor-Gene Q(Qiagen社製)でPCRをおこなった。
PCRの結果はRotor Gene Q Pure Detection(Qiagen社製)を用いて解析した。
解析により得られた遺伝子発現量について、コントロール(比較例1)を100%とした相対値を算出した。結果を図1に示す。
(ア):マウス頭蓋冠由来前骨芽細胞MC3T3−E1細胞(DSファーマバイオメディカル社より入手)を10%FBS含有MEMα培地(アスコルビン酸不含)で所定の数になるまで5容量%CO2インキュベーターにて、37℃、湿潤条件で培養した。培地を取り除き、DPBSで2度洗浄したのち、Trypsin−EDTAで細胞を剥離した。新鮮な10%FBS含有MEMα培地を加えてトリプシン反応を停止したのち、細胞をチューブへ集め、遠心機で800rpm、3分遠心して細胞を沈殿させた。4×105 cells/mLになるように新鮮な10%FBS含有MEMα培地に細胞を懸濁し、96well plateに100μL/wellで播種して1日間、5容量%CO2、37℃、湿潤条件で前培養した。
(オ)(エ)の測定後の培地からCell Counting-Kit 8を除き、TRAP/ALP染色キット(和光純薬社製)の説明書に従い、アルカリホスファターゼ(ALP)活性測定用の染色を行った。
次いで、グリシン、無水塩化マグネシウム、塩化亜鉛をそれぞれ0.1M、1mM、1mMになるように超純水に溶解し、水酸化ナトリウムでpH10.4に調整し、グリシン緩衝液とした。得られたグリシン緩衝液5mlに4−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物 5mgタブレット(Sigma Aldrich社製)を一粒溶解した。得られた液を、ALP染色後の各ウェルに150μL加えた。
37℃で30分加温した後、上清100μLをアッセイプレート(AGCテクノグラス社製)に移し405nmの吸光度(A2)をプレートリーダーで測定した。
上記で測定した吸光度A1及びA2を用いて、ALP活性を下記式により求めた。
ALP活性=A2/A1
得られたALP活性の値について、コントロール(比較例1)を100%として相対値を算出した。結果を図2に示す。
被験物質として、TD、TGXG及びTGEを以下の表1に記載で配合したものを用いた。表1中の配糖体とはTD及びTGXGの合計量を指す。これら実施例及び比較例の被験物質を、下記の(i)〜(viii)の手順の(脂肪分解酵素発現試験)に供した。
ホルモン感受性リパーゼ(HSL)の遺伝子発現を下記方法にて測定した。
(i)37℃、5容量%CO2インキュベーター内で、75cm2フラスコを用いて脂肪細胞に分化するマウス線維芽細胞(3T3−L1)を前培養培地で培養した。前培養培地としては、10%FBS−DMEMを用いた。
(ii)トリプシン処理により浮遊させた細胞を10%FBS−DMEMに懸濁し、96well plateの各wellに2×103cells/wellの細胞密度で播種した。播種後の細胞を、37℃、5容量%CO2インキュベーター内で2日間前培養した。
(iii)培地を除き、あらかじめ、デキサメタゾン、3-Isobutyl-1-methylxanthine、インスリンをそれぞれ1μM、1mM、20μg/mL含むように調製しておいた10%FBS−DMEM(脂肪細胞への分化誘導培地)を100μL/well添加し、2日間37℃、5容量%CO2インキュベーター内で培養した。
(iv)各wellから培地を半分除き、あらかじめインスリンを20μg/mL含むように調製しておいた10%FBS−DMEM(脂肪細胞分化維持培地)に交換し、さらに5日間37℃、5容量%CO2インキュベーター内で培養した。この間、2日おきに培地の半分をインスリンを含む10%FBS−DMEMに交換した。
(v) 各wellから培地を完全に除き、あらかじめ被験物質が100μg/mLになるように調製しておいた10%FBS−DMEMを100μL/well(TGE及び配糖体の総量の濃度が100μM)添加して、さらに48時間37℃、5容量%CO2インキュベーター内で培養を続けた。
(vi)培地を完全に除き、氷冷したDPBSで2回洗浄後、アイソジェン(ニッポンジーン社製)を100μL/well加え、取扱説明書の通り、総RNAを精製した。
(vii) (vi)で得られた総RNAから、ReverTra AceR qPCR RT Master Mix with gDNA Removerで取扱説明書に従い、cDNAを合成した。
(viii)QuantiNova SYBR Green PCR Kitを用いて、(vii)で得られたcDNAを鋳型としてRT−PCRをおこなった。プライマーとしてはHSL遺伝子発現用としてMm_Lipe_1_SG QuantiTect Primer Assayを用いた。内部標準にはActbをMm_Actb_1_SG QuantiTect Primer Assayを用いて行った。比較例1(コントロール)の遺伝子発現量を1とした時の相対値を図3に示す。
〔実施例3−1〜3−11並びに比較例3−1〜3−4〕
(1)細胞培養
37℃、5容量%CO2インキュベーター内で、75cm2フラスコを用いて、ヒト肝癌由来細胞(HepG2、ATCC社製)を10%ウシ胎児血清(FBS)含有培地により培養した。次いでトリプシン処理により浮遊させた細胞を、75cm2フラスコから96well plateの各wellに4.0×104cells/wellの細胞密度で播種した。その後、37℃、5容量%CO2インキュベーター内で24時間前培養した。各wellより培地を除去後、所定濃度に調製した被験物質含有培地を100μL/well添加し、CO2インキュベーター内で24時間培養した。被験物質含有培地における培地としては無血清DMEMを使用した。被験物質としては、TD、TGXG及びTGEを以下の表2に記載で配合したものを用いた。表2中の配糖体とはTD及びTGXGの合計量を指す。上記所定濃度としては、TD、TGXG及びTGEの総量の濃度として400μg/mlとした。比較例3−1はcontrolであり、被験物質含有培地の代わりに0.5%DMSO含有無血清DMEMを用いた。
上記の24時間培養後、培地を除去し、無血清DMEMで30容量倍に希釈したCell Counting Kit-8溶液(同仁化学製)を各wellに150μlずつ添加した。37℃、5容量%CO2インキュベーター内に静置し適度に発色させた後、450nmにおける吸光度を測定した。
得られたデータを元に% of controlを算出した。
% of control = (Data sample−Data blank) /(Data control−Data blank)×100
得られた結果を図4として示す。図4には、3連の平均値及び標準偏差を記載した。
実施例4の被験物質として、質量比が、TGE:配糖体=1:22.19(TD:TGXG=1:1.81)の粉末状組成物43.14mg(TGE及び配糖体の総量)を用いた。これを、下記美容試験に供した。
健常な女性2人(平均年齢19.7歳)を被験者とした。
被験者に水に溶解した実施例4の被験物質を毎朝摂取させた。これを12週間継続させた。摂取開始前、摂取開始後(4,8,12週間後)に左頬部(目尻と小鼻を直線で結んだときの中央付近)における角層水分量、水分蒸散量、弾力をそれぞれ下記の測定装置で測定した。角層水分量の平均値を図5に、水分蒸散量の平均値を図6に、弾力の平均値を図7に、それぞれ示す。
・水分蒸散量:Tewameter TM300(Courage+Khazaka社製)で測定した。
・弾力:皮膚粘弾力測定装置Cutometer MPA580(Courage+Khazaka社製)で測定した。弾力としては、測定器であるキュートメーターで得ることのできる皮膚粘弾性値の測定パラメータとして、測定部の皮膚を一定時間陰圧で吸引し、引き込まれた高さと吸引部頂点から戻った分の皮膚の変位を解析して求められる戻り弾性比率を用いた。戻り弾性比率は、1.00に近いほど、皮膚の弾力性は高いと言える。
これらの測定は、機器に付属の説明書に記載される標準的な方法で実施した。
Claims (8)
- テクトリゲニン及びテクトリゲニン配糖体を、前者:後者の質量比が1:10以上である量で含む、組織分化促進用組成物。
- 前記テクトリゲニン配糖体が、テクトリゲニンに糖が1個結合した配糖体及びテクトリゲニンに糖が2個結合した配糖体を含み、前者と後者の質量比が1:0.01以上7.5以下である、請求項1に記載の組織分化促進用組成物。
- 筋肉分化促進用組成物である、請求項1又は2に記載の組織分化促進用組成物。
- 骨分化促進用組成物である、請求項1又は2に記載の組織分化促進用組成物。
- テクトリゲニン及びテクトリゲニン配糖体を、前者:後者の質量比が1:10以上である量で含む、脂肪分解促進用組成物。
- テクトリゲニン及びテクトリゲニン配糖体を、前者:後者の質量比が1:10以上である量で含む、肝機能改善用組成物。
- テクトリゲニン及びテクトリゲニン配糖体を、前者:後者の質量比が1:10以上である量で含み、角層水分量向上、皮膚弾力向上又は皮膚水分蒸散抑制に用いられる組成物。
- テクトリゲニン及びテクトリゲニン配糖体を、前者:後者の質量比が1:10以上である量で含む組成物。
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