JP2021126055A - 魚類幹細胞の培養用培地 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ増殖させることができる技術を提供することである。【解決手段】本発明は、血漿、ビタミン類、カルシウム塩、マグネシウム塩、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、Ｄ−ガラクトース、及び２−メルカプトエタノールを少なくとも含む、魚類幹細胞の培養用培地を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、魚類幹細胞の培養用培地に関する。

従来より、優良な形質を有する魚類の育種や安定した供給のために、生殖細胞等の各種細胞を宿主魚類に移植し、これを生殖細胞系列へ分化誘導することを経て新たな個体を得る技術が開発されている。

他方、このような技術においては、移植に供する生殖細胞を充分に用意するために、幹細胞を、分化を抑制しつつ効率的に増殖させる必要がある。

幹細胞の培養技術については各種方法が報告されている（例えば、特許文献１）。

特開２０１８−１１５９９号公報

しかし、魚類幹細胞の培養技術は充分に確立されていない。

本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ増殖させることができる技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、特定の成分を組み合わせて含む培養用培地によれば上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。

（１） 血漿、ビタミン類、カルシウム塩、マグネシウム塩、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、Ｄ−ガラクトース、及び２−メルカプトエタノールを少なくとも含む、魚類幹細胞の培養用培地。

（２） さらに、血清代替物、及び／又はアミノ酸を含む、（１）に記載の培養用培地。

本発明によれば、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ増殖させることができる技術が提供される。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。

＜魚類幹細胞の培養用培地＞
本発明の魚類幹細胞の培養用培地（以下、「本発明の培地」ともいう。）は、血漿、ビタミン類、カルシウム塩、マグネシウム塩、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、Ｄ−ガラクトース、及び２−メルカプトエタノールを少なくとも含む。本発明者らの検討の結果、これらの成分を組み合わせて含む培地によれば、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ増殖させることができることが見出された。

本発明の培地に含まれる成分は、それぞれ、従来の細胞培養用培地に配合されることが知られる成分である。しかし、上記の組み合わせによれば、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ、魚類幹細胞を良好に増殖できるという意外な知見が見出された。上記の組み合わせのうち、いずれかの成分を含まない培地は、幹細胞の分化の促進、及び／又は、幹細胞の増殖の阻害が生じやすくなる。

本発明において、「魚類」とは、任意の脊椎動物亜門（ただし、四肢動物を除く。）を意味する。魚類としては、例えば、メダカ（学名：Ｏｒｙｚｉａｓ）、スマ（学名：Ｅｕｔｈｙｎｎｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ）等が挙げられる。

本発明において、「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有する、未分化な細胞を意味する。

本発明の培地による好ましい培養対象は、魚類のうちメダカ及びスマの幹細胞である。培養対象となる魚類幹細胞は、魚類の生殖腺等から従来知られる方法によって単離できる。

本発明の培地は、血漿、ビタミン類、カルシウム塩、マグネシウム塩、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、Ｄ−ガラクトース、及び２−メルカプトエタノールを少なくとも含むが、これらの成分に加えて、血清代替物、及び／又はアミノ酸を含むことが好ましい。また、本発明の培地が入れられる培養用ウェル等には、本発明の効果を阻害しない範囲でビトロネクチン等によるコーティングをすることが好ましい。

以下、本発明の培地に含まれる成分について説明する。

（血漿）
血漿とは、血液から赤血球を除いた液性成分である。血漿の由来生物は特に制限されないが、通常は、魚類（好ましくは、スマ等の大型魚）の血漿を用いる。

本発明の培地において、血漿の量は、好ましくは０．５〜５ｖｏｌ％、より好ましくは０．５〜１．５ｖｏｌ％である。

（ビタミン類）
本発明の培地において、ビタミン類は、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＥ、ビタミンＫ）及び水溶性ビタミン（ビタミンＢ群、ビタミンＣ）のいずれか１種以上が、単独で、又は、任意の組み合わせで含まれていてもよい。これらのうち、特にビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸が含まれていることが好ましい。

本発明の培地において、ビタミン類の量は、その総量が、好ましくは５００〜１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは６００〜８００μｇ／Ｌである。

本発明の培地は、ビタミンＤを８０〜１２０μｇ／Ｌ、ビタミンＡを８〜１０μｇ／Ｌ、ビタミンＢを１８０〜２２０μｇ／Ｌ、及び葉酸を８０〜１２０μｇ／Ｌ含んでいることが好ましい。

ビタミン類としては、市販の細胞培養用ビタミンミックス（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用してもよい。

（カルシウム塩）
本発明の培地において、カルシウム塩は、細胞培養用培地に配合され得る任意の塩であり得る。本発明の培地におけるカルシウム塩は、塩化カルシウム等が好ましい。

本発明の培地において、カルシウム塩の量は、好ましくは０．０５〜１．００質量％、より好ましくは０．１０〜０．５０質量％である。

（マグネシウム塩）
本発明の培地において、マグネシウム塩は、細胞培養用培地に配合され得る任意の塩であり得る。本発明の培地におけるマグネシウム塩は、硫酸マグネシウム等が好ましい。なお、マグネシウム塩としてマグネシウム塩酸塩を用いると、カルシウム塩と反応して塩析する可能性があるため、用いないことが好ましい。

本発明の培地において、マグネシウム塩の量は、好ましくは０．０８〜０．３０質量％、より好ましくは０．０８〜０．１０質量％である。

（ピルビン酸ナトリウム）
本発明の培地において、ピルビン酸ナトリウムの量は、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．５〜２．０ｍＭである。

（白血病阻止因子）
白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））は、ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカインである。

本発明の培地において、白血病阻止因子の量は、好ましくは０．００１〜０．０５ｖｏｌ％、より好ましくは０．００５〜０．０２ｖｏｌ％である。

（塩基性線維芽細胞増殖因子）
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＢＦＧＦ、又はＦＧＦ２））は、血管新生促進作用等を有することが知られるサイトカインである。

本発明の培地において、塩基性線維芽細胞増殖因子の量は、好ましくは０．０１〜１０ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜１．０ｖｏｌ％である。

（トランスフォーミング増殖因子ベータ）
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦｂ）は、骨形成等に関与することが知られる増殖因子である。トランスフォーミング増殖因子ベータには、５種類のサブタイプ（β１〜β５）が知られ、本発明においてはいずれを用いてもよいが、ＴＧＦ−β１が特に好ましい。

本発明の培地において、トランスフォーミング増殖因子ベータの量は、好ましくは０．００１〜０．１ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜０．０５ｖｏｌ％である。

（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム）
インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムの組み合わせは、細胞培養分野においてＩＴＳサプリメントとして知られる。

本発明の培地において、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムの量は、その総量が、好ましくは０．２５〜０．７５ｖｏｌ％、より好ましくは０．４０〜０．６０ｖｏｌ％である。

（硫酸ゲンタマイシン）
本発明の培地において、硫酸ゲンタマイシンの量は、好ましくは２．０〜８．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは３．０〜５．０μｇ／ｍｌである。

（Ｄ−ガラクトース）
本発明の培地において、Ｄ−ガラクトースの量は、好ましくは１００〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２５０〜５００μｇ／ｍｌである。

（２−メルカプトエタノール）
本発明の培地において、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の量は、好ましくは０．００１〜０．５００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、より好ましくは０．０１０〜０．２００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）である。

（血清代替物）
本発明の培地には、細胞増殖率を高めやすいという観点から、血清代替物（「ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫｏＳＲ）」等とも呼ばれる。）が含まれていてもよい。血清代替物とは、細胞培養において血清（血漿から凝固成分がほぼ除かれた成分）の代替物として使用される組成物である。なお、血清そのもの（魚類由来血清等）は魚類幹細胞の分化を促進させ得るため、本発明の培地には血清を配合しないことが好ましい。

本発明における血清代替物は、幹細胞の成長及び増殖を促進できることが知られる任意の血清代替物を使用できる。

本発明における血清代替物としては、アルブミンを含むものが好ましい。

本発明における血清代替物は、好ましくは以下を全て含む。下記成分の量は、幹細胞の成長及び増殖を促進できるかに基づき、適宜調整できる。
アミノ酸（グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン）
ビタミン及び抗酸化剤（チアミン、グルタチオン（還元型）、アスコルビン酸リン酸エステル）
微量元素（Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻、Ｆ⁻、Ｍｎ^２＋、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、Ｚｒ^４＋）
タンパク質（鉄トランスフェリン（飽和鉄）、インスリン、脂質リッチなアルブミン（「ＡｌｂｕＭＡＸ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等）

血清代替物としては、「Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の市販品を使用することができる。

本発明の培地において、血清代替物の量は、好ましくは１．０〜２０ｖｏｌ％、より好ましくは２．５〜１０ｖｏｌ％である。血清代替物の量がこの範囲であると、培養細胞の細胞死及び分化を抑制しやすい。

（アミノ酸）
本発明の培地には、細胞増殖率を高めやすいという観点から、アミノ酸が含まれていてもよい。アミノ酸としては、必須アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、及び非必須アミノ酸（グリシン、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、チロシン、システイン、アルギニン、プロリン）のいずれか１種以上が、単独で、又は、任意の組み合わせで含まれていてもよい。

本発明の培地において、アミノ酸の量は、必須アミノ酸が含まれている場合、その総量が、好ましくは０．０１〜５．００ｖｏｌ％、より好ましくは０．１０〜１．００ｖｏｌ％である。非必須アミノ酸が含まれている場合、その総量が、好ましくは０．０１〜１０．０ｖｏｌ％、より好ましくは０．１０〜１．００ｖｏｌ％である。

必須アミノ酸、及び非アミノ酸としては市販の細胞培養用アミノ酸ミックス（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用してもよい。

（基本培地）
本発明の培地には、任意の基本培地が含まれていてもよい。基本培地は、動物細胞用又はヒト細胞用であることが好ましい。基本培地は、無血清培地であってもよい。

基本培地としては、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２等）等が挙げられる。培養対象がスマ幹細胞である場合、基本培地はＬ−１５培地が好ましい。培養対象がメダカ幹細胞である場合、基本培地はＤＭＥＭ培地が好ましい。

（その他の成分）
本発明の培地には、上記の成分に加えて、細胞培養用培地に配合されることが知られるその他の成分（蒸留水等の水、無機塩、糖、微量元素等）が含まれていてもよい。

本発明の培地を用いて培養する際には、培地と接する培養器面にビトロネクチンによるコーティングをすることが好ましい。ビトロネクチンのコーティング量は、例えば、１０ｃｍプレート（つまり、半径５ｃｍの円形プレート）あたり、５０〜１００μｌであってもよい。

（本発明の培地の組成例）
以下に、本発明の培地の好ましい組成例を示す。

血清代替物：２．５〜１０ｖｏｌ％
血漿：０．５〜１．５ｖｏｌ％
ビタミンＤ：８０〜１２０μｇ／Ｌ
ビタミンＡ：８〜１０μｇ／Ｌ
ビタミンＢ：１８０〜２２０μｇ／Ｌ
葉酸：８０〜１２０μｇ／Ｌ
塩化カルシウム：０．１０〜０．５０質量％
硫酸マグネシウム：０．０８〜０．１０質量％
ピルビン酸ナトリウム：０．５〜２．０ｍＭ
必須アミノ酸：０．１０〜１．００ｖｏｌ％
非必須アミノ酸：０．１０〜１．００ｖｏｌ％
白血病抑制因子：０．００５〜０．０２ｖｏｌ％
塩基性線維芽細胞増殖因子：０．０１〜１．０ｖｏｌ％
トランスフォーミング増殖因子ベータ：０．０１〜０．０５ｖｏｌ％
インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）：０．５０ｖｏｌ％
ビトロネクチン：１０ｃｍプレートあたり、５０〜１００μｌ
硫酸ゲンタマイシン：３．０〜５．０μｇ／ｍｌ
２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）：０．０１０〜０．２００ｖｏｌ％
Ｄ−ガラクトース：２５０〜５００μｇ／ｍｌ
蒸留水：１０〜３０質量％
Ｌ−１５培地：４０〜６０質量％

＜本発明の培地の製造方法＞
本発明の培地は、上記の成分を適宜混合及び撹拌することで得られる。本発明の培地は、必要に応じて滅菌処理等を施してもよい。

＜本発明の培地を用いた培養方法＞
魚類幹細胞やこれを含む組織を、本発明の培地とともに培養することで、魚類幹細胞の分化を抑制しつつ増殖させることができる。

本発明の培地によれば、長期間（例えば、１０継代以上、２０継代以上、かつ／又は、３ヶ月以上、６ヶ月以上）にわたって、分化を抑制した状態で魚類幹細胞を培養できる。ただし、本発明の培地によれば、短期間（例えば、６０日以下、３０日以下）魚類幹細胞を培養することもできる。

本発明の培地によれば、分化だけではなく、細胞生存率の低下をも抑制した状態で魚類幹細胞を培養できる。

魚類幹細胞が増殖したかどうかは、所定期間培養後、実施例に示した「細胞増殖率」を算出することで評価できる。例えば、細胞増殖率が５０％以上であれば、魚類幹細胞の分化が抑制されていると評価できる。

魚類幹細胞の分化が抑制されているかどうかは、所定期間培養後、実施例に示した「細胞分化率」を算出することで評価できる。例えば、細胞分化率が２０％未満であれば、魚類幹細胞の分化が抑制されていると評価できる。

魚類幹細胞の生存率は、所定期間培養後、実施例に示した「細胞生存率」を算出することで評価できる。

培養に用いる培養器は、細胞培養に用いられる任意のものを使用でき、フラスコ、培養用フラスコ、培養用ディッシュ、マイクロウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。

培養条件は、細胞培養技術において知られる条件に基づき、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約１６〜３３℃、好ましくは約２５℃であり得る。ＣＯ_２濃度は、約０〜１０％、好ましくは約０〜５％であり得る。培養対象がスマ幹細胞である場合、ＣＯ_２濃度は０％に近いことが好ましい。培養対象がメダカ幹細胞である場合、ＣＯ_２濃度は５％に近いことが好ましい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜魚類幹細胞培養用培地の準備＞
表１〜３に規定される組成を有する魚類幹細胞培養用培地を調製した。用いた材料は以下のとおりである。なお、表１〜３の組成の各数値は、培地中の各成分の最終濃度を意味する。
（１）血清代替物：「Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
（２）血漿：海水魚から自家調製したもの
（３）ビタミンミックス（１００Ｘ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、最終濃度が１Ｘとなるように使用した。このビタミンミックスには、少なくともビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ、葉酸が含まれる。
（４）４Ｍ カルシウム塩：塩化カルシウム、Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製
（５）７．５Ｍ マグネシウム塩：硫酸マグネシウム、Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製
（６）１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＳＰ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
（７）必須アミノ酸（ＥＡ）５０Ｘ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、最終濃度が０．５Ｘとなるように使用した。
（８）非必須アミノ酸（ＮＡＡ）１００Ｘ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、最終濃度が２Ｘとなるように使用した。
（９）２μｇ／ｍｌ 白血病抑制因子（ＬＩＦ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
（１０）４μｇ／ｍｌ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ＢＦＧＦ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
（１１）１０ｎｇ／ｍｌ トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦｂ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
（１２）インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）１００Ｘ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、最終濃度が１Ｘとなるように使用した。
（１３）ビトロネクチン：Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、取扱説明書に従い、培養ウェルのコーティングとして用いた。
（１４）５ｍｇ／ｍｌ 硫酸ゲンタマイシン：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製
（１５）１０００×ＢＭＥ：ＧＩＢＣＯ社製、最終濃度が１Ｘとなるように使用した。
（１６）４５０ｍｇ／ｍｌ Ｄ−ガラクトース：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製
（１７）Ｌ−１５培地：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製

＜魚類幹細胞の準備＞
以下の方法で魚類幹細胞を準備した。

（生殖腺からの細胞の単離）
（１）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、１％ ＤＰＢＳ−ＢＳＡ（１ｇ ＢＳＡ／ｍｌ ＤＰＢＳ、以下、「ＤＰＢＳ ＢＳＡ培地」ともいう。）を調製した。
（２）魚類（メダカ、スマ）から生殖腺を無菌環境下で回収し、０．００１％ テトラサイクリン塩酸塩を含むＤＰＢＳ ＡＢ培地で、少なくとも２時間インキュベートした。
（３）次いで、生殖腺をＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で少なくとも３回洗浄し、５ｍｍ角に切り分けた。
（４）上記（３）で得た生殖腺組織に、組織１ｇあたり１０ｍｌの消化培地を加え、均一な細胞溶液が得られるまで、時折撹拌しながら室温でインキュベートした。卵巣については少なくとも２時間、精巣については少なくとも３時間の消化時間を要した。
（５）得られた細胞溶液を、１００マイクロ及び４０マイクロのメッシュ（Ｎｙｔａｌ社製）に連続して通し、得られた濾液を８００ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、次いでＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で少なくとも３回洗浄した。得られた細胞ペレットを、１ｍｇ細胞ペレット／ｍｌとなるようにＤＰＢＳ ＢＳＡ培地に懸濁させた。

ＤＰＢＳ ＡＢ培地の組成は以下のとおりである。
［ＤＰＢＳ ＡＢ培地の組成］
ＤＰＢＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン（２Ｘ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
２０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン硫酸塩：Ｇｉｂｃｏ社製
０．００１％ テトラサイクリン塩酸塩：Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製

消化培地の組成は以下のとおりである。
［消化培地］
Ｌ１５培地：Ｇｉｂｃｏ社製
２００μｇ／ｍｌ コラゲナーゼ：Ｗａｋｏ社製
１ｍｇ／ｍｌ ディスパーゼ １：Ｇｉｂｃｏ社製
２０ＵＩ／ｍｌ ペニシリン：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製
２００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸塩：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製
１ｕ／ｍ１ 組換えＤＮＡｓｅ１：Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ社製

（パーコールを用いた分離）
（１）「Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ」（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ社製）を、ＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で希釈し（１０、２０、３０、４０％）、各溶液７．５ｍｌを５０ｍ１チューブに入れ、密度勾配を作製した。
（２）上記（生殖腺からの細胞の単離）で得られた細胞溶液を、上記（１）の１０％パーコールのチューブの液面上にゆっくり入れ、２５００ｇで１時間遠心分離した。
（３）遠心後、１０〜２０％及び２０〜３０％の勾配にある細胞層を回収した。
（４）過剰なパーコールを除去し、回収した細胞層を過剰量のＤＰＢＳ ＢＳＡ培地に懸濁させ、８００ｇで２０分間遠心した。得られた細胞ペレットをＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で洗浄した後、細胞ペレットをＡＧＳＣ培地に懸濁させた。

（磁気ビーズを用いた分離）
（１）充分に撹拌した磁気ビーズ（「抗ウサギＩｇ−Ｄｙｎａｂｅａｄ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））１００μｌを、１．５ｍ１ 遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に入れ、該遠心管を磁気スタンド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にセットして５分間静置した。次いで、上清を捨て、ＤＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。
（２）磁気ビーズを、ブロッキング剤（ＤＰＢＳ ＢＳＡ培地）を用いて、時折撹拌しながら３０分間氷上でブロックした。次いで、ブロッキング剤を除去し、５００μｌのＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で懸濁させた。
（３）パーコールで分離した細胞溶液１ｍｌあたり、３μｌのＧＦＲ１ａ抗体（Ａｂｃａｍ社製）を添加し、ゆっくり撹拌しながら、３０分間氷上でインキュベートした。次いで、８００ｇで２０分間遠心分離し、過剰な抗体溶液を除き、細胞ペレットをＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で洗浄し、未結合の抗体を除いた。
（４）上記（３）で得た細胞ペレットを、５００μ１のＤＰＢＳ ＢＳＡ培地に懸濁させ、上記（２）で得た磁気ビーズに加え、時折ピペッティングしながら１時間氷上で反応させた後、磁気スタンドに遠心管をセットして５分間静置した。次いで、磁気ビーズをＤＰＢＳ ＢＳＡ培地で少なくとも３回洗浄した。
（５）１ｍ１の「Ｔｒｙｐ−ＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ−１Ｘ」（Ｇｉｂｃｏ社製）を、上記（４）で得たビーズ−細胞ペレットに加え、５分間インキュベートした。次いで、磁気スタンドに遠心管をセットして５分間静置した後、培地（細胞を含む。）を別の遠心管に回収した。該遠心管を８００ｇで、２０分間遠心し、細胞ペレットを回収した。該細胞ペレットを各魚類幹細胞培養用培地で２回洗浄してトリプシンを除いた後、各魚類幹細胞培養用培地に懸濁させた。
（６）得られた細胞溶液１０μｌを別のチューブに移し、１μｌの０．５％ トリパンブルー（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製）を加えた。青く染色された細胞及び透明な細胞の数を計測した後、死細胞の割合を特定し、生細胞の濃度が１０^６細胞／ｍｌとなるように調整し、下記の培養に供した。

＜魚類幹細胞の培養＞
（１）培養プレート（１０ｃｍ）に、各魚類幹細胞培養用培地８ｍｌ、及び、魚類幹細胞（２×１０^６細胞／ウェル）２ｍｌを入れ、２７℃で１０〜１５日間にわたって、コロニーが形成されるまで培養した。培地交換は毎日行った。
（２）コロニーが形成され始めた後、培地交換を１日おきに行いつつ、２週間又はコロニーが１ｍｍサイズになるまで培養した。
（３）培養後、培地を除去し、培養ウェルに１ｍ１の「Ｔｒｙｐ−ＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ−１Ｘ」（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて５〜１０分間インキュベートし、ウェル底から細胞を剥がし、得られた溶液を８００ｇで２０分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。
（４）得られた細胞ペレットをＡＧＳＣ培地で２回洗浄し、トリプシンを除去した。次いで、細胞ペレットをＡＧＳＣ培地に懸濁させ、「ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ ２」（ゼノアックリソース株式会社製）を用いて１０^６細胞／ｍｌに調整して以下の評価に供するまで−８０℃で保存した。

＜培養された魚類幹細胞の評価＞
以下の方法で培養細胞を染色し、染色結果に基づき、細胞増殖率、分化率、生存率をそれぞれ算出した。

（細胞染色）
得られた各培養細胞を、培養後１５〜２１日後の時点で、以下の３種の染色に供した。
（１）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色：「Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用。
（２）（ライブセル）イムノブロッティング：抗ＧＦＲ１ａ抗体（Ａｂｃａｍ社製）及び抗ＣＤ９０．２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用。
（３）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色：ヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用。

（染色細胞の評価）
染色細胞を顕微鏡観察及びフローサイトメトリー解析に供した。
ＡＰ染色陽性、かつ、抗ＧＦＲ１ａ抗体及び抗ＣＤ９０．２抗体に対して陽性であるが、ＰＩ染色陰性である場合、その細胞は、未分化の生きた幹細胞であると評価した。
ＡＰ染色陰性、かつ、ＰＩ染色陰性であるが、抗ＧＦＲ１ａ抗体及び抗ＣＤ９０．２抗体に対して陽性である場合、分化した細胞であると評価した。
ＰＩ染色陽性である場合、死細胞であると評価した。

上記の評価結果に基づき、細胞増殖率、分化率、生存率をそれぞれ算出した。その結果を表１〜３に示す。なお、各数値は以下の式に基づき算出した。
細胞増殖率（％）＝（未分化の幹細胞の総数／全細胞数）×１００
細胞分化率（％）＝（分化した細胞の総数／全細胞数）×１００
細胞生存率（％）＝１００−（死細胞の総数×１００／全細胞数）

細胞増殖率が５０％以上であれば、魚類幹細胞の増殖率が充分に高いことを意味する。細胞分化率が２０％未満であれば、魚類幹細胞の分化が充分に抑制されていることを意味する。

表に示されるとおり、本発明の実施例に係る培地（すなわち、本発明の要件を満たす培地）で培養された魚類幹細胞は、分化が抑制されつつ、細胞増殖率が高かった。

さらに、本発明の実施例に係る培地によれば、データは示していないが、長期間（例えば、２０継代以上、かつ／又は、６ヶ月以上）にわたって、魚類幹細胞を培養することができた。

Claims (2)

1. 血漿、ビタミン類、カルシウム塩、マグネシウム塩、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、Ｄ−ガラクトース、及び２−メルカプトエタノールを少なくとも含む、魚類幹細胞の培養用培地。
2. さらに、血清代替物、及び／又はアミノ酸を含む、請求項１に記載の培養用培地。