JP7011770B2 - 細胞培養状態評価装置 - Google Patents

Description

本開示は、細胞の培養状態を評価する技術に関する。

再生医療において用いられる技術の１つとして、採取した幹細胞を培養し、培養した細胞から作成した組織損傷部位に移植することにより、損傷した組織や器官の再生等を実現する、という手法がある。

細胞培養において、培養した細胞が培養容器や培養シート等の培養環境のなかで一定程度以上の密な状態、例えば隣接する細胞同士が接触あるいは非常に密接した培養状態になると、細胞の増殖が妨げられることが多い。したがって細胞培養では適切な細胞の培養状態を保つ為、細胞の培養状態として一定程度以上の密な状態に達するかを判定したうえで、他の培養容器に移し替えるなどの措置が必要になる。また、細胞培養に伴い、細胞が増殖、遊走することにより、培養環境内での、細胞相互がどの程度密な状態にあるかといった細胞の培養状態が変化する。この細胞の培養状態によりその後の増殖率が大きく異なる場合がある。細胞の増殖率に応じて培養容器の移し替えなどの作業を個別に実施する必要があるので、培養過程の早期段階において細胞の培養状態を判定し、細胞の増殖率をあらかじめ予測することは、後の様々な作業にとって有用である。

下記特許文献１は、『隣接する培養細胞からの影響が大きくならずに、最大の細胞数を確保することができる状態で継代の判断を行うことを可能とし、最適な状態で培養細胞を継代する。』ことを課題として、『培養容器内の培養細胞の占有面積率を計測し、計測された培養細胞の占有面積率と、培養細胞の増殖状態に応じて２つの領域に分類される細胞数と占有面積率との関係とに基づいて、該２つの領域の境界Ａに位置する占有面積率を有するか否かに応じて継代の可否を判断する培養細胞の継代判断方法を提供する。』という技術を開示している（要約参照）。

下記特許文献２は、『細胞の継代培養限界を判定できる。』ことを課題として、『残り細胞分裂回数ＮｄＲに対するみかけの細胞接着面積Ａｃの変化は、ドナーによらずどの角化細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することがわかった。また、このときの曲線は培養条件に依存して決まることもわかった。このため、細胞の培養条件とみかけの細胞接着面積Ａｃがわかれば、その残り細胞分裂回数ＮｄＲがわかるため、細胞の寿命がわかる。つまり、みかけの細胞接着面性Ａｃは継代培養を続けるべきか否かの指標となり得、細胞の接着面積を追跡すれば継代培養限界を判定できる。』という技術を開示している（要約参照）。

特開２００７－１２４９１４号公報 特開２００３－１１６５３０号公報

上記特許文献１～２においては、細胞の培養状態である細胞同士がどの程度密に分布しているかを評価するために、『培養容器内の培養細胞の占有面積率』（特許文献１）や『細胞接着面積』（特許文献２）を用いている。ここでいう面積とは、培養容器の底表面に細胞が平面状に分布している状態において、その底表面のうち細胞が占有している部分の面積のことである。すなわち特許文献１～２においては、細胞の面積をもって細胞の密度を判定していると考えられる。

他方で実際の細胞は、均一に分布しているとは限らず、局所的に密度が高い部分や低い部分が混在している場合がある。細胞の面積を用いて細胞の密度を判定する場合、このような局所的な密度分布を正確に把握することが困難になると考えられる。平面内において細胞の面積が占める割合は、細胞の位置的分布を表していないからである。

本開示は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、培養によって増殖させる細胞において、細胞の培養状態を表すパラメータをより正確に求めることができる技術を提供するものである。

本開示に係る細胞培養状態評価装置は、細胞の培養状態を評価する評価指標として、細胞の密集度を表す密集度パラメータを求める。

本開示に係る細胞培養状態評価装置によれば、細胞の面積に代えて細胞の密集度を表す密集度パラメータを培養状態の評価指標として求めることにより、細胞の培養状態をより正確に判定することができる。

実施形態１に係る細胞培養状態評価装置１００の構成を示す機能ブロック図である。 細胞コロニーの概念図である。 評価指標演算部１２２が細胞の個数をカウントする方法を説明する図である。 細胞の密集度を例示する画像である。 評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める手順を説明する図である。 評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める別手順を説明する図である。 評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める別手順を説明する図である。 本開示の有用性を検証するため用いた細胞画像の例である。 細胞の形状の違いを例示する画像である。 評価指標演算部１２２が評価指標として長さパラメータを求める手順を説明する図である。 細胞を培養する工程を示すチャートである。 細胞を培養する工程を示すチャートである。

＜実施の形態１：装置構成＞
図１は、本開示の実施形態１に係る細胞培養状態評価装置１００の構成を示す機能ブロック図である。細胞培養状態評価装置１００は、培養により増殖する細胞の培養状態を評価するために用いる評価指標を算出する装置である。評価指標の具体的内容とその算出手順については後述する。

以下では培養する細胞の例として、間葉系幹細胞を用いることとする。培養工程については後述する。

カメラ２１０は、培養容器２２０内において培養されている細胞を撮影し、その画像を細胞培養状態評価装置１００に対して出力する。細胞培養状態評価装置１００は、カメラ２１０から受け取った画像を用いて、評価指標を算出する。

細胞培養状態評価装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１１０、所定範囲設定部１２１、評価指標演算部１２２、数式算出部１２３、記憶部１３０を備える。所定範囲設定部１２１はさらにコロニー推定部１２１１を備える。所定範囲設定部１２１、評価指標演算部１２２、および数式算出部１２３はプログラムとして実装されており、ＣＰＵ１１０はこれらプログラムを実行する。以下では記載の便宜上、各プログラムを動作主体として説明する場合があるが、実際にこれらプログラムを実行するのはＣＰＵ１１０である。各プログラムの動作については後述する。記憶部１３０は、ＣＰＵ１１０が各プログラムを実行した結果を記憶する記憶装置（例えばハードディスクドライブ）である。

＜実施の形態１：処理の詳細＞
図２は、細胞コロニーの概念図である。ここでいう細胞コロニーとは、同一の細胞を起源として増殖した細胞群のことである。コロニー推定部１２１１は、カメラ２１０から取得した画像を用いて各細胞をトラッキングする（各細胞を監視し続ける）ことにより、細胞コロニーを特定することができる。培養初期においては同一の細胞を起源する細胞群は相互に近接し存在している確率が高いため、より簡易的には、例えば細胞の中心点を中心とした所定距離（例えば半径１６０μｍ）の円内に所定個数（例えば４個）以上の細胞が存在する場合、その細胞群を１つの細胞コロニーとして推定することができる。

コロニー推定部１２１１は、特定（または推定）した各細胞コロニー内の各細胞をトラッキングする（各細胞を監視し続ける）ことにより、後の時点において同じ細胞コロニーを特定することができる。

図３は、評価指標演算部１２２が細胞の個数をカウントする方法を説明する図である。個数をカウントするためには、画像上において各細胞の領域が分離されなければならない。そこで、評価指標演算部１２２は、カメラ２１０が撮影した画像に対して適当なフィルタリング処理を施すことにより、各細胞の一部領域を抽出する。その抽出画像を白黒の２値画像に変換した上で（図３においてはバックグラウンドを黒、細胞を白とした）、白い閉領域の個数をカウントすることにより、細胞個数をカウントできる。

細胞の種類によっては、細胞の周辺の細胞膜等の透明度が高く周辺の培地との間の境界を認識できない場合も多くある。例えば細胞核にあたる箇所を細胞の外縁として認識してしまうケースもある。この認識できた細胞の外縁が必ずしも正確でないことは、細胞の評価指標を算出する際の重要な課題となる。例えば細胞の外縁を不正確なまま細胞占有面積を計測すると、密集度として不正確な値が得られるからである。本実施形態１において評価指標演算部１２２が画像をフィルタリング処理して二値化することにより、細胞外縁を正確に認識していなくても、細胞の中心点を特定することができる。換言すると、各細胞の外縁の測定を前提とすることなく、各細胞の相互の位置関係に基づき密集度パラメータを測定することができる。

図４は、細胞の密集度を例示する画像である。一般に培養中の細胞群において、細胞の増殖、遊走等により、培養環境内での細胞相互の位置関係、つまり細胞の密集度といった細胞の培養状態が変化する。この細胞の培養状態によりその後の増殖率が大きく異なる場合がある。したがって、細胞の密集度を培養状態の評価指標として求めることにより、増殖率を正確に予測できると考えられる。例えば従来技術においては、細胞が占める面積割合などのような評価指標を用いて、細胞密度を評価指標として求めている。

他方で増殖中の細胞群は、個々の細胞が遊走することにより、空間分布が局所的に密になったり疎になったりすることがある。図４に示す４つの画像は、細胞の個数や画像内において細胞が占める面積割合は大きく変わらないものの、図４の最左画像から最右画像に向かって、細胞の空間的な密集度が次第に高くなっている。従来手法は細胞の面積を用いて密度を判定するので、このような密集度の違いを適切に数値化することが難しい。そこで評価指標演算部１２２は、図４が例示するような細胞の密集度の違いを適切に反映することができる手法を用いて、評価指標を求める。

図５は、評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める手順を説明する図である。評価指標演算部１２２は、同一の細胞コロニーに属する各細胞について、その周辺に存在する他の細胞の個数をカウントし、当該細胞コロニーにおいてその平均個数を求めることにより、密集度パラメータを求める。

図５においては、コロニー１の密集度パラメータを求める手順を例示した。評価指標演算部１２２は、カメラ２１０が撮影した画像上において、ある細胞ａの中心から所定距離内（例えば半径４０μｍの円内）に存在する他の細胞の個数をカウントする。図５においては、細胞ａの周辺には細胞ａを含めて５つの細胞が存在する。細胞ｂ、細胞ｃ、・・・についても同様に周辺細胞の個数をカウントする。評価指標演算部１２２は、最後にコロニー１における周辺細胞個数の平均値を求め、その値をコロニー１の評価指標である密集度パラメータとして用いる。

処理の便宜上、細胞中心から所定距離内に他の細胞の一部が含まれていれば、周辺細胞としてカウントしてよい。また評価指標は細胞コロニーごとに求めるので、細胞中心から所定距離内に他の細胞が存在する場合であっても、当該他の細胞が他の細胞コロニーに属するのであれば、周辺細胞としてカウントしないこととする。

周辺細胞の個数をカウントする際の所定距離（図５における円の半径、上記例においては４０μｍとした）は、短すぎると周辺個数を過小にカウントし、長すぎると周辺個数を過大にカウントすることになる。したがってこの所定距離は、培養容器２２０内の全細胞の長軸長さの代表値の半分よりも大きいことが望ましく、さらにその所定距離を半径とする円の面積が当該コロニーの面積よりも小さいことが望ましい。発明者等の実験によれば、人間の間葉系幹細胞の場合は半径３０μｍよりも大きく６５μｍよりも小さい円内に含まれる細胞個数をカウントするのが適当であると考えられるが、必ずしもこれに限るものではない。

ここでいう長軸長さの代表値とは、全ての細胞の長軸長さをもっともよく表す単一の数値である。例えば全ての細胞の長軸長さの平均値、中央値、などを代表値として用いることができる。また長軸長さとは、当該細胞の最大径を表す線分の長さのことである。具体的な算出方法の例については後述する。

図６は、評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める別手順を説明する図である。評価指標演算部１２２は、各細胞を母点とするボロノイ分割を実施することにより、各細胞に対応するボロノイ領域を求める。ボロノイ分割は、母点間の中心線を連結することにより、母点間の勢力関係を図示化する手法である。ボロノイ分割のアルゴリズムは公知であるので、ここでは説明を省略する。

図６（ａ）は、細胞の密集度が低い場合を示す。この場合は図６（ａ）右図に示すように、各ボロノイ領域の面積はばらついている。すなわちボロノイ領域の面積の分散は大きい。図６（ｂ）は細胞の密集度が高い場合を示す。この場合は図６（ｂ）右図に示すように、各ボロノイ領域の面積は概ね均等である。すなわちボロノイ領域の面積の分散は小さい。評価指標演算部１２２は、ボロノイ領域の面積のばらつきを表すパラメータ（例えば分散の逆数）を、密集度パラメータとして求めることができる。

図７は、評価指標演算部１２２が評価指標として密集度パラメータを求める別手順を説明する図である。評価指標演算部１２２は、各細胞を母点とみなし、ある位置を中心とする円内に存在する母点の個数を、円の半径値ごとにカウントする。中心位置は、例えば（ａ）細胞集合の重心、（ｂ）細胞が分布している領域の中心、（ｃ）これらのうちいずれかに対して最も近い細胞、などとすればよい。

図７（ａ）は、細胞の密集度が低い場合を示す。この場合は半径ｒが増えるのにともなって、その半径内に存在する母点の個数が略比例的に増加する。図７（ａ）右図は、半径ｒと母点個数をプロットしたグラフである。母点の個数が比例的に増加するので、変曲点の位置（図７（ａ）右図の丸印）は中心から比較的遠い位置にあり、変曲点における曲率の絶対値は小さい（曲率半径が大きい）。

図７（ｂ）は、細胞の密集度が高い場合を示す。この場合は中心から比較的近い範囲内に母点が密集していることになる。したがって図７（ｂ）右図に示すように、変曲点の位置は中心から比較的近い位置にあり、変曲点における曲率の絶対値は大きい（曲率半径が小さい）。

評価指標演算部１２２は例えば、図７右図に示すグラフにおける以下のいずれかのパラメータを、密集度パラメータとして求めることができる：（ａ）半径の増分に対する個数の増加率（微分値）、（ｂ）増加率が最大となる半径ｒの値、（ｃ）変曲点における半径ｒの値、（ｄ）変曲点における曲率の絶対値（または曲率半径）。

図８は、本開示の有用性を検証するため用いた細胞画像の例である。ここでは細胞の密集度が比較的疎である画像（図８左上）、中程度である画像（図８中上）、比較的密である画像（図８右上）の３つに対して、従来手法と本実施形態１に係る手法をそれぞれ適用した結果を説明する。図８中段は、上段の３画像をそれぞれ２値化したものである。図８下段は、従来手法において細胞が占める部分として特定される領域を囲んだ画像である。

図８上段の３画像に対して図５で説明した手法を用いた結果、密集度パラメータはそれぞれ１．５２０８（図８左上）／２．１６２５（図８中上）／２．８１９５（図８右上）となった。この結果から、図５で説明した手法は細胞の密集度を適切に数値化できていることが分かる。

図８上段の３画像に対して、細胞が占める部分として特定された領域内に存在する細胞の個数を、当該領域の面積（例えば当該領域を形成するピクセル数）で除算した値を求めた。これは従来手法における細胞占有面積を用いて評価指標を求めることに対応する。得られた結果はそれぞれ、７．１５４０ｅ^－４／２．９９２６ｅ^－４／８．５３６８ｅ^－４となった。疎画像と高密度画像について同程度の値が得られていること、および中密度画像の値が最低であることに鑑みると、図５で説明した手法のほうがより正確に密集度を数値化できていることが分かる。

図８上段の３画像に対して図６で説明した手法を用いた結果、ボロノイ領域の面積の平均値は、１５１５．７（図８左上）／１８６３．８（図８中上）／３７１２．２（図８右上）となった。ボロノイ領域の面積の標準偏差は、４２８３．８（図８左上）／７１２８．５（図８中上）／６４３４２．２（図８右上）となった。この結果から、図６で説明した手法は細胞の密集度を適切に数値化できていることが分かる。

図８上段の３画像に対して図７で説明した手法を用いた結果、半径ｒの増分に対する個数の増加率が最大となる半径ｒは、ｒ＝５０（図８左上）／ｒ＝７５（図８中上）／ｒ＝１２５（図８右上）となった。画像サイズの違いに鑑みると、図７で説明した手法は細胞の密集度を適切に数値化できていることが分かる。

＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係る細胞培養状態評価装置１００は、細胞の培養状態を評価する評価指標として、細胞が細胞コロニー内において密集している度合いを表す密集度パラメータを求める。これにより、図４で例示したような細胞の空間分布の違いを適切に反映して密集度を求めることができるので、細胞の培養状態をより正確に判定できる評価指標を得ることができる。

本実施形態１に係る細胞培養状態評価装置１００は、細胞コロニーごとに評価指標を求める。同一の被検体から採取した細胞であっても、個々の細胞の増殖性は異なる。細胞の増殖性は起源となる細胞の増殖性にも影響されるので、コロニーを特定し、コロニーごとに培養状態を評価することにより、培養環境全体の培養状態をより精度よく評価することができる。

本実施形態１においては、所定範囲設定部１２１が細胞コロニーごとに密集度パラメータを求める例を説明したが、その他の様々な増殖性の影響を検討したうえで、適当な範囲ごとに所定範囲を設定し密集度パラメータを求めてもよい。所定範囲を培養環境内の全て、または特定の範囲に設定して密集度パラメータを求めてもよい。例えば培養容器２２０の底面の全体領域について密集度パラメータを求めることができる。この場合は細胞群全体について密集度パラメータを求めることになる。あるいは培養容器２２０の底面の部分領域内に存在する細胞について密集度パラメータを求めることもできる。この場合はその部分細胞集合について密集度パラメータを求めることになる。また、特定のパラメータ値を有する細胞群や特定の細胞種を所定範囲に設定し、密集度パラメータを求めてよい。例えば、長軸長さが所定値の範囲に含まれる細胞群を識別し所定範囲に設定することで、密集度パラメータを求めてもよい。あるいは同時に同じ培養環境内で培養する場合に、細胞種を識別し細胞種ごとに密集度パラメータを求めてもよい。細胞の種類によって細胞の増殖性は異なるうえ、異なる細胞種間、同一の細胞種間の相互作用により増殖性が影響を受ける可能性があるからである。図５～図７それぞれの手法について同様である。

＜実施の形態２＞
実施形態１においては、細胞の培養状態を評価するために用いる評価指標として、密集度パラメータを求めることを説明した。本開示の実施形態２では、その他の評価指標として長さパラメータを求める例を説明する。

図９は、細胞の形状の違いを例示する画像である。図９の最左画像は長軸長さが短い（全体的に丸い）細胞が多い例を示し、最右画像は長軸長さが長い細胞が多い例を示す。間葉系幹細胞は、遊走するのにともなって細長い紡錘形状に変化することが知られている。また間葉系幹細胞は、細胞コロニー形成後の初期において、長軸長さが短い細胞が多い細胞コロニーほど増殖率が高い傾向にあることが知られている。そこで評価指標演算部１２２は、細胞コロニーのなかで短い細胞がどの程度含まれているかを表す長さパラメータを、培養状態の評価指標として求める。

図１０は、評価指標演算部１２２が評価指標として長さパラメータを求める手順を説明する図である。評価指標演算部１２２は、細胞の長軸を特定し、長軸長さが所定長（例えば６０μｍ）以下である細胞（便宜上、短細胞と呼ぶ）の個数を、細胞コロニーごとに求める。当該細胞コロニー内の全細胞個数に対する短細胞の個数の割合を、当該細胞コロニーの長さパラメータとする。

細胞の長軸とは、当該細胞の最大径を表す線分である。図１０下図はその具体例を示す模式図である。細胞の長軸を求める手法は様々存在するのでここでは格別説明しないが、例えば細胞の形状を線分によって近似することにより、当該細胞の長軸を求めることができる。その他適当な手法を用いて長軸を求めてもよい。本明細書における長軸長さの算出方法は後述する。

図１０において、例えばコロニー１内に細胞が２４個存在し、そのうち長軸長さが６０μｍ以下であるものの個数が９個である場合、コロニー１の長さパラメータは９／２４＝０．３７５と求められる。以後の手順は実施形態１と同様である。

＜実施の形態２：まとめ＞
本実施形態２に係る細胞培養状態評価装置１００は、細胞の培養状態を評価する評価指標として、細胞コロニーのなかで長軸長さが短い細胞がどの程度含まれているかを表す長さパラメータを求める。これにより実施形態１と同程度に、細胞の培養状態を正確に判定できる評価指標を得ることができる。

本実施形態２において、細胞コロニーごとに長さパラメータを求める例を説明したが、実施形態１と同様にその他の適当な範囲ごとに長さパラメータを求めてもよい。

＜実施の形態３＞
実施形態１～２で説明した評価指標は、細胞の成長性を予測するために用いることもできる。本発明の実施形態３では、その１例として、細胞を培養する工程のなかで実施形態１～２で説明した評価指標を求め、これを用いて細胞の成長性を予測する例について説明する。

＜実施の形態３：培養工程の概略＞
図１１は、細胞を培養する工程を示すチャートである。ここでは評価指標として、実施形態１で説明した密集度パラメータを用いる例を示した。細胞を培養開始した日（Ｄａｙ０）から５日目（Ｄａｙ４）の時点において、評価指標演算部１２２は、細胞の培養状態を評価するための評価指標を演算する。本実施形態３において、評価指標は細胞コロニーごとに求めることとする。評価指標を求める前提として、コロニー推定部１２１１は細胞コロニーを推定する。これらの処理はカメラ２１０から受け取った画像に基づき実施することができる。以下の工程における処理も同様である。

評価指標演算部１２２は、求めた評価指標を記述したデータを記憶部１３０に対して格納する。例えば細胞コロニーごとに２つの評価指標を求めた場合、各細胞コロニーの評価指標を図１１中段に示すように２次元プロットすることができる。図１１中段における各丸印がそれぞれの細胞コロニーに対応する。評価指標演算部１２２はその２次元プロットを記述したデータを記憶部１３０に対して格納する。

培養開始から１５日目（Ｄａｙ１４）において、培養を完了する。カメラ２１０は培養工程における各細胞の挙動を撮影し、コロニー推定部１２１１はその画像を用いて各細胞をトラッキングすることにより、Ｄａｙ４の時点で特定した細胞コロニーごとに細胞個数をカウントする。評価指標演算部１２２は、Ｄａｙ４の時点における２次元プロット上の各細胞コロニーについて、Ｄａｙ１４の時点における細胞個数を反映する。図１１下段においては、細胞個数が５００個以上の細胞コロニーを三角印で置き換え、５００個未満の細胞コロニーはＤａｙ４時点のままにしている。したがって、図１１中段における各プロット点と図１１下段における各プロット点は、それぞれ同じ細胞コロニーを表している。

数式算出部１２３は、Ｄａｙ１４時点における各細胞コロニーの細胞個数に基づき、増殖率の高い細胞コロニーと低い細胞コロニーを区別する関数（予測式）を予測する。図１１下段の例によれば、Ｄａｙ４時点における細胞個数が概ね３０個以上、評価指標２が概ね１．５以上の細胞コロニーはＤａｙ１４時点において５００個以上の細胞を有する傾向がある。したがって図１１下段の例において、数式算出部１２３は、同図の斜線が表す予測式を算出した。

以後同様の細胞培養を実施する際には、以上の手順によって求めた予測式にしたがって増殖率の高い細胞コロニーと低い細胞コロニーを区別することができる。さらに予測式を確定する前に、あらためて細胞培養を実施した結果に基づき、予測式の有用性を検証することもできる。

予測式を正確に求める前提として、適切な評価指標を求める必要がある。しかし従来技術のように細胞の面積を評価指標として用いる場合、個々の細胞の密集度が必ずしも評価指標として反映されない。実施形態１～２で説明した手法を用いることにより、細胞の密集度パラメータまたは長さパラメータを評価指標として正確に求めることができる。

図１２は、細胞を培養する工程を示すチャートである。ここでは評価指標として、実施形態２で説明した長さパラメータを用いる例を示した。したがって図１２の各グラフの縦軸は長さパラメータである。

実施形態１で説明した密集度パラメータと実施形態２で説明した長さパラメータを併用することもできる。例えば図１１や図１２で説明した２次元プロットに代えて、細胞個数／密集度パラメータ／長さパラメータの３次元プロットを作成し、予測式としてその３次元空間上における関数を求めることができる。その他、例えば密集度パラメータと長さパラメータそれぞれに対して重み係数を加味した評価指標を用いることも考えられる。

＜本開示の変形例について＞
本開示は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。

以上の実施形態においては、カメラ２１０が撮影した画像を用いることを説明したが、撮像装置の種類については、細胞のサイズや種類などに応じて適切な画像を取得できるものであればよい。

以上の実施形態においては、間葉系幹細胞を培養する例を説明したが、その他細胞を培養する場合においても、細胞の密集度パラメータを求める手法や長さパラメータを求める手法として、本開示に係る手法を用いることができる。

以上の実施形態においては、所定範囲設定部１２１、評価指標演算部１２２、数式算出部１２３を個別のプログラムとして記載したが、これらの機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアを用いてこれら機能部を構成することもできる。

以上の実施形態においては、ＣＰＵ１１０による演算結果を記憶部１３０に対して出力することを説明したが、これに代えてまたはこれと併用して、その他の出力形式を用いることもできる。例えばＣＰＵ１１０による演算結果を画面表示することが考えられる。その他、ネットワークを介してＣＰＵによる演算結果を送信することも考えられる。出力内容としては、例えば評価指標そのものを記述したデータであってもよいし、これらを図１１や図１２で例示したようにグラフ化したものであってもよい。評価指標にしたがって適当なアラートを出力してもよい。例えば評価指標が過大または過小であるとき、その旨のアラートを出力することができる。

以上の実施形態においては、各細胞を画像によってトラッキングすることにより、細胞コロニーを特定することを説明したが、細胞コロニーを特定する手法はこれに限るものではなく、その他適当な手法によりＤａｙ４とＤａｙ１４それぞれの時点における細胞コロニーを特定してもよい。

以上の実施形態においては、数式算出部１２３が予測式を求めることにより細胞コロニーを増殖率の高低にしたがって区別することを説明した。数式算出部１２３は、その他適当な手法により細胞コロニーを区別してもよい。例えばプロット空間上で適当なクラスタリング手法を用いて細胞コロニーをグルーピングすることにより、同様の処理を実施できる。さらには、細胞コロニーを３以上のグループに区分してもよい。

以上の実施形態においては、密集度パラメータを求める際に、半径４０μｍの円内に存在する細胞個数をカウントすることを説明したが、これは本発明者が実験的に見出した適切な数値である。したがって、例えば細胞種類などの環境が変わればこれ以外の数値を採用してもよい。長さパラメータを求める際における細胞の長軸長さ（６０μｍ）、および細胞コロニーを推定する際の距離（１６０μｍ）についても同様である。

以上の実施形態において、細胞の中心点を求める際には、例えば以下のような手法を用いることができる。図３右図の白領域は各細胞に対応する。各白領域の重心を当該細胞の中心点としてみなすことができる。

以上の実施形態において、細胞の長軸長さ（単位はμｍ）は、細胞領域の重心モーメントを用いた次の式で算出している。
長軸長さ＝２×√２×√｛Ｍ_0,2＋Ｍ_2,0＋√［(Ｍ_0,2－Ｍ_2,0)²＋４×Ｍ_1,1 ²]｝×Ａ
Ｍ_2,0 = Σ（ｘ－ｘ’)²÷Ｎ＋（１÷１２）
Ｍ_0,2 = Σ（ｙ－ｙ’)²÷Ｎ＋（１÷１２）
Ｍ_1,1 = Σ｛（ｘ－ｘ’)×（ｙ－ｙ’）｝÷Ｎ＋（１÷１２）
尚、Ｍ_2,0, Ｍ_0,2, Ｍ_1,1 はそれぞれ、画像Ｘ方向の二次モーメント、画像Ｙ方向の二次モーメント、相乗モーメント、である。x、yは細胞領域であるピクセルの座標を示す。ｘ’、ｙ’は細胞領域の重心位置の座標を示す。Ｎは細胞領域であるピクセル数を示す。Ａは、画像の1ピクセルに対応する実際の長さを示す。本願の解析で使用した画像は、1ピクセル= ４μｍであるため、Ａ＝４である。

以上の実施形態においては、Ｄａｙ４における評価指標を用いてＤａｙ１４における各細胞コロニーを区別することを説明した。Ｄａｙ４における評価指標を用いるのは、これよりも早い時点だと細胞が充分に増殖していないので評価指標を適切に求めることができず、これよりも遅いと培養の途中段階における評価指標から培養の最終段階における増殖率を予測する意義が減退するからである。Ｄａｙ１４を培養の最終段階としたのは、膝軟骨の間葉系幹細胞を用いる再生医療においては、この時点における細胞を患者に戻すからである。したがってその他種類の細胞を用いる場合などにおいては、これらとは異なる日程を用いる場合もあるが、その場合であっても、本開示と同様の手法を適用することにより、細胞培養の途中段階における評価指標に基づき最終段階における増殖率を推定することができる。

１００：細胞培養状態評価装置
１１０：ＣＰＵ
１２１：所定範囲設定部
１２２：評価指標演算部
１２３：数式算出部
１３０：記憶部
２１０：カメラ
２２０：培養容器

Claims (20)

1. 培養される細胞の培養状態を判定するためのパラメータを求める細胞培養状態評価装置であって、
   前記細胞の培養状態を評価するために用いる評価指標を求める評価指標演算部を備え、 前記評価指標演算部は、前記評価指標として、所定範囲のなかに存在する前記細胞の密集度を表す密集度パラメータを求め、
   前記評価指標演算部は、前記所定範囲として、細胞コロニーを形成する同一の細胞集合を用いることにより、前記同一の細胞集合に属する細胞の空間分布が局所的に密集している程度を表す密集度を、前記同一の細胞集合の前記密集度パラメータとして計算する
   ことを特徴とする細胞培養状態評価装置。
2. 前記評価指標演算部は、所定距離内に存在する前記細胞の個数の平均値を前記所定範囲ごとに求めることにより、前記所定範囲ごとに前記密集度パラメータを求める
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
3. 前記評価指標演算部は、前記所定範囲のなかに存在する前記細胞それぞれについて、前記細胞から第１距離以内に存在する他の前記細胞の個数をカウントし、その結果を前記所定範囲ごとに平均することにより、前記所定範囲ごとに前記密集度パラメータを求める
   ことを特徴とする請求項２記載の細胞培養状態評価装置。
4. 前記評価指標演算部は、前記細胞の長軸長さの代表値の半分よりも大きくなるように前記第１距離をセットする
   ことを特徴とする請求項３記載の細胞培養状態評価装置。
5. 前記評価指標演算部は、前記第１距離を半径とする円の面積が、前記所定範囲の面積よりも小さくなるように、前記第１距離をセットする
   ことを特徴とする請求項３記載の細胞培養状態評価装置。
6. 前記細胞は人間の間葉系幹細胞であり、
   前記第１距離は３０μｍより大きく６５μｍよりも小さい
   ことを特徴とする請求項３記載の細胞培養状態評価装置。
7. 前記評価指標演算部は、前記細胞を母点とするボロノイ分割を実施することにより各前記細胞に対応するボロノイ領域を求め、
   前記評価指標演算部は、前記ボロノイ領域の面積のばらつきを用いて前記密集度パラメータを求める
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
8. 前記評価指標演算部は、前記細胞を母点とする点集合を含む領域のうちいずれかの箇所を原点として、前記原点を中心とする円のなかに存在する母点の個数を、前記円の半径の値ごとにプロットし、
   前記評価指標演算部は、前記プロットの変化率に基づき前記原点の周辺における母点の密集度を数値化することにより、前記密集度パラメータを求める
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
9. 前記評価指標演算部は、前記評価指標として、前記細胞の長さを表す長さパラメータを求める
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
10. 前記評価指標演算部は、前記所定範囲のなかに含まれる前記細胞の長軸方向における長さを計測するとともに、前記長軸方向における長さが第２距離以下である短細胞の個数をカウントすることにより、前記長さパラメータを求める
    ことを特徴とする請求項９記載の細胞培養状態評価装置。
11. 前記評価指標演算部は、前記短細胞が属する前記所定範囲のなかに含まれる全細胞数に対する、前記短細胞の個数の割合を、前記長さパラメータとして求める
    ことを特徴とする請求項１０記載の細胞培養状態評価装置。
12. 前記評価指標演算部は、培養容器のなかにおいて培養されている全ての前記細胞を前記所定範囲として、前記密集度パラメータを求める
    ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
13. 前記評価指標演算部は、培養容器のなかにおいて培養されている前記細胞の一部を前記所定範囲として、前記密集度パラメータを求める
    ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
14. 前記評価指標演算部はさらに、同一の前記細胞を起源として増殖した細胞群によって形成されている細胞コロニーを推定するコロニー推定部を備え、
    前記評価指標演算部は、前記コロニー推定部が推定した前記細胞コロニーを前記所定範囲として、前記密集度パラメータを求める
    ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
15. 前記コロニー推定部は、細胞の中心点から第３距離以内に所定個数以上の前記細胞が存在する場合、前記所定個数以上の前記細胞は同一の前記細胞コロニーに属するものと推定する
    ことを特徴とする請求項１４記載の細胞培養状態評価装置。
16. 前記評価指標演算部は、各前記細胞を時系列に沿って撮影した画像をトラッキングすることにより、各前記細胞を特定する
    ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
17. 前記細胞培養状態評価装置はさらに、前記評価指標演算部による演算結果を出力する出力部を備える
    ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養状態評価装置。
18. 前記出力部は、前記評価指標演算部が求めた前記評価指標に基づき警告を出力する
    ことを特徴とする請求項１７記載の細胞培養状態評価装置。
19. 培養される細胞の培養状態を判定するためのパラメータを求める細胞培養状態評価方法であって、
    前記細胞の培養状態を評価するために用いる評価指標を求める評価指標演算ステップを有し、
    前記評価指標演算ステップにおいては、前記評価指標として、所定範囲のなかに存在する前記細胞の密集度を表す密集度パラメータを求め、
    前記評価指標演算ステップにおいては、前記所定範囲として、細胞コロニーを形成する同一の細胞集合を用いることにより、前記同一の細胞集合に属する細胞の空間分布が局所的に密集している程度を表す密集度を、前記同一の細胞集合の前記密集度パラメータとして計算する
    ことを特徴とする細胞培養状態評価方法。
20. 請求項１９記載の細胞培養状態評価方法をコンピュータに実行させることを特徴とする細胞培養状態評価プログラム。

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