JP6058395B2 - アルツハイマー病の診断のための繊維芽細胞成長パターン - Google Patents
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Description
本発明は、バイオマーカーとして繊維芽細胞成長パターンを使用するアルツハイマー病を診断する方法に関する。
アルツハイマー病は、神経変性障害であり、進行性の記憶力および認知機能の低下により特徴づけられる。500万人を超えるアメリカ人が、進行的な不治の病と共に生きていると推定される。アルツハイマー病は、脳細胞を破壊し、記憶障害と生活の質を低下する思考および行動の問題を引き起こす。ADには、既知の治療法がないが、症状の治療は、ADを患う100万人の人々および彼らの家族の生活の質を改善できる。ADの早期診断は、生活の質を最大にする選択を行うための時間を患者に与え、未知の問題についての不安を減少し、未来について計画するためのより多くの時間を与え、治療からの利益のよりよい機会を提供する。
ある好ましい実施形態において、本発明は、5つの別々の手順に向けられるアッセイ、ここにおいて(1)集積スコア法;(2)凝集の数あたりの平均凝集面積法;(3)細胞遊走分析法;(4)フラクタル分析法;および(5)空隙性分析法;と称される手順を使用するアルツハイマー病の診断方法に向う。
(b)フラクタル次元を、フラクタル次元データのデータベースと比較する;および
(c)工程(b)の比較に基づいて、診断を出力する;ための命令を含む。
ある実施形態において、本発明は、対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養する工程と;(b)培養された細胞の1つまたは1つ以上の特徴に基づいて集積スコアを決定する工程と;(c)集積スコアを、非アルツハイマー病細胞について決定された集積スコアと比較する工程と;(d)対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を診断する工程と;を含む方法に向う。
1.方法1:集積スコア
2.方法2:凝集の数あたりの平均凝集面積
3.方法3:細胞遊走分析
4.方法4:フラクタル分析
5.方法5:空隙性分析。
この研究において、培養の1〜2時間以内に皮膚繊維芽細胞は、マトリゲル上で接触して測定可能なネットワークを形成する。この状態は、細胞形態、細胞の生化学的な機能、細胞運動性または浸潤、および遺伝子発現を研究するための生理学的に関連する環境を提供する。1日後、これらのネットワークは変性し、エッジが後退し、測定可能な凝集が残る。
1.大きい凝集の存在
2.凝集に対する細胞の付着
3.凝集成長の兆候
4.少数の凝集(10倍画像において<10)
5.多数の凝集(10倍画像において>10)
6.ネットワーク内の測定可能なエッジ
7.細胞遊走の兆候
8.パーコレーション限界への近さ(細胞は連続的な流れを形成する)。
1.上述の最初の4つのパラメータは、アルツハイマー病(AD)に特異的であり、存在するときには、それぞれについて「−1」の点数を付け、不在のときには「0」を付ける。
8つのパラメータの2つは、凝集の数あたりの面積の大きさで表され、それは、ACおよび非ADDについてよりもADについての方が相当に高い(診断精度96%、N=31(nAD=12、nAC=10およびnnon−ADD=9))、ACに対するADについてp<0.000001、および非ADDに対するADについてp<0.00001)。
集積スコア法とは異なり、細胞遊走法は、AD、ACおよび非ADD細胞との間を識別することが可能である。図9および10を参照されたい。
集積スコア法とは異なり、フラクタル分析法は、AD、ACおよび非ADD細胞の間を識別することが可能である(p<0.01)。図11Bを参照されたい。
空隙性分析法は、繊維芽細胞パターンの間隙を定量化し、識別の第2のレベルとして使用される複雑性を補完する測定である。また、繊維芽細胞の平均空隙性は、ACおよび非ADD繊維芽細胞と比較したときに、ADから採取された繊維芽細胞の方がより高い。典型的に、空隙性は、ネットワーク変性が最大であるときに、即ち、孤立した凝集のみが見えるときに、増大し、ピークになる(図12A)。間隙は、ネットワーク変性が開始したときに生じる。
同じ数の繊維芽細胞(50細胞/mm3)を、AD細胞株について12ウェルプレート内で増加量100μLずつ400μL〜800μLまで増大した体積のマトリゲル上に播種した。マトリゲル体積、V、の増大は、関係式:V=(πr2)h、ここでr=11.05mmに従い、マトリゲル層の厚さに比例して増加を生じる(図13)。
1つの実施形態において、フラクタル次元は、原画像、これはデジタル画像であってもよいが、これを、例えば、2つのガウスの相違を使用するなどのエッジ検出手続きを経てフィルタ処理した後に、標準ボックス集計手続きを用いて算出される。ADは、培養されたヒト皮膚繊維芽細胞の定量的な画像分析に基づいて診断されてよい。1つの実施形態において、サンプルは、パンチバイオプシーを経て採取される。一般に、外科用刃が使用されてよい。個体群データは、AC症例が、AD症例よりも有意に高いフラクタル次元を有することを示す。減少した複雑性のヒト皮膚繊維芽細胞ネットワークAD症例は、ACおよび比AD認知症症例から識別される。
培養後の短時間内に、例えば、1時間以内に、測定可能なネットワークが形成する。1つの実施形態において、培養は、ゼラチン様タンパク質混合物中で行われ、それは、細胞形態を研究するために実行可能な環境を提供する。ある時間の後、例えば、約1日後、これらのネットワークは変性し、エッジが後退して、測定可能な「凝集塊」または凝集が後に残される。
もう1つの実施形態において、凝集の面積が算出される。例えば、図5B(AC細胞)に示される凝集塊の面積が算出される。これは、何れかの適切な方法により、例えば、これに限定するものではないが、凝集塊を横切る楕円をフィッティングすることにより実行されてよい。次に凝集塊が画像上でカウントされてよい。カウント並びに面積算出は、手動で行われるか、例えば、従来技術において公知の画像処理技術により自動で行われるかの何れかで行われてもよい。図5Bに示される数は、平方ミクロン、μ2の凝集塊の面積を表す。同様に、AD細胞の面積、例えば、図5Aに示されるものが、算出されてよい。例示として、図5Aで示される面積は12.670μ2であり、図5Bに示されるAC細胞の面積と関連付けられるものよりもかなり大きい。凝集塊の数あたりの面積が、図7に示されるようにプロットされてよい。
装置および物質:クラスIIA/B3生物学的安全キャビネット(Forma Scientific)。C02水−ジャケットインキャベータ(Forma Scientific)。倒立顕微鏡。パスツールピペット。血清学的ピペット。ピッペトエイド(Omega Cat.No.P5017)、BD還元マトリゲルマトリックス成長因子(BD Biosciences、Cat.No.354230)(アリコート800μLおよび−20℃で貯蔵)。滅菌12ウェル培養プレート(Coming Inc.,Cat. No.3S12)。
装置および物質。クラスIIA/B3生物学的安全キャビネット(Forma Scientific)。C02水−ジャケットインキュベータ(Forma Scientific)。倒立顕微鏡。T−E(トリプシン−EDTA溶液1倍)(−20℃で貯蔵)。M−2(培地2)10%FBSおよび1%PS含有のDMEM。パスツールピペット。血清学的ピペット。ピッペトエイド(Omega Cat.No.P5017)。培養フラスコ、ベントキャップ、25cm2。15mLおよび50mL滅菌プラスチックチューブ。500mLボトルトップフィルタ。水浴遠心機。
装置および物質。クラスIIA/B3生物学的安全キャビネット(Forma Scientific)。倒立顕微鏡。細胞カウントチャンバ−レビィダブル(VWR scientific,Cat.No.15170−208)。パスツールピペット。血清学的ピペット。ピッペトエイド(Omega Cat.No.P5017)。滅菌12ウェル培養プレート(Coming Inc.,Cat.No.3512)。
装置および物質:倒立顕微鏡。イメージJ。
装置および物質:倒立顕微鏡(Westover Digital AMID Model 2000)。ミクロン2.0.0ウェストオーバー・サイエンティフィック2008(Micron 2.0.0 Westover Scientific 2008)。イメージJ。
1.大きな凝集の存在
2.凝集に対する細胞の付着
3.凝集成長の兆候
4.少数の凝集(10倍画像において<10)
5.多数の凝集(10倍画像において>10)
6.ネットワーク内の測定可能なエッジ
7.細胞遊走の兆候
8.パーコレーション限界に対する近さ(細胞は連続的な流れを形成する)。
装置および物質:倒立顕微鏡(Westover Digital AMID Model 2000)。イメージJ。プラグ・イン・フラックラック(Plug in FracLac)。
培地の調製:DMEM(高グルコース)、Cat.No.10313−039、インビトロジェン・ギブコ(4℃冷蔵庫内で貯蔵);FBS、Cat.No.10082−147、インビトロジェン・ギブコ(アリコート50mLおよび−20℃で貯蔵);PS(ペニシリンおよびストレプトマイシン溶液)Cat.No.15140−122、インビトロジェン(アリコオート5mLおよび−20℃で貯蔵)。M−1(培地1)、45%および1%のPSを含むDMEM。M−2(培地2)10%および1%のPSを含むDMEM
。濾過、表示および4℃冷蔵庫内で1ヶ月まで貯蔵)。
本願発明の実施態様を以下に付記する。
1. ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下の工程を含む方法;
(a)ヒト対象から1つまたは1つ以上の細胞を得ること;
(b)1つまたは1つ以上の細胞をある期間に亘り培養すること;
(c)細胞凝集の平均面積を決定し、平均面積を凝集の数で割って、凝集の数あたりの面積を得ること;
(d)工程(c)の結果を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集の数あたりの面積と比較すること;および
(e)工程(d)の比較に基づいて、アルツハイマー病の存在または不在を診断すること。
2.1に記載の方法であって、工程(c)において決定された凝集の数あたりの面積が、工程(d)において決定された凝集の数あたりの面積よりも大きいときに、診断は、アルツハイマー病について陽性である方法。
3.1に記載の方法であって、診断が1つまたは1つ以上の更なる診断方法を用いて確認される方法。
4.1に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の更なる診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
5.1に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
6.1に記載の方法であって、工程(d)における非アルツハイマー病細胞がAC細胞である方法。
7.1に記載の方法であって、細胞がタンパク質混合物中で培養される方法。
8.7に記載の方法であって、タンパク質混合物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよび/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む方法。
9.8に記載の方法であって、タンパク質混合物が更に成長因子を含む方法。
10.8に記載の方法であって、細胞外マトリックスタンパク質が腫瘍から抽出される方法。
11.10に記載の方法であって、腫瘍がEHSマウス肉腫である方法。
12. 以下を含む方法;
(a)ヒト対象から1つまたは1つ以上の細胞を得ること;
(b)1つまたは1つ以上の細胞をある期間に亘り培養すること;
(c)前記ある期間の終わりに細胞の画像を得ること;
(d)画像における細胞のネットワークに関するフラクタル次元を決定すること;および(e)工程(d)の結果と、既知の非アルツハイマー病細胞に関して独立して決定されたフラクタル次元とを比較すること。
13.12に記載の方法であって、工程(d)において算出されたフラクタル次元が、既知の非アルツハイマー病細胞に関するフラクタル次元よりも統計学的に有意に低いときに、対象はアルツハイマー病であることを示す方法。
14.13に記載の方法であって、アルツハイマー病が1つまたは1つ以上の診断方法を使用して確認される方法。
15.14に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
16.12に記載の方法であって、フラクタル次元がボックス集計手続きを用いて算出される方法。
17.16に記載の方法であって、ボックス集計手続きがエッジ検出手続きを含む方法。
18.12に記載の方法であって、対象が、既知の非アルツハイマー病細胞を提供するコントロール対象と年齢が一致する方法。
19.12に記載の方法であって、ある期間が約24時間である方法。
20.12に記載の方法であって、細胞がタンパク質混合物中で培養される方法。
21.20に記載の方法であって、タンパク質混合物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよび/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む方法。
22.21に記載の方法であって、タンパク質混合物が更に成長因子を含む方法。
23.21に記載の方法であって、細胞外マトリックスタンパク質が腫瘍から抽出される方法。
24.23に記載の方法であって、腫瘍がEHSマウス肉腫である方法。
25. 以下を含む方法;
(a)ヒト対象からの繊維芽細胞のネットワークの画像のフラクタル次元を決定すること;
(b)既知の非アルツハイマー病細胞からの繊維芽細胞のネットワークの画像のフラクタル次元を決定すること;および
(c)工程(a)および(b)の結果を比較すること。
26.25に記載の方法であって、工程(a)において決定されたフラクタル次元が工程(b)において決定されたフラクタル次元よりも統計学的に有意に低いときに、診断は、アルツハイマー病を示す方法。
27.25に記載の方法であって、対象が既知の非アルツハイマー病細胞を提供するコントロール対象と年齢が一致する方法。
28. ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
(a)対象からの繊維芽細胞のネットワークの画像のフラクタル次元を算出すること;および
(b)工程(a)の結果を、既知の非アルツハイマー病細胞に関して独立して決定された
フラクタル次元と比較すること;
を含み、
ここで、工程(a)において算出されたフラクタル次元が、既知の非アルツハイマー病細胞に関するフラクタル次元よりも統計学的に有意に低いときに、診断は、対象におけるアルツハイマー病について陽性である方法。
29.28に記載の方法であって、対象が既知の非アルツハイマー病細胞を提供するコントロール対象と年齢が一致する方法。
30. ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
(a)外科用刃を用いて、対象の末梢皮膚繊維芽細胞のサンプルを得ること;
(b)インキュベータを用いてサンプルをある期間に亘りインキュベートすること;
(c)撮像装置を用いて、前記ある期間の終わりにサンプルの画像を得ること;
(d)コンピュータを用いて画像における繊維芽細胞のネットワークに関するフラクタル次元を算出すること;および
(e)工程(d)の結果と、既知の非アルツハイマー病細胞に関して独立して決定されたフラクタル次元とを比較すること;
を含み、
ここで、工程(d)において算出されたフラクタル次元が、既知の非アルツハイマー病細胞に関するフラクタル次元よりも統計学的に有意に低いときに、診断は、対象におけるアルツハイマー病について陽性である診断する方法。
31.30に記載の方法であって、サンプルがタンパク質混合物中でインキュベートされる方法。
32.31に記載の方法であって、タンパク質混合物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよび/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む方法。
33.32に記載の方法であって、タンパク質混合物が更に成長因子を含む方法。
34.32に記載の方法であって、細胞外マトリックスタンパク質が腫瘍から抽出される方法。
35.34に記載の方法であって、腫瘍がEHSマウス肉腫である方法。
36.ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下を含む方法;
(a)外科用刃を用いて対象の末梢皮膚繊維芽細胞のサンプルを得ること;
(b)インキュベータを用いてサンプルをある期間に亘りインキュベートすること;
(c)撮像装置を用いて、前記ある期間の終わりにサンプルの画像を得ること;
(d)コンピュータを用いて画像における繊維芽細胞のネットワークに関するフラクタル次元を算出すること;
(e)コンピュータを用いて、工程(d)のフラクタル次元を、種々の年齢のコントロール対象から得られた非アルツハイマー病細胞から生成されたフラクタル次元データを有す
るデータベースに入力すること;および
(f)コンピュータを用いて、工程(d)の算出されたフラクタル次元と、データベースのデータとを比較することにより、対象を診断すること。
37.36に記載の方法であって、サンプルが、ゼラチン様タンパク質混合物中でインキュベートされる方法。
38.37に記載の方法であって、ゼラチン様タンパク質混合物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよび/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む方法。
39.37に記載の方法であって、ゼラチン様タンパク質混合物が更に成長因子を含む方法。
40.38に記載の方法であって、細胞外マトリックスタンパク質が腫瘍から抽出される方法。
41.40に記載の方法であって、腫瘍がEHSマウス肉腫である方法。
42.種々の年齢のコントロール対象から得られた非アルツハイマー病細胞から生成されたフラクタル次元データのデータベースを有するコンピュータ読み取り可能媒体であって、
(a)画像のフラクタル次元を算出する;
(b)フラクタル次元を、フラクタル次元データのデータベースと比較する;および
(c)工程(b)の比較に基づいて、診断を出力する;
ための命令を含むコンピュータ読み取り可能媒体。
43. 以下を含む方法;
(a)ヒト対象からの皮膚細胞をある期間に亘り培養すること;
(b)細胞の繊維芽細胞のネットワークに関連する細胞形態学的特徴を測定すること;
(c)細胞形態学的特徴に関する演算を行うこと;および
(d)工程(c)の演算と、既知の非アルツハイマー病細胞に関連する独立して決定されたパラメータと比較すること。
44.43に記載の方法であって、細胞形態学的特徴が、繊維芽細胞凝集塊の数、繊維芽細胞凝集塊の大きさ、繊維芽細胞凝集塊の成長率およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
45.43に記載の方法であって、細胞形態学的特徴が、大きい凝集塊の存在または不在、凝集塊に対して付着した細胞の存在または不在、大きな凝集塊成長の存在または不在、凝集塊の数、以前に形成された凝集塊のネットワークからの残留エッジの存在または不在、細胞遊走の数、パーコレーションに近い細胞の存在または不在である方法。
46.43に記載の方法であって、工程(c)の演算が、それぞれの細胞形態学的特徴に対して離散値を割り当てること、および前記値を合計することを含む方法。
47.46に記載の方法であって、合計が使用されて、ADが診断またはADの不在が診断される方法。
48.43に記載の方法であって、細胞がタンパク質混合物中で培養される方法。
49.48に記載の方法であって、タンパク質混合物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよび/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む方法。
50.48に記載の方法であって、タンパク質混合物が更に成長因子を含む方法。
51.49に記載の方法であって、細胞外マトリックスタンパク質が腫瘍から抽出される方法。
52.51に記載の方法であって、腫瘍がEHSマウス肉腫である方法。
53. 対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養する工程;
(b)ある期間を越えて1つまたは1つ以上の細胞のフラクタル次元を測定する工程;
(c)時間の関数としてフラクタル次元をプロットしてフラクタル次元曲線を得る工程;
(d)フラクタル次元曲線を、非アルツハイマー病細胞および非アルツハイマー病認知症(非ADD)細胞から得たフラクタル次元曲線と比較する工程;および
(e)対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を診断する工程。
54.53に記載の方法であって、対象から得られた単数または複数の細胞から測定されたフラクタル次元曲線が、非アルツハイマー病細胞および非ADD細胞から得られたフラクタル次元曲線とは統計学的に有意に異なるときに、診断は、対象におけるアルツハイマー病について陽性である方法。
55.54に記載の方法であって、対象から得られた単数または複数の細胞が繊維芽細胞である方法。
56.53に記載の方法であって、診断が1つまたは1つ以上の更なる診断方法により確認される方法。
57.56に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の更なる診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
58. 対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養する工程;
(b)培養された細胞の1つまたは1つ以上の特徴に基づいて集積スコアを決定する工程;
(c)集積スコアを、非アルツハイマー病細胞について決定された集積スコアと比較する
工程;および
(d)対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を診断する工程。
59.58に記載の方法であって、集積スコアを算出するために使用される特徴が、凝集の大きさ、凝集に対する細胞の付着、凝集成長の兆候、凝集の数、ネットワーク内のエッジ、細胞遊走の兆候およびパーコレーション限界に対する近さ(または細胞密度)からなる群より選択される方法。
60.58に記載の方法であって、診断が1つまたは1つ以上の更なる診断方法により確認される方法。
611.60に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
62. 対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養する工程;
(b)遊走細胞の数を決定する工程;
(c)遊走細胞の数を、非アルツハイマー病細胞についての遊走細胞の数と比較する工程;および
(d)対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を診断する工程。
63.62に記載の方法であって、対象から得られた遊走細胞の数が、遊走非アルツハイマー病細胞の数よりも統計学的に有意に小さいときに、診断は、ADについて陽性である方法。
64.62に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
65.62に記載の方法であって、診断が1つまたは1つ以上の更なる診断方法により確認される方法。
66.65に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の更なる診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
67.対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養する工程;
(b)細胞の空隙性を決定する工程;
(c)細胞の空隙性を、非アルツハイマー病細胞の空隙性と比較する工程;および
(d)対象におけるアルツハイマーの存在または不在を診断する工程。
68.67に記載の方法であって、対象から得られた細胞の空隙性が、非アルツハイマー病細胞の空隙性よりも統計学的に有意に高いときに、診断は、ADについて陽性である
方法。
69.67に記載の方法であって、診断が1つまたは1つ以上の更なる診断方法により確認される方法。
70.69に記載の方法であって、1つまたは1つ以上の更なる診断方法が、集積スコアを決定することを含む方法、凝集の数あたりの面積を算出することを含む方法、細胞遊走分析を含む方法、フラクタル分析を含む方法および空隙性分析を含む方法からなる群より選択される方法。
71.67に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
72.アルツハイマー病を治療または予防するための1つまたは1つ以上の薬物候補を開発するために有用なリード化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法;
(a)細胞培養培地中で1つまたは1つ以上のAD細胞を培養する工程;
(b)AD細胞を化合物と接触させる工程;および
(c)AD細胞の1つまたは1つ以上の特徴が、化合物と接触されていない非アルツハイマー病細胞の特徴に類似するように変化しているか否かを決定する工程。
73.72に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
74.72に記載の方法であって、特徴がフラクタル次元である方法。
75.72に記載の方法であって、特徴が集積スコアである方法。
76.72に記載の方法であって、特徴が凝集の数あたりの平均凝集面積である方法。
77.72に記載の方法であって、特徴が細胞遊走である方法。
78.72に記載の方法であって、特徴が空隙性である方法。
79.対象におけるアルツハイマー病持続期間を決定する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得ること;
(b)既知のAD細胞株について、細胞遊走特性または凝集の数あたりの平均面積を測定すること;
(c)工程(b)において得られたデータを用いて検量線を作成すること;
(d)工程(a)において得られた細胞について、遊走特性または凝集の数あたりの平均面積を測定すること;および
(e)対象におけるAD病持続期間を決定すること。
80.79に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
81.79に記載の方法であって、10年または10年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
82.79に記載の方法であって、9年または9年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
83.79に記載の方法であって、8年または8年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
84.79に記載の方法であって、7年または7年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
85.79に記載の方法であって、6年または6年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
86.79に記載の方法であって、5年または5年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
87.79に記載の方法であって、4年または4年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
88.79に記載の方法であって、3年または3年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
89.79に記載の方法であって、2年または2年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定される方法。
90.79に記載の方法であって、1年または1年未満に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応を有すると同定される方法。
91. 対象におけるアルツハイマー病の存在と非アルツハイマー病認知症の存在とを識別する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得ること;
(b)ある期間を越えて1つまたは1つ以上の細胞のフラクタル次元を測定すること;
(c)フラクタル次元を時間の関数としてプロットしてフラクタル次元曲線を得ること;
(d)フラクタル次元曲線を、既知の非アルツハイマー病細胞、既知の非アルツハイマー病認知症(非ADD)細胞および既知のAD細胞から得られたフラクタル次元曲線と比較すること;および
(e)対象におけるADと非ADDとを識別すること。
92.91に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
93.対象におけるアルツハイマー病の存在と非アルツハイマー病認知症の存在とを識別する方法であって、以下を含む方法;
(a)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得ること;
(b)対象から1つまたは1つ以上の細胞を得て、組織培養培地中で1つまたは1つ以上の細胞を培養すること;
(c)遊走細胞の数を決定すること;
(d)遊走細胞の数を、既知の非アルツハイマー病細胞、既知のAD細胞および既知の非ADD細胞についての遊走細胞の数と比較すること;および
(e)対象におけるADと非ADDとを識別すること。
94.93に記載の方法であって、細胞が繊維芽細胞である方法。
Claims (12)
- アルツハイマー病診断の方法においてヒト対象由来の1つ以上の細胞を培養するためのタンパク質混合物の使用であって、前記診断方法は、細胞凝集、細胞遊走、フラクタル分析、空隙性分析、集積スコアおよびそれらの組み合わせから選択され;前記1つ以上の細胞は繊維芽細胞であり;前記タンパク質混合物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェン、成長因子および/またはそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む;使用。
- 診断方法が、細胞凝集であり、細胞凝集方法が、以下の工程を含む請求項1記載の使用;
(a)1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘り培養する工程;
(b)繊維芽細胞凝集の平均面積を決定し、平均面積を凝集の数で割って、凝集の数あたりの面積を得る工程;
(c)工程(b)の結果を、非アルツハイマー病繊維芽細胞を用いて決定された凝集の数あたりの面積と比較する工程。 - 診断方法が、細胞遊走であり、細胞遊走方法が、以下の工程を含む請求項1記載の使用;
(a)1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘り培養する工程;
(b)遊走繊維芽細胞の数を決定する工程;
(c)遊走繊維芽細胞の数を、非アルツハイマー病細胞についての遊走繊維芽細胞の数と比較する工程。 - 診断方法が、空隙性分析であり、空隙性分析方法が、以下の工程を含む請求項1記載の使用;
(a)1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘り培養する工程;
(b)繊維芽細胞の空隙性を決定する工程;
(c)前記繊維芽細胞の空隙性を、非アルツハイマー病繊維芽細胞の空隙性と比較する工程。 - 診断方法が、集積スコアであり、集積スコア方法が、以下の工程を含む請求項1記載の使用;
(a)1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘り培養する工程;
(b)凝集の大きさ、凝集に対する細胞の付着、凝集成長の兆候、凝集の数、ネットワーク内のエッジ、細胞遊走の兆候およびそれらの組み合わせからから選択される一以上の培養繊維芽細胞の特徴に基づいて集積スコアを決定する工程;
(c)前記集積スコアを、非アルツハイマー病繊維芽細胞の集積スコアと比較する工程。 - 診断方法が、フラクタル分析であり、フラクタル分析方法が、以下の工程を含む請求項1記載の使用;
(a)1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘り培養する工程;
(b)前記ある期間の終わりに繊維芽細胞の画像を得る工程;
(c)画像における繊維芽細胞のネットワークに関するフラクタル次元を決定する工程;(d)工程(c)の結果と、既知の非アルツハイマー病繊維芽細胞に関して独立して決定されたフラクタル次元とを比較する工程。 - 非アルツハイマー病繊維芽細胞が年齢を合わせた繊維芽細胞である請求項2〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞外マトリックス調製物が腫瘍から抽出される請求項1に記載の使用。
- 腫瘍がEHSマウス肉腫である請求項8に記載の使用。
- アルツハイマー病を治療または予防するための1つ以上の薬物候補を開発するために有用なリード化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法;
(a)細胞培養培地中でタンパク質混合物と共に1つ以上のAD繊維芽細胞を培養する工程;
(b)AD繊維芽細胞を化合物と接触させる工程; および
(c)AD繊維芽細胞の1つ以上の特徴が、化合物と接触されていない非アルツハイマー病繊維芽細胞の特徴に類似するように変化しているか否かを決定する工程、
ここで工程(a)のタンパク質混合物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよびそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む、上記方法。 - 対象におけるアルツハイマー病持続期間を決定する方法であって、以下を含む方法;(a)ヒト対象由来の1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘りタンパク質混合物と共に培養する工程;
(b)既知のAD細胞株について、細胞遊走特性または凝集の数あたりの平均面積を測定する工程;
(c)工程(b)において得られたデータを用いて検量線を作成する工程;(d)工程(a)において培養された繊維芽細胞について、遊走特性または凝集の数あたりの平均面積を測定する工程;および
(e)対象におけるAD病持続期間を決定する工程であって、ここで、10年、9年、8年、7年、6年、5年、4年、3年、2年、1年またはそれ未満から選ばれる時間量に亘りADを有すると同定された対象が、ADの治療に対して高い反応性を有すると同定され、
ここで工程(a)のタンパク質混合物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよびそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む、上記方法。 - ヒト対象におけるアルツハイマー病の存在と非アルツハイマー病認知症の存在とを識別する方法であって、以下を含む方法;
(a)ヒト対象由来の1つ以上の繊維芽細胞をある期間に亘りタンパク質混合物と共に培養する工程;および
(b)細胞遊走とフラクタル分析から選ばれる診断方法に基づいて、ヒト対象におけるADと非ADDとを識別する工程、
ここで工程(a)のタンパク質混合物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸化プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドジェンおよびそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックス調製物を含む、上記方法。
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