CN101061237A - 磷酸酶2a(pp2a)异常用于诊断与治疗阿耳茨海默病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及阿耳茨海默病的诊断方法以及用于治疗或预防阿耳茨海默病的化合物的筛选方法。该方法的依据是最近发现阿耳茨海默病细胞与对照细胞的蛋白磷酸酶2A(PP2A)功能及其相关分子事件存在差异。在一个实施方式中，与对照细胞相比，阿耳茨海默病细胞内的PP2A基因的基础表达水平存在差异。在另一个实施方式中，试验细胞和对照细胞相比，PP2A蛋白表达水平和酶活性存在差异。在另一个实施方式中，比较了对抑制PP2A功能的物质所发生反应的差异。另一个实施方式检测了磷酸化的Erk1/2，一种PP2A底物，在正常细胞和阿耳茨海默病细胞内的亚细胞分布的差异。检测外周组织中PP2A功能及相关事件的阿耳茨海默病特异性差异为用于早期诊断阿耳茨海默病的具有高度实用性的和高效的试验及诊断试验试剂盒提供了基础，同时也为鉴定用于药物开发的治疗性靶位提供了生化基础。

Description

磷酸酶2A(PP2A)异常用于诊断与治疗阿耳茨海默病

                                发明领域

本发明涉及诊断阿耳茨海默病的方法。该方法依据的是最新发现的阿耳茨海默病患者的细胞与对照细胞相比其磷酸酶2A蛋白(PP2A)表达或功能以及相关分子事件的差异。检测外周组织内阿耳茨海默病特异性的PP2A表达和功能的差异为具有极高实用性的及高效的检测以早期诊断阿耳茨海默病以及开发治疗药物提供了基础。

                                发明背景

蛋白磷酸化的异常，特别是磷酸酶通路受损而引起的蛋白磷酸化异常，被认为是阿耳茨海默病(AD)的分子病理学原因。这种异常的主要例子之一是组成神经原纤维缠结(NFT)的微管相关的tau蛋白的过度磷酸化，这代表了阿耳茨海默病的大脑内的一种最主要的损伤(Cummings等，1998；Jellinger和Bancher，1998)。在正常的神经元中，tau与微管蛋白结合，从而参与微管的组装。tau的磷酸化可抑制微管的结合，导致神经元骨架失去稳定性(Lee，1995；Billingskey和Kincaid，1997)。当tau过渡磷酸化时就失去了结合微管的能力，被认为会发生自身装配而形成双股螺旋状细丝(PHF)，这是细胞骨架蛋白组装过程异常的信号(Lee，1995；Billingsley和Kincaid，1997；Saito等，1995；Mandelkow等，1995)

在研究AD相关的分子异常发生的机制时，更多的注意力集中在调节tau磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶上。已经发现有几种蛋白激酶，其中包括糖原合成酶激酶-3(GSK-3)和有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶，可磷酸化tau。MAP激酶的正常活性可调控细胞的增殖和分化(Force和Bonventre，1998；Roovers和Assoian，2000)，在脑功能如学习和记忆中发挥重要作用(Valijent等，2001；Sweatt，2001；Zhao等，1999)。在另一方面，MAP激酶的异常持续活化可能是有害的，可引起tau的过度磷酸化和神经元的调亡(Guise等，2001)。MAP激酶家族的一个成员，细胞外信号调节激酶(Erk)的持续活化可被啮齿类海马(hyppocampal)神经元上的淀粉状蛋白诱导(Rapoport和Ferreira，2000；Dineley等，2001)，这会依次导致tau磷酸化水平升高、轴突变性和神经元死亡加速(Rapoport和Ferreira，2000)。另外，研究发现，一种高活性的炎症介质-缓激肽可诱导AD成纤维细胞内的Erk1/2持续磷酸化(Zhao等，2002)，活化的Erk2与神经原纤维缠结之间的关系在人脑中已得到证实(Knowles等，1999)。

磷酸酶活性的异常还在AD的蛋白磷酸化异常中起关键作用。在器官细胞内的四类主要丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(磷酸酶-1，2A，2B和2C)中，磷酸酶2A(PP2A)亚型主要表达在脑部，其靶位是细胞内蛋白如神经微丝(Saito等，1995；Janssens和Goris，2001)和微管相关蛋白(Mandelkow等，1995；Janssens和Goris，2001)的特异性局域化。通过结合并调节微管蛋白如tau和MAP2的磷酸化，PP2A在维持微管的稳定性中发挥关键作用(Mandelkow等，1995)。另外，试验表明PP2A可在体外和体内将过度磷酸化的tau的特异性位点去磷酸化(Goedert等，1992；Wang等，1995；Gong等，2000；Planel等，2001)。例如，PP2A可将已形成的PHF上过度磷酸化的tau去磷酸化，导致去磷酸化的tau从PHF上脱落下来，从而可以被蛋白酶水解(Wang等，1995)。健康的PP2A系统不仅是正常细胞内维持细胞骨架的稳定性所必须的，而且对于在病理条件如细胞应激和高钙毒性条件下矫正蛋白磷酸化水平的异常升高也是关键的。在AD晚期，PP2A基因的表达和活性明显降低(Gong等国，1995；Vogelsberg-Ragaglia等，2001)。在另一项研究中，突变形式的PP2A在鼠脑内的表达可引起PP2A活性的显著下降，诱导tau在特定的丝氨酸/苏氨酸残基上发生AD样过度磷酸化(Kins等，2001)。

研究证明，PP2A负责几类细胞上的MAP激酶的失活(Alessi等，1995；BraconiQuintaje等，1996；Chung和Brautigan，1999)，这说明PP2A可作为Erk2活性的负调节剂。最近的研究表明，PP2A导致的MAP激酶的失活可被PP2A的R2/B调节亚单位特异性调节(Silverstein等，2002)。我们以前的研究显示缓激肽刺激的Erk1/2磷酸化在AD细胞内异常持续(Zhao等，2002)。

相对早期的阿耳茨海默病(AD)患者脑内的主要病理标记是神经原纤维内的损伤，被称为神经原纤维缠结(NFT)。在AD中，95％的NFT损伤是由双股螺旋状细丝(PHF)形成的。PHF的主要成分是过度磷酸化的微管相关蛋白tau，它可引起细胞骨架蛋白的不稳定。磷酸酶2A(PP2A)是负责tau去磷酸化的一个主要酶。通过调节tau的去磷酸化，PP2A参与正常细胞内正常微管稳定性的维持以及在病理条件下抑制已形成的PHF内的tau异常磷酸化。PP2A还是使MAP激酶家族的一个成员-Erk1/2去磷酸化的两个磷酸酶中的一个。通过在促有丝分裂的刺激或炎症的刺激后及时使Erk1/2去磷酸化，PP2A在保护细胞免于调亡中发挥主要作用。

本发明部分基于发现了PP2A功能受损可能是AD发病的一个分子机制。由于不可能直接接近活人脑内的神经元，因此早期诊断AD是十分困难的。通过检测AD特异性的PP2A异常及其相关的分子事件，其中包括AD患者的皮肤细胞内Erk1/2的磷酸化和分布，本发明在某些实施方式中提供了具有高度实用性和高效率的检测方法用于AD的早期诊断，以及诊断检测试剂盒和开发治疗药物的方法。

                                发明概述

在一个实施方式中，本发明提供了利用人细胞诊断阿耳茨海默病的方法。本发明的基础在于发明者发现，与对照细胞相比，阿耳茨海默病细胞内的PP2A表达和功能及其相关的分子事件是不同的。需要强调的是，本发明的所有诊断方法都可以和WO02/067764所描述的任何方法联合使用，本文已完整纳入作为参考。在一个实施方式中，根据1型或2型细胞外信号调节激酶(Erk1/2)在用诸如缓激肽的试剂刺激后磷酸化水平异常增高而设计出的阿耳茨海默病的诊断方法，以及WO 02/067764所描述的阿耳茨海默病的相关诊断方法都可以和本文所描述的阿耳茨海默病的诊断方法组合使用。

本发明提供了多种与PP2A相关的标准以提高用于检测阿耳茨海默病的诊断试验的特异性和效率。对外周组织内阿耳茨海默病特异性的PP2A功能的差异的检测为鉴定用于治疗阿耳茨海默病的药物开发的治疗靶位提供了生物化学基础。

在一个方面，本发明涉及通过检测阿耳茨海默病细胞与对照细胞内PP2A基因表达水平的差异来诊断阿耳茨海默病的方法。这个实施方式的根据在于发明者发现，与年龄相匹配的个体的正常细胞相比，遗传性的AD和散发的AD来源的成纤维细胞内PP2A基因表达的基础水平明显升高。PP2A基因表达的检测优选采用反转录定量聚合酶链式反应。在一个优选实施方式中，定量检测试验细胞内编码PP2A的mRNA水平，并与非阿耳茨海默病对照细胞内所检测到的水平相比较。

在另一方面，本发明涉及通过检测试验细胞和对照细胞在用刺激蛋白质如Erk1/2磷酸化的化合物刺激以后其PP2A基因表达水平的差异来诊断阿耳茨海默病的方法，其中Erk1/2是信号转导级联反应的一部分，可在随后活化PP2A，其中包括PP2A基因的表达。接受刺激的细胞与未接受刺激的细胞相比PP2A的表达水平没有上升说明存在阿耳茨海默病。因为PP2A可直接导致Erk1/2去磷酸化，Erk1/2是PP2A的底物。PP2A还可以使其他许多蛋白去磷酸化。另外，除了PP2A以外，Erk1/2还可以被其他磷酸酶去磷酸化。但是，异常的PP2A活性和基因表达与阿耳茨海默病成纤维细胞受缓激肽刺激后的Erk1/2磷酸化水平的升高特异性相关。在一个具体实施方式中，刺激剂是缓激肽。其他可能的刺激剂包括而不限于胰岛素、佛波酯(phobol ester)、溶血磷脂胆碱、脂多糖、蒽环类抗生素柔红霉素(dannorubicin)和硫酸氧钒，它们都可以通过上游信号通路活化MAP激酶磷酸化。这个实施方式的根据在于发现了正常细胞可通过上调PP2A基因的表达来对化合物如缓激肽的刺激作出反应。与此相反，阿耳茨海默病细胞缺乏此正常反应。

在另外一个方面，本发明涉及通过检测阿耳茨海默病细胞与对照细胞内的PP2A蛋白表达水平和/或酶活性的差异来诊断阿耳茨海默病的方法，其中PP2A蛋白表达水平和/或酶活性下降则说明存在阿耳茨海默病。这个实施方式的基础在于发明者发现，与正常细胞相比，阿耳茨海默病细胞内的PP2A蛋白表达水平和PP2A酶活性都有显著下降。

在另一方面，本发明涉及在存在PP2A抑制剂的条件下通过评价细胞对试剂如缓激肽的刺激所作出的反应来诊断阿耳茨海默病的方法。在一个具体实施方式中，PP2A抑制剂是冈田酸。这个实施方式的基础在于发现了在冈田酸存在的条件下，正常细胞用缓激肽处理可使Erk1/2持续磷酸化，否则在缓激肽处理后约10分钟Erk1/2的磷酸化水平就会回到正常值。阿耳茨海默病细胞缺乏这种正常反应。

在另外一个方面，本发明涉及通过评价磷酸化的Erk1/2在细胞内的亚细胞分布来诊断阿耳茨海默病的方法。这个实施方式的基础在于发现了磷酸化的Erk1/2集中在正常细胞的细胞核内，而在阿耳茨海默病细胞内，磷酸化的Erk1/2分布在细胞核外区域(即胞质区室)。

本文所描述的方法可单独使用，也可以和诊断阿耳茨海默病的其他高特异性和高效检测方法联合使用。

在另一方面，本发明涉及利用本文所描述的检测方法筛选用于治疗或预防阿耳茨海默病的治疗性物质的方法。筛选方法的依据在于发明者发现了将在本文作进一步描述的阿耳茨海默病相关的PP2A异常及相关分子事件。

本发明还涉及包含用于执行本发明诊断方法的产品的试剂盒。

本发明用于诊断和治疗阿耳茨海默病的方法依据的是发明者的下列首次发现。

与年龄相匹配的个体的正常细胞相比，遗传性的和散发的AD患者的成纤维细胞内PP2A基因基础表达水平明显升高。

年龄相匹配的正常对照(AC)细胞经BK刺激后可上调PP2A基因的表达。而AD细胞缺乏此正常反应。

与AC细胞相比，AD细胞内的PP2A蛋白表达水平和酶活性都显著下降。

在PP2A抑制剂冈田酸(OA)存在的条件下用BK处理AC细胞可使Erk1/2持续磷酸化，否则在BK处理后约10分钟Erk1/2的磷酸化水平就会回到正常值。因为BK刺激的Erk1/2磷酸化在AD细胞内维持是由于对正常去磷酸化机制的抑制而引起的，所以OA的应用对Erk1/2磷酸化的程度没有更大的效应。因此，AC细胞中+OA/-OAErk1/2磷酸化的比例明显高于AD细胞。

当AC细胞内的Erk1/2被磷酸化时就会集中到细胞核内，而在AD细胞内，磷酸化的Erk1/2分布在细胞核外的区域。

上面所引用的AC和AD细胞之间的各种差异构成了用于诊断阿耳茨海默病的临床试验和诊断试剂盒的基础，以及本文所描述的用于治疗或预防阿耳茨海默病的化合物的筛选方法的基础。

在本发明一个优选实施方式中，人的皮肤成纤维细胞被用于本发明的试验和诊断分析，但也可以使用血细胞。在一个实施方式中，来自于同一个体的细胞在几个培养瓶中培养以进行不同的药理学处理。

在一个实施方式中，利用带384孔或96孔微板的Taqman实时PCR装置通过反转录定量PCR(RVQ-PCR)来检测PP2A基因的表达。在某些实施方式中，同时扩增在真核细胞内丰富表达的参考基因如GAPDH并用于标准化。

在一个实施方式中。利用Western印迹或ELISA来检测PP2A蛋白的表达水平和Erk1/2的磷酸化水平。

在一个实施方式中，分析了Erk1/2的核易位。细胞用BK刺激并通过免疫细胞化学或通过测定细胞核与胞质溶胶之间磷酸-Erk1/2(phospho-Erk1/2)的比例来确定活化的Erk1/2的细胞核分布。

已有研究表明丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A(PP2A)参与阿耳茨海默病(AD)的发病机制，因为PP2A在调节微管相关蛋白tau和有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶的去磷酸化中发挥关键作用。发明者发现PP2A负责细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)在被BK刺激活化后的去磷酸化。发明者还发现PP2A异常的基因表达和蛋白表达以及PP2A的异常活性促成了AD成纤维细胞内Erk1/2磷酸化的异常持续。用冈田酸抑制PP2A可使BK刺激后的Erk1/2磷酸化水平升高，并且持续时间更长，而PP2B和FK结合蛋白抑制剂FK506可抑制BK刺激的Erk1/2磷酸化。另外，磷酸化的Erk1/2主要集中在AC细胞的细胞核内，而在AD细胞内，磷酸化的Erk1/2主要分布在细胞核外的区域。发明者发现，在AD细胞内Erk1/2受BK刺激而活化后其去磷酸化被延迟是因为缺乏PP2A活性以及磷酸化的Erk1/2细胞核易位受损。

                            附图简述

图1A-1D：通过RTQ-PCR检测PP2A和GAPDH基因的表达：按照本文所描述的方法从人成纤维细胞培养物中提取总RNA并产生cDNA第一链。图1A和图1B显示的是PP2A和GAPDH标准曲线的线性图。图1C显示的是PP2A和GAPDH不同解链温度的解离曲线。在图1D中，具有预期序列大小的PP2A和GAPDH的最终PCR产物显示在TBE凝胶上(2道和4道)。在无反转录酶时样品经过反转录未扩增出PCR产物(1道和3道)。

图2A-2B：通过RTQ-PCR定量检测PP2A基因的表达：在实时PCR过程中，设备根据在同一轮PCR中同时扩增的每个基因的标准曲线来自动计算PP2A和GAPDHmRNA的水平。计算出了每个AC和AD细胞系的PP2A mRNA与GAPDH mRNA之比并显示在图2A中。利用t检验进行统计学分析发现AC和AD细胞之间的PP2AmRNA水平存在显著性差异(P＜0.01)。用10nM BK处理约10分钟时，AC细胞内的PP2A mRNA表达上调，而AD细胞未出现这种情况(图2B)。t检验表明AC和AD细胞之间存在明显的处理效应差异(^*P＝0.016)。

图3A-3B：AC和AD成纤维细胞内的PP2A蛋白水平和酶活性：按照本文所描述的方法制备AC和AD细胞的裂解物，用SDS样品缓冲液处理后分别用SDS-PAGE进行分析。利用抗PP2A抗体通过Western印迹技术测定每个样品内的PP2A表达水平。用密度测定仪扫描ECL所显示的PP2A的免疫反应信号并用UN-SCAN-IT软件定量。来自于同一个样品的膜联蛋白II的免疫反应信号用于PP2A信号的标准化。结果表明PP2A蛋白的表达水平在AC和AD细胞之间存在明显差异(P＜0.01，t检验)。图3B显示AD细胞的PP2A活性明显低于AC细胞(^*P＜0.001)。

图4：冈田酸(OA)对BK刺激的MAP激酶磷酸化的影响：AC细胞在存在或不存在约10nM OA的情况下用约10nM BK处理约5分钟和约10分钟。利用Western印迹检测所产生的Erk1/2磷酸化水平。Erk1/2的磷酸化水平用常规Erk1/2(总量)的磷酸化水平进行标准化。图的上半部分显示的是Western印迹的典型结果。下半部分的条形图总结了5个不同AD细胞的结果(^**P＜0.001)。BK，缓激肽；OA，冈田酸；P-Erk1/2，磷酸-Erk1/2。

图5A-5B：比较OA和FK506对AC和AD细胞内BK刺激的Erk1/2磷酸化的影响：AC和AD细胞在存在或不存在约10nM OA或约20nM FK506的情况下用约10nM BK处理约10分钟。按照本文所描述的方法检测所产生的每株细胞在每种条件下的Erk1/2磷酸化水平。图5A的左半部分显示的是典型的Western印迹结果，右边的条形图总结了9株AC细胞和9株AD细胞的结果。在图5B中，计算出了在存在OA或FK506时与不存在OA或FK506时的BK刺激的Erk1/2磷酸化水平的比例并进行了AC与AD细胞之间的比较。BK，缓激肽；OA，冈田酸；P-Erk1/2，磷酸-Erk1/2，常规Erk1/2。

图6A-6B：免疫细胞化学染色：(图6A)AC和AD细胞用约10nM BK处理约5分钟和约10分钟。在不同的培养板中，在BK处理前约10分钟，细胞与约10nM OA预孵育约15分钟。反应终止以后，按照本文所描述的方法，利用抗磷酸-Erk抗体通过免疫细胞化学染色来检测Erk1/2的磷酸化水平。放大图象中的箭头指向的是升高的Erk1/2磷酸化水平。(图6B)AC和AD细胞在存在或不存在约10nM OK的情况下用约10nM BK处理。然后用鼠抗磷酸-Erk1/2抗体和兔抗常规Erk1/2抗体同时对细胞进行免疫荧光双染色。然后再用荧光素标记的抗鼠(绿色)和德克萨斯红标记的(红色)抗兔二抗染色。BK，缓激肽；OA，冈田酸；P-Erk1/2，磷酸-Erk1/2；r-Erk1/2，常规Erk1/2。

                                发明详述

本发明涉及在人细胞内诊断阿耳茨海默病的方法，其依据是发现了阿耳茨海默病成纤维细胞内PP2A表达、功能及相关生化事件的特异性异常表现。以前的研究已经发现在阿耳茨海默病成纤维细胞内缓激肽可诱导Erk1/2持续磷酸化，这是WO02/067764的主题，本文已完整纳入作为参考。由于不可能直接接近活人脑组织内的神经元，因此早期诊断阿耳茨海默病是十分困难的。通过检测阿耳茨海默病特异性的PP2A异常及其相关的分子事件，其中包括阿耳茨海默病患者外周细胞内Erk1/2的磷酸化和分布，本发明提供了用于早期诊断阿耳茨海默病的高度实用性的、高灵敏的和高效的试验方法。另外，本文所描述的阿耳茨海默病特异性的差异为鉴定用于药物开发的治疗性靶位提供了基础。

本发明利用下列标准作为评价人外周细胞内阿耳茨海默病的各种诊断试验的基础：1)用或不用刺激PP2A底物磷酸化的试剂处理时PP2A在基因水平上的表达情况；2)用或不用刺激PP2A底物磷酸化的试剂处理时PP2A在蛋白水平上的表达情况以及PP2A的酶活性；3)能抑制PP2A功能的试剂对底物磷酸化水平的效应；以及4)PP2A的底物-磷酸化的Erk1/2在对照细胞和阿耳茨海默病细胞内分布(或易位)的差异。下面所描述的各个试验都可单独使用，也可以和其他方法组合使用以增加其特异性。

评价PP2A基因基础表达的方法

在一个实施方式中，本发明涉及诊断个体是否患有阿耳茨海默病的方法，该方法包括从该个体中分离细胞样品，然后检测细胞样品中PP2A基因的基础表达水平。这个实施方式的基础在于发明者发现，与从年龄相匹配的个体中分离的非阿耳茨海默病细胞相比，遗传性和散发性阿耳茨海默病患者成纤维细胞内的PP2A基因基础表达水平都明显升高。因此，PP2A基础水平升高则预示着存在阿耳茨海默病。在一个实施方式中，定量检测试验细胞内的编码PP2A的mRNA水平，并与对照细胞内的编码PP2A的mRNA水平进行比较。

在本发明的方法中，取自个体或患者的细胞可以是任何活细胞。优选的是皮肤成纤维细胞，但是其他外周组织细胞(即，中枢神经系统以外的细胞)也可用于本发明的试验中，只要这种细胞可以更方便地获得或处理。其他合适的细胞包括而不限于血细胞如红细胞和淋巴细胞，口腔粘膜细胞，神经细胞如嗅觉神经元，脑脊液、尿液和其他任何类型的外周细胞。另外，用于比较目的的细胞不一定必须来自健康供体。

细胞可以是新鲜的，也可以是培养的(参见，美国专利No.6,107,050，本文已完整纳入作为参考)。在一个具体实施方式中，通过皮肤穿孔来从受试者获得皮肤成纤维细胞。利用本文所描述的技术直接分析这些成纤维细胞，或者在细胞培养条件下培养。然后按照实施例或整个说明书所描述的方法分析所培养的成纤维细胞。可能还需要其他步骤来制备用于分析的其他类型的细胞，如口腔粘膜细胞、神经细胞如嗅细胞、血细胞如红细胞和淋巴细胞等。例如，血细胞很容易从外周静脉获取。然后用标准的程序(如，使用细胞分类仪、离心等)来分离细胞，随后进行分析。

在一个优选实施方式中，利用带384孔或96孔微板的Taqman^实时PCR仪通过反转录定量聚合酶链式反应(RVQ-PCR)来检测细胞样品中PP2A基因的表达水平。还应该同时扩增在真核细胞内丰富表达的参考基因如GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为标准化之用。根据本发明，与年龄相匹配的个体的正常细胞相比PP2A基因基础表达水平升高则说明存在阿耳茨海默病。

在用刺激PP2A底物磷酸化的试剂刺激细胞以后PP2A基因表达变化的评价方法

本发明的另一个实施方式涉及诊断阿耳茨海默病的方法，该方法包括步骤：从受试者获得细胞样品，使样品与刺激PP2A底物磷酸化的试剂接触，以及比较受刺激细胞内PP2A基因的表达水平与来自于个体的同一类型的未刺激细胞内的PP2A基因的表达水平。在一个优选实施方式中，所述试剂是缓激肽。在这个实施方式中，与未刺激细胞相比，刺激细胞内未发生缓激肽刺激的PP2A基因表达则说明存在阿耳茨海默病。这个方法的基础在于发明者发现，对照细胞可因缓激肽的刺激而作出上调PP2A基因表达的反应，而阿耳茨海默病患者的细胞缺乏这种正常的上调反应。其他可能的刺激剂包括而不限于胰岛素、佛波酯、溶血磷脂胆碱、脂多糖、蒽环类抗生素柔红霉素和硫酸氧钒。

缓激肽是在各种炎症发病过程中产生的具有高血管作用活性的九肽。缓激肽可与特异性的细胞膜缓激肽受体结合并活化之，从而激活细胞内事件的级联反应，导致被称为“有丝分裂原活化蛋白激酶”(MAPK)的磷酸化。蛋白质的磷酸化是在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基，是由被总称为蛋白激酶的各种酶所介导的。正常的磷酸化可调节蛋白质的功能，通常可活化蛋白质。内环境保持稳定要求磷酸化应该是瞬时的过程，这一过程可被使底物去磷酸化的磷酸酶逆转。磷酸化或去磷酸化的任何偏差都可能会中断通路和细胞功能。这种中断可能是某些脑疾病的基础。

在另一个具体实施方式中，缓激肽诱导的PP2A基因表达优选通过计算+缓激肽/-缓激肽(BK)的比例来评价。通过实时RT-PCR来检测BK刺激的和未刺激的细胞的PP2A基因表达水平。为了进行内部标准化，同时检测同一细胞样品的“持家”基因如GAPDH或S18 rRNA的基因表达。PP2A和持家基因的mRNA浓度可由实时PCR仪根据一系列稀释的cDNA样品的每个基因所产生的标准曲线自动计算出来。根据代表持家基因的浓度来标准化代表PP2A基因表达水平的数值：NR＝G_T/G_H，其中NR是标准化的基因表达水平；G_T是标准化前的靶基因(PP2A)表达水平数值；以及G_H是持家基因的表达水平数值。然后利用下列公式计算BK+和BK-细胞的NG比例：R＝NG_BK+/NG_BK-。其中R是+缓激肽/-缓激肽(BK)比例；NG_BK+是BK+细胞的标准化的PP2A基因表达值；NG_BK-是BK-细胞的标准化的PP2A基因表达值。

评价PP2A蛋白表达水平和酶活性的方法

本发明的另一个实施方式涉及诊断受试者是否患有阿耳茨海默病的方法，该方法包括从受试者获取细胞样品以及检测样品中PP2A蛋白的表达水平和/或PP2A酶活性的步骤。这个实施方式的基础在于发明者发现，与非阿耳茨海默病细胞相比，阿耳茨海默病细胞内的PP2A蛋白表达水平和酶活性都显著下降。

在一个优选实施方式中，细胞内存在的PP2A蛋白的表达水平可通过Western印迹技术来检测。可利用抗PP2A抗体(Biosource)来测定成纤维细胞内的PP2A蛋白表达水平。优选的是，测定同一个样品中另一个蛋白的表达水平作为参考蛋白用于标准化。可能的参考蛋白的例子包括而不限于膜联蛋白-II或肌动蛋白。在另一个实施方式中，以磷酸对硝基苯酯(PNPP)为底物根据一种操作程序(Pierce Biotechnology)来分析AD和AC细胞内的PP2A活性。酶活性分析在96孔微板上进行。将约10μl每种AC或AD细胞裂解物加入到约90μl反应混合物中开始反应，在约30℃的条件下孵育约15分钟，利用BioRad微板读数仪在420nM波长处检测。减去存在约10nMPP2A抑制剂冈田酸的反应所得到的数值，根据一系列已知浓度的纯化的PP2A蛋白所绘制的标准曲线来计算PP2A的活性。

在一个实施方式中，按照如下过程进行ELISA：1)将处理后的成纤维细胞裂解物以双复孔或三复孔的形式加到预先包被抗Erk抗体的96孔微板上。2)微板孔内的样品在室温下孵育约2小时。3)吸去样品并用以磷酸缓冲盐(PBS)为基础的洗涤缓冲液洗涤孔。4)在每个孔中加入工作稀释浓度的抗磷酸-Erk1/2或抗常规Erk1/2抗体，并在室温下孵育约1小时。5)吸去液体并用洗涤缓冲液洗涤孔。6)在每个孔中加入工作稀释浓度的连接有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗，并在室温下孵育约30分钟。7)吸去液体并用洗涤缓冲液洗涤孔。8)加入经过稳定的色原体如二氨基联苯胺(DAB)，并在室温下孵育约30分钟。9)加入终止液，然后在450nm处检测。在标准化后分析ErK1/2的磷酸化：NR＝A_P/A_R。其中NR＝标准化后的比例；A_P是磷酸-Erk1/2的吸光度值；A_R是总(常规)Erk1/2的吸光度值。

利用抑制PP2A的试剂和刺激PP2A底物磷酸化的试剂诊断阿耳茨海默病的方法

在另一个实施方式中，本发明涉及诊断阿耳茨海默病的方法，该方法包括步骤：从受试者获取细胞样品，在第二试剂PP2A抑制剂存在的条件下使细胞与刺激PP2A底物磷酸化的第一试剂接触，在开始接触步骤后的预定时间点上测定样品细胞内PP2A底物的磷酸化水平，以及将底物磷酸化的水平与在相同预定时间点上所测得的已知的非阿耳茨海默病细胞内的底物磷酸化水平进行比较，其中，与已知的非阿耳茨海默病细胞相比，样品细胞未对PP2A抑制剂产生反应则说明存在阿耳茨海默病。

这个实施方式的基础在于发明者发现，在PP2A抑制剂如冈田酸存在的条件下用物质如缓激肽处理非阿耳茨海默病细胞可使Erk1/2持续磷酸化，否则正常细胞经缓激肽刺激后约10分钟其磷酸化就会回到基础水平。因为缓激肽刺激的Erk1/2磷酸化在阿耳茨海默病细胞内持续维持是由于对正常去磷酸化机制的抑制而引起的，所以PP2A抑制剂如冈田酸的应用对Erk1/2磷酸化的程度没有更大的效应。因此，非阿耳茨海默病细胞中+冈田酸/-冈田酸Erk1/2磷酸化的比例明显高于阿耳茨海默病细胞。

在一个优选实施方式中公开了诊断受试者是否患有阿耳茨海默病的方法，其中的方法包括从受试者获取细胞样品；使细胞与刺激PP2A底物磷酸化的第一试剂接触(在某些实施方式中，该试剂是缓激肽，PP2A底物是Erk1/2)，其中的接触是在存在或不存在第二试剂PP2A抑制剂的条件下进行的(在某些实施方式中，第二试剂是冈田酸)；在开始接触步骤后的预定时间点上(在优选的实施方式中是在约5分钟、10分钟或15分钟后)测定所述对照细胞和所述细胞样品内PP2A底物的磷酸化水平，以及比较存在和不存在所述第二试剂PP2A抑制剂的条件下所得到的所述细胞样品内的PP2A底物的磷酸化水平，其中，在存在和不存在所述第二试剂时PP2A底物的磷酸化程度没有明显差异则说明作为细胞来源的受试者存在阿耳茨海默病。对照细胞则显示在存在和不存在所述第二试剂PP2A抑制剂时PP2A底物的磷酸化水平存在统计学意义上的差异。

在一个优选实施方式中，利用抗磷酸-Erk1/2抗体通过Western印迹技术分析Erk1/2的磷酸化。磷酸化的Erk1/2的免疫反应信号水平通过密度测定仪扫描来定量。磷酸-Erk1/2信号的平均密度用总Erk1/2信号的平均密度来标准化，后者是利用抗常规Erk1/2抗体通过另一个Western印迹试验从同一细胞裂解样品中得到的。标准化的公式为NR＝D_P/D_R。其中NR(标准化的比例)代表Erk1/2的磷酸化程度；D_P是磷酸-Erk1/2的平均密度；D_R是从同一样品的Western印迹上检测到的Erk1/2总量的平均密度。然后利用下列公式计算存在和不存在冈田酸时的NR比例(测试比例)：TR＝NR_OA+/NR_OA-。其中TR是测试比例，NR_OA+是OA存在时的标准化比例，NR_OA-是OA不存在时的标准化比例。

磷酸化Erk1/2在细胞内的分布情况的检测方法

能够定量分析磷酸化的Erk1/2的分布情况的许多方法都值得考虑，并且可包含在本发明的范围之内。下面所描述的是两个优选的方法。在优选方法1)中：BK刺激后的Erk1/2磷酸化水平可用免疫细胞化学技术来检测，利用荧光显微镜来获取信号。代表细胞核和胞质溶胶内磷酸-Erk1/2信号的荧光强度可用计算机软件如Metamorph或NIH Image分别定量。在细胞核中的磷酸Erk1/2(phospho Erk1/2)与在胞质溶胶中的磷酸Erk1/2之比可用DR＝PN/PC计算。其中DR是磷酸化的Erk1/2的分布比例；PN是细胞核内的磷酸-Erk1/2，PC是胞质溶胶内的磷酸-Erk1/2。在优选方法2)中：经过BK刺激以后，将细胞分离成细胞核组分和胞质溶胶组分。通过Western印迹技术或ELISA分别检测这些组分内的Erk1/2磷酸化水平。来自于细胞核的p-Erk1/2与来自于胞质溶胶的p-Erk1/2之比可用DR＝D_PN/D_PC计算。其中DR是分布比例；D_PN是来自于细胞核的磷酸-Erk1/2的平均密度测定值；D_PC是来自于胞质溶胶的磷酸-Erk1/2的平均密度测定值。

在另一个实施方式中，本发明提供了非阿耳茨海默病和阿耳茨海默病细胞内磷酸化的Erk1/2的亚细胞分布(或异位)差异的检测方法。这个实施方式的基础在于发明者发现，在对照细胞内，磷酸化的Erk1/2主要集中在细胞核，而在阿耳茨海默病细胞内，磷酸化的Erk1/2则分布在细胞核外区域(即，胞质溶胶)。根据本发明，Erk1/2的细胞核异位可通过如下步骤检测：用刺激Erk1/2磷酸化的试剂刺激细胞，优选通过免疫细胞化学技术或通过测定细胞核和胞质溶胶之间的磷酸化的Erk1/2之比来分析活化的(即，磷酸化的)Erk1/2的细胞核分布情况。磷酸化的Erk1/2的细胞核异位情况也可以通过Western印迹技术和ELISA来分析。检测磷酸化的Erk1/2的其他方法也值得考虑，其中包括而不限于流式细胞术、蛋白激酶分析、利用放射性标记的磷酸基进行免疫沉淀、质谱、利用荧光标记的抗体进行荧光偏振能量转移、利用粘附有磁珠的抗体进行免疫沉淀、利用MAP激酶的底物进行亲和分析、RNA印迹、一维或二维凝胶色谱、随后可进行可选的磷蛋白染色或检测、酶活性分析。

本发明的免疫分析可以是免疫荧光分析、放射免疫分析、Western印迹分析、酶免疫分析、免疫沉淀、化学发光分析、免疫细胞化学分析、点杂交或狭缝杂交分析等(参见《免疫分析的原理和实践》(Principles and Practice of Immunoassay)(1991)，Christopher P.Price和David J.Neoman(编辑)，Stockton Press，New York，New York，Ausubel等(编辑)(1987)，《当代分子生物学手册》(″Current Protocols in MolecularBiology″)John Wiley和Sons，New York，New York)。检测可通过比色法或放射活性法或本领域技术人员所熟知的其他任何常规方法。本领域熟知的用于ELISA的标准技术描述于《免疫诊断方法》(Methods in Immunodiagnosis)，第二版，Rose和Bigazzi编辑，John Wiley和Sons，New York 1980以及Campbell等，《免疫学方法》(Methodsof Immunology)，W.A.Benjamin，Inc.，1964，二者都已纳入本文作为参考。这些分析方法可以是如本领域所描述的直接的、间接的、竞争性的或非竞争性的免疫分析方法(参见《免疫分析的原理和实践》(″Principles and Practice of Immunoassay)(1991)，Christopher P.Price和David J.Neoman(编辑)，Stockton Press，NY，NY；Oellirich，M.1984.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22：895-904；Ausubel等(编辑)(1987)，《当代分子生物学手册》(″Current Protocols in Molecular Biology″)John Wiley和Sons，NewYork，New York)。

如上文所描述的，取自于被诊断的患者的细胞可以是任何细胞。可使用的细胞的例子包括而不限于成纤维细胞、口腔粘膜细胞、血细胞如红细胞、淋巴细胞和淋巴样干细胞、以及神经细胞和表达Erk1/2的其他任何细胞。尸检样品和病理样品也可以使用。包含这些细胞的组织也可以使用。细胞可以是新鲜的、培养的或冷冻的。从细胞或组织分离的蛋白样品可立即用于诊断分析，也可以冷冻起来在以后使用。在一个优选实施方式中使用的是成纤维细胞。成纤维细胞通过皮肤打孔活组织检查来获取。

蛋白可通过本领域技术人员熟知的常规方法从细胞分离。在一个优选实施方式中，洗涤分离自患者的细胞，在磷酸缓冲盐(PBS)中使其成团块。然后用“匀浆缓冲液”洗涤团块，匀浆缓冲液包含50nM NaF、1mM EDTA、1mM EGTA、20μg/ml亮肽素、50μg/ml抑肽素、10mM TRIS-HCl，pH＝7.4，通过离心使其再成为团块。弃去上清，加入“匀浆缓冲液”，然后超声破碎团块。所得到的蛋白提取物可马上使用，或者储存在-80℃用于以后的分析。

在本发明的这个方法中，公开的免疫分析所使用的抗体可以是单克隆或多克隆起源的抗体。制备抗体所使用的磷酸化的或非磷酸化的Erk1/2蛋白或其片段可以是天然的，也可以是重组的，或者通过化学合成方法制备。天然的Erk1/2蛋白可通过常规方法从生物样品中分离。可用于分离Erk1/2蛋白的生物样品的例子包括而不限于皮肤细胞如成纤维细胞、成纤维细胞系如阿耳茨海默病成纤维细胞系以及可从CoriellCell Repositories(Camden，NJ.)购买并列于国立衰老研究所(National Institute ofAging)1991细胞系目录和国立普通医学科学研究所(National Institute of GenerlaMedical Sciences)1992/1993细胞系目录[(NIH Publication 92-2011(1992)]的对照成纤维细胞系。

还应该了解的是，本发明涉及可用于完成上述各种诊断试验的试剂盒。如上所述，试剂盒可包含单次诊断试验或本文所描述的试验的任意组合。这种试剂盒可包含能够识别PP2A或磷酸化的PP2A底物的抗体以及可刺激PP2A底物磷酸化的各种化合物(例如，缓激肽)和/或PP2A功能抑制剂(如，冈田酸)。抗体可以是多克隆的，也可以是单克隆的。试剂盒还包含有关抗体或其他组分如何用于诊断试验的说明书。试剂盒还可以包含用于完成诊断试验的其他试剂，如PP2A编码基因和“持家基因”如GAPDH编码基因特异性的用于PCR或RT-PCR的寡核苷酸引物。试剂盒还可以包含缓冲液、二抗、对照细胞等。

用于鉴定治疗性化合物的筛选方法

在另一个实施方式中，本文所描述的诊断试验还可用于筛选和鉴定用于治疗或预防阿耳茨海默病的物质。根据本实施方式，可逆转或改善本文所描述的阿耳茨海默病相关差异(即，恢复到正常细胞的水平)的物质可被鉴定和选择为具有阿耳茨海默病潜在治疗价值的物质。

例如，一种筛选治疗性物质的方法包括步骤：使阿耳茨海默病患者来源的样品细胞与待筛选物质接触，检测样品中PP2A基因的表达水平，其中与阿耳茨海默病细胞相关的PP2A基因表达水平异常升高受到抑制则说明该物质具有治疗或预防阿耳茨海默病的潜在价值。AD细胞内PP2A基因表达水平的升高是对降低的PP2A蛋白表达水平和受损的PP2A活性的细胞补偿。可提高蛋白表达水平或增加PP2A活性的物质都会抑制Erk1/2的持续磷酸化，因此也有治疗AD的潜在价值。如果PP2A蛋白和活性都升高，则PP2A基因升高的表达水平可恢复到正常值。

在本文所描述的化合物筛选方法的另一个优选实施方式中，阿耳茨海默病相关的异常是指细胞与刺激Erk1/2磷酸化的试剂接触以后未发生PP2A表达水平升高的情况。在这个实施方式中，能够在细胞与刺激Erk1/2磷酸化的试剂如缓激肽接触后使其中的PP2A表达水平从新升高的化合物都可被鉴定为具有治疗或预防阿耳茨海默病的潜在价值的化合物。

在本文所描述的化合物筛选方法的另一个优选实施方式中，阿耳茨海默病相关的异常是指与非阿耳茨海默病对照细胞相比PP2A蛋白表达水平或PP2A酶活性下降。在这个实施方式中，能够使分离自阿耳茨海默病患者的细胞内的PP2A蛋白表达水平或PP2A酶活性恢复到正常值的化合物可被鉴定为具有治疗或预防阿耳茨海默病的潜在价值的化合物。

在本文所描述的化合物筛选方法的另一个优选实施方式中，阿耳茨海默病相关的异常是指在冈田酸存在的条件下试验细胞用缓激肽处理后缺乏正常反应。在这个实施方式中，能够使分离自阿耳茨海默病患者的细胞恢复正常反应的化合物可被鉴定为具有治疗或预防阿耳茨海默病的潜在价值的化合物。

在本文所描述的化合物筛选方法的另一个优选实施方式中，阿耳茨海默病相关的异常是指磷酸化的Erk1/2分布在细胞核外区域。在这个实施方式中，能够使磷酸化的Erk1/2正常分布在分离自阿耳茨海默病患者的细胞的细胞核内的化合物可被鉴定为具有治疗或预防阿耳茨海默病的潜在价值的化合物。

本领域的技术人员将会很容易地认识到本发明所描述的阿耳茨海默病相关的各种差异可被采用以形成用于鉴定治疗或预防阿耳茨海默病的治疗性物质的筛选方法或试验的基础。另外，这些方法可利用本领域熟知的和/或本文以描述的以及实施例中所描述的任何技术或材料。

发明者发现来自于AD患者的成纤维细胞的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A有缺陷。这种缺陷包括PP2A在基因和蛋白水平上的异常表达以及其磷酸酶活性有缺损。AD和AC细胞内PP2A基因的表达可用RTQ-PCR来检测，这是一种高灵敏性的比较mRNA水平的方法(Heid等，1996；Winer等，1999；Livak和Schmittgen，2001)。为了使因cDNA拷贝起始量的可能差异而造成的样品与样品之间的变异降到最低，利用GAPDH的mRNA水平对PP2A基因的表达水平进行标准化。由于经过反转录的样品中不含基因组DNA，因此扩增出的所有cDNA拷贝都应该是来自于从AD和AC细胞制备的mRNA。PCR产物是PP2A和GAPDH特异性的，这可从其特征性解链曲线(TM)以及TBE凝胶上具有预期序列大小的PP2A或GAPDH的单一PCR产物上得到证明(图1)。

AD细胞内的PP2A基因基础表达水平明显升高。但是，较高的PP2A mRNA基础水平并不必然导致较高的蛋白表达水平，也不一定说明具有正常的PP2A功能。实际上，在AD细胞内PP2A的量明显低于对照细胞，PP2A的酶活性也是如此。由于从病因学上说AD是异质性疾病，因此可能有多种因素参与导致AD细胞内PP2A异常表达和异常活性的上游分子机制。AD细胞内PP2A蛋白的表达水平下降可能是在蛋白合成过程中翻译后修饰受损的结果，和/或因异常升高的蛋白水解作用或不正确的蛋白折叠而造成的PP2A蛋白稳定性下降的结果，其中异常升高的蛋白水解作用或不正确的蛋白折叠都可加速PP2A蛋白的降解。AD细胞内的PP2A蛋白表达水平降低可导致PP2A活性的缺损。另外，酶特性的改变如调节区的底物结合亲和力和/或催化亚单位活性的改变也是导致PP2A功能缺损的因素。

AD所发生的上游分子事件的其他异常，如钙平衡紊乱，也是大家所熟知的。现已鉴定出在PP2A的B/PR72调节亚单位上有两个CA²⁺-结合EF手臂基序，该基序参与PP2A活性的调节(Janssens等，2003)。在一个体外系统中，这些作者的研究表明低CA²⁺浓度可增强PP2A的活性，而高CA²⁺浓度可抑制其活性(Janssens等，2003)。已经发现在AD不同类型的细胞内都存在异常增加的细胞内钙信号，其中包括早老蛋白-1突变引起的那些信号(Sheehan等，1997；Etcheberrigaray等，1998；Putney，2000；Yoo等，2000；Mattson等，2001)。细胞内升高的CA²⁺水平和氧化应激一起成为导致PP2A功能缺损的关键因素，上游蛋白激酶如MEK、PKC和PP60-src的活性升高导致了MAP激酶活性的升高及持续。例如，异常升高的pp60-src活性不仅可以促使MAP激酶磷酸化(Zhao等，2002)，而且还可以抑制PP2A的活性(McMahon等，2001)，二者对AD细胞内Map激酶通路的失调都有影响。

从死后尸检结果来看，AD大脑内PP2A mRNA的表达水平下降(Gong等，1995；Vogelsberg-Regaglia等，2001)。在AD细胞内，本文所描述的PP2A mRNA基础表达水平升高可能反映了对其蛋白表达缺陷和酶功能缺陷的细胞补偿机制。这种补偿现象在活的AD细胞内也存在，如本文所描述，但是在AD的最后阶段这种现象可能会完全消失，因此在死后尸检的AD大脑内所检测到的PP2A mRNA水平可能较低。

BK是一个高活性的炎症介质，可刺激一系列细胞内CA²⁺依赖性的信号转导过程，其中包括蛋白的磷酸化和诱导基因表达的转录因子的活化(Connolly，1998；Liebmann，2001)。作为正常反馈机制的一部分，磷酸酶可因蛋白的磷酸化而被活化，从而对细胞刺激作出反应，特殊磷酸酶的基因表达水平上调以便于为细胞提供足够的酶。本发明的发明者已经证实，当AC细胞受到BK的刺激约10分钟后，可检测到PP2A基因表达水平明显升高，说明细胞对药理刺激信号作出了正常的细胞反应。然而，AD细胞内未出现这种反应，因为经BK刺激后PP2A mRNA的表达水平没有发生变化。PP2A的基因表达应对刺激而发生调节的能力的丧失导致了AD发病期间PP2A功能的缺损。

BK可引起Erk1/2的磷酸化水平升高。在AC细胞内，这种升高的Erk磷酸化水平可持续数分钟，在刺激后约10分钟恢复到正常水平。然而，在AD细胞内，Erk的磷酸化水平可持续维持在高水平(Zhao等，2002)。PP2A的功能异常可导致AD相关的Erk1/2磷酸化增强。本发明的发明者证实了PP2A抑制剂(其中包括OA)和PP2B抑制剂FK506对缓激肽刺激后的Erk1/2磷酸化的影响。OA对PP2A的抑制可升高Erk1/2的磷酸化水平。AC细胞发生这种升高的程度明显高于AD细胞，在AC细胞内+OA/-OA的比例更高。由于约10nM的OA就可以特异性地抑制PP2A(Nagao等，1995；Sheppeck等，1997；Fernandez等，2002)，而FK506不能抑制Erk1/2的磷酸化，因此可以证明，在成纤维细胞内，是PP2A而不是其他磷酸酶如PP1或PP2B负责BK诱导的Erk1/2磷酸化的灭活。因而，AD细胞内由BK刺激所诱导的Erk1/2持续磷酸化是导致PP2A功能缺损的原因。

当细胞用FK506处理时，在AD细胞内由BK所诱导的Erk1/2持续磷酸化现象消失。除了PP2B以外，FK506的主要靶位还包括代表一类肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)的FK结合蛋白(FKBP)。以前的研究表明FK506可促使MAP激酶磷酸酶1表达并可增强其活性，导致Erk磷酸化水平下降，下游信号减弱(Winter等，1998；Zawadzka和Kaminska，2003)。有研究表明，FK506和其他FKBP配基可通过抑制PPIase的活性来发挥神经保护功能(Gold，1999，2000；Christner等，2001；Klettner等，2001)。Erk1/2是调节各种细胞事件的信号转导通路中的关键角色。已有报道证实，有丝分裂原刺激所引起的Erk活化可导致激酶从胞质溶胶转移到细胞核内(Chen等，1992；Gonzales等，1993；Lenormand等，1993；Brunet等，1999；Ferrell，1998；Lewis等，1998)，在其中参与基因转录过程的调节(Treisman，1996)。细胞核也是通过将Erk1/2与其上游的活化激酶MEK、其胞质溶胶活化剂进行细胞核隔绝，以及被特异性细胞核磷酸酶去磷酸化而使Erk1/2失活的关键位点(Volmat等，2001)。Erk进入细胞核是由几种机制介导的，其中包括Erk单体的被动扩散、Erk二聚体的主动运输以及通过Erk与核孔复合体的直接相互作用(Khokhlatchev等，1998；Adachi等，1999；Matsubayashi等，2001)。本发明的发明者在本文中描述了免疫细胞化学染色结果，结果表明活化的Erk1/2集中在AC细胞的细胞核内，而主要的磷酸-Erk1/2依然保持在AD细胞的细胞核外区域。本发明还涉及磷酸化的Erk1/2的不同亚细胞分布，结果表明活化的Erk1/2进入细胞核的机制在AD细胞内是受损的。

本发明利用了发明者的发现，即AD患者来源的成纤维细胞内PP2A的功能缺损，其中包括其基因表达和蛋白合成以及其酶活性。PP2A的这种缺损导致了AD细胞内BK诱导的Erk1/2磷酸化持续维持。PP2A的功能异常也发生在AD脑的神经元上，导致其无法有效逆转引起NFT损伤的tau蛋白的过度磷酸化。脑内PP2A的缺损还可导致Erk的灭活被延迟，这又进一步导致了更强的tau磷酸化。其他磷酸酶，包括双酪氨酸磷酸酶、负责灭活Erk的其他主要磷酸酶，的功能异常也会导致AD相关的Erk信号转导功能异常。

本申请所提及的所有参考文献、专利和出版的出版物都已完整纳入本申请作为参考。

下面的实施例可用于进一步阐释本发明，但并非以任何方式构成对本发明的范围的限制。

                            实施例

实施例1：AD细胞内PP2A mRNA水平的变化

利用RTQ-PCR定量分析PP2A基因的表达，以GAPDH作为参考基因进行标准化。如图1A和1B所示，利用实时PCR，PP2A和GAPDH引物以及一系列稀释的人成纤维细胞cDNA模板分别产生了一条扩增序列的线性标准曲线，试验设双份。根据PP2A、GAPDH和水的不同解离曲线(图2C)绘制的特异性解链温度(MT)证明了每种PCR产物的高度特异性。这种特异性可被图1D所示的结果确证，其中PP2A和GAPDH的PCR终产物在10％TBE凝胶上电泳。结果显示每个基因都有一条具有预期序列大小的条带(2道和4道)，但是在体外反转录过程中未添加反转录酶的样品未检测到条带(1道和3道)。这说明所扩增出的PP2A和GAPDH的PCR产物不是来自于基因组DNA。为了检测PP2A基因的表达，来自于19株AD和17株AC细胞系的成纤维细胞cDNA模板用于PCR扩增，每种模板都设双份。每株细胞系的PP2A和GAPDH表达水平可根据用AC和AD样品同时运行而得到的其标准曲线自动计算出来。PP2A基因的表达水平用每株细胞系的GAPDH的表达水平进行标准化，所得到的比例用t检验进行比较。如图2A所示，与AC细胞相比，AD细胞内的PP2A mRNA基础水平从统计学意义上来说更高(P＜0.01，t检验)。用10nM缓激肽(BK)处理成纤维细胞约10分钟可显著提高AC细胞内的PP2A mRNA水平。但是，AD细胞缺乏这种BK刺激的PP2A基因表达上调(图2B)。t检验分析表明存在明显的组间差异(P＝0.016)。这些结果说明，尽管PP2A mRNA的基础水平较高，但是PP2A对BK刺激而反应出的动态基因表达在AD细胞内则是缺损的。

实施例2：AD细胞内PP2A蛋白水平和酶活性的变化

为了确定AD细胞内PP2A蛋白的表达水平和功能是否能够反映其基因表达的变化，比较PP2A蛋白表达水平和活性在AC和AD细胞之间的差异。利用Western印迹所检测到的AD细胞内的PP2A蛋白量明显低于AC细胞内的PP2A蛋白量(P＜0.01)。PP2A表达量的这种降低并不是由于加载到SDS凝胶上的AD细胞来源的蛋白量较少，因为来自于同一个样品的参考蛋白膜联蛋白II的水平与AC细胞来源的膜联蛋白II水平并没有明显差异(图3A)。当用加载到SDS凝胶上的总蛋白对PP2A免疫反应信号进行标准化后，AD细胞内的PP2A下降程度是一致的。另外，与AC细胞相比，AD细胞内的PP2A活性也明显下降(P＜0.001)(图3B)。

实施例3：PP2A参与BK刺激后的Erk1/2的去磷酸化

为了检测PP2A是否参与了Erk1/2的去磷酸化，来自于5个不同个体的AC细胞用PP2A抑制剂冈田酸处理，冈田酸的浓度刚刚可以抑制PP2A(Nagao等，1995；Sheppeck等，1997；Fernandez等，2002)。利用磷酸-Erk1/2和常规Erk1/2的特异性抗体通过Western印迹确定Erk1/2磷酸化水平。在BK刺激后约5分钟Erk1/2的磷酸化水平升高，但是到约10分钟时恢复到对照水平(图4)，这可能是由细胞内的正常去磷酸化机制造成的。但是，在约10nM OA存在的条件下，这种Erk1/2去磷酸化明显被抑制(图4)。单向方差分析(one-way ANOVA)表明存在明显的处理效应(P＜0.001)。这些结果说明PP2A负责Erk1/2被BK刺激而磷酸化后的去磷酸化。

实施例4：PP2A功能缺损促成了AD细胞内Erk1/2的持续磷酸化

为了检测PP2A的缺损是否促成了BK刺激后Erk1/2磷酸化的持续维持，我们在存在或不存在10nM OA的条件下用BK处理AC和AD细胞约10分钟。按照上面描述的方法测定Erk1/2的磷酸化水平。9株AD和AC细胞系的结果清楚地表明(图5A)，在缓激肽刺激后约10分钟，OA可抑制AC细胞内的ErK1/2磷酸化。而对于AD细胞来说，在缓激肽刺激后约10分钟，Erk1/2的磷酸化依然维持较高水平。加入OA并不能使这些细胞内的Erk1/2磷酸化水平升高。+OA/-OA的比例在AC和AD细胞之间存在明显的差异。这些结果说明AD细胞内BK刺激诱导的Erk1/2磷酸化持续维持是由PP2A的功能造成的。

另一方面，PP2B抑制剂FK506的存在并不能引起AC细胞内的BK诱导的Erk1/2磷酸化水平显著升高(图5A)。还应该注意的是，在存在FK506时，AD细胞内的BK诱导的Erk1/2磷酸化持续维持现象消失(图5A)。

实施例5：免疫细胞化学

不同处理条件下磷酸-Erk1/2所产生的免疫反应信号显示在图6中。图6A显示的是在存在或不存在OA的条件下AC和AD细胞内BK诱导的Erk1/2磷酸化的时间过程，二者的Western印迹结果是一致的(参见图4)。图6B显示的是同一个AC或AD细胞内Erk1/2磷酸化与常规Erk1/2信号的比较，其结果与图5所示的Western印迹结果一致。但应当注意的是，免疫细胞化学染色所观察到的Erk1/2基础磷酸化水平在AD细胞内要高于在AC细胞内，这与Western印迹的结果不一致，后者显示AD和AC细胞之间的Erk1/2基础磷酸化水平没有明显差异。更有意义的是，我们还注意到磷酸化的Erk1/2的亚细胞分布在AD和AC细胞之间存在差异。在AC细胞内，磷酸化的Erk1/2主要集中在细胞核内，而在AD细胞内，磷酸化的Erk1/2更多地弥散分布在细胞核旁和胞质溶胶区域。这一点在用BK活化Erk1/2时显得更加清楚(见图6A，BK，约5分钟)。这些结果说明活化的Erk向细胞核的转移在AD细胞内被抑制，这可能会导致MAP激酶在调节基因转录时发生AD相关的功能异常以及BK刺激后Erk的去磷酸化被延迟。

实施例6：检测人皮肤成纤维细胞

人皮肤成纤维细胞可用作本发明的阿耳茨海默病诊断试验的材料。这种类型的细胞可从试验受试者和年龄相配的非阿耳茨海默病对照受试者获得，并按照已有的方法处理、培养和传代。细胞可在小培养瓶(通常25cm)或小培养皿(35mm)内培养直到达到80-90的汇合率，所用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。在处理细胞前用无血清培养基培养过夜使细胞“饥饿”。

利用定量实时PCR测定PP2A基因表达的基础水平。这种检测包括如下过程：1)从成纤维细胞中提取总RNA，或者利用其他方法如以过滤为基础的方法制备总RNA。2)利用DNA酶-I处理总RNA样品以去除基因组DNA。3)在体外反转录反应中从总RNA合成cDNA第一链。4)进行实时PCR。在同一轮PCR中同时扩增GAPDH和PP2A基因，以标准化PP2A基因的表达。

通过如下过程检测缓激肽诱导的PP2A基因表达：在37℃用合适浓度的缓激肽(BK)处理血清饥饿的成纤维细胞约10分钟。通过去除培养基来终止反应，用pH7.5的预冷的PBS漂洗细胞，然后将细胞冷冻在干冰/乙醇表面。培养相同细胞的另一个培养瓶内加入相同体积的PBS代替BK溶液，作为对照。按照上面所描述的方法制备总RNA、进行DNA酶-I处理、体外反转录和实时PCR。通过计算+BK/-BK比例来评价BK诱导的PP2A基因表达。

利用抗PP2A抗体通过Western印迹来检测成纤维细胞内的PP2A蛋白水平。同时检测同一样品内的另一种蛋白如膜联蛋白-II或肌动蛋白的水平，作为参考蛋白进行标准化。

通过如下过程检测BK刺激后冈田酸(OA)抑制的Erk1/2去磷酸化：相同细胞系来源的细胞分两个培养瓶或培养皿分别培养到80-90％的汇合率。经血清饥饿过夜后，细胞进行如下处理：1)BK处理约10分钟，2)用10nM OA预处理约15分钟，然后进行BK处理和其他剂量的OA处理约10分钟。终止反应，细胞用裂解缓冲液裂解，通过Western印迹检测Erk1/2磷酸化的程度和总Erk1/2的水平。用总Erk1/2的信号进行标准化后，计算在存在和不存在OA的条件下BK刺激的Erk1/2磷酸化的比例。

利用荧光免疫细胞化学染色来检测Erk1/2的基础磷酸化水平。成纤维细胞在小的圆形盖玻片上培养。达到约70-80％汇合并经过血清饥饿过夜以后，去掉培养基。迅速用pH7.5的预冷PBS漂洗，然后用约4％的甲醛固定。固定的细胞洗涤三次，每次约5分钟，与抗磷酸-Erk1/2抗体共孵育。随后用荧光素标记的二抗染色细胞。利用荧光显微镜获取免疫反应信号，磷酸-Erk1/2的荧光信号用Metaphore软件计算。

利用免疫细胞化学染色、Western印迹和ELISA检测磷酸-Erk1/2的核异位。1)细胞在小的圆形盖玻片上培养直到达到70-80％的汇合率。细胞经血清饥饿过夜，在存在或不存在约10nM OA的条件下用合适浓度的BK处理。终止反应后按照上述方法固定细胞。细胞用抗-磷酸-Erk1/2抗体免疫染色后再用荧光素标记的二抗染色。利用连接到计算机上的荧光显微镜观察并记录磷酸-Erk1/2的升高及向细胞核内转移的情况。2)来自于同一细胞系的细胞分几个培养瓶或培养皿培养，然后分别进行如下处理：对照、BK处理和BK+OA处理。反应终止以后，利用商品化的细胞核组分制备试剂盒分离胞质溶胶和细胞核组分。通过检测胞质溶胶组分和细胞核组分内的Erk1/2磷酸化水平来测定磷酸-Erk1/2的核异位。计算细胞核磷酸-Erk1/2与胞质溶胶磷酸-Erk1/2之比，并且比较不同处理条件下的数据。另外，利用ELISA也可以得到相同的结果。

实施例7：成纤维细胞的培养和处理

从Coriell Institute for Medical Research购买储存的阿耳茨海默病患者来源的皮肤成纤维细胞和年龄相配的对照细胞(AC)。年龄从59到81的19位AD患者的细胞用于本研究，另外还有11株来源于家族性AD(FAD)的细胞系和9株来源于散发AD(SAD)个体的细胞系。所有患者都表现出严重的痴呆、进行性的记忆丧失和其他认知功能损伤。这些AD患者还有异常的脑电图和不同程度的脑萎缩。对照的成纤维细胞来源于17位年龄接近性别相配的正常个体。到达实验室以后，按照以前所描述的方法(Zhao等，2002)用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞和传代。本研究所用的细胞传代数不超过17代。

实施例8：药理学处理

为了刺激MAP激酶磷酸化，成纤维细胞培养到约90％汇合，然后用一种有效的炎症介质缓激肽(BK，10nM)处理约5分钟或约10分钟。为了确定PP2A或PP2B是否参与MAP激酶磷酸化的调节，细胞用冈田酸(OA，约10nM)或FK506(约20nM)预处理约15分钟，然后用BK(约10nM)和另一剂量的冈田酸或FK506处理约10分钟。每株细胞系的细胞培养瓶用DMSO载体处理，用作对照。通过去掉培养瓶内的培养基来终止处理，用pH7.5的预冷1×PBS快速漂洗细胞，将培养瓶放到干冰/乙醇上(placing the flask or dry ice/ethanol)。根据试验目的的不同，向每个培养瓶内加入1ml RNA分离试剂或1ml含1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的细胞裂解缓冲液，用于随后的RNA制备或者酶和免疫印迹分析。

实施例9：总RNA的制备和cDNA第一链的合成

利用RNA分离剂(Sigma Genosys)按照厂家的说明书从每株AD和AC细胞系中提取总RNA，然后在37℃用DNA酶-I处理约30分钟以去除可能的基因组DNA污染。随后利用带寡(dT)引物的cDNA第一链合成试剂盒将总RNA(1.5μg)反转录成cDNA第一链。

实施例10：实时PCR

按照上述方法进行体外反转录(RTQ-PCR)以后，利用ABI 7900平台(AppliedBiosystems)通过实时聚合酶链式反应定量分析mRNA水平。用引物对扩增PP2A的靶节段，正向引物为5′-GTTGGGAGGTGGCAGTGAG-3′，SEQ ID NO：1，反向引物为5′-AAACACTGGCCTCTGGTGTC-3′，SEQ ID NO：2，PCR在20-μl含10μl SYBRgreen-I MaterMix(Applied Biosystems)、10pmol正向和反向引物和1μg反转录cDNA模板的混合物内进行。为了校正因样品间cDNA浓度的变异性而导致的误差，在同一PCR循环中同时扩增参考基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的片段，所用引物对中的正向引物为5′-CAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，SEQ ID NO：3，反向引物为5′-AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC-3′，SEQ ID NO：4。根据同一轮PCR中范围从10⁵到10¹²拷贝的一系列稀释度的cDNA模板所产生的每个基因的标准曲线，PCR仪可自动计算PP2A和GAPDH的实时扩增情况。在PCR结束时，用GAPDHmRNA水平标准化PP2A mRNA水平。所得到的比例(PP2A/GADPH)用作每一细胞系内的PP2A基因表达水平值。PP2A和GAPDH PCR产物的特异性可由其解链温度(MT)证明，通过在10％TUBE凝胶上分析最终的PCR产物可进一步验证其特异性。

实施例11：磷酸酶活性测定

以磷酸对硝基苯酯(PNPP，14.4mM)为底物，按照操作过程(Pierce Biotechnology)分析AD和AC细胞内的PP2A活性。酶活性分析在96孔微板上进行。将约10μl每种AC或AD细胞裂解物加入到约90μl反应混合物中开始反应，在约30℃的条件下孵育约15分钟，利用BioRad微板读数仪在420nM波长下检测。减去存在约10nMPP2A抑制剂冈田酸的反应所得到的数值，根据一系列已知浓度的纯化的PP2A蛋白所绘制的标准曲线来计算PP2A的活性。

实施例12：测定PP2A蛋白的表达水平

为了分析成纤维细胞内的PP2A表达水平，利用BCA蛋白分析试剂(PierceBiotechnology)测定细胞裂解物内的总蛋白浓度。将相同量的来自于AC和AD细胞系的总蛋白溶解到4-20％ SDS-PAGE上。利用抗PP2A多克隆抗体(BiosourceInternational)通过Western印迹检测PP2A蛋白。在同一个Western印迹上用抗膜联蛋白II抗体(Santa Cruz Biotechnology)检测成纤维细胞所表达的一种磷脂结合蛋白膜联蛋白II，其免疫反应信号作为参考用于蛋白加载量变化的标准化。

实施例13：Erk1/2磷酸化水平的测定

利用抗磷酸-Erk1/2抗体(Cell Signaling Technology)在Western印迹上确定不同处理条件下的Erk1/2磷酸化水平，加载到SDS凝胶上的Erk1/2蛋白总量可用抗常规Erk1/2抗体(Upstate Biotechnology)确定，用于标准化所检测到磷酸-Erk1/2信号。

实施例14：免疫组织化学染色

在包被有0.02mg多聚赖氨酸的直径2.5厘米的玻璃盖玻片表面培养成纤维细胞。在存在或不存在OA的条件下用缓激肽处理以后，细胞用4％甲醛快速固定15分钟，然后用0.1％ Triton X-100渗透30分钟。与10％的正常马血清共孵育30分钟后，细胞用抗磷酸-Erk1/2抗体处理，4℃过夜。细胞洗涤后用标记有荧光素(绿色)的抗兔IgG抗体处理60分钟。洗涤后用Vectashield封固剂(Vector Laboratories)封固，利用Nikon荧光显微镜观察磷酸-Erk1/2免疫染色信号。在另一种情况下，通过使细胞与鼠抗磷酸r-Erk1/2抗体和兔抗常规Erk1/2抗体共孵育进行免疫双染色以观察同一个盖玻片上的磷酸r-Erk1/2和常规Erk1/2。然后与标记有荧光素(绿色)和德克萨斯红(红色)的抗鼠和抗兔IgG二抗共孵育。按照上述方法获取免疫反应信号。

实施例15：数据分析

(1)19株AC细胞系和19株AD细胞系各样品中PP2A mRNA的定量PCR值用同一样品内的GPDH的定量PCR值进行标准化。(2)为了分析PP2A蛋白的表达情况，对免疫反应信号进行密度测定扫描。PP2A的密度测定值用膜联蛋白II的密度测定值进行标准化，并用UN-SCAN-IT软件(Silk Scientific，Inc.)进行定量。(3)为了评价Erk1/2的磷酸化水平，计算磷酸-Erk1/2对总Erk1/2的比例。然后利用t检验或单向方差分析比较AD与AC细胞之间磷酸酶2A活性的上述所有比例和数据。

参考文献

Adachi，M.，Fukuda，M.，Nishida，E.，1999.MAP进入细胞核的两种共存机制：单体的被动扩散和二聚体的主动运输(Two co-existing mechanisms for nuclear importof MAP kinase：passive diffusion of a monomer and active transport of a dimmer).EMBOJ.18，5347-5358.

Alessi，D.R.，Gomez，N.，Moorhead，G.，Lewis，T.，Keyse，S.M.，Cohen，P.，1995.在不同的细胞系内p42 MAP激酶可被蛋白磷酸酶2A和蛋白酪氨酸磷酸酶，而不是CL 100灭活(Inactivation of p42 MAP kinase by protein phosphatase 2A and aprotein tyrosine phosphatase，but not CLlOO，in various cell lines).Curr.Biol.5，283-295.Billingsley，M.L.，Kincaid，R.L.，1997.tau蛋白的磷酸化和去磷酸化调节：对微管相互作用、细胞内运输和神经变性的影响(Regulated phosphorylation anddephosphorylation of tau protein：effects on microtubule interaction，intracellulartrafficking and neurodegeneration).Biochem.J.323，557-591.

Braconi Quintaje，S.B.，Church，D.J.，Rebsamen，M.，Valloton，M.B.，Hemmings，B.A.，Lang，U.，1996.蛋白磷酸酶2a在心室心肌细胞内的有丝分裂原活化的蛋白激酶活性的调节中的作用(Role of protein phosphatase 2a in the regulation of mitogen-activated protein kinase activity in ventricular cardiomyocytes).Biochem.Biophys.Res.Commun.221，539-547.

Brunet，A.，Roux，D.，Lenormand，P.，Dowd，S.，Keyse，S.，Pouyssegur，J.，1999.p42/p44有丝分裂原活化的蛋白激酶的核转运是生长试剂诱导的基因表达和细胞周期起始所必须的(Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated proteinkinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry).EMBOJ.18，664-674.

Connolly，G.P.，1998.神经疾病的成纤维细胞模型：荧光检测试验(Fibroblastmodels of neurological disorders：fluorescence measurement studies).Trends Pharmacol.Sci.19，171-177.

Chen，R.H.，Sarnecki，C，Blenis，J.，1992.Erk-和rsk编码的蛋白激酶的细胞定位和调节(Nuclear localization and regulation of Erk-and rsk encoded protein kinases).Mol.Cell.Biol.12，915-927.

Christner，C，Herdegen，T.，Fischer，G.，2001.FKBP配基可作为神经疾病的新型治疗性试剂(FKBP ligands as novel therapeutics for neurological disorders).Mini-Rev.Med.Chem.1，337-397.

Chung，H.，Brautigan，D.L.，1999.蛋白磷酸酶2A可抑制MAP激酶信号转导和异位蛋白表达(Protein phosphatase 2A suppresses MAP kinase signaling and ectopicprotein expression).Cell Signal.11，575-580.

Cummings，J.L.，Vinters，H.V.，Cole，G.M.，Khachaturian，Z.S.，1998.阿耳茨海默病：病因学、病理生理学、已有认知和治疗机会(Alzheimer’s disease：etiologies，pathophysiology，cognitive reserve，and treatment opportunities).Neurology 51，S2-S17.

Dineley，K/T.，Westerman，M.，Bui，D.，Bell，K.，Ashe，K.H.，Sweatt，J.D.，2001.β淀粉样蛋白可通过海马α7烟碱乙酰胆碱受体活化有丝分裂原活化的蛋白激酶级联反应：与阿耳茨海默病相关的体外和体内机制(Beta-amyloid activates themitogen-activated protein kinase cascade via hippocampal alpha7 nicotinic acetylcholinereceptors：in vitro and in vivo mechanism is related to Alzheimer’s disease).J.Neurosci.21，4125-4133.

Etcheberrigaray，R.，Hirashima，N.，Nee，L.，Prince，J.，Govoni，S.，Racchi，M.，Tanzi，R.E.，Alkon，D.L.，1998.阿耳茨海默病家族的无症状成员来源的成纤维细胞内的钙反应(Calcium responses in fibroblasts from asymptomatic members ofAlzheimer’s disease families).Neuro-biol.Dis.5，37-45.

Fernandez，JJ.，Candenas，M.L.，Souto，M.L.，Trujillo，M.M.，Norte，M.，2002.冈田酸，研究细胞过程的有用工具(Okadaic acid，useful tool for studying cellularprocesses).Curr.Med.Chem.9，229-262.

Ferrell Jr.，J.E.，1998.调节蛋白转位如何产生开关样反应(How regulated proteintranslocation can produce switch-like responses).Trends Biochem.Sc.23，461-465.

Force，T.，Bonventre，J.V.，1998.生长试剂和有丝分裂原活化的蛋白激酶(Growthfactors and mitogen-activated protein kinases).Hypertension 31，152-161.

Goedert，M.，Spillantini，M.G.，Cairns，N.J.，Crowther，R.A.，1992.阿耳茨海默病双股螺旋状细丝的tau蛋白：所有六种脑亚型的异常磷酸化(Tau proteins ofAlzheimer paired helical filaments：abnormal phosphorylation of all six brain isoforms).Neuron 8，159-168.

Gold，B.G.，1999.FK506及亲免素FKBP-52在神经再生过程中的作用(FK506 andthe role of the immunophilin FKBP-52 in nerve regeneration).Drag Metab.Rev.31，649-663.

Gong，C.X.，Lidsky，T.，Wegiel，J.，Zuck，L.，Grundke-Iqbal，L，Iqbal，K.，2000.在哺乳动物脑内蛋白磷酸酶2A可调节微管相关蛋白tau的磷酸化.阿耳茨海默病的神经元纤维变性的标志(Phosphorylation of microtubule-associated protein tau isregulated by protein phosphatase 2A in mammalian brain.Implications for neurofibrillarydegeneration in Alzheimer’s disease).J.Biol.Chem.275，5535-5544.

Gong，C.X.，Shaikh，S.，Wang，J.Z.，Zaidi，T.，Grundke-Iqbal，L，Iqbal，K.，1995.磷酸酶对异常磷酸化的tau的活性；在阿耳茨海默病的大脑内下降(Phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau；decrease in Alzheimerdisease brain).J.Neurochem.65，732-738.

Gonzales，F.A.，Seth，A.，Raden，D.L.，Bowman，D.S.，Fay，F.S.，Davis，R.J.，1993.血清可诱导有丝分裂原活化的蛋白激酶转位到细胞表面raffling membrane和细胞核(Serum-induced translocation of mitogen-activated protein kinase to the cellsurface raffling membrane and the nucleus).J.Cell Biol.122，1089-10101.

Guise，S.，Braguer，D.，Carles，G.，Delacourte，A.，Briand，C，2001.在成神经瘤细胞内的抗癌药物诱导的凋亡过程中tau的过度磷酸化是由ERK活化诱导的(Hyperphosphorylation of tau is mediated by ERK activation during anticancerdrag-induced apoptosis in neuroblastoma cells).J.Neurosci.Res.63，257-267.

Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.，Williams，P.M.，1996.实时定量PCR(Realtime quantitative PCR).Genome Res.6，986-994.

Janssens，V.，Goris，J.，2001.蛋白磷酸酶2A：参与细胞生长和信号转导的高调节家族或丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(Protein phosphatase 2A：a highly regulated family orserine/threonine phosphatases implicated in cell growth.and signaling).Biochem.J.353，417-439.

Janssens，V.，Jordens，J.，Stevens，L，Van Hoof，C，Martens，E.，de Smedt，H.，Engelborghs，Y.M.，Waelkens，E.，Goris，J.，2003.蛋白磷酸酶2A的B”/PR72亚单位上的两种Ca2+结合EF手臂基序的鉴定及功能分析(Identification andfunctional analysis of two Ca2+-binding EF-hand motifs in the B″/PR72 subunit of proteinphosphatase 2A).J.Biol.Chem.278，10696-10706.

Jellinger，K.A.，Bancher，C，1998.阿耳茨海默病的神经病理学：最新进展(Neuropathology of Alzheimer’s disease：a critical update).J.Neural Transm.Suppl.54，77-95.

Kohkhlatchev，A.V.，Canagarajah，B.，Wilsbacher，J.，Robinson，M.，Atkinson，M.，Goldsmith，E.，Cobb，M.H.，1998.MAP激酶ERK2的磷酸化可促使其同源二聚化及向细胞核转位(Phosphorylation of the MAP kinase ERK2 promotes itshomodimerization and nuclear translocation).Cell 93，605-615.

Kins，S.，Crameri，A.，Evans，D.R.，Hemmings.，B.A.，Nitsch，R.M.，Gotz，J.，2001.在转基因鼠内蛋白磷酸酶2A的活性下降可诱导tau发生过度磷酸化和区域化过程改变(Reduced protein phosphatase 2A activity induces hyperhosphorylation andaltered compartmentalization of tau in transgenic mice).J.Biol.Chem.276，38193-38200.

Klettner，A.，Baumgrass，R.，Zhang，Y.，Fischer，G.，Burger，E.，Herdegen，T.，Mielke，K.，2001.FK506结合蛋白配基的神经保护作用：通过RNA从新合成来激发神经元存活，但是不依赖于NJK和神经钙蛋白的抑制(The neuroprotective actionsof FK506 binding protein ligands：neuronal survival is triggered by de novo RNAsynthesis，but is independent of inhibition of NJK and calcineurin).Brain Res.Mol.BrainRes.97，21-31.

Knowles，R.B.，Chin，J.，Ruff，C.T.，Hyman，B.T.，1999.通过荧光偏振能量转移证明活化的MAP激酶与神经原纤维缠结之间的紧密联系：阿耳茨海默病内的MAP激酶活化的意义(Demonstration by fluorescence resonance energy transfer of aclose association between activated MAP kinase and neurofibrillary tangles：implicationsfor MAP kinase activation in Alzheimer disease).J.Neuropathol.Exp.Neurol.58，1090-1098.

Lee，V.M.，1995.阿耳茨海默病内的细胞骨架破裂(Disruption of the cytoskeletonin Alzheimer’s disease).Curr.Opin.Neurobiol.5，663-668.

Lenormand，P.，Sardet，C，Pages，G.，L′AUemain，G.，Brunet，A.，Pouyssegur，J.，1993.在生希望细胞内生长试剂可诱导MAP激酶(p42mapk和/44mapk)而不是其活化剂MAP激酶((p45mapkk)的细胞核转位(Growth factors induce nucleartranslocation of MAP kinase(p42mapk and/44mapk)but not of their activator MAPkinase(p45mapkk)in fibroblasts).J.Cell Biol.122，1079-1088.

Lewis，T.S.，Shapiro，P.S.，Ahn，N.G.，1998.通过MAP激酶级联反应的信号转导(Signal transduction through MAP kinase cascades).Adv.Cancer Res.74，49-139.

Liebmann，C，2001.缓激肽传递给MAP激酶的信号：细胞特异性连接与主要的有丝分裂原通路(Bradykinin signaling to MAP kinase：cell specific connections versusprinciple mitogenic pathways).Biol.Chem.382，49-55.

Livak，KJ.，Schimttgen，T.D.，2001.利用实时定量PCR和2^-AAC _T方法分析相对基因表达数据(Analysis of relative gene expression data using real time quantitativePCR and the 2^-AAC _T method).Methods.25，402-408.

Mandelkow，E.，Song，Y.H.，Schweers，O.，Marx，A.，Mandelkow，E.M.，1995.在微管、tau和双股螺旋状细丝的结构上(On the structure of microtubules，tau，and paired helical filaments).Neurobiol.Aging 16，347-354.

Matsubayashi，Y.，Fukuda，M.，Nishida，E.，2001.在经过透化处理的细胞内ERK MAP激酶的核转位存在核孔复合物介导的非胞浆依赖的通路的证据(Evidencefor existence of a nuclear pore complex-mediated，cytosol-independent pathway of nucleartranslocation of ERK MAP kinase in permeabilized cells).J.Biol.Chem.276，41755-41760。

Mattson，M.，Chan，S.L.，Camandola，S.，2001.神经核免疫系统内的早老蛋白突变和钙信号缺损(Presenilin mutations and calcium signaling defects in the nervousand immune systems).BioEssays 23.8，733-744.

McMahon，K.A.，Wilson，NJ.，Marks，D.C.，Beecroft，T.L.，Whitty，G.A.，Hamilton，J.A.，Csar，X.F.，2001.集落刺激因子1(CSF-1)受体介导的髓细胞的macrophase分化：酪氨酸559依赖的蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的作用(Colony-stimulating factor-1(CSF-1)receptor-mediated macrophase differentiation inmyeloid cells：a role for tyrosine 559-dependent protein phosphatase 2A(PP2A)activity).Biochem.J.358，431-436.

Nagao，M.，Shima，H.，Nakayasu，M.，Sugimura，T.，1995.蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可作为冈田酸的结合蛋白(Protein serine/threonine phosphatase asbinding proteins for okadaic acid).Mutat.Res.333，173-179.

Planel，E.，Yasutake，K.，Fujita，S.C.，Ishiguro，K.，2001.蛋白磷酸酶2A的抑制作用可超越tau蛋白激酶I/糖原合成酶激酶3β和细胞周期蛋白依赖性激酶5的抑制作用并导致饥饿小鼠海马内的tau过度磷酸化(Inhibition of protein phosphatase 2A overrides tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3βand cyclin-dependent kinase5 inhibition and results in tau hyperphosphorylation in the hippocampus of starved mouse).J.Biol.Chem.276，34289-34306.

Putney Jr.，J.W.，2000.早老蛋白、阿耳茨海默病和库容性钙内流(Presenilins，Alzheimer’s disease，and capacitative calcium entry).Neuron 27，411-412.

Rapport，M.，Ferreira，A.，2000.PD98059可预防由原纤维β淀粉状蛋白诱导的成熟海马神经元内的轴突变性(PD 98059 prevents neurite degeneration induced byfibrillar beta-amyloid in mature hippocampal neurons).J.Neurochem.74，125-133.

Roovers，K.，Assoian，R.K.，2000.将MAP激酶信号整合到G1期细胞周期机器中(Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase cell cycle machinery).Bioessays 22，818-826.

Saito，T.，Ishiguro，K.，Uchida，T.，Miyamoto，E.，Kishimoto，T.，Hisanaga，S.，1995.在原代培养的胎儿大鼠神经元内用蛋白磷酸酶2A和2B使tau原位去磷酸化(In situ dephosphorylation of tau by protein phosphatase 2A and 2B in fetal rat primarycultured neurons).FEBS Lett.376，238-242.

Sheehan，J.P.，Swerdlow，R.H.，Miller，S.W.，Davis，R.E.，Parks，J.K.，Parker，W.D.，Tuttle，J.B.，1997.用来自于散发阿耳茨海默病患者的线粒体转化的细胞内的钙平衡和活性氧生成(Calcium homeostasis and reactive oxygen species production incells transformed by mitochondria from individuals with sporadic Alzheimer’s disease).J.Neurosci.17，4612-4622.

Sheppeck，J.E.，Gauss，CM.，Chamberlin，A.R.，1997.天然毒素对丝氨酸-苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A的抑制(Inhibition of the Ser-Thr phosphatases PP1 and PP2A bynaturally occurring toxins).Bioorg.Med.Chem.5，1739-1750。

Silverstein，A.M.，Barrow，C.A.，Davis，AJ.，Mumby，M.C.，2002.PP2A对MAP激酶通路和凋亡的效应是由不同调节亚单位介导的(Actions of PP2A on theMAP kinase pathway and apoptosis are mediated by distinct regulatory subunits).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，4421-4426.

Sweatt，J.D.，2001.神经元MAP激酶级联：有利于突触可塑性和记忆的生化信号整合系统(The neuronal MAP kinase cascade：a biochemical signal integration systemsubserving synaptic plasticity and memory).J.Neurochem.76，1-10.

Treisman，R.，1996.MAP激酶级联对转录的调节(Regulation of transcription byMAP kinase cascades).Curr.Opin.Cell Biol.8，205-215。

Valjent，E.，Caboche，J.，Vanhoutte，P.，2001.有丝分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶诱导脑内的基因调节：学习和记忆的分子底物(Mitogen-activatedprotein kinase/extracellular signal-regulated kinase induced gene regulation in brain：amolecular substrate for learning and memory).Mol.Neurobiol.23，83-99.

Vogelsberg-Ragaglia，V.，Schuck，T.，Trojanowski，J.Q.，Lee，V.M.，2001.阿耳茨海默病海马内的PP2A mRNA表达量下降(PP2A mRNA expression isquantitatively decreased in Alzheimer’s disease hippocampus).Exp.Neurol.168，402-412.

Volmat，V.，Camps，M.，-Arkinstall，S.，Pouyssegur，J.，Lenormand，P.，2001.细胞核，通过p42/p44 MAP激酶的隔绝和灭活终止信号的位点(The nucleus，a site forsignal termination by sequestration and inactivation of p42/p44 MAP kinases).J.Cell Sci.114，3433-3443.

Wang，J.Z.，gong，C.X.，Zaidi，T.，Grundke-Iqbal，L，Iqbal，K.，1995.蛋白磷酸酶-2A和-2B导致的阿耳茨海默氏双股螺旋状细丝的去磷酸化(Dephosphorylationof Alzheimer paired helical filaments by protein phosphatase-2A and-2B).J.Biol.Chem.270，4854-4860.

Winer，J.，Jung，C.K.，Shackel，L，Williams，P.M.，1999.用于在体外监测心肌细胞内的基因表达的实时定量反转录聚合酶链式反应的设计与确证(Developmentand validation of real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction formonitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro).Anal.Biochem.270，41-49.Winter，C，Schenkel，J.，Zimmermann，M.，Herdegen，T.，1998.FK506可在轴索断离术后存活的乳头区而不是变性的黑质神经元内诱导MAP激酶磷酸酶1的表达和表达水平升高(MAP kinase phosphatase 1 is expressed and enhanced by FK506 insurviving mamillary，but not degenerating nigral neurons following axotomy).Brain Res.801，198-205.

Yoo，A.S.，Cheng，L，Chung，S.，Grenfell，T.Z.，Lee，H.，Pack-Chung，E.，Handler，M.，Shen，J.，Xia，W.，Tesco，G.，Saunders，A.J.，Ding，K.，Frosch，M.P.，Tanzi，R.E.，Kim，T.W.，2000.早老蛋白介导的库容性钙内流的调节(Presenilin-mediated modulation of capacitative calcium entry).Neuron 27，561-572。

Zawadzka，M.，Kaminska，B.，2003.免疫抑制剂FO506可影响多个信号转导通路，并且能够调节星形胶质细胞内的基因表达(Immunosuppressant FK506 affectsmultiple signaling pathways and modulates gene expression in astrocytes).Mol.Cell.Neurosci.22，202-209.

Zhao，W.Q.，Chen，H.，Xu，H.，Moore，E.，Merri，N.，Quon，M.J.，Alkon，D.L.，1999.脑胰岛素受体和空间记忆。经过水迷宫训练的大鼠的海马内的基因表达、酪氨酸磷酸化和信号分子之间的相关变化(Brain insulin receptors and spatial memory.Correlated changes in gene expression，tyrosine phosphorylation，and signaling moleculesin the hippocampus of water maze trained rats).J.Biol.Chem.274，34893-34902.

Zhao，W.Q.，Ravindranath，L.，Mohamed，A.S.，Zohar，O.，Chen，G.H.，Lyketsos，C.G.，Etcheberrigaray，R.，Alkon，D.L.，2002.成纤维细胞内的阿耳茨海默病特异性的MAP激酶信号级联功能异常(MAP kinase signaling cascade dysfunction specific toAlzheimer’s disease in fibroblasts).Neurobiol.Dis.11，166-183.

Zhao，W.Q.，Feng，C，Alkon，D.L.2003.磷酸酶2A缺损可导致阿耳茨海默氏成纤维细胞内的MAP激酶磷酸化持续维持(Impairment of phosphatase 2A contributesto the prolonged MAP kinase phosphorylation in Alzheimer’s disease fibroblasts).Neurobiol.Dis.14，458-469。

Claims (45)

1.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；以及

b.检测所述样品内PP2A基因的表达水平，其中，与对照细胞相比，PP2A基因表达水平升高则说明存在阿耳茨海默病。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞样品选自成纤维细胞、口腔粘膜细胞、神经元或血细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测步骤(b)利用反转录定量聚合酶链式反应(RVQ-PCR)执行。

5.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；

b.使所述细胞样品与刺激PP2A底物磷酸化的试剂接触以刺激细胞；以及

c.比较所述受刺激细胞内的PP2A基因表达水平与所述受试者同一类型的未刺激细胞内的PP2A基因表达水平，其中与未刺激细胞相比，受刺激细胞内的PP2A基因表达水平未升高则说明存在阿耳茨海默病。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述试剂是缓激肽。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PP2A底物是Erk1/2。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞选自成纤维细胞、口腔粘膜细胞、神经元或和血细胞。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述比较步骤(c)通过计算存在和不存在刺激PP2A底物磷酸化的试剂时PP2A基因表达的比例来完成。

11.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；

b.检测所述细胞样品内的PP2A蛋白水平或酶活性，其中与非阿耳茨海默病对照细胞相比，PP2A蛋白水平或酶活性下降则说明存在阿耳茨海默病。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞样品选自成纤维细胞、口腔粘膜细胞、神经元或血细胞。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过Western印迹或ELISA检测PP2A蛋白水平。

15.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；

b.使所述细胞样品和对照细胞接触刺激PP2A底物磷酸化的第一试剂和作为PP2A抑制剂的第二试剂；

c.接触步骤开始后在预定时间点测定PP2A底物的磷酸化水平；以及

d.比较相同的预定时间点上所述细胞样品内的PP2A底物磷酸化水平和对照细胞内的PP2A底物磷酸化水平，其中，与对照细胞相比，PP2A抑制剂对细胞样品内PP2A底物磷酸化程度未产生附加效应则说明存在阿耳茨海默病。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述PP2A底物是Erk1/2。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述PP2A抑制剂是冈田酸。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞选自成纤维细胞、口腔粘膜细胞、神经元或血细胞。

19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。

20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述刺激磷酸化的试剂是缓激肽。

21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述比较步骤(d)可通过计算存在和不存在PP2A抑制剂时PP2A底物磷酸化的测试比例来完成，其中所述测试比例在对照细胞内要明显高于阿耳茨海默病细胞内。

22.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；

b.使对照细胞和所述细胞样品与刺激PP2A底物磷酸化的第一试剂接触，其中所述接触在存在和不存在作为PP2A抑制剂的第二试剂时进行的；

c.开始接触步骤(b)后在预定的时间点测量所述对照细胞和所述细胞样品的PP2A底物的磷酸化水平；以及

d.比较在存在或不存在所述作为PP2A抑制剂的第二试剂时所述细胞样品的PP2A底物的磷酸化水平，其中，在存在和不存在所述第二试剂时PP2A底物的磷酸化程度之间缺乏明显差异则说明存在阿耳茨海默病。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述对照细胞在存在和不存在所述作为PP2A抑制剂的第二试剂时PP2A底物的磷酸化水平表现出了明显的差异。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞样品选自成纤维细胞、口腔粘膜细胞、神经元或血细胞。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞样品是成纤维细胞。

26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述刺激PP2A底物磷酸化的第一试剂是缓激肽。

27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述作为PP2A抑制剂的第二试剂是冈田酸。

28.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述PP2A底物是Erk1/2。

29.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.从所述受试者获得细胞样品；以及

b.使所述细胞样品与刺激Erk1/2磷酸化的试剂接触；以及

c.检测磷酸化的Erk1/2的亚细胞分布，其中磷酸化的Erk1/2分布在细胞核外则说明存在阿耳茨海默病。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述刺激Erk1/2磷酸化的化合物是缓激肽。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述检测步骤(c)通过免疫细胞化学或通过确定样品细胞的细胞核和胞质溶胶之间磷酸化Erk1/2的测试比例来完成。

32.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，该方法包括权利要求1、5、11、15、22和29所述诊断方法的任意组合。

33.一种诊断受试者的阿耳茨海默病的方法，该方法包括权利要求1、5、11、15、22和29所述诊断方法的任意组合，还可以和依据用激发细胞内钙释放的试剂刺激后检测MAPK蛋白磷酸化水平升高的阿耳茨海默病诊断方法联合使用。

34.一种鉴定用于治疗或预防阿耳茨海默病的物质的筛选方法，该方法包括以下步骤：

a.使细胞样品与待测试物质接触；

b.确定该物质是否能够逆转或改善PP2A阿耳茨海默病相关异常，其中能够逆转或改善所述的PP2A异常的化合物被鉴定为可用于治疗或预防阿耳茨海默病的治疗性物质。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病相关异常是指与非阿耳茨海默病对照细胞相比存在PP2A mRNA升高。

36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病相关异常是指细胞与刺激Erk1/2磷酸化的试剂接触后PP2A的表达未升高。

37.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病相关异常是指与非阿耳茨海默病对照细胞相比PP2A蛋白或PP2A酶活性下降。

38.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病相关异常是指在存在冈田酸的条件下用缓激肽处理试验细胞时缺乏正常的反应。

39.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病相关异常是指磷酸化的Erk1/2分布在细胞核外区域。

40.一种用于阿耳茨海默病的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含缓激肽和特异于编码PP2A蛋白的核酸序列的寡核苷酸PCR引物。

41.一种用于阿耳茨海默病的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含抗PP2A抗体。

42.一种用于阿耳茨海默病的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含抗Erk1/2抗体和缓激肽。

43.一种用于阿耳茨海默病的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含抗磷酸Erk1/2抗体和缓激肽。

44.一种用于阿耳茨海默病的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含缓激肽、冈田酸和抗Erk1/2抗体。

45.如权利要求44所述的诊断检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含抗磷酸Erk1/2抗体。

Images