JP2016536611A - アルツハイマー病の処置に有用な化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ミトコンドリア挙動変数に基づいたシグネチャを用いて、アルツハイマー病の処置に有用である化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、アルツハイマー病を診断するための方法と、アルツハイマー病に罹患する対象者の治療に対する反応をモニタリングするための方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、医学の分野、特にアルツハイマー病の診断及び処置に関する。

アルツハイマー病は、高齢者における進行性認知症の最も一般的な形態である。アルツハイマー病は、細胞内神経原線維変化と脆弱な脳領域に蓄積する細胞外アミロイド班との神経病理学な所見により特徴づけられる神経変性疾患である。アルツハイマー病は６５歳を超える人々において１５．４％の有病率を示すことから、健康及び社会的に大きな負荷となっている。さらに、人口の高齢化のため、ヨーロッパにおけるＡＤの有病率は２０２５年までに６５歳を超える人々の２５％に達し、２０５０年までに世界で１億人に達すると予測される。

アルツハイマー病（ＡＤ）の薬剤開発には大きな期待が寄せられているが、現在のところ、後期臨床試験において非常に高率で不成功に打ち当っている。臨床試験が中止になる理由の多くは、認識されていない毒性と、処置の有効性が示されないこととにある。ＡＤの処置は、認知性症状の抑制及び／又は疾患進行の遅延を目的とする。特に、アミロイドの堆積及び神経原線維変化が、明白な症状の数十年前に現れることを考えると、「疾患修飾」薬剤、つまり発症及び能力障害を遅延するためにＡＤにおける最も早期の生物学的変化を標的とする薬剤を設計することが可能であり得ることが示唆される。実際に、疾患進行の開始を３．５年遅らせることにより、疾患の有病率を３分の１低減することが可能であり、疾患の処置をして進行をさらに２．８年遅延させることにより、ＡＤ患者の施設への収容の必要性を削減する。

さらに、処置による成功の見込みが最も高い段階で疾患を適切に診断することは重要である。しかしながら、ＡＤの診断は、時間の経過に伴う患者の減退における神経学的検査に主に基づくことから、時間を要し、またコストがかかる。ＡＤに関連する認知性減退における類型は、ＡＤに見受けられる複数の機能欠失もまた他の認知症に現れることから、精度の高いマーカではない。撮像は、局所的な細胞欠失を特定するので、認知症の診断の確立において臨床的な補助になり得るが、その他の認知症と比較するとＡＤに関して特定性が低い。

ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、又はメタボロームの大規模な解析は、ＡＤの臨床的形態に関する種々のマーカの発見をもたらしている。例として、ＡＤと関連することで知られるマーカは、遺伝的ＡＤの遺伝的症例のうちの５％の要因であるプレセニリン遺伝子の変異などの遺伝的決定因子、又はＡＰＯＥ４対立遺伝子の存在を含む。特にＡｂ４０及びＡｂ４２形態であるアミロイドベータペプチドの循環レベルもまた早期の疾患進行に関連し、Ａｂ４０／Ａｂ４２の割合の増加は、軽度認知障害（ＭＣＩ）として認識される疾患の前駆形態において見受けられる。さらに、脳脊髄液における総タウと比較してタウタンパク質のリン酸化形態が高いレベルで存在することも、ＡＤ診断の結論的なマーカと考えられる。その他の様々なマーカが特定されているが、その臨床的価値が確認されていない、或いは対立する結果が文献において見受けられるため、臨床的実施に徐々に取り入れられているのみである。

認知症は、残念ながら、家族又は医師のいずれにとっても対応が容易である状態ではない。ＡＤ及びその他の要因による認知症のプライマリケア段階における検出は、おこなわれるとしても通常は発症の２〜４年後になる。近年の研究では、中等度及び重度の認知症症例の７５％、及び９５％を超える軽度認知症症例は、プライマリケア段階において検出されないということが分かった。さらに、認知症が検出されても、医師の約７５％は正確なＡＤ診断に必要とされる統一的な基準を使用しない。

故に、ＡＤの処置に有用である薬剤、特に疾患修飾薬剤の選択方法と、早期の治療的介入のためのＡＤの診断及び患者の選択方法とが広く必要とされている。

発明者等は、ヒト生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、ＡＤに特異的であり、且つ疾患の早期又は無症候段階のＡＤの診断に使用されることが可能であるマーカ一式を特定した。さらに発明者等は、これらのマーカで得られるシグネチャが処置によって回復され得ることを示し、ＡＤの疾患進行を覆すことができる薬剤をスクリーニングするためのヒト由来のモデルを提供する。

つまり、第１の態様において、本発明は、アルツハイマー病の処置に有用である化合物のためのスクリーニング方法、好ましくはインビトロの方法に関し、該方法は、
ａ）アルツハイマー病に罹患する対象のサンプルから得られた前述の生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
ｂ）接触させた細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）である、
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
の値を測定するステップとを含む。

該方法は、ステップｂ）において取得された値を、テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含むとよい。

該方法は、
スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、ＮＣは、テスト化合物の非存在下においてアルツハイマー病に罹患する対象のサンプルから取得された値又は平均値であって、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であって、Ｖａｒは変数の測定値である。測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合に、テスト化合物はアルツハイマー病の処置に有用であると識別されるとよい。

第２の態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病の診断のための方法、好ましくはインビトロの方法に関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）である
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
の値を測定するステップを含む。

該方法は、前記対象がＡＤに罹患するかどうかを、測定されたミトコンドリア挙動変数の値に基づいて決定することをさらに含むとよい。

好ましくは、対象は、前駆症候性のアルツハイマー病患者である。

好ましくは、対象はアルツハイマー病に類似する臨床的徴候を示すか、或いはいずれの症状も示さない。

該方法は、測定変数のｚスコアを算出することをさらに含むとよい。好適には、好ましくはＶ７である第２変数及び変数Ｖ１１の正のｚスコア、並びに変数Ｖ５の負のｚスコアは、対象がアルツハイマー病に罹患することを示している。代替的に、好ましくはＶ７である第２変数、Ｖ１１、及びＶ１９、及び／又はＶ３の正のｚスコア、並びに変数Ｖ５の負のｚスコアは、対象が無症候段階のアルツハイマー病に罹患することを示している。

第３の態様において、本発明は、治療に対する、アルツハイマー病に罹患する対象の反応をモニタリングするための方法、好ましくはインビトロの方法にさらに関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）である
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
の値を測定するステップと、
ｂ）ステップａ）において処置の適用の前後に取得された測定値を比較するステップとを含む。

該方法は、
スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、ＮＣは処置の適用前に取得された値であって、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であって、Ｖａｒは変数の測定値である。好ましくは、患者は、測定変数すべてが正のスコアを示す場合に、治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。

特に、これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、及びＶ１９を測定することを含むとよい。また、これらの方法は、
（ｖｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、並びに
（ｖｉｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群より選択される変数、
である変数からなる群より選択される、少なくとも１つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含むとよい。

これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数の測定値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含むとよい。

好ましくは、サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検サンプルである。

細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群より選択されるとよい。好ましくは、細胞は線維芽細胞である。

好ましくは、分散記述子は、分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択される。

好ましくは、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、生細胞に包含されるミトコンドリアは標識される。ミトコンドリアは、任意の適切な標識、好ましくは蛍光標識、より好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識されるとよい。

ミトコンドリア挙動変数の値は、好ましくはＣＣＤカメラである適切なイメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得されるとよい。好ましくは、変数の値は、ＣＣＤカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される。

図１は、ウォード法を適用する階層的クラスタ分析の樹状図である。 図２は、階層的クラスタによって特定された３つのサブグループにおける、様々な対象の分類のヒートマップを表す。グラフは、ＡＤのシグネチャを構成する５つの変数のｚスコア値を示す。「Ｏ」と表示された患者は、疾患の進行に関して情報がない、遺伝子的にＡＤのリスクのある患者である。該分類は、疾患が臨床的に現れていなくとも生検の時点において存在するということを示す。 図３は、健康及び疾患である対象グループにおける各変数のｚスコアによって示される本発明のＡＤ及びＰＡＤシグネチャを表す。 図４は、本発明のＡＤシグネチャの５つの異なる変数（Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１及びＶ１９）におけるレスベラトロールの用量反応分析を表す（表現型のレスキューの％）。 図５は、疾患修飾におけるレスベラトロールの用量反応作用の重み付けを示す。 図６は、本発明のＡＤシグネチャの５つの異なる変数（Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１及びＶ１９）におけるアロプレグナノロンの用量反応分析を表す（表現型のレスキューの％）。 図７は、疾患修飾におけるアロプレグナノロンの用量反応作用の重み付けを示す。 図８は、本発明のＡＤシグネチャの５つの異なる変数（Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１及びＶ１９）におけるイマチニブの用量反応分析を表す（表現型のレスキューの％）。 図９は、疾患修飾におけるイマチニブの用量反応作用の重み付けを示す。

本発明者等は、生細胞の小器官、特にミトコンドリアの挙動を分析することにより、動物又はヒト生体における化合物の効果を予測するための重要な情報がもたらされることが可能であると以前に示した。発明者等は、膜透過性、空間と時間とにおける生細胞内部の小器官の動的運動性、小器官形態に起こる動的変化、及び、小器官と細胞骨格の要素との間にある動的関係などの細胞環境と小器官との相互作用、を分析することによって該挙動を規定した。この全般的な方法は米国特許第８，４９７，０８９号において公開され、その内容は、本明細書に参考文献としてすべて包含される。このように、本発明者らは、細胞代謝における個別の機能のみではなく、細胞小器官の全体的な機能を本明細書において考慮に入れている。

ミトコンドリアは、細胞環境に感受性があり、該環境と常にやり取りをするので、ミトコンドリア内において、そしてその他の細胞小器官やコンパートメントと、タンパク質同士の数千の相互作用をおこなう。本発明者等は、生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、生細胞におけるミトコンドリア網様システムを実験的及び動的に評価し、ミトコンドリアの挙動を表すこれらの相互作用の結果の取得を実現した。本発明者等は、ミトコンドリアの運動性、形態、ネットワーク構造、及び透過性に関する３７のミトコンドリア挙動変数を測定した。運動性変数は、例として、変位速度、増幅、頻度、及び動作の規則性、並びに移動距離の測定などを含む。形態変数は、例として、ミトコンドリア動態（融合・分裂バランス）の測定、及び種々の典型的形態的特性の出現頻度を含む。ミトコンドリアの網様ネットワーク構造は、細胞内細胞骨格、及び／又は微小管形成中心や焦点接着点など細胞内の特定のホットスポットに関して、その方向、分布、及び領域化についてスコアを付けられる。ミトコンドリアの膜透過性は、個々のミトコンドリアの信号強度の動的分析によって測定される。

本発明者らは、この分析に基づいて、健康、そしてＡＤである患者を区別するために十分である３つのミトコンドリア挙動変数のみを含むＡＤシグネチャを特定した。さらに、発明者等は、このシグネチャが薬理的に回復されることが可能であるため、ＡＤの処置に有用である化合物をスクリーニングするために使用されることができることを示した。

［定義］
本明細書において用いられるように、「対象」又は「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくはヒトに関する。

本明細書において用いられるように、「ＡＤ患者」又は「ＡＤ対象」という用語は、アルツハイマー病に罹患する対象に関する。対象は疾患の無症候又は症候的段階にあり得る。

「前駆症候性のアルツハイマー病患者」、「ＰＡＤ患者」又は「ＰＡＤ対象」という用語は、アルツハイマー病に罹患するが疾患の無症候の段階にある対象に関する。

本明細書において用いられるように、「健康な患者」又は「健康な対象」という用語は、ＡＤに罹患していない対象に関する。好ましくは、対象はいずれの既知の疾患にも罹患せず、つまり明らかに健康的である。

本明細書において用いられるように、「処置」、「処置する」又は「処置すること」という用語は、ＡＤの治療、予防、及び遅延など、患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為に関する。特定の実施形態において、そのような用語は、ＡＤ又はＡＤに関連した症状、特に神経性又は認知的症状の改善又は根絶に関する。他の実施形態において、この用語は、１つ以上の治療剤をＡＤに罹患する対象に投与することによってもたらされるＡＤの悪化を最小化することに関する。

本明細書において用いられるように、「サンプル」という用語は、対象に由来する生細胞を含む任意のサンプルを意味する。そのようなサンプルの例は、血液、血漿、唾液、尿、及び精液サンプルなどの体液、並びに生検、臓器、組織又は細胞サンプルを含む。好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検である。サンプルはその使用前に処理されるとよい。特に、皮膚生検は線維芽細胞を分離するように処理されるとよい。線維芽細胞は当業者に既知である任意の方法を用いて分離されるとよい。例として、皮膚の真皮成分は小片に切り分けられ、コラゲナーゼタイプ１及びディスパーゼで一晩処理されるとよい。細胞は、遠心分離及び再懸濁化後に培養フラスコに播種され、例えばダルベッコ最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む線維芽細胞増殖培地において培養されるとよい。

本明細書において用いられるように、「分散記述子」という用語は、値の分布がどのくらい広がっているか又は集約されているかを示す分散の測定に関する。好ましくは、この記述子は、分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群から選択される。好ましくは、分位範囲は四分位範囲又は十分位範囲である。四分位範囲は、上位と下位との四分位間、すなわち２５番目の百分位（データの下位の２５％を分離）と７５番目の百分位（データの上位２５％を分離）との間、の差である。十分位範囲は、１番目と９番目との十分位の間、つまり１０番目の百分位（データの下位の１０％を分離）と９０番目の百分位（データの上位１０％を分離）との間、の差である。好ましい実施形態では、分散記述子は、分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群から選択される。これらの値を算出する方法は当業者には通常知られている。

以下に開示される本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法であり得り、好ましくはインビトロの方法であるとよい。

第１の態様において、本発明は、ＡＤの処置に有用である化合物のためのスクリーニング方法に関し、該方法は、
ａ）アルツハイマー病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
ｂ）接触させた前記細胞において、以下のミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）、
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わされたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、の値を測定するステップとを含む。

任意的に、追加のミトコンドリア挙動変数の値が測定されるとよい。

一実施形態では、該方法は、ミトコンドリア挙動変数である、
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、の値を測定することをさらに含む。

好ましい実施形態において、本方法は、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖ）の値を測定すること、好ましくは、変数Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、及びＶ１９の値を測定することを含む。

一実施形態において、本方法は、ＡＤに罹患する対象からのサンプルを提供することさらに含む。

ＡＤに罹患する対象は、疾患の任意の段階、特に無症候の段階又は疾患進行の早期段階にあってもよい。好ましくは、対象はＰＡＤ対象である。

スクリーニング方法は、適切な治療、即ち個別化された医薬を選択するためにＡＤに罹患する対象のサンプルにおいて、又は、例えば薬剤開発若しくは薬剤再評価のためなど、ＡＤ若しくはＰＡＤサンプルの個体群において、おこなわれるとよい。

好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。

生細胞は、サンプルの特徴に従って、サンプルから直接的に、又はサンプルの細胞の初代培養から取得された、線維芽細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択されるとよい。また、生細胞は、成人の体細胞、特にサンプルから取得された線維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、インビボの状態に可能な限り近づくような結果を取得するために、非形質転換の生細胞である。

好ましい実施形態において、サンプルは皮膚生検であり、細胞は線維芽細胞である。特に、皮膚生検は、分離するか又は線維芽細胞の培養を富化するために処理されるとよい。

一実施形態において、本方法は、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、サンプルから取得された生細胞に含まれるミトコンドリアを標識することをさらに含む。好ましくは、ミトコンドリアはステップａ）の前に標識される。

ミトコンドリアは、当業者には通常既知である任意の方法を用いて標識されるとよい。好ましくは、標識は蛍光、発光、又は着色標識である。より好ましくは、標識は蛍光標識である。ミトコンドリアは、該小器官に特異的なプローブを用いて、及び／又はレポーター遺伝子の導入によって（例えば、ミトコンドリア標的発現を伴うＧＦＰ発現構造）、及び／又は該小器官に特異的に取り入れられるマーカ若しくは色素の生細胞内への微量注入によって、標識されるとよい。これらすべての技術は当業者に既知である。いくつかの市販のキットがこの種の標識のために利用可能であり、これらは製造者の推奨に従って用いられる必要がある。特に、ミトコンドリアは、カルセイン及びコバルト（Ｐｅｔｒｏｎｉｌｌｉ他、１９９８年）、ローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、及びテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）などの蛍光ローダミン誘導体、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ（ＮＡＯ）、又は、特にミトトラッカーグリーン（ＭＴＧ）若しくはミトトラッカーレッド（ＣＭＸＲｏｓ）であるミトトラッカー色素、を用いて標識されるとよい。好ましくは、ミトコンドリアは、ミトコンドリア膜電位に感受性がない染色を用いて標識される。特に、染色は、ミトトラッカーグリーン（ＭＴＧ）、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ（ＮＡＯ）、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択されることができる。特に好ましい実施形態において、ミトコンドリアはミトトラッカーグリーンを用いて標識される。

他の実施形態においてミトコンドリアは標識されず、ミトコンドリア挙動変数の値は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡などの標識不要の顕微鏡技術を用いて測定される。

ステップａ）において、生細胞はテスト化合物と接触させられる。

テスト化合物は、化学的化合物、生物学的化合物、放射線、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択されるとよい。
一実施形態において、テスト化合物は放射線、特にＸ線、ガンマ線、α粒子、β粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体、及び電離放射線の他の形態、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される放射線である。

他の実施形態において、テスト化合物は化学的化合物、即ち、有機又は無機化合物である。例として、テスト化合物は、ＡＤ以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤、高スループットの化学ライブラリからの化合物、又は遺伝子治療に適した核酸構築物であり得る。テスト化合物がＡＤ以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤である場合、本方法は薬剤再評価のために用いられるとよい。

さらなる実施形態において、テスト化合物は生物学的化合物である。生物学的化合物は、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物、及び他の任意の生物学的分子又は複合体からなる群から選択されるとよい。また、細胞療法に用いられる治療的細胞、又はウイルス療法用の組み換えをされたウイルスであってもよい。特に、治療的細胞は、幹細胞、前駆細胞、細胞置換療法のための成熟細胞及び機能細胞、又は細胞を利用した遺伝子治療のための遺伝子組み換え細胞であるとよい。

生細胞をテスト化合物と接触させる技術は、その化合物の特性次第で変わり得り、当業者によって容易に選択され得る。特に、テスト化合物が化学的又は生物学的化合物である場合、細胞培地に添加されるとよい。細胞療法では、サンプルから取得された生細胞と、治療的細胞又は遺伝子的に組み換えられた細胞とは、細胞同士の直接的な接触が可能であるか、又は可能ではない共培養系を用いて接触させるとよい。テスト化合物が放射線である場合、培地内の細胞は放射線にかけられるとよい。テスト化合物が核酸構築物である場合、リポソームなどの適切なビヒクル内の培地に添加されるか、細胞に導入されるか、又は細胞に直接的に注入されるとよい。これらすべての技術は当業者には既知である。

本方法のステップｂ）において、いくつかのミトコンドリア挙動変数の値は、ステップａ）においてテスト化合物に接触させた細胞において測定される。実験の項に示されるように、これらの変数は、ＡＤ患者の細胞を健康な人の細胞と区別するために十分であり、細胞がＡＤの処置若しくは予防に有用なテスト化合物と接触されるときに回復することが可能であるＡＤシグネチャを構成するように、発明者等によって選択された。

ミトコンドリア挙動変数の値は、生細胞内で観察されるミトコンドリア、好ましくは標識されたミトコンドリアのイメージを分析することで測定される。イメージは、例えば、少なくとも２分間、高走査速度で、少なくとも１０秒毎に、好ましくは少なくとも２〜６分間、高走査速度で、０．１〜１０秒毎に撮影される。イメージ撮影は、イメージ取得システムと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡などの任意の適切な顕微鏡技術を用いておこなわれるとよい。特に、ミトコンドリアが標識される場合、イメージ撮影は蛍光顕微鏡を用いておこなわれるとよい。ミトコンドリアが標識されない場合、イメージ撮影はＤＩＣ顕微鏡を用いておこなわれるとよい。イメージ取得デバイスは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）など、高速で高解像度フレームを撮影することが可能である任意のデバイスであってよい。特に好ましい実施形態において、イメージ撮影は３つの空間的次元においておこなわれる。つまり、イメージ撮影はサンプルを３次元で視覚化できるモーター付きプレートを備えた顕微鏡を用いておこなわれるとよい。測定はテスト化合物の存在下で、又はテスト化合物への曝露後におこなわれるとよく、好ましくはテスト化合物の存在下でおこなわれるとよい。好適には、細胞はイメージ撮影時に３７℃に保持される。

第１の変数Ｖ５は一般的な細胞構造に関し、平均細胞領域、又は細胞領域の分散記述子である。該変数は、各細胞の領域を測定し、観察されたすべての細胞のデータから平均領域を算出することによって取得されるとよい。また、変数は、各細胞の領域を測定し、細胞領域の分散記述子を算出することによって取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群から選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群から選択される。好適には、各細胞の領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。

第２の変数は、Ｖ７、Ｖ２９、及びＶ３０、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、Ｖ２９は７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であり、Ｖ７は総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であり、Ｖ３０は１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。

変数Ｖ２９とＶ３０とは、特定の領域範囲に示されるミトコンドリアの頻度に関する。好ましくは、各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。変数Ｖ２９とＶ３０とは、ミトコンドリアの領域を測定し、それぞれ７０〜１００μｍ^２及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの数を測定することによって取得される。そして、結果はミトコンドリアの総数の百分率で表される。

変数Ｖ７は、総細胞領域に対する、もつれたミトコンドリア、即ち単一のミトコンドリアの個別化が不可能であるところまで組み合せられたミトコンドリアを含む部分の総領域である。この変数は、ミトコンドリアの方向性と細胞骨格の方向性との一致を評価し、ミトコンドリアと細胞骨格との関係の状態に関連する。

第３の変数Ｖ１１は、総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた平均細胞領域、又はミトコンドリアでカバーされた細胞領域の分散記述子である。変数は、各細胞について、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域を測定し、観察されたすべての細胞のデータから平均領域を算出することによって取得されるとよい。また変数は、各細胞について、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域を測定し、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の分散記述子を算出することによって取得されてもよい。好ましくは、記述子は、分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。好適には、各細胞のミトコンドリアでカバーされた領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。

第４の変数Ｖ３は、ミトコンドリアの移動速度の分散記述子である。ミトコンドリアの移動速度は、各ミトコンドリアをフレーム毎に追跡し、各ミトコンドリアの速度を記録することによって評価される。そして、変数Ｖ３はミトコンドリアの移動速度の分散記述子を算出することによって取得されるとよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。

第５の変数Ｖ１９は、２．６〜３.１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定されるとよい。変数Ｖ１９は、ミトコンドリアの領域を測定し、２．６〜３.１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの数を測定することによって取得される。結果はミトコンドリアの総数の百分率で表される。

第６の変数Ｖ１２は、細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリア数の分散記述子である。この数は、イメージ分析ソフトウエアを用いて、細胞のイメージにおける各ミトコンドリアをカウントし、細胞領域単位毎の、好ましくは細胞領域のμｍ^２毎の数で結果を表すことによって好ましくは測定される。変数は、複数の測定から、細胞単位毎のミトコンドリアの平均数を算出して取得されるとよい。この変数は分散記述子を算出することによって取得されてもよく、該分散記述子は、好ましくは分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。

第７の変数は、Ｖ１及びＶ３４、及びそれらの組合せからなる群より選択され、Ｖ１は各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であり、Ｖ３４は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。

変数Ｖ１は、各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、停止の数、即ち、ミトコンドリアが２フレームの間で不動である期間の数を記録することによって評価される。変数Ｖ１は、追跡される各ミトコンドリアについて、単位時間毎の停止の数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータから停止の平均頻度を算出することによって取得される。

変数Ｖ３４は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、バーストの数、即ち、撮影期間時にミトコンドリアの最大変位の３０％内の急激な変異の数を記録することによって評価される。つまり、変数Ｖ３４は、追跡される各ミトコンドリアについて、単位時間毎のバーストの数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータから、バーストの平均頻度を算出することによって取得される。

好ましい実施形態において、顕微鏡を介して観察されるミトコンドリアのイメージを記録且つ分析するため、例えば適切なソフトウエアを備えたコンピュ―タなどの記録及びデータ管理デバイスが用いられる。

各変数のために分析されるミトコンドリア及び細胞の数は、統計的方法を用いて、当業者によって容易に決定される。好ましくは、少なくとも３、１０、又は１５の細胞から、少なくとも５０、８０又は１００のミトコンドリアが各変数のために分析される。特定の実施形態において、少なくとも５０、８０又は１００のミトコンドリアが、変数Ｖ１、Ｖ３、及びＶ３４のために分析され、少なくとも１００、２５０、５００、８００、９００、又は１０００のミトコンドリアが、変数Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１９、Ｖ２９、及びＶ３０のために分析される。

本方法は、Ｖ５、Ｖ７及びＶ１１；Ｖ５、Ｖ２９及びＶ１１；Ｖ５、Ｖ３０及びＶ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１及びＶ３；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１及びＶ３；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１及びＶ３；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１及びＶ１９；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１及びＶ１９；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１及びＶ１９；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３及びＶ１９；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３及びＶ１９；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３及びＶ１９；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１２；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１２；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１２；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ１；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ３４；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、及びＶ３４；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９及びＶ３４；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ１；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ１；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ１；Ｖ１１；Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ３４；Ｖ５、Ｖ２９、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ３４；Ｖ５、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２及びＶ３４からなる群より選択される組合せの変数の値を測定することを含むとよく、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ２９、Ｖ３０、Ｖ１１、Ｖ３、Ｖ１９、Ｖ１２、Ｖ１、及びＶ３４は上述で規定されたとおりである。

特定の実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数Ｖ５、Ｖ７及びＶ１１を測定することを含む。特に好ましい実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、Ｖ３、及びＶ１９を測定することを含む。

代替的に、変数は、ＡＤ又はＰＡＤ患者の個体群からのサンプルにおいて測定されることが可能である。各変数について取得された値は平均化される。

各変数は、それらの重要度を調整するために重み付けされるとよい。

本発明のスクリーニング方法は、テスト化合物の存在下において、ステップｂ）で取得された変数の値を、テスト化合物の非存在下において取得された値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、テスト化合物の非存在下における値は、テスト化合物に接触させる前に、ステップｂ）における同様のサンプルの細胞において取得される。特定の実施形態において、これらの値は、ミトコンドリアを標識した後且つステップａ）の前に、つまり、テスト化合物に接触させる前に、標識されたミトコンドリアを含む細胞において、取得される。各変数の値は上述されるように測定される。テスト化合物の非存在下で取得された値は、ＡＤの処置に有用であり得る化合物を特定するために負の対照として用いられるとよい。

本方法は、テスト化合物の存在下、任意的に非存在下において取得された変数の値を、（テスト化合物の非存在下で）健康な対象から得られたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、健康な対象は、ＡＤのサンプルを提供するＡＤ患者とおよそ同様の年齢である。各変数の値は上記に詳細に記載されるように測定される。健康な対象のサンプルより取得された値は、ＡＤの処置に有用であり得る化合物を特定するために正の対照として用いられるとよい。代替的に、この正の対照は健康な対象の個体群からのサンプルにおける変数を測定することによって得ることができる。そして、各変数について得られた値は平均化される。

特定の実施形態において、ＡＤシグネチャの変数の値は、ＡＤにおけるテスト化合物の用量反応作用を測定するために、複数の濃度のテスト化合物の存在下において測定される。

測定値の有意差は、ＡＮＯＶＡなどの任意の適切な統計テストを用いて測定されるとよい。

各用量のテスト化合物についての変数のために取得された値は、識別する等式を用いて、スコアとして表されるとよい。各用量の作用は、負及び／又は正の対照に対して取得されたスコアについて評価されるとよい。

特に、各変数についてのスコアは、
変数Ｖｘのスコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
（ＮＣは負の対照の値又は平均値であり、ＰＣは正の対照の値又は平均値であり、Ｖａｒは変数の値である）である比率を用いて算出されるとよい。

表現型のレスキューの全体的な百分率は各測定変数のスコアを加算することによって取得されるとよい。

このように、結果は表現型のレスキューの百分率として表されるとよく、正の対照（健康なサンプル）が１００％であり、負の対照（テスト化合物の非存在下のＡＤサンプル）が０％である。

正の表現型のレスキューを示すテスト化合物、つまり、ＡＤシグネチャを部分的又は全体的に回復することが可能である化合物は、ＡＤの処置に潜在的に有用であると特定される。所定の実施形態において、テスト化合物は、表現型のレスキューが５０％を超える、さらに好ましくは６０％、７０％、８０％又は９０％を超える場合に、潜在的に有用であると特定される。

好ましくは、テスト化合物は、測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合、つまり各変数についてレスキューが観測される場合に、ＡＤの処置に潜在的に有用であると特定される。

他の態様では、本発明は対象におけるアルツハイマー病を診断するための方法に関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群より選択される変数、並びに、
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
であるミトコンドリア挙動変数の値を測定することを含む。

任意的に、該方法は、
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
であるミトコンドリア挙動変数の値を測定することをさらに含むとよい。

スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。

本方法は、診断される対象からのサンプルを提供することさらに含むとよい。

好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。

対象は、ＡＤと類似する臨床的徴候を示すか、或いはいずれの症状も示さなくともよい。

本方法は、テスト、特に遺伝子テストをおこなって、対象がＡＤを発症するリスクがあるかどうかを測定することをさらに含むとよい。例として、ＡＰＯＥε４対立遺伝子や、アミロイドペプチド前駆体、ＴＲＥＭ２、ＰＳＥＮ１、又はＰＳＥＮ２遺伝子における変異は疾患のリスクを増加させることが知られる。また、年齢、性別、心血管系リスク、糖尿病、うつ病、又は以前に起こった脳損傷などのその他のパラメータもＡＤ発症のリスクを評価するために考慮されることができる。

本方法は、ミトコンドリア挙動変数の測定値に基づいて対象がアルツハイマー病に罹患するかどうかを測定することをさらに含むとよい。ＡＤの診断は、対象のサンプルから取得されたスコアを、健康なひと又はＡＤ患者から取得されたサンプルのスコアと比較することによって得るとよい。

特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数Ｖ５、第２の変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１、を測定することを含み、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、第２の変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１における増大と、変数Ｖ５における減少とは、ＡＤを示す。本方法は、測定変数のｚスコアを算出することをさらに含むとよい。特に、ＡＤサンプルにおいて、第２変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１のｚスコアが正であり、変数Ｖ５のｚスコアは負である。さらに、変数Ｖ３及び／又はＶ１９は、ＡＤ及びＰＡＤ患者を区別するために用いられるとよい。このように、他の特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数Ｖ５、第２の変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１、並びにＶ３及び／又はＶ１９を測定すること、好ましくは変数Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、及びＶ１９を測定することを含む。

この実施形態において、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、第２の変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１における増大と、変数Ｖ５及びＶ１９における減少とは、ＡＤを示す。代替的に、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、第２の変数即ちＶ７、Ｖ２９及び／又はＶ３０、好ましくはＶ７、並びにＶ１１並びにＶ１９、任意的にＶ３における増大と、変数Ｖ５における減少とは、前駆症候性ＡＤ（ＰＡＤ）を示す。

本発明は、対象におけるアルツハイマー病の診断に有用な情報を提供するための方法にも関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
であるミトコンドリア挙動変数の値を測定することを含む。

任意的に、該方法は、
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
であるミトコンドリア挙動変数の値を測定することをさらに含むとよい。

上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。

他の態様において、本発明は、アルツハイマー病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするか、又は治療のためにアルツハイマー病に罹患する対象を選択するための方法にも関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）である、
（ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
（ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに
（ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子（Ｖ１１）、
の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である、
（ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は
（ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
の値を測定するステップと、
ｂ）ステップａ）において処置の適用の前後に取得された測定値を比較するステップとを含む。

スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。

ＡＤに罹患する対象は疾患の任意の段階、特に無症候又は症候的段階ににあってよい。好適には、対象は疾患進行の早期段階にある。さらに好適には、対象はＰＡＤ対象である。

好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。

本方法は、処置の適用の前及び／又は後に、好ましくは処置の前後に、対象からのサンプルを提供することをさらに含むとよい。

治療は、上述で規定されるような、１又は複数の化学的又は生物学的化合物、及び放射線を適用することを含むとよい。

スクリーニング方法について上述されたように、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数のために取得された値は、スコアとして表されるとよい。つまり、治療の効果は処置の前と後とに取得されたスコアを比較することによって評価されるとよい。任意的に、スコアは、健康なサンプル又は健康なサンプルの母集団から取得されたスコアと比較されてもよい。

特に好ましい実施形態において、スコアは、スコア=（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）である等式を用いて各変数のために算出され、ＮＣは処置の適用前に取得された値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは変数の測定値である。測定されたすべての変数が正のスコアであるとき、患者は治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。１又は複数の変数が負のスコアである場合、治療は疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要がある。

結果は表現型のレスキューの百分率として表されてもよく、正の対照（健康なサンプル）は１００％であり、負の対照（いずれの処置もおこなわれないＡＤ又はＰＡＤのサンプル、好ましくはＡＤのサンプル、即ち処置の適用前に取得されたＡＤサンプル）は０％である。正の表現型のレスキューは、ＡＤ又はＰＡＤ患者が治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができることを示す。一方で、負の表現型のレスキューは、治療が疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要があることを示す。

本発明のさらなる態様及び有利性は以下の実施例に記載される。これは例示として考えられ、限定するものではない。

＜実施例＞
［実施例１：アルツハイマー病シグネチャ］
〔皮膚生検サンプル採取〕
皮膚生検は、５人の健康な対象、８人のＡＤ患者、及び４人の前駆症候性ＡＤ患者を含む、１８人のヒト提供者から採取された（表１）
表１はコホート特性を示す。

健康、前駆症候性、及び疾患のそれぞれの対象において、年齢の範囲を４０歳の凡そ前後１０年内に限定することによって起こり得る交絡的な年齢の影響を最小化するために、コホートを選択した。前駆症候の患者は、ＡＤとＰＡＤとの２つのグループを区別可能であるシグネチャを見出し、早期段階におけるアルツハイマー病の診断の可能性を示すために選択された。ＰＡＤグループは軽度認知障害（ＭＣＩ）を有する２人の患者を含み、１人の患者はプレセニリン変異を有し、１人の患者は後に疾患に進展する疾患を発症するリスクがある。死後の生体組織検査によって、ＡＤグループのうちの２５％においてＡＤを確認した。他の２５％は疾患発症の高リスクと関連するＡｐｏＥ４遺伝対立因子を発現した。

〔細胞培養〕
患者由来の線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭにおいて培養した。サンプルの細胞は増殖され、少なくとも１６〜２０継代の間安定的であった。

〔動的イメージング〕
線維芽細胞を、ミトコンドリア膜電位に感受性がない細胞透過性ミトコンドリア色素であるミトトラッカーグリーンを用いて、３０分間標識した。落射蛍光顕微鏡により、イメージを６分間継続的に記録した。イメージ撮影の間、細胞を３７℃に保持した。各実験条件において、３つの独立したプレートのウェル毎に３〜１５細胞、つまり、６０００までの個別のミトコンドリアが記録された。データ取得の最大期間は３０分（つまり、６分間観測された５個の細胞）であった。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ顕微鏡を用いて、空間における３次元と時間とにおいて、イメージを撮影した。

〔ＡＤシグネチャのマーカの特定〕
ミトコンドリアの挙動を規定し、Ｖ１〜Ｖ３７にラベル付けされた３７個の変数を共に測定する。これらの変数は、ミトコンドリアの運動性、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの網様ネットワーク、又は細胞骨格との関係性及びミトコンドリア透過性を示した。

統計的方法（主成分分析、階層的クラスタ分類、判別分析、及びＡＮＯＶＡ）を用いて、３つの変数（Ｖ５、Ｖ７、及びＶ１１）が、ＡＤ及びＰＡＤサンプルから健康なサンプルを１００％の正確性で区別するのに十分であることがわかった。

Ｖ５は、細胞領域の平均、又は細胞の領域の分散記述子である。

Ｖ７は、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域である。

Ｖ１１は、総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞の領域の分散記述子である。

発明者等は、このシグネチャにおいて、Ｖ７は、
７０〜１００μｍ^２の領域を表すミトコンドリアの頻度であるＶ２９、又は
１００〜２００μｍ^２の領域を表すミトコンドリアの頻度であるＶ３０によって置換され得ることを発見した。

さらにまた、２つの追加的変数、即ちＶ３とＶ１９とを用いて、対象の３つのグループ（健康、ＡＤ、及びＰＡＤグループ）における対象者のすべてを適切に分類することが可能であることも分かった。

Ｖ３は、ミトコンドリアの移動速度の分散記述子である。

Ｖ１９は、２．６〜３．１μｍ^２の領域を表すミトコンドリアの頻度である。

ウォード法を適用し、５つの変数（Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、及びＶ１９）により取得された階層的クラスタ分析の樹状図を図１に示す。クラスタ分析は（ｉ）健康な対象群（上部のグループ）、（ｉｉ）ＰＡＤ１４対象が不適切に配置されたＡＤ患者群（中央部のグループ）、及び（ｉｉｉ）ＡＤ１２対象が不適切に配置されたＰＡＤ患者群（下部のグループ）からなる３つのサブグループを示す。不適切に配置されたＰＡＤとＡＤとの患者は、それらの不適切なグループへの分類の説明になり得る特異性を有する。ＰＡＤ対象の１４番がプレセニリン遺伝子１における変異を保持する一方で、ＡＤ対象の１２番は、他のすべての対象である白人人種と比較して、アジア系人種である。

コホートの各患者において、各変数について調査されたミトコンドリアの数は、Ｖ５において３３１５〜１５２３７、Ｖ３において１３９〜４６１、Ｖ７において３３１５〜１５２３７、Ｖ１１において３３１５〜１５２３７、及び
Ｖ１９において３３１５〜１５２３７であった。これらの結果から、対象から取得された実際の値に対応するヒートマップを得た（図２）。

ＡＤ患者は、変数Ｖ５における減少と、Ｖ７及びＶ１１における増大とによって特徴づけられる。ＰＡＤ患者は、Ｖ５における減少と、Ｖ３、Ｖ７、Ｖ１１、及び主にＶ１９における増大とによって特徴づけられる（図３）。

５つの変数を含むシグネチャの強固性をテストし、９回の個々の実験において２１５個の細胞から約３９，０００のさらなるミトコンドリアを分析すること、選択された提供者のペア（１人の健康な対象と１人のＡＤ患者）で階層的クラスタ分析を繰り返すこと、により確認した。これらの提供者のペアは実施例２において続いて用いられた。

［実施例２：ＡＤシグネチャの回復］
〔参考化合物〕
レスベラトロールはブドウや赤ワインに見受けられる植物性ポリフェノールである。レスベラトロールは、老化、代謝障害、炎症、及びがんにおける有益な効果と関連する。レスベラトロールは、その物理化学的特性により損なわれる低い生物学的利用能にもかかわらず、アミロイド前駆体タンパク質の非アミロイド形成的切断を促進し、アミロイドベータペプチドの除去を増進させ、神経細胞の損傷を低減することを示す（Ｌｉ等、２０１２年；Ｖａｎｇ等、２０１１年；Ｓｍｏｌｉｇａ等、２０１１年；Ｐａｔｅｌ等、２０１１年；Ｔｉｍｍｅｒｓ等、２０１１年；Ａｌｂａｎｉ等、２０１０年）。臨床試験は、米国で、アルツハイマー病におけるレスベラトロールの治療的可能性をテストするために現在おこなわれている。

アロプレグナノロンはＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであり、ＡＤ患者の新皮質領域における内在性の神経発生を刺激することが可能である（Ｂｒｉｎｔｏｎ等、２００６年）。ＡＤの種々のトランスジェニックマウスモデルにおけるアロプレグナノロン処置の治療的効果について、文献には相反する結果が見受けられる（Ｃｈｅｎ等、２０１１年；Ｓｉｎｇｈ等、２０１２年；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ等、２０１２年；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ等、２０１３年）。アロプレグナノロンは、現在、臨床試験においてテストされている。

イマチニブも、アミロイド細線維化（Ｆｒａｅｒｉｎｇ等、２００５年；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、２０１１年）とタウのリン酸化（Ｃａｎｃｉｎｏ等、２００８年）とにおける作用を有すると報告されているため、使用された。しかしながら、イマチニブは血液脳関門を越えず、顕著な心臓性毒性と関連する。

〔材料と方法〕
患者由来の線維芽細胞を、１５％ウシ胎児血清と、ミトコンドリアの挙動において不活性であるとして知られる濃度である０．５％ＤＭＳＯとを含むＤＭＥＭにおいて培養した。

細胞を、ＤＭＳＯに希釈された様々な用量の参考化合物（レスベラトロール、アロプレグナノロン、若しくはイマチニブ）とともに、又はビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）で、３０分間インキュベートし、動的イメージ撮影中にさらに３０分間、低速度ビデオ顕微鏡を用いて観察した。

参考化合物を、３．５ｌｏｇ（１０、１、０．１、及び０．０５μＭ）にわたる３又は４用量でテストした。これらの濃度は、新薬の開発につながるような多くの小分子の循環レベルと一致し、ＰＫ・ＰＤ（薬物動態学・薬力学）研究がおこなわれるときに最大血中濃度に基づく用量の範囲内にある。

負の対照はビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）で処置された罹患細胞を含み、正の対照はビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）で処置された健康な細胞を含む。

参考化合物を罹患細胞においてテストし、２つの対照と比較した。

すべての生データを対照値の百分率として表した（健康な対照＝１００％、ＡＤの対照＝０％）。

シグネチャ変数のデータ分析は、測定された記述子のロジックにおける分岐を特定するように特に調製された。ミトコンドリアの網様構造によって定められたこれらの分岐及び適応型により、細胞がどのようにテスト要素に適応するかについての重要な理解が得られる。各個々の変数における疾患の影響を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて従来の線形分析によって分析した。グループ間の有意差はボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）のポストホック分析によって求められた。

〔結果〕
・レスベラトロール
ＡＤシグネチャを構成する５つの変数におけるレスベラトロールの作用の用量反応分析は図４に示される。

作用は疾患の表現型の百分率として表される。０％は疾患の状態を表し、１００％は健康な状態を表す。

レスベラトロールを、ＤＭＳＯにおける０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭでテストした。レスベラトロールは、Ｖ３について疾患表現型の回復に有効であったが、Ｖ５及びＶ７では一進一退の作用を示した。レスベラトロールの作用により、Ｖ１１とＶ１９では疾患の表現型が大きく悪化した。

レスキュー全体における異なる変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果としての作用プロファイル（図５）は、０．１μＭと１μＭとのレスベラトロールがＡＤ表現型に対してレスキューを示さず、疾患の状態を悪化させる有害な作用を示したことを表す。一方で、１０μＭでは、レスベラトロールは６３％の回復を示した。

・アロプレグナノロン
ＡＤシグネチャを構成する５つの変数におけるアロプレグナノロンの作用の用量反応分析は図６に示される。

作用は疾患表現型の百分率として表される。０％は疾患の状態を表し、１００％は健康な状態を表す。

アロプレグナノロンを、ＤＭＳＯにおける０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭでテストした。レスキューは、Ｖ３におけるすべてのテスト用量と、Ｖ５における１μＭ及び１０μＭとで得られた。Ｖ１９においてアロプレグナノロンの効果は得られなかった。Ｖ７及びＶ１１では、アロプレグナノロンの作用は、最低テスト用量において有害であり、薬剤濃度が高くなると改善される傾向があったが、疾患表現型が回復されるレベルではない。

レスキュー全体における異なる変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果としての作用プロファイル（図７）は、１μＭと１０μＭとのアロプレグナノロンが、１μＭで全体的な３６％の有効作用に達する、ＡＤ表現型に対する用量依存的なレスキューを得たことを示す。

・イマチニブ
ＡＤシグネチャを構成する５つの変数におけるイマチニブの作用の用量反応分析は図８に示される。

作用は疾患表現型の百分率として表される。０％は疾患の状態を表し、１００％は健康な状態を表す。

イマチニブを、ＤＭＳＯにおける０．０５μＭ、０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭでテストした。イマチニブは、健康な対象由来の細胞と比較可能なレベルへのＶ５、Ｖ７、及びＶ１９の変化を示す最低テスト用量において、有意な疾患修飾能を示した。Ｖ３とＶ１１とは０．０５μＭでは影響を受けない。Ｖ３は用量の増加により改善する傾向があるが、Ｖ１１は悪化する。

レスキュー全体における異なる変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果としての作用プロファイル（図９）は、イマチニブが、疾患表現型の全体のレスキューにおける有効性の用量依存的な減少を示したことを提示する（図９）。５４％の最高レスキューは、０．０５μＭである最低テスト用量において得られた。より低い用量が効果的であるかを見るためにテストされたが、効果を示さず（図示せず）、この薬剤によりＡＤ処置をする機会が非常に少ないことを示唆する。

〔結果〕
これらの結果は、発明者等により示された、５つの変数を含むＡＤシグネチャが、ＡＤ、ＰＡＤ患者、及び健康な対象を区別するのに適し、最小限の侵入的な皮膚生検から前駆症候性段階を含む疾患進行のいくつかの段階におけるＡＤ診断をする基礎をなし得ることを示す。

また発明者等は、このＡＤシグネチャが回復されることができるため、用量依存的方法においても化合物の疾患修飾特性の検討を可能にすることも示した。実施例として、動物における疾患回復能を有することは以前に示されたが物理化学的特性と耐性の問題とのためヒトにおいては薬剤化されないレスベラトロール、アロプレグナノロン、及びイマチニブの３つの化合物が、用量依存的方法においてＡＤシグネチャを回復する能力を有することが示された。このように、このシグネチャは、ＡＤ処置に有用である新規の薬剤をスクリーニング及び特定するための有効な手段として用いられることができる。

ＡＤ患者における化合物投与前又は後に、このシグネチャの発展をモニタリングすることが可能であることから、このシグネチャは特に臨床試験において治療有効性の代用マーカとしても用いられ得る。

＜参考文献＞
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Claims (22)

1. アルツハイマー病の処置に有用な化合物をインビトロにおいてスクリーニングする方法であって、
   ａ）アルツハイマー病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
   ｂ）接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
   （ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
   （ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
   （ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞領域の分散記述子（Ｖ１１）、
   の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
   （ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
   （ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
   の値を測定するステップとを含む方法。
2. 前記ステップｂ）において取得された前記値を、前記テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 各前記変数について、
   スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
   である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、ＮＣは前記テスト化合物の非存在下においてアルツハイマー病に罹患する対象のサンプルから取得された前記値又は平均値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは測定された前記変数の値である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記テスト化合物は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、アルツハイマー病の処置に有用であると特定される、請求項３に記載の方法。
5. 対象におけるアルツハイマー病を診断するためのインビトロの方法であって、
   前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
   （ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
   （ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
   （ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞領域の分散記述子（Ｖ１１）、
   の値の測定と、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
   （ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
   （ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
   の値の測定とを含む方法。
6. 前記対象はアルツハイマー病に類似する臨床的徴候を示すか、或いはいずれの症状も示さない、請求項５に記載の方法。
7. 測定された前記変数のｚスコアを算出することをさらに含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。
8. 前記（ｉｉ）の変数、好ましくはＶ７、及び前記変数Ｖ１１の正のｚスコア、並びに前記変数Ｖ５の負のｚスコアは、前記対象がアルツハイマー病に罹患することを示す、請求項７に記載の方法。
9. 前記（ｉｉ）の変数、好ましくはＶ７、及びＶ１１、Ｖ１９、及び／又はＶ３、の正のｚスコア、並びに前記変数Ｖ５の負のｚスコアは、前記対象が無症候段階のアルツハイマー病に罹患することを示す、請求項７に記載の方法。
10. アルツハイマー病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロの方法であって、
    ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数である
    （ｉ）細胞領域の平均、又は細胞領域の分散記述子（Ｖ５）、
    （ｉｉ）７０〜１００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
    （ｉｉｉ）総細胞領域の百分率として表される、ミトコンドリアでカバーされた細胞領域の平均、又はミトコンドリアでカバーされた細胞領域の分散記述子（Ｖ１１）、
    の値を測定し、任意的に、ミトコンドリア挙動変数である
    （ｉｖ）ミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３）、及び／又は、
    （ｖ）２．６〜３．１μｍ^２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１９）、
    の値を測定するステップと、
    ｂ）前記ステップａ）において前記処置の適用の前後に測定されて得られた前記値を比較するステップとを含む方法。
11. 各前記変数について、
    スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
    である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、ＮＣは前記処置の適用前に取得された前記値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは測定された前記変数の前記値である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記対象は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、前記治療に反応的であるか、又は前記治療による効果を得ることができる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法は、請求項１、請求項５、及び請求項１０のいずれか１項において規定される前記ミトコンドリア挙動変数Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７、Ｖ１１、及びＶ１９を測定することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記方法は、変数である
    （ｖｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、並びに、
    （ｖｉｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、
    からなる群より選択される、少なくとも１つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記方法は、測定された前記ミトコンドリア挙動変数の値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択され、好ましくは皮膚生検サンプルである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記生細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記生細胞は線維芽細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記分散記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記生細胞に含まれる前記ミトコンドリアは前記ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に標識される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記生細胞の前記ミトコンドリアは、好ましくは蛍光標識を用いて、より好ましくはミトトラッカーグリーン、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択される色素を用いて、さらにより好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ミトコンドリア挙動変数の値は、イメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又はＤＩＣ顕微鏡を用いて、好ましくはＣＣＤカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。