CN110964801A - hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了hsa‑miRNA‑451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用。本发明是基于本发明发明人发现hsa‑miRNA‑451a表达上调，提示患者具有帕金森病认知功能障碍血清所作出的发明创造。本发明还提供了一种用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物。该miRNA标志物可单独、联合或与外泌体蛋白组学相关研究相结合，明确帕金森病认知障碍病理生理机制、提高早期诊断效率，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。

Description

hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志 物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术与医药领域，尤其涉及hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大常见的神经退行性疾病。PD的特征性病理改变主要表现为中脑黑质多巴胺(DA)能神经元变性、残存神经元胞质内路易小体形成以及纹状体DA含量降低，从而表现出静止性震颤、肌僵直、运动迟缓等一系列运动症状。以往，医生和患者主要关注PD运动症状，然而，近年来，PD非运动症状逐渐引起了关注。认知障碍是一种常见的非运动症状。帕金森病轻度认知功能障碍(Parkinson’s disease withmild cognitive impairment，PD-MCI)介于PD认知功能正常与PD痴呆(Parkinson’sdisease dementia,PDD)之间的一种过渡状态，可能在PD患者早期阶段，甚至在新近诊断的PD患者中出现，是众多基础和临床研究工作者关注的热点。研究表明，在认知功能正常的PD患者(n＝142)中，28.9％的患者5年内发展成为PD-MCI，39.1％的PD-MCI患者5年内发展为PDD，PD-MCI持续1年的患者痴呆转化率为59.1％。在研究过程中，部分PD-MCI患者认知恢复正常，但与认知功能正常的患者相比，在随访前3年恢复正常认知的PD-MCI患者随后发生痴呆的风险增加。长期随访研究发现，达83％的PD患者在发病20年后进展为PDD。由此可见，早期PD-MCI，无论是持续或恢复到认知功能正常，对于PD患者预测PDD均具有预后判断价值。

外泌体(Exosome)是细胞分泌的直径为40-100nm的微小膜泡，其具有脂质双层膜结构。外泌体携带蛋白质、脂质以及RNAs，介导体内不同类型细胞之间的通讯，从而影响免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等正常或病理状态。包括神经元在内的多种类型的细胞都可以释放外泌体，不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此，除了作为细胞间通讯介质之外，越来越多的研究认为外泌体可作为疾病的生物标志物和预后因子。例如，从阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)患者的脑脊液样品提取外泌体可检测到一种AD既定的生物标志物苏氨酸181磷酸化的tau蛋白；α-突触核蛋白是一种在PD的发病机制中起重要作用的肽，可在PD体外模型中获得的外泌体中发现，有研究证实溶酶体功能障碍会导致外泌体中α-突触核蛋白释放的增加，并加速外泌体α-突触核蛋白的释放、促进周围细胞病变，导致疾病的发生。帕金森病等神经退行性疾病是神经元逐渐退化的结果，最终将导致残疾，其早期治疗至关重要，因此迫切需要特异性和敏感性的生物标志物实现这类疾病的早期诊断及病情追踪随访。外泌体与神经退行性疾病密切相关，大量文献报道外泌体参与了与错误折叠蛋白相关的神经退行性病变的发展。脑脊液和外周血外泌体的RNA/蛋白质成分可作为某些神经退行性疾病的早期诊断标志物，是中枢神经系统疾病很有应用前景的生物标志物来源。

microRNA(miRNA)是一类内源性非编码单链RNA分子，可通过促进靶mRNA降解或抑制其翻译起到转录后调节作用，从而发挥其生物学效应。生物信息学预测表明，miRNA能调控超过60％的基因，在细胞发育、分化、增殖、凋亡、迁移及代谢等过程中都具有重要作用。近年来，研究发现哺乳动物环状RNA缺失可引起miRNA调控并影响大脑功能；外泌体包裹分泌出miRNA，其脂质双层膜结构能很好的保护miRNA，外泌体中的miRNA比细胞内呈现出更高的浓度，其异常表达与机体变化密切相关，尤其与包括PD、AD等在内的多种神经退行性疾病关系密切。miRNA不仅可能是PD诊断病例标志物，也可能参与PD的发生发展过程。通过hsa-miRNA-195表达上调，hsa-miRNA-185、hsa-miRNA-15b、hsa-miRNA-221及hsa-miRNA-181a表达下调的模式能准确区分PD患者和健康对照，可作为诊断PD的潜在血清标志物。有研究表明，miRNA-205在PD患者的额叶皮质中表达明显下降，中脑黑质中miRNA-34b和hsa-miRNA-34c表达下调，hsa-miRNA-13b主要在黑质多巴胺能神经元中表达。有研究发现5个在PD患者大脑扣带回上调的hsa-miRNA-144、hsa-miRNA-199b、hsa-miRNA-221、hsa-miRNA-488及hsa-miRNA-544与SNCA、PARK2及LRRK2转录水平的降低相关。还有研究表明PD大脑中出现多种miRNA的上调或下调，但目前的研究并没有得到一致结论。最近有关人和动物的研究已经在PD脑组织样品中发现了大量表达上调或下调的miRNA，其中异常调节miRNA的靶基因有：SNCA、PARK2、LRRK2、TNFSF13B、LTA、SLC5A3、PSMB2、GSR、GBA、LAMP-2A、HSC。miRNA-7和miRNA-153抑制SNCA的表达，miRNA-205对LRKK2的直接抑制已得到证实，miRNA-16-1通过靶向调控热休克蛋白70促进PD异常α-突触核蛋白积累。多项研究表明，炎症、氧化应激、凋亡及自噬都是PD的主要病因之一，miRNAs具有调节氧化应激和防止ROS介导的多巴胺能神经元损伤的作用，miRNA-181a通过抑制p38MAPK/JNK通路调节PD细胞凋亡和自噬，而miRNA-124可调节MPTP模型中细胞凋亡和自噬过程，从而减少DA能神经元的丢失，提示了特异性miRNA可能是PD新的治疗策略的靶点。

PD认知功能障碍，尤其是PDD会严重影响PD患者的生活质量、增加照料者的负担、加重患者运动症状及增加患者死亡率，因此，针对PD-MCI开展研究对于预防PDD的发生具有重要意义。前期研究中有学者选择miRBase、miRanda、TargetScan、PicTar数据库或预测软件预测hsa-miRNA-451靶基因，并对预测的hsa-miRNA-451靶基因的基因集合进行功能富集分析和信号转导通路富集分析。研究发现至少3个数据库或预测软件预测到hsa-miRNA-451靶基因的靶点18个；功能富集分析预测的结果显示，hsa-miRNA-451靶基因主要参与上皮细胞增生、发育以及调节酶活性相关生物过程(p＜0.05)；信号转导通路富集分析预测的结果显示，hsa-miRNA-451靶基因显著富集于转化生长因子-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、表皮生长因子信号通路、Wnt信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路等(P＜0.05)。因此，hsa-miRNA-451可调控与上皮细胞增生、发育相关的多个信号通路(陈振娜,邵彦,李筱荣.hsa-miRNA-451靶基因预测及生物信息学分析[J].中华眼底病杂志,2015,31(6):597-599.)。miRNA-451与巨噬细胞抑制因子(macrophageinhibition factor，MIF)之间存在一种负调控作用，miRNA-451表达上调可抑制MIF功能的发挥。MIF作为免疫系统和内分泌系统重要的介质之一，在血管性病变中发挥着重要作用。不同的研究一致表明，MIF的血清水平在患有2型糖尿病的肥胖受试者和并发微血管病变(肾病，视网膜病和糖尿病足综合征)的糖尿病患者中升高。MIF可通过PI3K促进IL-8、ICAM-1、VCAM-1等细胞因子的释放，从而促进血管新生。因此，MIF参与大血管病变、血管介入治疗后再狭窄、以及糖尿病相关的微血管病变、血管新生等过程。因此，miRNA-451/MIF可引起脑微血管病变、微循环灌注不足参与PD认知障碍的发生。PD患者血清外泌体的基因组学的研究可为PD认知功能障碍诊断提供生物标志物，提高PD认知功能障碍早期诊断效率。目前，国内外均未见到PD认知功能障碍患者血清外泌体miRNA标志物方面的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物。

本发明的目的之三在于提供上述用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用，是基于本发明发明人发现hsa-miRNA-451a表达上调，提示患者具有帕金森病认知功能障碍。

所述的hsa-miRNA-451a为成熟的hsa-miRNA-451。

所述的hsa-miRNA-451a来自外周血血清中的外泌体。

所述的hsa-miRNA-451a能用于PD认知功能障碍的早期临床筛查及预后监测，从而在制备帕金森病认知功能障碍诊断制剂中进行应用。

一种用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物，包括hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p。

上述用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物在制备帕金森病认知功能障碍诊断试剂盒中的应用。

本发明对正常人、PD认知功能正常患者和PD轻度认知障碍患者外周血血清外泌体miRNA表达谱进行分析、研究，对比分析PD患者与对照者血清外泌体中的差异miRNA。结果表明，miRNAhsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p在PD认知功能正常患者和PD-轻度认知功能障碍患者中共同存在表达上调。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.发明人经过对比分析PD患者与对照者血清外泌体中的差异miRNA，发现可将外周血血清外泌体中的生物学检测指标hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p用作检测帕金森病认知功能障碍的生物标志物，其中，hsa-miRNA-451a表达上调并参与帕金森病脑微血管病变，其表达差异可有效识别帕金森病，且能预测帕金森病认知功能障碍的发生风险。

2.本发明的hsa-miRNA-451a可用以开发检测试剂盒，以提高帕金森病认知功能障碍诊断的敏感性和特异性。

3.本发明提供的用于诊断帕金森病认知功能障碍miRNA标志物可单独、联合或与外泌体蛋白组学相组合，明确PD认知障碍病理生理机制，提高PD认知障碍早期诊断效率。

附图说明

图1是血清外泌体的粒径和浓度分析图；其中，图A是血清外泌体的照片图，图B是血清外泌体的粒径和浓度的三维图，图C是不同粒径的血清外泌体的浓度图，图D是血清外泌体粒径的统计结果报告照片图。

图2是血清外泌体的表面标志物检测结果和形态学特征图；其中，图A是Westernblot检测外泌体表面的标志物的结果图；图B是电镜下血清外泌体的形态特征照片图。

图3是HC与PD-NC、PD-NC与PD-MC以及HC与PD-MCI差异的miRNA表达谱图；其中，图A是HC与PD-NC差异的miRNA表达情况，图B是PD-NC与PD-MC差异的miRNA表达情况，图C是HC与PD-MCI差异的miRNA表达情况，每个小方格代表一个基因，颜色表示基因的表达量大小，表达量越大颜色越深(红色为上调，绿色为下调)，每行表示每个基因在不同样本中的表达量情况，每列表示每个样品中所有基因的表达量情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1筛选外周血血清外泌体中表达变化的miRNA

1.研究对象

选取就诊于广东省人民医院神经科的2例PD患者，参照MDS PD-MCI诊断标准，将PD患者分为PD-NC组和PD-MCI组。另选取1例年龄、性别和受教育程度相匹配的健康人作为对照组。此研究患者均知情、自愿，并签署知情同意书。患者症状均由两位主治或以上职称的神经科医师独立诊断。以下是对患者的评定标准。

1.1PD患者

入选标准：

(1)根据英国脑库PD诊断标准和2006年中国运动障碍及帕金森学组制定的PD诊断标准确诊。

(2)右利手。

排除标准：

(1)患有继发性帕金森综合征和帕金森叠加综合征。

(2)合并严重心功能不全或肝肾功能不全。

(3)有失语、谵妄、意识障碍或其他影响认知功能评价疾病。

(4)近3个月内有过急性脑血管病史。

(5)有活动性癫痫或精神病史。

(6)接受过颅内手术治疗。

1.2PD-MCI组

选取1例根据2012年国际运动障碍协会(MDS)公布的PD-MCI诊断标准确诊的患者。

入选标准：

(1)符合英国脑库的PD诊断标准。

(2)诊断PD后，主诉进行性认知功能下降，并由知情者或临床医师证实。

(3)对患者的四个认知域：注意、视空间、执行以及记忆进行评估，至少一项认知域的评估量表评分小于1.5个标准差。

(4)日常生活基本保持正常，某些复杂精细工作的完成可能有困难。

排除标准：

(1)符合2007年MDS的PDD诊断标准。

(2)患有导致痴呆的其他疾病。

(3)PD伴发会影响认知功能评估结果的其他疾病。

1.3PD-NC组

选取1位认知功能正常，未达到PD-MCI或PDD诊断标准的PD患者。

1.4健康对照组(HC组)

选择1位无神经疾病和精神病病史，磁共振检查无结构异常，年龄、性别和受教育程度与PD-NC组和PD-MCI组相匹配的健康人作为对照组。

2研究方法

2.1评估方法

评估依据MDS发布的PD-MCI诊断标准，结合认知功能评估，参考日常生活能力受损情况，排除严重抑郁及痴呆。

2.1.1人口统计学调查：

收集入组三人的临床资料，包括：年龄、性别、文化程度、起病年龄、病程、首发症状、伴发症状、异动症、吸烟饮酒史以及伴有的其它系统的疾病(高血压、糖尿病等)。

2.1.2临床评估：

(1)运动功能：采用帕金森病统一评定量表(Unified Parkinson Disease RatingScale,UPDRS)第III部分Hoehn&Yahr分级量表对病情严重程度进行分级评估。

(2)焦虑、抑郁状况：采用17项汉密尔顿焦虑量表(Hamilton Anxiety Scale,HAMA)和24项汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)进行评估。

(3)日常行为能力：采用14项日常生活能力量表(Activities of Daily Livingscale,ADL)进行评估。

2.1.3认知功能评估：

(1)整体认知功能：采用简易精神状态量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)进行评估。

(2)记忆力：采用韦氏记忆量表(WMS)中视觉再认和再生(Verbal PairedAssociates、VisualReproduction)、理解记忆(Logical Memory)进行评估。

(3)执行功能：采用韦氏智力量表(WAIS-R)中图形排列(Picture Arrangement)及相似性(Similarities)评估。

(4)注意力：采用数字广度(Digit Span)评估。

(5)视空间功能：采用韦氏智力量表(WAIS-R)中积木测试(Block design test)评估。

2.2实验方法

2.2.1血浆收集

(1)用肝素抗凝管采集外周血2mL，并于1h内处理。

(2)将外周血4℃，1000×g离心10min。

(3)取1mL上清移至洁净的1.5mL离心管中，4℃、12000rpm离心10min，取上清移至新的离心管中，放入-80℃冰箱中保存。

2.2.2血浆预处理

(1)每0.5mL血浆加入5μL PBS(0.01M、pH7.4)溶解纯化凝血酶(浓度为500U/mL)，使凝血酶终浓度为5U/mL。

(2)将加入凝血酶的血浆室温下静置5min，轻弹，缓慢混合。

(3)将混合后的血浆10000rpm离心5min，离心管管底可见纤维蛋白颗粒，将上清液转移到新的EP管中。

(4)用沉淀溶液处理上清液，5℃下沉淀外泌体30-60min，弃上清，获得外泌体。5℃下沉淀外泌体30-60min，弃上清。

2.2.3外泌体分离

(1)在250μL外泌体样品中加入63μL Exoquick溶液，冰上孵育30min。

(2)1500×g离心30min，1500×g离心5min，移除上清液。

(3)100μL PBS悬浮沉淀。

2.2.4NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪鉴定外泌体

外泌体是直径约为30-150nm的微囊泡，利用NanoSightt纳米颗粒跟踪分析仪来检验富集颗粒的颗粒度和直径是否符合外泌体直径特征，外泌体的颗粒数量在10⁷-10⁸时样品为最佳。

(1)获得的外泌体浓缩液稀释100倍，进行检测。

(2)软件输出报告。

2.2.5透射电镜检测(TEM)鉴定外泌体

(1)外泌体重悬后吸取10μL，用浓度为体积百分比2.5％的戊二醛固定2h。

(2)用PBS(0.01M、pH7.4)清洗3次，每次10min。

(3)用1％-2％的锇酸固定2-3h。

(4)用磷酸缓冲液清洗3次，每次10min。

(5)将磷酸缓冲液清洗后的外泌体悬液滴至铜网，以2.5％磷钨酸负染15s。

(6)透射电镜观察。

2.2.6Agilent 2100生物分析仪质控、分析、鉴定外泌体

(1)提取的miRNA采用DNaseI处理和DEPC处理水溶解处理。

(2)用Agilent 2100生物分析仪检测溶解后的样本。

2.2.7Western blot鉴定外泌体

(1)凝胶的配制

1)配制12％凝胶，其中，各成分见表1。

表1 12％凝胶成分表

2)将配制的12％凝胶混匀，倒入玻璃板中，在胶液面上注入0.5mL异丙醇。

3)分离胶凝固后(约30min)倒出覆盖的异丙醇，用滤纸吸净残留液体。

4)制备浓缩胶，其中，各成分见表2。

表2浓缩胶成分表

5)在分离胶上层倒入浓缩胶，将干净的样品梳插入胶内，静置30min。

(2)样品的处理

裂解后的外泌体样品12000rpm离心20min，取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，取100μL样品并加入5×蛋白上样缓冲液25μL，吹打混匀。样品煮沸处理10min，冷却后待用。

(3)免疫印迹

1)样品处理好后进行上样，每孔上样量10μL，所含蛋白量30μg，接通电源调节电压至80V，当溴酚蓝到达分离胶后(约30min)，将电压提高至120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm处。

2)将PVDF用甲醇活化5min，膜、胶以及滤纸按序叠加，90V转膜1.5h。

3)转膜结束后，将膜放入浓度为5％的脱脂奶粉，常温孵育2h。

4)用TBST洗膜3次，每次10min，分别加入Anti-CD9抗体、Anti-CD63抗体，4℃孵育过夜。

5)一抗孵育后用TBST洗膜4次，每次5min，再加入HRP标记二抗，常温振荡孵育1h，二抗孵育结束后用PBST洗膜5次，每次间隔5min。

6)配发光液并显影。

(4)实验结果分析

采用ImageJ软件来分析蛋白条带。

2.2.8Total RNA抽提

用Invitrogen Trizol提取总RNA。采用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀为1.8-2.0才可用于荧光定量检测。

2.2.9测序步骤

1)A₂₆₀/A₂₈₀为1.8～2.0的样品总RNA采用NanoDrop ND-2000定量。

2)Agilent 2100生物分析仪检测总RNA完整性。

3)根据芯片标准流程进行标记、芯片杂交以及洗脱。

4)总RNA去磷酸化，变性，采用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记。

5)标记好的总RNA纯化后和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。

2.3数据分析

采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)处理原始图像、提取原始数据。接着利用Genespring软件(version13.1，AgilentTechnologies)进行quantile标准化和后续处理。对标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少保留一组100％标记为Detected的探针，进行后续分析。利用倍数变化值进行差异miRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0。

3结果

3.1Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪测量外泌体粒径和浓度

本研究中使用250μL血浆提取外泌体，沉淀用100μL PBS重悬，然后稀释100倍进行测量，结果显示外泌体呈不规则的布朗运动，直径D10-D90为135.0nm～216.5nm，250μL血浆可提取到约10¹⁰个外泌体(见图1)。

3.2Western blotting鉴定外泌体表面标志物

四旋蛋白是常见的外泌体特异性标志物，主要包括CD9、CD63和CD81的膜蛋白。本研究采用Western blot方法检测外泌体标记蛋白CD9、CD63的表达情况，发现检测外泌体均表达CD9和CD63(见图2A)。

3.3透射电镜(TEM)鉴定外泌体形态

透射电镜最常用于进行外泌体的形态鉴定和粒径分析。在透射电镜下观察到外周血外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30-100nm，可见其膜性结构，中央为低电子密度成分(见图2B)。

3.4外泌体miRNA差异筛选与分析

外泌体中含有蛋白质、脂质以及RNA等物质，miRNA是外泌体中重要的物质。分别收集对照组、PD-NC组以及PD-MCI组血清外泌体，进行miRNA芯片分析。在筛选差异miRNA之前，先进行探针过滤，至少有一组100％标记为Detected的探针留下进行后续分析。对于没有生物学重复的分析，仅利用差异倍数Fold change值进行筛选，标准为Fold change值≥2.0。通过芯片筛查不同受试者血清外泌体miRNA，发现3个组的外周血的miRNA表达谱不同：PD-NC组和HC组相比，差异miRNA共有584个，46个上调，538个下调；PD-MCI组和HC组相比，差异miRNA共有569个，其中26个上调，543个下调；PD-MCI组和PD-NC组相比，差异miRNA共有32个，9个上调，23个下调，结果如表3所示。

表3帕金森病认知功能障碍患者外周血血清中外泌体miRNA表达

结果表明，PD-MCI组和HC组相比，26个miRNA表达上调，包括hsa-miRNA-7977、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-1228-3p、hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-1304-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-3960、hsa-miRNA-4281、hsa-miRNA-4313、hsa-miRNA-4459、hsa-miRNA-4516、hsa-miRNA-4665-3p、hsa-miRNA-5100、hsa-miRNA-6069、hsa-miRNA-6087、hsa-miRNA-6089、hsa-miRNA-6090、hsa-miRNA-6508-5p、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p、hsa-miRNA-7641、hsa-miRNA-8069、hsa-miRNA-940；PD-MCI组和PD-NC组相比，9个miRNA表达上调，包括hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-1260a、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p，其中PD-MCI与HC组、PD-MCI与PD-NC组共同存在上调miRNA有hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p。

3.5聚类分析

对差异miRNA进行非监督层次聚类，通过挑选的差异miRNA的表达情况来计算样品直接的相关性，一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的miRNA可能具有相似的生物学功能。采用MeV软件进行聚类分析，按照说明书进行操作，结果用Heatmap即热图展示(结果见图3)。热图是对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可以用来进行实验数据的质量控制和差异数据的具像化展示，还可以对数据和样品进行聚类，观测样品质量。图中每个小方格表示一个基因，其颜色表示该基因表达量大小，表达量越大颜色越深(红色为上调，绿色为下调)。每行表示每个基因在不同样本中的表达量情况，每列表示每个样品中所有基因的表达量情况。上方树形图表示对来自不同实验分组的不同样品的聚类分析结果，左侧树状图表示对来自不同样本的不同基因的聚类分析结果。图3中显示hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p在PD-MCI和HC组、PD-MCI和PD-NC组中均表达上调。hsa-miRNA-451a在PD中表达高于HC组，且PD-MCI中hsa-miRNA-451a表达高于PD-NC组，并参与帕金森病脑微血管病变，其表达差异可有效识别帕金森病，且能预测帕金森病认知功能障碍的发生风险。因此，以上基因可作为用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用。

2.根据权利要求1所述的hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用，其特征在于：所述的hsa-miRNA-451a为成熟的hsa-miRNA-451。

3.根据权利要求1所述的hsa-miRNA-451a在制备诊断帕金森病认知功能障碍分子标志物中的应用，其特征在于：所述的hsa-miRNA-451a来自外周血血清中的外泌体。

4.一种用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物，其特征在于：所述的miRNA标志物包括hsa-miRNA-1234-3p、hsa-miRNA-1238-3p、hsa-miRNA-191-3p、hsa-miRNA-3162-3p、hsa-miRNA-451a、hsa-miRNA-6515-3p、hsa-miRNA-6737-3p、hsa-miRNA-6800-3p。

5.权利要求4所述的用于诊断帕金森病认知功能障碍的miRNA标志物在制备帕金森病认知功能障碍诊断试剂盒中的应用。

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