JP2016531587A - ハンチントン病の処置に有用な化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ミトコンドリア挙動変数に基づいたシグネチャを用いて、ハンチントン病の処置に有用である化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、ハンチントン病を診断するための方法と、ハンチントン病に罹患する対象者の治療に対する反応をモニタリングするための方法にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、医学の分野、特にハンチントン病の診断及び処置に関する。
ハンチントン病は、特徴的な舞踏様運動、認知欠失、種々の精神障害、そして最終的な死亡をもたらす進行性の神経性障害である。HDは、タンパク質の伸長ポリグルタミン領域へと転写するハンチンチン(Htt)遺伝子の第1エクソンにおける、不安定な多形トリヌクレオチド(CAG)のn個のリピートの拡張により起こる。この変異は常染色体且つ優勢であるため、変異又は改変遺伝子の単に1つのコピーは疾患の発現をまねくのに十分である。
Htt遺伝子は、輸送、カルシウムのホメオスタシス、神経伝達物質放出、遺伝子転写、プロテアソーム、及びミトコンドリアの機能を含む、細胞におけるいくつかの主要な機能を変化させる遍在性の遺伝子である。これらの複合的な分子相互作用は、該疾患の病的進行において広範囲の臨床パターンをもたらす。
患者がHDに類似し得る臨床的徴候を発症する場合、神経学者は、統一ハンチントン病評価尺度を用いて徹底した神経学的検査により疾患を診断し、Htt遺伝子における39個を超えるCAGリピートの存在を示す遺伝子検査によってさらに確認される。しかしながら、疾患の進行は、CAGリピートの長さと、変異遺伝子が脳の感受性領域における細胞機能に影響するという既存の条件と次第であるため、35〜39個のリピートを伴う変異における疾患の発現を除くことを難しくしている。一方で、39個のリピートを有し、HD診断が確認された患者はHDを発症する、ということを確証することはできない。さらに、舞踏様運動はHDだけのものではなく、いくつかの自己免疫性障害、遺伝性若しくは薬物に関連する状態において起こり得る。結果として、HD様症状の差異を示す診断は複雑であり、不必要且つ費用の高い検査をおこなうことになり得る(Martino等、2012年)。
HD診断は大部分を遺伝子検査に依存するので、HDの前駆症状の患者における疾患の早期進行の徴候を特定することができるタンパク質又はイメージングマーカを特定するための研究はほとんどない。例として、(末梢性ベンゾジアゼピン受容体として既知である)TSPOに結合することができる化合物が、
HDを含む炎症に関連する神経変性疾患のためのマーカをイメージングするように想定されている(例として国際特許出願公開第10/020000号;Politis等、2011年)。しかし、処置が患者への有益性を証明する可能性が高い場合に、疾患進行の早期段階、又は無症状の段階においても、HDを診断するために用いられ得るマーカを未だ明らかに欠いている。
HDを含む炎症に関連する神経変性疾患のためのマーカをイメージングするように想定されている(例として国際特許出願公開第10/020000号;Politis等、2011年)。しかし、処置が患者への有益性を証明する可能性が高い場合に、疾患進行の早期段階、又は無症状の段階においても、HDを診断するために用いられ得るマーカを未だ明らかに欠いている。
さらに、HDを処置するか又はその進行を緩徐にするために認可された薬剤は現在のところ存在しない。ベンゾジアゼピン、及び神経弛緩薬、及び抗てんかん薬は舞踏病性症状を抑制するために用いられ得る。だが、HD患者は、運動症状に加えて、うつ病、動作緩慢、認知障害、攻撃的挙動、及び摂食障害などその他の合併疾患を示す。
有効な遺伝子検査が存在することから、疾患の前駆段階は治療的な行為をおこなう最適なときであると考えられる。だが、前駆段階において薬剤の生物学的活性を示す有効なマーカの必要性がある。同様に、疾患進行のモニタリングのための、定量化可能であり信頼のおけるバイオマーカは、神経保護の臨床研究に重要であり、未だ活発な研究領域である。
原因となる病態生理的機構の理解は、HDの細胞及び動物モデルに主に基づいて深まっている。
原因となる病態生理的機構の理解は、HDの細胞及び動物モデルに主に基づいて深まっている。
HDの種々のモデルは、数年にわたって、昆虫(キイロショウジョウバエ(Drosophilae melanogaster))(Jackson等、1998年)、扁形動物(シー・エレガンス(C. elegans))などの無脊椎モデル(Faber等、2002年;Parker等、2005年)、種々の齧歯動物モデル(Carter等、1999年;Tabrizi等、2000年;Menalled等、2002年;Wheeler等、2000年;Hodgson等、1999年;Gray等、2008年)、トランスジェニックヒツジ(Jacobsen等、2010年)、及びブタモデル(Yang等、2010年)から、近年になって発展した非ヒト霊長動物トランスジェニックモデル(Yang等、2008年)まで記載されている。
これらのモデルは疾患の病態生理の理解に大きく貢献しているが、いずれもヒトの病理を完全に再現するものではない。さらに、種の違いは重要であり、薬効の移行は限定的である。
故に、ハンチントンプロテオミクスインタラクトームの徹底した複雑性を再現することが可能であり、HDの処置に有用である薬剤を効率的に選択するために用いられ得るインビトロのヒト由来モデルが大きく必要とされる。
発明者等は、ヒト生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、HDに特異的であり、且つ疾患の早期又は無症候段階のHDの診断に使用されることが可能である、マーカ一式を特定した。さらに発明者等は、これらのマーカで得られるシグネチャが処置によって回復され得ることを示し、HDの疾患進行を覆すことができる薬剤をスクリーニングするためのヒト由来のモデルを提供する。
第1の態様において、本発明は、ハンチントン病の処置に有用である化合物のためのスクリーニング方法、好ましくはインビトロの方法に関し、該方法は、
a)ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
b)前記接触させた細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(iii)である、
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
a)ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
b)前記接触させた細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(iii)である、
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
該方法は、ステップb)において取得された値を、テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含むとよい。
該方法は、
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、NCは、テスト化合物の非存在下においてHDのサンプルから取得された値又は平均値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは測定された変数の値である。測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合に、テスト化合物はハンチントン病の処置に有用であると識別されるとよい。
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、NCは、テスト化合物の非存在下においてHDのサンプルから取得された値又は平均値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは測定された変数の値である。測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合に、テスト化合物はハンチントン病の処置に有用であると識別されるとよい。
第2の態様において、本発明は、対象におけるハンチントン病の診断のための方法、好ましくはインビトロの方法にも関し、該方法は、
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
本方法は、測定されたミトコンドリア挙動変数の値に基づいて、前記対象がHDに罹患するかどうかを決定することをさらに含むとよい。
好ましくは、対象は、htt遺伝子において36〜39個のCAGリピートを含む。
本方法は、測定変数のzスコアを算出することをさらに含むとよい。好適には、好ましくはV1である第1変数、及び第2及び第4変数の正のzスコア、並びに第3変数、第5変数、好ましくはV29である第6変数、好ましくはV32である第7変数の負のzスコアは、対象がハンチントン病に罹患することを示している。
第3の態様において、本発明は、ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするための方法、好ましくはインビトロの方法にさらに関し、該方法は、
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
b)処置の適用の前後に取得されたサンプルについて、ステップa)において得られた測定値を比較するステップとを含む。
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
b)処置の適用の前後に取得されたサンプルについて、ステップa)において得られた測定値を比較するステップとを含む。
本方法は、
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、NCは処置の適用前に取得された値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは変数の測定値である。好ましくは、患者は、測定変数すべてが正のスコアを示す場合に、治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、NCは処置の適用前に取得された値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは変数の測定値である。好ましくは、患者は、測定変数すべてが正のスコアを示す場合に、治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。
特に、これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数V1、V12、V13、V15、V29、及びV32、好ましくはV1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32を測定することを含むとよい。また、これらの方法は、
V7、V30、V33、及びV34からなる群から選択される少なくとも1つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含むとよい。
V7、V30、V33、及びV34からなる群から選択される少なくとも1つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含むとよい。
これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数の測定値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された変数の値と比較することをさらに含むとよい。
好ましくは、サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検サンプルである。
細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群より選択されるとよい。好ましくは、細胞は線維芽細胞である。
好ましくは、分散記述子は、分散、標準偏差、及び好ましくは四分位範囲である分位範囲、からなる群より選択される。
好ましくは、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、生細胞に包含されるミトコンドリアは標識される。ミトコンドリアは、任意の適切な標識、好ましくは蛍光標識、より好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識されるとよい。
ミトコンドリア挙動変数の値は、好ましくはCCDカメラである適切なイメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得されるとよい。好ましくは、変数の値は、CCDカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される。
現在、ニューロンにおけるHttの通常の機能と、Httにおける伸長ポリQ配列が選択的神経変性を引き起こす分子メカニズムとは、理解されていない。しかし、htt遺伝子が、輸送、カルシウムのホメオスタシス、神経伝達物質放出、遺伝子転写、プロテアソーム、及びミトコンドリアの機能を含む細胞のいくつかの主要な機能を変化させる遍在的遺伝子であることは既知である。この複雑性により、分子変異に対する異なる感受性に影響をうける様々な細胞におこる種々の分子イベントに対応する、疾患の病的進行における広範囲の臨床パターンがもたらされる(図8)。疾患修飾能を有する薬剤を特定するための現在の機構的手法は、下流のイベントの変化を可能にするために一連のイベントにおいて十分に早期であることを所望して、これらの機構のうちの1つに焦点を当てるものである。今のところ、この手法は成功していない。
本発明者等は、生細胞の小器官、特にミトコンドリアの挙動を分析することにより、動物又はヒト生体における化合物の効果を予測するための重要な情報がもたらされることが可能であると以前に示した。発明者等は、膜透過性、空間と時間とにおける生細胞内部の小器官の動的運動性、小器官形態に起こる動的変化、及び、小器官と細胞骨格の要素との間にある動的関係などの細胞環境と小器官との相互作用、を分析することによって該挙動を規定した。この全般的な方法は米国特許第8,497,089号において公開され、その内容は、本明細書に参考文献としてすべて包含される。このように、本発明者らは、細胞代謝における個別の機能のみではなく、細胞小器官の全体的な機能を本明細書において考慮に入れている。
ミトコンドリアは、細胞環境に感受性があり、該環境と恒常的にやり取りをするので、ミトコンドリア内において、そしてその他の細胞小器官やコンパートメントと、タンパク質同士の数千の相互作用をおこなう。本発明者等は、生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、生細胞におけるミトコンドリア網様システムを実験的及び動的に評価し、ミトコンドリアの挙動を表すこれらの相互作用の結果の取得を実現した。本発明者等は、ミトコンドリアの運動性、形態、ネットワーク構造、及び透過性に関する37のミトコンドリア挙動変数を測定した。運動性変数は、例として、変位速度、増幅、頻度、及び動作の規則性、並びに移動距離の測定を含む。形態変数は、例として、ミトコンドリア動態(融合・分裂バランス)の測定、及び種々の典型的形態的特性の出現頻度を含む。ミトコンドリアの網様ネットワーク構造は、細胞内細胞骨格、及び/又は微小管形成中心や焦点接着点など細胞内の特定のホットスポットに関して、その方向、分布、及び領域化についてスコアを付けられる。ミトコンドリアの膜透過性は、個々のミトコンドリア内の信号強度の動的分析によって測定される。
この分析に基づいて、本発明者らは、健康、そしてHDである患者を区別するのに適する7つのミトコンドリア挙動変数のみを含むHDシグネチャを特定した。さらに、発明者等は、このシグネチャが薬理的に回復されるので、HDの処置に有用である化合物をスクリーニングするために使用されることが可能であることをさらに示した。
[定義]
「ハンチントン病」、「HD」、又は「ハンチントン舞踏病」(OMIM、143100番)という用語は、染色体4p16.3上のハンチンチンをコードする遺伝子(遺伝子ID:3064)における、伸長トリヌクレオチド(CAG)(グルタミン酸をコード)のリピートnにより引き起こされる、常染色体性及び優勢である進行性の神経変性障害に関する。通常のヒトにおいて、リピート数は6〜35個である。36〜39個のリピート数を有するヒトはHDを発症し得り、40個以上のリピート数を有するヒトはHDを発症する。
「ハンチントン病」、「HD」、又は「ハンチントン舞踏病」(OMIM、143100番)という用語は、染色体4p16.3上のハンチンチンをコードする遺伝子(遺伝子ID:3064)における、伸長トリヌクレオチド(CAG)(グルタミン酸をコード)のリピートnにより引き起こされる、常染色体性及び優勢である進行性の神経変性障害に関する。通常のヒトにおいて、リピート数は6〜35個である。36〜39個のリピート数を有するヒトはHDを発症し得り、40個以上のリピート数を有するヒトはHDを発症する。
本明細書において用いられるように、「対象」又は「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくは成人、子供、及び胎児期段階のヒトを含むヒトに関する。
本明細書において用いられるように、「HD患者」又は「HD対象」という用語は、Htt遺伝子において少なくとも36個のCAGリピートを有し、HDを発症した又はHDを発症するであろう対象に関する。対象は、疾患の無症候又は症候的段階にあり得る。
本明細書において用いられるように、「健康な患者」又は「健康な対象」という用語は、HDに罹患していない対象、特にHtt遺伝子において6〜35個のCAGリピートを有する対象に関する。好ましくは、対象はいずれの既知の疾患にも罹患せず、つまり明らかに健康的である。
本明細書において用いられるように、「処置」、「処置する」又は「処置すること」という用語は、HDの治療、予防、及び遅延など、患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為に関する。特定の実施形態において、そのような用語は、HD又はHDに関連した症状、特に神経性症状の改善又は根絶に関する。他の実施形態において、この用語は、1つ以上の治療剤をHDに罹患する対象に投与することによってもたらされるHDの広がり又は悪化を最小化することに関する。
本明細書において用いられるように、「サンプル」という用語は、対象に由来する生細胞を含む任意のサンプルを意味する。そのようなサンプルの例は、血液、血漿、唾液、尿、及び精液サンプルなどの体液、並びに生検、臓器、組織又は細胞サンプルを含む。好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検である。サンプルはその使用前に処理されるとよい。特に、皮膚生検は線維芽細胞を分離するように処理されるとよい。線維芽細胞は当業者に既知である任意の方法を用いて分離されるとよい。例として、皮膚の真皮成分は小片に切り分けられ、コラゲナーゼタイプ1及びディスパーゼで一晩処理されるとよい。細胞は、遠心分離及び再懸濁化後に培養フラスコに播種され、例えばダルベッコ最小必須培地、10%ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む線維芽細胞増殖培地において培養されるとよい。
本明細書において用いられるように、「分散記述子」という用語は、値の分布がどのくらい広がっているか又は集約されているかを示す分散の測定に関する。好ましくは、この記述子は、分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群から選択される。好ましくは、分位範囲は四分位範囲又は十分位範囲である。四分位範囲は、上位と下位との四分位間、すなわち25番目の百分位(データの下位の25%を分離)と75番目の百分位(データの上位25%を分離)との間、の差である。十分位範囲は、1番目と9番目との十分位の間、つまり10番目の百分位(データの下位の10%を分離)と90番目の百分位(データの上位10%を分離)との間、の差である。好ましい実施形態では、分散記述子は、分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群から選択される。これらの値を算出する方法は当業者には通常知られている。
以下に開示される本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法であり得り、好ましくはインビトロの方法であるとよい。
第1の態様において、本発明は、HDの処置において有用である化合物のためのスクリーニング方法に関し、該方法は、
a)ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
b)接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又は各個のミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
a)ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
b)接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又は各個のミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
一実施形態において、本方法は、HDに罹患する対象からのサンプルを提供することさらに含む。
HDに罹患する対象は、疾患の任意の段階、特に無症候の段階又は疾患進行の早期段階にあってもよい。好ましくは、対象は少なくとも40個のCAGリピートを有するhtt遺伝子の変異を包含する。
スクリーニング方法は、適切な治療、即ち個別化された医薬を選択するために、HD患者のサンプルにおいて、又は、例えば薬剤開発若しくは薬剤再評価のためなど、HDサンプルの個体群において、おこなわれるとよい。
好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。
生細胞は、サンプルの特性に従って、サンプルから直接的に取得された、又はサンプルの細胞の初代培養から取得された、線維芽細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択されるとよい。また、生細胞は、成人の体細胞、特にサンプルから取得された線維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、インビボの状態に可能な限り近づくような結果を取得するために、非形質転換の生細胞である。
好ましい実施形態において、サンプルは皮膚生検であり、細胞は線維芽細胞である。特に、皮膚生検は、分離するか又は線維芽細胞の培養を富化するために処理されるとよい。
一実施形態において、本方法は、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、サンプルから取得された生細胞に含まれるミトコンドリアを標識することをさらに含む。好ましくは、ミトコンドリアはステップa)の前に標識される。
ミトコンドリアは、当業者には通常既知である任意の方法を用いて標識されるとよい。好ましくは、標識は蛍光、発光、又は着色標識である。より好ましくは、標識は蛍光標識である。ミトコンドリアは、該小器官に特異的なプローブを用いて、及び/又はレポーター遺伝子の導入によって(例えば、ミトコンドリア標的発現を伴うGFP発現構造)、及び/又は該小器官に特異的に取り入れられるマーカ若しくは色素の生細胞内への微量注入によって、標識されるとよい。これらすべての技術は当業者に既知である。この種の標識のために一部の市販のキットが利用可能であり、これらは製造者の推奨に従って用いられる必要がある。特に、ミトコンドリアは、カルセイン及びコバルト(Petronilli他、1998年)、ローダミン123、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、及びテトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)などの蛍光ローダミン誘導体、カルボシアニン色素、10−N−ノニルアクリジンオレンジ(NAO)、又は、特にミトトラッカーグリーン(MTG)若しくはミトトラッカーレッド(CMXRos)であるミトトラッカー色素、を用いて標識されるとよい。好ましくは、ミトコンドリアは、ミトコンドリア膜電位に感受性がない色素を用いて標識される。特に、色素は、ミトトラッカーグリーン(MTG)、カルボシアニン色素、10−N−ノニルアクリジンオレンジ(NAO)、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択されることができる。特に好ましい実施形態において、ミトコンドリアはミトトラッカーグリーンを用いて標識される。
他の実施形態においてミトコンドリアは標識されず、ミトコンドリア挙動変数の値は、微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡などの標識不要の顕微鏡技術を用いて測定される。
ステップa)において、生細胞はテスト化合物と接触させられる。
テスト化合物は、化学的化合物、生物学的化合物、放射線、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択されるとよい。
一実施形態において、テスト化合物は放射線、特にX線、ガンマ線、α粒子、β粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体、及び電離放射線の他の形態、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される放射線である。
一実施形態において、テスト化合物は放射線、特にX線、ガンマ線、α粒子、β粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体、及び電離放射線の他の形態、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される放射線である。
他の実施形態において、テスト化合物は化学的化合物、即ち、有機又は無機化合物である。例として、テスト化合物は、HD以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤、高スループットの化学ライブラリからの化合物、又は遺伝子治療に適した核酸構築物であり得る。テスト化合物がHD以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤である場合、本方法は薬剤再評価のために用いられるとよい。
さらなる実施形態において、テスト化合物は生物学的化合物である。生物学的化合物は、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物、及び他の任意の生物学的分子又は複合体からなる群から選択されるとよい。また、細胞療法に用いられる治療的細胞、又はウイルス療法用に組み換えをされたウイルスであってもよい。特に、治療的細胞は、幹細胞、前駆細胞、細胞置換療法のための成熟細胞及び機能細胞、又は細胞を利用した遺伝子治療のための遺伝子組み換え細胞であるとよい。
生細胞をテスト化合物と接触させる技術は、その化合物の特性次第で変わり得り、当業者によって容易に選択され得る。特に、テスト化合物が化学的又は生物学的化合物である場合、細胞培地に添加されるとよい。細胞療法では、サンプルから取得された生細胞と、治療的細胞又は遺伝子的に組み換えられた細胞とは、細胞同士の直接的な接触が可能であるか、又は可能ではない共培養系を用いて接触させるとよい。テスト化合物が放射線である場合、培地内の細胞は放射線にかけられるとよい。テスト化合物が核酸構築物である場合、リポソームなどの適切なビヒクル内の培地に添加されるか、細胞に導入されるか、又は細胞に直接的に注入されるとよい。これらすべての技術は当業者には既知である。
本方法のステップb)において、いくつかのミトコンドリア挙動変数の値は、ステップa)においてテスト化合物に接触させた細胞において測定される。実験の項に示されるように、これらの変数は、HD患者の細胞を健康な人の細胞と区別するために十分であり、細胞がHDの処置若しくは予防に有用なテスト化合物と接触させられるときに回復することが可能であるHDシグネチャを構成するように、発明者等によって選択された。
ミトコンドリア挙動変数の値は、生細胞内で観察されるミトコンドリア、好ましくは標識されたミトコンドリアのイメージを分析することで測定される。イメージは、例えば、少なくとも2分間、高走査速度で、少なくとも10秒毎に、好ましくは少なくとも2〜6分間、高走査速度で、0.1〜10秒毎に撮影される。イメージ撮影は、イメージ取得システムと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡などの任意の適切な顕微鏡技術を用いておこなわれるとよい。特に、ミトコンドリアが標識される場合、イメージ撮影は蛍光顕微鏡を用いておこなわれるとよい。ミトコンドリアが標識されない場合、イメージ撮影はDIC顕微鏡を用いておこなわれるとよい。イメージ取得デバイスは、電荷結合デバイス(CCD)など、高速で高解像度フレームを撮影することが可能である任意のデバイスであってよい。特に好ましい実施形態において、イメージ撮影は3つの空間的次元においておこなわれる。つまり、イメージ撮影はサンプルを3次元で視覚化できるモーター付きプレートを備えた顕微鏡を用いておこなわれるとよい。測定はテスト化合物の存在下で、又はテスト化合物への曝露後におこなわれるとよく、好ましくはテスト化合物の存在下でおこなわれるとよい。好適には、細胞はイメージ撮影時に37℃に保持される。
ミトコンドリアは、細胞微小管とアクチンフィラメントネットワークとに沿って動くとき、細胞質内で移動する。第1の変数はV1、V34、及びその組合せとからなる群から選択され、V1は各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であり、V34は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。
変数V1は、各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、停止の数、即ち、ミトコンドリアが2フレームの間で不動である期間の数を記録することによって評価される。つまり、変数V1は、追跡される各ミトコンドリアについて単位時間毎の停止の数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータから停止の平均頻度を算出することによって取得される。
変数V34は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、バーストの数、即ち、撮影期間時にミトコンドリアの最大変位の30%内の急激な変異の数を記録することによって評価される。つまり、変数V34は、追跡される各ミトコンドリアについて単位時間毎のバーストの数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからバーストの平均頻度を算出することによって取得される。
第2の変数V12は、細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子である。この数は、イメージ分析ソフトウエアを用いて、細胞のイメージにおける各ミトコンドリアをカウントし、細胞領域単位毎の、好ましくは細胞領域のμm2毎の数で結果を表すことによって好ましくは測定される。変数は、複数の測定から、細胞単位毎のミトコンドリアの平均数を算出して取得されるとよい。この変数は分散記述子を算出することによって取得されてもよく、該分散記述子は、好ましくは分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
第3の変数V13は、ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子である。該変数は、各個のミトコンドリアの領域を測定し、観察されたすべてのミトコンドリアのデータから平均領域を算出することで取得されるとよい。また該変数は、各個のミトコンドリアの領域を測定し、ミトコンドリアの領域の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。好適には、各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。
第4の変数V15は、0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
第5の変数V23は、10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
第6の変数は、V29、V7、及びV30、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、V29は70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であり、V7は総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であり、V30は100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
変数V15、V23、V29、及びV30は特定の領域範囲に示されるミトコンドリアの頻度に関する。好ましくは、各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。つまり、変数V15、V23、V29、及びV30は、ミトコンドリアの領域を測定し、それぞれ0.51〜1μm2、10〜20μm2、70〜100μm2、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの数を測定することによって取得される。結果はミトコンドリアの総数の百分率で表される。
変数V7は、総細胞領域に対する、もつれたミトコンドリア、即ち単一のミトコンドリアの個別化が不可能であるところまで組み合せられたミトコンドリアを含む部分の総領域である。この変数は、ミトコンドリアの方向性と細胞骨格の方向性との一致を評価し、ミトコンドリアと細胞骨格との関係の状態に関連する。
第7の変数は、V32及びV33、及びそれらの組合せからなる群から選択され、V32はミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であり、V33は各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子である。
変数V32はミトコンドリアの平均移動速度である。ミトコンドリアの移動速度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、各ミトコンドリアの平均速度を記録することによって評価される。変数V32は追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからミトコンドリアの平均移動速度を算出することで取得されるとよい。また該変数はミトコンドリアの移動速度の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
変数V33は各個のミトコンドリアの平均最大移動速度である。最大速度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、撮影時に達したミトコンドリアの最大速度を記録することによって評価される。変数V33は、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからミトコンドリアの平均最大移動速度を算出することで取得されるとよい。また該変数はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
好ましい実施形態において、顕微鏡を介して観察されるミトコンドリアのイメージを記録且つ分析するため、例えば適切なソフトウエアを備えたコンピュ―タなどの記録及びデータ管理デバイスが用いられる。
各変数のために分析されるミトコンドリア及び細胞の数は、統計的方法を用いて、当業者によって容易に決定される。好ましくは、少なくとも3、10、又は15の細胞から、少なくとも50、80又は100のミトコンドリアが各変数のために分析される。特定の実施形態において、少なくとも50、80又は100のミトコンドリアが、変数V1及びV32のために分析され、少なくとも100、250、500、800、900、又は1000のミトコンドリアが、変数V12、V13、V15、V23、及びV29のために分析される。
本方法は、V1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32;V1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV33;V1、V12、V13、V15、V23、V7、及びV32;V1、V12、V13、V15、V23、V7、及びV33;V1、V12、V13、V15、V23、V30、及びV32;V1、V12、V13、V15、V23、V30、及びV33;V34、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32;V34、V12、V13、V15、V23、V29、及びV33;V34、V12、V13、V15、V23、V7、及びV32;V34、V12、V13、V15、V23、V7、及びV33;V34、V12、V13、V15、V23、V30、及びV32;並びにV34、V12、V13、V15、V23、V30、及びV33からなる群より選択される組合せの変数の値を測定することを含むとよく、V1、V34、V12、V13、V15、V23、V29、V7、V30、V32、及びV33は上述で規定されたとおりである。
特定の実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数V1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32を測定することを含む。ここの実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数V7、V30、V33、及びV34からなる群から選択される少なくとも1つの追加的変数を測定することをさらに含むとよい。
代替的に、変数は、HD患者の個体群からのサンプルにおいて測定されることが可能である。各変数について取得された値は平均化される。
各変数は、それらの重要度を調整するために重み付けされるとよい。
本発明のスクリーニング方法は、テスト化合物の存在下において、ステップb)で取得された変数の値を、テスト化合物の非存在下において取得された値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、テスト化合物の非存在下における値は、テスト化合物に接触させる前に、ステップb)における同様のサンプルの細胞において取得される。特定の実施形態において、これらの値は、ミトコンドリアを標識した後且つステップa)の前に、つまり、テスト化合物に接触させる前に、標識されたミトコンドリアを含む細胞において、取得される。各変数の値は上述されるように測定される。テスト化合物の非存在下で取得された値は、HDの処置に有用であり得る化合物を特定するために負の対照として用いられるとよい。
本方法は、テスト化合物の存在下、任意的に非存在下において取得された変数の値を、(テスト化合物の非存在下で)健康な対象から得られたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、健康な対象は、HDのサンプルを提供するHD患者とおよそ同様の年齢である。各変数の値は上記に詳細に記載されるように測定される。健康な対象のサンプルより取得された値は、HDの処置に有用であり得る化合物を特定するために正の対照として用いられるとよい。代替的に、この正の対照は健康な対象の個体群からのサンプルにおける変数を測定することによって得ることができる。そして、各変数について得られた値は平均化される。
特定の実施形態において、HDシグネチャの変数の値は、HDにおけるテスト化合物の用量反応作用を測定するために、複数の濃度のテスト化合物の存在下において測定される。
測定値の有意差は、ANOVAなどの任意の適切な統計テストを用いて測定されるとよい。
各用量のテスト化合物について変数のために取得された値は、識別する等式を用いて、スコアとして表されるとよい。各用量の作用は、負及び/又は正の対照に対して取得されたスコアについて評価されるとよい。
特に、各変数についてのスコアは、
変数Vxのスコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
(NCは負の対照の値又は平均値であり、PCは正の対照の値又は平均値であり、Varは変数の値である)である比率を用いて算出されるとよい。
変数Vxのスコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
(NCは負の対照の値又は平均値であり、PCは正の対照の値又は平均値であり、Varは変数の値である)である比率を用いて算出されるとよい。
表現型のレスキューの全体的な百分率は各測定変数のスコアを加算することによって取得されるとよい。
このように、結果は表現型のレスキューの百分率として表されるとよく、正の対照(健康なサンプル)が100%であり、負の対照(テスト化合物の非存在下のHDサンプル)が0%である。正の表現型のレスキューを示すテスト化合物、つまり、HDシグネチャを部分的又は全体的に回復することが可能である化合物は、HDの処置に潜在的に有用であると特定される。所定の実施形態において、テスト化合物は、表現型のレスキューが50%を超える、さらに好ましくは60%、70%、80%又は90%を超える場合に、潜在的に有用であると特定される。
好ましくは、テスト化合物は、測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合、つまり各変数についてレスキューが観測される場合に、HDの処置に潜在的に有用であると特定される。
他の態様では、本発明は対象におけるハンチントン病を診断するための方法に関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
本方法は、対象からのサンプルを提供することさらに含むとよい。
好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。
対象は、HDと類似する臨床的徴候を示すか、或いはいずれの症状も示さなくともよい。
本方法は、htt遺伝子におけるCAGリピートの数を測定するために遺伝子テストをおこなうことをさらに含むとよい。
好ましい実施形態において、対象はhtt遺伝子において36〜39個のCAGリピートを包含する。この場合、本発明の方法は、CAGリピートの数から疾患の進行を予測することは不可能であるため、特に関連する。
本方法は、対象がハンチントン病に罹患するかどうかをミトコンドリア挙動変数の測定値に基づいて測定することをさらに含むとよい。HDの診断は、対象のサンプルから取得されたスコアを、健康な対象若しくはHD患者から、又は代替的に健康な対象若しくはHD患者の個体群から取得されたサンプルのスコアと比較することによって取得されるとよい。
健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数V12、V15、及び第1の変数即ちV1及び/又はV34における関数の利得と、V13、V23、第6の変数即ちV29、V7及び/又はV30、及び第7の変数即ちV32及び/又はV33における関数の損失とは、HDを示す。
特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数V1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32を測定することを含み、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数V1、V12、及びV15における関数の利得と、変数V13、V23、V29、及びV32における関数の損失とは、HDを示す。本方法は、測定変数のzスコアを算出することをさらに含むとよい。特に、HDサンプルにおいて、変数V1、V12、及びV15のzスコアは正であり、変数V13、V23、V29、及びV32のzスコアは負である。
他の特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数V1、V23、及びV32を測定することを含み、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数V1及びV23における関数の利得と、変数V32における関数の損失とは、HDを示す。この実施形態において、本方法は測定変数のzスコアを算出することをさらに含むとよい。特に、HDサンプルにおいて、変数V1、V23、及びV32のzスコアは正であり、変数V32のzスコアは負である。本方法はミトコンドリア挙動変数V13、V12、V15、及び/又はV29を測定することをさらに含むとよい。
本発明は、対象におけるハンチントン病の診断に有用な情報を提供するための方法にも関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)の値である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
を測定するステップを含む。
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
を測定するステップを含む。
上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
他の態様において、本発明は、ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするか、又は治療を目的としてハンチントン病に罹患する対象を選択するための方法にも関し、該方法は、
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
b)ステップa)において処置の適用の前後に取得された測定値を比較するステップとを含む。
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数(i)〜(vii)である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるV1、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるV34、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるV12、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるV13、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV15、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV23、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV29、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるV7、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるV30、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるV32、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるV33、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
b)ステップa)において処置の適用の前後に取得された測定値を比較するステップとを含む。
スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。
本方法は、処置の適用の前及び/又は後に、好ましくは処置の前後に、対象からのサンプルを提供することをさらに含むとよい。
治療は、上述で規定されるような、1又は複数の化学的又は生物学的化合物、及び放射線を適用することを含むとよい。
スクリーニング方法について上述されたように、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数のために取得された値は、スコアとして表されるとよい。つまり、治療の効果は処置の前と後とに取得されたスコアを比較することによって評価されるとよい。任意的に、スコアは、健康なサンプル又は健康なサンプルの母集団から取得されたスコアと比較されてもよい。
特に好ましい実施形態において、スコアは、スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)である等式を用いて各変数のために算出され、NCは処置の適用前に取得された値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは変数の測定値である。測定されたすべての変数が正のスコアであるとき、患者は治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。1又は複数の変数が負のスコアである場合、治療は疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要がある。
結果は表現型のレスキューの百分率として表されてもよく、正の対照(健康なサンプル)は100%であり、負の対照(いずれの処置もおこなわれないHDサンプル、即ち処置前に取得されたHDサンプル)は0%である。正の表現型のレスキューは、HD患者が治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができることを示す。一方で、負の表現型のレスキューは、治療が疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要があることを示す。
本発明のさらなる態様及び有利性は以下の実施例に記載される。これは例示として考えられ、限定するものではない。
<実施例>
[実施例1:ハンチントン病シグネチャ]
〔皮膚生検サンプル採取〕
皮膚生検は、6人の健康な対象と6人のHD患者とを含む12人のヒト提供者から採取された(表1)。2つのグループにおいて、他の疾患又は併存症は報告されなかった。
[実施例1:ハンチントン病シグネチャ]
〔皮膚生検サンプル採取〕
皮膚生検は、6人の健康な対象と6人のHD患者とを含む12人のヒト提供者から採取された(表1)。2つのグループにおいて、他の疾患又は併存症は報告されなかった。
女性のみの対象を選択することによって、また健康及び疾患のそれぞれの対象において年齢の範囲を36又は38歳の凡そ前後10年内に限定することによって起こり得る交絡的な年齢及び性別の影響を最小化するために、コホートを選択した。
この選択はまた、健康な個体群における異種性を最小化する。
HD患者において、生検前における疾患の臨床的症状の期間は1〜10年と異なる。臨床的症状のプロファイルは、6人中4人のHD患者について利用可能であった。舞踏様運動は異なるレベルの重症度の2人の患者に現れた。1人の患者はジストニア及び著しい振戦を伴うHDの運動低下性変異型を有する。1人はわずかにジストニアであり、動作緩慢及び表情の乏しさ(hypomimia)を示した。他の1は動作緩慢である。CAGリピートのサイズは4人のHD患者について得られ、変異対立遺伝子において47〜69個のCAGリピートの範囲であった。1人の患者は同型接合体を有し、重症である
表1はコホート特性を示す
表1はコホート特性を示す
〔細胞培養〕
患者由来の線維芽細胞を15%ウシ胎児血清を含むDMEMにおいて培養した。サンプルの細胞は増殖され、少なくとも16〜20継代の間安定的であった。
患者由来の線維芽細胞を15%ウシ胎児血清を含むDMEMにおいて培養した。サンプルの細胞は増殖され、少なくとも16〜20継代の間安定的であった。
〔動的イメージング〕
線維芽細胞を、ミトコンドリア膜電位に感受性がない細胞透過性ミトコンドリア色素であるミトトラッカーグリーンを用いて、30分間標識した。落射蛍光顕微鏡により、イメージを6分間継続的に記録した。イメージ撮影の間、細胞を37℃に保持した。各実験条件において、3つの独立したプレートのウェル毎に3〜15細胞、つまり、6000までの個別のミトコンドリアが記録された。データ取得の最大期間は30分(即ち、6分間観測された5個の細胞)であった。Zeiss Axioplan II顕微鏡を用いて、空間における3次元と時間とにおいて、イメージを撮影した。
線維芽細胞を、ミトコンドリア膜電位に感受性がない細胞透過性ミトコンドリア色素であるミトトラッカーグリーンを用いて、30分間標識した。落射蛍光顕微鏡により、イメージを6分間継続的に記録した。イメージ撮影の間、細胞を37℃に保持した。各実験条件において、3つの独立したプレートのウェル毎に3〜15細胞、つまり、6000までの個別のミトコンドリアが記録された。データ取得の最大期間は30分(即ち、6分間観測された5個の細胞)であった。Zeiss Axioplan II顕微鏡を用いて、空間における3次元と時間とにおいて、イメージを撮影した。
〔HDシグネチャのマーカの特定〕
ミトコンドリアの挙動を規定し、V1〜V37にラベル付けされた37個の変数を共に測定した。これらの変数は、ミトコンドリアの運動性、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの網様ネットワーク、又は細胞骨格との関係性及びミトコンドリア透過性を示す。
ミトコンドリアの挙動を規定し、V1〜V37にラベル付けされた37個の変数を共に測定した。これらの変数は、ミトコンドリアの運動性、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの網様ネットワーク、又は細胞骨格との関係性及びミトコンドリア透過性を示す。
統計的方法(主成分分析、階層的クラスタ分類、判別分析、及びANOVA)を用いて、7つの変数(V1、V32、V12、V13、V15、V23、及びV29)は、ただ1つの誤分類を伴って(ID:090407)、健康なサンプルとHDサンプルとを区別するのに十分であることがわかった。
V1は各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度である。
V12は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
V13はミトコンドリアの平均領域、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
V15は0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
V23は10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
V29は70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
V32はミトコンドリアの平均移動速度、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
ウォード法を適用し、7つの変数により取得された階層的クラスタ分析の樹状図を図1に示す。クラスタ分析は、対象090407が誤配置された、疾患の患者(上部のグループ)と、健康な対象(下部のグループ)とからなる2つのサブグループを示す。
コホートの各患者において、各変数について調査されたミトコンドリアの数は、V1及びV32において59〜100、V12、V13、V15、V23、及びV29において970〜3696であった。これらの結果から、対象から取得された実際の値に対応するヒートマップを得た(図2)。このマップは、HD患者について、変数V1、V12、及びV15における増大と、変数V13、V23、V29、及びV32における減少とを示し、健康な対象については逆のパターンを示す(対象090407は除く)(図3)。
7つの変数を含むシグネチャの強固性は、9回の個々の実験において215個の細胞から約39,000のさらなるミトコンドリアを分析すること、及び階層的クラスタ分析を繰り返すこと、により確認された。
[実施例2:HDシグネチャの回復]
レスベラトロールはブドウや赤ワインに見受けられる植物性ポリフェノールである。レスベラトロールは、老化、代謝障害、炎症、及びがんにおける有益な効果と関連する。レスベラトロールは、低い生物学的利用能にもかかわらず、複数のインビトロ及びHDを再現するインビボモデルにおいて、変異ハンチンチンポリグルタミン毒性におけるレスキューを示した(Parker等、2005年;Maher等、2011年;Ho等、2010年)。レスベラトロールは、AMPK、SIRT1、及びPGC−1αなどの複数の主要な代謝センサ・エフェクタタンパク質を標的とすることによりその作用を示し得る(Pasinetti等、2011年)。
レスベラトロールはブドウや赤ワインに見受けられる植物性ポリフェノールである。レスベラトロールは、老化、代謝障害、炎症、及びがんにおける有益な効果と関連する。レスベラトロールは、低い生物学的利用能にもかかわらず、複数のインビトロ及びHDを再現するインビボモデルにおいて、変異ハンチンチンポリグルタミン毒性におけるレスキューを示した(Parker等、2005年;Maher等、2011年;Ho等、2010年)。レスベラトロールは、AMPK、SIRT1、及びPGC−1αなどの複数の主要な代謝センサ・エフェクタタンパク質を標的とすることによりその作用を示し得る(Pasinetti等、2011年)。
シクロスポリンA(CSA)はカルシニューリンを阻害する抗炎症剤である。カルシニューリンは、細胞内Ca2+濃度における変化に対する神経細胞反応に重要な役割を果たすと考えられる、Ca2+及びカルモジュリン依存性タンパク質セリン・スレオニンホスファターゼである。ミトコンドリア膜電位の変化と異常なCa2+処理はHDに関連する分子機構であり、CSAの標的である(Choo等、2004年)。CSAと、他のカルシニューリン阻害剤であるFK506とは、HDを再現する種々の動物モデルにおいて議論となる作用を有することが示されている(Pineda等、2009年;Kumar等、2010年;Hernandez−Espinosa等、2006年)。
〔材料と方法〕
患者由来の線維芽細胞を、15%ウシ胎児血清と、ミトコンドリアの挙動において不活性であるとして知られる濃度である0.5%DMSOとを含むDMEMにおいて培養した。
患者由来の線維芽細胞を、15%ウシ胎児血清と、ミトコンドリアの挙動において不活性であるとして知られる濃度である0.5%DMSOとを含むDMEMにおいて培養した。
細胞を、DMSOに希釈された様々な用量のレスベラトロール又はシクロスポリンA(CSA)とともに、又はビヒクルのみ(DMSO)で、30分間インキュベートし、動的イメージ撮影中にさらに30分間、低速度ビデオ顕微鏡を用いて観察した。
レスベラトロール及びCSAは3.5log(10、1、0.1、及び0.05μM)にわたる4用量でテストした。
負の対照はビヒクルのみで処置されたHD患者(ID:090401)の細胞であり、正の対照はビヒクルのみで処置された健康な対象(ID:071201)の細胞であった。
各ミトコンドリアについて取得された生データは、データ=(NC-Var)*100/(NC-PC)である式を用いて、比率(%)として表された(NCは負の対照の平均値、PCは正の対照の平均値、Varは変数の値)。
〔結果〕
・レスベラトロール
HDシグネチャを構成する7つの変数におけるレスベラトロールの作用の用量反応分析は図4に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。0%は疾患の状態を表し、100%は健康な状態を表す。
・レスベラトロール
HDシグネチャを構成する7つの変数におけるレスベラトロールの作用の用量反応分析は図4に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。0%は疾患の状態を表し、100%は健康な状態を表す。
全体のレスキューにおける変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果としての作用プロファイル(図5)は、0.05μMのレスベラトロールが、疾患状態の軽度の悪化を示す有害な作用を示す一方で、0.1μM及び1μMでは、それぞれ86%及び89.9%の回復を示した。10μMでは、作用は健康な状態を超え、過剰な補償作用を示し得る。
レスベラトロールの全体の作用は、低用量を除いて、疾患修飾能及び疾患状態のレスキューを示す。
・シクロスポリンA(CSA)
HDシグネチャを構成する7つの変数におけるCSAの作用の用量反応分析は図6に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。0%は疾患の状態を表し、100%は健康な状態を表す。
HDシグネチャを構成する7つの変数におけるCSAの作用の用量反応分析は図6に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。0%は疾患の状態を表し、100%は健康な状態を表す。
全体のレスキューにおける変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果の作用プロファイル(図7)は、CSAで処理された疾患表現型の全体のレスキューにおける効果の用量依存的減少を示す。高用量(10μM)におけるCSAの有効作用の悪化は毒性の可能性を示し得る。
しかしながら、CSAは、0.05μMでは84%に近い回復を示し、レスベラトロールより有力な薬剤とされる。
〔結果〕
これらの結果は、発明者等により示された、7つの変数を含むHDシグネチャが、HD患者と健康な対象とを区別するのに適し、前駆症候性段階を含む疾患進行の異なる段階におけるHD診断をするための手段として用いられ得ることを示す。
これらの結果は、発明者等により示された、7つの変数を含むHDシグネチャが、HD患者と健康な対象とを区別するのに適し、前駆症候性段階を含む疾患進行の異なる段階におけるHD診断をするための手段として用いられ得ることを示す。
また、発明者等は、動物モデルにおいて疾患回復能を有することが以前に示された2つの化合物であるレスベラトロール及びシクロスポリンAを用いることで、このHDシグネチャが回復されることができ、故に用量依存的方法においても化合物の疾患修飾特性の検討を可能にすることも示した。よって、このシグネチャはHD処置に有用である新規の薬剤をスクリーニング及び特定するための有効な手段として用いられることができる。
HD患者における化合物投与前又は後に、このシグネチャの発展をモニタリングすることが可能であることから、このシグネチャは、特に臨床試験において治療有効性の代用マーカとしても用いられることができる。
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Claims (21)
- ハンチントン病の処置に有用な化合物をインビトロにおいてスクリーニングする方法であって、
a)ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
b)接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む方法。 - 前記ステップb)において取得された前記値を、前記テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 各前記変数について、
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、NCは前記テスト化合物の非存在下においてHDサンプルから取得された前記値又は平均値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは測定された前記変数の前記値である、請求項1又は請求項2に記載の方法。 - 前記テスト化合物は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、ハンチントン病の処置に有用であると特定される、請求項3に記載の方法。
- 対象におけるハンチントン病を診断するためのインビトロの方法であって、
前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定することを含む方法。 - 前記対象はhtt遺伝子において36〜39個のCAGリピートを含有する、請求項5に記載の方法。
- 測定された前記変数のzスコアを算出することをさらに含む、請求項5又は請求項6に記載の方法。
- 前記(i)の変数、好ましくはV1、及び前記(ii)及び前記(iv)の変数の正のzスコア、並びに前記(iii)、前記(v)、前記(vi)、好ましくはV29、及び(vii)、好ましくはV32、の変数の負のzスコアは、前記対象がハンチントン病に罹患することを示す、請求項7に記載の方法。
- ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロの方法であって、
a)前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数である
(i)各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度(V1)、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度(V34)、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
(ii)細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子(V12)、
(iii)ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子(V13)、
(iv)0.51〜1μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V15)、
(v)10〜20μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V23)、
(vi)70〜100μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V29)、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域(V7)、及び100〜200μm2の領域に示されるミトコンドリアの頻度(V30)、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
(vii)ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子(V32)、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子(V33)、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
b)前記ステップa)において前記処置の適用の前後に測定されて得られた前記値を比較するステップとを含む方法。 - 各前記変数について、
スコア=(NC−Var)*100/(NC−PC)
である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、NCは前記処置の適用前に取得された前記値であり、PCは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Varは測定された前記変数の前記値である、請求項9に記載の方法。 - 前記対象は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、前記治療に反応的であるか、又は前記治療による効果を得ることができる、請求項10に記載の方法。
- 前記方法は、請求項1、請求項5、及び請求項9のいずれか1項において規定される前記ミトコンドリア挙動変数V1、V12、V13、V15、V23、V29、及びV32を測定することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、請求項1、請求項5、及び請求項9のいずれか1項において規定されるV7、V30、V33、及びV34からなる群より選択される少なくとも1つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記方法は、測定された前記ミトコンドリア挙動変数の前記値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択され、好ましくは皮膚生検サンプルである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生細胞は線維芽細胞である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分散記述子は分散、標準偏差、及び好ましくは四分位範囲である分位範囲、からなる群から選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生細胞に含まれる前記ミトコンドリアは前記ミトコンドリア挙動変数の前記値を測定する前に標識される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生細胞の前記ミトコンドリアは、好ましくは蛍光標識を用いて、より好ましくはミトトラッカーグリーン、カルボシアニン色素、10−N−ノニルアクリジンオレンジ、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択される色素を用いて、さらにより好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ミトコンドリア挙動変数の前記値は、イメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又はDIC顕微鏡を用いて、好ましくはCCDカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
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