JP2016531587A - ハンチントン病の処置に有用な化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ミトコンドリア挙動変数に基づいたシグネチャを用いて、ハンチントン病の処置に有用である化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、ハンチントン病を診断するための方法と、ハンチントン病に罹患する対象者の治療に対する反応をモニタリングするための方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、医学の分野、特にハンチントン病の診断及び処置に関する。
ハンチントン病は、特徴的な舞踏様運動、認知欠失、種々の精神障害、そして最終的な死亡をもたらす進行性の神経性障害である。ＨＤは、タンパク質の伸長ポリグルタミン領域へと転写するハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子の第1エクソンにおける、不安定な多形トリヌクレオチド（ＣＡＧ）のｎ個のリピートの拡張により起こる。この変異は常染色体且つ優勢であるため、変異又は改変遺伝子の単に１つのコピーは疾患の発現をまねくのに十分である。
Ｈｔｔ遺伝子は、輸送、カルシウムのホメオスタシス、神経伝達物質放出、遺伝子転写、プロテアソーム、及びミトコンドリアの機能を含む、細胞におけるいくつかの主要な機能を変化させる遍在性の遺伝子である。これらの複合的な分子相互作用は、該疾患の病的進行において広範囲の臨床パターンをもたらす。
患者がＨＤに類似し得る臨床的徴候を発症する場合、神経学者は、統一ハンチントン病評価尺度を用いて徹底した神経学的検査により疾患を診断し、Ｈｔｔ遺伝子における３９個を超えるＣＡＧリピートの存在を示す遺伝子検査によってさらに確認される。しかしながら、疾患の進行は、ＣＡＧリピートの長さと、変異遺伝子が脳の感受性領域における細胞機能に影響するという既存の条件と次第であるため、３５〜３９個のリピートを伴う変異における疾患の発現を除くことを難しくしている。一方で、３９個のリピートを有し、ＨＤ診断が確認された患者はＨＤを発症する、ということを確証することはできない。さらに、舞踏様運動はＨＤだけのものではなく、いくつかの自己免疫性障害、遺伝性若しくは薬物に関連する状態において起こり得る。結果として、ＨＤ様症状の差異を示す診断は複雑であり、不必要且つ費用の高い検査をおこなうことになり得る（Ｍａｒｔｉｎｏ等、２０１２年）。
ＨＤ診断は大部分を遺伝子検査に依存するので、ＨＤの前駆症状の患者における疾患の早期進行の徴候を特定することができるタンパク質又はイメージングマーカを特定するための研究はほとんどない。例として、（末梢性ベンゾジアゼピン受容体として既知である）ＴＳＰＯに結合することができる化合物が、
ＨＤを含む炎症に関連する神経変性疾患のためのマーカをイメージングするように想定されている（例として国際特許出願公開第１０／０２００００号；Ｐｏｌｉｔｉｓ等、２０１１年）。しかし、処置が患者への有益性を証明する可能性が高い場合に、疾患進行の早期段階、又は無症状の段階においても、ＨＤを診断するために用いられ得るマーカを未だ明らかに欠いている。
さらに、ＨＤを処置するか又はその進行を緩徐にするために認可された薬剤は現在のところ存在しない。ベンゾジアゼピン、及び神経弛緩薬、及び抗てんかん薬は舞踏病性症状を抑制するために用いられ得る。だが、ＨＤ患者は、運動症状に加えて、うつ病、動作緩慢、認知障害、攻撃的挙動、及び摂食障害などその他の合併疾患を示す。
有効な遺伝子検査が存在することから、疾患の前駆段階は治療的な行為をおこなう最適なときであると考えられる。だが、前駆段階において薬剤の生物学的活性を示す有効なマーカの必要性がある。同様に、疾患進行のモニタリングのための、定量化可能であり信頼のおけるバイオマーカは、神経保護の臨床研究に重要であり、未だ活発な研究領域である。
原因となる病態生理的機構の理解は、ＨＤの細胞及び動物モデルに主に基づいて深まっている。
ＨＤの種々のモデルは、数年にわたって、昆虫（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｅ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））（Ｊａｃｋｓｏｎ等、１９９８年）、扁形動物（シー・エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ））などの無脊椎モデル（Ｆａｂｅｒ等、２００２年；Ｐａｒｋｅｒ等、２００５年）、種々の齧歯動物モデル（Ｃａｒｔｅｒ等、１９９９年；Ｔａｂｒｉｚｉ等、２０００年；Ｍｅｎａｌｌｅｄ等、２００２年；Ｗｈｅｅｌｅｒ等、２０００年；Ｈｏｄｇｓｏｎ等、１９９９年；Ｇｒａｙ等、２００８年）、トランスジェニックヒツジ（Ｊａｃｏｂｓｅｎ等、２０１０年）、及びブタモデル（Ｙａｎｇ等、２０１０年）から、近年になって発展した非ヒト霊長動物トランスジェニックモデル（Ｙａｎｇ等、２００８年）まで記載されている。
これらのモデルは疾患の病態生理の理解に大きく貢献しているが、いずれもヒトの病理を完全に再現するものではない。さらに、種の違いは重要であり、薬効の移行は限定的である。
故に、ハンチントンプロテオミクスインタラクトームの徹底した複雑性を再現することが可能であり、ＨＤの処置に有用である薬剤を効率的に選択するために用いられ得るインビトロのヒト由来モデルが大きく必要とされる。
発明者等は、ヒト生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、ＨＤに特異的であり、且つ疾患の早期又は無症候段階のＨＤの診断に使用されることが可能である、マーカ一式を特定した。さらに発明者等は、これらのマーカで得られるシグネチャが処置によって回復され得ることを示し、ＨＤの疾患進行を覆すことができる薬剤をスクリーニングするためのヒト由来のモデルを提供する。
第１の態様において、本発明は、ハンチントン病の処置に有用である化合物のためのスクリーニング方法、好ましくはインビトロの方法に関し、該方法は、
ａ）ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
ｂ）前記接触させた細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｉｉｉ）である、
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
該方法は、ステップｂ）において取得された値を、テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含むとよい。
該方法は、
スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、ＮＣは、テスト化合物の非存在下においてＨＤのサンプルから取得された値又は平均値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは測定された変数の値である。測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合に、テスト化合物はハンチントン病の処置に有用であると識別されるとよい。
第２の態様において、本発明は、対象におけるハンチントン病の診断のための方法、好ましくはインビトロの方法にも関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖｉｉ）である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
本方法は、測定されたミトコンドリア挙動変数の値に基づいて、前記対象がＨＤに罹患するかどうかを決定することをさらに含むとよい。
好ましくは、対象は、ｈｔｔ遺伝子において３６〜３９個のＣＡＧリピートを含む。
本方法は、測定変数のｚスコアを算出することをさらに含むとよい。好適には、好ましくはＶ１である第１変数、及び第２及び第４変数の正のｚスコア、並びに第３変数、第５変数、好ましくはＶ２９である第６変数、好ましくはＶ３２である第７変数の負のｚスコアは、対象がハンチントン病に罹患することを示している。
第３の態様において、本発明は、ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするための方法、好ましくはインビトロの方法にさらに関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖｉｉ）である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
ｂ）処置の適用の前後に取得されたサンプルについて、ステップａ）において得られた測定値を比較するステップとを含む。
本方法は、
スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
である等式を用いて、各変数のためのスコアを算出することをさらに含むとよく、ＮＣは処置の適用前に取得された値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは変数の測定値である。好ましくは、患者は、測定変数すべてが正のスコアを示す場合に、治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。
特に、これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２９、及びＶ３２、好ましくはＶ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２を測定することを含むとよい。また、これらの方法は、
Ｖ７、Ｖ３０、Ｖ３３、及びＶ３４からなる群から選択される少なくとも１つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含むとよい。
これらの方法は、ミトコンドリア挙動変数の測定値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された変数の値と比較することをさらに含むとよい。
好ましくは、サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検サンプルである。
細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群より選択されるとよい。好ましくは、細胞は線維芽細胞である。
好ましくは、分散記述子は、分散、標準偏差、及び好ましくは四分位範囲である分位範囲、からなる群より選択される。
好ましくは、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、生細胞に包含されるミトコンドリアは標識される。ミトコンドリアは、任意の適切な標識、好ましくは蛍光標識、より好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識されるとよい。
ミトコンドリア挙動変数の値は、好ましくはＣＣＤカメラである適切なイメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得されるとよい。好ましくは、変数の値は、ＣＣＤカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される。
図１は、ウォード法を適用する階層的クラスタ分析の樹状図である。 図２は、階層的クラスタによって特定された２つのサブグループにおける、様々な対象の分類のヒートマップを表す。グラフは、ＨＤシグネチャを構成する７つの変数のｚスコア値を示す。 図３は、健康及び疾患である対象グループにおける各変数のｚスコアによって示される本発明のＨＤシグネチャを表す。 図４は、本発明のＨＤシグネチャの７つの異なる変数（Ｖ１、Ｖ３２、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、及びＶ２９）におけるレスベラトロールの用量反応分析を表す（表現型のレスキューの％）。 図５は、疾患修飾におけるレスベラトロールの用量反応作用の重み付けを示す。 図６は、本発明のＨＤシグネチャの７つの異なる変数（Ｖ１、Ｖ３２、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、及びＶ２９）におけるシクロスポリンＡの用量反応分析を表す（表現型のレスキューの％）。 図７は、疾患修飾におけるシクロスポリンＡの用量反応作用の重み付けを示す。 図８は、疾患の進行、及び単独の遺伝子Ｈｔｔの変異がもたらす種々の機能的相互作用の複雑性の概略的な表示である。
現在、ニューロンにおけるＨｔｔの通常の機能と、Ｈｔｔにおける伸長ポリＱ配列が選択的神経変性を引き起こす分子メカニズムとは、理解されていない。しかし、ｈｔｔ遺伝子が、輸送、カルシウムのホメオスタシス、神経伝達物質放出、遺伝子転写、プロテアソーム、及びミトコンドリアの機能を含む細胞のいくつかの主要な機能を変化させる遍在的遺伝子であることは既知である。この複雑性により、分子変異に対する異なる感受性に影響をうける様々な細胞におこる種々の分子イベントに対応する、疾患の病的進行における広範囲の臨床パターンがもたらされる（図８）。疾患修飾能を有する薬剤を特定するための現在の機構的手法は、下流のイベントの変化を可能にするために一連のイベントにおいて十分に早期であることを所望して、これらの機構のうちの１つに焦点を当てるものである。今のところ、この手法は成功していない。
本発明者等は、生細胞の小器官、特にミトコンドリアの挙動を分析することにより、動物又はヒト生体における化合物の効果を予測するための重要な情報がもたらされることが可能であると以前に示した。発明者等は、膜透過性、空間と時間とにおける生細胞内部の小器官の動的運動性、小器官形態に起こる動的変化、及び、小器官と細胞骨格の要素との間にある動的関係などの細胞環境と小器官との相互作用、を分析することによって該挙動を規定した。この全般的な方法は米国特許第８，４９７，０８９号において公開され、その内容は、本明細書に参考文献としてすべて包含される。このように、本発明者らは、細胞代謝における個別の機能のみではなく、細胞小器官の全体的な機能を本明細書において考慮に入れている。
ミトコンドリアは、細胞環境に感受性があり、該環境と恒常的にやり取りをするので、ミトコンドリア内において、そしてその他の細胞小器官やコンパートメントと、タンパク質同士の数千の相互作用をおこなう。本発明者等は、生細胞におけるミトコンドリアの分子イメージングを用いて、生細胞におけるミトコンドリア網様システムを実験的及び動的に評価し、ミトコンドリアの挙動を表すこれらの相互作用の結果の取得を実現した。本発明者等は、ミトコンドリアの運動性、形態、ネットワーク構造、及び透過性に関する３７のミトコンドリア挙動変数を測定した。運動性変数は、例として、変位速度、増幅、頻度、及び動作の規則性、並びに移動距離の測定を含む。形態変数は、例として、ミトコンドリア動態（融合・分裂バランス）の測定、及び種々の典型的形態的特性の出現頻度を含む。ミトコンドリアの網様ネットワーク構造は、細胞内細胞骨格、及び／又は微小管形成中心や焦点接着点など細胞内の特定のホットスポットに関して、その方向、分布、及び領域化についてスコアを付けられる。ミトコンドリアの膜透過性は、個々のミトコンドリア内の信号強度の動的分析によって測定される。
この分析に基づいて、本発明者らは、健康、そしてＨＤである患者を区別するのに適する７つのミトコンドリア挙動変数のみを含むＨＤシグネチャを特定した。さらに、発明者等は、このシグネチャが薬理的に回復されるので、ＨＤの処置に有用である化合物をスクリーニングするために使用されることが可能であることをさらに示した。
［定義］
「ハンチントン病」、「ＨＤ」、又は「ハンチントン舞踏病」（ＯＭＩＭ、１４３１００番）という用語は、染色体４ｐ１６．３上のハンチンチンをコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ：３０６４）における、伸長トリヌクレオチド（ＣＡＧ）（グルタミン酸をコード）のリピートｎにより引き起こされる、常染色体性及び優勢である進行性の神経変性障害に関する。通常のヒトにおいて、リピート数は６〜３５個である。３６〜３９個のリピート数を有するヒトはＨＤを発症し得り、４０個以上のリピート数を有するヒトはＨＤを発症する。
本明細書において用いられるように、「対象」又は「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくは成人、子供、及び胎児期段階のヒトを含むヒトに関する。
本明細書において用いられるように、「ＨＤ患者」又は「ＨＤ対象」という用語は、Ｈｔｔ遺伝子において少なくとも３６個のＣＡＧリピートを有し、ＨＤを発症した又はＨＤを発症するであろう対象に関する。対象は、疾患の無症候又は症候的段階にあり得る。
本明細書において用いられるように、「健康な患者」又は「健康な対象」という用語は、ＨＤに罹患していない対象、特にＨｔｔ遺伝子において６〜３５個のＣＡＧリピートを有する対象に関する。好ましくは、対象はいずれの既知の疾患にも罹患せず、つまり明らかに健康的である。
本明細書において用いられるように、「処置」、「処置する」又は「処置すること」という用語は、ＨＤの治療、予防、及び遅延など、患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為に関する。特定の実施形態において、そのような用語は、ＨＤ又はＨＤに関連した症状、特に神経性症状の改善又は根絶に関する。他の実施形態において、この用語は、１つ以上の治療剤をＨＤに罹患する対象に投与することによってもたらされるＨＤの広がり又は悪化を最小化することに関する。
本明細書において用いられるように、「サンプル」という用語は、対象に由来する生細胞を含む任意のサンプルを意味する。そのようなサンプルの例は、血液、血漿、唾液、尿、及び精液サンプルなどの体液、並びに生検、臓器、組織又は細胞サンプルを含む。好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。より好ましくは、サンプルは皮膚生検である。サンプルはその使用前に処理されるとよい。特に、皮膚生検は線維芽細胞を分離するように処理されるとよい。線維芽細胞は当業者に既知である任意の方法を用いて分離されるとよい。例として、皮膚の真皮成分は小片に切り分けられ、コラゲナーゼタイプ１及びディスパーゼで一晩処理されるとよい。細胞は、遠心分離及び再懸濁化後に培養フラスコに播種され、例えばダルベッコ最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む線維芽細胞増殖培地において培養されるとよい。
本明細書において用いられるように、「分散記述子」という用語は、値の分布がどのくらい広がっているか又は集約されているかを示す分散の測定に関する。好ましくは、この記述子は、分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群から選択される。好ましくは、分位範囲は四分位範囲又は十分位範囲である。四分位範囲は、上位と下位との四分位間、すなわち２５番目の百分位（データの下位の２５％を分離）と７５番目の百分位（データの上位２５％を分離）との間、の差である。十分位範囲は、１番目と９番目との十分位の間、つまり１０番目の百分位（データの下位の１０％を分離）と９０番目の百分位（データの上位１０％を分離）との間、の差である。好ましい実施形態では、分散記述子は、分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群から選択される。これらの値を算出する方法は当業者には通常知られている。
以下に開示される本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法であり得り、好ましくはインビトロの方法であるとよい。
第１の態様において、本発明は、ＨＤの処置において有用である化合物のためのスクリーニング方法に関し、該方法は、
ａ）ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
ｂ）接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるＶ１、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるＶ３４、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるＶ１２、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるＶ１３、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ１５、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２３、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２９、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるＶ７、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ３０、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるＶ３２、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又は各個のミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるＶ３３、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップとを含む。
一実施形態において、本方法は、ＨＤに罹患する対象からのサンプルを提供することさらに含む。
ＨＤに罹患する対象は、疾患の任意の段階、特に無症候の段階又は疾患進行の早期段階にあってもよい。好ましくは、対象は少なくとも４０個のＣＡＧリピートを有するｈｔｔ遺伝子の変異を包含する。
スクリーニング方法は、適切な治療、即ち個別化された医薬を選択するために、ＨＤ患者のサンプルにおいて、又は、例えば薬剤開発若しくは薬剤再評価のためなど、ＨＤサンプルの個体群において、おこなわれるとよい。
好ましくは、サンプルは皮膚生検、神経組織生検、血清及び血液からなる群から選択される。
生細胞は、サンプルの特性に従って、サンプルから直接的に取得された、又はサンプルの細胞の初代培養から取得された、線維芽細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択されるとよい。また、生細胞は、成人の体細胞、特にサンプルから取得された線維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、インビボの状態に可能な限り近づくような結果を取得するために、非形質転換の生細胞である。
好ましい実施形態において、サンプルは皮膚生検であり、細胞は線維芽細胞である。特に、皮膚生検は、分離するか又は線維芽細胞の培養を富化するために処理されるとよい。
一実施形態において、本方法は、ミトコンドリア挙動変数の値を測定する前に、サンプルから取得された生細胞に含まれるミトコンドリアを標識することをさらに含む。好ましくは、ミトコンドリアはステップａ）の前に標識される。
ミトコンドリアは、当業者には通常既知である任意の方法を用いて標識されるとよい。好ましくは、標識は蛍光、発光、又は着色標識である。より好ましくは、標識は蛍光標識である。ミトコンドリアは、該小器官に特異的なプローブを用いて、及び／又はレポーター遺伝子の導入によって（例えば、ミトコンドリア標的発現を伴うＧＦＰ発現構造）、及び／又は該小器官に特異的に取り入れられるマーカ若しくは色素の生細胞内への微量注入によって、標識されるとよい。これらすべての技術は当業者に既知である。この種の標識のために一部の市販のキットが利用可能であり、これらは製造者の推奨に従って用いられる必要がある。特に、ミトコンドリアは、カルセイン及びコバルト（Ｐｅｔｒｏｎｉｌｌｉ他、１９９８年）、ローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、及びテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）などの蛍光ローダミン誘導体、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ（ＮＡＯ）、又は、特にミトトラッカーグリーン（ＭＴＧ）若しくはミトトラッカーレッド（ＣＭＸＲｏｓ）であるミトトラッカー色素、を用いて標識されるとよい。好ましくは、ミトコンドリアは、ミトコンドリア膜電位に感受性がない色素を用いて標識される。特に、色素は、ミトトラッカーグリーン（ＭＴＧ）、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ（ＮＡＯ）、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択されることができる。特に好ましい実施形態において、ミトコンドリアはミトトラッカーグリーンを用いて標識される。
他の実施形態においてミトコンドリアは標識されず、ミトコンドリア挙動変数の値は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡などの標識不要の顕微鏡技術を用いて測定される。
ステップａ）において、生細胞はテスト化合物と接触させられる。
テスト化合物は、化学的化合物、生物学的化合物、放射線、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択されるとよい。
一実施形態において、テスト化合物は放射線、特にＸ線、ガンマ線、α粒子、β粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体、及び電離放射線の他の形態、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される放射線である。
他の実施形態において、テスト化合物は化学的化合物、即ち、有機又は無機化合物である。例として、テスト化合物は、ＨＤ以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤、高スループットの化学ライブラリからの化合物、又は遺伝子治療に適した核酸構築物であり得る。テスト化合物がＨＤ以外に適用する目的で市販されるように認可された薬剤である場合、本方法は薬剤再評価のために用いられるとよい。
さらなる実施形態において、テスト化合物は生物学的化合物である。生物学的化合物は、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物、及び他の任意の生物学的分子又は複合体からなる群から選択されるとよい。また、細胞療法に用いられる治療的細胞、又はウイルス療法用に組み換えをされたウイルスであってもよい。特に、治療的細胞は、幹細胞、前駆細胞、細胞置換療法のための成熟細胞及び機能細胞、又は細胞を利用した遺伝子治療のための遺伝子組み換え細胞であるとよい。
生細胞をテスト化合物と接触させる技術は、その化合物の特性次第で変わり得り、当業者によって容易に選択され得る。特に、テスト化合物が化学的又は生物学的化合物である場合、細胞培地に添加されるとよい。細胞療法では、サンプルから取得された生細胞と、治療的細胞又は遺伝子的に組み換えられた細胞とは、細胞同士の直接的な接触が可能であるか、又は可能ではない共培養系を用いて接触させるとよい。テスト化合物が放射線である場合、培地内の細胞は放射線にかけられるとよい。テスト化合物が核酸構築物である場合、リポソームなどの適切なビヒクル内の培地に添加されるか、細胞に導入されるか、又は細胞に直接的に注入されるとよい。これらすべての技術は当業者には既知である。
本方法のステップｂ）において、いくつかのミトコンドリア挙動変数の値は、ステップａ）においてテスト化合物に接触させた細胞において測定される。実験の項に示されるように、これらの変数は、ＨＤ患者の細胞を健康な人の細胞と区別するために十分であり、細胞がＨＤの処置若しくは予防に有用なテスト化合物と接触させられるときに回復することが可能であるＨＤシグネチャを構成するように、発明者等によって選択された。
ミトコンドリア挙動変数の値は、生細胞内で観察されるミトコンドリア、好ましくは標識されたミトコンドリアのイメージを分析することで測定される。イメージは、例えば、少なくとも２分間、高走査速度で、少なくとも１０秒毎に、好ましくは少なくとも２〜６分間、高走査速度で、０．１〜１０秒毎に撮影される。イメージ撮影は、イメージ取得システムと連結された蛍光顕微鏡又は微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡などの任意の適切な顕微鏡技術を用いておこなわれるとよい。特に、ミトコンドリアが標識される場合、イメージ撮影は蛍光顕微鏡を用いておこなわれるとよい。ミトコンドリアが標識されない場合、イメージ撮影はＤＩＣ顕微鏡を用いておこなわれるとよい。イメージ取得デバイスは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）など、高速で高解像度フレームを撮影することが可能である任意のデバイスであってよい。特に好ましい実施形態において、イメージ撮影は３つの空間的次元においておこなわれる。つまり、イメージ撮影はサンプルを３次元で視覚化できるモーター付きプレートを備えた顕微鏡を用いておこなわれるとよい。測定はテスト化合物の存在下で、又はテスト化合物への曝露後におこなわれるとよく、好ましくはテスト化合物の存在下でおこなわれるとよい。好適には、細胞はイメージ撮影時に３７℃に保持される。
ミトコンドリアは、細胞微小管とアクチンフィラメントネットワークとに沿って動くとき、細胞質内で移動する。第１の変数はＶ１、Ｖ３４、及びその組合せとからなる群から選択され、Ｖ１は各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であり、Ｖ３４は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。
変数Ｖ１は、各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、停止の数、即ち、ミトコンドリアが２フレームの間で不動である期間の数を記録することによって評価される。つまり、変数Ｖ１は、追跡される各ミトコンドリアについて単位時間毎の停止の数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータから停止の平均頻度を算出することによって取得される。
変数Ｖ３４は各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度である。この頻度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、バーストの数、即ち、撮影期間時にミトコンドリアの最大変位の３０％内の急激な変異の数を記録することによって評価される。つまり、変数Ｖ３４は、追跡される各ミトコンドリアについて単位時間毎のバーストの数を測定し、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからバーストの平均頻度を算出することによって取得される。
第２の変数Ｖ１２は、細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子である。この数は、イメージ分析ソフトウエアを用いて、細胞のイメージにおける各ミトコンドリアをカウントし、細胞領域単位毎の、好ましくは細胞領域のμｍ２毎の数で結果を表すことによって好ましくは測定される。変数は、複数の測定から、細胞単位毎のミトコンドリアの平均数を算出して取得されるとよい。この変数は分散記述子を算出することによって取得されてもよく、該分散記述子は、好ましくは分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
第３の変数Ｖ１３は、ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子である。該変数は、各個のミトコンドリアの領域を測定し、観察されたすべてのミトコンドリアのデータから平均領域を算出することで取得されるとよい。また該変数は、各個のミトコンドリアの領域を測定し、ミトコンドリアの領域の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。好適には、各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。
第４の変数Ｖ１５は、０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
第５の変数Ｖ２３は、１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
第６の変数は、Ｖ２９、Ｖ７、及びＶ３０、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、Ｖ２９は７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であり、Ｖ７は総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であり、Ｖ３０は１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
変数Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３０は特定の領域範囲に示されるミトコンドリアの頻度に関する。好ましくは、各ミトコンドリアの領域はイメージ分析ソフトウエアを用いて測定される。つまり、変数Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３０は、ミトコンドリアの領域を測定し、それぞれ０．５１〜１μｍ２、１０〜２０μｍ２、７０〜１００μｍ２、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの数を測定することによって取得される。結果はミトコンドリアの総数の百分率で表される。
変数Ｖ７は、総細胞領域に対する、もつれたミトコンドリア、即ち単一のミトコンドリアの個別化が不可能であるところまで組み合せられたミトコンドリアを含む部分の総領域である。この変数は、ミトコンドリアの方向性と細胞骨格の方向性との一致を評価し、ミトコンドリアと細胞骨格との関係の状態に関連する。
第７の変数は、Ｖ３２及びＶ３３、及びそれらの組合せからなる群から選択され、Ｖ３２はミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であり、Ｖ３３は各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子である。
変数Ｖ３２はミトコンドリアの平均移動速度である。ミトコンドリアの移動速度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、各ミトコンドリアの平均速度を記録することによって評価される。変数Ｖ３２は追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからミトコンドリアの平均移動速度を算出することで取得されるとよい。また該変数はミトコンドリアの移動速度の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
変数Ｖ３３は各個のミトコンドリアの平均最大移動速度である。最大速度は、フレーム毎に各ミトコンドリアを追跡し、撮影時に達したミトコンドリアの最大速度を記録することによって評価される。変数Ｖ３３は、追跡されたすべてのミトコンドリアのデータからミトコンドリアの平均最大移動速度を算出することで取得されるとよい。また該変数はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子を算出することで取得されてもよい。好ましくは、記述子は分散、標準偏差、及び分位範囲からなる群より選択され、より好ましくは分散、標準偏差、及び四分位範囲からなる群より選択される。
好ましい実施形態において、顕微鏡を介して観察されるミトコンドリアのイメージを記録且つ分析するため、例えば適切なソフトウエアを備えたコンピュ―タなどの記録及びデータ管理デバイスが用いられる。
各変数のために分析されるミトコンドリア及び細胞の数は、統計的方法を用いて、当業者によって容易に決定される。好ましくは、少なくとも３、１０、又は１５の細胞から、少なくとも５０、８０又は１００のミトコンドリアが各変数のために分析される。特定の実施形態において、少なくとも５０、８０又は１００のミトコンドリアが、変数Ｖ１及びＶ３２のために分析され、少なくとも１００、２５０、５００、８００、９００、又は１０００のミトコンドリアが、変数Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、及びＶ２９のために分析される。
本方法は、Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２；Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３３；Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ７、及びＶ３２；Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ７、及びＶ３３；Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ３０、及びＶ３２；Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ３０、及びＶ３３；Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２；Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３３；Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ７、及びＶ３２；Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ７、及びＶ３３；Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ３０、及びＶ３２；並びにＶ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ３０、及びＶ３３からなる群より選択される組合せの変数の値を測定することを含むとよく、Ｖ１、Ｖ３４、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、Ｖ７、Ｖ３０、Ｖ３２、及びＶ３３は上述で規定されたとおりである。
特定の実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２を測定することを含む。ここの実施形態において、本方法は上述に規定されるような変数Ｖ７、Ｖ３０、Ｖ３３、及びＶ３４からなる群から選択される少なくとも１つの追加的変数を測定することをさらに含むとよい。
代替的に、変数は、ＨＤ患者の個体群からのサンプルにおいて測定されることが可能である。各変数について取得された値は平均化される。
各変数は、それらの重要度を調整するために重み付けされるとよい。
本発明のスクリーニング方法は、テスト化合物の存在下において、ステップｂ）で取得された変数の値を、テスト化合物の非存在下において取得された値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、テスト化合物の非存在下における値は、テスト化合物に接触させる前に、ステップｂ）における同様のサンプルの細胞において取得される。特定の実施形態において、これらの値は、ミトコンドリアを標識した後且つステップａ）の前に、つまり、テスト化合物に接触させる前に、標識されたミトコンドリアを含む細胞において、取得される。各変数の値は上述されるように測定される。テスト化合物の非存在下で取得された値は、ＨＤの処置に有用であり得る化合物を特定するために負の対照として用いられるとよい。
本方法は、テスト化合物の存在下、任意的に非存在下において取得された変数の値を、（テスト化合物の非存在下で）健康な対象から得られたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含んでもよい。好ましくは、健康な対象は、ＨＤのサンプルを提供するＨＤ患者とおよそ同様の年齢である。各変数の値は上記に詳細に記載されるように測定される。健康な対象のサンプルより取得された値は、ＨＤの処置に有用であり得る化合物を特定するために正の対照として用いられるとよい。代替的に、この正の対照は健康な対象の個体群からのサンプルにおける変数を測定することによって得ることができる。そして、各変数について得られた値は平均化される。
特定の実施形態において、ＨＤシグネチャの変数の値は、ＨＤにおけるテスト化合物の用量反応作用を測定するために、複数の濃度のテスト化合物の存在下において測定される。
測定値の有意差は、ＡＮＯＶＡなどの任意の適切な統計テストを用いて測定されるとよい。
各用量のテスト化合物について変数のために取得された値は、識別する等式を用いて、スコアとして表されるとよい。各用量の作用は、負及び／又は正の対照に対して取得されたスコアについて評価されるとよい。
特に、各変数についてのスコアは、
変数Ｖｘのスコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
（ＮＣは負の対照の値又は平均値であり、ＰＣは正の対照の値又は平均値であり、Ｖａｒは変数の値である）である比率を用いて算出されるとよい。
表現型のレスキューの全体的な百分率は各測定変数のスコアを加算することによって取得されるとよい。
このように、結果は表現型のレスキューの百分率として表されるとよく、正の対照（健康なサンプル）が１００％であり、負の対照（テスト化合物の非存在下のＨＤサンプル）が０％である。正の表現型のレスキューを示すテスト化合物、つまり、ＨＤシグネチャを部分的又は全体的に回復することが可能である化合物は、ＨＤの処置に潜在的に有用であると特定される。所定の実施形態において、テスト化合物は、表現型のレスキューが５０％を超える、さらに好ましくは６０％、７０％、８０％又は９０％を超える場合に、潜在的に有用であると特定される。
好ましくは、テスト化合物は、測定されたすべての変数が正のスコアを示す場合、つまり各変数についてレスキューが観測される場合に、ＨＤの処置に潜在的に有用であると特定される。
他の態様では、本発明は対象におけるハンチントン病を診断するための方法に関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖｉｉ）である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるＶ１、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるＶ３４、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるＶ１２、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるＶ１３、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ１５、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２３、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２９、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるＶ７、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ３０、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるＶ３２、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるＶ３３、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップを含む。
スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
本方法は、対象からのサンプルを提供することさらに含むとよい。
好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。
対象は、ＨＤと類似する臨床的徴候を示すか、或いはいずれの症状も示さなくともよい。
本方法は、ｈｔｔ遺伝子におけるＣＡＧリピートの数を測定するために遺伝子テストをおこなうことをさらに含むとよい。
好ましい実施形態において、対象はｈｔｔ遺伝子において３６〜３９個のＣＡＧリピートを包含する。この場合、本発明の方法は、ＣＡＧリピートの数から疾患の進行を予測することは不可能であるため、特に関連する。
本方法は、対象がハンチントン病に罹患するかどうかをミトコンドリア挙動変数の測定値に基づいて測定することをさらに含むとよい。ＨＤの診断は、対象のサンプルから取得されたスコアを、健康な対象若しくはＨＤ患者から、又は代替的に健康な対象若しくはＨＤ患者の個体群から取得されたサンプルのスコアと比較することによって取得されるとよい。
健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数Ｖ１２、Ｖ１５、及び第１の変数即ちＶ１及び／又はＶ３４における関数の利得と、Ｖ１３、Ｖ２３、第６の変数即ちＶ２９、Ｖ７及び／又はＶ３０、及び第７の変数即ちＶ３２及び／又はＶ３３における関数の損失とは、ＨＤを示す。
特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２を測定することを含み、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数Ｖ１、Ｖ１２、及びＶ１５における関数の利得と、変数Ｖ１３、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２における関数の損失とは、ＨＤを示す。本方法は、測定変数のｚスコアを算出することをさらに含むとよい。特に、ＨＤサンプルにおいて、変数Ｖ１、Ｖ１２、及びＶ１５のｚスコアは正であり、変数Ｖ１３、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２のｚスコアは負である。
他の特定の実施形態において、本方法は、上述で規定されるようなミトコンドリア挙動変数Ｖ１、Ｖ２３、及びＶ３２を測定することを含み、健康なサンプルから取得された変数の値と比較することによる、変数Ｖ１及びＶ２３における関数の利得と、変数Ｖ３２における関数の損失とは、ＨＤを示す。この実施形態において、本方法は測定変数のｚスコアを算出することをさらに含むとよい。特に、ＨＤサンプルにおいて、変数Ｖ１、Ｖ２３、及びＶ３２のｚスコアは正であり、変数Ｖ３２のｚスコアは負である。本方法はミトコンドリア挙動変数Ｖ１３、Ｖ１２、Ｖ１５、及び／又はＶ２９を測定することをさらに含むとよい。
本発明は、対象におけるハンチントン病の診断に有用な情報を提供するための方法にも関し、該方法は、前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖｉｉ）の値である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるＶ１、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるＶ３４、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるＶ１２、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるＶ１３、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ１５、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２３、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２９、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるＶ７、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ３０、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるＶ３２、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるＶ３３、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
を測定するステップを含む。
上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
他の態様において、本発明は、ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするか、又は治療を目的としてハンチントン病に罹患する対象を選択するための方法にも関し、該方法は、
ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数（ｉ）〜（ｖｉｉ）である
（ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度であるＶ１、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度であるＶ３４、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
（ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子であるＶ１２、
（ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子であるＶ１３、
（ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ１５、
（ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２３、
（ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ２９、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域であるＶ７、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度であるＶ３０、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
（ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子であるＶ３２、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子であるＶ３３、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
の値を測定するステップと、
ｂ）ステップａ）において処置の適用の前後に取得された測定値を比較するステップとを含む。
スクリーニング方法のために上述されたすべての実施形態はこの態様においても考慮される。
好ましくは、生細胞に含まれるミトコンドリアはミトコンドリア挙動変数を測定する前に標識される。
本方法は、処置の適用の前及び／又は後に、好ましくは処置の前後に、対象からのサンプルを提供することをさらに含むとよい。
治療は、上述で規定されるような、１又は複数の化学的又は生物学的化合物、及び放射線を適用することを含むとよい。
スクリーニング方法について上述されたように、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数のために取得された値は、スコアとして表されるとよい。つまり、治療の効果は処置の前と後とに取得されたスコアを比較することによって評価されるとよい。任意的に、スコアは、健康なサンプル又は健康なサンプルの母集団から取得されたスコアと比較されてもよい。
特に好ましい実施形態において、スコアは、スコア=（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）である等式を用いて各変数のために算出され、ＮＣは処置の適用前に取得された値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは変数の測定値である。測定されたすべての変数が正のスコアであるとき、患者は治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができる。１又は複数の変数が負のスコアである場合、治療は疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要がある。
結果は表現型のレスキューの百分率として表されてもよく、正の対照（健康なサンプル）は１００％であり、負の対照（いずれの処置もおこなわれないＨＤサンプル、即ち処置前に取得されたＨＤサンプル）は０％である。正の表現型のレスキューは、ＨＤ患者が治療に反応的であるか、又は治療による効果を得ることができることを示す。一方で、負の表現型のレスキューは、治療が疾患の症状を悪化させ得、停止又は回避される必要があることを示す。
本発明のさらなる態様及び有利性は以下の実施例に記載される。これは例示として考えられ、限定するものではない。
＜実施例＞
［実施例１：ハンチントン病シグネチャ］
〔皮膚生検サンプル採取〕
皮膚生検は、６人の健康な対象と６人のＨＤ患者とを含む１２人のヒト提供者から採取された（表１）。２つのグループにおいて、他の疾患又は併存症は報告されなかった。
女性のみの対象を選択することによって、また健康及び疾患のそれぞれの対象において年齢の範囲を３６又は３８歳の凡そ前後１０年内に限定することによって起こり得る交絡的な年齢及び性別の影響を最小化するために、コホートを選択した。
この選択はまた、健康な個体群における異種性を最小化する。
ＨＤ患者において、生検前における疾患の臨床的症状の期間は１〜１０年と異なる。臨床的症状のプロファイルは、６人中４人のＨＤ患者について利用可能であった。舞踏様運動は異なるレベルの重症度の２人の患者に現れた。１人の患者はジストニア及び著しい振戦を伴うＨＤの運動低下性変異型を有する。１人はわずかにジストニアであり、動作緩慢及び表情の乏しさ（ｈｙｐｏｍｉｍｉａ）を示した。他の１は動作緩慢である。ＣＡＧリピートのサイズは４人のＨＤ患者について得られ、変異対立遺伝子において４７〜６９個のＣＡＧリピートの範囲であった。１人の患者は同型接合体を有し、重症である
表１はコホート特性を示す
〔細胞培養〕
患者由来の線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭにおいて培養した。サンプルの細胞は増殖され、少なくとも１６〜２０継代の間安定的であった。
〔動的イメージング〕
線維芽細胞を、ミトコンドリア膜電位に感受性がない細胞透過性ミトコンドリア色素であるミトトラッカーグリーンを用いて、３０分間標識した。落射蛍光顕微鏡により、イメージを６分間継続的に記録した。イメージ撮影の間、細胞を３７℃に保持した。各実験条件において、３つの独立したプレートのウェル毎に３〜１５細胞、つまり、６０００までの個別のミトコンドリアが記録された。データ取得の最大期間は３０分（即ち、６分間観測された５個の細胞）であった。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ顕微鏡を用いて、空間における３次元と時間とにおいて、イメージを撮影した。
〔ＨＤシグネチャのマーカの特定〕
ミトコンドリアの挙動を規定し、Ｖ１〜Ｖ３７にラベル付けされた３７個の変数を共に測定した。これらの変数は、ミトコンドリアの運動性、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの網様ネットワーク、又は細胞骨格との関係性及びミトコンドリア透過性を示す。
統計的方法（主成分分析、階層的クラスタ分類、判別分析、及びＡＮＯＶＡ）を用いて、７つの変数（Ｖ１、Ｖ３２、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、及びＶ２９）は、ただ１つの誤分類を伴って（ＩＤ：０９０４０７）、健康なサンプルとＨＤサンプルとを区別するのに十分であることがわかった。
Ｖ１は各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度である。
Ｖ１２は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
Ｖ１３はミトコンドリアの平均領域、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
Ｖ１５は０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
Ｖ２３は１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
Ｖ２９は７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度である。
Ｖ３２はミトコンドリアの平均移動速度、又は測定値の分散、標準偏差、又は四分位範囲である。
ウォード法を適用し、７つの変数により取得された階層的クラスタ分析の樹状図を図１に示す。クラスタ分析は、対象０９０４０７が誤配置された、疾患の患者（上部のグループ）と、健康な対象（下部のグループ）とからなる２つのサブグループを示す。
コホートの各患者において、各変数について調査されたミトコンドリアの数は、Ｖ１及びＶ３２において５９〜１００、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、及びＶ２９において９７０〜３６９６であった。これらの結果から、対象から取得された実際の値に対応するヒートマップを得た（図２）。このマップは、ＨＤ患者について、変数Ｖ１、Ｖ１２、及びＶ１５における増大と、変数Ｖ１３、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２における減少とを示し、健康な対象については逆のパターンを示す（対象０９０４０７は除く）（図３）。
７つの変数を含むシグネチャの強固性は、９回の個々の実験において２１５個の細胞から約３９，０００のさらなるミトコンドリアを分析すること、及び階層的クラスタ分析を繰り返すこと、により確認された。
［実施例２：ＨＤシグネチャの回復］
レスベラトロールはブドウや赤ワインに見受けられる植物性ポリフェノールである。レスベラトロールは、老化、代謝障害、炎症、及びがんにおける有益な効果と関連する。レスベラトロールは、低い生物学的利用能にもかかわらず、複数のインビトロ及びＨＤを再現するインビボモデルにおいて、変異ハンチンチンポリグルタミン毒性におけるレスキューを示した（Ｐａｒｋｅｒ等、２００５年；Ｍａｈｅｒ等、２０１１年；Ｈｏ等、２０１０年）。レスベラトロールは、ＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１、及びＰＧＣ−１αなどの複数の主要な代謝センサ・エフェクタタンパク質を標的とすることによりその作用を示し得る（Ｐａｓｉｎｅｔｔｉ等、２０１１年）。
シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）はカルシニューリンを阻害する抗炎症剤である。カルシニューリンは、細胞内Ｃａ２＋濃度における変化に対する神経細胞反応に重要な役割を果たすと考えられる、Ｃａ２＋及びカルモジュリン依存性タンパク質セリン・スレオニンホスファターゼである。ミトコンドリア膜電位の変化と異常なＣａ２＋処理はＨＤに関連する分子機構であり、ＣＳＡの標的である（Ｃｈｏｏ等、２００４年）。ＣＳＡと、他のカルシニューリン阻害剤であるＦＫ５０６とは、ＨＤを再現する種々の動物モデルにおいて議論となる作用を有することが示されている（Ｐｉｎｅｄａ等、２００９年；Ｋｕｍａｒ等、２０１０年；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｐｉｎｏｓａ等、２００６年）。
〔材料と方法〕
患者由来の線維芽細胞を、１５％ウシ胎児血清と、ミトコンドリアの挙動において不活性であるとして知られる濃度である０．５％ＤＭＳＯとを含むＤＭＥＭにおいて培養した。
細胞を、ＤＭＳＯに希釈された様々な用量のレスベラトロール又はシクロスポリンＡ（ＣＳＡ）とともに、又はビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）で、３０分間インキュベートし、動的イメージ撮影中にさらに３０分間、低速度ビデオ顕微鏡を用いて観察した。
レスベラトロール及びＣＳＡは３．５ｌｏｇ（１０、１、０．１、及び０．０５μＭ）にわたる４用量でテストした。
負の対照はビヒクルのみで処置されたＨＤ患者（ＩＤ：０９０４０１）の細胞であり、正の対照はビヒクルのみで処置された健康な対象（ＩＤ：０７１２０１）の細胞であった。
各ミトコンドリアについて取得された生データは、データ＝（ＮＣ-Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ-ＰＣ）である式を用いて、比率（％）として表された（ＮＣは負の対照の平均値、ＰＣは正の対照の平均値、Ｖａｒは変数の値）。
〔結果〕
・レスベラトロール
ＨＤシグネチャを構成する７つの変数におけるレスベラトロールの作用の用量反応分析は図４に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。０％は疾患の状態を表し、１００％は健康な状態を表す。
全体のレスキューにおける変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果としての作用プロファイル（図５）は、０．０５μＭのレスベラトロールが、疾患状態の軽度の悪化を示す有害な作用を示す一方で、０.１μＭ及び１μＭでは、それぞれ８６％及び８９．９％の回復を示した。１０μＭでは、作用は健康な状態を超え、過剰な補償作用を示し得る。
レスベラトロールの全体の作用は、低用量を除いて、疾患修飾能及び疾患状態のレスキューを示す。
・シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）
ＨＤシグネチャを構成する７つの変数におけるＣＳＡの作用の用量反応分析は図６に示される。作用は上述に規定されるような対照値の百分率、つまり表現型のレスキューの百分率として表される。０％は疾患の状態を表し、１００％は健康な状態を表す。
全体のレスキューにおける変数の重み付け作用を表すため、判別式を適用した。結果の作用プロファイル（図７）は、ＣＳＡで処理された疾患表現型の全体のレスキューにおける効果の用量依存的減少を示す。高用量（１０μＭ）におけるＣＳＡの有効作用の悪化は毒性の可能性を示し得る。
しかしながら、ＣＳＡは、０.０５μＭでは８４％に近い回復を示し、レスベラトロールより有力な薬剤とされる。
〔結果〕
これらの結果は、発明者等により示された、７つの変数を含むＨＤシグネチャが、ＨＤ患者と健康な対象とを区別するのに適し、前駆症候性段階を含む疾患進行の異なる段階におけるＨＤ診断をするための手段として用いられ得ることを示す。
また、発明者等は、動物モデルにおいて疾患回復能を有することが以前に示された２つの化合物であるレスベラトロール及びシクロスポリンＡを用いることで、このＨＤシグネチャが回復されることができ、故に用量依存的方法においても化合物の疾患修飾特性の検討を可能にすることも示した。よって、このシグネチャはＨＤ処置に有用である新規の薬剤をスクリーニング及び特定するための有効な手段として用いられることができる。
ＨＤ患者における化合物投与前又は後に、このシグネチャの発展をモニタリングすることが可能であることから、このシグネチャは、特に臨床試験において治療有効性の代用マーカとしても用いられることができる。
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Claims (21)

  1. ハンチントン病の処置に有用な化合物をインビトロにおいてスクリーニングする方法であって、
    ａ）ハンチントン病に罹患する対象のサンプルから得られた生細胞を、テスト化合物に接触させるステップと、
    ｂ）接触させた前記細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
    （ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
    （ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
    （ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
    （ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
    （ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
    （ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
    （ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
    の値を測定するステップとを含む方法。
  2. 前記ステップｂ）において取得された前記値を、前記テスト化合物の非存在下で取得された値と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 各前記変数について、
    スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
    である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、ＮＣは前記テスト化合物の非存在下においてＨＤサンプルから取得された前記値又は平均値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは測定された前記変数の前記値である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 前記テスト化合物は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、ハンチントン病の処置に有用であると特定される、請求項３に記載の方法。
  5. 対象におけるハンチントン病を診断するためのインビトロの方法であって、
    前記対象のサンプルから取得された生細胞において、ミトコンドリア挙動変数である
    （ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
    （ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
    （ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
    （ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
    （ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
    （ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
    （ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
    の値を測定することを含む方法。
  6. 前記対象はｈｔｔ遺伝子において３６〜３９個のＣＡＧリピートを含有する、請求項５に記載の方法。
  7. 測定された前記変数のｚスコアを算出することをさらに含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。
  8. 前記（ｉ）の変数、好ましくはＶ１、及び前記（ｉｉ）及び前記（ｉｖ）の変数の正のｚスコア、並びに前記（ｉｉｉ）、前記（ｖ）、前記（ｖｉ）、好ましくはＶ２９、及び（ｖｉｉ）、好ましくはＶ３２、の変数の負のｚスコアは、前記対象がハンチントン病に罹患することを示す、請求項７に記載の方法。
  9. ハンチントン病に罹患する対象の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロの方法であって、
    ａ）前記対象のサンプルから取得された生細胞において、処置の適用の前後に、ミトコンドリア挙動変数である
    （ｉ）各個のミトコンドリアの軌跡における停止の平均頻度（Ｖ１）、及び各個のミトコンドリアの変位におけるバーストの平均頻度（Ｖ３４）、及びそれらの組合せ、からなる群から選択される変数、
    （ｉｉ）細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの平均数、又は細胞領域単位毎の各個のミトコンドリアの数の分散記述子（Ｖ１２）、
    （ｉｉｉ）ミトコンドリアの平均領域、又はミトコンドリアの領域の分散記述子（Ｖ１３）、
    （ｉｖ）０．５１〜１μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ１５）、
    （ｖ）１０〜２０μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２３）、
    （ｖｉ）７０〜１００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ２９）、総細胞領域に対する、組み合わせられたミトコンドリアを含む部分の総領域（Ｖ７）、及び１００〜２００μｍ２の領域に示されるミトコンドリアの頻度（Ｖ３０）、及びそれらの任意の組合せ、からなる群から選択される変数、並びに、
    （ｖｉｉ）ミトコンドリアの平均移動速度、又はミトコンドリアの移動速度の分散記述子（Ｖ３２）、及び各個のミトコンドリアの平均最大移動速度、又はミトコンドリアの最大移動速度の分散記述子（Ｖ３３）、及びそれらの組合せからなる群から選択される変数、
    の値を測定するステップと、
    ｂ）前記ステップａ）において前記処置の適用の前後に測定されて得られた前記値を比較するステップとを含む方法。
  10. 各前記変数について、
    スコア＝（ＮＣ−Ｖａｒ）＊１００／（ＮＣ−ＰＣ）
    である等式を用いてスコアを算出することをさらに含み、ＮＣは前記処置の適用前に取得された前記値であり、ＰＣは健康なサンプルから取得された値又は平均値であり、Ｖａｒは測定された前記変数の前記値である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記対象は、測定された前記変数のすべてが正のスコアを有する場合に、前記治療に反応的であるか、又は前記治療による効果を得ることができる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記方法は、請求項１、請求項５、及び請求項９のいずれか１項において規定される前記ミトコンドリア挙動変数Ｖ１、Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１５、Ｖ２３、Ｖ２９、及びＶ３２を測定することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記方法は、請求項１、請求項５、及び請求項９のいずれか１項において規定されるＶ７、Ｖ３０、Ｖ３３、及びＶ３４からなる群より選択される少なくとも１つの追加的ミトコンドリア挙動変数を測定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記方法は、測定された前記ミトコンドリア挙動変数の前記値を、健康な対象から取得されたサンプルにおいて測定された前記変数の値と比較することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記サンプルは、皮膚生検サンプル、神経組織生検サンプル、及び血清又は血液サンプルからなる群より選択され、好ましくは皮膚生検サンプルである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記生細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞、リンパ球、及び神経細胞からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記生細胞は線維芽細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記分散記述子は分散、標準偏差、及び好ましくは四分位範囲である分位範囲、からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記生細胞に含まれる前記ミトコンドリアは前記ミトコンドリア挙動変数の前記値を測定する前に標識される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記生細胞の前記ミトコンドリアは、好ましくは蛍光標識を用いて、より好ましくはミトトラッカーグリーン、カルボシアニン色素、１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ、及びカルセイン・コバルトの組合せからなる群より選択される色素を用いて、さらにより好ましくはミトトラッカーグリーンを用いて標識される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ミトコンドリア挙動変数の前記値は、イメージ取得デバイスと連結された蛍光顕微鏡又はＤＩＣ顕微鏡を用いて、好ましくはＣＣＤカメラと連結された蛍光顕微鏡を用いて撮影されたイメージから取得される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
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