ES2326772B1 - Procedimiento de obtencion de celulas madre mesenquimales con capacidad pluripotente. - Google Patents
Procedimiento de obtencion de celulas madre mesenquimales con capacidad pluripotente. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento de obtención de células madre mesenquimales con
capacidad pluripotente que utiliza sangre periférica de mamíferos o
sus hemoderivados como fuente celular. Las células madre
mesenquimales son un tipo de célula madre adulta con capacidad de
diferenciarse hacia tejidos derivados del mesodermo y otros linajes
celulares de otras capas embrionarias.
Description
Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente.
La presente invención se encuadra en el ámbito
de la biomedicina. Más específicamente, se refiere a la obtención
de células madre mesenquimales mediante un procedimiento que
utiliza sangre periférica de mamíferos o sus hemoderivados como
fuente celular. Las células madre mesenquimales son un tipo de
célula madre adulta con capacidad de diferenciarse hacia tejidos
derivados del mesodermo y otros linajes celulares de otras capas
embrionarias.
Un tipo de célula madre adulta, especialmente
prometedor en aplicaciones terapéuticas, son las denominadas
células madre mesenquimales (CMM). En 1.974, Friedenstein y
colaboradores describieron una población de células, aisladas de la
médula ósea (MO), con adherencia innata al plástico y capacidad de
diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos,
denominándolas por ello células estromales de la médula ósea
(Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF,
Keiliss-Borok IV. Transplantation 1974; 17:
331-340). Desde entonces numerosos grupos de
investigación han aislado poblaciones celulares de otros tejidos
sólidos (tejido adiposo, cartílago, piel, etc...) con
características muy similares a las células estromales de la MO e
idéntica capacidad de diferenciación hacía tejidos derivados del
mesodermo, de ahí que las células estromales de la MO pasasen a
denominarse genéricamente Células Madre Mesenquimales (revisado en
Beyer Nardi N, da Silva Meirelles L. Handbook Experimental
Pharmacology 2006;174:249-282). Posteriormente se
ha demostrado que también poseen capacidad de diferenciación hacia
linajes celulares de otras capas embrionarias, e incluso presentan
capacidad de injertar in vivo en fetos
pre-inmunes de ternera y diferenciarse in
situ en células maduras de múltiples órganos (Liechty KW,
MacKenzie TC, Shaaban AF, Radu A, Moseley AM, Deans R, Marshak DR,
Flake AW. Nature Medicine 2000; 6: 1282-12862).
La diferenciación de las CMM no es sólo un hecho
descrito in vitro; en diversos modelos animales de daño
tisular se ha observado cómo, en la zona dañada, aparecían células
no hematopoyéticas de la MO o bien directamente CMM, y que estas
células eran capaces de diferenciarse hacía el linaje celular del
tejido donde anidaban (piel, cerebro, hígado, etc...)(Prockop DJ,
Gregory CA, Spees JL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;
100:11917-11923). Esto demuestra el potencial de las
CMM para reparar y regenerar múltiples órganos gracias a su
capacidad de movilizarse desde sus reservorios naturales hasta la
sangre periférica (SP) y de ahí extravasarse hacia el lugar donde
se localice el daño. Esta movilización implicaría la presencia de
CMM en sangre, al menos de forma transitoria. Efectivamente diversos
artículos han mostrado la posibilidad de aislar CMM de sangre
periférica, de sangre de cordón umbilical e incluso de sangre fetal
(Revisado en Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L,
Adams G, Edwards CJ, Moss J, Burger JA, Maini RN. Arthritis
Research 2000; 2: 477-488 y en He Q, Wan C, Li G.
Stem Cells 2007; 25: 69-77). Además investigadores
del Hospital Universitario de Salamanca han aislado CMM de MO de
pacientes sometidos a trasplante hematopoyético y en dos casos han
observado como un cierto porcentaje de las CMM de MO eran de origen
del donante, demostrando indirectamente que éstas se hallaban en la
aféresis con la que se realizó el trasplante (Villaron EM, Almeida
J, Lopez-Holgado N, Alcoceba M,
Sanchez-Abarca LI, Sanchez-Guijo
FM, Alberca M, Perez-Simon JA, San Miguel JF, Del
Canizo MC. Haematologica. 2004; 89:1421-1427). Sin
embargo, otros autores han sido incapaces de reproducir estos
hallazgos de CMM en SP (Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL,
Rosenthal NS, Caplan Al. Bone Marrow Transplantation 1995; 16:
557-564; Wexler SA, Donaldson C,
Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B, Hows JM.
British Journal Haematology 2003; 121: 368-374 y las
anteriores revisiones). Al revisar la bibliografía al respecto se
observa un punto común en todos los trabajos que es la dificultad
de aislar CMM de SP, con los métodos disponibles en la actualidad
(revisado en Roufosse CA, Direkze NC, Otto WR, Wright NA.
International Journal Biochemistry Cell Biology 2004; 36:
585-597 y las anteriores revisiones). Se han
detectado CMM en SP total aunque su cultivo igualmente resulta
dificultoso y poco reproducible ya que sólo en un pequeño
porcentaje de las muestras se consigue obtener, por los métodos
tradicionales, y expandir durante meses poblaciones enriquecidas en
CMM (Ramírez M, Lucia A, Gómez-Gallego F,
Esteve-Lanao J, Pérez-Martínez A,
Foster C, Andreu AL, Martín MA, Madero L, Arenas J,
García-Castro J. British Journal Sports Medicine
2006; 40: 719-22; García-Castro J,
Balas A, Ramírez M, Pérez-Martínez A, Madero L,
González-Vicent M, Díaz MA. Journal Pediatric
Hematology Oncology 2007; 29:
388-392).
388-392).
En la actualidad el proceso de obtención de CMM
humanas de diversos tejidos sólidos se basa en el mismo principio,
la adherencia innata de las CMM al plástico. En general, tras
disgregar el tejido y obtener una muestra celular en suspensión se
obtiene una fracción enriquecida en células mononuclares, utilizando
gradientes de densidad (ficoll, percoll...). Esta fracción se suele
depositar directamente sobre frascos de cultivo celular estándar
con medios generalistas a los que se añade suero bovino fetal. Al
día siguiente se retiran las células no adheridas y se mantiene el
cultivo de células adheridas hasta que este se enriquece en CMM
(Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF,
Keiliss-Borok IV. Transplantation 1974; 17:
331-340; WO 0183709; WO 0134775; WO 2005121317; WO
2005015151). Además las CMM se pueden obtener de forma similar a
partir de ciertos fluidos corporales durante el desarrollo del
feto, tales como líquido amniótico (Tsai MS, Lee JL, Chang YJ,
Hwang SM. Human Reproduction. 2004; 19:1450-1456;
In 't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur
C, Noort WA, Claas FH, Willemze R, Fibbe WE, Kanhai HH. Blood.
2003; 102:1548-1459; WO 2006019357; US 2005118712),
sangre fetal (Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, Bennett PR,
Bellantuono I, Fisk NM. Blood. 2001; 98: 2396-2402)
y sangre de cordón umbilical (Erices A, Conget P, Minguell JJ.
British Journal Haematology 2000; 109: 235-242; Lee
OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH. Blood. 2004; 103:
1669-1675; Bieback K, Kern S, Kluter H, Eichler H.
Stem Cells. 2004; 22: 625-634; WO 2006113881; WO
2006121043; WO 2007015546; WO 03070922; US 2007105221).
Sin embargo durante la etapa adulta la obtención
de CMM de fluidos corporales humanos resulta mucho más complicada y
menos reproducible. Con la metodología tradicional, anteriormente
comentada, ocasionalmente se puede obtener CMM de sangre periférica
movilizada y con mucha menor probabilidad con SP no movilizada
(Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G,
Edwards CJ, Moss J, Burger JA, Maini RN. Arthritis Research 2000;
2: 477-488; He Q, Wan C, Li G. Stem Cells. 2007;
25: 69-77; Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL,
Rosenthal NS, Caplan Al. Bone Marrow Transplantation 1995; 16:
557-564; Wexler SA, Donaldson C,
Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B, Hows JM.
British Journal Haematology 2003; 121: 368-374; WO
0022097; WO 9901145). Para obtener una mayor cantidad de CMM de SP
sería necesario disponer de un sistema que permitiese aislar CMM de
una manera reproducible.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento de obtención de células madre mesenquimales con
capacidad pluripotente que utiliza sangre periférica de mamíferos o
sus hemoderivados como fuente celular y que incluye las siguientes
etapas:
a) centrifugación en gradiente de densidad de
dicha sangre periférica o sus hemoderivados para obtener células
mononucleares.
b) separación de la fracción celular mononuclear
obtenida en la etapa anterior y lavado de la misma con un buffer
salino centrifugando hasta obtención de un pellet celular.
c) resuspensión de dicho pellet celular y
recuento de células
d) cultivo de dichas células
Dicho cultivo se realiza a partir de una
densidad celular inicial comprendida entre 10^{6}
células/cm^{2} y 5 x 10^{6} células/cm^{2} en un medio de
cultivo químicamente definido derivado del
alpha-MEM suplementado con glutamina y con al menos
un 10% de suero fetal bovino y sobre una matriz extracelular que
contenga ligandos de integrinas.
La fuente celular se selecciona entre sangre
periférica fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada
fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada y sin
movilizar obtenida por técnicas de aféresis fresca o criopreservada,
fracción CD34-fresca o criopreservada obtenida de
sangre periférica movilizada o buffy coats. Preferentemente, la
fuente celular es sangre periférica humana procedente de un
individuo al cuál se le ha administrado un factor de crecimiento
capaz de movilizar los precursores hematopoyéticos a sangre
periférica (SP movilizada). Dicho factor de crecimiento
administrado para movilizar los precursores hematopoyéticos se
selecciona entre factor de crecimiento de colonias de granulocitos
(G-CSF) o factor de crecimiento de colonias
granulomacrofágicas (GM-CSF).
Las etapas de centrifugación en gradiente de
densidad, separación de la fracción celular mononuclear y lavado
con buffer salino así como la resuspensión del pellet celular,
todas ellas previas al cultivo, se realizan en un rango de tiempo
comprendido entre 5 minutos y 48 horas, preferentemente entre 5
minutos y 6 horas, adicionándose un anticoagulante, preferentemente
heparina, a cualquiera de las fuentes celulares cuando las etapas
previas al cultivo se realizan en un periodo de tiempo superior a 5
minutos.
En un modo alternativo de realización de la
invención, la fracción celular mononuclear se somete a
criopreservación antes de la etapa de cultivo; en este supuesto, la
resuspensión del pellet celular se lleva a cabo en un medio
compuesto por un 90% de suero fetal bovino y un 10% de un
crioprotector, preferentemente dimetilsulfóxido (DMSO).
El medio químicamente definido derivado del
alpha-MEM utilizado para el cultivo de las células
se selecciona entre DMEM o Stemline Médium
(Sigma-Aldrich) suplementados con glutamina y al
menos un 10% de suero fetal bovino, utilizándose preferentemente
medio DMEM suplementado con un 20% de suero fetal bovino, glutamina
y antibióticos.
La matriz extracelular sobre la que se realiza
el cultivo de las células contiene ligandos de receptores con el
motivo de unión RGD
(arginina-glicina-aspártico),
seleccionándose entre matrigel, fibronectina, vitronectina, Cultrex
Basement Membrane Extract o
Dextrosa-Gelatina-Veronal.
Preferentemente, la matriz extracelular sobre la que se realiza el
cultivo de las células es fibronectina a una concentración entre 1
y 10 \mug/cm^{2}.
En un modo preferente de realización del
procedimiento objeto de la presente invención, la fuente celular a
partir de la cual se obtienen las CMM es sangre periférica de
aféresis movilizada fresca, realizándose el cultivo partiendo de una
concentración inicial de 1,25 x 10^{6} células/cm^{2} en medio
DMEM suplementado con glutamina y un 20% de suero fetal bovino y
sobre una matriz de fibronectina a una concentración de 6,25
\mug/cm^{2}.
Tabla 1. Porcentaje de eficacia en la obtención
de CMM de Sangre Periférica en función del medio de cultivo
utilizado y de la concentración celular de partida: 0,25x10^{6}
células/cm^{2}, 1,25x10^{6} células/cm^{2} ó 5x10^{6}
células/cm^{2}.
Figura 1.- A) Células adheridas a las 48 horas
de iniciar los cultivos con Sangre Periférica. Es muy habitual
observar estas formaciones celulares con células de diferente
tamaño y morfología. En los cultivos exitosos para la obtención de
CMM las células fibroblastoides de los bordes de estas
"colonias" comienzan a crecer y tras dos-tres
pases se obtiene una población homogénea de CMM. B) Células con
fenotipo fibroblastoide, alargadas y estrechas, de gran tamaño, que
corresponden a las CMM obtenidas de cultivos de SP, tras obtener la
población homogénea antes mencionada.
Figura 2.- Histogramas de Citometría de Flujo
con análisis de expresión de marcadores de CMM derivadas de SP. En
cada histograma aparece el control negativo del isotipo (histograma
relleno) y dos muestras independientes de CMM derivadas de SP
(histogramas vacíos; negro y gris) marcadores con el anticuerpo que
reconoce el antígeno indicado.
Figura 3.- A) Cultivo de CMM derivadas de SP
sometidas a un proceso de diferenciación adipocítica. Se observan
los preadipocitos con las numerosas vacuolas intracelulares que se
tiñen con la solución Oil Red. B) Cultivo de CMM derivadas de SP
sometidas a un proceso de diferenciación osteogénica. Se observan la
gran secreción de matriz extracelular que se tiñe con la solución
Alizarin Red.
Figura 4.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de sangre periférica en función de la matriz
utilizada para iniciar el cultivo y de la fuente celular de partida:
Negro, aféresis frescas de SP movilizada; Gris, muestras
descongeladas de SP movilizada; Blanco, muestras frescas de la
fracción CD34- obtenida de SP movilizada; Negro rayado, muestras
descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada; Gris
rayado, muestras frescas de buffy coats. Los datos de esta gráfica
son la media de todos los cultivos con diferentes medios.
Figura 5.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de Sangre Periférica, utilizando medio de cultivo
DMEM + 10% FBS, en función de la matriz utilizada para iniciar el
cultivo y de la fuente celular de partida: Barras negras, aféresis
frescas de SP movilizada; Barras grises, muestras descongeladas de
SP movilizada; Barras blancas, muestras frescas de la fracción
CD34- obtenida de SP movilizada; Barras negras rayadas, muestras
descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada;
Barras grises rayadas, muestras frescas de buffy coats.
Figura 6.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de sangre periférica, utilizando medio de cultivo
DMEM + 20% FBS, en función de la matriz utilizada para iniciar el
cultivo y de la fuente celular de partida: Barras negras, aféresis
frescas de SP movilizada; Barras grises, muestras descongeladas de
SP movilizada; Barras blancas, muestras frescas de la fracción
CD34- obtenida de SP movilizada; Barras negras rayadas, muestras
descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada;
Barras grises rayadas, muestras frescas de buffy coats.
Figura 7.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de sangre periférica, utilizando medio MSCBM
(Lonza), en función de la matriz utilizada para iniciar el cultivo y
de la fuente celular de partida: Barras negras, aféresis frescas de
SP movilizada; Barras grises, muestras descongeladas de SP
movilizada; Barras blancas, muestras frescas de la fracción CD34-
obtenida de SP movilizada; Barras negras rayadas, muestras
descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada;
Barras grises rayadas, muestras frescas de buffy coats.
Figura 8.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de sangre periférica, utilizando medio NH
Expansion Medium (Miltenyi), en función de la matriz utilizada para
iniciar el cultivo y de la fuente celular de partida: Barras negras,
aféresis frescas de SP movilizada; Barras grises, muestras
descongeladas de SP movilizada; Barras blancas, muestras frescas de
la fracción CD34- obtenida de SP movilizada; Barras negras rayadas,
muestras descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP
movilizada; Barras grises rayadas, muestras frescas de buffy
coats.
Figura 9.- Porcentaje de eficacia en la
obtención de CMM de sangre periférica, utilizando medio Stemline
(Sigma-Aldrich) + 10% FBS, en función de la matriz
utilizada para iniciar el cultivo y de la fuente celular de partida:
Barras negras, aféresis frescas de SP movilizada; Barras grises,
muestras descongeladas de SP movilizada; Barras blancas, muestras
frescas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada; Barras
negras rayadas, muestras descongeladas de la fracción CD34- obtenida
de SP movilizada; Barras grises rayadas, muestras frescas de buffy
coats.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención presenta un método para obtener
células madre mesenquimales humanas utilizando sangre periférica
como fuente celular. Aunque en dicho método la fuente preferida es
SP movilizada fresca, también serían fuentes alternativas la SP
movilizada congelada, la fracción CD34-obtenida de
SP movilizada fresca, dicha fracción congelada, la SP de aféresis
sin movilizar, fresca y congelada, así como los buffy coats y la SP
sin movilizar. Más en detalle, la invención presenta un método para
obtener células madre mesenquimales humanas con capacidad
pluripotente que comprende:
1) Obtención de CMM a partir de muestras de
sangre periférica. Esta SP es preferible que proceda de un
individuo al cuál se le ha administrado un factor de crecimiento
capaz de movilizar a SP a los precursores hematopoyéticos (SP
movilizada) (Robinson BE, Quesenberry PJ. Am J Med Sci. 1990; 300:
163-170; US 5199942). Incluso con los métodos
tradicionales de obtención de CMM se ha visto que la probabilidad
de obtener CMM de SP es mayor si esta sangre es movilizada (Lazarus
HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Rosenthal NS, Caplan AI. Bone Marrow
Transplantation 1995; 16: 557-564; Wexler SA,
Donaldson C, Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B,
Hows JM. British Journal Haematology 2003; 121:
368-374; Fernandez M, Simon V, Herrera G, Cao C,
Del Favero H, Minguell JJ. Bone Marrow Transplantation 1997; 20:
265-271; Kassis I, Zangi L, Rivkin R, Levdansky L,
Samuel S, Marx G, Gorodetsky R. Bone Marrow Transplantation 2006;
37: 967-976; Tondreau T, Meuleman N, Delforge A,
Dejeneffe M, Leroy R, Massy M, Mortier C, Bron D, Lagneaux L. Stem
Cells. 2005; 23:1105-1112; WO 0022097; WO 9901145).
En la práctica clínica la movilización de los pacientes se realiza
habitualmente con el factor de crecimiento de colonias de
granulocitos (G-CSF), aunque experimentalmente se
ha visto que otros factores de crecimiento podrían teóricamente
movilizar CMM a SP (Son BR, Marquez-Curtis LA, Kucia
M, Wysoczynski M, Turner AR, Ratajczak J, Ratajczak MZ,
Janowska-Wieczorek A. Stern Cells. 2006;
24:1254-1264; EP 1779865).
2) Obtención de CMM a partir de muestras de
sangre periférica, donde el proceso se realiza preferiblemente
entre las seis primeras horas tras la obtención de la SP. Las
muestras biológicas en suspensión pueden ser criopreservadas durante
años sin sufrir alteraciones en su funcionalidad. Esta propiedad
también se da en las CMM congeladas en soluciones que contengan
algún agente crioprotector, como por ejemplo el dimetilsulfóxido al
10% (Lee MW, Choi J, Yang MS, Moon YJ, Park JS, Kim HC, Kim YJ.
Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320: 273-278; Lee
MW, Yang MS, Park JS, Kim HC, Kim YJ, Choi J. Int J Hematol. 2005;
81: 126-30; WO9739104). Sin embargo la mayor
manipulación de la muestra durante el proceso de congelación puede
alterar la calidad de la muestra (Almici C,
Carlo-Stella C, Wagner JE, Rizzoli V. Acta
Haematologica 1996; 95: 171-175; Meyer TP, Hofmann
B, Zaisserer J, Jacobs VR, Fuchs B, Rapp S, Weinauer F, Burkhart J.
Cytotherapy. 2006; 8: 265-276) y por lo tanto la
eficacia de obtención de las CMM.
3) Obtención de CMM a partir de muestras de
sangre periférica, preferiblemente sin haber sufrido depleción de
otras poblaciones celulares. Algunos autores han propuesto la
selección positiva de ciertas poblaciones celulares como método de
obtención de CMM (Tondreau T, Meuleman N, Delforge A, Dejeneffe M,
Leroy R, Massy M, Mortier C, Bron D, Lagneaux L. Stem Cells. 2005;
23:1105-1112; Quirici N, Soligo D, Bossolasco P,
Servida F, Lumini C, Deliliers GL. Experimental Hematology 2002;
30: 783-791; Deschaseaux F, Gindraux F, Saadi R,
Obert L, Chalmers D, Herve P. British Journal Haematology 2003;
122: 506-517; Letchford J, Cardwell AM, Stewart K,
Coogans KK, Cox JP, Lee M, Beresford JN, Perry MJ, Welham MJ.
Journal Immunology Methods 2006; 308: 124-137). Sin
embargo ningún otro grupo, ha podido reproducir estos resultados.
Por otro lado, en la práctica clínica los trasplantes de
progenitores hematopoyéticos en ocasiones se realizan utilizando la
subpoblación celular CD34+ que posee la mayor parte de los
progenitores hematopoyéticos y ciertas células endoteliales (Demirer
T. Adv Exp Med Biol. 2003; 534: 107-118. Asahara T,
Kawamoto A. Am J Physiol Cell Physiol. 2004; 287:
572-579). Por lo tanto, la fracción CD34- posee las
CMM dada la ausencia de este marcador en las CMM (Tondreau T,
Lagneaux L, Dejeneffe M, Delforge A, Massy M, Mortier C, Bron D.
Cytotherapy 2004; 6: 372-379; Mageed AS, Pietryga
DW, DeHeer DH, West RA. Transplantation. 2007; 83:
1019-1026) por lo que puede ser utilizada como
fuente alternativa de CMM.
4) Obtención de células mononucleares de SP
utilizando gradientes de densidad. La utilización de gradientes de
densidad de diferentes productos comerciales (ficoll, percoll,
sucrosa, etc) es habitual para obtener células mononucleares como
método de obtención de poblaciones celulares enriquecidas en
células precursoras, incluyendo las CMM (Pittenger MF, Mackay AM,
Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW,
Craig S, Marshak DR. Science. 1999; 284: 143-147;
EP 1767617; JP2006149375; WO 9901145).
5) Cultivo de dichas células mononucleares donde
la densidad celular de inicio sea preferentemente mayor de
0,25x10^{6} células/cm^{2} y menor de 5x10^{6}
células/cm^{2}. La concentración celular de inicio en los
cultivos es muy variable entre los distintos grupos no existiendo
un consenso real sobre la cantidad óptima de partida de células
para iniciar un cultivo de CMM, aunque en general se parte de una
cantidad muy elevada de células incluso mayor a 10^{7}
células/cm^{2} (US 5942225).
6) Que dicho cultivo se realice preferentemente
sobre una matriz extracelular. Las CMM se encuentran en la MO
embebidas en una matriz compuesta por ácido hialurónico y distintas
proteínas, algunas estructurales como los proteoglicanos, el
colágeno o la elastina y otras más especializadas como la
fibronectina o la laminina. Muchas células poseen ligandos
específicos de cada uno de estos componentes de la matriz
extracelular. Se conoce poco sobre la expresión de dichos ligandos
en CMM obtenidas de MO (Docheva D, Popov C, Mutschler W, Schieker
M. J Cell Mol Med. 2007; 11: 21-38; Lopez Ponte A,
Marais E, Gallay N, Langonne A, Delorme B, Herault O, Charbord P,
Domenech J. Stem Cells. 2007: Mar 29) y apenas nada sobre estos
ligandos en CMM derivadas de SP. Es obvio pensar que las CMM que
circulan por la sangre presenten un perfil de moléculas de adhesión
muy diferente a las CMM presentes en tejidos sólidos, donde se
encuentran rodeadas de la matriz extracelular. Por ello, para
optimizar la obtención de CMM de SP hemos utilizado proteínas que
mimeticen una matriz a la que las CMM de SP pudiesen anclarse con
más afinidad y así mejorar la adhesión y posterior crecimiento de
estas células.
7) Que dicha matriz extracelular esté compuesta
preferentemente de ligandos de integrinas. Las CMM de la MO
expresan una gran cantidad de integrinas y son capaces de crecer en
substratos recubiertos por ligandos de estas integrinas (Gronthos
S, Simmons PJ, Graves SE, Robey PG. Bone. 2001; 28:
174-181). Nada se conoce de la expresión de
integrinas en CMM obtenidas de SP. Los resultados obtenidos indican
que las matrices más óptimas para aislar CMM de SP son aquellas que
posean ligandos de receptores con el motivo de unión RGD
(arginina-glicina- aspártico).
8) Que el medio de cultivo sea preferentemente
un medio químicamente definido derivado del
alpha-MEM y 9) que dicho medio de cultivo se
suplemente con un porcentaje superior al 10% de suero fetal bovino.
La forma habitual de crecimiento de las CMM son medios derivados
del alpha-MEM, suplementados con suero fetal bovino
en porcentajes variables, además de glutamina y antibióticos. Se han
realizado diversos intentos en la optimización de los medios de
cultivo de CMM, intentado sustituir el suero fetal bovino por suero
humano o por la adición de diversos factores de crecimiento
(Sotiropoulou PA, Perez SA, Salagianni M, Baxevanis CN, Papamichail
M. Stem Cells 2006; 24: 462-471; Berger MG, Veyrat-
Masson R, Rapatel C, Descamps S, Chassagne J,
Boiret-Dupre N. Stem Cells 2006; 24:
2888-2890; JP 2006325445; US 2005013804; WO
2006022091; WO 9639487) con resultados diversos. Varias casas
comerciales venden medios específicos para cultivar CMM. En general
estos medios están optimizados para el cultivo de CMM de MO y en
los experimentos realizados por los autores de la presente invención
han funcionado peor que el medio químicamente definido suplementado
con suero bovino, aunque el porcentaje de éste es importante en la
reproducibilidad y eficacia del sistema de obtención de CMM de
SP.
1.- Obtención de CMM de SP: Las muestras
de SP se obtuvieron, previo consentimiento informado, de donantes
sanos movilizados con G-CSF, cuyas aféresis iban a
ser utilizadas para trasplantes de progenitores hematopoyéticos en
el Servicio de Oncohematología y Trasplante Hematopoyético del
Hospital Niño Jesús de Madrid. Las muestras de buffy coat se
obtuvieron del Centro de Transfusiones de la Comunidad de Madrid.
Las muestras heparinizadas de SP movilizada, o los buffy coat, se
centrifugaron (400 g, 25 minutos, 20ºC) en un gradiente de densidad
utilizando Ficoll-Paque para obtener la fracción de
células mononucleares. Una vez obtenida la fracción mononuclear se
lavó dos veces con un buffer salino (centrifugando a 600 g, 5
minutos, temperatura ambiente). El pellet celular se resuspendió y
se contó el número de células. Si las células se criopreservaron,
las células se resuspendieron en una solución al 90% de suero fetal
bovino y 10% de DMSO y se introdujo en criotubos que se almacenaron
en nitrógeno líquido. En el caso de los cultivos con células
"frescas", estas células se sembraron en frascos de cultivo a
una densidad inicial variable según cada caso. En el caso de los
experimentos donde se ensayaban matrices para el cultivo se
utilizaron frascos no tratados para cultivo celular. Se cultivaron
en medios específicos para cultivo de CMM comerciales o en
Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; Sigma, Estados Unidos),
con o sin suplementar con suero fetal bovino (FBS; Lonza, Suiza),
manteniéndose en un incubador a 37°C, en una atmósfera de 5% de
CO_{2} y saturada de humedad. Tras 24 horas de cultivo se
eliminaron las células no adheridas a la placa de cultivo y se
añadió medio fresco. Los cultivos se lavaron con buffer fosfato y
se reemplazó el medio por medio fresco dos veces a la semana. Cuando
el cultivo alcanzaba la semiconfluencia (70-80% de
la superficie de la placa), las células se tripsinizaron (solución
con 0,5% tripsina más 0,2% EDTA), se lavaron (centrifugando a 600
g, 5 minutos, temperatura ambiente) y replaquearon a una
concentración de 4x10^{3} células/cm^{2}. En los cultivos donde
se obtuvieron CMM a partir del tercer pase se obtenía una población
homogénea de CMM, que se caracterizaron como se expone a
continuación.
En los cultivos en los que se utilizó, la
concentración de los factores de crecimiento fue de 10 ng/mL de
FGF, EGF y HGF. En los cultivos en los que se utilizó, la
concentración de las matrices fue la siguiente: 7,5 \mug/cm^{2}
de matrigel (BD Biosciences, Estados unidos), 6,25 \mug/cm^{2}
de fibronectina (R&D Systems, Estados Unidos), 6,25 1
\mug/cm^{2} de vitronectina, 0,1 mg/mL de Cultrex Basement
Membrane Extract (R&D Systems, Estados Unidos),
Dextrosa-Gelatina-Veronal (DGV) al
10% (Lonza, Suiza).
El extracto comercial "Cultrex Basement
Membrane Extract" es una forma soluble de membrana purificada de
tumor Engelbreth-Holm-Swarm. Dicho
extracto se gelifica a 37°C para formar una membrana reconstituida
similar a un estroma fisiológico. Los principales componentes de
este extracto incluyen la laminina I, el colágeno IV, la entactina
y el proteoglican heparan-sulfato.
El buffer comercial
Dextrosa-Gelatina-Veronal (DGV) se
utiliza como un estabilizador de las muestras biológicas cuya
composición química es la siguiente:
- CaCl_{2} 20 mg/L
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 120 mg/L
- NaCl 8.500 mg/L
- Gelatina 600 mg/L
- Glucosa 10.000 mg/L
- Veronal sódico 380 mg/L
- Veronal 580 mg/L
2.- Caracterización fenotípica y funcional de
CMM de SP: Ante la ausencia de un marcador específico de CMM,
esta población celular se define combinando diversas propiedades
que les caracterizan, como son una morfología definida, un fenotipo
determinado por múltiples marcadores de membrana y una marcada
capacidad de diferenciación hacia línea mesenquimal utilizando
medios específicos (Dominici M, Le Blanc K, Mueller I,
Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R,
Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. The International Society for
Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8:
315-317). La caracterización de CMM obtenidas de SP
se realizó basándose en los siguientes criterios:
- -
- Caracterización morfológica: células con fenotipo fibroblastoide, alargadas y estrechas, de gran tamaño, con mucha eucromatina nuclear y en el citoplasma abundantes lisosomas. Su tiempo de duplicación, aunque variable entre muestras, rondaba las 30-35 horas.
- -
- Caracterización por citometría de flujo: el perfil que se obtuvo fue de una población homogénea con el siguiente perfil: células negativas para los antígenos CD34, CD 19, CD 14, HLA-DR y positivas para CD73, CD90, CD 105, CD 166.
- -
- Caracterización funcional: las CMM se caracterizan por poseer la capacidad de diferenciarse, con medios específicos, hacia tipos celulares como adipocitos, osteocitos y condriocitos. Con el fin de evaluar dicha capacidad, cultivos confluentes de CMM se incubaron durante dos-tres semanas en medios definidos para cada tipo de diferenciación que consisten en:
- *
- Diferenciación osteogénica: IMDM suplementado con 0,1 gM dexametasona, 10 mM \beta-glicerolfosfato y 0,2 mM de ácido ascórbico.
- *
- Diferenciación adipogénica: IMDM suplementado con 0,5 mM IBMX, 1 \muM hidrocortisona y 0,1 mM indometacina.
- *
- Diferenciación condrogénica: se utilizó la técnica de micromasa, se centrifugaron las células a 1.000 rpm durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante que fue sustituido por un medio específico compuesto por DMEM suplementado con 0,1 \muM dexametasona, 50 \mug/mL prolina, 10 ng/ml TGF-\beta1 y 50 mg/mL ITS premix de BD Biosciences (contiene BSA, insulina, transferrina y ácido linoleico; BD Biosciences, Estados Unidos).
Posteriormente, se analizaron los cultivos
diferenciados por técnicas histológicas y/o con marcadores
moleculares. Histológicamente las células se tiñeron con colorantes
específicos, como son el "Alizarin Red" para los Osteocitos, el
"Oil Red O" para los adipocitos y el "Alcian blue" para
los condriocitos.
3.- Caracterización por Citometría de
Flujo: los cultivos de CMM se analizaron por técnicas de
citometría de flujo. Básicamente, las células en cultivo se
tripsinizaron durante 5 minutos (solución con 0,5% tripsina más
0,2% EDTA), se lavaron con buffer salino (centrifugando a 600 g, 5
minutos, temperatura ambiente) y se resuspendieron en 100 \muL de
buffer salino. En tubos distintos las células se incubaron con 10
\muL de anticuerpos monoclonales unidos a diversos fluorocromos,
como son CD34, CD19, CD14, HLA-DR, CD73, CD90,
CD105, CD166 (BD Biosciences, Estados Unidos). Como control
negativo las células se incubaron con inmunoglobulinas del mismo
isotipo unidas a los mismos fluorocromos. Tras 45 minutos de
incubación a 4°C en oscuridad las células se lavaron y se
resuspendieron en 200 \muL de buffer salino. El análisis de las
poblaciones celulares se realizó en un citómetro de flujo.
Para obtener el mejor protocolo de obtención de
CMM de SP se realizaron cultivos celulares con las siguientes
variables, combinándolas todas ellas:
I) Origen de la muestra: muestras frescas
de SP movilizada, muestras frescas de la fracción CD34- obtenida de
SP movilizada, muestras descongeladas de SP movilizada, muestras
descongeladas de la fracción CD34- obtenida de SP movilizada,
muestras de buffy coats frescas y descongeladas.
II) Densidad inicial del cultivo celular:
0,25x10^{6} células/cm^{2}, 1,25x10^{6} células/cm^{2} ó
5x10^{6} células/cm^{2}.
III) Medio de cultivo: DMEM + 10%FBS,
DMEM + 20%FBS, MSCBM + MSCGM (Lonza, Suiza), NH Expansion Medium
(Miltenyi Biotecnology, Alemania) o Stemline Médium
(Sigma-Aldrich, Estados Unidos) + 10% FBS.
IV) Matriz de soporte en la placa: placa
con tratamiento estándar (poliestireno tratado con plasma en
condiciones de vacío), Cultrex Basement Membrane Extract, DGV,
fibronectina, vitronectina o matrigel.
V) Suplemento de factores de crecimiento:
ninguno, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de
crecimiento epitelial (EGF) o factor de crecimiento hepático
(HGF).
Para definir que un cultivo había resultado
exitoso en la obtención de CMM se siguió el siguiente criterio:
obtener un cultivo homogéneo de células con una morfología (figura
1), fenotipo (figura 2) y capacidad de diferenciación (figura 3)
características de las CMM y que se pudiese expandir, al menos,
desde un pocillo de cultivo de 2 cm^{2} hasta un frasco de
cultivo de 75 cm^{2}.
Los resultados obtenidos mostraron que la
densidad inicial celular es crítica para obtener CMM de SP. Así,
los mejores resultados obtenidos, con independencia del medio de
cultivo utilizado y de otros parámetros, siempre resultaban con una
concentración inicial de 1,25x10^{6} células/cm^{2} (tabla 1).
Es por ello que el resto de los experimentos se realizaron con esta
concentración inicial.
Para optimizar la adhesión de las CMM
circulantes en la SP se realizaron experimentos con placas de
cultivo recubiertas de distintas matrices y partiendo de distintas
fuentes celulares. Como se observa en la figura 4, los cultivos en
los que se utiliza SP movilizada fresca tienen una mayor eficacia
que el resto. Además existía una gran diferencia entre los
distintos substratos empleados, mostrándose la más eficaz la matriz
de fibronectina. En esta figura 4 se muestra la media de todos los
cultivos, con independencia del medio de cultivo empleado.
Desglosando los resultados en función del medio de cultivo
utilizado se observaron aún diferencias más notorias (figuras
5-9), obteniendo, a igual de tipo de muestra y
donante, concentración celular y substrato, eficacias del 100% con
DMEM+20%FBS versus 0% con NH Expansion Medium.
Claims (14)
1. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente que utiliza sangre
periférica de mamíferos o sus hemoderivados como fuente celular y
que incluye las siguientes etapas:
a) centrifugación en gradiente de densidad de
dicha sangre periférica o sus hemoderivados para obtener células
mononucleares.
b) separación de la fracción celular mononuclear
obtenida en la etapa anterior y lavado de la misma con un buffer
salino centrifugando hasta obtención de un pellet celular.
c) resuspensión de dicho pellet celular y
recuento de células
d) cultivo de dichas células
caracterizado porque dicho cultivo se
realiza a partir de una densidad celular inicial comprendida entre
10^{6} células/cm^{2} y 5 x 10^{6} células/cm^{2} en un
medio de cultivo químicamente definido derivado del
alpha-MEM suplementado con glutamina y con al menos
un 10% de suero fetal bovino y sobre una matriz extracelular que
contenga ligandos de integrinas.
2. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fuente celular se selecciona entre
sangre periférica fresca o criopreservada, sangre periférica
movilizada fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada y
sin movilizar obtenida por técnicas de aféresis fresca o
criopreservada, fracción CD34- fresca o criopreservada obtenida de
sangre periférica movilizada o buffy coats.
3. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación 2,
caracterizado porque la fuente celular es preferentemente
sangre periférica humana procedente de un individuo al cuál se le
ha administrado un factor de crecimiento capaz de movilizar los
precursores hematopoyéticos a sangre periférica (SP
movilizada).
4. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación 3,
caracterizado porque el factor de crecimiento administrado
para movilizar los precursores hematopoyéticos se selecciona entre
factor de crecimiento de colonias de granulocitos
(G-CSF) o factor de crecimiento de colonias
granulomacrofágicas (GM-CSF).
5. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
1 a 4, caracterizado porque las etapas de centrifugación en
gradiente de densidad, separación de la fracción celular
mononuclear y lavado con buffer salino así como la resuspensión del
pellet celular, todas ellas previas al cultivo, se realizan en un
rango de tiempo comprendido entre 5 minutos y 48 horas,
preferentemente entre 5 minutos y 6 horas.
6. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación 5,
caracterizado porque se adiciona un anticoagulante,
preferentemente heparina, a cualquiera de las fuentes celulares
cuando las etapas previas al cultivo se realizan en un periodo de
tiempo superior a 5 minutos.
7. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
5 y 6, caracterizado porque la fracción celular mononuclear
se somete a criopreservación antes de la etapa de cultivo.
8. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación 7,
caracterizado porque cuando la fracción celular mononuclear
se somete a criopreservación antes de la etapa de cultivo, la
resuspensión del pellet celular se lleva a cabo en un medio
compuesto por un 90% de suero fetal bovino y un 10% de un
crioprotector, preferentemente dimetilsulfóxido (DMSO).
9. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado porque el medio químicamente definido
derivado del alpha-MEM utilizado para el cultivo de
las células se selecciona entre DMEM o Stemline Médium
(Sigma-Aldrich) suplementados con glutamina y al
menos un 10% de suero fetal bovino.
10. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
1-9, caracterizado porque el medio utilizado
para el cultivo de las células es DMEM suplementado con un 20% de
suero fetal bovino, glutamina y antibióticos.
11. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
1-10, caracterizado porque la matriz
extracelular sobre la que se realiza el cultivo de las células
contiene ligandos de receptores con el motivo de unión RGD
(arginina-glicina-aspártico).
12. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación
11, caracterizado porque la matriz extracelular sobre la que
se realiza el cultivo de las células se selecciona entre matrigel,
fibronectina, vitronectina, Cultrex Basement Membrane Extract o
Dextrosa-Gelatina-Veronal.
13. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según la reivindicación
12, caracterizado porque la matriz extracelular sobre la que
se realiza el cultivo de las células es fibronectina a una
concentración comprendida entre 1 y 10 \mug/cm^{2}.
14. Procedimiento de obtención de células madre
mesenquimales con capacidad pluripotente según las reivindicaciones
1-13, caracterizado porque la fuente celular
es sangre periférica de aféresis movilizada fresca, realizándose el
cultivo partiendo de una concentración inicial de 1,25 x 10^{6}
células/cm^{2} en medio DMEM suplementado con glutamina y un 20%
de suero fetal bovino y sobre una matriz de fibronectina a una
concentración de 6,25 \mug/cm^{2}.
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| ES200702640A ES2326772B1 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Procedimiento de obtencion de celulas madre mesenquimales con capacidad pluripotente. |
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|---|---|
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