CN107746830A - 从富血小板血浆制备血小板裂解物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过以下步骤从富血小板血浆(PRP)制备血小板裂解物的方法：(i)将富血小板血浆浸入液氮中，(ii)在37℃将所述富血小板血浆解冻，和(iii)随后再重复步骤(i)和(ii)3次。
Description
本申请是分案申请，其原申请的申请号为201280033446.3，申请日为2012年7月6日，发明名称为“中胚层谱系祖细胞”。
技术领域
本发明涉及中胚层谱系祖细胞及其治疗应用以及制备血小板裂解物的方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是多能的成体干细胞。MSC分化形成见于骨骼组织中的不同的特化细胞。例如，它们能分化为软骨的细胞(软骨细胞(chondrocyte))、骨细胞(成骨细胞)和脂肪的细胞(脂肪细胞(adipocyte))。
MSC用于多种疗法中，例如对年龄相关性黄斑变性(AMD)和心肌梗塞的治疗。一旦被施用至患者，MSC通常会迁移(或归巢)至受损的组织处并通过旁分泌信号传导以及通过促进受损组织中的相邻细胞的存活、修复和再生而发挥其治疗效果。
目前的疗法通常涉及MSC亚型混合物的输注，而这些亚型中的某些并不能高效地迁移至所关注的组织。这使得需要使用高的细胞剂量，而这可能导致离靶(off-target)副作用和体积相关的副作用。MSC通常获自骨髓，因此其难以大量获得。
发明内容
本发明人令人惊讶地鉴定出了一类新的具有特定标志物表达谱的中胚层谱系祖细胞(PML)。本发明的PML的同源群能从单个核细胞(MC)(例如外周血MC)中分离出。所述PML能够高效地迁移至受损组织并对其进行修复。
本发明提供了一种中胚层谱系祖细胞，其中，所述细胞(a)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271并且(b)不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。
本发明还提供了：
-包含两种以上的本发明的祖细胞的群；
-一种药物组合物，其包含(a)本发明的祖细胞或本发明的群以及(b)药物可接受的载剂或稀释剂；
-一种制备本发明的群的方法，其包括：(a)在诱导单个核细胞(MC)分化为中胚层谱系祖细胞的条件下培养MC；和(b)收集具有本发明的表达谱的祖细胞并进行培养，由此制备本发明的群；
-一种修复患者的受损组织的方法，其包括对患者施用本发明的群并由此修复患者的受损组织，其中所述群包含治疗有效数量的细胞；和
-用于修复患者的受损组织的本发明的群。
附图说明
图1显示了RT-PCR凝胶，其证实了本发明的PML中存在CD44而不存在CD34。
图2显示了对本发明的PML的FACS分析的结果。这证实了所述细胞至少呈CD73和CD90阳性，而对CD14、CD34和CD45呈阴性。
图3显示了来自FACS分析的进一步结果，即针对CD90(上图)和CD73(下图)的柱形图。
图4显示了在染色的细胞(图4a)和未染色的细胞(图4b)中缺乏CD14、CD34和CD45的FACS柱形图。
图5显示了中胚层谱系祖细胞以时间依赖性和CXCR4依赖性方式迁移至骨折部位。在接受了PML-P-Act-Luc(PML)(左列)、PML-fl-Act-Luc-CXCR4+(CXCR4(+))(中列)或PML-P-Act-Luc-CXCR4-(CXCR4(-))(右列)移植物的胫骨骨折的小鼠骨折/移植后的第1天(第1行)、第3天(第2行)、第7天(第3行)和第14天(第4行)进行生物发光分析。
具体实施方式
应该理解，针对本领域的具体需要，可以对所公开的产品和方法的不同应用进行定制。此外还应理解，本文所用的术语的目的仅在于描述本发明的特定实施方式，而非意在进行限制。
另外，除非文中明确地另有规定，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”都包括复数的指代物。因此，例如，对于“一个细胞”的指代包括“多个细胞”，对于“一种组织”的指代包括两种以上的组织，对于“一位患者”的指代包括两位以上的患者，等等。
本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请，不论在上文还是下文中，均通过援引将其全部内容并入本文中。
本发明的PML
本发明提供了一种中胚层谱系祖细胞(PML)。所述PML表达可检测水平的CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD271，但不表达可检测水平的CD14,CD34和CD45。
本发明的PML具有许多优点。在此将总结其主要优点。然而，根据下文的讨论，其它优点将变得显而易见。
本发明的PML可以有利地用于修复患者的受损组织。PML能够高效地迁移(或归巢)至受损组织并在该组织中发挥抗炎效应。这将在下文更详细地讨论。PML的最重要的能力之一是迁移(或归巢)至受损部位，这涉及趋化作用。这以趋化因子信号传导为基础，并且利用诸如滚动(rolling)、粘附和迁徙(transmigration)等机制。PML的抗炎效应促进了受损组织中的相邻细胞的存活、修复和再生。这些细胞还能够发挥旁分泌效果，例如分泌血管生成因子、趋化因子和抗凋亡因子。
如下文更详述讨论的，PML由取自人个体的单个核细胞(MC)(例如外周MC)产生。由于PML从MC产生，其可以容易地制备(例如从外周血)并且对于待治疗的患者而言可以是自体同源的，由此避免了患者的免疫排斥风险。
原理上，可以从单个个体产生无限数量的PML，这是因为可以获得多种MC样品(即，多种血液样品)。当然可以从单个个体产生极大数量的PML。因此，本发明的PML可以以大的数量制得。
本发明的PML在临床相关条件下制备，例如，在不存在痕量的内毒素和其它环境污染物以及动物产品(例如胎牛血清)的情况下制备。这使得本发明的PML特别适于施用至患者。
由于本发明的PML产自MC，其是基本同源的，并且可以是自体同源的。其还避免了供体-供体间差异，这种差异往往出现在间充质干细胞(MSC)中。本发明的许多PML群可以从取自尚未经受任何其它治疗(例如化疗或放射治疗)的患者的单个样品中产生。因此，本发明的PML能避免这些治疗的任何有害效果。
本发明的PML可以快速制得。PML可以在小于30天(例如，约22天)内从MC制得。
从MC制备PML避免了与使用源自人胚胎肝细胞(hESC)的间充质干细胞(MSC)相关的道德和伦理问题。
本发明的PML通常产自人MC。因此，本发明的PML通常为人PML。
可以利用本领域已知的标准方法(包括谱系限制性标志物的表达、结构和功能特征)将本发明的PML鉴定为中胚层谱系祖细胞。PML会表达可检测水平的已知为中胚层谱系祖细胞的特征的细胞表面标志物。特别地，除下文更详细讨论的标志物以外，PML还可以表达α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白α链、GATA6、Mohawk和波形蛋白(Sági B等，Stem CellsDev.2012年3月20日；21(5):814-28)。
本发明的PML能够成功地在体外完成分化测定，从而证实其属于中胚层谱系。此类测定包括但不限于脂肪生成性分化测定、骨生成性分化测定和神经生成性分化测定(ZaimM等，Ann Hematol.2012年8月；91(8):1175-86)。
本发明的PML并不是干细胞。特别而言，其不是间充质干细胞(MSC)。它们是终末分化的细胞。虽然其在体外能够在正确的条件下被强制分化，例如分化为软骨或骨细胞，但其在体内并不分化。本发明的PML通过迁移至受损组织并在受损组织中进行旁分泌信号传导而发挥其效果。特别地，PML优选能够在受损组织中诱导抗炎效应。这将在下文更详细地讨论。
本发明的PML通常以纺锤形形态为特征。PML通常为成纤维细胞样，即，其具有小的细胞体且带有几个细长的细胞突。这些细胞的直径通常为约10μm至约20μm。
本发明的PML通过其标志物表达谱而区别于已知PML。本发明的PML表达可检测水平的CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD271。本发明的PML可以过表达CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD271中的一种或多种，例如全部。如果本发明的PML表达得比其他PML和/或MSC多，则其过表达CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD271中的一种或多种。本发明的PML不表达可检测水平的CD14,CD34和CD45。
CD29(β4整联蛋白)是与极晚期抗原受体相关的整联蛋白单元。已知其与α-3亚基结合以产生α3β1复合体，该复合体与神经生长因子-1和络丝蛋白(reelin)反应。
CD44是参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。在人中，CD44抗原由染色体11上的CD44基因编码。
CD73也称为胞外-5’-核苷酸酶(ecto-5′-NT,EC 3.1.3.5)，是见于人和小鼠的许多类型的癌症中的糖基磷脂酰肌醇连接的70kDa细胞表面胞外酶。
CD90(或Thy-1)是25kDa至37kDa的重度N-糖基化的、糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定的保守的细胞表面蛋白，其具有一个单一的V样免疫球蛋白结构域。其最初作为胸腺细胞抗原而被发现。
CD105(或内皮因子)是位于细胞表面的I型膜糖蛋白，其为TGFβ受体复合体的一部分。
CD271也称作低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)或p75NTR，属于低亲和力神经营养因子受体和肿瘤坏死因子受体超家族。
CD14是天然免疫系统的组分，并且以两种形式存在。其或者通过糖基磷脂酰肌醇尾部锚定在膜内(mCD14)，或者以可溶形式存在(sCD14)。可溶性CD14在mCD14发生脱落后出现(48kDa)，或者直接由胞内囊泡分泌(56kDa)。
CD34是细胞表面糖蛋白，并且充当细胞-细胞粘附因子。例如，其介导干细胞对骨髓胞外基质或直接对基质细胞的附着。
CD45是位于除红细胞和血小板外的造血细胞中的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。CD45也称白细胞共同抗原、小鼠中的T220和B220。该蛋白酪氨酸激酶构成了受体样的胞质诱导酶家族，该酶家族催化磷酸酪氨酸残基的去磷酸化并且以同源的催化结构域为特征。
可以使用本领域已知的标准方法来确定上文(和下文)讨论的各种标志物的可检测表达、低表达或缺乏表达。合适的方法包括但不限于免疫细胞化学、免疫测定、流式细胞术(例如，荧光活化细胞分选(FACS))和聚合酶链式反应(PCR)(例如，逆转录PCR(RT-PCR))。合适的免疫测定包括但不限于蛋白印迹、酶联免疫测定(ELISA)、酶联免疫吸附点测定(ELISPOT测定)、酶倍增免疫测定技术、放射变应性吸附(RAST)测试、放射免疫测定、放射结合测定和免疫荧光。蛋白印迹、ELISA和RT-PCR均为定量方法，因此能够用于测量所存在的各种标志物的表达水平。FACS的应用公开于实施例中。针对本文所讨论的各种标志物的抗体和荧光标记抗体均可商购获得。
本发明的PML优选能迁移至患者的特定受损组织。换言之，当将这些细胞施用给具有受损组织的患者时，这些细胞能迁移(或归巢)至受损组织。这是有利的，因为这意味着所述细胞能经由标准途径(例如，静脉内)输注，然后靶向受损部位。所述细胞不必被递送至受损组织。所述受损可能因下文更详细讨论的损伤(injury)或疾病而引起。
本发明的PML的迁移至受损组织的能力可以使用本领域中已知的标准测定来测量。合适的方法包括但不限于基因组逆转录聚合酶链式反应(采用或不采用报告基因的RT-PCR)和标记技术。
RT-PCR是最为直接简便的跟踪患者体内的本发明的PML的手段。出于该目的，可以使用转导的转基因或单独的供体标志物，并且已在数个患者研究中获得了移植细胞特异性信号。结果通常是半定量的。
作为另一选择，本发明的PML可以用所关注的染料(例如荧光染料)进行染色，并且可以通过来自该染料的信号在患者中进行监测。此类标记的具体方法公开于实施例中。
迁移(或归巢)通常通过测量到达受损组织的细胞的数量来确定。其也可通过观察肺(而不是受损组织)中所累积的细胞的数量来间接测量。
能够迁移至患者的特定受损组织的本发明的PML优选(a)表达可检测水平的(或过表达)1型C-X-C趋化因子受体(CXCR1)且/或(b)表达可检测水平的(或过表达)CXCR2。本发明的PML更优选表达可检测水平的(或过表达)CXCR1和CXCR2。受损组织释放许多可溶性炎性因子，例如巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和白细胞介素-8，且这些因子可以通过结合CXCR1和/或CXCR2而将本发明的PML(和其它炎性细胞)吸引至受损组织。
如果本发明的PML比其它PML和/或MSC产生更多的CXCR1和/或CXCR2，则其过表达CXCR1和/或CXCR2。CXCR1和/或CXCR2的表达可以如上文讨论的那样来测量。本发明的视网膜归巢细胞不表达可检测水平的CXCR1和CXCR2。这在下文会更详细讨论。
本发明的PML所能够迁移至的特定受损组织优选为心脏组织、视网膜组织或骨组织。视网膜组织优选为黄斑。
如果所述特定的受损组织为心脏组织或骨组织，则本发明的PML优选表达可检测水平的(或过表达)4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)。如果本发明的PML比其它PML和/或MSC表达更多的CXCR4，则其过表达CXCR4。如果所述特定的受损组织为心脏组织或骨组织，则本发明的PML更优选表达可检测水平的(或过表达)：(a)CXCR1和CXCR4；(b)CXCR2和CXCR4；或(c)CXCR1、CXCR2和CXCR4。CXCR4的表达可以如上文所讨论的那样来测量。
受损的心脏组织释放炎性趋化因子和细胞因子，例如，基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)。另外，心肌梗塞会增加VEGF和红细胞生成素(EPO)的水平。CXCR4与其配体SDF-1结合，因此，表达CXCR4的本发明的PML会向着由受损的心脏组织产生的SDF-1梯度迁移。其它受损组织(例如骨)也释放SDF-1。
如果所述特定的受损组织为视网膜组织(例如黄斑)，则本发明的PML优选表达可检测水平的CXCR4、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、CXCL12、CD109、CD119、核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、CD140a、CD140b、CD221、CD222、CD304、CD309和CD325。本发明的视网膜归巢性PML优选过表达这些因子中的一种或多种或甚至全部。如果所述PML比其它PML和/或MSC表达更多的这些因子，则其过表达这些因子。对细胞标志物的定量测定如上所述。
本发明的视网膜归巢性PML优选还表达可检测水平的色素上皮衍生因子(PEDF)或过表达PEDF。这些标志物的可检测表达可以如上文讨论的那样来测量。如果本发明的PML比其它PML和/或间充质干细胞(MSC)表达更多的PEDF，则其过表达PEDF。
如果所述特定的受损组织是骨组织，则本发明的PML优选表达可检测水平的TGF-β3、骨形态生成蛋白-6(BMP-6)、SOX-9、胶原蛋白-2、CD117(c-kit)、趋化因子(C-C基序)配体12(CCL12)、CCL7、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生生长因子A(PDGF-A)、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、IGF-1、肝细胞生长因子(HGF)、PDGF-Rα、PDGF-Rβ、CXCR4、1型C-C趋化因子受体1(CCR1)、IGF-1受体(IGF-1R)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、CXCL12和NFκB。本发明的骨归巢性PML优选过表达这些因子中的一种或多种或甚至全部。如果所述PML比其它PML和/或MSC表达更多的这些因子，则其过表达这些因子。这些标志物的可检测表达可以如上文讨论的那样来测量。
本发明的PML优选能够在患者的受损组织中产生抗炎效应。本发明的PML的产生抗炎效应的能力也可以利用本领域已知的标准测定来测量。合适的方法包括但不限于针对细胞因子分泌的酶联免疫吸附测定(ELISA)、增强的混合型白细胞反应以及通过流式细胞术测量的共刺激分子和成熟标志物的上调。可以采用的具体方法在实施例中公开。所测量的细胞因子通常为白细胞介素(例如，白细胞介素-8(IL-8))、选择素、粘附分子(例如，胞间粘附分子-1(ICAM-1))和化学吸引蛋白(例如，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α))。针对这些细胞因子的测定可商购获得。
抗炎性PML优选表达可检测水平的CD120a(肿瘤坏死因子(TNF)-α受体1)、CD120b(TNF-α受体2)、CD50(胞间粘附分子-3，ICAM-3)、CD54(ICAM-1)、CD58(淋巴细胞功能相关抗原-1、LFA-1)、CD62E(E-选择素)、CD62L(L-选择素)、CD62P(P-选择素)、CD106(血管细胞粘附蛋白，VCAM-1)、CD102(ICAM-2)、CD166(活化白细胞细胞粘附分子)、CD104(β4整联蛋白)、CD123(白细胞介素-3受体)、CD124(白细胞介素-4受体)、CD126(白细胞介素-6受体)、CD127(白细胞介素-7受体)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。抗炎性PML优选过表达这些因子中的一种或多种或甚至全部。如果所述PML比其它PML和/或MSC表达更多的一种或多种这些因子，则其过表达这些因子。这些标志物的可检测表达可以如上文讨论的那样来测定。
本发明的PML更优选能迁移至患者的受损组织并在受损组织中产生抗炎效应。这使得受损得到有效地修复并且减少了需要施用的细胞数量。
本发明的PML可表达不同于上文讨论的那些标志物的多种其它标志物。其中的一些会辅助PML的迁移至受损组织和到达受损组织后产生抗炎效应的能力。本发明的任何PML还可以表达可检测水平的以下(i)～(vii)中的一种或多种：(i)胰岛素样生长因子-1(IGF-1)；(ii)IGF-1受体；(iii)1型C-C趋化因子受体(CCR1)；(iv)基质细胞衍生因子-1(SDF-1)；(v)低氧诱导性因子-1α(HIF-1α)；(vi)Akt1；和(vii)肝细胞生长因子(HGF)和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
IGF-1受体促进向着IGF-1梯度迁移的能力。IGF-1增加迁移的机制之一是上调细胞表面上的CXCR4，这使细胞对SDF-1信号传导更为敏感。这在上文讨论过。
CCR1是CCL7(以前称为MCP3)的受体，其增加MSC的归巢和植入能力(因此可预期期对本发明的PML具有相同的效果)并且能够通过旁分泌信号传导来增加受损的心肌中的毛细血管密度。
HIF-1α活化了增加氧的递送和促进适应性促存活响应的途径。HIF-1α的许多靶基因中包括红细胞生成素(EPO)、内皮缩血管肽和VEGF(与其受体Flk-1)。表达或过表达HIF-1α的PML会使例如数种血管发生生长因子的旁分泌刺激物的表达上调，这些刺激物可促成更具治疗性的亚型。如下文更详细地讨论的，通过在低氧条件(低于20％氧)(例如，约2％或约0％氧)下培养，可以将本发明的PML预先调节为更具治疗性的亚型。
Akt1是胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在多种细胞过程(例如葡萄糖代谢、细胞增殖、凋亡、转录和细胞迁移)中起着关键作用。Akt1的过表达据显示能够防止大鼠MSC经历凋亡，并且会在本发明的PML中具有相同效果。防止凋亡的保护会增强PML的治疗效果。
据显示，MSC的HGF过表达能够通过抑制经由钙神经素介导途径的凋亡和血管发生来防止缺血后心力衰竭。HGF和G-CSF在这方面显示出协同效应。高度表达HGF及其受体c-met的MSC还具有提高的进入受损组织的迁移能力，这种提高的能力通过激素、旁分泌和自分泌信号传导来实现。对于表达HGF和/或G-CSF的本发明的PML也会是这样。
PML可以过表达上文限定的(i)～(vii)中的一种或多种。如果本发明的PML比其它PML和/或比间充质干细胞(MSC)表达更多的(i)～(vii)中的一种或多种，则其过表达(i)～(vii)中的一种或多种。对细胞标志物的定量测定如上文所述。这些标志物的可检测表达及其表达水平可以如上文讨论的那样来测量。
本发明的任何PML可以表达可检测水平的以下(i)～(vii)中的一种或多种：(i)血管内皮生长因子(VEGF)，(ii)转化生长因子β(TGF-β)，(iii)胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，(iv)成纤维细胞生长因子(FGF)，(v)肿瘤坏死因子α(TNF-α)，(vi)干扰素γ(IFN-γ)，和(vii)白细胞介素-1α(IL-1α)。来自过表达VEGF的细胞的条件培养基据显示会减轻仓鼠模型的心力衰竭。因此，表达或过表达VEGF的本发明的PML将对受损的心脏组织产生相同的效果。
PML可以过表达(i)～(vii)中的一种或多种。如果本发明的PML比其它PML和/或比间充质干细胞(MSC)表达更多的(i)～(vii)中的一种或多种，则其过表达(i)～(vii)中的一种或多种。对细胞标志物的定量测定如上文所述。这些标志物的可检测表达及其表达水平可以如上文讨论的那样来测定。
在上文给出的两组(i)～(vii)的定义中，(i)～(vii)中的一种或多种的任意组合都可以表达或过表达。例如，对于每组(i)～(vii)的定义，PML可以表达可检测水平的以下物质或过表达以下物质：(i)；(ii)；(iii)；(iv)；(v)；(vi)；(vii)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(i)和(vii)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(ii)和(vii)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iii)和(vii)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(iv)和(vii)；(v)和(vi)；(v)和(vii)；(vi)和(vii)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(ii)和(v)；(i)、(ii)和(vi)；(i)、(ii)和(vii)；(i,)、(iii)和(iv)；(i)、(iii)和(v)；(i)、(iii)和(vi)；(i)、(iii)和(vii)；(i)、(iv)和(v)；(i)、(iv)和(vi)；(i)、(iv)和(vii)；(i)、(v)和(vi)；(i)、(v)和(vii)；(i)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(v)；(ii)、(iii)和(vi)；(ii)、(iii)和(vii)；(ii)、(iv)和(v)；(ii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iv)和(vii)；(ii)、(v)和(vi)；(ii)、(v)和(vii)；(ii)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)和(v)；(iii)、(iv)和(vi)；(iii)、(iv)和(vii)；(iii)、(v)和(vi)；(iii)、(v)和(vii)；(iii)、(vi)和(vii)；(iv)、(v)和(vi)；(iv)、(v)和(vii)；(iv)、(vi)和(vii)；(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)和(iv)；(i)、(ii)、(iii)和(v)；(i)、(ii)、(iii)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)和(v)；(i)、(ii)、(iv)和(vi)；(i)、(ii)、(iv)和(vii)；(i)、(ii)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)和(v)；(i)、(iii)、(iv)和(vi)；(i)、(iii)、(iv)和(vii)；(i)、(iii)、(v)和(vi)；(i)、(iii)、(v)和(vii)；(i)、(iii)、(vi)和(vii)；(i)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)和(v)；(ii)、(iii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iii)、(iv)和(vii)；(ii)、(iii)、(v)和(vi)；(ii)、(iii)、(v)和(vii)；(ii)、(iii)、(vi)和(vii)；(ii)、(iv)、(v)和(vi)；(ii)、(iv)、(v)和(vii)；(ii)、(iv)、(vi)和(vii)；(ii)、(v)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)、(vi)和vii)；(i)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(ii)、iii)、(iv)、(v)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)、(v)、(vi)和vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)。每组(i)～(vii)定义的组合可从该列表中独立地选择。
除上文讨论的任何标志物外，本发明的PML还优选表达可检测水平的(或过表达)LIF和/或血小板衍生生长因子(PDGF)受体。PDGF受体优选为PDGF-A受体和/或PSDGF-B受体。高度表达这些受体的MSC能够有效地迁移至血小板已得到活化的区域，例如伤口和血栓性血管。对于表达或过表达这些受体的PML也会是这样。
本发明的PML优选是自体同源的。换言之，这些细胞优选源自将要接受这些细胞的患者。作为另一选择，PML优选是同种异基因的。换言之，这些细胞优选源自与将要接受这些细胞的患者具有免疫相容性的患者。
本发明的PML可以是分离的、基本分离的、纯化的或基本纯化的细胞。如果所述PML完全不含任何其它成分，例如培养基、其它本发明的细胞或其它细胞类型，则所述PML是分离的或纯化的。如果所述PML混有不会感染其目标应用的载剂或稀释剂，例如培养基，则所述PML是基本分离的。作为另一种选择，本发明的PML可以存在于生长基质中或固定在表面上，如下文所讨论的。
本发明的PML可以利用包括基于抗体的技术在内的多种技术来分离。可以利用基于单克隆抗体与存在于PML上的那些表面标志物(见上文)的结合的阴性和阳性选择技术来分离细胞。因此，可以利用任何基于抗体的技术(包括荧光活化细胞分选(FACS)和磁珠分离)来分离PML。
如下文所更详细讨论的，可以对所述PML进行离体处理。因此，这些细胞可以载有或转染有治疗剂或诊断剂，然后治疗性地用于本发明的方法中。
本发明的群
本发明还提供了含有两种以上本发明的PML的群。该群中可以存在任何数目的细胞。本发明的群优选包含至少约5×105个本发明的PML。所述群更优选包含至少约1×106、至少约2×106、至少约5×106、至少约1×107、至少约2×107、至少约5×107、至少约1×108或至少约2×108个本发明的PML。在某些情形中，所述群可以包含至少约1.0×107、至少约1.0×108、至少约1.0×109、至少约1.0×1010、至少约1.0×1011或至少约1.0×1012个本发明的PML，甚至更多。
本发明的群对于下文讨论的治疗是有利的。制备包含大量的本发明的PML的群的能力是本发明的关键优点之一。本发明使得可以用细胞群来治疗患者，所述细胞群中的大多数(如果不是全部)细胞都高效地迁移至所关注的组织并且在一旦到达该组织后就产生抗炎效应。这使得可以使用低细胞剂量，并且避免了离靶副作用和体积相关的副作用。
除本发明的PML外，本发明的群还可以包含其它细胞。不过，该群中至少70％的细胞优选为本发明的PML。更优选地，该群中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约97％、至少约98％或至少99％的细胞是本发明的PML。
本发明的群优选为同源的。换言之，群中的所有PML优选在基因型和表型上是相同的。所述群优选为自体同源的或同种异基因的，如上文所定义。
然而，所述群也可以是半同种异基因的。半同种异基因群通常从来自两个以上患者的单个核细胞制备，所述两个以上患者与将要接受所述群的患者是免疫相容的。换言之，所述群中的所有细胞优选在遗传学上相同或在遗传学上足够相同以使所述群与将要接受所述群的患者是免疫相容的。由于本发明的PML可以源自患者，其可以与待治疗的患者是自体同源的(即，与所述患者在遗传学上相同或在遗传学上足够相同以使其在向患者施用时是相容的)。
本发明的群可以是分离的、基本分离的、纯化的或基本纯化的。如果群完全不含其它成分，如培养基和其它细胞，则所述群是分离的或纯化的。如果群混有不会干扰其目标应用的载剂或稀释剂(例如培养基)，则所述群是基本分离的。下文将更详细地讨论其它载剂和稀释剂。基本分离或基本纯化的群不包含除本发明的PML外的其它细胞。在一些实施方式中，本发明的群可以存在于生长基质中或固定在表面上，如下文所讨论的。
所述群通常在体外培养。细胞培养技术是本领域技术人员公知的。所述细胞可以在无血清培养基中在37℃、5％CO2的标准条件下培养。所述细胞优选在低氧条件下培养，如下文所更详细讨论的。所述细胞可以在任何合适的烧瓶或器皿中培养，包括平板(例如标准6孔板)的板孔。这类板可从Fisher scientific、VWR suppliers、Nunc、Starstedt或Falcon商购获得。板孔的容积通常为约1ml至约4ml。
容纳或培养有所述群的烧瓶、器皿或板孔可以经过改造以便于操作PML。例如，所述烧瓶、器皿或板孔可以经改造以便于培养细胞，例如，通过包含生长基质。所述烧瓶、器皿或板孔可以经改造以允许PML附着或使PML固定在表面上。一个或多个表面可以涂覆有胞外基质蛋白(例如层粘连蛋白或胶原蛋白)，或者涂覆有与细胞结合并将其固定或捕获在表面上的任何其它捕获分子。
可以利用本文所述的任何技术对所述群进行离体修饰。例如，所述群可以载有或转染有治疗剂或诊断剂。然后可以将所述群用于下文更详细讨论的治疗方法中。
本发明的制备PML的方法
本发明还提供了制备本发明的群(即，含有两种以上本发明的PML的群)的方法。所述方法包括在诱导单个核细胞(MC)分化为PML的条件下培养MC。所述方法因而包括收集和培养下述PML，所述PML：
(a)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45；
(b)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271和CXCR1，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45；
(c)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271和CXCR2，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45；
(d)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR1和CXCR2，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45；
(e)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR1和CXCR4，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45(这些细胞是心脏归巢性和骨归巢性PML)；
(f)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR2和CXCR4，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45(这些细胞是心脏归巢性和骨归巢性PML)；
(g)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR1、CXCR2和CXCR4，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45(这些细胞是心脏归巢性和骨归巢性PML)；
(h)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR4、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、CXCL12、CD109、CD119、核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、CD140a、CD140b、CD221、CD222、CD304、CD309和CD325，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45(这些细胞是视网膜归巢性PML)；或
(i)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、TGF-β3、骨形态生成蛋白-6(BMP-6)、SOX-9、胶原蛋白-2、CD117(c-kit)、趋化因子(C-C基序)配体12(CCL12)、CCL7、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、IGF-1、肝细胞生长因子(HGF)、PDGF-Rα、PDGF-Rβ、CXCR4、1型C-C趋化因子受体(CCR1)、IGF-1受体(IGF-1R)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、CXCL12和NFκB，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45(这些细胞是骨归巢性PML)。
所收集的细胞可以过表达上文描述本发明的细胞时所描述的任何因子。除上述(a)～(i)的任一项以外，所述方法优选包括收集和培养下述PML，所述PML：
(j)表达可检测水平的CD120a(肿瘤坏死因子(TNF)-α受体1)、CD120b(TNF-α受体2)、CD50(胞间粘附分子-3，ICAM-3)、CD54(ICAM-1)、CD58(淋巴细胞功能相关抗原-1、LFA-1)、CD62E(E-选择素)、CD62L(L-选择素)、CD62P(P-选择素)、CD106(血管细胞粘附蛋白、VCAM-1)、CD102(ICAM-2)、CD166(活化白细胞细胞粘附分子)、CD104(β4整联蛋白)、CD123(白细胞介素-3受体)、CD124(白细胞介素-4受体)、CD126(白细胞介素-6受体)、CD127(白细胞介素-7受体)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)；
(k)表达可检测水平的(i)胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、(ii)IGF-1受体、(iii)1型C-C趋化因子受体(CCR1)、(iv)基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、(v)低氧诱导性因子-1α(HIF-1α)、(vi)Akt1和(vii)肝细胞生长因子(HGF)和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)中的一种或多种；
(l)过表达(k)中的(i)～(vii)中的一种或多种；
(m)表达可检测水平的(i)血管内皮生长因子(VEGF)、(ii)转化生长因子β(TGF-β)、(iii)胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、(iv)成纤维细胞生长因子(FGF)、(v)肿瘤坏死因子α(TNF-α)、(vi)干扰素γ(IFN-γ)和(vii)白细胞介素-1α(IL-1α)中的一种或多种；
(n)过表达(m)中的(i)～(vii)中的一种或多种。
单个核细胞(MC)及其分离方法是本领域已知的。MC可以是分离自骨髓的原生MC。MC优选为外周血MC(PBMC)，例如淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞。PBMC可以利用亲水性多糖(例如)从血液中分离出。例如，可以使用(一种商购的密度介质)来从血液中分离出PBMC，如实施例中所公开的。
在培养MC之前，可以将MC暴露于间充质干细胞富集混合液。所述混合液优选包含识别CD3、CD14、CD19、CD38、CD66b(存在于不需要的细胞上)的抗体以及红细胞组分。这种混合液使不需要的细胞与红细胞交联以形成免疫花结(immunorosette)，所述免疫花结可以从需要的MC中除去。优选的混合液是
适合诱导MC分化为间充质细胞(主要源自中胚层的组织)的条件是本领域已知的。例如，合适的条件公开于Capelli,C.等，(Human platelet lysate allows expansion andclinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples ofbone marrow aspirates or marrow filter washouts.Bone Marrow Transplantation,2007.40:785-791页)中。这些条件还可以用于诱导MC分化为本发明的PML。
所述方法优选包括用血浆裂解物培养MC以诱导所述MC分化为PML。血小板裂解物是指已通过裂解血小板而释放出的血小板中所含的天然生长因子的组合。裂解可以通过化学手段(即，CaCl2)、渗透手段(使用蒸馏H2O)或通过冷冻/解冻程序来完成。血小板裂解物可以源自全血，如美国专利第5,198,357号所述。血小板裂解物优选如实施例中所述那样制备。血小板裂解物优选为人血浆裂解物。
在一个优选实施方式中，本发明的方法的步骤(a)包括：在包含血小板裂解物的培养基中将MC培养充足的时间，该时间足以诱导MC分化为中胚层谱系祖细胞。所述充足的时间通常为约15天至约25天，优选为约22天。所述培养基优选包含约20体积％以下(例如，约15体积％以下或约10体积％以下)的血小板裂解物。所述培养基优选包含约5体积％至约20体积％(例如约10体积％至约15体积％)的血小板裂解物。所述培养基优选包含约10体积％的血小板裂解物。
在另一个优选实施方式中，本发明的方法的步骤(a)包括：使MC暴露于间充质富集混合液，然后在包含血小板裂解物的培养基中将该MC培养充足的时间，该时间足以诱导MC分化为中胚层谱系祖细胞。所述充足的时间通常为约15天至约25天，优选为约22天。
在步骤(a)中，所述培养基优选为最小必需培养基(MEM)。MEM可以从包括Sigma-Aldrich在内的多种来源商购获得。所述培养基优选还包括肝素、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉抗生物素蛋白(P/S)中的一种或多种。L-谷氨酰胺可以用(可商购获自LifeTechnologies)替代。
如上文所讨论的，本发明的PML中的一些表达可检测水平的CXCR4。CXCR4的表达是细胞因子依赖性的，并且在细胞暴露于干细胞因子(SCF)、白细胞介素-6(IL-6)、Flt-3配体、肝细胞生长因子(HGF)和IL-3时增加。培养基可以包含(i)SCF、(ii)IL‐6、(iii)Flt‐3配体、(iv)肝细胞生长因子和(v)IL-3中的一种或多种，例如，(i)；(ii)；(iii)；(iv)；(v)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iv)和(v)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(ii)和(v)；(i)、(iii)和(iv)；(i)、(iii)和(v)；(i)、(iv)和(v)；(ii)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(v)；(ii)、(iv)和(v)；(iii)、(iv)和(v)；或(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)。(i)至(v)中的任一种都可以以约10ng/ml至约150ng/ml的浓度存在。
步骤(a)优选包括在允许PML粘附的条件下培养MC。合适的条件在上文更详细地讨论过。
在步骤(a)中，MC优选在低氧条件下培养。MC优选在低于约20％氧气(O2)时培养，例如，在低于约19％、低于约18％、低于约17％、低于约16％、低于约15％、低于约14％、低于约13％、低于约12％、低于约11％、低于约10％、低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％、低于约5％、低于约4％、低于约3％、低于约2％或低于约1％氧气(O2)时培养。MC优选在约0％至约19％O2时培养，例如约1％至约15％O2、约2％至约10％O2或约5％至约8％O2。MC最优选在约0％O2时培养。上文在％氧气(或％O2)前列出的数字是指在培养期间供给至细胞的气体(例如，细胞温育箱所供给的气体)中的氧气所占的体积％。一些氧气可能渗漏至温育箱内，或者在门打开时进入。
在步骤(a)中，最优选在存在血小板裂解物时且在低氧条件下培养MC。这种组合模拟了受损组织中的天然条件，因此产生更健康且更具有治疗能力的细胞。常规的细胞培养是在20％或21％氧气(接近大气含量)中进行，但在人体中没有具有这种氧气水平的地方。肺中的上皮细胞会“见到”这种氧气水平，但是一旦氧气溶解并离开肺，其就降低至约17％。从那里开始，氧气水平在大多数的组织中进一步降低至约1％至2％，而在无血管组织(例如，关节中的软骨)中会低至0.1％。
在步骤(b)中，所述方法还包括收集和培养具有上文所讨论的必需的标志物表达谱的PML。具有必需的标志物表达谱的PML可以利用任何基于抗体的技术来收集，包括荧光活化细胞分选(FACS)和磁珠分离。优选FACS。
在步骤(a)背景下公开的培养PML的任何方法都等同地适用于步骤(b)。特别地，在步骤(b)中，在血小板裂解物的存在下且在低氧条件下培养细胞，正如上文在步骤(a)背景下所讨论的。
从上文的讨论显而易见的是，本发明的方法在临床相关条件下进行，即，不存在痕量的内毒素和其它环境污染物(如脂多糖、脂肽和肽聚糖等)。这使得本发明的PML特别适于施用至患者。
MC优选获自患者或同种异基因供体。本发明还提供了一种制备适于施用至患者的本发明的群的方法，其中，所述方法包括：在诱导MC分化为中胚层谱系祖细胞的条件下培养获自患者的MC；和(b)收集和培养具有如上文所定义的表达谱的那些祖细胞并由此制备适于施用至患者的本发明的群。所述群与所述患者将是自体同源的，因此不会在植入后被排斥。本发明还提供了适于施用至患者并以此方式制备的本发明的群。
作为另一选择，本发明提供了一种制备适于施用至患者的本发明的群的方法，其中，所述方法包括：在诱导MC分化为中胚层谱系祖细胞的条件下培养获自另一患者(该患者与所述细胞将要施用给的患者免疫相容)的MC；和(b)收集和培养具有如上文所定义的表达谱的那些祖细胞并由此制备适于施用至患者的本发明的群。所述群与所述患者将是同种异基因的，因此会降低植入后的排斥机会。本发明还提供了适于施用至患者并以此方式制备的本发明的群。
药物、方法和治疗应用
本发明的PML可以用在人或动物体的治疗方法中。因此，本发明提供了用于人或动物体的治疗方法中的本发明的PML或本发明的群。特别地，本发明涉及利用本发明的PML来修复患者的受损组织。本发明还涉及利用本发明的PML来治疗患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性或者骨损伤或骨病。
本发明提供了修复患者的受损组织的方法，所述方法包括：向患者施用本发明的群，其中所述群包含治疗有效数量的细胞，并由此治疗患者的受损组织。本发明还提供了用于修复患者的受损组织的本发明的群。本发明还提供了本发明的群在制备用于修复患者的受损组织的药物中的应用。
所述组织优选源自中胚层。所述组织更优选为心脏组织、视网膜组织或骨组织。
对组织的损害可能是损伤或疾病造成的。所述损伤或疾病优选为患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性(AMD)或者骨损伤或骨病。因此，本发明提供了治疗患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性或者骨损伤或骨病的方法，所述方法包括：对患者施用本发明的群，其中所述群包含治疗有效数量的细胞，并由此治疗患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性或者骨损伤或骨病。本发明还提供了用于治疗患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性或者骨损伤或骨病的本发明的群。本发明还提供了本发明的群在制造用于治疗患者的心脏损伤或心脏病、年龄相关性黄斑变性或者骨损伤或骨病的药物中的应用。
所述心脏损伤或心脏病优选选自心肌梗塞(MI)、左心室肥大、右心室肥大、栓塞物、心力衰竭、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病、心律不齐和心肌炎。
MI提高心肌所释放的VEGF和EPO的水平。此外，MI还与炎性反应相关，且梗塞的组织还释放巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白细胞介素(IL-6)和KC/Gro-α。CCL7(以前称作MCP3)、CXCL1、CXCL2在心肌梗塞(MI)后在心脏中显著上调，且可能参与调控MSC向梗塞的心肌的植入和归巢。
在心肌梗塞小鼠模型中，据显示IL-8主要在MI后前2天内高度上调基因表达。值得注意的是，提高的IL-8表达主要位于梗塞的区域和边界区，而在余下的心肌中仅以小得多的程度存在。通过活化CXCR2，MIF展现出趋化因子样功能，并充当炎性细胞募集和动脉粥样硬化形成的主要调控因子。
AMD可以是干AMD或湿AMD。干AMD因视网膜下方的视网膜色素上皮层萎缩而引起，这通过使眼中心部分中的感光体(视杆和视锥)损失而导致视力损失。湿AMD引起视力损失的原因是：脉络膜毛细管层中的血管异常生长(脉络膜新生血管化)，穿过Bruch膜，最终导致黄斑下方的血液渗漏和蛋白渗漏。湿AMD与黄斑中的色素上皮衍生因子(PEDF)的水平下降有关。用于治疗湿AMD的PML优选表达可检测水平的PEDF或过表达PEDF。
骨损伤或骨病优选选自骨折、Salter–Harris骨折、旁弯骨折、骨刺、颅缝早闭、科-勒二氏综合征、进行性骨化纤维性发育不良、纤维性结构不良、Fong氏病(或指甲-髌骨综合征)、低磷酸脂酶症、克-费二氏综合征、代谢性骨病、指甲-髌骨综合征、骨关节炎、变形性骨炎(或佩吉特骨病)、囊性纤维性骨炎(或纤维性骨炎或Von Recklinghausen氏骨病)、耻骨骨炎、致密性骨炎(或硬化性骨炎)、髂骨致密性骨炎、剥脱性骨软骨炎、成骨不全、骨软化、骨髓炎、骨质减少、骨硬化、骨质疏松、骨坏死、促骨痂形成性骨肥厚、原发性甲状旁腺功能亢进、肾性骨营养不良、骨癌、转移癌相关骨损害、Gorham Stout病、原发性甲状旁腺功能亢进、牙周病和关节置换物无菌性松弛。骨癌可以是尤因肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤(骨的巨型肿瘤)、骨软骨瘤或破骨细胞瘤。导致骨损害的转移癌可以是乳癌、前列腺癌、肾癌、肺癌和/或成年T细胞白血病。
如果受损组织是心脏组织或骨组织，则群中的PML优选表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR1、CXCR2和CXCR4，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。如果受损组织是骨组织，则群中的PML优选表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、TGF-β3、骨形态生成蛋白-6(BMP-6)、SOX-9、胶原蛋白-2、CD117(c-kit)、趋化因子(C-C基序)配体12(CCL12)、CCL7、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、IGF-1、肝细胞生长因子(HGF)、PDGF-Rα、PDGF-Rβ、CXCR4、1型C-C趋化因子受体(CCR1)、IGF-1受体(IGF-1R)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、CXCL12和NFκB，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。
如果受损组织是视网膜组织，则群中的PML优选表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CXCR4、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、CXCL12、CD109、CD119、核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、CD140a、CD140b、CD221、CD222、CD304、CD309和CD325，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。
在所有情形中，本发明的PML优选源自患者或者同种异基因供体。从患者获取本发明的PML应当确保这些PML自身不会被患者的免疫系统排斥。供体和接受体之间的任何差异都会最终导致PML的清除，但不会在其已修复了受损组织的至少一部分之前发生。
本发明涉及向患者施用治疗有效数量的本发明PML。治疗有效数量是使得损害、疾病或损伤的一种或多种症状得到改善的数量。治疗有效数量优选为修复受损组织或治疗疾病或损伤的数量。合适的数量在下文中有更详细的讨论。
本发明的PML可以施用至任何合适的患者。患者通常为人类患者。患者可以为婴儿、青少年或成人。患者可以已知具有受损组织或者疑似具有受损组织。患者可以对相关疾病或损伤易感或具有罹患风险。例如，患者可以在遗传上易患心力衰竭。
本发明可以与用于修复受损组织或提供镇痛作用的其它手段和物质组合使用。在某些情形中，本发明的PML可以与设计用来修复受损组织或提供镇痛作用的其他物质同时、依次或分开施用。所述PML可以与对受损组织的已有治疗组合使用，且可以例如简单地与这些治疗混合。因此，本发明可以用于提高对受损组织的已有治疗的效力。
本发明优选涉及载有或转染有治疗剂和/或诊断剂的PML的应用。治疗剂可以帮助修复受损组织。诊断剂(例如荧光分子)可以帮助确定PML在患者中的位置。可以使用本领域的任何已知方法来装载或转染PML。PML的装载可以在体外进行或离体进行。在每种情形下，可以简单地使PML与试剂在培养液中接触。作为另一选择，可以利用例如脂质体等递送载具来使PML装载有试剂。此类载具是本领域已知的。
PML的转染可以在体外进行或离体进行。作为另一选择，可以在MC阶段进行稳定转染，从而使该MC可以分化成表达转基因的PML。PML转染有编码试剂的核酸。例如，可以采用编码试剂的病毒颗粒或其它载体。其实现方法是本领域已知的。
所述核酸在PML中引起所述试剂的表达。核酸分子优选包含下述启动子：该启动子与编码所述试剂的序列可操作地连接，并且在PML中活跃或能够在PML中被诱导。
在特别优选的实施方式中，编码试剂的核酸可以经由病毒颗粒来递送。病毒颗粒可以包含确保高效转染的靶向分子。该靶向分子通常被整体或部分地提供在所述病毒的表面上，以使所述分子能够引导该病毒靶向PML。
在这些实施方式中可以使用任何合适的病毒。病毒可以为例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。在特别优选的实施方式中，病毒可以是慢病毒。慢病毒可以是适用于递送基因的经修饰的HIV病毒。慢病毒可以是基于SIV、FIV或马传染性贫血病毒(EQIA)的载体。病毒可以是莫洛尼鼠科白血病病毒(MMLV)。用于本发明中的病毒优选是复制缺陷型病毒。
并非必须使用病毒颗粒。可以使用任何能够转染本发明的PML的载体，例如，常规的质粒DNA或RNA转染。
核酸构建体的摄取可以通过数种已知的转染技术来增强，例如包括使用转染剂的技术。所述转染剂的实例包括阳离子剂(例如，磷酸钙和DEAE-右旋糖酐)和脂质转染剂(例如，LipofectAmine、Fugene和Transfectam)。
可以在合适的条件下装载或转染细胞。例如，可以使细胞与试剂或载体接触5分钟至10天，优选1小时至5天，更优选5小时至2天，进而更优选12小时至1天。
本发明还提供了上述的已经载有或转染有试剂的PML。此类PML可以用在本发明的治疗性实施方式中。
在某些实施方式中，可以从患者回收MC，利用本发明将其转化为PML，在体外进行装载或转染，然后使其返回至同一患者。在此类情形中，本发明中采用的PML将是所述患者的自体同源细胞且与所述患者完全匹配。在优选情形中，将本发明中所采用的细胞从患者回收并离体使用，随后使其返回至同一患者。
药物组合物和施用
本发明额外提供了包含(a)本发明的PML或本发明的群和(b)药物可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。所述组合物可以包含本文提及的任何PML或群，且在某些实施方式中，包含本文所述的核酸分子、载体或病毒。本发明提供了修复患者的受损组织的方法，所述方法包括对患者施用有效量的本发明的药物组合物。上文所讨论的任何治疗性实施方式都等同地适用于本实施方式。
本发明的各种组合物可以利用任何合适的方法来配制。可以利用药学领域的常规方法来将细胞与标准的药物可接受的载剂和/或赋形剂配制在一起。制剂的确切性质将取决于包括待施用的细胞和所需的施用途径在内的数种因素。合适的制剂类型在“Remington's Pharmaceutical Sciences”，第19版，Mack Publishing Company,EasternPennsylvania,USA中有完整描述。
细胞可以通过任何途径施用。合适的途径包括但不限于静脉内、肌肉内、腹膜内或其它合适的施用途径。如果受损组织是视网膜组织，则所述细胞可以施用至眼部。如果受损组织是心脏组织，则所述细胞可以通过心内膜心肌、心外肌膜、心室内、冠状动脉内、冠状静脉窦逆行、动脉内、心包内或静脉内途径施用。如果受损组织是骨，则所述细胞可以通过骨内途径施用，或施用至损伤(例如骨折)或疾病部位。所述细胞优选经静脉内施用。
组合物可以与生理上可接受的载剂或稀释剂制备在一起。通常，可以将此类组合物制备为细胞的悬浮液。细胞可以与药物可接受且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。
另外，需要时，本发明的药物组合物可以包含少量的辅助物质，例如，润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强有效性的佐剂。所述组合物优选包含人血清白蛋白。
一种合适的载剂或稀释剂是Plasma-Lyte这是一种用于静脉内施用的无菌无热源的等渗溶液。每100mL含有：526mg氯化钠，USP(NaCl)；502mg葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)；368mg三水合乙酸钠，USP(C2H3NaO2·3H2O)；37mg氯化钾，USP(KCl)；和30mg氯化镁，USP(MgCl2·6H2O)。其不含抗微生物剂。pH用氢氧化钠调节。pH为7.4(6.5～8.0)。
所述PML以与剂型相容的方式并以治疗有效量进行施用。待施用的量取决于待治疗的受试对象、受试对象免疫系统的能力和所需的修复程度。需要施用的PML的精确的量可依赖于医师的判断并可能对于每个受试对象是特殊的。
可以对受试对象施用任何合适数量的细胞。例如，可以施用至少或大约0.5×106、1.5×106、4.0×106或5.0×106个细胞/kg患者。例如，可以施用至少或大约105、106、107、108、109个细胞。作为指导，待施用的本发明的细胞数可以为105～109，优选为106～108。通常，对每个患者施用至多2×108个PML。可以施用上文涉及本发明的群时所讨论的任何特定数量。在施用细胞或存在细胞的情形中，可以存在培养基以利于细胞存活。在一些情形中，本发明的细胞可以冷冻的等分试样提供，且可以存在诸如DMSO等物质来帮助其在冷冻期间存活。这种冷冻的细胞通常会被解冻，然后置于缓冲液或培养基中以用于保持或用于施用。
下面的实施例对本发明进行举例说明。
实施例
材料和方法
一旦从患者取血后，在干细胞实验室中在卫生条件下制备源于中胚层的祖细胞；在层流通风机下操作带有细胞或其它材料的敞口容器。在每个制备步骤中，取出样品并确定干细胞数量和活力。
通过 1.073密度离心从全血中分离出单个核细胞，并在α-MEM-PL中培养5天。收集粘附细胞，针对多种细胞标志物(见下文)进行免疫荧光染色并利用流式细胞术分析来确定这些细胞的免疫表型。对于每个染色程序使用适当的同型(isotype)对照。
细胞活力用1％台盼蓝溶液来评估。通过FACS(FACSCalibur,Beckton Dickinson)对细胞计数。此外，还针对支原体、无菌性(通过革兰氏染色来评估)、内毒素、同一性、纯度和活力以及核型分析对细胞进行了测试以排除染色体异常。
以下总结了细胞实际上是如何得到的。
1.从患者取20ml外周血。
2.然后使11.5ml剩余血流过Ficoll 1.073。
3.使其离心以得到单个核细胞，对这些细胞执行4a或4b：
4a.在培养物中在0％氧气中生长8天；或
4b.进行Rosette分离，然后在培养物中在0％氧气中生长8天。
5.更换培养基，在0％氧气中培养细胞14天。
6.然后收集细胞并运行FACS。
利用RT-PCR和FACS分析研究了多种标志物。所研究的主要标志物是CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD271、CD181、CD182和CD184。
以下为所采用的工作规程。
富血小板血浆(PRP)的制备
1.将血样分装至两个15ml Falcon试管中，每管中大于8ml。
2.在室温(RT)下以120×g离心15分钟，不制动。
3.将富血小板血浆(PRP)上清液转移至新的15ml Falcon试管中。
4.记录所转移的PRP的体积。
5.用Hank平衡盐溶液(HBSS)置换所述PRP体积。
培养基的制备
1.将0.3ml PRP转移至Eppendorf管中以便利用Cell-Dyn仪器进行自动血液学分析。计算理论最大血小板数量。
理论最大血小板数量＝血小板浓度×PRP体积
2.将0.25ml PRP转移至Eppendorf管中并冻存(-80℃)。
3.将剩余的PRP在1610×g下于室温离心10分钟，有制动。
4.将无血小板血浆(PFP)上清液移至单独的Falcon试管中，将血小板沉淀物用一定体积的PFP重悬以得到1×109细胞/ml的浓度(利用理论最大血小板数量——以1.5×109为目标，以便获取1×109)。
5.将剩余的PFP以0.25ml的等分试样转移至Eppendorf管中并冻存(-80℃)。
6.用石蜡封口膜包裹PRP Falcon试管的顶盖。
7.将该Falcon试管浸入液氮中5分钟。
8.将该Falcon试管浸入37℃水浴，直至解冻。
9.将步骤7和8再重复3次。
10.通过将PL以10％添加至αMEM、5U/ml肝素、2mM Glutamax、1％P/S中以制成培养基(即，添加1.5ml PL至13.5ml培养基中)。
MNC分离
1.将稀释的血样体积(16.5ml)合并到新的50ml Falcon试管中。
2.将血样用HBSS进一步进行1:2稀释至约33ml。
3.向两个新的50ml Falcon试管中添加15ml Ficoll-Paque PREMIUM 1.073。
4.倾斜试管并使血样缓慢沿试管壁流出，从而小心地使经稀释的血样在Ficoll-Paque顶部成层。
5.将其在400×g下于室温离心35分钟，不制动。
6.在软巴斯德吸管的辅助下，在不干扰浑浊的单个核细胞(MNC)层的情况下将尽可能多的上清液(HBSS)弃去。
7.将在澄清的Ficoll-Paque上方静息的浑浊单个核细胞层吸出并移至新的50ml试管中汇集。
8.通过将所转移的MNC吸入10ml移液管中来记录其体积。
9.将所述体积的一半转移至新的50ml试管中。
10.用HBSS以至少3倍样品体积(约13ml)来稀释这两个试管中的MNC。
11.将这两个试管在500×g下于室温离心15分钟，有制动。
12.弃去上清液。
13.将其中一个试管重悬至约1000000MNC/ml，约5ml。
Rosette-Sep富集
1.将第二份MNC沉淀物用来自最初的0.75ml等分试样的660μL全血重悬。
2.添加33μL Rosette-Sep并吹吸混合。
3.将其在室温下温育20分钟。
4.通过添加700μL HBSS将样品以1∶2稀释至总样品体积为约1.4ml。
5.将1ml Ficoll-Paque添加至新的15ml Falcon试管。
6.小心地使稀释的血样在Ficoll-Paque上方成层。
7.将其在400×g下于室温离心35分钟，不制动。
8.用1ml单通道移液管通过抽吸来弃去上清液。
9.将Ficoll上方的浑浊细胞层转移至新的15ml Falcon试管中。
10.记录富集的细胞的体积，并用HBSS以至少3倍样品体积(约3ml)将其稀释。
11.将细胞在500×g下于室温离心15分钟，有制动。
12.弃去上清液。
13.将沉淀物以0.5ml重悬。
细胞培养
1.将细胞以1.0×105细胞的接种密度接种至自体同源或同种异基因的血小板裂解物培养基中。
2.用合适的培养基体积将其加满。
3.于37℃将细胞在0％O2、5％CO2中温育8天。
4.在第8天更换培养基，并温育细胞直至第14天。
5.挑选集落并转移至新的培养容器中。添加同种异基因血小板裂解物培养基。
6.继续进行细胞的培养和传代，直至获得约5×105～1×106细胞。
7.收集细胞并用流式细胞术进行分析，且在必要时将细胞冻存。
归巢和抗炎测试
测试了按照本发明制得的细胞的归巢至小鼠特定受损组织并在到达该组织后诱导抗炎效应的能力。对于归巢，将细胞用荧光剂标记并利用生物发光来确定其在小鼠体内的位置。
对于抗炎效应，针对包括白细胞介素(例如IL-8)、选择素、粘附分子(例如ICAM-1)和化学吸引蛋白(例如MCP-1和TNF-α)在内的多种炎性标志物进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
结果
所有细胞
根据本发明制得的所有中胚层谱系祖细胞都表达了CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271，但未表达CD14、CD34和CD45。示例性RT-PCR凝胶显示出存在CD44而不存在CD34，如图1所示。
FACS结果的示例性组如图2至4所示。这些结果证实，所述细胞为至少呈CD73和CD90阳性且呈CD14、CD34和CD45阴性的细胞。
这些细胞的直径通常为10μm至20μm。这些细胞通常具有纺锤形形态且呈成纤维细胞样(即，其具有小的细胞体，该细胞体具有几个细长的细胞突)。
归巢细胞
据显示，能够归巢至特定受损组织的细胞表达了1型和2型趋化因子受体(CXCR1和CXCR2)。
据显示，能够归巢至受损的心脏组织和骨组织的细胞表达了CXCR4。图5显示，呈CXCR4阳性的细胞能够归巢至受损的骨。来自图5所示实验的结果总结如下。
上表显示了BLI信号半定量分析。将胫骨骨折部位的兴趣区(ROI)的信号(以光子/秒/cm2/sr测量)归一化，归一化方法是从中减去在对侧未骨折的胫骨的等同ROI中所见的背景信号。a：针对CXCR4组p<0.05；b：针对CXCR4组p<0.01；c：针对PML p<0.05(Tukey后检验)。缩写：ANOVA：方差分析；PML：中胚层谱系祖细胞。
据显示，能够归巢至受损视网膜组织的细胞表达了CXCR4、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、CXCL12、CD109、CD119、核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、CD140a、CD140b、CD221、CD222、CD304、CD309和CD325。
能够归巢至受损骨组织的细胞表达了可检测水平的TGF-β3、骨形态生成蛋白-6(BMP-6)、SOX-9、胶原蛋白-2、CD117(c-kit)、趋化因子(C-C基序)配体12(CCL12)、CCL7、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、IGF-1、肝细胞生长因子(HGF)、PDGF-Rα、PDGF-Rβ、CXCR4、1型C-C趋化因子受体(CCR1)、IGF-1受体(IGF-1R)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、CXCL12和NFκB。
抗炎效应
据显示，按照本发明制得的细胞表达了以下抗炎标志物：CD120a(肿瘤坏死因子(TNF)-α受体1)、CD120b(TNF-α受体2)、CD50(细胞间粘附分子-3、ICAM-3)、CD54(ICAM-1)、CD58(淋巴细胞功能相关抗原-1、LFA-1)、CD62E(E-选择素)、CD62L(L-选择素)、CD62P(P-选择素)、CD106(血管细胞粘附蛋白，VCAM-1)、CD102(ICAM-2)、CD166(活化白细胞细胞粘附分子)、CD104(β4整联蛋白)、CD123(白细胞介素-3受体)、CD124(白细胞介素-4受体)、CD126(白细胞介素-6受体)、CD127(白细胞介素-7受体)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。
Claims (1)
1.一种通过以下步骤从富血小板血浆(PRP)制备血小板裂解物的方法：
(i)将富血小板血浆浸入液氮中，
(ii)在37℃将所述富血小板血浆解冻，和
(iii)随后再重复步骤(i)和(ii)3次。
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