JP2016502844A - アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用 - Google Patents

アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2016502844A
JP2016502844A JP2015547970A JP2015547970A JP2016502844A JP 2016502844 A JP2016502844 A JP 2016502844A JP 2015547970 A JP2015547970 A JP 2015547970A JP 2015547970 A JP2015547970 A JP 2015547970A JP 2016502844 A JP2016502844 A JP 2016502844A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ncbi gene
placental stem
gene
anoikis
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015547970A
Other languages
English (en)
Inventor
ズハング キアオクイ
ズハング キアオクイ
アボット スチュアート
アボット スチュアート
ボスキナリアン‐ベルセ バネッサ
ボスキナリアン‐ベルセ バネッサ
Original Assignee
アントフロゲネシス コーポレーション
アントフロゲネシス コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アントフロゲネシス コーポレーション, アントフロゲネシス コーポレーション filed Critical アントフロゲネシス コーポレーション
Publication of JP2016502844A publication Critical patent/JP2016502844A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

アノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)は、低付着環境での生存が向上されているので、好都合なことに、非接着状態で、より長時間存続するその能力に基づいて、治療において使用することができる。胎盤幹細胞を改変して、該胎盤幹細胞をアノイキス抵抗性にする方法であって、該胎盤幹細胞を有効量の調節性RNA分子と接触させて、胎盤幹細胞のアノイキスと関連する1以上の遺伝子が阻害されるようにすることを含む前記方法。さらに開示するのは、調節のための、アノイキスと関連する遺伝子である。【選択図】図１

Description

本出願は、その開示の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,498号の優先権を主張する。
(1. 分野)
本明細書で提供されるのは、アノイキス抵抗性胎盤細胞及びその組成物、並びにこうした細胞及び組成物を使用する方法である。
(2. 背景)
哺乳類胎盤は、豊富であり、通常は医療廃棄物として廃棄されるので、医学的に有用な細胞、例えば胎盤幹細胞のたぐい稀な原料となる。胎盤幹細胞は一般的に、組織培養プレートなどの培養表面及び細胞外マトリクスに接着（付着）する。アノイキスは、付着依存性細胞において、これらの細胞が低付着環境下で培養される/低付着環境中に存在する場合に生じる、プログラムされた細胞死(アポトーシス)の一形態である。アノイキスに対して抵抗性であり、したがって非接着状態で、より長い時間生存する、胎盤幹細胞の集団の必要性が存在する。本明細書で提供されるのは、こうした改良された胎盤幹細胞、こうした胎盤幹細胞の集団、及びこうした胎盤幹細胞を使用する方法である。
（3. 概要）
一態様では、本明細書で提供されるのは、胎盤幹細胞を改変して、該胎盤幹細胞をアノイキス抵抗性にする方法である。本明細書で提供するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)は、例えば非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキス抵抗性となるように改変されていない胎盤幹細胞)と比較して、低付着環境での生存の向上を示すので、非接着状態で、より長時間存続するその能力に基づいて、好都合なことに、例えば胎盤幹細胞の投与(例えば、胎盤幹細胞の全身投与)を利用する治療法に使用することができる。ある種の実施態様では、胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞がアノイキスを通常は受けるであろう条件で生存する能力がある場合に、アノイキス抵抗性である。ある種の実施態様では、胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞がアノイキスを通常は受けるであろう条件で非改変胎盤幹細胞よりも長時間生存する能力がある場合に、アノイキス抵抗性である。
一実施態様では、本明細書で提供されるのは、胎盤幹細胞を改変して、該胎盤幹細胞をアノイキス抵抗性にする方法であって、該胎盤幹細胞を有効量の単量体又は重合体分子と接触させて、胎盤幹細胞のアノイキスと関連する1以上の遺伝子が阻害される(例えば、改変されていない、例えば前記分子と接触させられていない胎盤幹細胞と比較して下方調節される)ようにすることを含む前記方法である。本明細書に記載する、こうした改変された胎盤幹細胞を、本明細書では、「アノイキス抵抗性胎盤幹細胞」(「arPSC」)と呼ぶ。ある種の実施態様では、前記単量体又は重合体分子は、調節性RNA分子である。具体的実施態様では、調節性RNA分子は、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAインヒビター(miRインヒビター)、miR模倣体（mimic）、アンチセンスRNA、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA適応型（-adapted）shRNA(shRNAmir)、又はこれらの任意の組み合わせである。
ある種の実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、胎盤幹細胞におけるアノイキスに関連すると本明細書で特定される1以上の胎盤幹細胞遺伝子(「アノイキス関連遺伝子」)を標的にする。具体的実施態様では、arPSCを産生するために本明細書に記載する方法で標的とされる前記1以上のアノイキス関連遺伝子は、下の表1に列挙される1以上の遺伝子を含む:
Figure 2016502844
Figure 2016502844
Figure 2016502844
一実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、低分子干渉RNA(siRNA)である。具体的実施態様では、前記siRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にする。別の具体的実施態様では、前記siRNAは、二本鎖であり、ここでは、前記siRNAの一方の鎖は、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)である。具体的実施態様では、前記shRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にする。別の具体的実施態様では、前記shRNAは、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、アンチセンスRNAである。具体的実施態様では、前記アンチセンスRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にする。別の具体的実施態様では、前記アンチセンスRNAは、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、1以上のアノイキス関連遺伝子の産生を調節するように働く、胎盤細胞における1以上のマイクロRNA(miRNA)を標的にする。一実施態様では、前記調節性RNA分子は、miRインヒビターである。別の実施態様では、前記調節性RNA分子は、miR模倣体である。具体的実施態様では、標的となるmiRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を調節するmiRNAである。ある種の実施態様では、前記miRインヒビター又は前記miR模倣体は、表1に特定された遺伝子のうちの1つの産生を調節するmiRNAの配列に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)の産生を調節するmiRNAを標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上のmiRNAを標的にし、ここでは、前記miRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の産生を調節する:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上のmiRNAを標的にし、ここでは、前記miRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の産生を調節する:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子の産生を調節する少なくとも1つのmiRNAを標的にする。
別の態様では本明細書で提供されるのは、本明細書に記載する方法に従って産生される、単離されたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)及びその組成物である。例えば、胎盤幹細胞は、前記胎盤幹細胞を有効量の単量体又は重合体分子(例えば調節性RNA分子)と接触させて、該胎盤幹細胞をアノイキス抵抗性にすることによって改変されている。こうしたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、例えば非改変胎盤幹細胞(例えば、有効量の単量体又は重合体分子(例えば調節性RNA分子)と接触されていない胎盤幹細胞)と比較して、低付着環境での生存の向上を示す。
一実施態様では、本明細書で提供される単離されたarPSCは、少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する。具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、表1に列挙した遺伝子からの少なくとも1つの遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSC又はその集団である。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、表1に列挙した遺伝子からの2以上の遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、例えば、表1に列挙した遺伝子からの2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は10個よりも多い遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSC又はその集団である。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。本明細書でさらに提供されるのは、こうしたarPSCを含む細胞の集団、及びこうしたarPSCを含む組成物である。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、1、2、3個、又はそれ以上の以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)1、2、3個、又はそれ以上の以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する;及び(ii)表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたarPSCである。本明細書でさらに提供されるのは、こうしたarPSCを含む細胞の集団、及びこうしたarPSCを含む組成物である。
具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、CD200を発現し、かつHLA-Gを発現しない;又はCD73、CD105、及びCD200を発現する;又はCD200及びOCT-4を発現する;又はCD73、CD105を発現し、かつHLA-Gを発現しない;又はCD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、前記集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、1以上の胚様体の形成を促進する;又はOCT-4を発現し、かつ、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、前記集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に、1以上の胚様体の形成を促進する。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、さらにCD90+及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、さらにCD80-及びCD86-でもある。さらに他の実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、CD44、CD90、HLA-A、B、C、又はABC-pのうちの1つ以上を発現する、かつ/又はCD45、CD117、CD133、KDR、CD80、CD86、HLA-DR、SSEA3、SSEA4、又はCD38のうちの1つ以上を発現しない。ある種の実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、免疫細胞の活性を抑制する。例えば、T細胞の増殖を、例えば混合リンパ球反応分析、回帰分析、又はT細胞アッセイによって決定可能な場合に、非改変胎盤幹細胞(例えば、有効量の単量体又は重合体分子(例えば調節性RNA分子)と接触されていない胎盤幹細胞)よりも検出可能な程度に大きく抑制する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、免疫応答のための、例えば、対象、例えばヒト対象の免疫応答を調節する、又はインビトロでの免疫応答を調節するための方法であって、免疫細胞を本明細書に記載するarPSC又はその組成物と接触させることを含む前記方法である。具体的実施態様では、本明細書で提供されるarPSCは、同等量の非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と同じ程度に免疫応答を調節する能力がある。細胞(例えば、arPSCを含めた胎盤幹細胞)が免疫応答を調節する能力を測定するための分析は、当技術分野で公知であり(例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,682,803号を参照のこと)、本明細書に記載している（例えば、混合リンパ球反応、回帰分析）。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、血管新生を促進するための方法である。具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象、例えばヒト対象における血管新生を促進するための方法であって、前記対象に本明細書に記載するarPSC又はその組成物を投与することを含む前記方法である。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるarPSCは、同等量の非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と同じ程度に血管新生を促進する能力がある。細胞(例えば、arPSCを含めた胎盤幹細胞)が血管新生を促進する能力を測定するための分析（例えば、細胞が内皮細胞による管形成を促進する能力を分析すること、細胞が内皮細胞の遊走及び/又は増殖を促進する能力を分析すること、及び、細胞が血管新生を促進する因子を分泌する能力を分析すること）は、当技術分野で公知である(例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0250182号を参照のこと)。
(3.1 定義)
本明細書で使用する場合、用語「量」は、胎盤幹細胞、例えば本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞に関する場合、胎盤幹細胞(例えばアノイキス抵抗性胎盤幹細胞)の特定の数を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「由来の」は、単離される又は単離とは別に精製されることを意味する。例えば、胎盤由来の接着細胞は、胎盤から単離される。用語「由来の」は、組織（例えば胎盤）から直接単離された細胞から培養された細胞、及び初代分離株から培養又は拡大された細胞を包含する。
本明細書で使用する場合、「免疫局在決定」は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、インサイツハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば抗体又はそのフラグメントを使用する、化合物、例えば細胞性マーカーの検出を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「SH2」とは、マーカーCD105上のエピトープと結合する抗体をいう。したがって、SH2+と称される細胞は、CD105+である。
本明細書で使用する場合、用語「SH3」及び「SH4」とは、マーカーCD73上に存在するエピトープと結合する抗体をいう。したがって、SH3+及び/又はSH4+と称される細胞は、CD73+である。
本明細書で使用する場合、幹細胞は、該幹細胞と天然に関連する他の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも99%が、例えば幹細胞の収集及び/又は培養中に幹細胞から取り出される場合に、「単離される」。「単離された」細胞の集団は、その細胞の集団が由来する組織(例えば胎盤)の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。いくつかの実施態様では、例えば幹細胞の集団は、該幹細胞の集団と天然に関連する細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも99%が、例えば幹細胞の集団の収集及び/又は培養中に幹細胞の集団から取り出される場合に、「単離される」。
本明細書で使用する場合、用語「胎盤幹細胞」とは、初代培養後の継代数は関係なく、その非改変状態で組織培養基材(例えば、組織培養プラスチック又はフィブロネクチンコーティング組織培養プレート)に接着する、哺乳類胎盤由来の、例えば哺乳類胎盤から単離される、幹細胞又は前駆細胞をいう。しかし、本明細書で使用する場合の用語「胎盤幹細胞」は、この細胞が当業者によって理解されている通り、栄養芽層も、細胞栄養芽層も、胚性生殖細胞も、胚性幹細胞も指さない。用語「胎盤幹細胞」と「胎盤由来の幹細胞」は、互換的に使用することができる。本明細書で別に注記しない限り、用語「胎盤」には、臍帯が含まれる。本明細書に開示する胎盤幹細胞は、ある種の実施態様では、インビトロで多能性(すなわち、細胞は、分化条件下でインビトロで分化する)、インビボで多能性(すなわち、細胞はインビボで分化する)、又はこれらの両方である。
本明細書で使用する場合、細胞は、ある特定のマーカーが検出可能である場合、そのマーカーについて「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は、例えばCD73について陽性である。何故なら、CD73は、(例えば、任意の所与のアッセイについて、アイソタイプ対照又は実験上の陰性対照と比較した場合に)バックグラウンドを検出可能に超える量で、胎盤幹細胞上で検出可能であるからである。細胞はまた、あるマーカーを、少なくとも1種の他の細胞型からその細胞を識別するために使用することができる場合、或いは、存在する又は細胞によって発現される場合にその細胞を選択又は単離するために使用することができる場合、そのマーカーについて陽性である。
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」は、幹細胞の少なくとも1つの特質、例えば、1以上のタイプの幹細胞と関連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル;培養において少なくとも10〜40回複製する能力;多能性、例えば、インビトロ、インビボ、またはこれらの両方で、1以上の三胚葉細胞に分化する能力;成熟(すなわち分化した)細胞の特性の欠如などを保持する細胞を定義する。
本明細書で使用する場合、「免疫調節」及び「免疫調節性の」は、免疫応答の検出可能な変化を引き起こすこと又は引き起こす能力を有すること、及び、免疫応答の検出可能な変化を引き起こす能力を意味する。
本明細書で使用する場合、「免疫抑制」及び「免疫抑制性の」は、免疫応答の検出可能な低下を引き起こすこと又は引き起こす能力を有すること、及び、免疫応答の検出可能な抑制を引き起こす能力を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「単量体又は重合体分子」とは、(例えば、対象の遺伝子、RNA、又はタンパク質の領域と結合又はハイブリッド形成することによって)対象の遺伝子、RNA、又はタンパク質を標的にする能力がある生体分子をいう。この用語には、例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、オリゴペプチド又はポリペプチド、及びこれらの任意の組み合わせ(例えば、キメラの組み合わせ)が含まれる。したがって、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝であってもよいし、ヘアピンを有し、内部又は末端のバルジ又はループなどの構成要素を含むこともできる。単量体又は重合体二本鎖分子は、ハイブリッド形成して二本鎖化合物を形成する二本鎖、又はハイブリダイゼーション及び完全又は部分的に二本鎖の分子の形成が可能になるのに十分な自己相補性を有する単鎖であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「調節性RNA分子」とは、選択可能な標的(1つ又は複数)(例えば、標的遺伝子、RNA、又はタンパク質)の発現又は活性を直接的又は間接的に調節する(例えば、上方調節又は下方調節する)RNA分子をいう。ある種の実施態様では、「調節性RNA分子」は、宿主細胞における選択可能な標的の発現を調節する、siRNA、miRインヒビター、miR模倣体、アンチセンスRNA、shRNA、shRNAmir、又はこれらのハイブリッド若しくは組み合わせである。ある種の実施態様では、本明細書で提供される調節性RNA分子は、約1から約100、約8から約80、10から50、13から80、13から50、13から30、13から24、18から22、19から23、20から80、20から50、20から30、又は20から24個の核酸塩基(すなわち約1から約100個の連結したヌクレオシド)を含む。
本明細書で使用する場合、表現「生存の向上」とは、非改変胎盤幹細胞と比較したアノイキス抵抗性胎盤幹細胞の生存を説明する場合、非改変胎盤幹細胞の(例えばアポトーシスによる)死を引き起こす条件、例えば、胎盤幹細胞が基材(例えば、組織培養プレート又は細胞外マトリクスなどの生物学的基材)に接着できない、又は基材に接着する能力が低い条件、すなわち低付着条件下で、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が生存可能なままである能力をいう。ある種の実施態様では、非改変胎盤幹細胞に対する、本明細書に記載するarPSCの生存の向上とは、arPSCが、低付着条件下で培養された場合に、同じ条件下で培養された同等量の非改変胎盤幹細胞と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、又は10倍の生存時間の向上を呈する能力をいう。ある種の実施態様では、非改変胎盤幹細胞に対する、本明細書に記載するarPSCの生存の向上とは、arPSCが、低付着条件下で培養された場合に、同じ条件下で培養された同等量の非改変胎盤幹細胞と比較して、少なくとも1.5倍から2.5倍、2倍から3倍、2.5倍から3.5倍、3倍から4倍、3.5倍から4.5倍、4倍から5倍、5倍から6倍、6倍から7倍、7倍から8倍、8倍から9倍、又は9倍から10倍の生存時間の向上を呈する能力をいう。arPSC及び非改変胎盤幹細胞の生存は、当技術分野で公知の方法、例えば、トリパンブルー排除アッセイ、二酢酸フルオレセイン取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ;チミジン取込みアッセイ、及びMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを使用して評価することができる。
本明細書で使用する場合、表現「レベルの低下」とは、非改変胎盤幹細胞における同一の遺伝子の発現と比較したアノイキス抵抗性胎盤幹細胞における所与の遺伝子の発現のレベルをいう場合、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞における遺伝子の発現が、下方調節又は阻害され、その結果、例えば、該遺伝子によって産生されるmRNA転写物及び/又は該遺伝子の発現から得られるタンパク質が減少することを意味する。所与の遺伝子が低下したレベルで発現されるかどうかの決定は、細胞によるタンパク質産生又は核酸産生の検出のための当分野で承認されている任意の方法、例えば核酸に基づく方法、例えばノーザンブロット分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)、リアルタイムPCR、定量PCRなどによって実現することができる。タンパク質の発現は、対象のタンパク質と結合する抗体を使用して、例えばELISA、ウェスタンブロット、サンドイッチ分析などにおいて、評価することができる。ある種の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞における遺伝子(例えばアノイキス関連遺伝子)は、その発現が、非改変胎盤幹細胞における遺伝子の発現と比較して少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、又は10倍低下する場合に、低下したレベルで発現される。ある種の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞における遺伝子(例えばアノイキス関連遺伝子)は、その発現が、非改変胎盤幹細胞における遺伝子の発現と比較して少なくとも1.5倍から2.5倍、2倍から3倍、2.5倍から3.5倍、3倍から4倍、3.5倍から4.5倍、4倍から5倍、5倍から6倍、6倍から7倍、7倍から8倍、8倍から9倍、又は9倍から10倍低下する場合に、低下したレベルで発現される。
(4. 図面の簡単な説明)
図1は、細胞接着を可能にするプレート(Corning Cellbind)上での、また、細胞接着を可能にしないプレート(低付着プレート:Corning Ultra-Low Attachment;Nunc Hydrocell;及びNunc Low Cell Binding)上での低付着条件下での、胎盤幹細胞の成長を示す。
図2は、細胞接着を可能にするプレート(Corning Cellbind)上での、また、細胞接着を可能にしない培養プレート(Corning Ultra-Low Attachment)上での低付着条件下での、胎盤幹細胞培養株の顕微鏡画像を示す。
図3は、組織培養プレートウェルにおける、GFP発現レンチウイルスshRNAを形質導入された胎盤幹細胞の成長を示す。組織プレートウェル内の輝点は、形質導入された胎盤幹細胞によるGFP発現に相当する。
図4は、その指定された(x軸上に列挙した)アノイキス関連遺伝子がsiRNAの標的にされた胎盤幹細胞に対して実施した、MTS分析の結果を示す。非処理対照は、非改変胎盤幹細胞を指し;NTP対照は、非特異的なsiRNAで処理された胎盤幹細胞を指す。
図5は、その指定された(y軸上に列挙した)アノイキス関連遺伝子がsiRNAの標的にされた胎盤幹細胞に対して実施したCyQuant Direct生存能力分析の結果を示す。非処理対照は、非改変胎盤幹細胞を指し;NTP対照は、非特異的なsiRNAで処理された胎盤幹細胞を指す。
図6は、その指定された(x軸上に列挙した)アノイキス関連遺伝子がsiRNAの標的にされた胎盤幹細胞に対して実施した、CyQuant Direct生存能力分析の結果を示す。NTP対照は、非特異的なsiRNAで処理された胎盤幹細胞を指す。
図7:細胞成長。A)低付着条件下での（細胞接着を可能にしないプレート上での）アノイキス抵抗性幹細胞の集団の成長を示す。B)低付着条件下での（細胞接着を可能にしないプレート上での）非改変胎盤幹細胞の集団の成長を示す。
(5. 詳細な説明)
(5.1 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生)
一態様では、本明細書で提供されるのは、胎盤幹細胞を改変して、該胎盤幹細胞をアノイキス抵抗性にする方法である。こうした方法は、該胎盤幹細胞を有効量の1以上の単量体又は重合体分子と接触させて、胎盤幹細胞におけるアノイキスを付与する1以上の遺伝子が阻害される(すなわち、単量体又は重合体分子と接触させた胎盤幹細胞における該遺伝子の発現が、同単量体又は重合体分子と接触させられていない胎盤幹細胞における該遺伝子の発現と比較して減じられる)ようにすることを含む。本明細書に記載する方法によって産生されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)は、非改変胎盤幹細胞と比較した場合の低付着環境での生存の向上を示す胎盤幹細胞である。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、ヌクレオチド(例えばDNA又はRNA分子)、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド模倣体、ポリペプチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド模倣体、及びこれらの任意の組み合わせ(例えばキメラの組み合わせ）を含む。
一実施態様では、ヌクレオチド類似体は、RNA類似体、例えば、2’-OH基において、ある基、例えば-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH、又は-Fでの置換によって改変されている、RNA類似体である。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、糖、塩基、又はヌクレオシド間結合における1以上の改変(例えば化学的改変)を含む。本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシド間結合基」とは、例えばRNA単位間などの2つのヌクレオチドを共有結合させる能力がある基をいう。例としては、リン酸、ホスホジエステル基、及びホスホロチオエート基が挙げられる。一実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、少なくとも1つのリン酸ヌクレオシド間結合基を含む。一実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、少なくとも1つのホスホジエステルヌクレオシド間結合基を含む。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、一本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体又は重合体分子は、二本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、糖、塩基、又はヌクレオシド間結合における1以上の改変(例えば化学的改変)を含む。
具体的実施態様では、本明細書に記載する方法で使用される単量体分子は、調節性RNA分子である。ある種の実施態様では、調節RNA分子は、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAインヒビター(anti-miR)、他の調節性RNA分子、例えばアンチセンスRNA、miR模倣体、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA適応型shRNA(shRNAmir)、又はこれらの任意の組み合わせである。
（5.1.1 siRNA）
ある種の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生のための本明細書で提供される方法は、胎盤幹細胞を有効量の低分子干渉RNA(siRNA)と接触させて、例えば、改変されていない(例えばsiRNAと接触されていない)胎盤幹細胞と比較した場合に、前記胎盤幹細胞におけるアノイキスに対する抵抗性が付与されるようにすることを含む。本明細書で使用する場合、用語「低分子干渉RNA」又は「siRNA」とは、特定の遺伝子の発現と干渉するRNA分子をいう。
本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、一本鎖又は二本鎖であり得、改変されていても改変されていなくてもよい。一実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、1以上の2'-デオキシ又は2'-O改変塩基を有する。いくつかの実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、1以上の塩基置換及び逆位(例えば、3-4核酸塩基逆位)を有する。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、二本鎖である。一実施態様では、siRNAの一方の鎖が、標的核酸に対してアンチセンスであるのに対し、他方の鎖は、第1の鎖に対して相補的である。ある種の実施態様では、前記siRNAは、第1の鎖と第2の鎖の間の中央の相補的領域と、前記第1の鎖と第2の鎖の間の又は標的RNAとの任意に相補的な末端領域を含む。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、約2から約50核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、二本鎖であり、かつ、約5から45、約7から40、又は約10から約35核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、二本鎖であり、かつ、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は35核酸塩基の長さである。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAの第1の鎖及び/又は第2の鎖の片側又は両側末端は、1以上の天然又は改変された核酸塩基を付加して突出部を形成することによって改変される。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAの第1の鎖及び/又は第2の鎖の片側又は両側末端は、平滑末端である。本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAの第1の鎖及び/又は第2の鎖の一方の末端が平滑末端であり、他方の末端が突出している核酸塩基を有することが可能である。一実施態様では、前記突出部は、約1から約10、約2から約8、約3から約7、約4から約6核酸塩基の長さである。別の実施態様では、前記突出部は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10核酸塩基の長さである。具体的実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、二本鎖であり、かつ、約21核酸塩基の長さを有する。別の具体的実施態様では、siRNAは、二本鎖であり、かつ、センス鎖とアンチセンス鎖との間に19nt相補的領域が存在するようにジヌクレオチド3’突出部(例えば、UU又はTT 3'-突出部などのジヌクレオチド3' DNA突出部)を含む約21核酸塩基の長さを有する。
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、arPSCを産生する方法であって、胎盤幹細胞又はその集団を、胎盤幹細胞におけるアノイキスと関連すると本明細書で特定される1以上の遺伝子を標的にする1以上のsiRNAと接触させることを含む前記方法である。すなわち、該方法は、1以上のsiRNAで1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にすることを含む。本明細書に記載する方法に従ってsiRNAによって標的にすることができるアノイキス関連遺伝子としては、上の表1に列挙した遺伝子が挙げられる。
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、arPSCを産生する方法であって、胎盤幹細胞又はその集団を、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にするsiRNAと接触させることを含む前記方法である。一実施態様では、前記siRNAは、二本鎖である。具体的実施態様では、前記二本鎖siRNAの一方の鎖（例えばセンス鎖）は、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の具体的実施態様では、胎盤幹細胞のアノイキス関連遺伝子をsiRNAと接触させた結果、前記胎盤幹細胞における前記遺伝子のmRNAレベルが低下することになる。例えば、得られるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、非改変胎盤幹細胞(すなわち、siRNAと接触させていない胎盤幹細胞)における同じ遺伝子のmRNAレベルよりも低下する。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法に従って産生されるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、例えば、非改変胎盤幹細胞における前記遺伝子の発現(mRNAレベル)と比較して、およそ、最大で、又は多くとも、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低下する。
本明細書に記載する方法で使用されるsiRNAは、販売業者によって供給されてもよいし(例えばAmbion社;Dharmacon)、例えば、固相合成によって、又は、例えばGaitらの文献「オリゴヌクレオチド及び類似体のためのプロトコル（Protocols for Oligonucleotides and Analogs）」、Agrawal編(1993)、Humana Press;Scaringe, Methods(2001)、23、206-217、Galloらの文献「RNA:タンパク質相互作用における化学合成されたRNAの適用（Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions）」、Smith編(1998)、1-36、Tetrahedron(2001)、57、5707-5713に記載されている手順に従って合成することもできる。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生のために有用なsiRNAは、当技術分野で公知の様々な方法によって特定することができる。ある種の実施態様では、こうしたsiRNAは、1以上のsiRNAライブラリ、例えば、市販品として入手可能なライブラリ(例えば、Ambion社、Silencer(登録商標) Select Human Nuclear Hormone Receptor(HNR)siRNA Library V4;Dharmacon社、siRNAライブラリHuman ON-TARGET plus siRNA Nuclear Receptors Sub-Library)から、任意にスクリーニング方法、例えばミディアム又はハイスループットスクリーニングによって、特定及び入手することができる。一実施態様では、こうしたライブラリは、広範な遺伝子(例えば、ヒトゲノムワイドsiRNAライブラリ)を包含することができるか、又は特定の標的遺伝子又は遺伝子ファミリー(例えば、ヒト核内受容体siRNAライブラリ、ホスファターゼsiRNAライブラリなど)を包含するようにあらかじめ定義され得る。スクリーニング方法は、例えば、自動ロボット装置（automated robotics）、液体取り扱い装置、データ処理ソフトウェア、及び/又は高感度検出装置、例えば、Precision XS Automated Pipettor System、EL406自動分注システム（Liquid handling system）、又はsynergyプレートリーダーを使用して、実施することができる。
（5.1.2 miRインヒビター及びmiR模倣体）
ある種の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生のための本明細書で提供される方法は、胎盤幹細胞を有効量のマイクロRNAインヒビター(miRインヒビター)と接触させて、例えば、改変されていない(例えばmiRインヒビターと接触されていない)胎盤幹細胞と比較した場合に、前記胎盤幹細胞におけるアノイキスに対する抵抗性が付与されるようにすることを含む。本明細書で使用する場合、用語「マイクロRNA」、「miRNA」、又は「miR」とは、限定はされないが成熟した一本鎖miRNA、miRNA前駆体(pre-miR)、及びこれらの変異形を含めた、短いリボ核酸(RNA)分子をいう。本明細書で使用する場合、用語「マイクロRNAインヒビター」、「miRNA阻害剤」、「miRインヒビター」、又は「anti-miR」とは、miRNA(例えば、内在性miRNA)を阻害するように設計されたリボ核酸分子をいう。いくつかの実施態様では、miRインヒビターは、1以上の内在性miRの阻害によって、標的遺伝子を下方調節(例えば阻害)する。一実施態様では、マイクロRNAは、天然に存在する。ある種の実施態様では、マイクロRNAは、標的メッセンジャーRNA転写物(mRNA)上の相補的な配列と結合して翻訳抑制及び遺伝子サイレンシングをもたらす、転写後調節因子である。ある種の実施態様では、単一の前駆体が、2以上の成熟したmiRNA配列を含有する。他の実施態様では、複数の前駆体miRNAが、同一の成熟した配列を含有する。いくつかの実施態様では、相対的存在度によって、優勢に発現されるmiRNAが明確に示される場合、用語「マイクロRNA」、「miRNA」、又は「miR」とは、優勢な産物をいい、用語「マイクロRNA＊」、「miRNA＊」、又は「miR＊」とは、該前駆体の逆のアームをいう。一実施態様では、miRNAは、最終的にRNA-Induced Silencing Complex(RISC)に入り込む「ガイド」鎖であり、miRNA＊は、他の「パッセンジャー」鎖である。別の実施態様では、対応するmiRNAよりも低いレベル(例えば≦15%)で細胞内に存在するmiRNA＊のレベル。細胞内に存在するパッセンジャー鎖の割合がより高い、いくつかの実施態様では、miRNA/miRNA＊の代わりに、miRNA-3p(すなわち、miRNA前駆体の3'アーム由来のmiRNA)とmiRNA-5p(すなわち、miRNA前駆体の5'アーム由来のmiRNA-5p)という名称が使用される。
本明細書で使用する場合、用語「マイクロRNA模倣体(1つ又は複数)」又は「miR模倣体(1つ又は複数)」とは、1以上のmiRNAの遺伝子サイレンシング能力をまねる又は模倣するために使用することができる分子をいう。一実施態様では、miR模倣体は、1以上の内在性miRをまねることによって、標的遺伝子を下方調節(例えば阻害)する。ある種の実施態様では、miRNA模倣体は、合成の非コードRNAである(すなわち、該miRNAは、内在性miRNAの原型の精製からは得られない)。ある種の実施態様では、miRNA模倣体は、RNAi経路に入り込み、遺伝子発現を調節する能力がある。ある種の実施態様では、miRNA模倣体は、成熟した分子(例えば一本鎖)又は模倣体前駆体(例えば、pri-又はpre-miRNA)として設計することができる。
いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるmiRインヒビター又はmiRNA模倣体は、例えばRNA、DNA、改変されたRNA、改変されたDNA、ロックト核酸、若しくは2'-O,4'-C-エチレン架橋型核酸(ENA)、又はこれらの任意の組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドを含めた核酸(改変された又は改変された核酸)を含む。
miRインヒビター又はmiR模倣体は、一本鎖又は二本鎖であり得、かつ、改変されていても改変されていなくてもよい。ある種の実施態様では、miRインヒビター又はmiR模倣体は、約2から約30核酸塩基の長さを有する。ある種の実施態様では、miRインヒビター又はmiR模倣体は、一本鎖であり、かつ約15から約30核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施態様では、miRインヒビターは、一本鎖であり、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30核酸塩基の長さである。
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、arPSCを産生する方法であって、胎盤幹細胞又はその集団を、胎盤幹細胞におけるアノイキスと関連すると本明細書で特定される1以上の遺伝子の活性を調節する前記胎盤幹細胞における1以上のmiRを標的にする1以上のmiRインヒビター又はmiR模倣体と接触させることを含む前記方法である。本明細書に記載する方法に従ってmiRインヒビター及び/又はmiR模倣体によって標的にすることができるmiRとしては、上の表1に列挙したアノイキス関連遺伝子の調節と関連するmiRが挙げられる。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、arPSCを産生する方法であって、胎盤幹細胞又はその集団を、前記胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子(例えば、上の表1に列挙したアノイキス関連遺伝子)の産生を調節する、前記胎盤幹細胞におけるmiRを標的にするmiRインヒビター又はmiR模倣体と接触させて、前記胎盤幹細胞による該アノイキス関連遺伝子の産生が、例えば同等数の非改変胎盤幹細胞と比較して低下するようにすることを含む、前記方法である。ある種の実施態様では、前記miRインヒビター又は前記miR模倣体は、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの産生を調節するmiRNAの配列に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)の産生を調節するmiRNAを標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)の産生を調節するmiRNAを標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上のmiRNAを標的にする。ここでは、前記miRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の産生を調節する:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター又はmiR模倣体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上のmiRNAを標的にする。ここでは、前記miRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の産生を調節する:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子の産生を調節する少なくとも1つのmiRNAを標的にする。
別の具体的実施態様では、胎盤幹細胞のアノイキス関連遺伝子の産生を調節するmiRNAをmiRインヒビター又はmiR模倣体と接触させた結果、前記胎盤幹細胞における前記遺伝子のmRNAレベルが低下することになる。例えば、得られるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、非改変胎盤幹細胞(すなわち、miRインヒビター又はmiR模倣体と接触させていない胎盤幹細胞)における同じ遺伝子のmRNAレベルよりも低下する。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法に従って産生されるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、例えば、非改変胎盤幹細胞における前記遺伝子の発現(mRNAレベル)と比較して、およそ、最大で、又は多くとも、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低下する。
本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター及びmiR模倣体は、販売業者によって供給されてもよいし(例えばAmbion社;Dharmafect)、例えば、固相合成によって、又は、例えばGaitらの文献「オリゴヌクレオチド及び類似体のためのプロトコル（Protocols for Oligonucleotides and Analogs）」、Agrawal編(1993)、Humana Press;Scaringe, Methods(2001)、23、206-217、Galloらの文献「RNA:タンパク質相互作用における化学合成されたRNAの適用（Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions）」、Smith編(1998)、1-36、Tetrahedron(2001)、57、5707-5713に記載されている手順に従って合成することもできる。
本明細書に記載する方法で使用されるmiRインヒビター及びmiR模倣体は、当技術分野で公知の様々な方法によって特定することができる。ある種の実施態様では、こうしたmiRインヒビター及び/又はmiR模倣体は、1以上のmiRインヒビター又はmiR模倣体ライブラリ、例えば、市販品として入手可能なライブラリ(例えば、Ambion社、Anti-miR miRNA Precursor Library Human V13)から、任意にスクリーニング方法、例えばミディアム又はハイスループットスクリーニングによって、特定及び入手することができる。一実施態様では、こうしたライブラリは、広範な標的miR(例えば、ヒトゲノムワイドsiRNAライブラリ)を包含することができるか、又は特定の標的遺伝子又は遺伝子ファミリー(例えば、核内受容体siRNAライブラリ、ホスファターゼsiRNAライブラリなど)を包含するようにあらかじめ定義され得る。スクリーニング方法は、例えば、自動ロボット装置、液体取り扱い装置、データ処理ソフトウェア、及び/又は高感度検出装置、例えば、Precision XS Automated Pipettor System、EL406自動分注システム、又はsynergyプレートリーダーを使用して、実施することができる。
（5.1.3 他の調節性RNA分子）
arPSCの産生に有用な他の調節性RNA分子は、アンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirを含む。これらのRNA分子は、本明細書に記載するarPSCを産生するために、任意の組み合わせで使用することができ、また、siRNA、miR模倣体、及び/又はmiRインヒビターと組み合わせて使用することができる。
本明細書で使用する場合、用語「アンチセンスRNA」は、アンチセンスリボ核酸分子である。実例に過ぎず、限定はされないが、アンチセンスRNAは、標的核酸(例えば遺伝子)とハイブリッド形成して、転写又は翻訳などの、標的核酸の発現活性を調節する。
本明細書で使用する場合、用語「低分子ヘアピン型RNA」又は「shRNA」とは、ステム-ループ構造を含むRNA分子をいう;用語「shRNAmir」とは、「マイクロRNA適応型shRNA」をいう。ある種の実施態様では、前記shRNAは、相補的な配列の第1及び第2の領域を含む。これらの領域の相補性及び方向性の程度は、これらの領域間に塩基対合が起こって、第1の領域と第2の領域とがループ領域（ループはループ領域内のヌクレオチド(又はヌクレオチド類似体)間の塩基対合の欠如に起因する）によって連結されるのに十分である。shRNAヘアピン構造は、例えば、細胞機構によってsiRNAに切断され、その後、RNA-Induced Silencing Complex(RISC)と結合することができる。この複合体は、複合体と結合したsiRNAと適合するmRNAと結合して、そのmRNAを切断する。
いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるshRNAmir又はマイクロRNA適応型shRNAは、shRNAへのmiRNAループとmiRNAフランキング配列の付加を伴う、天然に存在する一次転写物miRNAを模倣するshRNA構築物である。いかなる理論にも拘泥されることを望まないが、このshRNAmirは、Droshaによって、最初に切断されて、shRNAを生じ、次いで、Dicerによって再び切断されて、siRNAを生じる。次いで、このsiRNAは、標的mRNA分解のためのRISCに組み込まれる。これにより、shRNAmirがDroshaによって切断されるのが可能になり、それによって、ノックダウン効率の、より大きな増大が可能になる。shRNAヘアピンの両側へのmiR30ループと125ntのmiR30フランキング配列の付加は、マイクロRNAを伴わない従来のshRNA構築物と比較した場合、発現されたヘアピンのDrosha及びDicerプロセシングの10倍超の増大をもたらすことが報告されている。
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、arPSCを産生する方法であって、胎盤幹細胞又はその集団を、胎盤幹細胞におけるアノイキスと関連すると本明細書で特定される1以上の遺伝子を標的にする1以上のアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirと接触させることを含む前記方法である。すなわち、該方法は、1以上のアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirで1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にすることを含む。本明細書に記載する方法に従ってアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirによって標的にすることができるアノイキス関連遺伝子としては、上の表1に列挙した遺伝子が挙げられる。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、低分子ヘアピン型RNA又はshRNAである。具体的実施態様では、前記shRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にする。別の具体的実施態様では、前記shRNAは、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、アンチセンスRNAである。具体的実施態様では、前記アンチセンスRNAは、上の表1に列挙した1以上のアノイキス関連遺伝子を標的にする。別の具体的実施態様では、前記アンチセンスRNAは、上の表1に特定された遺伝子のうちの1つの配列(この表に提供される遺伝子のGene IDに基づいて特定される)に対して少なくとも約70%、80%、90%、95%、98%、又は100%相補的な配列を有する。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるshRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を標的にする。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を標的にする。
別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)。別の具体的実施態様では、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNAは、以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、又はそれ以上を標的にする:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)、及び表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を標的にする。
別の具体的実施態様では、胎盤幹細胞のアノイキス関連遺伝子をshRNA又はアンチセンスRNAと接触させた結果、前記胎盤幹細胞における前記遺伝子のmRNAレベルが低下することになる。例えば、得られるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、非改変胎盤幹細胞(すなわち、shRNA又はアンチセンスRNAと接触させていない胎盤幹細胞)における同じ遺伝子のmRNAレベルよりも低下する。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法に従って産生されるarPSCにおけるアノイキス関連遺伝子のmRNAレベルは、例えば、非改変胎盤幹細胞における前記遺伝子の発現(mRNAレベル)と比較して、およそ、最大で、又は多くとも、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低下する。
本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirは、販売業者によって供給されてもよいし(例えばAmbion社;Dharmafect)、例えば、固相合成によって、又は、例えばGaitらの文献「オリゴヌクレオチド及び類似体のためのプロトコル（Protocols for Oligonucleotides and Analogs）」、Agrawal編(1993)、Humana Press;Scaringe, Methods(2001)、23、206-217、Galloらの文献「RNA:タンパク質相互作用における化学合成されたRNAの適用（Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions）」、Smith編(1998)、1-36、Tetrahedron(2001)、57、5707-5713に記載されている手順に従って合成することもできる。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生に有用なアンチセンスRNA、shRNA、shRNAmir、及び他の調節性RNA分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって特定することができる。ある種の実施態様では、こうしたアンチセンスRNA、shRNA、shRNAmir、及び他の調節性RNA分子は、1以上のライブラリ、例えば、市販品として入手可能なライブラリ(Thermo Scientific社、shRNAmirライブラリ)から、任意にスクリーニング方法、例えばミディアム又はハイスループットスクリーニングによって、特定及び入手することができる。一実施態様では、こうしたライブラリは、広範な遺伝子(例えば、ヒトゲノム標的ライブラリ)を包含することができるか、又は特定の標的遺伝子又は遺伝子ファミリー(例えば、ヒト核内受容体標的ライブラリ、ホスファターゼ標的ライブラリなど)を包含するようにあらかじめ定義され得る。スクリーニング方法は、例えば、自動ロボット装置、液体取り扱い装置、データ処理ソフトウェア、及び/又は高感度検出装置、例えば、Precision XS Automated Pipettor System、EL406自動分注システム、又はsynergyプレートリーダーを使用して、実施することができる。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirは、約1から約100、約8から約80、10から50、13から80、13から50、13から30、13から24、18から22、19から23、20から80、20から50、20から30、又は20から24個の核酸塩基(核酸塩基(すなわち約1から約100個の連結したヌクレオシド)を含む。
本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirは、一本鎖又は二本鎖、改変又は非改変であり得る。ある種の実施態様では、前記アンチセンスRNA、miR模倣体、shRNA、shRNAmir、及び他の調節性RNA分子は、約1から約100、約8から約80、10から50、13から80、13から50、13から30、13から24、18から22、19から23、20から80、20から50、20から30、又は20から24個の核酸塩基(すなわち約1から約100個の連結したヌクレオシド)を含む。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNA、shRNA、及びshRNAmirは、約12から約35個の核酸塩基(すなわち約12から約35個の連結したヌクレオシド)を含む一本鎖である。一実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるアンチセンスRNA、miR模倣体、shRNA、及びshRNAmirは、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は35核酸塩基の長さである。
本明細書に記載する方法で使用されるshRNAmirは、任意の公知の方法によって、細胞に送達することができる。具体的実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるshRNAmirは、真核細胞発現ベクターに組み込まれる。別の具体的実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるshRNAmirは、遺伝子発現のためのウイルスベクターに組み込まれる。こうしたウイルスベクターとしては、限定はされないが、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルス、及びアデノウイルスが挙げられる。具体的実施態様では、本明細書に記載する方法で使用されるshRNAmirは、レンチウイルスベクターに組み込まれる。
（5.1.4 胎盤幹細胞への調節性RNA分子の送達）
本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、トランスフェクション(例えば、一過性又は安定的トランスフェクション)又は当技術分野で公知の他の手段によって、胎盤幹細胞に送達することができる。ある種の実施態様では、前記トランスフェクションは、例えば、脂質(例えばリポソーム)、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、デンドリマー、又はポリマー(例えばカチオン性ポリマー)を使用して;電気穿孔法、光学的トランスフェクション、遺伝子電気的導入（gene electrotransfer）、刺入導入（impalefection）、遺伝子銃、又は磁気導入（magnetofection）によって;ウイルス(例えばウイルス担体)を介して;又はこれらの組み合わせを使用して実施することができる。一実施態様では、前記トランスフェクションは、市販品として入手可能なトランスフェクション試薬又はキット(例えば、Ambion社、siPORT(商標) Amine、siPORT NeoFXのもの;Dharmafect、Dharmafect 3トランスフェクション試薬又はDharmafect 1トランスフェクション試薬;Invitrogen社、Lipofectamine RNAiMAX;Integrated DNA Technologies社、Transductin;Mirus Bio LLC社、TransIT-siQUEST、TransIT-TKO)を使用して実施される。具体的実施態様では、前記トランスフェクションは、Dharmafect 1トランスフェクション試薬と共に、Dharmacon ON-TARGET plus SMARTpool(登録商標)siRNA試薬を使用して実施することができる。いくつかの実施態様では、前記トランスフェクションは、限定はされないが、マイクロタイタープレート(例えば96ウェルプレート)及びマイクロプレートリーダー(例えばsynergyプレートリーダー)、又は自動化システム、例えば、Precision XS Automated Pipettor System、EL406自動分注システムの使用を含めた、ミディアム又はハイスループット方式で行うことができる。他の実施態様では、前記トランスフェクションは、限定はされないが、組織培養ディッシュ又は培養フラスコ(例えば、T25、T75、又はT225フラスコ)の使用を含めて、大規模で行われる。胎盤幹細胞は、組織培養容器（例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートなど）中で、胎盤幹細胞がトランスフェクション時に約20〜80%コンフルエント又は約30〜70%コンフルエントまで増殖するのに十分な時間、プレーティング及び培養することができる。例えば、トランスフェクション時に、96ウェルプレートにおいて、ウェルあたり約2000、2500、3000、3500、又は4000個の胎盤幹細胞が存在することができる。一実施態様では、胎盤幹細胞は、トランスフェクション時に約50%コンフルエントである。別の実施態様では、直接的トランスフェクション時に、96ウェルプレートにおいて、ウェルあたり約3000又は3500個の胎盤幹細胞が存在する。別の実施態様では、リバーストランスフェクション時に、96ウェルプレートにおいて、ウェルあたり約3500個の胎盤幹細胞が存在する。
本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子は、一過性トランスフェクションによって細胞に与えることもできるし、調節性RNA分子(例えばsiRNA)が標的とする遺伝子の長期間の調節(例えば抑制)のために、細胞に安定的に移入することもできる。一実施態様では、調節性RNA分子の安定的トランスフェクションは、例えば、機能性の調節性RNA分子を発現するプラスミド又は発現ベクターの使用によって実施することができる。一実施態様では、こうしたプラスミド又は発現ベクターは、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質選択マーカー)を含む。別の実施態様では、こうしたプラスミド又は発現ベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、RNAポリメラーゼIII(RNA pol III)プロモーター(例えば、U6又はH1)、又はRNAポリメラーゼII(RNA pol II)プロモーターを含む。別の実施態様では、こうしたプラスミド又は発現ベクターは、市販品として入手可能な(例えば、Ambion社、pSilencer(商標) 4.1-CMVベクター)である。
哺乳類発現ベクターの他の例としては、pLOC(Open Biosystems社)（サイトメガロウイルスプロモーターを含有する）;pCDM8(Seedの文献、Nature 329:840(1987))、及びpMT2PC(Kaufmanらの文献、EMBO J. 6:187-195(1987))が挙げられる。使用することができる発現ベクターの他の例としては、pFN10A(ACT)FLEXI(登録商標)ベクター(Promega社)、pFN11A(BIND)FLEXI(登録商標)ベクター(Promega社)、pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/Hygro](Promega社)、pFC14K(HALOTAG(登録商標) 7) MCV FLEXI(登録商標)ベクター(Promega社)、pFC15A(HALOTAG(登録商標) 7) MCV FLEXI(登録商標)ベクター(Promega社)などが挙げられる。
哺乳類細胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供することができる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス40に由来する。原核細胞と真核細胞の両方のための他の適切な発現システムは、例えば、Sambrookらの文献、Sambrook編、「分子クローニング：研究室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」第2版、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州Cold Spring Harbor(1989)のチャプター16及び17に記載されている。
組み換え発現ベクターは、発現されることとなる遺伝子をコードする核酸配列と、例えば作動可能に連結することができる、1以上の制御配列を含むことができる。こうした制御配列は、例えば、Goeddelの文献、「遺伝子発現技術:酵素学における方法（Gene Expression Technology:Methods in Enzymology）」185、Academic Press社、カリフォルニア州San Diego(1990)に記載されている。ある種の実施態様では、ベクターは、胎盤幹細胞におけるヌクレオチド配列の恒常的発現を誘導する制御配列を含む。ある種の他の実施態様では、制御配列は、arPSCのレシピエントにおけるある種の組織の細胞のみにおける、例えば、前記レシピエント内の肺、神経、筋肉、皮膚、血管系、又は他の組織におけるヌクレオチド配列の発現を誘導する。ある種の他の実施態様では、前記ベクターは、例えば、化学薬品、例えば、テトラサイクリンとの接触によって誘導可能である制御配列を含む。
調節性RNA分子は、当分野の技術者に公知の任意の技術によって、例えば、直接的トランスフェクションによって、細胞に与えることができる。例えば、前記直接的トランスフェクションは、トランスフェクション前に細胞をあらかじめプレーティングして、ある期間の間(例えば24時間)、再付着させて成長を再開させ、その後、トランスフェクション複合体に曝露させるというステップを含むことができる。調節性RNA分子はまた、リバーストランスフェクションによって、細胞に与えることができる。例えば、前記リバーストランスフェクションは、プレーティング前に、浮遊している細胞にトランスフェクション複合体を添加するステップを含むことができる。
種々の実施態様では、胎盤幹細胞に対する調節性RNA分子の効果、例えば、前記胎盤幹細胞からarPSCを作製するための、前記胎盤幹細胞における1以上のアノイキス関連遺伝子の下方調節は、最大で、およそ、又は多くとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、若しくは23時間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、若しくは28日、又はそれ以上の間、持続することができる。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法を使用して作製されるarPSCは、arPSCが産生された後、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、若しくは23時間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、若しくは28日以内に使用される（例えば対象に投与される）。ある種の実施態様では、本明細書に記載する方法を使用して作製されたarPSCは、使用する前に（例えば対象への投与の前に）保存、例えば凍結保存される。ある種の実施態様では、arPSCに対する調節性RNA分子の効果は、誘導可能である。ある種の他の実施態様では、胎盤幹細胞が改変されてarPSCが産生される時点とarPSCが投与又は凍結保存される時点との間に、細胞の拡大(arPSCの培養、増殖など)が、まったく又は実質的にまったく実施されない。
本明細書に記載する方法で使用される調節性RNA分子の機能(例えば、アノイキス関連遺伝子のサイレンシング)の評価、例えば、遺伝子サイレンシングのレベル又は程度の評価は、細胞によるタンパク質産生又は核酸産生の検出のための当分野で承認されている任意の方法によって実現することができる。例えば、評価は、こうした核酸配列で形質移入又は形質転換されていない同等の胎盤幹細胞と比較した場合の、arPSCの試料(例えば、10×105から10×107個のarPSC、又は1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、若しくは10%の前記arPSCの試料)における対象の遺伝子のmRNA又はタンパク質レベルを決定することによって実施することができる。評価は、例えば核酸に基づく方法、例えばノーザンブロット分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)、リアルタイムPCR、定量PCRなどを使用して実施することができる。他の実施態様では、タンパク質の発現は、対象のタンパク質と結合する抗体を使用して、例えばELISA、サンドイッチ分析などにおいて、評価することができる。具体的実施態様では、本明細書に記載する方法を使用して作製されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、同等量の非改変胎盤幹細胞(すなわち、調節性RNA分子と接触されていない胎盤幹細胞)と比較して、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%少ない標的遺伝子(例えばアノイキス関連遺伝子)のmRNAを産生する。具体的実施態様では、本明細書に記載する方法を使用して作製されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、同等量の非改変胎盤幹細胞(すなわち、調節性RNA分子と接触されていない胎盤幹細胞)と比較して、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%少ない標的遺伝子(例えばアノイキス関連遺伝子)のタンパク質を産生する。
（5.2 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の使用）
本明細書に記載するarPSCの1つの利点は、該arPSCが、非改変胎盤幹細胞(例えば、その開示の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,311,904号;第7,311,905号;第7,468,276号、及び第8,057,788号に記載されている胎盤幹細胞)の機能特性を維持し、しかもアノイキスに対して抵抗性であり、したがって、例えばアノイキス抵抗性ではない非改変胎盤幹細胞と比較した場合に、低付着条件での生存の向上を示すことである。したがって、本明細書に記載するarPSCは、好都合なことに、対象への胎盤幹細胞の投与を含む方法であって、該胎盤幹細胞が、低付着環境で投与される（例えば、該胎盤幹細胞が全身的に投与される又は該胎盤幹細胞が局所的に投与される）、かつ、局所的環境で基材(例えば細胞外マトリクス)に接着しない、前記方法に使用することができる。
一実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、所望されない又は有害な免疫応答、例えば、炎症要素を有する疾患、障害、又は状態によって引き起こされる又は該疾患、障害、又は状態と関連する疾患、障害、又は状態を有する、又は発症するリスクがある個人を治療する方法において使用することができる。別の実施態様では、本明細書で提供されるのは、免疫細胞(1つ又は複数)を複数のarPSC(例えば、arPSCを含む組成物)と接触させることによる、免疫細胞又は複数の免疫細胞の調節、例えば活性（例えば増殖）の抑制のための方法である。こうした方法に従って、治療有効量のarPSCを、個人に投与することができる。ここでは、投与されるarPSCは、前記個人における低付着条件で、例えば同じ様式で投与される非改変胎盤幹細胞よりも長い時間、生存することができる。
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、免疫応答を抑制する方法であって、複数の免疫細胞を複数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞と、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が免疫応答を検出可能な程度に抑制するのに十分な時間、接触させることを含む前記方法である。ここでは、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応(MLR)又は回帰分析におけるT細胞増殖を、検出可能な程度に抑制する。「免疫細胞」は、この方法の状況では、免疫系のあらゆる細胞、特にT細胞及びNK(ナチュラルキラー)細胞を意味する。したがって、該方法の種々の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、複数の免疫細胞と接触される。ここでは、複数の免疫細胞は、複数のT細胞(例えば、複数のCD3+T細胞、CD4+T細胞、及び/又はCD8+T細胞)、及び/又はナチュラルキラー細胞である、又はこれらの細胞を含む。「免疫応答」は、この方法の状況では、免疫細胞によって通常認識される刺激に対する、免疫細胞によるあらゆる応答、例えば、抗原の存在に対する応答であり得る。種々の実施態様では、免疫応答は、輸血若しくは移植片に存在する抗原などの外来の抗原に、又は自己免疫疾患の場合のように自己抗原に応答する、T細胞(例えば、CD3+T細胞、CD4+T細胞、及び/又はCD8+T細胞)の増殖であり得る。免疫応答は、移植片内に含有されるT細胞の増殖でもあり得る。免疫応答は、ナチュラルキラー(NK)細胞のあらゆる活性、樹状細胞の成熟などでもあり得る。免疫応答は、1以上のクラスの免疫細胞の活性の、局所的な、組織又は器官特異的な、又は全身的な影響でもあり得る。例えば、免疫応答は、移植片対宿主病、炎症、炎症関連瘢痕組織の形成、自己免疫状態(例えば、関節リウマチ、I型糖尿病、エリテマトーデスなど)などであり得る。
「接触させること」は、こうした状況で本明細書で使用する場合、胎盤幹細胞と免疫細胞を共に、単一の容器(例えば、培養ディッシュ、フラスコ、バイアルなど)に、又は、インビボで、例えば同一の個体(例えば哺乳類、例えばヒト)に導入することを包含する。一実施態様では、接触させることは、免疫細胞の免疫機能の変化が検出可能であるのに十分な時間、かつ十分な数のarPSCと免疫細胞とを接触させることである。ある種の実施態様では、前記「接触させること」は、免疫機能(例えば、抗原に応答するT細胞増殖)を、arPSCの非存在下での免疫機能と比較して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%抑制するのに十分である。インビボ状況におけるこうした抑制は、インビトロアッセイ(以下参照)において決定することができる;すなわち、インビトロアッセイにおける抑制の程度から、特定の数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞とレシピエント個人における免疫細胞の数を基に、個人における抑制の程度を推定することができる。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が免疫応答を抑制する能力は、例えば、インビトロで評価することができる。ある種の実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同じ程度、免疫応答を抑制する。ある種の実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と同じ程度に免疫応答を抑制する。例えば、複数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、CD4+又はCD8+T細胞と樹状細胞(DC)とアノイキス抵抗性胎盤幹細胞とを約10:1:2の比で組み合わせることを含むMLRにおいて試験することができる。ここでは、T細胞は、例えば、嬢細胞に分配されるCFSEなどの染料で染色され、かつ、T細胞は、約6日間増殖させられる。T細胞増殖が、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の存在下で、6日間で、DCの存在下かつ胎盤幹細胞の非存在下でのT細胞増殖と比較して、検出可能な程度に低下する場合、該複数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、免疫抑制性である。さらに、非改変胎盤幹細胞を使用する対照を並行して実施して、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、非改変又は非処理胎盤幹細胞よりも免疫抑制性であることを実証することができる。こうしたMLRでは、例えば、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、解凍する、又は培養物から回収することができる。約20,000個のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を、100μlの培地(RPMI 1640、1mM HEPES緩衝液、抗生物質、及び5%のプールされたヒト血清)に再懸濁し、ウェルの底に2時間接着させる。CD4+及び/又はCD8+T細胞を、全末梢血単核細胞Miltenyi磁気ビーズから単離する。この細胞をCFSE染色し、合わせて100,000個のT細胞(CD4+T細胞単独、CD8+T細胞単独、又は等量のCD4+T細胞とCD8+T細胞)を、ウェルに添加する。ウェル内の体積を200μlとし、MLRを進行させる。回帰分析又はBTR分析を、類似の様式で使用することができる。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、血管新生を促進するための方法である。具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象、例えばヒト対象における血管新生を促進するための方法であって、前記対象に本明細書に記載するarPSC又はその組成物を投与することを含む前記方法である。ある種の実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同じ程度、血管新生を促進する。ある種の実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞(例えば、アノイキスに対して抵抗性ではない胎盤幹細胞)と同じ程度に血管新生を促進する。細胞(例えば、arPSCを含めた胎盤幹細胞)が血管新生を促進する能力を測定するための分析（例えば、細胞が内皮細胞による管形成を促進する能力を分析すること、細胞が内皮細胞の遊走及び/又は増殖を促進する能力を分析すること、及び、細胞が血管新生を促進する因子を分泌する能力を分析すること）は、当技術分野で公知である(例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0250182号を参照のこと)。
本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、1種以上の第2の型の幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞と共に投与することができる。こうした第2の幹細胞は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞と共に、例えば約1:10から約10:1の比で個人に投与することができる。
本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、当技術分野で公知の任意の方式で、例えば、全身的に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、眼内に、非経口的に、くも膜下腔内に、又は器官、例えば膵臓に直接的に、個人に投与することができる。インビボ投与については、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、以下に記載する通りに、医薬組成物として製剤化することができる。
（5.3 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びアノイキス抵抗性胎盤幹細胞集団）
本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)は、本明細書に記載する方法を使用して、胎盤幹細胞から産生される。arPSCを産生するための本明細書に記載する方法によれば、本明細書に記載するarPSCは、1以上のアノイキス関連遺伝子（本明細書で特定される通り、例えば、上の表1に特定した1以上のアノイキス関連遺伝子）を、非改変胎盤幹細胞における同じアノイキス関連遺伝子の発現と比較した場合に、低下したレベルで発現する（すなわち、1以上のアノイキス関連遺伝子の発現は、下方調節される。）。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞がそこから産生される胎盤幹細胞は、血液、例えば、胎盤血又は臍帯血に由来しない。本明細書で提供される方法及び組成物において使用されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される胎盤幹細胞は、個人の免疫系を抑制する能力を有し、かつ、その能力について選択することができる。
胎盤幹細胞は、胎児又は母親起源であり得る(すなわち、母親又は胎児の遺伝子型を有することができる)。胎盤幹細胞の集団、又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、もっぱら胎児起源又はもっぱら母親起源の胎盤幹細胞を含むこともできるし、胎児と母親両方の起源の胎盤幹細胞の混合集団を含むこともできる。胎盤幹細胞、及び、胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、例えば、下に論じる形態的特性、マーカー特性、及び培養特性によって、特定及び選択することができる。
(5.3.1 物理的及び形態的特性)
arPSCを作製するために本明細書に記載する方法において使用される胎盤幹細胞は、初代培養で、又は細胞培養で培養した場合、組織培養基材、例えば組織培養容器表面(例えば組織培養プラスチック)と接着する。培養下での胎盤幹細胞は一般に、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から伸びている、線維芽細胞様の星状の外観を呈する。しかし、本明細書に記載するarPSCを作製するための方法において使用される胎盤幹細胞は、線維芽細胞よりも多い数のこうした突起を呈するので、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に区別可能である。形態学的には、胎盤幹細胞はまた、培養下で一般に、より丸みを帯びた又は丸石様形態を示す造血幹細胞と区別可能である。
したがって、本明細書に記載するarPSCは、例えば、線維芽細胞及び造血幹細胞とは異なる。さらに、本明細書に記載するarPSCは、特に、低付着条件で細胞が生存する能力に関して、arPSCを作製するために使用される胎盤幹細胞とは異なり;本明細書に記載するarPSCは、非改変胎盤幹細胞よりも高い、低付着条件で生存する能力を示す。何故なら、本明細書に記載するarPSCは、アノイキスに対して抵抗性であるのに対して、非改変胎盤幹細胞は、アノイキス抵抗性ではないからである。
(5.3.2 細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝マーカー)
非改変胎盤幹細胞と同様に、本明細書に記載するarPSCは、arPSCを含む細胞又は細胞の集団を特定する及び/又は単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。一般に、本明細書に記載するarPSCと関連するマーカーを特定することは、該arPSCが由来する胎盤幹細胞(すなわち、arPSCを作製するために本明細書に記載する方法において使用される胎盤幹細胞)を特定するために使用することができるものと同様である。したがって、本明細書に記載するarPSCは、細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝マーカーに関して、非改変胎盤幹細胞に匹敵し、これらの細胞間の違いは、本明細書に記載するarPSCが、アノイキス関連遺伝子のうちの少なくとも1つ(例えば、上の表1に特定された遺伝子のうちの少なくとも1つ)を、同等量の非改変胎盤幹細胞における前記遺伝子の発現よりも低いレベルで発現する、すなわち、本明細書に記載するarPSCにおいては、少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子が下方調節/阻害されている（ここでは、非改変胎盤幹細胞においては、前記アノイキス関連遺伝子は、下方調節/阻害されていない）ことである。
本明細書に記載するarPSCは、該arPSCが由来する胎盤幹細胞と同様に、骨髄由来の間葉系細胞でも、脂肪由来の間葉系幹細胞でも、臍帯血、胎盤血、又は末梢血から得られる間葉系細胞でもない。
ある種の実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)は、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD34-、CD10+、及びCD105+である。具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)は、神経表現型、骨形成表現型の細胞、及び/又は軟骨形成表現型の細胞に分化する潜在能力を有する。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD45-又はCD90+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD45-及びCD90+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD90+又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD90+及びCD45-でもある、すなわち、該細胞は、CD34-、CD10+、CD45-、CD90+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様では、前記CD34-、CD10+、CD45-、CD90+、CD105+、CD200+の本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD80-及びCD86-でもある。
ある種の実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)は、フローサイトメトリーによって検出される場合に、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、並びにCD38-、CD45-、CD80-、CD86-、CD133-、HLA-DR、DP、DQ-、SSEA3-、SSEA4-、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A、B、C+、PDL1+、ABC-p+、及び/又はOCT-4+のうちの1以上である。他の実施態様では、本明細書に記載するCD34-、CD10+、CD105+ arPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、又はSH4+のうちの1以上でもある。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD44+でもある。別の具体的実施態様では、本明細書に記載する単離されたCD34-、CD10+、CD105+ arPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、CD117-、CD133-、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、若しくはProgrammed Death-1リガンド(PDL1)+のうちの1以上、又はこれらの任意の組み合わせでもある。
別の実施態様では、本明細書に記載するCD34-、CD10+、CD105+ arPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-カドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、若しくはProgrammed Death-1リガンド(PDL1)+のうちの1以上、又はこれらの任意の組み合わせでもある。別の実施態様では、本明細書に記載するCD34-、CD10+、CD105+ arPSC(及び/又はarPSCを産生するために本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-カドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、及びProgrammed Death-1リガンド(PDL1)+でもある。
別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にABC-p+、又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって決定される場合にOCT-4+(POU5F1+)でもある。ここでは、ABC-pは、胎盤特異的ABCトランスポータータンパク質(乳癌耐性タンパク質(BCRP)として又はミトキサントロン耐性タンパク質(MXR)としても公知である)であり、OCT-4は、オクタマー-4タンパク質(POU5F1)である。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、フローサイトメトリーによって決定される場合にSSEA3-又はSSEA4-でもある。ここでは、SSEA3は、ステージ特異的胎児抗原3であり、SSEA4は、ステージ特異的胎児抗原4である。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、SSEA3-及びSSEA4-でもある。
別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかは、MHC-I+(例えばHLA-A、B、C+)、MHC-II-(例えばHLA-DP、DQ、DR-)、若しくはHLA-G-のうちの1以上である、又は該細胞のいずれかはさらに、MHC-I+(例えばHLA-A、B、C+)、MHC-II-(例えばHLA-DP、DQ、DR-)、若しくはHLA-G-のうちの1以上でもある。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSC(及び/又はarPSCを産生するための本明細書に記載する方法で使用される胎盤幹細胞)のいずれかはさらに、MHC-I+(例えば、HLA-A、B、C+)、MHC-II-(例えば、HLA-DP、DQ、DR-)、及びHLA-G-でもある。
本明細書で提供されるのはまた、本明細書に記載するarPSCの集団である。ある種の実施態様では、本明細書に記載するのは、本明細書に記載する単離されたarPSCを含むarPSCの集団である。ここでは、該細胞集団は、例えば、単離されたCD10+、CD105+、及びCD34- arPSCを少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は98%含む;すなわち、前記集団における少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は98%の細胞が、単離されたCD10+、CD105+、及びCD34- arPSCである。具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+ arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+ arPSCはさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD90+又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+ arPSCはさらに、フローサイトメトリーによって検出される場合にCD90+及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、先に記載した単離されたCD34-、CD10+、CD105+ arPSCのいずれかはさらに、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、又はSH4+のうちの1以上でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+ arPSC又は単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+でもある。先述の単離されたCD34-、CD10+、CD105+ arPSCを含む細胞の集団のいずれかの具体的実施態様では、該単離されたarPSCはさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-カドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、若しくはProgrammed Death-1リガンド(PDL1)+のうちの1以上、又はこれらの任意の組み合わせでもある。別の具体的実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+ arPSCはさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-カドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、及びProgrammed Death-1リガンド(PDL1)+でもある。
ある種の実施態様では、前記細胞集団における単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、及びABC-p+のうちの1以上又はすべてである。ここでは、前記単離されたarPSCを作製する方法で使用される前記胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的及び/又は酵素的破壊によって得られた。具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びABC-p+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びCD34-であり、ここでは、前記単離されたarPSCは、以下の特性のうちの少なくとも1つを有する:CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びCD34-であり、かつ、SH2+又はSH3+のいずれかである。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、SH2+、及びSH3+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-であり、かつ、SH2+又はSH3+のいずれかである。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びCD34-であり、かつ、SH2+又はSH3+のいずれかであり、かつ、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-、又はSSEA4-のうちの少なくとも1つである。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-、及びSSEA4-であり、かつ、SH2+又はSH3+のいずれかである。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34-、CD45-、SSEA3-、又はSSEA4-である。別の実施態様では、単離されたarPSCは、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、OCT-4+、CD34-、又はCD45-である。
別の実施態様では、本明細書に記載する単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+であり;ここでは、前記単離されたarPSCはさらに、OCT-4+、SSEA3-、又はSSEA4-のうちの1以上でもある。
ある種の実施態様では、単離されたarPSCは、CD200+又はHLA-G-である。具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD200+及びHLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記arPSCは、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+又はHLA-G- arPSCは、胚様体の形成を可能にする条件下で、該単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における胚様体の形成を促進する。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、前記arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、これらの組み合わせのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、例えば濃縮されたCD200+、HLA-G- arPSCを含む、細胞の集団である。具体的実施態様では、前記集団は、胎盤細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、単離されたCD200+、HLA-G- arPSCである。好ましくは、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%が、単離されたCD200+、HLA-G- arPSCである。より好ましくは、前記細胞の少なくとも約90%、95%、又は99%が、単離されたCD200+、HLA-G- arPSCである。細胞集団の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、HLA-G- arPSCはまた、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、HLA-G- arPSCはまた、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、HLA-G- arPSCはまた、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+でもある。別の実施態様では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養した場合に1以上の胚様体を生じる。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、HLA-G- arPSCは、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する単離されたarPSCは、CD73+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、HLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、及びCD200+ arPSCは、単離されたarPSCを含む胎盤細胞の集団における1以上の胚様体の形成を、該集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、該単離されたarPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、例えば濃縮された、単離されたCD73+、CD105+、CD200+ arPSCを含む、細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約70%は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約90%、95%、又は99%は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+ arPSCである。前記集団の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、HLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCはさらに、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-でもある。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養した場合に1以上の胚様体を生じる。別の具体的実施態様では、arPSCの前記集団は、arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、arPSCの前記集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
ある種の他の実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、HLA-G-、又はABC-p+のうちの1以上である。具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、及びOCT-4+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、HLA-G-、SH2+、SH3+、SH4+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びABC-p+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4- arPSCはさらに、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+でもある。別の実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+及びCD34-であり、かつSH3+又はSH4+のいずれかである。別の実施態様では、単離されたarPSCは、CD34-であり、かつ、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、又はOCT-4+のいずれかである。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、CD200+及びOCT-4+である。具体的実施態様では、単離されたarPSCは、CD73+及びCD105+である。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、HLA-G-である。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、該arPSCを含む胎盤細胞の集団による1以上の胚様体の産生を、該集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、前記arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCは、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、例えば濃縮された、CD200+、OCT-4+ arPSCを含む、細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞の少なくとも約70%は、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約80%、90%、95%、又は99%は、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCである。単離された集団の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCはさらにCD73+及びCD105+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCはさらに、HLA-G-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-でもある。別の具体的実施態様では、該細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養した場合に1以上の胚様体を生じる。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、単離されたCD200+、OCT-4+ arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、及びHLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、OCT-4+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+でもある。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCは、前記arPSCを含む胎盤細胞の集団における胚様体の形成を、該集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する。別の具体的実施態様では、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCは、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCは、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、例えば濃縮された、単離されたCD73+、CD105+、及びHLA-G- arPSCを含む、細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約90%、95%、又は99%は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCである。先述の集団の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、OCT-4+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+、HLA-G- arPSCはさらに、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、CD73+、CD105+、HLA-G- arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、CD73+及びCD105+であり、かつ、前記CD73+、CD105+細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1以上の胚様体の形成を、前記集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、OCT-4+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCは、前記細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCは、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD73+、CD105+であり、かつ前記細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1以上の胚様体の形成を、前記集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する、例えば濃縮された、単離されたarPSCを含む、細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%は、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約90%、95%、又は99%は、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCである。先述の集団の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、OCT-4+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、前記単離されたCD73+、CD105+ arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、OCT-4+であり、かつ、前記arPSCを含む単離された胎盤細胞の集団における1以上の胚様体の形成を、前記細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する。具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCさらに、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCは、OCT-4+ arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCは、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、OCT-4+であり、かつ前記細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における1以上の胚様体の形成を、前記集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合に促進する、例えば濃縮された、単離されたarPSCを含む、細胞の集団である。種々の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、前記単離されたOCT-4+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%は、前記単離されたOCT-4+ arPSCである。別の実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約80%、90%、95%、又は99%は、前記単離されたOCT-4+ arPSCである。先述の集団の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD200+でもある。別の具体的実施態様では、前記単離されたOCT-4+ arPSCはさらに、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-でもある。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、前記arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記細胞集団は、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、単離されたHLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34- arPSCである。別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたarPSCを含む細胞の集団であり、ここでは、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%は、単離されたHLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34- arPSCである。具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、HLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34- arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCの前記集団は、母親由来の成分を実質的に含まない;例えば、単離されたarPSCの前記集団における前記細胞の少なくとも約40%、45%、5-0%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133- arPSCである。別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたarPSCを含む細胞の集団であり、ここでは、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%は、単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133- arPSCである。具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、前記単離されたarPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133- arPSCは、母親起源ではない、すなわち、胎児の遺伝子型を有する。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCの前記集団における前記細胞の少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、単離されたCD10+ CD33-、CD44+、CD45-、及びCD117- arPSCである。別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物に有用な細胞集団は、例えば濃縮された、単離されたarPSCを含む、細胞の集団であり、ここでは、前記細胞集団における細胞の少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%は、単離されたCD10+ CD33-、CD44+、CD45-、及びCD117- arPSCである。具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記細胞集団における前記arPSCの少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、これらのマーカーを呈示しない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、単離されたCD10+ CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117- arPSCである。別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、例えば濃縮された、単離されたCD10+、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117- arPSCを含む、細胞の集団であり、ここでは、前記集団における細胞の少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%が、CD10+ CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117- arPSCである。具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、前記arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離された胎盤細胞は、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、HLA A、B、C+、CD45-、CD34-、及びCD133-であり、さらに、CD10+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+及び/又はHLA-G-である、及び/又はCD117について陰性である。別の実施態様では、本明細書に記載する方法において有用な細胞集団は、単離されたarPSCを含む細胞の集団であり、ここでは、前記集団における細胞の少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は約99%は、HLA A,B,C-、CD45-、CD34-、CD133-であり、かつ、さらにCD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200について陽性、及び/又はCD117及び/又はHLA-Gについて陰性である、単離されたarPSCである。具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、前記arPSCではない胎盤細胞から単離される。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記細胞集団における前記arPSCの少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCの集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、抗体結合によって判定される場合にCD200+及びCD10+、並びに抗体結合とRT-PCRとの両方によって判定される場合にCD117-である、単離されたarPSCである。別の実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G-、MHCクラスI+、及びβ-2-ミクログロブリン+である単離された胎盤幹細胞である。別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、少なくとも1つの細胞性マーカーの発現が、同等数の間葉系幹細胞(例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞)よりも少なくとも2倍高いarPSCである。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、母親起源ではない。別の具体的実施態様では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、母親起源ではない。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-カドヘリンlow、CD184/CXCR4-、β2-ミクログロブリンlow、MHC-Ilow、MHC-II-、HLA-Glow、及び/又はPDL1lowのうちの1以上である、単離されたarPSCである。具体的実施態様では、単離されたarPSCは、少なくともCD29+及びCD54+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、少なくともCD44+及びCD106+である。別の具体的実施態様では、単離されたarPSCは、少なくともCD29+である。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたarPSCを含み、前記細胞集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-カドヘリンdim、CD184/CXCR4-、β2-ミクログロブリンdim、HLA-Idim、HLA-II-、HLA-Gdim、及び/又はPDL1dim arPSCのうちの1以上である、単離されたarPSCである。別の具体的実施態様では、前記細胞集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-カドヘリンdim、CD184/CXCR4-、β2-ミクログロブリンdim、MHC-Idim、MHC-II-、HLA-Gdim、及びPDL1dim arPSCである。ある種の実施態様では、arPSCは、インターフェロンガンマ(IFN-γ)によって誘導された場合に、HLA-IIマーカーを発現する。
別の実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCは、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、及びABC-p+(ここでは、ABC-pは、胎盤特異的ABCトランスポータータンパク質(乳癌耐性タンパク質(BCRP)又はミトキサントロン耐性タンパク質(MXR)としても公知である)である)のうちの1以上又はすべてである、単離されたarPSCであり、ここでは、前記単離されたarPSCは、臍帯血が抜かれ、かつ残留した血液を取り除くために灌流されている、哺乳類の、例えばヒトの胎盤の灌流によって得られる胎盤幹細胞由来である。
先述の実施態様のいずれかの別の具体的実施態様では、列挙した細胞性マーカー(1つ又は複数)(例えば、分化又は免疫原性マーカー(1つ又は複数)のクラスター)の発現は、フローサイトメトリーによって判定される。別の具体的実施態様では、これらのマーカー(1つ又は複数)の発現は、RT-PCRによって判定される。
遺伝子プロファイリングによって、単離されたarPSC、及び単離されたarPSCの集団が、他の細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞と識別可能であることが確認される。本明細書に記載する単離されたarPSCは、単離されたarPSCにおけるその遺伝子の発現が、骨髄由来の間葉系幹細胞よりも有意に高い、1以上の遺伝子の発現に基づいて、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞と識別することができる。特に、本明細書で提供する治療の方法において有用な単離されたarPSCは、単離されたarPSCにおけるその遺伝子の発現が、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞よりも有意に高い(すなわち、少なくとも2倍高い)、1以上の遺伝子の発現に基づいて、骨髄由来の間葉系幹細胞と識別することができる。ここでは、この1以上の遺伝子は、細胞を等しい条件下で成長させた場合、
Figure 2016502844
 又は前述のもののいずれかの組み合わせを含む。例えば、その開示の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2007/0275362号を参照のこと。ある種の具体的実施態様では、前記1以上の遺伝子の前記発現は、例えば、RT-PCR、又は例えばU133-Aマイクロアレイ(Affymetrix社)を使用するマイクロアレイ分析によって判定される。
別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、DMEM-LG(例えばGibco社より);2%ウシ胎仔血清(例えばHyclone Labs.社より);1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS);1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA);10-9Mデキサメタゾン(例えばSigma社より);10-4Mアスコルビン酸2-リン酸エステル(例えばSigma社より);上皮成長因子10ng/mL(例えばR&D Systems社より);及び血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(例えばR&D Systems社より)を含む培地中で、何回かの集団倍加、例えば、約3から約35回の集団倍加で培養された場合に、前記1以上の遺伝子を発現する。別の具体的実施態様では、胎盤細胞に特異的な遺伝子は、CD200である。
これらの遺伝子に関する具体的な配列は、GenBankで、受託番号
Figure 2016502844
 (2008年3月付け)で見ることができる。
ある種の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、細胞を等しい条件下で成長させた場合、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、
Figure 2016502844
 のそれぞれを発現する。
具体的実施態様では、arPSCは、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1(1型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節因子);ARTS-1及びLRAP(白血球由来のアルギニンアミノペプチダーゼ);IL6(インターロイキン-6)及びTGFB2(トランスフォーミング成長因子、β2);IL6及びKRT18(ケラチン18);IER3(前初期応答(immediate early response)3)、MEST(中胚葉特異的転写物相同体)及びTGFB2;CD200及びIER3;CD200及びIL6;CD200及びKRT18;CD200及びLRAP;CD200及びMEST;CD200及びNFE2L3(核内因子(赤血球由来2)-様3);又はCD200及びTGFB2を発現する。ここでは、前記骨髄由来の間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤幹細胞が受けた継代数と等しい回数の継代培養を受けている。他の具体的実施態様では、arPSCは、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、ARTS-1、CD200、IL6及びLRAP;ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18及びMEST;CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2;ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2;又はIER3、MEST及びTGFB2を発現する。ここでは、前記骨髄由来の間葉系幹細胞は、前記単離されたarPSCが受けた継代数と等しい回数の継代培養を受けている。
上に言及した遺伝子の発現は、標準の技術によって評価することができる。例えば、遺伝子(1つ又は複数)の配列に基づくプローブを、個々に選択し、従来技術によって構築することができる。この遺伝子の発現を、例えば、1以上の遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、Affymetrix GENECHIP(登録商標)ヒトゲノムU133A 2.0アレイ又はAffymetrix GENECHIP(登録商標)ヒトゲノムU133 Plus 2.0(カリフォルニア州サンタクララ)上で評価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のGenBank受託番号の配列が修正された場合でも評価することができる。何故なら、修正された配列に特異的なプローブを、周知の標準の技術を使用して容易に作製することができるからである。
これらの遺伝子の発現のレベルを使用して、単離されたarPSCの集団の同一性を確認する、又は、細胞の集団が少なくとも複数の単離されたarPSCを含むことを確認する、又は同様のことを行うことができる。その同一性が確認された、単離されたarPSCの集団は、クローン性のもの、例えば、単一の単離されたarPSCから拡大された単離されたarPSCの集団、又はarPSCの混合集団(例えば、複数の単離されたarPSCから拡大された単離されたarPSCを含む細胞の集団、又は本明細書に記載した通りの単離されたarPSCと少なくとも1つの他の型の細胞とを含む細胞の集団)であり得る。
これらの遺伝子の発現のレベルを使用して、単離されたarPSCの集団を選択することができる。例えば、細胞の集団、例えば、クローン的に拡大されたarPSCは、上に列挙した1以上の遺伝子の、該細胞集団由来の試料における発現が、骨髄由来の間葉系幹細胞の同等の集団よりも有意に高い場合に選択することができる。こうした選択は、複数の単離されたarPSC集団由来の集団、その同一性が不明である複数の細胞集団由来の集団などのためのものであり得る。
単離されたarPSCは、前記1以上の遺伝子における(例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞対照における)発現のレベルと比較した場合の、1以上のこうした遺伝子の発現のレベルに基づいて選択することができる。一実施態様では、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞を含む試料における前記1以上の遺伝子の発現のレベルが、対照として使用される。別の実施態様では、ある種の条件下で試験される、単離されたarPSCに対する対照は、前記条件下での骨髄由来の間葉系幹細胞における前記1以上の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。
同様に、アノイキス関連遺伝子の発現を使用して、単離されたarPSCの集団を選択することができる。例えば、細胞の集団、例えば、クローン的に拡大されたarPSCは、1以上のアノイキス関連遺伝子(例えば、本明細書に記載する1以上のアノイキス関連遺伝子)の、該細胞集団由来の試料における発現が、非改変胎盤幹細胞の同等の集団よりも低下する場合に選択することができる。
本明細書に記載する単離されたarPSCは、初代培養において、又は、例えばDMEM-LG(Gibco社)、2%ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-リン酸エステル(Sigma社)、上皮成長因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来成長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含む培地中での増殖中に、先述の特性(例えば、細胞表面マーカー及び/又は遺伝子発現プロファイルの組み合わせ)を示す。
本明細書に開示するarPSCのいずれかのある実施態様では、細胞は、ヒトである。本明細書に開示するarPSCのいずれかのある実施態様では、細胞性マーカー特性又は遺伝子発現特性は、ヒトマーカー又はヒト遺伝子である。
単離されたarPSC、又は単離されたarPSCを含む細胞の集団の、別の具体的実施態様では、前記細胞又は集団は、拡大されている、例えば、少なくとも、又はおよそ、又は多くとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20回継代されているか、又は少なくとも、又はおよそ、又は多くとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、又は40回の集団倍加で増殖されている。前記単離されたarPSC、又は単離されたarPSCを含む細胞の集団の、別の具体的実施態様では、前記細胞又は集団は、初代分離株である。本明細書に開示する単離されたarPSC、又は単離されたarPSCを含む細胞の集団の、別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、胎児起源である(すなわち、胎児の遺伝子型を有する)。
ある種の実施態様では、前記単離されたarPSCは、成長培地(すなわち、増殖を促進するように調合された培地)中での培養中、例えば、成長培地中での増殖中には分化しない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、増殖させるために支持細胞層を必要としない。別の具体的実施態様では、前記単離されたarPSCは、支持細胞層が存在しないというだけの理由で、支持細胞層の非存在下の培養では分化しない。
別の実施態様では、単離されたarPSCは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイによって評価した場合に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)について陽性である。こうしたアッセイは、当技術分野で公知である(例えば、Bostian及びBettsの文献、Biochem.J.,173,787(1978)を参照のこと)。具体的実施態様では、前記ALDHアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとして、ALDEFLUOR(登録商標)(Aldagen社、オレゴン州Ashland)を使用する。具体的実施態様では、arPSCの約3%から約25%が、ALDHについて陽性である。別の実施態様では、前記単離されたarPSCは、ほぼ同じ細胞数の同じ条件下で培養された骨髄由来の間葉系幹細胞の集団よりも少なくとも3倍、又は少なくとも5倍高いALDH活性を示す。
本明細書に記載する単離されたarPSCを含む細胞の集団のいずれかのある実施態様では、細胞の前記集団におけるarPSCは、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まない;例えば、前記集団におけるarPSCの少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、胎児の遺伝子型を有する。本明細書に記載する単離されたarPSCを含む細胞の集団のいずれかのある種の他の実施態様では、前記arPSCを含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まない;例えば、前記集団における細胞の少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、胎児の遺伝子型を有する。
先述の単離されたarPSC、又は単離されたarPSCを含む細胞集団の、いずれかの具体的実施態様では、細胞、例えばすべての細胞、又は前記集団における少なくとも約95%又は約99%の細胞の核型は、正常である。先述のarPSC又は集団又はarPSCのいずれかの別の具体的実施態様では、arPSCは、母親起源ではない。
本明細書に開示する胎盤細胞の実施態様のいずれかの具体的実施態様では、胎盤細胞は、遺伝的に安定であり、正常な倍数染色体数及び正常な核型を示す。
マーカーの先述の組み合わせのいずれかを有する単離されたarPSC又は単離されたarPSCの集団を、任意の比で組み合わせることができる。任意の2種以上の先述の単離されたarPSC集団を組み合わせて、単離されたarPSC集団を形成することができる。例えば、単離されたarPSCの集団は、先に記載したマーカー組み合わせのうちのあるものによって定義される単離されたarPSCの第1の集団と、先に記載したマーカー組み合わせのうちの別のものによって定義される単離されたarPSCの第2の集団とを含むことができる。ここでは、前記第1の集団と第2の集団は、約1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、又は約99:1の比で組み合わせられる。同様に、任意の3種、4種、5種、又はそれ以上の先述の単離されたarPSC又は単離された胎盤幹細胞集団を組み合わせることができる。
本明細書に記載するarPSCを作製するための方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、例えば、酵素的消化若しくは灌流を伴う又は伴わない胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、単離された胎盤幹細胞の集団は、臍帯血が抜かれ、かつ残留した血液を取り除くために灌流されている哺乳類胎盤を灌流すること;前記胎盤を灌流溶液で灌流すること;及び前記灌流溶液を収集すること(ここでは、灌流後の前記灌流溶液は、単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を含む);及び前記細胞集団から前記胎盤幹細胞を単離することを含む方法に従って生じることができる。具体的実施態様では、灌流溶液を、臍帯静脈と臍帯動脈の両方に通過させ、胎盤から浸出した後に収集する。別の具体的実施態様では、灌流溶液を、臍帯静脈に通過させて、臍帯動脈から収集する、又は臍帯動脈に通過させて、臍帯静脈から収集する。
種々の実施態様では、胎盤の灌流から得られる細胞の集団に含有される、本明細書に記載するarPSCを作製するための方法において有用である単離された胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞の前記集団の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は少なくとも99.5%である。別の具体的実施態様では、灌流によって収集される単離された胎盤幹細胞は、胎児細胞及び母親細胞を含む。別の具体的実施態様では、灌流によって収集される単離された胎盤幹細胞は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は少なくとも99.5%、胎児の細胞である。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、灌流によって収集される(単離される)、本明細書に記載するarPSCを作製するための方法において有用である単離された胎盤幹細胞の集団を含む組成物である。ここでは、前記組成物は、胎盤幹細胞を単離するために使用される灌流溶液の少なくとも一部分を含む。
本明細書に記載するarPSCを作製するための方法において有用である単離された胎盤幹細胞の集団は、組織破壊酵素を用いて胎盤組織を消化して、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を得ることと、前記胎盤細胞の残部から複数の胎盤幹細胞を単離すること、又は実質的に単離することによって生じることができる。胎盤の全体又は任意の部分を消化して、本明細書に記載する単離された胎盤幹細胞を得ることができる。具体的実施態様では、例えば、前記胎盤組織は、全胎盤(例えば臍帯を含めて)、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜との組み合わせ、又は前述のもののいずれかの組み合わせであり得る。他の具体的実施態様では、組織破壊酵素は、トリプシン又はコラゲナーゼである。種々の実施態様では、胎盤を消化することによって得られる細胞の集団に含有される単離された胎盤幹細胞は、前記胎盤細胞の集団の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は少なくとも99.5%である。
先に記載した単離されたarPSCの集団、及び単離されたarPSCの集団は一般に、およそ、又は少なくとも、又は多くとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれ以上の単離された胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書に記載する方法及び組成物において有用な単離されたarPSCの集団は、例えば、例えばトリパンブルー排除によって決定される場合に少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%生存可能である単離されたarPSCを含む。
先述の胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の集団(例えば、本明細書に記載するarPSCを産生する方法において有用な非改変胎盤幹細胞、又は本明細書に記載するarPSC、又はこれらの組成物)のいずれかについては、胎盤幹細胞の細胞又は集団は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、又は20回又はそれ以上継代されている、若しくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、又は40回又はそれ以上の集団倍加で拡大されている細胞である、又は該細胞を含むことができる。
先述の胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞集団(例えば、本明細書に記載するarPSCを産生する方法において有用な非改変胎盤幹細胞、又は本明細書に記載するarPSC、又はこれらの組成物)のいずれかの具体的実施態様では、細胞の、又は前記集団における細胞の少なくとも約95%又は約99%の核型は、正常である。先述の胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞集団のいずれか(例えば、本明細書に記載するarPSCを産生する方法において有用な非改変胎盤幹細胞、又は本明細書に記載するarPSC、又はこれらの組成物)の別の具体的実施態様では、細胞、又は該細胞集団内の細胞は、母親起源ではない。
マーカーの先述の組み合わせのいずれかを有する単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団(例えば、本明細書に記載するarPSCを産生する方法において有用な非改変胎盤幹細胞、又は本明細書に記載するarPSC、又はこれらの組成物)を、任意の比で組み合わせることができる。任意の2種以上の先述の胎盤幹細胞集団を単離又は濃縮して、胎盤幹細胞集団を形成することができる。例えば、先に記載したマーカー組み合わせのうちのあるものによって定義される胎盤幹細胞の第1の集団を含む単離された胎盤幹細胞の集団を、先に記載したマーカー組み合わせのうちの別のものによって定義される胎盤幹細胞の第2の集団と組み合わせることができる。ここでは、前記第1の集団と第2の集団は、約1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、又は約99:1の比で組み合わせられる。同様に、任意の3種、4種、5種、又はそれ以上の先述の胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞集団を組み合わせることができる。
先に言及した胎盤幹細胞(例えば、本明細書に記載するarPSCを産生する方法において有用な非改変胎盤幹細胞、又は本明細書に記載するarPSC、又はこれらの組成物)の具体的実施態様では、胎盤幹細胞は、IL-6、IL-8、及び単球走化性タンパク質(MCP-1)を恒常的に分泌する。
先に記載した免疫抑制性の複数のarPSCは、およそ、又は少なくとも、又は多くとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれ以上のarPSCを含むことができる。
ある種の実施態様では、本明細書で提供する方法において有用なarPSCは、1から100ng/mLのVEGFへの4から21日間の曝露後の免疫局在決定によって検出されるCD34を発現しない。別の具体的実施態様では、前記arPSCは、例えばMATRIGEL(商標)などの基材上で、例えば、血管新生因子、例えば血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)又は塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)などの存在下で培養した場合、内皮細胞を出芽又は管様構造を形成するように誘導する。
別の態様では、本明細書で提供するarPSC、又は細胞の集団(例えばarPSCの集団)、又は前記細胞集団における細胞の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、若しくは98%がarPSCである細胞の集団は、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、若しくはガレクチン-1のうちの1以上又はすべてを、例えば、1つ又は複数の細胞が成長する培養培地に分泌する。別の実施態様では、arPSCは、低酸素条件(例えば、約5%未満のO2)下で、正常酸素条件(例えば、約20%又は約21% O2)と比較して増大したレベルのCD202b、IL-8、及び/又はVEGFを発現する。
別の実施態様では、本明細書に記載するarPSC又はarPSCを含む細胞の集団のいずれかは、前記arPSCと接触する内皮細胞の集団における出芽又は管様構造の形成を引き起こすことができる。具体的実施態様では、arPSCは、ヒト内皮細胞と共培養され、これは、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL(商標)などの基材内又は該基材上で、細胞外マトリクスタンパク質(I型及びIV型コラーゲンなど)及び/又は血管新生因子(血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、又は塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)など)の存在下で、少なくとも4日間培養した場合に、出芽又は管様構造を形成する、或いは内皮細胞出芽の形成を助ける。別の実施態様では、本明細書に記載するarPSCを含む細胞の集団のいずれかは、血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、又はインターロイキン-8(IL-8)などの血管新生因子を分泌し、それによって、ヒト内皮細胞が、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL(商標)などの基材内又は該基材上で、I型及びIV型コラーゲンなどの細胞外マトリクスタンパク質の存在下で培養された場合に、出芽又は管様構造を形成するのを誘導することができる。
別の実施態様では、arPSCを含む細胞の先述の集団のいずれかは、血管新生因子を分泌する。具体的実施態様では、該細胞の集団は、血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、及び/又はインターロイキン-8(IL-8)を分泌する。他の具体的実施態様では、arPSCを含む細胞の集団は、1種以上の血管新生因子を分泌し、それによって、ヒト内皮細胞がインビトロ創傷治癒アッセイにおいて遊走するのを誘導する。他の具体的実施態様では、arPSCを含む細胞の集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、又は筋芽細胞の成熟、分化、又は増殖を誘導する。
別の実施態様では、本明細書で提供されるのは、前述の特性のいずれかを含み(例えば、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+であり)、かつ少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子が、同等数の非改変胎盤幹細胞(例えば、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+非改変胎盤幹細胞)における前記アノイキス関連遺伝子の発現のレベルよりも下方調節/阻害される、arPSC及びarPSCの集団である。具体的実施態様では、少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子は、AMIGO1(NCBI GENE ID NO:57463);ARHGAP20(NCBI GENE ID NO:57569);CD38(NCBI GENE ID NO:952);CLCC1(NCBI GENE ID NO:23155);CNTF(NCBI GENE ID NO:1270);ZFP91-CNTF(NCBI GENE ID NO:386607);COX8A(NCBI GENE ID NO:1351);DHX34(NCBI GENE ID NO:9704);FAM175A(NCBI GENE ID NO:NO 51023);MRPS18C(NCBI GENE ID NO:84142);FAM44C(NCBI GENE ID NO:284257);FBP2(NCBI GENE ID NO:8789);FLI1(NCBI GENE ID NO:2313);FREM3(NCBI GENE ID NO:166752);IFIT5(NCBI GENE ID NO:24138);LOC399851(NCBI GENE ID NO:399851);LOC400713(NCBI GENE ID NO:400713);LOC651610(NCBI GENE ID NO:651610);PIGP(NCBI GENE ID NO:51227);SH3TC2(NCBI GENE ID NO:79628);SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515);STAU2(NCBI GENE ID NO:27067) TMEFF1(NCBI GENE ID NO:8577);TMEM217(NCBI GENE ID NO:221468);TMEM79(NCBI GENE ID NO:84283);USHBP1(NCBI GENE ID NO:83878);APH1B(NCBI GENE ID NO:83464);ATP2B2(NCBI GENE ID NO:491);C13orf39(NCBI GENE ID NO:196541);C4orf17(NCBI GENE ID NO:84103);C4orf46(NCBI GENE ID NO:201725);DDX41(NCBI GENE ID NO:51428);DKFZp547J222(NCBI GENE ID NO:84237);FGFR1(NCBI GENE ID NO:2260);FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462);GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771);GP5(NCBI GENE ID NO:2814);IL1RN(NCBI GENE ID NO:3557);KIF24(NCBI GENE ID NO:347240);KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442);LOC100132598(NCBI GENE ID NO:100132598);LOC151760(NCBI GENE ID NO:151760);LOC152024(NCBI GENE ID NO:152024);LOC339833(NCBI GENE ID NO:339833);LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846);LSG1(NCBI GENE ID NO:55341);MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217);PDK3(NCBI GENE ID NO:5165);PELI2(NCBI GENE ID NO:57161);RNF103(NCBI GENE ID NO:7844);SNX31(NCBI GENE ID NO:169166);TXN2(NCBI GENE ID NO:25828);又はXKR7(NCBI GENE ID NO:343702)である。具体的実施態様では、前記arPSCにおいて、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又は10個よりも多い前記アノイキス関連遺伝子が、同等数の非改変胎盤幹細胞(例えば、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+非改変胎盤幹細胞)における前記アノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現のレベルよりも下方調節/阻害される。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子STAU2(NCBI GENE ID NO:27067)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。本明細書でさらに提供されるのは、こうしたarPSCを含む細胞の集団、及びこうしたarPSCを含む組成物である。
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、1、2、3個、又はそれ以上の以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、 (i)1、2、3個、又はそれ以上の以下の胎盤幹細胞アノイキス関連遺伝子:FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、及びSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する;及び(ii)表1に列挙した少なくとも1つの追加のアノイキス関連遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子(1つ又は複数)の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+ arPSCである。本明細書でさらに提供されるのは、こうしたarPSCを含む細胞の集団、及びこうしたarPSCを含む組成物である。
(5.3.3 培養下での成長)
本明細書に記載するarPSCを含めた胎盤細胞の成長は、あらゆる哺乳類細胞については、成長のために選択される特定の培地に、ある程度依存する。本明細書で提供されるarPSCの産生の方法において使用される胎盤幹細胞は、培養中、培養下の基材、例えば組織培養容器(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコーティングプラスチックなど)の表面に接着し、単層を形成する。胎盤幹細胞が接着する基材が存在しない場合(例えば低付着条件下では)、胎盤幹細胞はアノイキスを受け、生存の低下を示す。一方、本明細書に記載するarPSCは、arPSCが接着する基材が存在しない場合(例えば低付着条件下)でもアノイキスを受けないので、非改変胎盤幹細胞と比較して、こうした条件での生存の向上を示す。
具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、低付着条件下でインビトロで培養された場合に、例えば、低付着性の組織培養プレートで培養された場合に、非改変胎盤幹細胞と比較して生存の向上を示す。別の具体的実施態様では、本明細書に記載するarPSCは、低付着条件下でインビボで培養された場合に、例えば、全身的又は局所的に又は細胞が低付着環境中で投与される別の投与方法によって対象に投与された場合に、非改変胎盤幹細胞と比較して、生存の向上を示す。
ある種の実施態様では、低付着条件下で(インビトロ又はインビボで)培養された場合、本明細書に記載するarPSCは、同じ条件下で培養された同等量の非改変胎盤幹細胞と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、又は10倍の生存の向上を示す。ある種の実施態様では、低付着条件下で(インビトロ又はインビボで)培養された場合、本明細書に記載するarPSCは、同じ条件下で培養された同等量の非改変胎盤幹細胞と比較して、1.5倍から2.5倍、2倍から3倍、2.5倍から3.5倍、3倍から4倍、3.5倍から4.5倍、4倍から5倍、5倍から6倍、6倍から7倍、7倍から8倍、8倍から9倍、又は9倍から10倍の生存の向上を示す。別の具体的実施態様では、低付着条件下で(インビトロ又はインビボで)培養された場合、本明細書に記載するarPSCは、同じ条件下で培養された同等量の非改変胎盤幹細胞と比較して、10倍を超える生存の向上を示す。arPSC及び非改変胎盤幹細胞の生存は、当技術分野で公知の方法、例えば、トリパンブルー排除アッセイ、二酢酸フルオレセイン取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ;チミジン取込みアッセイ、及びMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを使用して評価することができる。
(5.4 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を作製する方法に使用するための胎盤幹細胞を得る方法)
(5.4.1 幹細胞収集組成物)
本明細書に記載するarPSCを作製する方法に使用するための胎盤幹細胞は、本明細書で提供される方法に従って、収集及び単離することができる。一般に、胎盤幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば、幹細胞収集組成物を使用して、哺乳類胎盤から得られる。幹細胞収集組成物は、関連する米国特許出願公開第20070190042号に詳細に記載されている。
幹細胞収集組成物は、幹細胞の収集及び/又は培養に適した任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、塩類溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル溶液、0.9% NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、HDMEM、など)などを含むことができる。
幹細胞収集組成物は、収集時から培養時まで胎盤幹細胞を保存するのに(すなわち、胎盤幹細胞が死滅するのを防止する、胎盤幹細胞の死を遅らせる、又は死滅する細胞集団における胎盤幹細胞の数を減少させるなどに)役立つ1種以上の成分を含むことができる。こうした成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤);血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ジチオカルバミン酸ピロリジン、又はクロナゼパム);TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬パーフルオロカーボン(例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミドなど)であり得る。
幹細胞収集組成物は、1種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。こうした酵素としては、限定はされないが、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられる。
幹細胞収集組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある種の非限定的な実施態様では、抗生物質は、マクロライド(例えばトブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、若しくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えばペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様では、抗生物質は、グラム陽性及び/又はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性である。
幹細胞収集組成物はまた、次の化合物のうちの1以上も含むことができる:アデノシン(約1mMから約50mM);D-グルコース(約20mMから約100mM);マグネシウムイオン(約1mMから約50mM);一実施態様では、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の巨大分子(例えば、約25g/lから約100g/l又は約40g/lから約60g/lで存在する合成の又は天然に存在するコロイド、デキストラン若しくはポリエチレングリコールなどの多糖類);酸化防止剤(例えば、約25μMから約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、若しくはビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mMから約5mMで存在するN-アセチルシステイン);カルシウムの細胞への流入を防止する薬剤(例えば、約2μMから約25μMで存在するベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約0.05g/Lから約0.2g/L);一実施態様では、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000単位/lから約100,000単位/lの濃度で存在するヘパリン若しくはヒルジン);又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μMから約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、若しくはイソブチルアミロライド)。
(5.4.2 胎盤の収集及び取扱い)
一般に、ヒト胎盤は、出産後、娩出の直後に回収される。好ましい実施態様では、胎盤は、インフォームドコンセントの後、かつ、患者の全病歴を取得してその胎盤と関連付けた後に、患者から回収される。この病歴は、分娩後も継続することが好ましい。こうした病歴を使用して、胎盤又は胎盤から回収される幹細胞のその後の使用を調整することができる。例えば、ヒト胎盤細胞は、その病歴を踏まえて、その胎盤と関係がある乳児のための、又はその乳児の両親、兄弟姉妹、若しくは他の血縁者のための個別化医療目的で使用することができる。
胎盤幹細胞の回収の前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。ある種の実施態様では、分娩後に、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血回収プロセスにかけることができる。一般的に、針又はカニューレを使用し、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号;Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照のこと)。針又はカニューレを通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかに揉んで、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。こうした臍帯血回収は、例えば、LifeBank社(ニュージャージー州Cedar Knolls)、ViaCord、Cord Blood Registry and Cryocellによって商業的に実施することもできる。臍帯血回収中の組織破壊が最小限になるように、さらなる操作を行わずに、胎盤を重力によって排出させることが好ましい。
一般的に、臍帯血の回収及び幹細胞の収集(例えば灌流若しくは組織分離による)のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば実験室に輸送する。胎盤は、滅菌した断熱輸送装置(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)に入れて、例えば、臍帯の近位部をクランプした胎盤を、滅菌したジップロック式プラスチックバッグに入れ、次いで、これを断熱容器に入れることによって、輸送することが好ましい。別の実施態様では、胎盤は、実質的に、2005年9月19日に出願された係属中の米国特許出願第11/230,760号に記載されている通りの臍帯血収集キットに入れて輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の4から24時間後に実験室に移送される。ある種の実施態様では、臍帯血回収前に、胎盤盤状部(placental disc)への付着点から好ましくは4〜5cm(センチメートル)以内のところで、臍帯近位部がクランプされる。他の実施態様では、臍帯近位部は、臍帯血回収後、ただし、胎盤のさらなる処理前にクランプされる。
胎盤は、胎盤幹細胞収集前に、滅菌条件下、かつ室温又は5から25℃(摂氏)の温度のいずれかで保管することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を取り出す前に、胎盤を、48時間よりも長い期間、好ましくは4から24時間の期間、保管することができる。胎盤は、5から25℃(摂氏)の温度で、抗凝血剤溶液に入れて保管することが好ましい。適切な抗凝血剤溶液は、当技術分野で周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施態様では、抗凝血剤溶液は、ヘパリンの溶液(例えば、1:1000溶液中、1%w/w)を含む。放血された胎盤は、胎盤細胞が収集される前に、最大で36時間保管されることが好ましい。
哺乳動物の胎盤又はその一部は、いったん、一般に先述の通りに収集及び調製されれば、当技術分野で公知の任意の方式で処理する、例えば、灌流又は破壊(例えば1種以上の組織破壊酵素で消化)して、幹細胞を得ることができる。
(5.4.3 胎盤組織の物理的破壊及び酵素的消化)
一実施態様では、例えば、先に記載した幹細胞収集組成物を使用して、器官の物理的破壊、例えば酵素的消化によって、哺乳類胎盤から胎盤幹細胞を収集する。例えば、胎盤又はその一部を、例えば緩衝液、培地、又は幹細胞収集組成物と接触させながら、例えば、圧搾する、剪断する、細かく切り刻む、さいの目状に切る、みじん切りにする、又は液体に浸して柔らかくするなどを行うことができ、続いて、その組織を1種以上の酵素で消化することができる。胎盤又はその一部はまた、物理的に破壊及び1種以上の酵素で消化し、次いで、得られた材料を、緩衝液、培地、又は幹細胞収集組成物に浸す又は混ぜることができる。例えばトリパンブルー排除によって決定される、前記器官中の生存可能な細胞の、複数、より好ましくは過半数、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%が、その破壊の方法によって残存するという条件で、物理的破壊の任意の方法を使用することができる。
一般的に、胎盤細胞は、胎盤組織の小さなブロック(例えば、体積が約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は約1000立方ミリメートルである胎盤組織のブロック)の破壊によって得ることができる。
酵素的消化は、単一の酵素又は酵素の組み合わせを使用して実施することができる。一実施態様では、胎盤組織の酵素的消化は、マトリクスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びヒアルロン酸消化のための粘液溶解酵素の組み合せ(例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの組み合せ、又はLIBERASE(Boehringer Mannheim社、インディアナ州Indianapolis)及びヒアルロニダーゼの組み合せなど)を使用する。胎盤組織を破壊するために使用することができる他の酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなどが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによって阻害されることがあるので、消化のために使用される培地は通常、無血清である。細胞回収の効率を高めるために、EDTA及びDNアーゼが、酵素的消化手順において一般的に使用される。粘性の消化産物内に幹細胞が捕捉されることを避けるために、消化残渣を希釈することが好ましい。
組織消化酵素の典型的な濃度としては、例えば、コラゲナーゼI及びコラゲナーゼIVの50〜200U/mL、ディスパーゼの1〜10U/mL、及びエラスターゼの10〜100U/mLが挙げられる。胎盤細胞を遊離させるために、プロテアーゼを、組み合わせて、すなわち2種以上のプロテアーゼを同一の消化反応で使用することもできるし、連続的に使用することもできる。例えば、一実施態様では、胎盤又はその一部を、最初に2mg/mlの適量のコラゲナーゼIで30分間消化し、続いて、0.25％トリプシンで37℃で10分間消化する。セリンプロテアーゼを、他の酵素の使用後に続けて使用することが好ましい。
別の実施態様では、幹細胞収集組成物を用いて胎盤幹細胞を単離する前に、幹細胞を含む幹細胞収集組成物に、又はその中で組織を破壊及び/又は消化する溶液に、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N'N'-四酢酸(EGTA)又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加することによって、組織をさらに破壊することができる。
胎児細胞と母親細胞の両方を含む胎盤全体又は胎盤の一部分(例えば、胎盤の一部分が、絨毛膜又は胎盤葉を含む場合)が消化されて胎盤幹細胞が得られる場合、収集される胎盤細胞は、胎児起源と母親起源の両方に由来する胎盤細胞の混合物を含むこととなることを理解されたい。母親細胞(例えば羊膜)を全く含まない又は無視できる数しか含まない胎盤の一部分が使用されて胎盤幹細胞が得られる場合、収集される胎盤幹細胞は、ほとんど胎児性胎盤幹細胞だけを含むこととなる。
(5.4.4 胎盤の灌流)
胎盤幹細胞はまた、哺乳類胎盤の灌流によって得ることもできる。哺乳類胎盤を灌流して幹細胞を得る方法は、例えば、Haririの米国特許出願第2002/0123141号に、及び2005年12月29日に出願された「胎盤細胞を収集及び保存するための改善された組成物並びに該組成物を使用する方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Cells and Methods of Using the Composition)」という表題の関連する米国特許仮出願第60/754,969号に開示されている。
胎盤幹細胞は、灌流によって、例えば、例えば灌流溶液として幹細胞収集組成物を使用して胎盤血管系を通して収集することができる。一実施態様では、哺乳類胎盤は、臍帯動脈と臍帯静脈のいずれか又は両方への灌流溶液の通過によって灌流される。胎盤への灌流溶液の流れは、例えば、胎盤への重力による流れを使用して実現することができる。好ましくは、灌流溶液は、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを使用して胎盤に押し出される。例えば、臍帯静脈には、滅菌した管などの滅菌した接続器具と接続されたカニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニューレを挿入することができる。滅菌した接続器具は、灌流マニフォールドと接続される。
灌流に備えて、胎盤は、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に位置するように方向付けられる(例えば吊るされる)ことが好ましい。胎盤は、胎盤血管系への、又は胎盤血管系と周囲組織への、灌流流体、例えば、本明細書で提供される幹細胞収集組成物の通過によって灌流することができる。一実施態様では、臍帯動脈と臍帯静脈が、柔軟なコネクタを介して灌流溶液の貯蔵容器に接続されたピペットに、同時に接続される。灌流溶液は、臍帯静脈及び臍帯動脈を通過する。灌流溶液は、血管壁から浸出して及び/又は血管壁を通過して胎盤の周囲組織に至り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から、適切な開放管中に収集される。灌流溶液はまた、臍帯開口部を通して導入し、母親の子宮壁と接続している胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。別の実施態様では、灌流溶液を、臍帯静脈に通過させて、臍帯動脈から収集する、又は、臍帯動脈に通過させて、臍帯静脈から収集する。
一実施態様では、臍帯近位部が、灌流中にクランプされ、より好ましくは、胎盤盤状部への臍帯付着点から好ましくは4〜5cm(センチメートル)以内のところで、臍帯近位部がクランプされる。
放血プロセス中の哺乳類胎盤からの灌流流体の最初の収集物は一般に、臍帯血及び/又は胎盤血の残留赤血球により色が付いており;灌流液のこの部分は廃棄してもよい。灌流が進み、残留した臍帯血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、灌流流体は、より無色になっていく。
胎盤幹細胞を収集するために使用される灌流液の体積は、収集される胎盤幹細胞の数、胎盤の大きさ、単一の胎盤でなされる収集の回数などに応じて変動し得る。種々の実施態様では、灌流液の体積は、50mLから5000mL、50mLから4000mL、50mLから3000mL、100mLから2000mL、250mLから2000mL、500mLから2000mL、又は750mLから2000mLであり得る。一般的に、胎盤は、放血後、700〜800mLの灌流液を用いて灌流される。
胎盤は、数時間から数日間にわたって、複数回灌流することができる。胎盤は、複数回灌流されることとなる場合、容器又は他の適切な管内で、無菌条件下で維持又は培養し、幹細胞収集組成物、又は標準の灌流溶液(例えばリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)(抗凝血剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)を含む又は含まない、及び/又は抗微生物剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM);ストレプトマイシン(例えば40〜100μg/ml)、ペニシリン(例えば40U/ml)、アンホテリシンB(例えば0.5μg/ml)などの抗生物質を含む又は含まない)などの通常の塩類溶液)を用いて灌流することができる。一実施態様では、単離された胎盤は、灌流液を収集せずに、ある期間維持又は培養され、その結果、該胎盤は、灌流及び灌流液の収集前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24時間、又は2若しくは3日又はそれ以上の間、維持又は培養されることになる。灌流された胎盤は、さらにもう1回以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、又はそれ以上の間、維持し、例えば700〜800mLの灌流流体を用いて、再び灌流することができる。胎盤は、1、2、3、4、5回、又はそれ以上の回数、例えば、1、2、3、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様では、回収される有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで、胎盤の灌流と、灌流溶液、例えば幹細胞収集組成物の収集が繰り返される。異なる時点での灌流液を、さらに個別に処理して、時間に応じた胎盤幹細胞の集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。
いかなる理論にも拘泥されることを望まないが、胎盤の放血及び十分な時間の灌流の後、胎盤幹細胞は、好ましくは灌流による収集管への洗浄によって胎盤幹細胞が収集可能であるような、放血されかつ灌流された胎盤の微小循環に移動すると考えられる。単離された胎盤を灌流することは、残留臍帯血を除去するだけではなく、胎盤に酸素を含めた適切な栄養を提供するためにも役立つ。胎盤は、好ましくは抗凝血剤を添加しない、残留臍帯血細胞を除去するために使用した溶液と同様の溶液を用いて、培養及び灌流することができる。
幹細胞は、1種以上のプロテアーゼ又は他の組織破壊酵素を含む溶液を用いる灌流によって、胎盤から単離することができる。具体的実施態様では、胎盤又はその一部分を25〜37℃に置き、200mLの培養培地中で1種以上の組織破壊酵素とともに、30分間インキュベートする。灌流液由来の細胞を収集し、4℃に置き、5mM EDTA、2mMジチオスレイトール、及び2mMβ-メルカプトエタノールを含む冷たい阻害剤混合物で洗浄する。数分後、胎盤幹細胞を、本明細書別所記載の冷たい(例えば4℃の)幹細胞収集組成物で洗浄する。
受け皿法(pan method)を使用する灌流、すなわち、灌流液が胎盤の母親側から浸出した後に収集される灌流は、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらす。その結果、この方法によって収集された細胞は、胎児起源と母親起源の両方の胎盤幹細胞の混合集団を含む。一方、灌流流体が1つ又は2つの胎盤血管を通過し、単に残りの血管を通して収集される、胎盤血管系を通しただけの灌流は、ほとんどが胎児起源である胎盤幹細胞の集団の収集という結果になる。
(5.4.5 胎盤細胞の単離、選別、及び特徴付け)
哺乳類胎盤由来の幹細胞は、灌流によって得られても、酵素的消化で得られても、最初に、フィコール勾配遠心分離によって他の細胞から精製(すなわち単離)することができる。こうした遠心分離は、遠心分離速度などについて、任意の標準のプロトコルに従うことができる。一実施態様では、例えば、胎盤から収集された細胞は、室温で15分間の5000×gでの遠心分離(これによって、細胞は、例えば、余計な破砕片及び血小板から分離される)によって灌流液から回収される。別の実施態様では、胎盤灌流液は、約200mlに濃縮され、Ficoll上に穏やかに層形成され、22℃で20分間、約1100×gで遠心分離され、細胞の低密度界面層が、さらなる処理のために収集される。
細胞ペレットを、新鮮な幹細胞収集組成物、又は幹細胞維持に適した培地、例えば、2U/mlヘパリン及び2mM EDTA(GibcoBRL社、NY)を含有するIMDM無血清培地に再懸濁することができる。例えば、製造者の推奨手順に従ってLymphoprep(Nycomed Pharma社、ノルウェー、Oslo)を使用して、全単核細胞分画を単離することができる。
本明細書で使用する場合、胎盤幹細胞を「単離すること」は、無処置の哺乳類胎盤において胎盤幹細胞が通常関係する細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%を取り出すことを意味する。
灌流又は消化によって得られる胎盤幹細胞を、例えば0.2％EDTA(Sigma社、ミズーリ州St.Louis)を含む0.05％トリプシンの溶液を使用する、差異的なトリプシン処理によって、例えば、更に又は最初に単離することができる。他の接着性の集団が一般的に、20〜30分間を超えるインキュベーションを必要とするのに対し、胎盤幹細胞は一般的に、約5分以内にプラスチック表面から剥離するので、差異的なトリプシン処理が可能である。トリプシン処理、及び例えばトリプシン中和溶液(TNS、Cambrex社)を使用するトリプシン中和後、剥離した胎盤幹細胞を回収することができる。
胎盤幹細胞の単離の一実施態様では、胎盤細胞の一定分量、例えば約5〜10×106個を、いくつかのT-75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンコーティングT75フラスコのそれぞれに入れる。こうした一実施態様では、これらの細胞を、市販品として入手可能な間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)(Cambrex社)を用いて培養し、組織培養インキュベータ(37℃、5％CO2)内に入れることができる。10から15日後、PBSで洗浄することによって、接着していない細胞をフラスコから取り出す。次いで、PBSをMSCGMで置き換える。フラスコを、様々な接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞様細胞のクラスターの同定及び拡大について、毎日検査することが好ましい。
哺乳類胎盤から収集された細胞の数と種類は、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的な抗体若しくは細胞マーカー特異的抗体を用いる染色)、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)などの標準の細胞検出技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、及び/又は光学顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡法を使用する細胞の形態の調査によって、及び/又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当技術分野で周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって、モニタリングすることができる。これらの技術を、1以上の特定のマーカーについて陽性である細胞を特定するためにも使用することができる。例えば、CD34に対する抗体を使用して、先述の技術を使用して、細胞が、例えばアイソタイプ対照と比較した場合に、検出可能な量のCD34を含むかどうかを判定することができ;もし含むのであれば、その細胞はCD34+である。同様に、細胞が、RT-PCRによって検出可能であるのに十分なOCT-4 RNA、又は高度に分化した細胞よりも有意に多いOCT-4 RNAを産生するならば、その細胞は、OCT-4+である。細胞表面マーカー(例えば、CD34などのCDマーカー)に対する抗体、及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野で周知である。
胎盤細胞、特に、フィコール分離、接着の差異、又はこれらの両方の組合せによって単離された細胞を、選別する、例えば、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてさらに単離することができる。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含めた粒子を分離するための、周知の方法である(Kamarchの文献、1987、Methods Enzymol,151:150-165)。個々の粒子中の蛍光部分のレーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁分離が可能になる。一実施態様では、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドは、別々の蛍光標識で標識される。細胞は、細胞選別機を通して処理され、使用される抗体に結合する能力に基づく細胞の分離が可能になる。FACSで選別された粒子を、96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接堆積させて、分離及びクローニングを行いやすくすることができる。
ある選別スキームでは、胎盤幹細胞を、マーカーCD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4、及び/又はHLA-G、又は本明細書別所に列挙した他のマーカーのいずれかの発現に基づいて選別することができる。これは、幹細胞を培養下でのその接着特性に基づいて選択する手順と組み合わせて実現することができる。例えば、胎盤幹細胞の接着選択は、マーカー発現に基づく選別の前又は後に行うことができる。一実施態様では、例えば、胎盤幹細胞が、最初にそのCD34発現に基づいて選別され;CD34-細胞が保持され、CD200+又はHLA-G+である細胞が、他の全てのCD34-細胞から分離される。別の実施態様では、胎盤幹細胞を、そのCD200及び/又はHLA-Gの発現又はその欠如に基づいて選別することができ;例えば、これらのマーカーのいずれかを提示する細胞を、さらなる使用のために単離することができる。例えばCD200及び/又はHLA-Gを発現する細胞を、具体的実施態様では、そのCD73及び/又はCD105、又は抗体SH2、SH3、若しくはSH4によって認識されるエピトープの発現、或いはCD34、CD38、又はCD45の発現の欠如に基づいて、さらに選別することができる。例えば、一実施態様では、胎盤幹細胞が、CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38、及びCD45の発現又はその欠如によって選別され、CD200+、HLA-G-、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-、及びCD45-である胎盤幹細胞が、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、磁気ビーズを使用して、細胞を分離する、例えば、胎盤幹細胞を他の胎盤細胞から分離することができる。磁気活性化細胞選別(MACS)技術、すなわち、磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)に結合する能力に基づいて粒子を分離するための方法を使用して、細胞を選別することもできる。磁気ミクロスフェアに対して、特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含めた、様々な有用な改変を行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合し、結合させる。次いで、細胞を磁場に通過させて、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様では、次いで、この細胞を単離し、追加的な細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。この細胞を再び磁場に通過させて、両方の抗体と結合した細胞を単離する。次いで、こうした細胞を、クローン単離用のマイクロタイターディッシュなどの別々のディッシュで希釈することができる。
胎盤幹細胞はまた、細胞形態及び成長特性に基づいて、特徴付ける及び/又は選別することもできる。例えば、胎盤幹細胞を、例えば培養下で線維芽細胞様外観を有するものと特徴付ける、及び/又はこうした外観に基づいて選択することができる。胎盤幹細胞はまた、胚様体を形成する能力を有するものと特徴付ける、及び/又はこうした能力に基づいて選択することもできる。一実施態様では、例えば、線維芽細胞様の形状であり、かつCD73及びCD105を発現し、かつ培養下で1以上の胚様体を産生する胎盤細胞を、他の胎盤細胞から単離することができる。別の実施態様では、培養下で1以上の胚様体を産生するOCT-4+胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。
別の実施態様では、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイによって特定及び特徴付けを行うことができる。コロニー形成単位アッセイは、当技術分野で一般的に公知である(例えば、Mesen Cult(商標)培地(Stem Cell Technologies社、ブリティッシュコロンビア州Vancouver)など)。
胎盤幹細胞は、(生存能力を評価するための)トリパンブルー排除アッセイ、二酢酸フルオレセイン取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ;及び、(増殖を評価するための)チミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイなど、当技術分野で公知の標準の技術を使用して、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどによって決定することができる。
胎盤幹細胞はまた、当該技術分野で公知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長(陽性選択)、所望でない細胞の選択的破壊(陰性選択);例えば大豆凝集素を用いる、混合集団における細胞凝集力の差異に基づく分離;凍結-解凍処置;濾過;従来のゾーン遠心分離;遠心溶出(向流遠心分離);単位重力分離;向流分配;電気泳動;などを使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
(5.5 胎盤幹細胞の培養)
(5.5.1 培養培地)
本明細書に記載するarPSCを含めた胎盤幹細胞は、幹細胞の培養のために許容し得ると当技術分野で認識されている、任意の培地中かつ任意の条件下で培養することができる。ある種の実施態様では、この培養培地は、血清を含む。ある種の実施態様では、本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞は、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン)、LA＋BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有するDMEM-LG(ダルベッコの改変必須培地、低グルコース)/MCDB 201(ニワトリ線維芽細胞基本培地);10％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM-HG(高グルコース);15％FBSを含むDMEM-HG;10％FBS、10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフの改変ダルベッコ培地);10％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199;10％FBS、GlutaMAX(商標)、及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地);10％FBS、GlutaMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むDMEMなどの中で培養することができる。好ましい培地は、2％FBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含む、DMEM-LG/MCDB-201である。
本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞を培養するために使用することができる他の培地としては、DMEM(高又は低グルコース)、イーグルの基本培地、ハムのF10培地(F10)、ハムのF-12培地(F12)、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)、ライボヴィッツのL-15培地、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、改良DMEM(Gibco社)、DMEM/MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GRO FREEが挙げられる。
培養培地には、例えば、血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは約2〜15％(v/v);ウマ科動物(ウマ)血清(ES);ヒト血清(HS));β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは約0.001％(v/v);1種以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮成長因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO);L-バリンを含めたアミノ酸;並びに、例えばペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための1種以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤;を含めた1種以上の成分を、単独で又は組み合わせで補足することができる。
(5.5.2 胎盤幹細胞の拡大及び増殖)
本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞を、いったん単離(例えば、該幹細胞又は幹細胞の集団が通常インビボで関係している胎盤細胞の少なくとも50%から分離)すれば、この幹細胞又は幹細胞の集団を、インビトロで増殖及び拡大させることができる。例えば、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞をいったん産生すれば、こうした細胞を、インビトロで増殖及び拡大させることもできる。本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞は、組織培養容器、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、胎盤幹細胞が70〜90%コンフルエントに増殖するのに十分な時間、すなわち、胎盤幹細胞及びその子孫が組織培養容器の培養表面積の70〜90％を占めるようになるまで培養することができる。
本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞を、細胞成長を可能にする密度で、培養管内に播種することができる。例えば、胎盤幹細胞を、低密度(例えば約1,000から約5,000細胞/cm2)ないし高密度(例えば約50,000細胞/cm2又はそれ以上)で播種することができる。好ましい実施態様では、胎盤幹細胞は、空気中の約0から約5体積パーセントのCO2下で培養される。いくつかの好ましい実施態様では、胎盤幹細胞は、空気中の約2から約25パーセントのO2下で、好ましくは空気中の約5から約20パーセントのO2下で培養される。胎盤幹細胞は、約25℃から約40℃、好ましくは37℃で培養されることが好ましい。胎盤幹細胞は、インキュベータ内で培養されることが好ましい。培養培地は、静置する、又は、例えばバイオリアクターを使用して撹拌することができる。胎盤幹細胞は、(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステインなどを添加して)低酸化ストレス下で成長させることができる。
いったん、70〜90%コンフルエントが得られれば、本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞を継代することができる。例えば、この細胞を、当技術分野で周知の技術を使用して、酵素的に処理し、例えばトリプシン処理し、組織培養表面から分離することができる。この胎盤幹細胞をピペッティングによって取り出し、計数した後、約20,000〜100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の胎盤幹細胞を、新鮮な培養培地を含有する新しい培養容器に継代する。一般的に、新しい培地は、幹細胞を取り出した培地と同じ種類である。本明細書で提供されるのは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、若しくは20回、又はそれ以上の回数継代した、本明細書に記載するasPSCを含めた胎盤幹細胞の集団、及び該胎盤幹細胞の集団の組み合わせである。
(5.6 アノイキス抵抗性胎盤細胞の保存)
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、保存する、すなわち、長期保管を可能にする条件、又は例えばアポトーシス又は壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、例えば、2005年12月25日に出願された「胎盤細胞を収集及び保存するための改善された組成物並びに該組成物を使用する方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Cells and Methods of Using the Composition)」という表題の関連する米国特許仮出願第60/754,969号に記載されている通りの、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び/又は酸素運搬パーフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。
一実施態様では、本明細書で提供されるのは、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を保存する方法であって、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボンを含む幹細胞収集組成物と接触させることを含む前記方法である。ここでは、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していないアノイキス抵抗性胎盤幹細胞の集団と比較した場合に、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の集団におけるアポトーシスを低下させる又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様では、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的実施態様では、前記アポトーシス阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様では、前記JNK阻害剤は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様では、前記幹細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤と前記酸素運搬パーフルオロカーボンを別の相に含む。別の実施態様では、前記幹細胞収集組成物は、エマルジョン中に、前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬パーフルオロカーボンを含む。別の実施態様では、該幹細胞収集組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施態様では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細胞と接触させる時点で、約0℃から約25℃である。より具体的な別の実施態様では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細胞と接触させる時点で、約2℃から10℃又は約2℃から約5℃である。より具体的な別の実施態様では、前記接触は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の輸送中に実施される。より具体的な別の実施態様では、前記接触は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の集団の凍結及び解凍中に実施される。
別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞をアポトーシス阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることを含む方法によって保存することができる。ここでは、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していないアノイキス抵抗性胎盤幹細胞と比較した場合に、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞のアポトーシスを低下させる又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様では、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されており;ViaSpanとしても知られている;Southardらの文献(Transplantation 49(2):251-257(1990))も参照のこと)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液である。別の実施態様では、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組み合わせである。
別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される胎盤幹細胞は、灌流中に、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はこれらの組合せを含む幹細胞収集組成物と接触される。別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される前記胎盤幹細胞は、組織破壊のプロセス、例えば酵素的消化中に接触される。別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される胎盤細胞は、灌流による収集後に、又は組織破壊、例えば酵素的消化による収集後に、前記幹細胞収集化合物と接触される。
一般的に、胎盤幹細胞の収集、濃縮、及び単離中には、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限にする又は排除することが好ましい。したがって、該方法の別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される胎盤幹細胞は、収集、濃縮、又は単離中、前記保存中に6時間未満の低酸素状態に曝される。ここでは、低酸素条件は、正常な血中酸素濃度未満である酸素の濃度である。より具体的な実施態様では、前記胎盤幹細胞は、前記保存中に2時間未満の前記低酸素状態に曝される。より具体的な別の実施態様では、前記胎盤幹細胞は、1時間未満若しくは30分未満の前記低酸素状態に曝される、又は、収集、濃縮、及び単離中に、低酸素状態には曝されない。別の具体的実施態様では、収集、濃縮、又は単離中に、前記胎盤幹細胞は、剪断ストレスに曝されない。
本明細書に記載する、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞、並びにアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生するために使用される胎盤幹細胞は、例えば、小型の容器、例えばアンプル中の凍結保存培地に入れて凍結保存することができる。適切な凍結保存培地としては、限定はされないが、例えば、成長培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販品として入手できる細胞凍結培地(例えば、C2695、C2639、若しくはC6039(Sigma社))を含めた培養培地が挙げられる。凍結保存培地は、例えば約10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)を含むことが好ましい。凍結保存培地は、追加の物質、例えば、Plasmalyte、メチルセルロースを含むことができ、グリセロールは含んでも含まなくてもよい。幹細胞は、凍結保存時に、約1℃/分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃から約-180℃、好ましくは約-125℃から約-140℃である。凍結保存された細胞は、液体窒素に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様では、例えば、アンプルがいったん約-90℃に到達したら、液体窒素保管エリアに移す。凍結保存された細胞は、約25℃から約40℃、好ましくは約37℃の温度で解凍することが好ましい。ある種の実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、調節性RNA分子と接触(例えばトランスフェクション)させてから約12、24、36、48、60、又は72時間後に凍結保存される。一実施態様では、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、調節性RNA分子と接触(例えばトランスフェクション)させてから約24時間後に凍結保存される。
（5.7 組成物）
(5.7.1 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む組成物)
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む組成物である。こうした組成物は、例えば研究又は治療に使用するための任意の生理的に許容し得る又は医学的に許容し得る化合物、組成物、又は装置と組み合わせて、本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞の集団を含むことができる。
(5.7.1.1 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の凍結保存)
本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を、後で使用するために保存する、例えば凍結保存することができる。幹細胞などの細胞の凍結保存のための方法は、当技術分野で周知である。アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、個人に容易に投与できる形で調製することができる。例えば、本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、医療用途に適した容器内に入れることができる。こうした容器は、例えば、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、バイアル、又は胎盤細胞集団を容易に分注することができる他の容器であり得る。例えば、容器は、血液バッグ、又はレシピエントへの液体の静脈内投与に適した他のプラスチック製の医学的に許容し得るバッグであり得る。容器は、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の凍結保存を可能にするものであることが好ましい。
凍結保存されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞集団は、単一のドナー又は複数のドナーに由来するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むことができる。該アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが適合するものであっても、部分的若しくは完全にHLAが適合しないものであってもよい。
したがって、一実施態様では、本明細書で提供されるのは、容器に入った、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む組成物である。具体的実施態様では、該アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、凍結保存される。別の具体的実施態様では、該容器は、バッグ、フラスコ、バイアル又はジャーである。より具体的な実施態様では、前記バッグは、滅菌プラスチックバッグである。より具体的な実施態様では、前記バッグは、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の静脈内投与に適している、又は該投与を可能にする、又は該投与を容易にする。該バッグは、投与前又は投与中に、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞と1種以上の他の溶液(例えば薬物)との混合を可能にするために相互接続された、複数の内腔又は区画を含むことができる。別の具体的実施態様では、該組成物は、組み合わされた幹細胞集団の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の具体的実施態様では、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、生理的に許容し得る水溶液内に含まれる。より具体的な実施態様では、前記生理的に許容し得る水溶液は、0.9% NaCl溶液である。別の具体的実施態様では、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞のレシピエントとHLAが適合する。別の具体的実施態様では、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞のレシピエントと、少なくとも部分的にHLAが適合しない。別の具体的実施態様では、前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、複数のドナー由来の胎盤幹細胞由来である。
(5.7.1.2 医薬組成物)
別の態様では、本明細書で提供されるのは、炎症要素を有する疾患、障害、又は状態を有する、又は発症するリスクがある個人を治療するための医薬組成物であって、治療有効量のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む前記医薬組成物である。
本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、インビボでの使用のための医薬組成物に製剤化することができる。こうした医薬組成物は、医薬として許容し得る担体、例えば、塩類溶液、又はインビボ投与のための他の認可された生理的に許容し得る溶液中に、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞のいずれかを含むことができる。該医薬組成物は、胎児の、母親の、又は胎児と母親の両方のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の個人若しくは胎盤から又は複数の個人若しくは胎盤から得られた胎盤幹細胞から産生されたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞をさらに含むことができる。
本明細書で提供される医薬組成物は、任意の数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むことができる。例えば、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の単回単位用量は、種々の実施態様では、およそ、又は少なくとも、又は多くとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれ以上のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むことができる。
本明細書で提供される医薬組成物は、50%又はそれ以上の生存可能なアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む(すなわち、集団における細胞の少なくとも50%が、機能している又は生きている)アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の集団を含むことができる。好ましくは、集団における細胞の少なくとも60%が、生存可能である。より好ましくは、該医薬組成物内の集団におけるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞の少なくとも70%、80%、90%、95%、又は99%が、生存可能である。
(5.7.1.3 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むマトリクス)
本明細書でさらに提供されるのは、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むマトリクス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどである。本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、天然のマトリクス、例えば、羊膜材料などの胎盤生体材料に播種することができる。こうした羊膜材料は、例えば、哺乳類胎盤から直接的に切開された羊膜;固定された又は加熱処理された羊膜、実質的に乾燥している(すなわち、＜20％H2Oの)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜と絨毛膜などであり得る。アノイキス抵抗性胎盤細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、Haririの米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている。
本明細書で提供されるアノイキス抵抗性胎盤細胞は、例えば注射に適したヒドロゲル溶液に懸濁させることができる。こうした組成物に適したヒドロゲルとしては、RAD16などの自己集合ペプチドが挙げられる。アノイキス抵抗性胎盤幹細胞はまた、例えば局所注射のためのアルギナート若しくは多血小板血漿、又は他のフィブリン含有マトリクスと組み合わせることもできる。一実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリクスを形成することができる。こうしたマトリクス中のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を、この細胞が埋め込み前に有糸分裂によって拡大されるように培養することもできる。該ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合によって架橋されて3次元の開放格子構造をもたらす(この3次元開放格子構造が、水分子を捕捉してゲルを形成する)有機ポリマー(天然又は合成)であり得る。ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、多糖類(アルギナート及びその塩など)、ペプチド、ポリホスファジン、及びポリアクリレート、又は、それぞれ温度若しくはpHによって架橋されるブロックポリマー(ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなど)が挙げられる。いくつかの実施態様では、ヒドロゲル又はマトリクスは、生分解性である。
いくつかの実施態様では、マトリクスは、インサイチューで重合可能なゲルを含む(例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号;Ansethらの文献、J.Control Release,78(1-3):199-209(2002);Wangらの文献、Biomaterials,24(22):3969-80(2003)を参照のこと)。
いくつかの実施態様では、ポリマーは、荷電側鎖基又はその一価のイオン性塩を有する、水、緩衝塩類溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に、少なくとも部分的に溶解可能である。カチオンと反応することができる酸側鎖基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン化ポリマー(スルホン化ポリスチレンなど)である。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーとの反応によって形成される酸側鎖基を有するコポリマーを使用することもできる。酸基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくはフッ素化)アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、3次元フレームワーク又はスキャフォールドに播種し、インビボで埋め込むことができる。こうしたフレームワークは、任意の1種以上の、成長因子、細胞、薬物、又は組織形成を刺激する若しくは本明細書別所記載の治療の方法の実践を向上させる又は改善する他の成分と組み合わせて埋め込むことができる。
本明細書で使用することができるスキャフォールドの例としては、不織マット、多孔性発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の合成の吸収性コポリマー(例えばPGA/PLA)(VICRYL,Ethicon社、ニュージャージー州Somerville)から構成される繊維を用いて形成することができる。フリーズドライ又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えばポリ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)コポリマーから構成される、発泡体(例えば、米国特許第6,355,699号を参照のこと)も、スキャフォールドとして使用することができる。
別の実施態様では、スキャフォールドは、ナノ繊維スキャフォールド、例えば電界紡糸ナノ繊維スキャフォールドである又はこれを含む。より具体的な実施態様では、前記ナノ繊維スキャフォールドは、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、I型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとのコポリマー(PVDF-TrFE)、ポリ(-カプロラクトン)、ポリ(L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン)[P(LLA-CL)](例えば75:25)、及び/又はポリ(3-ヒドロキシブチラート-コ-3-ヒドロキシバレレート)(PHBV)とI型コラーゲンとのコポリマーを含む。ナノ繊維スキャフォールド、例えば電界紡糸ナノ繊維スキャフォールドを生成する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Xuらの文献、Tissue Engineering 10(7):1160-1168(2004);Xuらの文献、Biomaterials 25:877-886(20040;Mengらの文献、J. Biomaterials Sci.,Polymer Edition 18(1):81-94(2007)を参照のこと。
本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞はまた、限定はされないが、モノ-、ジ-、トリ-、α-トリ-、β-トリ-、及びテトラ-リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、BIOGLASS(登録商標)などの生体活性ガラス、並びにこれらの混合物を含めた、生理的に許容し得るセラミック材料に播種する又は該セラミック材料と接触させることができる。市販品として現在入手できる多孔性の生体適合性セラミック材料としては、SURGIBONE(登録商標)(CanMedica社、カナダ)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France社、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys,AG社、スイスBettlach)、並びに石灰化コラーゲン骨移植用製品(HEALOS(商標)(DePuy社、マサチューセッツ州Raynham)、及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登録商標)(Orthovita社、ペンシルバニア州Malvern)など)が挙げられる。フレームワークは、天然及び/又は合成材料の混合物、ブレンド、又は複合体であり得る。
別の実施態様では、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、例えば、生体吸収性材料(PGA、PLA、PCLコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸など)でできたマルチフィラメント糸から構成することができるフェルトに播種する又は該フェルトと接触させることができる。
本明細書に記載するアノイキス抵抗性胎盤幹細胞は、別の実施態様では、複合体構造であり得る発泡体スキャフォールドに播種することができる。こうした発泡体スキャフォールドを、有用な形状に成型することができる。いくつかの実施態様では、フレームワークは、細胞接着を強化するために、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の接種前に、例えば0.1M酢酸で処理し、続いて、ポリリジン、PBS、及び/又はコラーゲン中でインキュベートされる。マトリクスの外側表面を、例えば、マトリクスをプラズマコーティングすることによって、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、網状繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)、細胞マトリクス、及び/又は他の材料(限定はされないが、ゼラチン、アルギナート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなど)の添加によって、修飾して、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を向上させることができる。
いくつかの実施態様では、スキャフォールドは、スキャフォールドを非血栓形成性にする材料を含む、又は該材料で処理される。これらの処理及び材料はまた、内皮成長、移動、及び細胞外マトリクス沈着を促進及び持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては、限定はされないが、天然材料、例えば基底膜タンパク質(ラミニン及びIV型コラーゲンなど)など、合成材料、例えばEPTFE、及びセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン(PURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、カリフォルニア州Berkeley)など)などが挙げられる。スキャフォールドはまた、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともできるし;アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を播種する前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する(例えばプラズマコーティングする)こともできる。
(6. 実施例)
（6.1 実施例1:胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子の特定）
胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子の存在を、製造業者の説明書に従ってDecode(商標) RNAi Viral Screening Library(Thermo Scientific社)を使用して決定した。簡単に言うと、この分析は、RNAiに基づくレンチウイルス技術を利用して、shRNAmirを標的宿主細胞ゲノムの遺伝子に組み込むものである。細胞は、shRNAmirを形質導入され、また、shRNAmirによる緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づく細胞選別によって、又は（該shRNAmirは、形質導入された細胞にピューロマイシン抵抗性を付与する遺伝子を含有するので）ピューロマイシン分析を使用して、選択することができる。次いで、選択圧を適用して、圧力を生き延びる、したがってある種の遺伝子を増大又は低下したレベルで発現する細胞を、生存表現型と特定する。こうした差異的に発現される遺伝子は、生存している細胞のゲノムDNAのPCR増幅によって特定される。ここでは、特異的な遺伝子に組み込まれたshRNAmir(したがって、これらの遺伝子の発現を阻害/下方調節する)の配列が増幅される。したがって、生存表現型を付与することに関与する特定の遺伝子を特定することができる。
胎盤幹細胞についてのアノイキス分析を最初に策定した。対照の(付着条件下で培養された)非改変胎盤幹細胞と比較して、死ぬ又はアポトーシスする非改変胎盤幹細胞が90%を超えるという目的を果たす、胎盤幹細胞についての適切なアノイキス分析は、以下から構成されることが決定された:胎盤幹細胞を、1×105細胞/ml（0.1% FBSを補足すしたDMEM中）の濃度でプレーティングすることと、該細胞を、対照プレート(これは細胞付着を可能にする)上で、又はCorning Ultra-Low Attachment、Nunc Hydrocell、又はNunc Low Cell Bindingから選択される低付着プレート上で、37℃、5% CO2で、48〜72時間培養すること。図1は、非改変胎盤幹細胞が、培養の48時間後に、低付着条件下で、非常に低い生存を示すのに対し、同等数の非改変胎盤幹細胞が、細胞付着を可能にする分析条件下で、ほぼ100%の生存を示すことを実証する。図2に示す通り、顕微鏡観察によって、付着条件(Corning CellBindプレート)下で培養された胎盤幹細胞が生存可能であることが確認され、培養の72時間後の胎盤幹細胞の形態的特性が実証されたのに対し、低付着条件(Corning Ultra-Low Attachmentプレート)下で培養された胎盤幹細胞は、それに匹敵する（例外は付着条件である）培養条件下での培養の72時間後に生存していなかった。
確立された胎盤幹細胞アノイキス分析を、Decode(商標) RNAi Viral Screening Library(Thermo Scientific社)において、選択圧として使用した。簡単に言うと、胎盤幹細胞を、製造業者の説明書に従って、ポリブレンを含む無血清DMEM中で、0.3のMOIで、Decode Viral Libraryで形質導入した。形質導入された細胞を、選択可能なマーカーとしてGFPを使用するFACS Aria(Becton Dickinson社)セルソーターを使用して選択した。次に、この形質導入された胎盤幹細胞を、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の選択のために、先に記載した最適化されたアノイキス分析にかけた。このアノイキス分析における培養の48時間後に生存している細胞(例えば、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞)を、単一の細胞選別(FACSを使用する)又はGFP+細胞の段階希釈によって単離した。単離された細胞を、384ウェルプレート中で拡大させて、ウェルあたり＞500細胞に到達させた。図3は、この分析において特定された、拡大させた胎盤幹細胞の集団を含むウェルを示す(ウェル内の明るい色の印は、GFP陽性細胞を表す）。187ウェル（強いGFP発現を伴うウェル）の細胞からの遺伝子発現プロファイルを評価して、細胞からゲノムDNAを単離することによってアノイキス関連遺伝子を特定し、続いて、バーコード含有断片をPCR増幅して、配列に基づく標的遺伝子特定が容易に実施されるようにした。アノイキス関連遺伝子は、生存している細胞において阻害/下方調節されるもの、したがって、胎盤幹細胞におけるアノイキス経路と関連すると特定されるものを含む。
以下の遺伝子を含めた73遺伝子が、胎盤幹細胞アノイキスにおける役割を有すると特定された:AMIGO1(NCBI GENE ID NO:57463);ARHGAP20(NCBI GENE ID NO:57569);CD38(NCBI GENE ID NO:952);CLCC1(NCBI GENE ID NO:23155);CNTF(NCBI GENE ID NO:1270);ZFP91-CNTF(NCBI GENE ID NO:386607);COX8A(NCBI GENE ID NO:1351);DHX34(NCBI GENE ID NO:9704);FAM175A(NCBI GENE ID NO:NO 51023);MRPS18C(NCBI GENE ID NO:84142);FAM44C(NCBI GENE ID NO:284257);FBP2(NCBI GENE ID NO:8789);FLI1(NCBI GENE ID NO:2313);FREM3(NCBI GENE ID NO:166752);IFIT5(NCBI GENE ID NO:24138);LOC399851(NCBI GENE ID NO:399851);LOC400713(NCBI GENE ID NO:400713);LOC651610(NCBI GENE ID NO:651610);PIGP(NCBI GENE ID NO:51227);SH3TC2(NCBI GENE ID NO:79628);SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515);STAU2(NCBI GENE ID NO:27067) TMEFF1(NCBI GENE ID NO:8577);TMEM217(NCBI GENE ID NO:221468);TMEM79(NCBI GENE ID NO:84283);USHBP1(NCBI GENE ID NO:83878);APH1B(NCBI GENE ID NO:83464);ATP2B2(NCBI GENE ID NO:491);C13orf39(NCBI GENE ID NO:196541);C4orf17(NCBI GENE ID NO:84103);C4orf46(NCBI GENE ID NO:201725);DDX41(NCBI GENE ID NO:51428);DKFZp547J222(NCBI GENE ID NO:84237);FGFR1(NCBI GENE ID NO:2260);FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462);GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771);GP5(NCBI GENE ID NO:2814);IL1RN(NCBI GENE ID NO:3557);KIF24(NCBI GENE ID NO:347240);KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442);LOC100132598(NCBI GENE ID NO:100132598);LOC151760(NCBI GENE ID NO:151760);LOC152024(NCBI GENE ID NO:152024);LOC339833(NCBI GENE ID NO:339833);LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846);LSG1(NCBI GENE ID NO:55341);MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217);PDK3(NCBI GENE ID NO:5165);PELI2(NCBI GENE ID NO:57161);RNF103(NCBI GENE ID NO:7844);SNX31(NCBI GENE ID NO:169166);TXN2(NCBI GENE ID NO:25828);and XKR7(NCBI GENE ID NO:343702)。
この実施例は、胎盤幹細胞が、低付着条件でアノイキスを受けることと、胎盤幹細胞においてアノイキスを引き起こす特定の胎盤幹細胞遺伝子(アノイキス関連遺伝子)が存在することを実証する。
（6.2 実施例2:アノイキス抵抗性胎盤幹細胞の産生）
実施例1で特定した選択されたアノイキス関連遺伝子を、対象となる特定の遺伝子に誘導されるsiRNAを使用して、胎盤幹細胞において標的にした。選択された遺伝子に特異的なDharmacon ON-TARGETplus SMARTpool siRNAを、25nMの最終siRNA濃度で、Dharmafect 1 トランスフェクション試薬と共に使用して、胎盤幹細胞を形質移入した。TaqMan(登録商標)遺伝子発現キットと共に7900HT Fast Real-Time PCR Systemを使用して実施される定量リアルタイムPCR分析を使用して、遺伝子発現を分析し、遺伝子サイレンシング効率を調べた。
選択されたアノイキス関連遺伝子に特異的なsiRNAが、こうした遺伝子の発現を有効に阻害/下方調節することが、いったん確認されたら、アノイキス関連遺伝子が標的にされた胎盤幹細胞を、実施例1に記載したアノイキス分析において培養した。これらの胎盤幹細胞の生存能力を、CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)及びCyQuant Direct分析を使用して評価し、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子を特異的に標的にすることによって作製されたかどうかを決定した。
図4は、MTS分析の結果を示す。ここでは、実施例1で特定した選択されたアノイキス関連遺伝子は、これらの遺伝子に特異的なsiRNAを使用して、胎盤幹細胞において阻害/下方調節された。胎盤幹細胞を、48時間、実施例1に記載したアノイキス分析にかけて、こうした細胞の生存能力を決定し、非改変胎盤幹細胞(アノイキス関連遺伝子に特異的なsiRNAと接触させていない胎盤幹細胞;「非処理」)、及び本明細書で特定されたアノイキス関連遺伝子のいずれかに特異的ではない非標的プールsiRNA(「NTP」)と接触させた胎盤幹細胞の生存能力と比較した
図4に示す通り、実施例1において特定された多数のアノイキス関連遺伝子を標的にすることは、非処理及びNTP胎盤幹細胞群と比較した場合の胎盤幹細胞の生存能力の増大をもたらした（すべての場合において、アノイキス関連遺伝子特異的なsiRNAで標的にした胎盤幹細胞は、NTP胎盤幹細胞群と比較して、生存能力の増大を示した）。アノイキス関連遺伝子の標的化の後に生存能力の増大を示す胎盤幹細胞は、非改変胎盤幹細胞と比較した場合の、低付着条件で生存するその能力の増大に基づいて、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞(arPSC)ということになる。CyQuant Direct生存能力分析によって、MTS分析と同等の条件下では、arPSCは、胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子を標的にすることによって作製することができるということが立証された(図5)。
選択されたアノイキス関連遺伝子に対して、さらなる分析を実施した。胎盤幹細胞における該遺伝子の阻害は、アノイキス分析における(すなわち、低付着条件における)、胎盤幹細胞生存能力の有意な増大をもたらした。具体的には、以下のアノイキス関連遺伝子の阻害の影響を、さらに評価した:FH2ドメイン含有1(FHDC1: NCBI GENE ID NO:85462)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質α阻害2(GNAI2;NCBI GENE ID NO:2771)、キナーゼ非触媒Cローブドメイン含有1(KNDC1;NCBI GENE ID NO:85442)、リゾホスファチジン酸受容体4(LPAR4;NCBI GENE ID NO:2846)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ キナーゼ キナーゼ5(MAP3K5;NCBI GENE ID NO:4217)、溶質輸送体ファミリー2、メンバー3(SLC2A3;NCBI GENE ID NO:6515)、及びstaufen相同体2(STAU2;NCBI GENE ID NO:27067)。
CyQuant Direct生存能力分析によって、arPSCは、先に記載したアノイキス分析における48時間の培養後に、胎盤幹細胞におけるアノイキス関連遺伝子を標的にすることによって作製することができることが確認された(図6)。分析された各アノイキス関連遺伝子の阻害/下方調節は、非特異的なsiRNA(NTP)で標的にした胎盤幹細胞と比較した場合の、胎盤幹細胞が低付着条件で生存する能力の増大をもたらし、試験された7つの遺伝子のうちの5つの阻害/下方調節によって、胎盤幹細胞の生存の統計的に有意な増大がもたらされ、胎盤幹細胞が、アノイキスに対して抵抗性となったことが確認された。
アノイキス抵抗性幹細胞の生存能力をさらに確認するために、溶質輸送体ファミリー2、メンバー3(SLC2A3;NCBI GENE ID NO:6515)が阻害/下方調節されたarPSC集団と、同等量の非改変胎盤幹細胞とを、低付着条件下で3日間、別々に培養した。3日間の培養期間後、これらの2つの細胞集団を、顕微鏡観察を使用して視覚化した。図7は、生存可能な非改変胎盤幹細胞の数(図7B)と比較して、より多い数のアノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、培養期間後に生存可能なままである(図7A)ことを示す。
この実施例は、アノイキス関連遺伝子の発現を調節する手法を使用して、胎盤幹細胞における特定のアノイキス関連遺伝子を標的にする（こうした遺伝子をsiRNAで標的にすることを含めて）ことによって、胎盤幹細胞をアノイキスに対して抵抗性にすることができることを実証する。この実施例において作製されるarPSCは、これらが、(例えば、対象への全身的又は局所的投与の後に)インビボで生存可能なままであるために接着する基材を必要としないという事実に基づくと、好都合なことに、治療薬として使用することができ、また、好都合なことに、懸濁培養物として、胎盤幹細胞の大規模増殖において使用することができる。
等価物:
本明細書に開示する組成物及び方法は、本明細書に記載する具体的実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載したものに加えて、組成物及び方法の様々な改変が、前述の説明及び添付の図面から、当分野の技術者には明らかになるであろう。こうした改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が、本明細書に引用されており、これらの開示の全体を、参照により本明細書に組み込む。

Claims (24)

  1. アノイキスに対して抵抗性である、単離された胎盤幹細胞。
  2. 少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、単離された胎盤幹細胞。
  3. 前記アノイキス関連遺伝子が、AMIGO1(NCBI GENE ID NO:57463);ARHGAP20(NCBI GENE ID NO:57569);CD38(NCBI GENE ID NO:952);CLCC1(NCBI GENE ID NO:23155);CNTF(NCBI GENE ID NO:1270);ZFP91-CNTF(NCBI GENE ID NO:386607);COX8A(NCBI GENE ID NO:1351);DHX34(NCBI GENE ID NO:9704);FAM175A(NCBI GENE ID NO:NO 51023);MRPS18C(NCBI GENE ID NO:84142);FAM44C(NCBI GENE ID NO:284257);FBP2(NCBI GENE ID NO:8789);FLI1(NCBI GENE ID NO:2313);FREM3(NCBI GENE ID NO:166752);IFIT5(NCBI GENE ID NO:24138);LOC399851(NCBI GENE ID NO:399851);LOC400713(NCBI GENE ID NO:400713);LOC651610(NCBI GENE ID NO:651610);PIGP(NCBI GENE ID NO:51227);SH3TC2(NCBI GENE ID NO:79628);SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515);STAU2(NCBI GENE ID NO:27067) TMEFF1(NCBI GENE ID NO:8577);TMEM217(NCBI GENE ID NO:221468);TMEM79(NCBI GENE ID NO:84283);USHBP1(NCBI GENE ID NO:83878);APH1B(NCBI GENE ID NO:83464);ATP2B2(NCBI GENE ID NO:491);C13orf39(NCBI GENE ID NO:196541);C4orf17(NCBI GENE ID NO:84103);C4orf46(NCBI GENE ID NO:201725);DDX41(NCBI GENE ID NO:51428);DKFZp547J222(NCBI GENE ID NO:84237);FGFR1(NCBI GENE ID NO:2260);FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462);GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771);GP5(NCBI GENE ID NO:2814);IL1RN(NCBI GENE ID NO:3557);KIF24(NCBI GENE ID NO:347240);KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442);LOC100132598(NCBI GENE ID NO:100132598);LOC151760(NCBI GENE ID NO:151760);LOC152024(NCBI GENE ID NO:152024);LOC339833(NCBI GENE ID NO:339833);LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846);LSG1(NCBI GENE ID NO:55341);MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217);PDK3(NCBI GENE ID NO:5165);PELI2(NCBI GENE ID NO:57161);RNF103(NCBI GENE ID NO:7844);SNX31(NCBI GENE ID NO:169166);TXN2(NCBI GENE ID NO:25828);又はXKR7(NCBI GENE ID NO:343702)である、請求項2記載の単離された胎盤幹細胞。
  4. 前記アノイキス関連遺伝子が、FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、又はSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)である、請求項3記載の単離された胎盤幹細胞。
  5. アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団。
  6. 前記細胞集団における細胞の少なくとも50%が、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞である、請求項5記載の単離された細胞集団。
  7. 前記細胞集団における細胞の、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%が、アノイキス抵抗性胎盤幹細胞である、請求項5記載の単離された細胞集団。
  8. 前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を、非改変胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、請求項5から7のいずれか1項記載の単離された細胞集団。
  9. 前記アノイキス関連遺伝子が、AMIGO1(NCBI GENE ID NO:57463);ARHGAP20(NCBI GENE ID NO:57569);CD38(NCBI GENE ID NO:952);CLCC1(NCBI GENE ID NO:23155);CNTF(NCBI GENE ID NO:1270);ZFP91-CNTF(NCBI GENE ID NO:386607);COX8A(NCBI GENE ID NO:1351);DHX34(NCBI GENE ID NO:9704);FAM175A(NCBI GENE ID NO:NO 51023);MRPS18C(NCBI GENE ID NO:84142);FAM44C(NCBI GENE ID NO:284257);FBP2(NCBI GENE ID NO:8789);FLI1(NCBI GENE ID NO:2313);FREM3(NCBI GENE ID NO:166752);IFIT5(NCBI GENE ID NO:24138);LOC399851(NCBI GENE ID NO:399851);LOC400713(NCBI GENE ID NO:400713);LOC651610(NCBI GENE ID NO:651610);PIGP(NCBI GENE ID NO:51227);SH3TC2(NCBI GENE ID NO:79628);SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515);STAU2(NCBI GENE ID NO:27067) TMEFF1(NCBI GENE ID NO:8577);TMEM217(NCBI GENE ID NO:221468);TMEM79(NCBI GENE ID NO:84283);USHBP1(NCBI GENE ID NO:83878);APH1B(NCBI GENE ID NO:83464);ATP2B2(NCBI GENE ID NO:491);C13orf39(NCBI GENE ID NO:196541);C4orf17(NCBI GENE ID NO:84103);C4orf46(NCBI GENE ID NO:201725);DDX41(NCBI GENE ID NO:51428);DKFZp547J222(NCBI GENE ID NO:84237);FGFR1(NCBI GENE ID NO:2260);FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462);GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771);GP5(NCBI GENE ID NO:2814);IL1RN(NCBI GENE ID NO:3557);KIF24(NCBI GENE ID NO:347240);KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442);LOC100132598(NCBI GENE ID NO:100132598);LOC151760(NCBI GENE ID NO:151760);LOC152024(NCBI GENE ID NO:152024);LOC339833(NCBI GENE ID NO:339833);LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846);LSG1(NCBI GENE ID NO:55341);MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217);PDK3(NCBI GENE ID NO:5165);PELI2(NCBI GENE ID NO:57161);RNF103(NCBI GENE ID NO:7844);SNX31(NCBI GENE ID NO:169166);TXN2(NCBI GENE ID NO:25828);又はXKR7(NCBI GENE ID NO:343702)である、請求項8記載の単離された細胞集団。
  10. 前記アノイキス関連遺伝子が、FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、又はSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)である、請求項9記載の単離された細胞集団。
  11. アノイキス抵抗性胎盤幹細胞を産生する方法であって、該胎盤幹細胞を有効量の調節性RNA分子と接触させて、前記胎盤幹細胞が、前記調節性RNA分子と接触させた後に、(i)少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を、前記調節性RNA分子と接触させていない同等量の胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、及び/又は(ii)前記調節性RNA分子と接触させていない同等量の胎盤幹細胞よりも長い時間、低付着環境で生存するようにすることを含む前記方法。
  12. 前記調節性RNA分子が、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAインヒビター(miRインヒビター)、マイクロRNA模倣体(miR模倣体)、アンチセンスRNA、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項11記載の方法。
  13. 前記調節性RNA分子が、前記胎盤幹細胞の少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を標的にする、請求項11又は12記載の方法。
  14. 前記アノイキス関連遺伝子が、AMIGO1(NCBI GENE ID NO:57463);ARHGAP20(NCBI GENE ID NO:57569);CD38(NCBI GENE ID NO:952);CLCC1(NCBI GENE ID NO:23155);CNTF(NCBI GENE ID NO:1270);ZFP91-CNTF(NCBI GENE ID NO:386607);COX8A(NCBI GENE ID NO:1351);DHX34(NCBI GENE ID NO:9704);FAM175A(NCBI GENE ID NO:NO 51023);MRPS18C(NCBI GENE ID NO:84142);FAM44C(NCBI GENE ID NO:284257);FBP2(NCBI GENE ID NO:8789);FLI1(NCBI GENE ID NO:2313);FREM3(NCBI GENE ID NO:166752);IFIT5(NCBI GENE ID NO:24138);LOC399851(NCBI GENE ID NO:399851);LOC400713(NCBI GENE ID NO:400713);LOC651610(NCBI GENE ID NO:651610);PIGP(NCBI GENE ID NO:51227);SH3TC2(NCBI GENE ID NO:79628);SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515);STAU2(NCBI GENE ID NO:27067) TMEFF1(NCBI GENE ID NO:8577);TMEM217(NCBI GENE ID NO:221468);TMEM79(NCBI GENE ID NO:84283);USHBP1(NCBI GENE ID NO:83878);APH1B(NCBI GENE ID NO:83464);ATP2B2(NCBI GENE ID NO:491);C13orf39(NCBI GENE ID NO:196541);C4orf17(NCBI GENE ID NO:84103);C4orf46(NCBI GENE ID NO:201725);DDX41(NCBI GENE ID NO:51428);DKFZp547J222(NCBI GENE ID NO:84237);FGFR1(NCBI GENE ID NO:2260);FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462);GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771);GP5(NCBI GENE ID NO:2814);IL1RN(NCBI GENE ID NO:3557);KIF24(NCBI GENE ID NO:347240);KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442);LOC100132598(NCBI GENE ID NO:100132598);LOC151760(NCBI GENE ID NO:151760);LOC152024(NCBI GENE ID NO:152024);LOC339833(NCBI GENE ID NO:339833);LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846);LSG1(NCBI GENE ID NO:55341);MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217);PDK3(NCBI GENE ID NO:5165);PELI2(NCBI GENE ID NO:57161);RNF103(NCBI GENE ID NO:7844);SNX31(NCBI GENE ID NO:169166);TXN2(NCBI GENE ID NO:25828);又はXKR7(NCBI GENE ID NO:343702)である、請求項13記載の方法。
  15. 前記アノイキス関連遺伝子が、FHDC1(NCBI GENE ID NO:85462)、GNAI2(NCBI GENE ID NO:2771)、KNDC1(NCBI GENE ID NO:85442)、LPAR4(NCBI GENE ID NO:2846)、MAP3K5(NCBI GENE ID NO:4217)、SLC2A3(NCBI GENE ID NO:6515)、又はSTAU2(NCBI GENE ID NO:27067)である、請求項14記載の方法。
  16. 請求項11から15のいずれか1項記載の方法によって産生される、単離されたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞又はその集団。
  17. 請求項1記載の単離されたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む組成物。
  18. 請求項11から15のいずれか1項記載の方法によって産生される、単離されたアノイキス抵抗性胎盤幹細胞を含む組成物。
  19. 前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、(i)少なくとも1つのアノイキス関連遺伝子を、前記調節性RNA分子と接触させていない胎盤幹細胞における同一のアノイキス関連遺伝子の発現と比較して低下したレベルで発現する、及び/又は(ii)前記調節性RNA分子と接触させていない胎盤幹細胞よりも長い時間、低付着環境で生存する、請求項18記載の組成物。
  20. 請求項19の方法によって改変されている、改良された胎盤幹細胞を含む組成物。
  21. 前記胎盤幹細胞が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である、請求項1から4又は16のいずれか1項記載の胎盤幹細胞。
  22. 前記集団における前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である、請求項5から10のいずれか1項記載の細胞集団。
  23. 前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である、請求項11から15のいずれか1項記載の方法。
  24. 前記アノイキス抵抗性胎盤幹細胞が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である、請求項17から20のいずれか1項記載の組成物。
JP2015547970A 2012-12-14 2013-12-13 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用 Pending JP2016502844A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261737498P 2012-12-14 2012-12-14
US61/737,498 2012-12-14
PCT/US2013/074892 WO2014093753A1 (en) 2012-12-14 2013-12-13 Anoikis resistant placental stem cells and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018224316A Division JP2019068814A (ja) 2012-12-14 2018-11-30 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016502844A true JP2016502844A (ja) 2016-02-01

Family

ID=50934980

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015547970A Pending JP2016502844A (ja) 2012-12-14 2013-12-13 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2018224316A Pending JP2019068814A (ja) 2012-12-14 2018-11-30 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2020185486A Withdrawn JP2021045133A (ja) 2012-12-14 2020-11-06 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2022112849A Pending JP2022160451A (ja) 2012-12-14 2022-07-14 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018224316A Pending JP2019068814A (ja) 2012-12-14 2018-11-30 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2020185486A Withdrawn JP2021045133A (ja) 2012-12-14 2020-11-06 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2022112849A Pending JP2022160451A (ja) 2012-12-14 2022-07-14 アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150307879A1 (ja)
EP (2) EP3556215A1 (ja)
JP (4) JP2016502844A (ja)
CN (2) CN105283075A (ja)
AU (1) AU2013359076A1 (ja)
CA (1) CA2895106C (ja)
WO (1) WO2014093753A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016512433A (ja) * 2013-03-14 2016-04-28 アントフロゲネシス コーポレーション 増強胎盤幹細胞及びその使用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475419A (zh) * 2017-09-22 2017-12-15 浙江大学 Kndc1基因及其表达产物在卵巢癌检测中的应用
CN110129321B (zh) * 2019-07-08 2021-10-15 江苏医药职业学院 降低LSG1基因表达的siRNA、重组载体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009521929A (ja) * 2005-12-29 2009-06-11 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤幹細胞集団

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4798824A (en) 1985-10-03 1989-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Perfusate for the preservation of organs
US5190556A (en) 1991-03-19 1993-03-02 O.B. Tech, Inc. Cord cutter sampler
US5552267A (en) 1992-04-03 1996-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Solution for prolonged organ preservation
US5372581A (en) 1993-07-21 1994-12-13 Minneapolis Children's Services Corporation Method and apparatus for placental blood collection
CA2370330C (en) 1999-04-16 2009-01-20 Wm. Marsh Rice University Biodegradable poly(propylene fumarate) networks cross linked with poly(propylene fumarate)-diacrylate macromers
US6355699B1 (en) 1999-06-30 2002-03-12 Ethicon, Inc. Process for manufacturing biomedical foams
EP2305795B1 (en) 2000-12-06 2019-07-03 Celularity, Inc. Method of collecting placental stem cells
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
EP2336300B1 (en) 2001-02-14 2015-07-08 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
EP1367892B1 (en) 2001-02-14 2013-10-30 Anthrogenesis Corporation Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells
US20030187515A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
NZ567335A (en) 2005-10-13 2012-02-24 Anthrogenesis Corp Immunomodulation using placental stem cells
CN101374941A (zh) 2005-12-29 2009-02-25 人类起源公司 采集和保存胎盘干细胞的改良组合物及其使用方法
EP2208499A4 (en) * 2007-10-03 2011-12-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd NUCLEIC ACID FOR REGULATING CELL PROLIFERATION
CN101862315A (zh) * 2009-04-17 2010-10-20 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 双取代苯基双胍诱导恶性肿瘤细胞失巢凋亡的用途
EP2494076B1 (en) * 2009-10-26 2017-11-22 Abbott Molecular Inc. Detection of chromosomal abnormalities associated with prognosis of non small cell lung cancer
KR101874463B1 (ko) * 2009-10-31 2018-08-02 뉴 월드 레보러토리즈 인코포레이티드. 세포의 재프로그램화 방법 및 이의 용도
NZ602808A (en) 2010-04-07 2014-10-31 Anthrogenesis Corp Angiogenesis using placental stem cells
WO2012092458A2 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof
US8969315B2 (en) * 2010-12-31 2015-03-03 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
JP2016512433A (ja) * 2013-03-14 2016-04-28 アントフロゲネシス コーポレーション 増強胎盤幹細胞及びその使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009521929A (ja) * 2005-12-29 2009-06-11 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤幹細胞集団

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016512433A (ja) * 2013-03-14 2016-04-28 アントフロゲネシス コーポレーション 増強胎盤幹細胞及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3556215A1 (en) 2019-10-23
EP2938196B1 (en) 2019-04-03
JP2021045133A (ja) 2021-03-25
JP2022160451A (ja) 2022-10-19
US20150307879A1 (en) 2015-10-29
WO2014093753A1 (en) 2014-06-19
CA2895106C (en) 2023-01-24
NZ709113A (en) 2020-11-27
EP2938196A1 (en) 2015-11-04
CN113481164A (zh) 2021-10-08
CN105283075A (zh) 2016-01-27
AU2013359076A1 (en) 2015-07-02
CA2895106A1 (en) 2014-06-19
JP2019068814A (ja) 2019-05-09
EP2938196A4 (en) 2016-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8969315B2 (en) Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
JP2022166249A (ja) ヒト胎盤灌流液由来の血管形成細胞
JP5469457B2 (ja) 胎盤幹細胞を使用する腫瘍抑制
JP2022160451A (ja) アノイキス抵抗性胎盤幹細胞及びその使用
JP2024028780A (ja) 増強胎盤幹細胞及びその使用
US20220235326A1 (en) Enhancement of fibroblast therapeutic activity by rna
NZ709113B2 (en) Anoikis resistant placental stem cells and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20161212

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171205

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180305

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180731