DE69813908T2

DE69813908T2 - Verwendung von kreatinsubstanzen zur behandlung von knochen- und knorpelzellen und geweben

Info

Publication number: DE69813908T2
Application number: DE69813908T
Authority: DE
Inventors: Theo Wallimann; Isabel Gerber
Original assignee: Synthes AG Chur
Current assignee: Alzchem Trostberg GmbH
Priority date: 1998-07-28
Filing date: 1998-07-28
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2018-07-29
Also published as: CA2338712A1; ES2198067T3; US20020039567A1; US20050085543A1; DE69813908D1; CA2338712C; WO2000006150A1; JP2002521440A; EP1100488A1; ATE238049T1; JP4778143B2; PT1100488E; EP1100488B1; HK1037910A1; DK1100488T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Kreatinverbindungen gemäss den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 2.
Die Kreatinverbindungen können in die dreidimensionalen Strukturelemente von Osteoblasten, Chondrozyten oder mesenchymalen Stammzellen eingebaut werden, welche zur gewebetechnologischen Aufbereitung von Knochen- bzw. Knorpeldefekten bestimmt sind.
Weiterhin können die Kreatinverbindungen zur Verbesserung der Aufnahme und des Einwachsens von Knochenimplantaten dienen.
Kreatin ist eine Substanz, die auf natürliche Art im menschlichen Körper vorkommt und die in Hirngewebe sowie in anderen erregbaren Geweben von Säugetieren, wie zum Beispiel in Skelettmuskeln, im Herz und in der Augennetzhaut anzutreffen sind. Seine phosphorylierte Form, Kreatinphosphat, ist ebenfalls in den genannten Organen anzutreffen und stellt das Produkt der Kreatinkinase-Reaktion dar, bei welcher Kreatin als Substrat verwendet wird. Kreatin und Kreatinphosphat lassen sich relativ einfach synthetisch herstellen und gelten als für Säugetiere ungiftig.
Die Verwendung von Kreatin und Kreatinanaloga zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems sind bereits in WO-A-96/14063 AVICENA GROUP INC. beschrieben worden.
Die Verwendung von Kreatinkinase oder von Kreatinverbindungen wird jedoch nirgendwo im Zusammenhang mit der Behandlung von Knochen- und Knorpelzellen oder -geweben im speziellen offenbart oder zur Behandlung von gesundem und erkranktem Knochen und Knorpel empfohlen.
Die gegenwärtig beanspruchte Erfindung schafft eine neue Verwendung von Kreatinkinase und Kreatinverbindungen (bei welchen eine oder mehrere der strukturellen bzw. funktionalen Komponenten des Kreatinkinase-/ Kreatinphosphat-Systems einer regulierenden Wirkung unterzogen werden) als Therapeutikum. Im spezielleren schafft die vorliegende Erfindung Verfahren zur:

a) Behandlung von Knochen- bzw. Knorpelerkrankungen (z. B. Osteoporose, Osteoarthritis oder Periodontitis);
b) Förderung des Wachstums und der Mineralisierung von Knochen- bzw. Knorpelzellen und -geweben;
c) konservativen oder operativen Behandlung von Knochenbrüchen bzw. Knochendefekten;
d) Einbringung von Knochen- oder Knorpeltransplantaten im Bereich von Knochen- oder Knorpelbrüchen bzw. -defekten.
e) gewebetechnologischen Aufbereitung auf dem Wege der extrakorporalen, kreatinunterstützten Kultur von (aus einem gesunden Individuum oder einem bestimmten Patienten gewonnenen) knochen- bzw. knorpelbildenden Zellen zur Bildung eines dreidimensionalen Zellagglomerats, das in einem späteren Verfahrensschritt an eine bestimmte von einem Knochenbzw. Knorpeldefekt betroffene Körperstelle desselben Patienten übertragen werden kann;
f) stoffwechseltechnischen Aufbereitung von Knochen- und Knorpelzellen durch Transfektion mit DNA-Codierung zur Bildung von Kreatinkinase, um die Zellen zu einer Überexpression von Kreatinkinase zu veranlassen und dadurch in Zusammenwirkung mit Kreatin die physiologische Funktion der Zellen und Gewebe zu verbessern, zu stimulieren und zu stabilisieren, welche, wie in Abschnitt e) erwähnt, zur Reimplantation in Patienten bestimmt sind.

Bei all diesen Anwendungen von Kreatin besteht die Grundfunktion des Kreatin (Cr) in seiner Fähigkeit, als Energiequelle und Regulator des Energiestoffwechsels in der Zelle, sowie als Schutzmittel der Zelle gegen Stoffwechselstress zu fungieren. Darüber hinaus konnte überraschenderweise festgestellt werden, dass Kreatin über eine Schutzwirkung gegen das verfrühte Eintreten von programmiertem Zelltod bzw. Apoptose verfügt. Diese Auswirkungen werden allesamt durch Kreatinkinase vermittelt.
Die überraschende Wirkung von Kreatinverbindungen auf Knochen- und Knorpelzellen und -gewebe besteht darin, den Heilungsprozess von traumatisch oder chirurgisch verursachten Verletzungen von Knochen- oder Knorpelgewebe, einschliesslich Knochenfrakturen und die Annahme und das Einwachsen künstlicher Implantate, zu beschleunigen und zu verbessern. Die Behandlung mit Kreatinverbindungen kann therapeutisch für erkrankte Patienten, präventiv für Personen mit normalem Gesundheitszustand, oder aber als Geriatrikum in der Altenbetreuung eingesetzt werden. Im Zusammenhang mit der Erfindung kann eine Vielfalt von Kreatinverbindungen zum Einsatz kommen, insbesondere solche, die aus der Gruppe bestehend aus Kreatin, Kreatinphosphat, Kreatinpyruvat und Cyclokreatin ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindungen können in Form eines pharmakologisch verträglichen Salzes ausgebildet sein oder in Kombination mit einem Hilfsmittel oder anderen, zur Behandlung von Knochen- und/oder Knorpelzellen wirksamen Pharmazeutikum eingesetzt werden. Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbaren Substanzen handelt es sich um Kreatinverbindungen, die eine regulierende Wirkung auf das Kreatinkinase-System haben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, welche Kreatinverbindungen in Kombination mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz enthalten. Eine Darstellung solcher Trägermedien findet sich z. B. in
"Principles of Tissue Engineering (Grundlagen der Gewebetechnologie), Kapitel 19: Biodegradable Polymers for Tissue Engineering (Biologisch abbaubare Polymere in der Gewebetechnologie), J. M. Pachence und J. Kohn, 1997, S. 274–293 und in
"Der Orthopäde, Bone replacement materials (Knochenersatzmaterialien), J. M. Rueger, 2-1998, S 73-79.
Die im Rahmen der Erfindung brauchbaren Zusammensetzungen können in Form eines Granulats oder als Zubereitung mit langsamer Wirkung oral verabreicht werden. Der Ausdruck "mit langsamer Wirkung" verweist dabei auf eine Zubereitung, bei welcher die Zusammensetzung für den Patienten über einen längeren Zeitraum hinweg in richtig proportionierten Mengen biologisch verfügbar gemacht wird. Solche Zusammensetzungen sind einschlägig weithin bekannt.
Der Hauptweg der Cr-Biosynthese bei Säugern umfasst die Bildung von Guanidinoacetat in der Niere, dessen Transport durch das Blut und dessen Methylierung zu Cr in der Leber. Das von der Leber abgegebene und wiederum durch das Blut weitertransportierte Cr kann anschliessend mithilfe des Kreatin-Transportproteins von jenen Geweben aufgenommen werden, die Bedarf an Cr haben. Wenn Säugetierzellen kultiviert werden, ist Kreatin nur in jenen Mengen verfügbar, in denen es in dem hinzugefügten Serum vorhanden ist, das 0,05–0,10 mM Cr enthält. Das Enzym Kreatinkinase (CK) spielt eine Schlüsselrolle beim Energiestoffwechsel von Zellen mit intermittierend hohem, fluktuierendem Energiebedarf. CK-Isoenzyme finden sich vorwiegend in der Skelett- und Herzmuskulatur, aber auch in Samenzellen (Sperma von Wirbeltieren und des Seeigels), in den elektrischen Zellen des elektrischen Organs des Welses, in Photorezeptorzellen der Netzhaut und der Linse des Auges, im Gehirn (Glialzellen und neuronale Zellen des Kleinhirns, glomeruläre Strukturen des Kleinhirns), in der Gebärmutter und der Plazenta, in intestinalen Bürstenrand-Epithelzellen und -Endothelzellen, in der Nieren- und Rektalsalzdrüse, in Fettgewebe, in der Bauchspeicheldrüse, der Thymusdrüse, der Schilddrüse und der Leber, in Knorpel und Knochen, in Makrophagen, in Blutplättchen, sowie in gewissen bösartigen Tumoren und Krebszellen.
Die von Kreatinkinasen ausgelöste Reaktion, der reversible Transfer der Phosphorylgruppe von Phosphokreatin (PCr) zu ADP, ermöglicht eine Regenerierung des als zentraler Energieträger der Zelle fungierenden Moleküls ATP. Zellen enthalten eine Reihe unterschiedlicher CK-Isoformen, welche in den Zellen nicht gleichmässig verteilt sind. Sie sind in isoform-spezifischer Weise kompartimentiert, wobei die beiden Isoformen M-CK und B-CK cytosolisch und zwei der Isoformen, Mia-CK und Mib-CK, spezifisch mitochondrial sind. Von diesen verschiedenen CK-Isoformen wird angenommen, dass sie ein kompliziertes Energiepuffer- und Energietransportsystem darstellen und Orte energiereicher Phosphatproduktion (durch Glykolyse und oxidative Phosphorylierung) mit Orten des Energieverbrauchs (ATPasen) verbinden.
Die mitochondrialen CK-Isoformen (Mi-CK) sind entlang der äusseren Oberfläche der gesamten inneren Membran und auch an Stellen, an denen die äussere und die innere Membran nahe beieinanderliegen, angeordnet. In den zuletztgenannten Bereichen kann die Mi-CK intra-mitrochondrial erzeugte ATP zur Herstellung von PCr verwenden, welches in das Cytosol ausgeschüttet wird, wo es als leicht diffundierbarer Metabolit zur Speicherung von Energie dient. Im Gegensatz zu den cytosolischen CK-Isoformen, welche dimerisch sind, bilden die Mi-CK hochsymmetrische, würfelförmige Oktamere (Schnyder et al. 1991), die mit dem Rand von Lipidmembranen eine Bindung eingehen können. Am wichtigsten dabei ist, dass die Mi-Ck eine vermittelnde Aufgabe bei der Bildung von Verbindungsstellen zwischen der inneren und der äusseren mitochondrialen Membran übernehmen kann und dass die Mi-CK darüber hinaus funktionell an die oxidative Phosphorylierung gekoppelt ist, die mittels des Adeninnukleotid-Transportproteins erfolgt, welches den ATP/ADP-Austauschtransport über die innere Membran hinweg katalysiert. Die Nettoproduktion an PCr lässt sich durch die Zugabe von extra-mitochondrialem Cr stimulieren, und zwar auch bei Vorhandensein von externen ATP-Regenerationssystemen und ATP-Senken.
Kreatin und Phosphokreatin im Knorpel
Ruhende und hypertrophierte Knorpel enthalten beide Cr. Die Verteilung von PCr ist jedoch in den verschiedenen Knorpelbereichen unterschiedlich. Den höchsten Cr-Gehalt weist der ruhende Knorpel auf. Die anderen Bereiche verfügen über ähnliche Mengen an Cr. Andererseits findet sich die grösste Menge an PCr im proliferativen Knorpelbereich bei gleichzeitig geringerer Konzentration in ruhendem und in hypertrophiertem Knorpel. In kalzifiziertem Knorpelknochen ist hingegen kein PCr feststellbar.
Aus experimentellen Studien geht hervor, dass die externe Zugabe von PCr der Knorpelmineralisierung in Organ- und Zellkulturen förderlich ist. Die Ablagerung von Calcium in der Knorpelmatrix der Epiphyse von kultivierten Hühnerembryo-Oberschenkelknochen wird durch die Zugabe sehr roher PCr- und Cr-Zubereitungen bei 0,1 mM in Hühnerembryo-Extrakt mit 20% Pferdeserum beschleunigt. Die Mineralisierung bei sich differenzierenden Knospen-Mesenchymzellen von Hühnerextremitäten in Mikromasse-Kulturen lässt sich durch Beigabe von 1 und 2 mM ATP oder 2mM PCr anregen. Die so gebildete, mineralisierte Knorpelmatrix ähnelt jener, wie sie in ovo anzutreffen ist. Die Beigabe von ATP oder PCr bewirkt keinerlei Veränderung der Geschwindigkeit der Zellproliferation, der Geschwindigkeit der Matrixsynthese, der mittlere Mizellenlänge oder der Geschwindigkeit der Mineralablagerung im Vergleich zu Kulturen mit anorganischem Phosphatzusatz. Die Ultrastruktur der kultivierten Zellen bei Vorhandensein von 4 mM anorganischem Phosphat (Pi), 1–2 mM ATP oder 2 mM PCr ist am 14. und am 21. Tag ähnlich. Es sind differenzierte Chondrozyten innerhalb des Nodulus vorhanden, welche hypertrophierten und degenerierenden Knorpel enthalten. Am Rand des Nodulus ist die Typ II-Kollagen, Proteoglykan und Matrixbläschen enthaltende, knorpelige Matrix von undifferenzierten Zellen und Typ I-Kollagen umgeben. ATP, PCr oder Pi führen zwar um den Rand der Mikromasse herum zu einer Erhöhung des Mineral-/Matrixverhältnisses, nicht jedoch im Zentrum des Knorpelnodulus (niedriges Mineral-/Matrixverhältnis). Es ist kein Pi-, ATP- oder PCrbedingter Unterschied im -Mineralisierungsmuster festzustellen.
Eine Verringerung der Cr-Aufnahme durch Fütterung von Ratten mit Beta-Guanidinopropionat führt zu ausgeprägten Abnormitäten beim Epiphysenwachstumsknorpel der Ratten. Der Bereich des kalzifizierten Knorpels ist breiter und reicht bis in die Metaphyse hinein. In den hypertrophischen Chondrozyten bilden sich Hohlräume, das Stützgewebe ist unzureichend und die Mineralisierung erfolgt in weniger reichlichem Umfang und kommt auch in den Septa transversa vor. Die Gefässdurchdringung ist mangelhaft. Es kommt zu einer verringerten Osteoidausbildung. GPA beeinträchtigt die Synthese von pro-a Typ II- und Typ X-Kollagen in kultivierten Chondrozyten.
Kreatin und Phosphokreatin im Knochen
PCr führt zu einer Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in den SaOS-2-Zellen. Die perichondrale Ossifikation in der Diaphyse von kultivierten Hühnerembryo-Oberschenkelknochen wird durch die Zugabe von PCr- und Cr-Zubereitungen bei 0,1 mM in Hühnerembryo-Extrakt mit 20% Pferdeserum beschleunigt.
Kreatinkinase im Knorpel
Der Grad der CK-Aktivität steht in Korrelation mit der Heranreifung von Chondrozyten in der Epiphyse und in der Rippe. Es kommt zu einem Anstieg der CK-Aktivität vom ruhend-proliferativen Knorpel zum hypertrophischen Knorpel (um das 6-fache) und zum kalzifizierten Knorpelknochenbereich (um das 17-fache). Beim ruhenden und proliferierenden Knorpel wird die vorherrschende CK-Isoform von MM gebildet. Der M-CK-Anteil beträgt 1/3 bis 1/5 der in der Skelettmuskulatur vorhandenen Menge (600 600 ng/mg Protein), wobei die Menge altersunabhängig ist. In hyperstrophischem Knorpel sind die MB-CK- und BB-CK--Isoformen vorherrschend und die Menge an B-CK ist um das 30–47-fache höher als jene in der Skelettmuskulatur (60 ng/mg Protein) und die B-CK weist mit fortschreitendem Alter einen signifikanten Rückgang auf.
Die CK-Aktivität scheint für die Matrixsynthese und für die Mineralisierung der enchondralen Epiphysenknorpels erforderlich zu sein und kultivierte, hypertrophierende Chondrozyten weisen eine erhöhte CK-Aktivität auf. Ihren Höhepunkt erfährt die CK-Aktivität im Knorpel von Ratten im Alter der eintretenden Geschlechtsreife.
Die CK-Aktivität im Knorpel wird durch Wachstumshormon (GH), durch den insulinhaltigen Wachstumsfaktor 1 (IGF-I), durch das Stoffwechselzwischenprodukt von Vitamin D [24R,25(OH)₂D₃] bei normalen Ratten und bei Ratten mit Vitamin D-Mangel, durch PTH, durch proteaseresistente Varianten des Nebenschilddrüsenhormons (PTH), durch 17b-Östradiol bei normalen Ratten und Ratten mit operativ entfernten Eierstöcken stimuliert. Die Stimulierung der BB-CK-Aktivität wird gefolgt von einem parallelen Anstieg der DNA-Synthese.
Bei rachitischem Knorpel ist das CK-Profil ähnlich, wobei jedoch die Werte in dem hypertrophischen und auch in dem kalzifizierten Knorpel niedriger sind als bei normalem Knorpel.
Kreatinkinase im Knochen
In embryonalem Hühnerknochen ist BB-CK-Aktivität parallel mit einem bestimmten Grad an MB- und MM-CK-Aktivität feststellbar. Während der frühen Gesichtsentwicklung ist ein auffallender anaerobischer Stoffwechsel bei den fazialen Prozessen zu beobachten, wobei die BB-CK ab dem 9. embryonalen Tag vorhanden ist und die MB-CK sowie die MM-CK sich in der Zeit zwischen dem 10. und dem 15. Tag entwickeln. Die Knochenmenge, die während der heterotrophen Knochenbildung durch die Implantation von BMP in das Muskelgewebe von Ratten erzeugt wurde, zeigt ein nahezu paralleles Verhältnis bezüglich der Mengenverhältnisse von S-100b-Protein, P-CK, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat und der ALP-Aktivität. Die B-CK-Expression wird im Zuge der Differenzierung osteoblastischer Zellen durch während und nach der Transkription stattfindende Mechanismen reguliert. Eine erhöhte Aktivität von Membranpumpen und Veränderungen im Zellgerüst stehen in Verbindung mit der Bildung einer extrazellulären Matrix und mit der Mineralisierung.
Ähnlich wie im Knorpel kann auch im Knochen die BB-CK sowohl in vitro wie auch in vivo experimentell durch IGP-I; durch 1,25(OH)₂D₃; durch PTH; durch proteaseresistente Varianten von PTH; durch PGE₂; durch 17b-Östradiol (E₂) erhöht werden. Des weiteren erfolgt die Stimulierung des Knochenzellenergiestoffwechsels durch 17b-Östradiol (E₂) und Testosteron geschlechtsspezifisch, wie anhand von diaphysärem Knochen von flaschenernährten Ratten, nicht jedoch von Epiphysenknorpel gezeigt werden konnte. E₂ bewirkt eine Zunahme der CK-Aktivität um 70–200% in vivo und in vitro in ROS 17/2.8, bei MC3T3-E₁-Zellen und bei Schädeldach-Zellen von Rattenföten, sowie eine Zunahme von 40% bei den Epiphysenknorpelzellen von Ratten. Die Stimulation durch E₂ ist dosis- und zeitabhängig. Ratten mit operativ entfernten Eierstöcken zeigen 1-4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff eine Stimulierung von CK durch E₂, und zwar 24 h nach der Injektion. Sowohl die Basisaktivität als auch die stimulierte Aktivität der CK ist in der Diaphyse und in der Epiphyse höher als im Uterus. Die Wirkung von E₂ in vivo und bei in vitro-Chondroblasten und -Osteoblasten wird durch hohe Mengen des Anti-Östrogens Tamoxifen gehemmt, welches in hoher Konzentration seinerseits eine stimulierende Wirkung hat. Des weiteren bewirkt eine operative Keimdrüsenentfernung den Verlust der geschlechtsspezifischen Reaktion von diaphysärem Knochen auf Steroidhormone. Ihren Höhepunkt erfährt die CK-Aktivität in diaphysärem Knochen und Knorpel von Ratten im Alter der eintretenden Geschlechtsreife. Patienten mit dominant-autosomaler Osteopetrosis vom Typ II haben einen erhöhten BB-CK-Spiegel, wohingegen Patienten mit anderen sklerosierenden Knochenerkrankungen jedoch keinen solchen erhöhten BB-CK-Spiegel aufweisen.
Beim Menschen liegt die Tagesdosierung von chemisch reinem Kreatinmonohydrat für einen Erwachsenen (70 kg) in einem Bereich von 0,1 bis 20,0 g pro Tag, vorzugsweise unter Beachtung einer "Ladephase" von 4 mal 4–6 g pro Tag während der ersten 8–14 Tage und einer "Erhaltungsphase" von 2–4 g pro Tag für die darauf folgenden 3 Monate, woraufhin das Supplementationsschema für einen Monat unterbrochen werden sollte.
Zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit kann chemisch reines Kreatinmonohydrat mit Kohlenhydraten wie etwa Maltodextrinen und/oder Dextrose und anderen Substanzen gemischt werden.
Die verschiedenen Neuheitsmerkmale, welche die Erfindung kennzeichnen, werden eingehend in den Ansprüchen ausgeführt, die der vorliegenden Darstellung als deren integraler Bestandteil beigefügt sind. Zum besseren Verständnis der Erfindung, ihrer nutzbaren Vorteile und der spezifischen Zielsetzungen, die durch ihre Verwendung erreicht werden, sei auf die beigelegten Zeichnungen, Beispiele und Beschreibungen verwiesen, in welchen bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung erläutert und beschrieben werden.
Es zeigen:
1 ein Diagramm zur Lebensfähigkeit (NR) von Einschichten-Osteoblastzellkulturen in einem Stadium von 1, 2 und 3 Wochen ohne Kreatinzusatz (Kontrollgruppe) und bei Vorhandensein von entweder 10 mM oder 20 mM Kreatin in dem Medium. Die Fehlerquadratmethode zeigt eine mittlere quadratische Abweichung von ±1,96;
2 ein Diagramm zur Stoffwechselaktivität (MTT) von Einschichten-Osteoblastzellkulturen in einem Stadium von 1, 2 und 3 Wochen ohne Kreatinzusatz (Kontrollgruppe) und bei Vorhandensein von entweder 10 mM oder 20 mM Kreatin in dem Medium. Die Fehlerquadratmethode zeigt eine mittlere quadratische Abweichung von ±1,96;
3 ein Diagramm zur Mineralisierung von Einschichten-Osteoblastzellkulturen in einem Stadium von 1, 2 und 3 Wochen ohne Kreatinzusatz (Kontrollgruppe) und bei Vorhandensein von entweder 10 mM oder 20 mM Kreatin in dem Medium. Die Fehlerquadratmethode zeigt eine mittlere quadratische Abweichung von ±1,96;
4 ein Diagramm zur Mineralisierung einer Mikromasse-Osteoblastzellkultur in einem Stadium von 2 und 3 Wochen ohne Kreatinzusatz (Kontrollgruppe) und bei Vorhandensein von entweder 10 mM oder 20 mM Kreatin in dem Medium. Die Fehlerquadratmethode zeigt eine mittlere quadratische Abweichung von ±1,96; und
5 ein Diagramm zur Feuchtstoffmasse von embryonalen Oberschenkelknochen von Ratten nach 3-wöchiger Organkultur mit und ohne Zusatz von 10 mM bzw. 20 mM Kreativ. Die Fehlerquadratmethode zeigt eine mittlere quadratische Abweichung von ±1,96.
Zielsetzung der experimentellen Untersuchungen
Es wurden die Auswirkungen der Supplementation mit Kreativ (Cr) und Beta-Guanidinopropionsäure (GPA; einem Cr-Analogon, das ebenfalls der Cr-Aufnahme in die Zelle dient) auf die Differenzierung von Osteoblasten und Chondrozyten in vitro ermittelt. Gegenstand der Untersuchungen waren die Lebensfähigkeit (basierend auf der physischen Aufnahme von Neutralrot und der Stoffwechselaktivität), die histochemische ALP-Aktivität und der Mineralisierungsgrad, sowie die TEM-Ultrastruktur.
Methoden
Zellkultur
Diese Isolierungstechnik basiert auf der Fähigkeit von Osteoblasten, vom Knochen auf ein Substrat zu migrieren. Kalvariaknochen aus dem Scheitelbein und dem Stirnbein (4 pro Versuchstier) wurden unter Sterilitätsbedingungen aus 6 Tage alten IcoIbm-Ratten explantiert. Die Kalvarien wurden in ein calcium- und magnesiumfreies Mineralsalzmedium nach Tyrode (TBSS) gelegt. Das Periost wurde enzymatisch mit 0,05% Trypsin und 0,02% Kollagenase A (0,76 U/mg), gelöst in TBSS (40 Kalvarien/20 ml), entfernt. Die Kalvarien wurden in einem Wasserbad bei 37°C 70 Minuten lang durchgeschüttelt. Sie wurden mit TBSS gewaschen und anschliessend auf 60 mm-Petrischalen (40 Kalvarien/ Schale) übertragen, welche 5 ml 0,02-Kollagenase A (0,76 U/mg) in Kulturmedium BGJ_b, Fitton-Jackson- Modifikation, enthielten, und für 4 Stunden in den Inkubator gelegt. Im Anschluss daran wurden die Kalvarien mit Kulturmedium B, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), gewaschen. Die Kalvarien wurden auf 60 mm-Petrischalen (4 Stirnbeinkalvarien und 4 Scheitelbeinkalvarien/Schale) übertragen. Das mit 10% FCS und 50 μg/ml Ascorbat supplementierte Wachstumsmedium wurde alle 48 h vollständig ausgewechselt. Die Kultur wurde 3 Wochen lang aufbewahrt.
Nach Ablauf von 3 Wochen wurden die migrierten Zellen eingesammelt. Die Petrischale wurde mit TBSS gewaschen und es wurden hierauf 5 ml TBSS enthaltend 0,05% Trypsin und 0,02% Kollagenase A (0,76 U/mg) hinzugefügt. Nach einer Verweildauer von 1 Stunde im Inkubator wurde die Schale mit Kulturmedium BGJ_b, supplementiert mit 10% Kälberserum, gewaschen. Die die Kalvarien und Zellen enthaltenden Schalen wurden mit Medium BGJ_b-hältigem Serum gespült. Die so gewonnenen Zellen wurden zur Entfernung von Knochendebris und Zellaggregaten durch ein Nylonnetz mit einer Maschenweite von 40 μm gefiltert. Die suspendierten Zellen wurden bei 600 g 5 Minuten geschleudert. Das dadurch gewonnene Zellpelle wurde erneut in Medium BGJ_b-hältigem Serum suspendiert und geschleudert. Die Lebensfähigkeit der wieder suspendierten Zellen wurde durch 'Farbstoffausschluss' von 0,4% Trypanblau untersucht und die Zellen wurden in einem Hämozytometer gezählt. Die Beimpfungsdichte betrug 2·10⁵/10 cm² für Einschichtenkulturen und 2·10⁵/30 μl für Mikromassekulturen. Die Mikromassekulturen wurden 1 h lang im Inkubator gehalten und anschliessend wurden 2 ml Wachstumsmedium hinzugefügt.
Organkulturen
Kalvarien mit Periost
Kalvarien aus dem Scheitelbein und dem Stirnbein (4 pro Versuchstier) wurden unter Sterilitätsbedingungen aus 6 Tage alten IcoIbm-Ratten explantiert. Die Kalvarien wurden gründlich mit TBSS durchgewaschen und daraufhin auf 60 mm-Petrischalen übertragen (4 Stirnbeinkalvarien und 4 Scheitelbeinkalvarien/Schale), welche Wachstumsmedium BGJ_b supplementiert mit 50 μg/ml Ascorbat entweder serumfrei oder mit 10% FCS enthielten Das Medium wurde alle 48 h vollständig ausgewechselt. Die Kultur wurde 3 Wochen lang aufbewahrt und daraufhin für die Histologie aufbereitet.
'Denudierte' Kalvarien
Das Periost wurde enzymatisch mit 0,05% Trypsin und 0,02 Kollagenase A (0,76 U/mg), gelöst in TBSS (40 Kalvarien/ 20 ml), entfernt. Die Kalvarien wurden in einem Wasserbad bei 37°C 70 Minuten lang durchgeschüttelt. Sie wurden mit TBSS gewaschen. Die Kalvarien wurden anschliessend auf 60 mm-Petrischalen (40 Kalvarien/Schale) übertragen, welche 5 ml 0,02%-Kollagenase A (0,76 U/mg) in Kulturmedium BGJb enthielten, und für 4 Stunden in den Inkubator gelegt. Anschliessend wurden die Kalvarien mit Kulturmedium BGJ_b, supplementiert mit 10% FCS, gewaschen. Die Kalvarien wurden auf 60 mm-Petrischalen (4 Stirnbeinkalvarien und 4 Scheitelbeinkalvarien/Schale) übertragen. Das Wachstumsmedium BGJ_b, supplementiert mit 50 μg/ml Ascorbat, wurde entweder serumfrei oder mit 10% FCS verwendet und wurde alle 48 h vollständig ausgewechselt. Um die Auswirkung des FCS untersuchen zu können, wurden die Kulturen 3 Wochen lang aufbewahrt und anschliessend für die Histologie aufbereitet.
Zur Untersuchung des Knochenregenerationsvermögens der Kalvarien wurden sie als Langzeit-Kulturen 6, 9, 12, 15 Wochen lang in Wachstumsmedium mit 10% FCS aufbewahrt. Diese Kalvarien wurden alle 3 Wochen auf eine frische Petrischale übertragen. Am Endpunkt angelangt, wurden die Kalvarien für die Histologie aufbereitet.
Embryonale Röhrenknochen
Die Ratten wurden am 17.–18. Tag der Schwangerschaft getötet. Die Embryos wurden unter Sterilitätsbedingungen aus dem Uterus entfernt und beide Oberschenkelknochen wurden durch sorgfältiges Sezieren unter dem Stereomikroskop freigelegt und in sterile TBSS gegeben. Die Organkultur der Rudimente erfolgte in 10 cm²-Petrischalen aus Plastik. Ein Teflon-Halter mit einem Maschennetz (20 μm Porenweite) wurde in der Schale angebracht, um die Explantate in Schwebe zu halten und um optimale Gasaustausch- und Nährbedingungen zu gewährleisten. Der linke und der rechte Oberschenkelknochen eines jeden Tieres wurde nach dem Zufallsprinzip jeweils entweder der Versuchsgruppe oder der Kontrollgruppe zugeordnet. Die Kontrollgruppe wurde in 3 ml B mit 50 μg/ml Ascorbat aufbewahrt. Bei der Versuchsgruppe wurde das Wachstumsmedium entweder mit 10 mM Cr, 20 mM Cr, 1 mM GPA, 5 mM GPA, oder mit 10 mM GPA supplementiert. Das Wachstumsmedium wurde bis zum 10. Tag jeden zweiten Tag erneuert. Die Kultivierung wurde bei 37,5°C und in einer 5% CO₂-Atmosphäre durchgeführt. Nach Verstreichen von 10 Tagen wurde die Feuchtstoffmasse eines jeden Oberschenkelknochens auf einer Mikrowaage bestimmt. Das Ergebnis eines jeden Oberschenkelknochens aus der Versuchsgruppe wird dabei mit jenem seines jeweils kollateralen Gegenstücks aus der Kontrollgruppe in Beziehung gesetzt. Zum Zweck der histologischen Bewertung wurden die Oberschenkelknochen in 4% Formaldehyd fixiert, dehydriert und in Methylmethacrylat eingebettet. Die 6 μm-Schnitte wurden mit Pentachrom-Movat eingefärbt.
Kulturbedingungen
Sämtliche Kulturen wurden bei 37° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit, aufbewahrt.
Alle Kulturmedien wurden mit 50 μg/ml Ascorbat supplementiert. Zur Analyse der Kollagentypen wurden dem Kulturmedium 60 μg/ml Beta-Aminopropionitril (Beta-APN) beigefügt. Während der Zellisolation und der Beimpfung wurde zur Erhöhung der Beimpfungseffizienz auf die Verwendung von Ascorbat verzichtet. Es wurden keine Antibiotika und keine Beta-Glycerophosphate hinzugefügt. Die Medien wurden alle 48 Stunden vollständig ausgewechselt (60 mm-Petrischale 5 ml; 35 mm-Petrischale 2 ml).
Morphologie
Alkalische Phosphatase-Aktivität (histochemisch betrachtet) Die Zellen wurden für die alkalische Phosphatase histochemisch eingefärbt, wie im Sigma Technischen Bulletin Nr. 85L beschrieben.
Prinzip
Mässig fixierte Zellen wurden im Brutschrank in einer Lösung gezüchtet, welche Naphthol AS-MX enthielt. Als Ergebnis der Phosphatase-Aktivität wurde Naphthol AS-MX freigesetzt, welches sich sofort mit einem Diazoniumsalz verband und an jenen Stellen, an denen Phosphatase-Aktivität vorhanden war, einen unlöslichen, blauen Farbstoff bildete.
Lösungen

– Fixierungsmittel 2 Vol. Citratpuffer; Citratkonzentrat verd. 1 : 50 3 Vol. Aceton
– Färbemittel den Inhalt einer Kapsel Fast Blue in 48 ml destilliertem Wasser auf einem Magnetrührer auflösen unmittelbar vor der Verwendung 2 ml einer Naphthol AS-MX Lösung hinzufügen.

Verfahren
1. 3 × in TBSS waschen
2. Fixierung 5 min. bei 20°C
3. 3 × mit destilliertem Wasser abwaschen
4. 30' im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) einfärben
5. 3 × mit destilliertem Wasser abwaschen
Mineralisierung
Prinzip
Die präziseste Methode zur Erkennung von kalzifizierten Matrices ist die von Kossa-Reaktion. Eine Silberfärbung weist auf das Vorhandensein von Calciumphosphat vereinigt mit bestimmten organischen Säuren hin. Strukturdetails sind durch den dunklen Niederschlag völlig verdunkelt.
Kalzifizierte Gewebekomponenten sind in verschiedenen Schattierungen von hellbraun bis tiefschwarz eingedunkelt, und zwar ungeachtet ihres Mineralgehalts.
Lösung

– Silbernitrat 5% AgNO₃ in destilliertem Wasser
– Pyrogallol 1% in destilliertem Wasser
– Natriumthiosulfat 1% Na₂S₂O₃ 5 H₂O in destilliertem Wasser.

Verfahren

1. Fixierung in 4% Formaldehyd 30 Min.
2. 3 × mit destilliertem Wasser abwaschen
3. Silbernitrat 30 Min. im Dunkeln
4. mit destilliertem Wasser 5× abwaschen
5. Pyrogallol 5 Min.
6. mit destilliertem Wasser 5× abwaschen
7. Natriumthiosulfat 10 Min.
8. mit destilliertem Wasser 5× abwaschen

TEM-Aufbereitung
Prinzip
In einem Elektronenmikroskop wird die Untersuchungsprobe einem sehr hohen Vakuum ausgesetzt. Daher muss das Gewebe, um kontrastgebend zu wirken, mit schweren Metallen fixiert und eingefärbt werden, und nur sehr dichtes Material ist in der Lage, Elektronen abzulenken und somit Bilder zu liefern. Das Gewebe wird entweder vor oder/und nach dem Sezieren mit Schwermetallen (Uran, Blei) imprägniert. Da Elektronen nicht sehr tief in das Gewebe eindringen, müssen sehr feine Schnitte (50–100 nm) unter Verwendung entweder eines Glas- oder eines Diamantmessers realisiert werden. Zur Durchführung von Ultradünnschnitten muss die Untersuchungsprobe dehydriert und mit monomerem Kunstharz durchdrungen sein, welches polymerisiert.
Zur chemischen Fixierung wird meist Glutaraldehyd verwendet. Es vernetzt die Proteine kovalent mit ihren Nachbarproteinen. Um die Lipide, insbesondere die Zellmembranen, zu stabilisieren, wird Osmiumperoxid zur Nachfixierung verwendet. Zur Kontrasterhöhung wird das Gewebe en bloc mit Uranylacetat behandelt und die Schnitte werden in der Folge mit Uranylacetat und Bleicitrat eingefärbt.
Lösungen

– 0,2 M Kakodylatpuffer pH 7,4 Stoff A 25 ml Stoff B 1,35 ml 100 ml destilliertes Wasser beigeben Stoff A 10,7 g Kakodylsäure Natriumsalz Trihydrat 250 ml Destilliertes Wasser Stoff B 0,2 M HCl
– Fixierung 25% Glutaraldehyd (EM-Güteklasse) 2 ml 0,2 M Kakodylatpuffer pH 7,4 10 ml 20 ml destilliertes Wasser beigeben
– Nachfixierung 1% OsO₄ in 0,1 M Kakodylatpuffer pH 7,4 1 Vol. 2% OsO₄ 1 Vol. 0,2 M Kakodylatpuffer pH 7,4 2% OsO₄ Phiole brechen destilliertes Wasser zugeben 5 Min. beschallen durch 0,45 mm Filter (Millex) filtern im Dunkeln bei 4°C aufbewahren
– 2% wässeriges Uranylacetat

Verfahren

1.Fixierung bei 20°C	20 Min.
2. in 0,1 M Kakodylatpuffer pH 7,4 spülen	3 × 30 s
3.Nachfixierung bei 4°C	1 h
4. in destilliertem Wasser spülen	3 × 30 s
5. Uranylacetat at Raumtemperatur.	1 h
6. Dehydration in einer abgestuften Ethanolreihe:
7. 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.	alle 5 Min.
8. LR White (Polysciences).	> 2 h
9. Polymerisierung bei 60 °C	über Nacht

Ultradünnschnitte
Prinzip
Ultradünnschnitte wurden entweder mit einem Glasmesser oder mit einem Drukker Diamantmesser auf einem LKB III Mikrotour realisiert, auf beschichtete Formvar-Kupfergitter gelegt und mit Schwermetallen eingefärbt.
Lösungen

– 5% Uranylacetat 1 g/20 ml.
– Bleicitrat nach Reynolds Pb (NO₃)₂ 0,67 g Natriumcitrat 0,88 g Trinatriumcitratdihydrat 15 ml destilliertes Wasser während 15 Min, mässig durchschütteln 4 ml 1 N NaOH hinzufügen, weisser Niederschlag geht in Lösung auf 25 ml mit destilliertem Wasser auffüllen destilliertes Wasser hinzufügen bis 25 ml
Beide Lösungen vor dem Gebrauch durch einen Whatman Nr. 50 (gehärtet) durchfiltern.

Verfahren
Alle Lösungen wurden als Tropfen auf einen Parafilm aufgebracht. Einzelne Gitter wurden schwebend, mit der Schnittseite nach unten, auf die Tröpfchen gelegt. Feste NaOH-Pellets wurden in eine in derselben Kammer befindliche Plastikschale gelegt, um in der Luft vorhandenes CO₂ zu absorbieren, um eine Kohlendioxidausfällung von Bleisalzen zu verhindern. Die Färbelösungen und die festen NaOH-Pellets wurden beide mit einem Deckel zugedeckt.

1. destilliertes Wasser
2. 5% Uranylacetat 10 Min.
3. destilliertes Wasser 2 ×
4. Bleicitrat 10 Min.
5. M NaOH₃ × 30 s
6. destilliertes Wasser 2 ×
7. die zwischen den Pinzettenspitzen verbleibenden, geringen Wassermengen mit Filterpapier entfernen und die Gitter auf Whatman Nr. 50 Filterpapier mit der Schnittseite nach oben trocknen. Als die Gitter fertig getrocknet waren, wurden sie gebrauchsfertig in einem Lagerbehälter aufbewahrt.

Die Schnitte wurden auf einem mit 100 kV betriebenen JEOL JEM 100 CX Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht. Es wurden Mikrofotografien auf einem Kodak EM 4303 Film mit den Standard-Vergrösserungsfaktoren 2000, 5000, 20000 oder 33000 angefertigt. Der Ausdruck der Bilder erfolgte auf Papier mit wechselndem Kontrast.
Zell-Lebensfähigkeit (MTT)
Der 'Zellproliferationskit I (MTT)' nach Böhringer kam für die Untersuchung zum Einsatz, wir verwendeten jedoch ein anderes Lösungsmittel zur Auflösung der MTT Kristalle.
Prinzip
Ursprünglich beschrieb Mosmann 1983 das allgemeine Prinzip, das bei der Erkennung von Zellwachstum/Zelltod involviert ist, als durch die Umwandlung des Tetrazoliumsalzes (MTT) in das gefärbte Formazan durch mitochondriale Dehydrogenasen angezeigt. Dessen Konzentration kann dann spektralphotometrisch gemessen werden.
Verfahren

1. Der MTT Stamm (5 mg/ml in sterilem PBS) von Böhringer wurde auf das 110-fache mit fertigem Wachstumsmedium verdünnt und es erfolgte eine sterile Filterung.
2. Die Zellen wurden in 2 ml/10 cm² MTT-Lösung bei 37°C 3 h lang im Inkubator herangezüchtet.
3. Der Flüssigkeitsüberstand wurde sorgfältig entfernt.
4. 4 ml/10 cm² Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden hinzugefügt.
5. Die Schalen wurden so lange auf einen Schüttelapparat gestellt bis sich die Kristalle zur Gänze aufgelöst hatten.
6. Die Absorbanz des Flüssigkeitsüberstands (3 Aliquotanteile/Schale) wurde bei 550 nm gegenüber DMSO abgelesen.

Kommentar
Wenn die Absorbanz höher als 1 war, wurden die Untersuchungsproben gemeinsam mit dem DMSO aufgelöst.
Zell-Lebensfähigkeit (Neutralrot, NR)
Es wurde die in (Lindl et al., 1994) beschriebene Methode verwendet.
Prinzip
Die Aufnahme von NR in die Lysosomen erfolgt unabhängig von dem Stoffwechselstatus der Zelle.
Lösungen

– 0,5 mg Neutralrot/ml Wachstumsmedium, für mindestens 2 h auf 37°C erwärmt, sterile Filterung
– Extraktionspuffer 50% Ethanol in 1% Essigsäure

Verfahren

1. Die Zellen wurden in 2 ml/10 cm² NR-Lösung bei 37°C 3 h lang im Inkubator herangezüchtet.
2. Der Flüssigkeitsüberstand wurde entfernt,
3. Durchwaschen mit PBS, zumindest 3 Mal, bis keine Kristalle mehr vorhanden waren.
4. Hinzufügung von 4 ml/10 cm² Extraktionspuffer.
5. Die Absorbanz des Flüssigkeitsüberstands (3 Aliquotanteile/Schale) wurde bei 540 nm gegenüber dem Extraktionspuffer abgelesen.
6. Wenn die Absorbanz höher als 1 war, wurden die Untersuchungsproben gemeinsam mit dem Extraktionspuffer aufgelöst.

Statistik
Der Mittelwert und die Standardabweichung bestanden aus n unabhängigen Experimenten. Die Werte für die einzelnen Experimente wurden aus dem Durchschnitt von 3 aliquoten Anteilen derselben Schale ermittelt. Um die Behandlung zu vergleichen zu können, wurde eine Analyse der Kontraste von Varianzmodellen ausgewertet.
Bei Experimenten, die als gepaarte Entwürfe durchgeführt wurden, wurde eine modellhafte Buchführung für die als Blöcke betrachteten Tiere geprüft. Haupteffekte und Interaktionseffekte wurden durch F-Tests untersucht.
Mithilfe von 'Fehlerquadratmitteln', die berechnet wurden, um zu Durchschnittsmitteln zu gelangen, wurden die anderen Variablen in dem Modell gebildet. Fehlerquadratmittel wurden unter Verwendung des Mehrbereichstests nach Tukey miteinander verglichen. QQ-Diagramme der Residuale und Tukey-Ascombe-Diagramme (Residuale und vorhergesagte) wurden analysiert um die normale Verteilungsannahme auf ihre Richtigkeit hin zu prüfen.
Ergebnisse
Einschichten-Zellkultur
Zell-Lebensfähigkeit und Stoffwechselaktivität
Was die Zell-Lebensfähigkeit betrifft, so wurden von dem Neutralrot (NR) in allen Gruppen hauptsächlich die am Rand und an der Spitze der Noduli befindlichen Zellen sowie die zwischen diesen Zellen befindlichen Zellen eingefärbt. Bei der Einfärbung mit Trypanblau zeigte es sich, dass die Zellen/Matrix zwischen den Noduli und die Noduli selber eingefärbt wurden.
Erste quantitative Daten zur NR-Aufnahme zeigten, dass die Cr-Gruppe und die GPA-Gruppe nach 2 Wochen ähnliche Ergebnisse aufwiesen als die Kontrollgruppe. Was die durch die MTT-Reaktion gemessene Stoffwechselaktivität anlangt, so wurden die Cr-Gruppen verglichen mit der Kontrollgruppe leicht stimuliert, jedoch wies die 5 M- oder die 10 mM-GPA-Gruppe niedrigere Werte als die Kontrollgruppe aus, was auf eine gewisse Hemmung der GPA bei diesen speziellen Konzentrationen hindeutet Die 1 mM GPA-Gruppe verhielt sich ähnlich wie die Kontrollgruppe. Nach 3 Wochen wiesen alle Testgruppen eine niedrigere NR-Aufnahme auf als die Kontrollgruppe. Das Cr stimulierte die MTT-Reaktion und die 1 mM oder 5 mM GPA-Gruppe hatte niedrigere Werte als die Kontrollgruppe. Die 10 mM GPA-Gruppe verhielt sich ähnlich wie die Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das Cr eine stimulierende Wirkung auf den Stoffwechsel der Zellen hat und dass die GPA bis zu einem gewissen Grad eine hemmende Wirkung auf die mitochondriale Aktivität der Zellen ausübte.
Bei den weiteren Experimenten zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit und der Stoffwechselaktivität der Zellen wurden ausschliesslich die Kreatin-Gruppen verwendet. Die statistische Analyse der NR-Aufnahme (1) zeigte, dass ein geringe aber signifikanter Wechselwirkungseffekt vorhanden war (p < 0,05). Dies bedeutete, dass die Auswirkung einer Kreatinbehandlung zu den verschiedenen Zeitpunkten einander nicht ähnlich war. Die NR-Aufnahme der Kontrollgruppe nach Verstreichen von 1 Woche war signifikant niedriger als jene nach 2 und nach 3 Wochen (p < 0,03, bzw. p < 0,0002). Die NR-Aufnahme der 10 mM Cr-Gruppe war signifikant höher nach 3 Wochen verglichen mit jener nach 1 Woche (p < 0,02). Nach 1 und nach 2 Wochen gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu verzeichnen. Nach 3 Wochen lag die Kontrollgruppe signifikant (p < 0,008) höher als die 20 mM Cr-Gruppe. Die erhöhte NR-Aufnahme der Kontrollgrupe während der Kultur deutete darauf hin, dass eine Zunahme der Anzahl der Zellen stattgefunden hat. Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der 10 mM Cr-Gruppe war nicht signifikant. Dies zeigte, dass das Kreatin in dieser speziellen Konzentration keine toxische Wirkung ausübte. Dies stand in Gegensatz zu der 20 mM Cr-Gruppe, welche verglichen mit der Kontrollgruppe eine signifikant abgesenkte NR-Aufnahme zeigte. Dies liess auf gewisse toxische Auswirkungen auf die Proliferation der Zellen schliessen.
Betreffend die Stoffwechselaktivität (MTT) der Zellen ( 2), hatte Kreatin eine Auswirkung auf in der Kultur vorhandene Osteoblasten. Nach 1 Woche verhielten sich alle Gruppen ähnlich. Nach 2 Wochen lag die Kontrollgruppe sigifikant unter der 10 mM Cr-Gruppe und unter der 20 mM Cr-Gruppe (p < 0,015, bzw. p < 0,0025). Nach 3 Wochen lagen die 10 mM Cr-Gruppe und die 20 mM Cr-Gruppe beide signifikant über der Kontrollgruppe (p < 0,001). Diese Daten zeigten, dass Kreatin allgemein gesprochen die Stoffwechselaktivität von Osteoblasten von der zweiten Woche an stimulierte.
Morphologie
Nach 1 Woche bildeten die Zellen in allen Gruppen eine monomolekulare Schicht mit ALP-positiven Zellen. Manche Zellen wiesen eine ausgesprochen hohe ALP-Aktivität auf. Nach 2 Wochen bildeten sämtliche Gruppen eine bestimmte Menge kleiner, mineralisierter Noduli aus. Nach 3 Wochen war die allgemeine Einfärbung als Zeichen einer ALP-Aktivität in allen Gruppen ähnlich. Bei stärker Bildvergrösserung zeigte sich bei den GPA-Gruppen ein unterschiedliches Färbemuster für die ALP-Aktivität, verglichen mit der Kontrollgruppe und der Cr-Gruppe. Die Zelldichte um die Noduli herum war geringer als in der Kontrollgruppe und der Cr-Gruppe. Nach 3 Wochen kam es zu einer Zunahme der Grösse und Anzahl der Noduli verglichen mit dem Zustand nach 2 Wochen. Alle Testgruppen wiesen einen höheren Mineralisierungsgrad auf als die Kontrollgruppe. Das Kalzifizierungsmuster der GPA-Gruppen unterschied sich von jenem der Kontrollgruppe und der Cr-Gruppe insofern als die Mineralisierung nicht auf die Noduli beschränkt war und mehr einzelne Zellen eine Kalzifizierung aufwiesen als bei der Kontrollgruppe und der Cr-Gruppe.
Im Zuge der weiterführenden Experimente zur Quantifizierung der Kalzifizierung mittels Bildanalyse des Zentralbereichs (123 mm²) der Petrischale wurden lediglich die Kreatin-Gruppen mit den Kontrollgruppen verglichen, wohingegen die GPA-behandelten Zellen nicht weiter ausgewertet wurden. Die statistische Analyse zeigte, dass nach 2 Wochen der kalzifizierte Bereich in der 20 mM Cr-Gruppe (3) signifikant höher war als jener in der Kontrollgruppe (p < 0,02). Nach 3 Wochen wies die 10 mM Cr-Gruppe einen höheren Mineralisierungsgrad auf als die Kontrollgruppe, während die 20 mM Cr-Gruppe weniger effizient war, es war jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen festzustellen.
TEM-Monoschicht
Die Ultrastruktur der Kontrollgruppe bei 1% FCS ähnelte jener der Zellen, welche bei 10% FCS gehalten wurden.
Die Ultrastruktur zeigte, dass es keine augenfälligen Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe, der 10 mM Cr-Gruppe, der 20 mM Cr-Gruppe, der 1 mM GPA-Gruppe und der 5 mM GPA-Gruppe gab.
In allen Gruppen kam es zur Kollagenproduktion und zur Mineralisierung. Das Zell-Zytoplasma wies die typischen Merkmale von Osteoblasten auf, wie etwa eine gute Entwicklung des RER, des Golgi-Bereichs, der Mitochondrien, der Vesikeln und der Mikrofilamente. Die Zellen verfügten über zahlreiche Zellfortsätze, die in engem Kontakt zueinander standen. Es erfolgte eine reichliche Kollagenproduktion. Die Kollagenfibrillen wurden in den Membranfalten beobachtet. Der Durchmesser der Fibrillen war eher gleichförmig. Im Bereich der Mineralisierung schienen die einzelnen Fibrillen zu grösseren Einheiten zu verschmelzen. Das Mineralisierungsmuster war in allen Gruppen ähnlich. In den untersten Zellschichten kam es zur Bildung von nadelähnlichen Strukturen mit hoher Dichte. An der Mineralisierungsfront wurde dasselbe Material im Bereich um die Kollagenfibrillen herum und in enger Apposition zu den Plasmamembranen beobachtet. Mineralisierte Gewebeteile fanden sich in der Kollagenmatrix. In Bereichen mit weit vorangeschrittener Kalzifizierung waren die Details der Matrix nicht mehr zu erkennen.
Mikromasse-Zellkultur
Die NR-Aufnahme war nach 1 und nach 2 Wochen in allen Gruppen ähnlich. Nach 3 Wochen wiesen die 20 mM Cr-Gruppen eine signifikant niedrigere NR-Aufnahme auf (p < 0,005, bzw. p < 0,003) als die Kontrollgruppe und die 10 mM Cr-Gruppe. Die Mitochondrienaktivität (MTT-Umwandlung) war nach 1, nach 2 und nach 3 Wochen in allen Gruppen ähnlich. Die Cr-Gruppen mit einer Konzentration von 10 mM und 20 mM wiesen jedoch nach 2 Wochen eine signifikant höhere MTT-Reaktion auf als nach 1 Woche (p < 0,02, bzw. p < 0,006). Nach 3 Wochen war bei der 20 mM Cr-Gruppe eine signifikant niedrigere MTT-Umwandlung festzustellen als nach 2 Wochen (p < 0,015). Was den mineralisierten Bereich (4) anlangt, so wiesen die Kreatin-Gruppen mit den Konzentrationen von 10 mM und 20 mM nach 2 Wochen einen signifikant höheren Mineralisierungsgrad (p < 0,00025) auf als die Kontrollgruppe. Nach 3 Wochen war der mineralisierte Bereich bei den Kreatin-Gruppen mit den Konzentrationen von 10 mM und 20 mM signifikant grösser als bei der Kontrollgruppe (p < 0,0035, bzw. p < 0,03). Weiterhin zeigte die Kontrollgruppe und die 10 mM Cr-Gruppe einen signifikant höheren Mineralisierungsgrad nach 3 Wochen als nach 2 Wochen (p < 0,0005, bzw. p < 0,0015).
Organkultur
Oberschenkelknochen
Die Kontrollgruppe (5) zeigte jeweils eine signifikant niedrigere Feuchtstoffmasse als die 10 mM Cr-Gruppe (p < 0,005), die 20 mM Cr-Gruppe (p < 0,001), die 5 mM GPA-Gruppe (p < 0,0005) und die 10 mM GPA-Gruppe (p < 0,015). Die Ergebnisse der 1 mM GPA-Gruppe wiesen verglichen mit der Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede auf.
Bewertung der Experimentdaten
Zu beobachten war ein geringer aber signifikanter Wechselwirkungseffekt von Kreatin bei der NR-Aufnahmen in Monoschicht-Kulturen. Dies bedeutete, dass die Auswirkung der Kreatinbehandlung zu den verschiedenen Zeitpunkten einander nicht ähnlich war. Bei der Kontrollgruppe war ein signifikanter Anstieg der NR-Rufnahme während der Kultur zu beobachten. Dies war durch eine zahlenmässige Vermehrung der Zellen bedingt. Nach 1 und nach 2 Wochen gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu verzeichnen. Nach 3 Wochen war jedoch die Auswirkung der 10 mM Cr-Gruppe auf die NR-Aufnahme signifikant verglichen mit jener nach 1 Woche. Nach 3 Wochen lag die 20 mM Cr-Gruppe signifikant unter der Kontrollgruppe. Dies lies auf gewisse toxische Auswirkungen schliessen, die eine verminderte Proliferation der Zellen zur Folge hatte. Nicht beobachtet werden konnte dies bei der 10 mM Cr-Gruppe, die sich ähnlich wie die Kontrollgruppe verhielt. Dies zeigte, dass das Kreatin in dieser speziellen Konzentration von 10 mM keine toxische Wirkung ausübte. Bei den Mikromasse-Kulturen war die NR-Aufnahme nach 1 und nach 2 Wochen in allen Gruppen ähnlich. Nach 3 Wochen jedoch wies die 20 mM Cr-Gruppe eine signifikant geringere Menge davon auf als die Kontrollgruppe und die 10 mM Cr-Gruppe. Im Gegensatz zu den Monoschicht-Kulturen wurde die NR-Aufnahme während der Kultur nicht verringert. Die Erklärung hierfür lag in der Tatsache, dass bei Mikromasse-Kulturen die Zellen dabei waren, von dem ursprünglich aufgeimpften Zellentropfen wegzuwandern, wodurch sich die Anzahl der Zellen langsam vegrössert.
Die Ergebnisse betreffend die Stoffwechselaktivität von in Monoschicht-Kulturen gezüchteten Osteoblasten zeigten ab der zweiten Woche eine signifikante Stimulierung dieser Zellen durch Kreatin, und zwar bei beiden Konzentrationsgruppen, 10 mM und 20 mM. Bei Mikromasse-Kulturen war der Anstieg bei der MTT-Umwandlung bei den Cr-Gruppen nur signifikant was den Zustand nach 2 Wochen in Bezug auf jenen nach 1 Woche betrifft. Dies legte den Schluss nahe, dass Mikromasse-Kulturen sich anders verhalten als Monoschicht-Kulturen. Dies war nicht weiter erstaunlich, denn in Mikromasse-Kulturen treten die Zellen bereits in einem sehr frühen Stadium untereinander in Kontakt, wodurch der Differenzierungsprozess früher einsetzte als dies bei Monoschicht-Kulturen der Fall ist, bei denen die Zellen zunächst proliferieren müssen, bevor sie untereinander in Kontakt treten können. Nichtsdestoweniger hatte das Kreatin einen signifikant stimulierenden Einfluss auf die Stoffwechselaktivität der Mikromasse-Kulturen, wie aus der frühzeitigen Mineralisierung bereits nach 2 Wochen hervorgeht, verglichen mit dem Zustand nach 1 Woche.
In allen Gruppen färbte das NR hauptsächlich die Zellen am Rand und an der Spitze der Noduli sowie die zwischen diesen liegenden Zellen. Ein bei allen Gruppen durchgeführtes Einfärben mit Trypanblau zeigte, dass die am Boden der Petrischale befindlichen Zellen sich ebenso gut einfärben liessen wie jene in den Noduli. Dies könnte entweder auf ein beim Einfärben auftretendes Artefakt zurückzuführen sein, oder es könnte auch sein, dass die Zellmembran der eingefärbten Zellen tatsächlich beschädigt war. Was die Artefakt-Variante betrifft, so würde dies bedeuten, dass Trypanblau auch ausserzelluläre Proteine einfärbt. Einen Hinweis auf das Vorhandensein von beschädigten Zellmembranen ergaben die TEM-Ultrastrukturuntersuchungen von Monoschicht-Kulturen. Manche der Zellen in der Nähe der Oberfläche der Petrischale wiesen elektronendichtes, nadelähnliches Material im Zytoplasma auf. Es könnte sein, das die unteren Zellen des mineralisierenden Nodulus nicht genügend Nahrung oder Sauerstoff auf dem Weg der Diffusion durch all die anderen Zellschichten erhalten haben. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen am Leben erhalten werden, denn nur lebensfähige Zellen sind in der Lage, die Mineralablagerung zu regulieren und eine dystrophische Kalzifizierung zu verhindern. Das Vorhandensein abgestorbener Zellen kann zu einer erhöhten Mineralisierung führen.
Nach 2 Wochen bildeten alle Gruppen einige kleine mineralisierte Noduli aus, deren Anzahl und Grösse sich nach 3 Wochen vermehrte. Eine Kalzifizierung konnte auch bei einzelnen Zellen beobachtet werden. Die mittleren Werte waren nach 2 und nach 3 Wochen bei den Cr-Gruppen höher als bei der Kontrollgruppe. Bei den Mikromasse-Kulturen wiesen die Cr-Gruppen eine signifikant höhere Mineralisierung auf als die Kontrollgruppen.
Somit vermehrte das Kreatin die Bildung von mineralisierten Noduli durch eine Erhöhung der Stoffwechselaktivität der diversen, kulturgezüchteten Osteoblasten. Es ist naheliegend, anzunehmen, dass es während der Gewebemineralisierung zu einem erhöhten PCr-Umsatz kommt, weil die Kreatinphosphatkonzentration kalzifiziertem Knorpel gering ist und die Aktivität der Kinase in diesem Bereich hoch ist. Darüber hinaus kann der im Knorpel stattfindende Energiestoffwechsel einen Einfluss auf die formbildenden Ereignisse des Skelettwachstums ausübt.
Es gilt als bewiesen, dass die Mineralisierung von Zellen eine grosse Energiemenge erfordert. Im Differenzierungsstadium befindliche knochenbildende Zellen haben Mitochondrien mit verdichteten Cristae, welche auf einen beschleunigten Energiestoffwechsel schliessen lassen. Diese Mitochondrien sind besonders zahlreich während der Differenzierungsphase vorhanden und nehmen mit zunehmendem Reifegrad der Kultur ab. Man geht davon aus, dass die Mineralisierung vielmehr mit einem optimalen Grad des Energiestoffwechsels verbunden ist als mit extrem verminderter oder erhöhter Sauerstoffkonzentration.
Eine vermehrte Glykolyse gepaart mit konstanter mitochondrialer Aktivität führt zu einem erhöhten Energiestoffwechsel und zu einer Steigerung der ATP-Produktion. Diese vermehrte Verfügbarkeit von ATP könnte ein Grund dafür sein, dass Osteoblasten grössere Mengen an Kollagen aufbauen, wenn sie einem hohen pH ausgesetzt sind. Eine während der Knochen- und Knorpelbildung stattfindende, erhöhte Zelldifferenzierung geht Hand in Hand mit erhöhten Aktivitäten von ATPase und Lactat, Malat und Glukose-6-phosphat-Dehydrogenasen. Die grösste Aktivität wurde beim Einsetzen der Matrixablagerung beobachtet, gefolgt von einem Abfallen der Enzymaktivitäten während der Transformation von Osteoblasten in reife Osteozyten und während der Hypertrophie von Chondrozyten. Die bei Osteoblasten festgestellte histochemische ATPase-Aktivität ist an die Stoffwechselaktivität und -lebensfähigkeit dieser Zellen angepasst. Die ARPase-Aktivität ist bei Knochen- und Knorpelzellen bedeutend geringer als bei der Skelettmuskulatur, den Blutgefässen und beim Knochenmark. Osteoklaste weisen eine starke ATPase-Aktivität auf und werden, was die Intensität betrifft, gefolgt von Osteoblasten, osteo-chondrogenen Zellen und zuletzt von Osteozyten. Die Knorpelzellenaktivität, die in dieser Weise geregelt wird, ist im allgemeinen schwächer als die osteoblastische Aktivität. Junge Zellkompartimente weisen eine grössere Aktivität auf als jene älterer Tiere, wobei Aktivitätsspitzen üblicherweise bis zu einem Alter von 5 Wochen beobachtet werden. Mit zunehmendem Alter und verringerten Funktionsanforderungen tritt ein Rückgang der ATPase-Aktivität ein, wobei Gelenksknorpelzellen davon ausgenommen sind. Eine Hemmung der Glykolyse führt sowohl zu einer Reduktion bei der Kollagensynthese als auch zu einer Hypermineralisierung der Schienbeinknochen von Hühnerembryos über einen weiten Bereich von [Ca × Pi] in dem Medium (Pi 0, 5 mM–3, 0 mM und 1,8 mM Ca²⁺). Weiterhin kommt es bei fehlendem Glutamin zu vermehrtem Absterben von Zellen. Glutamin tritt als a-Ketoglutarat in den Citronensäurezyklus ein und liefert dabei biosynthetische Präkursorsubstanzen und NADH. NADH tritt in die oxidative Phosphorylierung ein und liefert dabei ATP. Eine Hemmung der Aktivität von NAD-abhängigen Enzymen gepaart mit der Produktion von ATP beeinträchtigt die Knorpelbildung und führt in weiterer Folge zu einer Verkürzung der Gliedmassen.
GPA, ein kompetitiver Inhibitor des Eintretens von Cr in Zellen, scheint negative Auswirkungen sowohl auf den Stoffwechsel als auch auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu haben, die Mineralisierung wird durch ihn jedoch erhöht. Dies liesse sich durch die Tatsache erklären, dass der Zelltod auch zu einer Mineralisierung führen kann. Da die Stoffwechselaktivität von kreatinbehandelten Zellen im allgemeinen höher war als die der Kontrollgruppe, derselbe Parameter bei GPA-behandelten Zellen jedoch niedriger ausfiel, kam man zu dem Schluss, dass die erhöhte Mineralisierung bei den Cr-behandelten Gruppen durch die Osteoblast-Stoffwechselstimulation bedingt war, wohingegen jene bei GPA-behandelten Zellen in erster Linie auf Zelltod zurückzuführen war. Es wird gezeigt, dass der Knorpel der Wachstumsfuge sich nicht auf den durch die Verabreichung von GPA bedingten Stoffwechselstress einstellen kann, was in vivo und in vitro eine gestörte enchondrale Knochenbildung zur Folge hat. Der Bereich des kalzifizierten Knorpels ist breiter und reicht bis in die Metaphyse hinein. In den hypertrophischen Chondrozyten bilden sich Hohlräume, das Stützgewebe ist unzureichend und die Mineralisierung erfolgt in weniger reichlichem Umfang und kommt auch in den Septa transversa vor. Die Gefässdurchdringung des Gewebes ist mangelhaft. Es kommt zu einer verringerten Osteoidausbildung. GPA beeinträchtigt die Synthese von pro-a Typ II- und Typ X-Kollagen in kultivierten Chondrozyten. Bei schalenlosen Langzeitkulturen unter Verwendung von GPA wird zwar die CK-Aktivität in ihrer Gesamtheit nicht verändert, es kommt jedoch zu Störungen des CK-Isoenzymprofils. Die Aktivität von BB-CK in den Röhrenknochen wird unterdrückt, doch die Isoenzym-Distribution von Kalvarien ist davon nicht betroffen. Normaler embryonaler Knorpel enthält annähernd gleiche Anteile an MM-CK und BB-CK. Bei embryonalen Kalvarien und Knochen kommt es hauptsächlich zur Expression von BB-CK. Bei einer Fütterung der Ratten und Mäusen mit GPA kommt es zu einer allmählichen Abnahme der Konzentrationen von Cr und PCr in Herz- und Skelettmuskeln, was zu ausgeprägten morphologischen Veränderungen führt, von denen vor allem Mitochondrien beeinflusst werden. Eine Population von vergrösserten, stabförmigen Mitochondrien mit charakteristischen, kristallinen, intramitochondrialen Einschlüssen tritt in vitro bei Herzmuskelzellen von erwachsenen Ratten auf. Dieses Phänomen ist vollständig reversibel, wenn das Zellkulturmedium mit Cr supplementiert wird. Das Auftreten von in hohem Masse geordneten, intramitrochondrialen Einschlüssen korreliert mit einem niedrigen intrazellulären Gesamtkreatingehalt. Die Immunofluoreszenz und die Immunoelektronenmikroskopie zeigen, dass diese Einschlüsse für Mi-CK angereichert sind.
Bei den GPA-behandelten Osteoblasten ähnelten die Mitochondrien jenen der Kontrollgruppe und der Cr-Gruppe. Osteoblaste reagieren also anders auf GPA als Muskelzellen. Es wird gezeigt dass GPA einen vergleichsweise geringeren Einfluss auf den Cr- und PCr-Gehalt des Gehirns hatte. Die Mitochondrien des Musculus soleus zeigen verglichen mit der Kontrollgruppe einen Zuwachs an Mi-CK-Protein um das 4-fache und einen Zuwachs an Adeninnukleotid Translokatorprotein um das 3-fache.
Schlussfolgerungen
Kreatin stimuliert über die Wirkung von Kreatinkinase und anderen kretin- bzw. phosphokreatin-regulierten Enzymen wie etwa AMP-abhängige Proteinkinase die Mineralisierung von Osteoblasten in Kultur, indem es die Stoffwechselaktivität der in Monoschicht-Kultur gezüchteten Zellen erhöht. Bei Mikromasse-Kulturen erhöhte das Kreatin zwar die Mineralisierung, die Stoffwechselaktivität war jedoch ähnlich wie bei der Kontrollgruppe. Allerdings war in der Kreatin-Gruppe die MTT-Umwandlung nach 2 Wochen im Vergleich zu dem nach 1 Woche gegebenen Zustand signifikant erhöht. Das Kreatin hatte wahrscheinlich gewisse Auswirkungen auf den Differenzierungsprozess der Zellen in diesem Zellkulturmodell. Während der Nodulusausbildung und der darauf folgenden Kalzifizierung benötigen die Zellen eine grosse Menge chemischer Energie. Die Biosynthese von Matrixkollagen und Proteoglykanen bzw. die Proliferation der Zellen wird erhöht. Als externer Energielieferant hat das Kreatin den Vorteil, dass es den in dem Wachstumsmedium vorhandenen pH nicht herabsetzt, wodurch eine Hemmung der Glykolyse und der Kollagensynthese vermieden wird.
Das Kreatin erhöht auch die Feuchtstoffmasse embryonaler Oberschenkelknochen (5) bei Organkulturen. Dies kann als Anzeichen dafür gewertet werden, dass nicht nur Knochen- sondern auch Knorpelzellen von einer externen Kreatinzuführung profitieren. Die Biosynthese des Matrixkollagens und des Proteoglykans bzw. die Proliferation der Zellen wird stimuliert.
Kretin kann daher als Nahrungsmittelzusatz bzw. -supplement für Menschen und Tiere verwendet werden, um den Heilungsprozess nach einem Trauma und nach orthopädischen chirurgischen Eingriffen bei Frakturen und Knochendefekten zu unterstützen.
Das Kreatin ist auch in der Lage, den Stoffwechsel von Osteoblasten bei Patienten, welche an Osteoporose leiden, zu stimulieren. Auch bei der Behandlung von degenerativen Knorpelerkrankungen wie z. B. Arthritis hat Kreatin eine unterstützende Wirkung.
Die Behandlung grosser Knochendefekte stellt nach wie vor eine Herausforderung für den Chirurgen dar. Patienten, die an solchen grossen Knochendefekten leiden, können durch Knochentransplantation aus dem Darmbeinkamm an die von dem Defekt betroffene Stelle bzw. durch Kallusdistraktion oder Segmenttransport behandelt werden. Alle diese Verfahren sind für den Patienten sehr schmerzvoll und darüber hinaus ist auch das Knochentransplantat nur in begrenzten Mengen vorhanden. Der Einsatz der Gewebetechnologie bietet eine Lösung für dieses Problem. Knochenbildende Zellen (Osteoblaste, mesenchymale Stammzellen, Periostzellen, Knochenmark-Stromazellen oder Mantelzellen des Muskels) sowie von gesunden Individuen bzw. aus dem Körper des Patienten selbst entnommene Chondroblaste werden als Monoschicht-Kulturen, Mikromasse-Kulturen oder in einem dreidimensionalen, biologisch abbaubaren Stützgewebe unter Beigabe von Kreatin herangezüchtet. Die Knochen- oder Knorpelzellen bzw. die zellbeimpften Schwämme, Schäume oder Membranen werden zu einem späteren Zeitpunkt an die von dem Defekt betroffene Stelle im Körper des Patienten übertragen. Den kritischsten Schritt bei diesem Ansatz stellt die Aufbereitung der Zellkultur dar. Besonders wichtig dabei ist, das die Zellen in vitro überleben, sich vermehren und sich differenzieren. Es müssen daher optimale Kulturbedingungen gegeben sein. Die Zugabe von Kreatin als Supplement zu dem Kulturmedium ist diesbezüglich zuträglich.
Obwohl es bei Knochen- und Knorpelzellen zu einer Expression von Kreatinkinase kommt, wenn auch nur in relativ kleinen Mengen im Vergleich zu Muskel- oder Gehirnzellen, ist es überraschend, dass eine Überexpression von Kreatinkinase gepaart mit Kreatin-Supplementierung bei den Knorpel- und Knochenzellen zu einer verbesserten Proliferation, Stoffwechselstabilität und Resistenz gegenüber Stressoren, wie z. B. Toxinen, Hitze, Stoffwechselüberlastung, etc. führte. Knochenbildende Zellen (Osteoblaste, Periostzellen, Knochenmark-Stromazellen oder Mantelzellen des Muskels) und knorpelbildende Zellen (Chondroblaste), welche von gesunden Individuen bzw. aus dem Körper des zu behandelnden Patienten selbst entnommen worden sind, werden also in Form von Zellkulturen aufbereitet und mit komplementärer DNA-Codierung transfiziert und dadurch zur Expression von Kreatinkinase-Isoformen veranlasst (wobei es sich entweder um cytosolische, muskelspezifische MM-CK, um cytosolische, ubiquitäre, hirnspezifische BB-CK oder um das heterodimere MB-CK-Hybridenzym, oder um sarkomere bzw. ubiquitäre, mitochondriale Mi-CK'n oder Kombinationen daraus handeln kann). Komplementäre DNA (cDNA) kann durch umgekehrte Transkription (RT) der mRNA von CK-Isoenzymen, durch eine RT-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), oder durch andere Verfahren unter Verwendung des geeigneten, den jeweiligen CK-Isoenzymen entsprechenden Startermoleküls gewonnen werden.
Die Methoden des Gentransfers zur cDNA-Codierung für Kreatinkinase-Isoformen sollen die gesamte Palette möglicher Transfektionstechniken umfassen, sowie auch neue, in Zukunft entwickelte und öffentlich zugänglich gemachte Techniken, wie zum Beispiel Transfektion durch Mikroinjektion von Zellen, Transfektion durch Zentrosomen-Bombardement oder Transfektion des DNA-Präzipitats, sowie Transfektion durch verschiedene Viren, virale und nicht-virale Vektoren oder Plasmide (Single-copy- und Multi-copy-Plasmide), Cosmide oder künstliche Chromosomen. Die Kreatinkinase-Expression erfolgt gesteuert von schwachen oder starken, gewebespezifischen Promotoren. Eingebaute Auswahlmarker, z. B. Widerstandskraft gegenüber Antibiotika, Toxinen oder anderen Substanzen machen es möglich, transfizierte Zellen gezielt auszuwählen, die dann wie weiter oben beschreiben, unter Beigabe von 1 bis 20 mM in Kulturen herangezogen und vermehrt werden.
Mit Kreatinkinase-cDNA transfizierte Knorpel- oder Knochenzellen, die zu einer Überexpression eines oder mehrerer Kreatinkinase-Isoenzyme veranlasst wurden, werden dann auf einem Auswahlmedium ausgewählt, expandiert und entweder als Monoschichten, Mikromasse-Kulturen oder auf dreidimensionalem, biologisch abbaubarem Stützgewebe oder Gewebeschwämmen (wie weiter oben beschrieben) kultiviert, um in vitro gentechnologisch veränderte Knorpel- und Knochengewebevorstufen zu bilden, welche an die von Knorpel- bzw. Knochendefekten betroffenen Stellen transplantiert werden können. Derart transfizierte Knorpelzellen können zum Beispiel in arthritische Gelenke injiziert werden, um die beschädigten Bereiche wieder aufzufüllen und die mit Knorpeldegeneration verbundenen Defekte in dem betroffenen Gelenk auf dem Weg der Proliferation und der Herstellung einer neuen, chondrozytenabgeleiteten, extrazellulären Matrix zu reparieren. In ähnlicher Weise können transfizierte, knochenbildende Zellen in von einem Knochendefekt betroffene Bereiche reimplantiert werden, um die Regeneration und das Wachstum von Knochenmasse bei den Patienten wieder in Gang zu bringen.
Da Kreatinkinase und Kreatin/Phosphokreatin eine wichtige Rolle bei der Bildung und beim Erhalt von Knorpel- und Knochengewebe spielen, kommt es bei solchen Geweben, welche durch gentechnologische Veränderung zu einer Überexpression von Kreatinkinasen veranlasst worden sind und auf dem Weg der externen Zugabe mit Kreatin oder Kreatinanaloga supplementiert werden, nach der Implantation zu einem besseren Einwachsen in die von Knorpel- bzw. Knochendefekten betroffenen Bereiche, wenn den Patienten eine orale und/oder lokale Kreatin-Supplementation verabreicht wird. In Verbindung mit einer Kreatin-Supplementation verbessert die gentechnologische Aufbereitung von Kreatinkinase zu Knorpel- und Knochenzellen die Proliferation, das Wachstum und die spezifische Funktion dieser Zellen, wie z. B. die Ausbildung einer extrazellulären knorpel- bzw. knochenspezifischen Matrix. Dieses stoffwechseltechnische Verfahren, gefolgt von einer Kreatin-Supplementation, ist für die Neubildung, die Heilung und die Reparatur von Knorpel und Knochen sowie für dessen Mineralisierung förderlich.
Die Konzentration der Kreatinverbindung in dem Kulturmedium sollte dabei vorzugsweise in einem Bereich zwischen 10 und 20 mM liegen. Das Kulturmedium enthält charakteristischerweise 0,1% bis 5,0%, vorzugsweise 0,5% bis 2% fötales Kälberserum. Weiterhin sollte das Kulturmedium 10 bis 250 μg, vorzugsweise 25 bis 100 μg Ascorbinsäure bzw. eine äquivalente Menge eines pharmazeutisch verträglichen Ascorbats enthalten. Die Zellkultur wird mit einer Menge von 2 000 bis 100 000 Zellen, vorzugsweise 10 000 bis 50 000 Zellen begonnen.
Die Kreatinverbindung kann in Kombination mit Hormonen verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus PTH-verwandtem Protein, Schilddrüsenhormon, Insulin, steroidischen Geschlechtshormonen (Östrogen, Androgen, Testosteron), Prostaglandinen oder Glucocorticoiden ausgewählt sind.
Weiterhin kann die Kreatinverbindung in Kombination mit einer intermittierenden Verabreichung von Nebenschilddrüsenhormon, vorzugsweise in Kombination mit 1,25 (OH)₂ Vitamin D₃ und Analoga bzw. Metaboliten von Vitamin D, Calcitonin, Östrogen oder Biophosphonaten verabreicht werden.
Die Kreatinverbindung kann in Kombination mit Vitaminen, verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus 1,25 (OH)₂ Vitamin D₃ und Analoga bzw. Metaboliten von Vitamin D, aus Vitamin C/Ascorbat oder aus Retinoiden ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann in Kombination mit Wachstumsfaktoren verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus insulinartigen Wachstumsfaktoren (IGF), b-Wachstumsfaktor (TGF-b), knochenformbildenden Proteinen (BMP), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), blutplättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF), oder epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Cytokinen verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Interleukinen (IL), Interferonen, oder leukämiehemmendem Faktor (LIF) ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Matrixproteinen verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Kollagenen, Glycoproteinen, Hyaluronan, oder Proteoglykanen ausgewählt sind.
Als Glykoproteine haben sich jene, die aus der Gruppe bestehend aus:

a) alkalischer Phosphatase
b) Osteonectin (ON),
c) Gamma-Carboxy-Glutaminsäure enthaltende Proteine, vorzugsweise Matrix gla Protein oder Osteokalzin oder Knochen gla Protein (OC),
d) Arginin-Glycin-Asparagin enthaltende Proteine, vorzugsweise Thromspondin, Fibronectin, Vitronectin, Fibrillin, Osteoadherin, Sialoproteine (Osteopontin oder Knochen-Sialoprotein BSP) ausgewählt sind, als besonders nützlich erwiesen.

Als Proteoglykane haben sich jene, die aus der Gruppe bestehend aus:

a) Aggrecan,
b) Versican,
c) Biglycan,
d) Decorin ausgewählt sind, als besonders nützlich erwiesen.

Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Serumproteinen verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Albumin oder Alpha-2HS Glykoprotein ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Enzymen verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Metalloproteasen, Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysinen, Plasminogenaktivatoren, Cysteinproteinasen oder Asparaginproteinasen ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Calciumsalzen, Knochenmehl oder Hydroxyapatit verabreicht werden.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Fluoridsalzen, vorzugsweise mit Natriumfluorid oder Mononatriumfluorophosphat verabreicht werden.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Peptiden verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Amylin, vasoaktiven Wirkstoffen oder Neuropeptiden ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit Antioxidantia verabreicht werden, welche vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Cystein, N-Acetyl-Cystein, Glutathionen oder den Vitaminen A, C, D oder E ausgewählt sind.
Die Kreatinverbindung kann auch in Kombination mit einer Substanz verabreicht werden, die aus der Gruppe bestehend aus Transferrin, Selen, Bor, Silikon oder Stickstoffoxyd ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff im wesentlichen frei von Dihydrotriazin ist. Es hat sich herausgestellt, dass Dihydrotriazin eine toxische Verunreinigung von handelsüblichem Kreatin ist und dass es eine negative Auswirkung auf den Patienten hat. Aus demselben Grund sollte der Wirkstoff auch im wesentlichen frei von Dicyanodiamid sein, wobei es sich ebenfalls um eine toxische Verunreinigung von handelsüblichem Kreatin handelt.
Es ist weiterhin von Vorteil, über einen Wirkstoff zu verfügen, welcher im wesentlichen frei von Kreatinin, einem natürlichen Zersetzungsprodukt von Kreatin, ist.
Der erfindungsgemässe Wirkstoff kann einem menschlichen Patienten vorzugsweise in einer Menge von 1,4 bis 285 mg pro Tag verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kreatinverbindung aus der Gruppe bestehend aus Kreatin, Kreatinphosphat, Kreatinpyruvat, Cyclokreatin, Homokreatin oder Homocyclokreatin ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das Kreatinanalogon die folgende allgemeine Formel:
Z1===C(===Z2)===X-A-Y
und beinhaltet auch dessen pharmazeutisch akzeptable Salze, wobei:

(a) Y aus der Gruppe bestehend aus: -CO₂H, -NHOH, -NO₂, -SO₃H, -C(=O)NHSO₂J und -P(=O)(OH)(OJ) ausgewählt ist, wobei J aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₆ geradkettigem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl und Aryl ausgewählt ist;
(b) A aus der Gruppe bestehend aus : C, CH, C₁-C₅ Alkyl, C₂-C₅ Alkenyl, C₂-C₅ Alkinyl, und der C₁-C₅ Alkoylkette ausgewählt ist, wobei ein jedes dieser Elemente 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist:
(1) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind;
(2) einer Arylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist; und
(3) -NH-M, wobei M aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, C₂-C₄ Alkenyl, C₁-C₄ Alkoyl, C₃-C₄ verzweigtem Alkyl, C₃-C₄ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist;
(c) X aus der Gruppe bestehend aus: NR₁, CHR₁, CR₁, O und S ausgewählt ist, wobei R₁ aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist
(1) Wasserstoff;
(2) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind;
(3) einer Arylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist;
(4) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, welche am Omega-methyl-Carbon hängt;
(5) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-aza-omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, welche am Omega-methyl-Carbon hängt;
(6) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-thia-omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, wobei A und X mittels einer Einfach- bzw. einer Doppelbindung verbunden sind;
(d) Z₁ und Z₂ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: =O, -NHR₂, -CH₂R₂, -NR₂OH ausgewählt sind; wobei Z₁ und Z₂ nicht beide =O sein dürfen und wobei R₂ aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist.
(1) Wasserstoff;
(2) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind;
(3) einer Arylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist;
(4) einer C₄-C₈ Alpha-amino-Carbonsäure, welche am Omega-Carbon hängt;
(5) B, wobei B aus der Gruppe bestehend aus: -CO₂H, -NHOH, -NO₂, -SO₃H, -C{=O) NHSO₂J und -P(=O)(OH)(OJ) ausgewählt ist, wobei J aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₆ linearem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₂-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl und Aryl ausgewählt ist; wobei B mit dem Stickstoff wahlweise über einen Bindungsvermittler verbunden ist, der aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₂ Alkyl, C₂ Alkenyl, und C₁-C₂ Alkoyl ausgewählt ist;
( 6) -D-E, wobei D aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₃ geradkettigem Alkyl, C₃ verzweigtem Alkyl, C₂-C₃ linearem Alkenyl, C3 verzweigtem Alkenyl, C₁-C₃ linearem Alkoyl, und Aryl ausgewählt ist; und E aus der Gruppe bestehend aus: -(PO₃)_nNMP ausgewählt ist, wobei n gleich 0–2 ist und NMP ein Ribonukleotid-Monophosphat ist, das an dem 5'-Phosphat, an dem 3'-Phosphat oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -[P(=O)(OCH₃)(O)]_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -[P(==O)(OH)(CH₂) ]_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; und einer Arylgruppe, die 0–3 Substituenten hat, welche unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: C1, Br, Epoxy-, Acetoxy-, -OG, -C(=O)G, und -CO₂G ausgewählt sind, wobei G unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₁-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist; wobei E an jedem beliebigen Punkt mit D verbunden sein kann, und – sofern D Alkyl oder Alkenyl ist – D an einem beliebigen oder an beiden Enden durch eine Amidbindung verbunden sein kann; und
(7) -E, wobei E aus der Gruppe bestehend aus: -(PO₃)_nNMP ausgewählt ist, wobei n gleich 0–2 ist und MMP ein Ribonukleotid-Monophosphat ist, das an dem 5'-Phosphat, an dem 3'-Phosphat oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -P(P(=O)(OCH₃)(O))_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -[P(=O)(OH)(CH₂)]m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; und einer Arylgruppe, welche 0–3 Substituenten hat, welche unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Cl, Br, Epoxy-, Acetoxy-, -OG, -C(=O)G, und -CO₂G ausgewählt sind, wobei G unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl; C₃-C6 verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist; und – sofern E Aryl ist – E durch eine Amidbindung verbunden sein kann;
(e) sofern R₁ und zumindest eine R₂-Gruppe vorhanden sind, R₁ durch einen Einfach- oder eine Doppelbindung mit einer R₂-Gruppe zu einem Zyklus aus 5 bis 7 Bestandteilen verbunden sein kann;
(f) sofern zwei R₂-Gruppen vorhanden sind, diese durch eine Einfach- oder eine Doppelbindung miteinander zu einem Zyklus aus 5 bis 7 Bestandteilen verbunden sein können; und
(g) sofern R₁ vorhanden ist und Z₁ oder Z₂ aus der Gruppe bestehend aus -NHR₂, -CHzR₂ und -NR₂OH ausgewählt ist, R₁ durch eine Einfach- oder eine Doppelbindung mit dem Kohlenstoff oder dem Stickstoff von Z₁ bzw. Z₂ zu einem Zyklus aus 4 bis 7 Bestandteilen verbunden sein kann.

Die verschiedenen in den abhängigen Ansprüchen charakterisierten Abänderungen und bevorzugten Ausführungsformen haben eine stimulierende Wirkung auf Knochen bzw. Knorpel ausgeübt.
Die vorangegangene Beschreibung und die angeführten Beispiele stellen zwar die bevorzugten Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dar, es ist jedoch für Personen mit einschlägiger Fachkenntnis klar ersichtlich, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne dass dadurch der Umfang der Erfindung überschritten wird.

Claims

Verwendung von Kreatinverbindungen, einschliesslich Analoga oder pharmazeutisch akzeptable Salze derselben, zur In-vitro-Behandlung von Knochenzellen, Knorpelzellen oder mesenchymalen Stammzellen und Geweben, welche für die Transplantation in den tierischen oder menschlichen Körper bestimmt sind.
Verwendung von Kreatinverbindungen, einschliesslich Analoga oder pharmazeutisch akzeptable Salze derselben, zur Zubereitung eines Wirkstoffes für die In-vitro-Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff zur therapeutischen Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankungen, vorzugsweise von Osteoporose, Osteoarthritis oder Periodontitis, bzw. zur prophylaktischen Behandlung dieser Knochen- bzw. Knorpelerkrankungen verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff zur Förderung des Wachstums und der Mineralisierung von Knochen- bzw. Knorpelzellen und – geweben verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw, der Wirkstoff zur konservativen oder operativen Behandlung von Knochenfrakturen oder Knochendefekten verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff in ein auf die Fraktur oder auf den Defekt aufzubringendes Knochen- oder Knorpeltransplantat integriert ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff in die dreidimensionalen Strukturelemente von Osteoblasten, Chondrozyten oder mesenchymalen Stammzelle eingebaut werden, welche zur gewebetechnologischen Aufbereitung der Knorpel- und Knochendefekte bestimmt sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass knocken- bzw. knorpelbildende Zellen, welche aus einem gesunden Individuum oder aus dem Körper eines bestimmten Patienten gewonnenen worden sind, unter Beigabe des Wirkstoffes zu einem dreidimensionalen Zellagglomerat kultiviert werden, das in einem späteren Verfahrensschritt an eine bestimmte von einem Knochen- bzw. Knorpeldefekt betroffene Körperstelle desselben Patienten übertragbar ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff dazu verwendet wird, um die Annahme und das Einwachsen des Knochentransplantats zu verbessern.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Knochenimplantaten um Endoprothesen, vorzugsweise um Gelenk-Endoprothesen handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff aus der Gruppe bestehend aus Kreatin, Kreatinphosphat, Kreatinpyruvat, Cyclokreatin, Homokreatin oder Homocyclokreatin ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–10, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Hormonen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) PTH-verwandtes Protein, b) Schilddrüsenhormon, c) Insulin, d) steroidische Geschlechtshormone (Östrogen, Androgen, Testosteron), e) Prostaglandine, f) Glucocorticoide.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit einer intermittierenden Verabreichung von Nebenschilddrüsenhormon, vorzugsweise in Kombination mit 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und Analoga bzw. Metaboliten von Vitamin D, Calcitonin, Östrogen oder Biophosphonaten zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–13, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Vitaminen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und Analoga bzw. Metaboliten von Vitamin D, b) Vitamin C/Ascorbat, c) Retinoiden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–14, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Wachstumsfaktoren zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF), b) b-Wachstumsfaktor (TGF-b), c) knochenformbildende Proteine (BMP), d) basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), e) blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDFG); f) epidermaler Wachstumsfaktor (EGF).
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–15, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Zytokinen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) Interleukine (IL), b) Interferone, c) leukämiehemmender Faktor (LIF).
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–16, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Matrixproteinen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: A) Kollagene, B) Glycoproteine, C) Hyaluronan, D) Proteoglykane.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycoproteine aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) alkalische Phosphatase b) Osteonectin (ON), c) Gamma-Carboxy-Glutaminsäure enthaltende Proteine, vorzugsweise Matrix gla Protein oder Osteokalzin oder Knochen gla Protein (OC), d) Arginin-Glycin-Asparagin enthaltende Proteine, vorzugsweise Thromspondin, Fibronectin, Vitronectin, Fibrillin, Osteoadherin, Sialoproteine (Osteopontin oder Knochen-Sialoprotein BSP).
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteoglykane aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) Aggrecan, b) Versican, c) Biglycan, d) Decorin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–19, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Serumproteinen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) albumin b) Alpha-2HS Glykoprotein.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–20, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Enzymen zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) Metalloproteasen, b) Kollagenasen, c) Gelatinasen, d) Stromelysine, e) Plasminogenaktivatoren, f) Cysteinproteinasen, g) Asparaginproteinasen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–20, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Calciumsalzen, Knochenmehl oder Hydroxyapatit zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–21, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Fluoridsalzen, vorzugsweise mit Natriumfluorid oder Mononatriumfluorophosphat zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–23, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Peptiden zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) Amylin, b) vasoaktive Wirkstoffe, c) Neuropeptide.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–24, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit Antioxidantia zu verabreichen ist, die vorzugsweise aus der Gruppe der folgenden Elemente ausgewählt sind: a) Cystein, b) N-Acetyl-Cystein, c) Glutathione, d) die Vitamine A, C, D oder E.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–25, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in Kombination mit einer Substanz zu verabreichen ist, die aus den folgenden Elementen ausgewählt ist: a) Transferrin, b) Selen, c) Bor, d) Silikon, e) Stickstoffoxyd.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 3–8 oder 11–26, dadurch gekennzeichnet, dass die Knochenzellen aus der Gruppe der Osteoblaste, Periostzellen, Knochenmark-Stromazellen, Mantelzellen des Muskelgewebes und mesenchymalen Stammzellen ausgewählt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 3–8 oder 11–26, dadurch gekennzeichnet, dass die Knorpelzellen aus der Gruppe der Chondroblaste, Chondroklaste und mesenchymalen Stammzellen ausgewählt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7–8 oder 11–28, dadurch gekennzeichnet, dass die Knochen- oder Knorpelzellen als Monoschicht-Kulturen, Mikromasse-Kulturen oder in einem dreidimensionalen, biologisch abbaubaren Stützgewebe herangezüchtet werden.
Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur der Knochen- bzw. Knorpelzellen in dem dreidimensionalen, biologisch abbaubaren Stützgewebe ein dreidimensionales Zellagglomerat bilden welches die Struktur eines beimpften Schwamms, eines Schaums oder einer Membran aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kreatinverbindung in dem Kulturmedium in einem Bereich zwischen 10–20 mM liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium 0,1% bis 5,0%, vorzugsweise 0,5% bis 2% fötales Kälberserum enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium 10 bis 250 μg, vorzugsweise 25 bis 100 μg Ascorbinsäure bzw. eine entsprechende Menge eines pharmazeutisch akzeptablen Ascorbats enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur mit einer Menge von 2 000 bis 100 000 Zellen, vorzugsweise 10 000 bis 50 000 Zellen begonnen wird.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff im wesentlichen frei von Dihydrotriazin ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff im wesentlichen frei von Dicyanodiamidist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff im wesentlichen frei von Kreatinin, einem natürlichen Zersetzungsprodukt von Kreatin, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7, 9–26 oder 35–37, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff einem menschlichen Patienten in einer Menge von 1,4 bis 285 mg/kg pro Tag zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–6, 9–26 oder 35–37, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff einem menschlichen Patienten in einer Menge von 0,1 bis 20,0 g pro Tag zu verabreichen ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Kreatinanalogon bzw. der Wirkstoff die folgende allgemeine Formel aufweist: Z₁===C(===Z₂)===X-A-Y und auch dessen pharmazeutisch akzeptable Salze beinhaltet, wobei: (a) Y aus der Gruppe bestehend aus: -CO₂H, -NHOH, -NO₂, -SO₃H, -C(=O)NHSO₂J und -P(=O)(OH)(OJ) ausgewählt ist, wobei J aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₆ geradkettigem Alkyl, C₃-C₃ verzweigtem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl und Aryl ausgewählt ist; (b) A aus der Gruppe bestehend aus: C, CH, C₁-C₅ Alkyl, C₂-C₅ Alkenyl, C₂-C₅ Alkinyl, und der C₁-C₅ Alkoylkette ausgewählt ist, wobei ein jedes dieser Elemente 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist. (1) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind; (2) einer Rrylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist; und (3) -NH-M, wobei M aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, C₂-C₄ Alkenyl, C₁-C₄ Alkoyl, C₃-C₄ verzweigtem Alkyl, C₃-C₄ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist; (c) X aus der Gruppe bestehend aus: NR₁, CHR₁, CR₁, O und S ausgewählt ist, wobei R₁ aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist (1) Wasserstoff; (2) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₅ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind; (3) einer Arylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist; (4) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, welche am Omega-methyl-Carbon hängt; (5) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-aza-omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, welche am Omega-methyl-Carbon hängt; (6) einer C₅-C₉ Alpha-amino-omega-thia-Omega-methyl-omega-Adenosyl-Carbonsäure, wobei A und X mittels einer Einfach- bzw. einer Doppelbindung verbunden sind; (d) Z₁ und Z₂ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus : =O, -NHR₂, -CH₂R₂, -NR₂OH ausgewählt sind; wobei Z₁ und Z₂ nicht beide =O sein dürfen und wobei R₂ aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Elementen ausgewählt ist. (1) Wasserstoff; (2) K, wobei K aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, und C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist, wobei K 0–2 Substituenten hat, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt sind; (3) einer Arylgruppe, welche aus der Gruppe bestehend aus: einem 1-2 Ring Carbocyclus und einem 1-2 Ring Heterocyclus ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe 0–2 Substituenten enthält, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂L und -COCH₂L ausgewählt sind, wobei L unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: Bromo-, Chloro-, Epoxy- und Acetoxy- ausgewählt ist; (4) einer C₄-C₈ Alpha-amino-Carbonsäure, welche am Omega-Carbon hängt; (5) B, wobei B aus der Gruppe bestehend aus: -CO₂H, -NHOH, -NO₂, -SO₃H, -C{=O) NHSO₂J und -P(=O)(OH)(OJ) ausgewählt ist, wobei J aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₆ linearem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₂-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl und Aryl ausgewählt ist; wobei B mit dem Stickstoff wahlweise über einen Bindungsvermittler verbunden ist, der aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₂ Alkyl, C₂ Alkenyl, und C₁-C₂ Alkoyl ausgewählt ist; (6) -D-E, wobei D aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₃ geradkettigem Alkyl, C₃ verzweigtem Alkyl, C₂-C₃ linearem Alkenyl, C₃ verzweigtem Alkenyl, C₁-C₃ linearem Alkoyl, und Aryl ausgewählt ist; und E aus der Gruppe bestehend aus: -(PO₃)_nNMP ausgewählt ist, wobei n gleich 0–2 ist und NMP ein Ribonukleotid-Monophosphat ist, das an dem 5'-Phosphat, an dem 3'-Phosphat oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -[P(=O)(OCH₃)(O)]_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; –[P(==O)(OH)(CH₂) ]_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; und einer Arylgruppe, die 0–3 Substituenten hat, welche unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Cl, Br, Epoxy-, Acetoxy-, -OG, -C(=O)G, und -CO₂G ausgewählt sind, wobei G unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₃-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₁-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist; wobei E an jedem beliebigen Punkt mit D verbunden sein kann, und – sofern D Alkyl oder Alkenyl ist – D an einem beliebigen oder an beiden Enden durch eine Amidbindung verbunden sein kann; und (7) -E, wobei E aus der Gruppe bestehend aus: -(PO₃)_nNMP ausgewählt ist, wobei n gleich 0–2 ist und MMP ein Ribonukleotid-Monophosphat ist, das an dem 5'-Phosphat, an dem 3'-Phosphat oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -P(P(=O)(OCH₃)(O))_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; -[P(=O)(OH)(CH₂)]_m-Q, wobei m gleich 0–3 ist und Q ein Ribonukleosid ist, das an der Ribose oder an dem aromatischen Ring der Base hängt; und einer Arylgruppe, welche 0–3 Substituenten hat, welche unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus: Cl, Br, Epoxy-, Acetoxy-, -OG, -C(=O)G, und -CO₂G ausgewählt sind, wobei G unabhängig aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆ linearem Alkyl, C₂-C₆ linearem Alkenyl, C₁-C₆ linearem Alkoyl; C₃-C₆ verzweigtem Alkyl, C₃-C₆ verzweigtem Alkenyl, C₄-C₆ verzweigtem Alkoyl ausgewählt ist; und – sofern E Aryl ist – E durch eine Amidbindung verbunden sein kann; (e) sofern R₁ und zumindest eine R₂-Gruppe vorhanden sind, R₁ durch einen Einfach- oder eine Doppelbindung mit einer R₂-Gruppe zu einem Zyklus aus 5 bis 7 Bestandteilen verbunden sein kann; (f) sofern zwei R₂-Gruppen vorhanden sind, diese durch eine Einfach- oder eine Doppelbindung miteinander zu einem Zyklus aus 5 bis 7 Bestandteilen verbunden sein können; und (g) sofern R1 vorhanden ist und Z₁ oder Z₂ aus der Gruppe bestehend aus -NHR₂, -CH₂R₂ und -NR₂OH ausgewählt ist, R₁ durch eine Einfach- oder eine Doppelbindung mit dem Kohlenstoff oder dem Stickstoff von Z₁ bzw. Z₂ zu einem Zyklus aus 4 bis 7 Bestandteilen verbunden sein kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–7 oder 9–40, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff zur Behandlung degenerativer Knorpelerkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Arthritis verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreatinverbindung bzw. der Wirkstoff mit der Kreatinkinase-Transfektion von Knochenoder Knorpelzellen kombiniert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–6, 9–26 oder 35–42, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff mit pharmakologisch geeigneten Trägersubstanzen vermischt wird, um eine bessere Bioverfügbarkeit zu gewährleisten.
Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz aus der Gruppe der Kohlenhydrate, insbesondere aus den Maltodextrinen und/oder Dextrose ausgewählt ist.
Verwendung von Kreatin in Kombination mit der gentechnologischen Aufbereitung von Knorpel- oder Knochenzellen, die entsprechend transfiziert und damit zu einer Überexpression des Enzyms Kreatinkinase veranlasst werden, und zwar im Hinblick auf die Zubereitung eines Wirkstoffes zur Behandlung von Knochen- und Knorpelzellen und -geweben, dadurch gekennzeichnet, dass a) ausgehend von knochen- oder knorpelbildende Zellen, die von einem gesunden Individuum bzw. aus dem Körper des Patienten entnommen worden sind, unter Beigabe von Kreatin eine Zellkultur angelegt wird und dass die Zellen mit komplementärer DNA-Codierung für Creatinkinase-Isoformen transfiziert werden und zu einer Überexpression eines oder mehrerer Kreatinkinase-Isoenzyme veranlasst werden; b) die unter Schritt a) gewonnenen, stoffwechselveränderten Zellen in der Folge expandiert und kultiviert werden, um in vitro gentechnologisch aufbereitete Knorpel- oder Knochengewebe zu bilden, welche in die von Knorpel- bzw. Knochendefekten betroffenen Bereiche des jeweiligen gesunden Individuums bzw. des Patienten transplantierbar sind.