JP2022505032A - 腫瘍オルガノイドを産生するための組成物および腫瘍オルガノイドを産生する方法 - Google Patents
腫瘍オルガノイドを産生するための組成物および腫瘍オルガノイドを産生する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2018 年 10 月 16 日付で出願された米国仮出願番号62/746,296の優先権の恩典を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、オルガノイドを産生する方法、およびそれにより産生されるオルガノイドに関する。
通常、患者の腫瘍細胞は二次元(2D)単層として培養され、これによっては腫瘍自体の複雑な組成を再現することができない。さらに、単層として培養された細胞は、インビボで見られる間質細胞および細胞外マトリックス(ECM)との相互作用を欠いている。オルガノイド(3D)培養により、開始物質の量が非常に少ない場合でも、腫瘍細胞を増殖させることができる。オルガノイドは、潜在的ながんのドライバおよび新規の治療標的を同定するうえで既に役立っている(Boj et al., 2015)。しかしながら、オルガノイドを作出する改善されたさらに効率的な方法が必要である。
1つの態様において、外因性コラーゲンIホモ三量体を含む、動物またはヒト細胞用の基本細胞培地が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、培地は無血清である。いくつかの局面において、培地は血清代替物を含む。いくつかの局面において、培地には血清が補充されている。
ヒト腫瘍片をプラスチック上に配置し、またはマトリゲル上に配置し、オルガノイドとして成長させて、がんの生物学、遺伝子調節または治療の有効性/抵抗性、および薬物スクリーニングの研究を行ってきた。オルガノイドは、ヒトがん組織に似た病変へのその成長および進行のためにコラーゲンIホモ三量体を必要とする。コラーゲンIホモ三量体を欠くがん細胞は、成功裏のオルガノイドを形成することができない。このように、コラーゲンIホモ三量体は培養下でのオルガノイドの生成に必要であり、培養物をコラーゲンIホモ三量体で補完することはオルガノイド形成に有利に働く。
A. 細胞外マトリックス
単離された幹細胞または初代細胞は、好ましくは、該幹細胞または初代細胞が自然に存在する細胞ニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境中で培養される。この細胞ニッチは、細胞の運命を制御する重要な調節シグナルとなる、マトリックス、足場、および培養基質のような、生体材料の存在下で細胞を培養することによって模倣されうる。そのような生体材料は、天然、半合成および合成の生体材料、および/またはそれらの混合物を含む。足場は、二次元または三次元のネットワークを提供する。そのような足場に適した合成材料は、多孔性固体、ナノファイバー、ならびに例えば自己組織化ペプチドを含むペプチド、ポリエチレングリコールホスフェート、ポリエチレングリコールフマレート、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリセルロースアセテートおよび/またはそれらの共重合体から構成されるヒドロゲルのような、ヒドロゲルから選択される重合体を含む。当業者に公知のように、例えば足場の弾性のような機械的特性は、細胞の増殖、分化および遊走に影響を与える。足場には、細胞の増殖および/または分化および/または遊走に必要とされるシグナルを提供する、天然、半合成または合成のリガンドが補充される。
本発明の方法において用いられる細胞培地は、本明細書において提供される制限に従う、任意の適当な細胞培地を含む。細胞培地は通常、培養細胞の維持を支持するために必要な多数の成分を含有する。当業者は、以下の開示を考慮に入れて、成分の適当な組み合わせを容易に配合することができる。本発明による培地は、一般に、文献および以下にさらに詳細に記述されるように、アミノ酸、ビタミン、無機塩、炭素エネルギー源、および緩衝液のような、標準的な細胞培養成分を含む栄養溶液であろう。
1つの態様において、オルガノイドは膵臓オルガノイドである。1つの態様において、オルガノイドは前立腺オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは膀胱オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは肝臓オルガノイドである。さらに別の態様において、オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さらなる態様において、オルガノイドは乳房オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは肺オルガノイドである。1つの態様において、オルガノイドは心臓オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは皮膚オルガノイドである。1つの態様において、オルガノイドは胃オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは脳オルガノイドである。別の態様において、オルガノイドは結腸オルガノイドである。さらに別の態様において、オルガノイドは腸オルガノイドである。さらに他の態様において、任意のオルガノイドを本発明の方法において用いることができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者らが発見した技法が本発明の実践において十分に機能することを示し、したがって、その実践に好ましい様式を構成すると考えられると当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお類似または同様の結果を得ることができると当業者に理解されるはずである。
LSL-KrasG12D;Pdx1-Cre (KCといわれる)またはLSL-KrasG12D;Trp53loxP/loxP;Pdx1-Cre (KPPCといわれる)マウスをCol1a1loxP/loxPマウス系統(loxP隣接エクソン2~5を有する; European Mouse Mutant Cell Repository (EuMMCR)から購入したCol1a1tm1a(EUCOMM)Wtsi系統から確立された)と交配させ、KC;Col1a1loxP/loxP (KC;Col1pdxKOといわれる)およびKPPC;Col1a1loxP/loxP (KPPC;Col1pdxKOといわれる)マウスの作出をもたらした(図1A)。これらのマウスは、PDAC細胞におけるCol1a1の欠失を可能にする。所望の遺伝子型を有する前述の実験マウスを、無作為化または盲検化することなくモニターおよび分析した。実験用マウスには、PDACに望ましい遺伝子型を有する雌と雄の両方のマウスを用いた。全てのマウスはMD Anderson Cancer Center (MDACC)の動物施設にて標準的な飼育条件下で飼育され、全ての動物手順は、MDACC施設内動物管理使用委員会によって審査および承認された。
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載されるものを補足する他の詳細を示す程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Boj et al., “Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer,” Cell, 160:324-338, 2015.
Claims (37)
- 外因性コラーゲンIホモ三量体を含む、動物またはヒト細胞用の基本細胞培地。
- 無血清である、請求項1記載の培地。
- 血清代替物を含む、請求項1記載の培地。
- 血清が補充されている、請求項1記載の培地。
- 外因性コラーゲンIホモ三量体を含む、動物またはヒト細胞用の細胞培養添加物。
- 細胞外マトリックス、ヒドロゲル、生物学的足場、または合成足場である、請求項5記載の添加物。
- 細胞外マトリックスがマトリゲルである、請求項6記載の添加物。
- 外因性コラーゲンIホモ三量体を含む、動物またはヒト細胞用の細胞培養表面。
- 細胞培養プレート、チャネル、ダクト、バルブ、またはマイクロ流体デバイスである、請求項8記載の表面。
- オルガノイドを取得および/または培養するための方法であって、請求項1記載の培地の存在下、請求項5記載の添加物の存在下、または請求項8記載の表面上で、細胞を細胞外マトリックスとともに培養する段階を含む、前記方法。
- 細胞が初代細胞である、請求項10記載の方法。
- 初代細胞ががん細胞である、請求項11記載の方法。
- がん細胞が膵管腺がん細胞である、請求項12記載の方法。
- がん細胞がヒト組織から解離されている、請求項12記載の方法。
- ヒト組織が生検によって得られたものである、請求項14記載の方法。
- 細胞が幹細胞である、請求項10記載の方法。
- 細胞外マトリックスが、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS)マウス肉腫細胞によって分泌された基底膜調製物である、請求項10記載の方法。
- 細胞外マトリックスが、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンIVを含む、請求項17記載の方法。
- 細胞外マトリックスがマトリゲルである、請求項18記載の方法。
- 細胞外マトリックスが合成物である、請求項10記載の方法。
- 請求項10~20のいずれか一項記載の方法によって得られたオルガノイド。
- インビトロで形成された、請求項21記載のオルガノイド。
- オルガノイド中の細胞の少なくとも75%が生存可能である、請求項21記載のオルガノイド。
- オルガノイド中の細胞の95%超が生存可能である、請求項23記載のオルガノイド。
- 少なくとも1週間~少なくとも1ヶ月の間、培養下で維持されている、請求項21記載のオルガノイド。
- 1ヶ月超の間、培養下で維持されている、請求項21記載のオルガノイド。
- 少なくとも6ヶ月の間、培養下で維持されている、請求項21記載のオルガノイド。
- 膵管腺がんオルガノイドである、請求項21記載のオルガノイド。
- 臓器線維症オルガノイドである、請求項21記載のオルガノイド。
- 腎線維症オルガノイドである、請求項21記載のオルガノイド。
- 少なくとも1×103個の細胞~1×107個の細胞の集団を含む、請求項21記載のオルガノイド。
- 請求項21~31のいずれか一項記載のオルガノイドを試験化合物とともに培養する段階を含む、創薬スクリーニングを行う方法。
- アッセイが、オルガノイドを試験化合物と接触させる段階を含む、請求項32記載の方法。
- 請求項21~31のいずれか一項記載のオルガノイドを培養する段階を含む、毒性アッセイを行う方法。
- アッセイが、試験化合物の臓器特異的な細胞毒性を決定する、請求項34記載の方法。
- アッセイが、オルガノイドを試験化合物と接触させる段階を含む、請求項34記載の方法。
- 試験化合物が、化学予防剤、がん化学療法剤、環境化学物質、栄養補助食品、または潜在的な毒性物質を含む、請求項33または36記載の方法。
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