KR102293012B1 - 줄기 세포 배양 및 치료를 위한 배지, 방법, 세포 및 분비 인자 - Google Patents

줄기 세포 배양 및 치료를 위한 배지, 방법, 세포 및 분비 인자 Download PDF

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Abstract

본원은 다능성 줄기 세포에서 분극화를 유도하는데 유용한 방법 및 배양 배지를 기재한다. 또한, 본원은 유용한 치료제인 본 발명의 방법 및 배양 배지에 의해 생산된 다능성 세포를 기재한다. 또한, 본원은 치료제로서 유용한 본 발명의 방법 및 배양 배지에 의해 생산되는 다능성 세포에 의해 분비된 세포외 소포 및 인자를 기재한다.

Description

줄기 세포 배양 및 치료를 위한 배지, 방법, 세포 및 분비 인자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 31일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/316,131호에 우선권을 주장하며, 이는 본원에서 참고로 포함된다.
다능성 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포는 미접촉 또는 비자극 상태로부터 톨 유사 수용체(Toll-like receptor)의 선택적 자극을 통해 염증 유발성(1형) 또는 항염증성(2형) 표현형으로 유도될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 미접촉 다능성 줄기 세포(일부 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포)를 염증과 면역을 선택적으로 촉진 또는 억제하는 별개의 다능성 1형 또는 2형 세포 표현형으로 유도, 활성화 또는 프라이밍하기 위한 신규 배양 배지 조성물, 줄기 세포 배양 방법, 및 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역계 또는 염증 반응의 조절이 바람직한(예를 들어, 암, 시신경염) 유용한 치료법을 제공한다. 선행 방법과 비교하여, 본 발명에서, 세포는 질환 부위로 보다 효율적으로 이동하고 지속적으로 항염증성 사이토카인을 더 높은 수준으로 발현하는 균일한 2형 집단으로 유도될 수 있으므로, 세포의 효능 및 효력은 더 커질 것으로 예상된다. 선행 방법과 비교하여, 본 발명에서, 세포는 종양 괴사 및 종양 미세 환경으로 효율적으로 이동하는 능력으로 이끄는 특정 사이토카인의 특징적인 염증 유발성 특성 및 지속적으로 더 높은 발현을 보이는 균일한 1형 집단으로 유도될 수 있으므로, 세포의 안전성, 효능 및 효력이 더 커질 것으로 예상된다.
본 발명은 염증 및 면역을 선택적으로 촉진 또는 억제하기 위해 별개의 균일한 세포 표현형을 유도, 분극화, 활성화 또는 프라이밍하기 위한 신규 줄기 세포 배양 및 치료 방법 및 배양 배지 조성물을 제공하여 세포 기반 요법에 사용되는 공지된 배양 배지 및 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 상기 방법 및 배지 조성물은 세포 기반 요법에 사용될 수 있는 다능성 줄기 세포의 보다 균일하고 예측 가능한 생체 외 증식 및 유도, 분극화, 활성화 또는 프라이밍된 집단을 제공하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태의 이점은 이들이 다능성 줄기 세포의 배양물을 환자에게 도입시 예측 가능한 방식으로 행동하는 균일하고 별개의 표현형으로 유도, 분극화, 활성화, 또는 프라이밍하는 데에 사용될 수 있다는 점이다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다.
본 발명은 또한 줄기 세포 배양물의 신규 부산물, 치료 방법, 및 부산물을 생산하기 위한 배지 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 부산물은 본 발명의 신규 줄기 세포 배양 방법 및 조성물을 사용하여 다능성 줄기 세포에 의해 생성되는 조건화 배지이다. 특정 실시양태에서, 부산물은 본 발명의 신규 줄기 세포 배양 방법 및 조성물을 사용하여 다능성 줄기 세포에 의해 생산되는 세포외 소포이다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드; 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴(non-erythropoietin) 폴리펩티드, 또는 지질을 포함하는 제2 유도제를 포함하는 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민, 아세틸콜린, 글루타메이트, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH: alpha-melanocyte-stimulating hormone) 및 류코트리엔 B4로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C), 폴리(A:U), 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 i) 저산소 상태, ii) 저산소증 모방물(hypoxia mimetic), iii) 에리트로포이에틴, 또는 iv) i), ii) 또는 iii)의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트, 데스페리옥사민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 다능성 줄기 세포 집단을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 20배 초과의 CXCL9 mRNA 유도를 일으킨다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 miR-Let 7a/d, miR-17_1, miR-222, miR-92a, 및 miR-1260a로 이루어진 목록으로부터 선택된 어느 하나의 miRNA의 2배 초과의 유도를 일으킨다. 본원의 특정 실시양태는 배지로부터 채취된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포 집단은 중간엽 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포 집단은 본질적으로 중간엽 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 염증성 또는 자가 면역 병태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 본원의 특정 실시양태는 염증성 또는 자가 면역 병태의 치료 방법으로서, 본 단락에 기재된 배지로부터 채취된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 본원의 특정 실시양태는 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 본 단락에 기재된 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 방법은 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 특정 실시양태는 세포외 소포의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 본 단락에 기재된 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 줄기 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 배지로부터 단리 및/또는 정제된다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드인 제1 유도제; 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질을 포함하는 제2 유도제를 포함하는 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민, 아세틸콜린, 글루타메이트, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH), 및 류코트리엔 B4로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 지질 다당류, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 i) 저산소 상태, ii) 저산소증 모방물, iii) 에리트로포이에틴, 또는 iv) i), ii) 또는 iii)의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트, 데스페리옥사민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 다능성 줄기 세포 집단을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 TNFSF10 mRNA의 20배 초과의 유도를 일으킨다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 miR-146, miR-155, miR-1305, miR-575, 및 miR-1973으로 이루어진 목록으로부터 선택된 어느 하나의 miRNA의 2배 초과의 유도를 일으킨다. 본원의 특정 실시양태는 본 단락에 기재된 배지로부터 채취된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 종양 또는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 본원의 특정 실시양태는 종양 또는 암의 치료 방법으로서, 본 단락에 기재된 배지로부터 채취된 다능성 줄기 세포 집단의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 세포 집단으로 이루어진다. 본원의 특정 실시양태는 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 본 단락에 기재된 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 줄기 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 방법은 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 특정 실시양태는 세포외 소포의 생산 방법으로서, 다능성 줄기 세포 집단을 본 단락에 기재된 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 본질적으로 중간엽 줄기 세포 집단으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 배지로부터 단리 및/또는 정제된다.
특정 실시양태에서, 본원은 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 연접 플라코글로빈(JUP: junction plakoglobin), 데스모플라킨(DSP: desmoplakin), 모에신(MSN: moesin), 비멘틴(VIM: vimentin), 액틴(ACTB: actin), 아넥신 A2(ANXA2: annexin A2) 단백질, 또는 이들의 일부 중 어느 하나 이상을 미접촉 비자극 중간엽 줄기 세포에 존재하는 수준과 비교하여 상승된 수준으로 포함하는 단리 및 정제된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH), 연접 플라코글로빈(JUP), 데스모플라킨(DSP), 모에신(MSN), 비멘틴(VIM), 액틴(ACTB), 및 아넥신 A2(ANXA2) 중 어느 2가지 이상을 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH), 연접 플라코글로빈(JUP), 데스모플라킨(DSP), 모에신(MSN), 비멘틴(VIM), 액틴(ACTB), 또는 아넥신 A2(ANXA2)의 7가지 모두를 증가된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 종양 또는 암을 가진 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 본원의 특정 실시양태는 대상체에서 암 또는 종양의 치료 방법으로서, 본 단락에 기재된 단리 및 정제된 세포외 소포의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.
특정 실시양태에서, 본원은 미오신-1(MYH1: myosin-1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2: tissue factor pathway inhibitor 2) 단백질 또는 이들의 일부 중 어느 하나 이상을 무접촉 비자극 중간엽 줄기 세포에 존재하는 수준과 비교하여 상승된 수준으로 포함하는 단리 및 정제된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 및 조직 인자 경로 억제제 2로부터 선택된 어느 2가지 이상의 단백질을 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 또는 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2)의 4가지 모두를 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체로부터 선택된 비활성 성분을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 세포외 소포는 종양 또는 암을 가진 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 본원의 특정 실시양태는 대상체에서 암 또는 종양의 치료 방법으로서 본 단락에 기재된 단리 및 정제된 세포외 소포의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드이고, 제2 유도제는 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C)이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(A:U)이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제3 유도제를 추가로 포함하며, 제3 유도제는 저산소 상태, 저산소증 모방물, 또는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제4 유도제를 추가로 포함하며, 제4 유도제는 제3 유도제와 상이하며 저산소 상태, 저산소증 모방물, 또는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 다능성 줄기 세포 집단을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 비자극 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 자극된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 자극된 줄기 세포 집단에서 20배 초과의 CXCL9 mRNA 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 30배 초과의 CXCL9 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 50배 초과의 CXCL9 mRNA 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 유사 수용체 4(TLR4) 리간드이고, 제2 유도제는 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 LPS이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제3 유도제를 추가로 포함하며, 제3 유도제는 저산소 상태, 저산소증 모방물, 또는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제4 유도제를 추가로 포함하며, 제4 유도제는 제3 유도제와 상이하며, 저산소 상태, 저산소증 모방물, 또는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 다능성 줄기 세포 집단을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 비자극 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 자극된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 자극된 줄기 세포 집단에서 20배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 30배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 비자극 다능성 줄기 세포에서보다 50배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 단락에 기재된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1 및 제2 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드이고, 2 유도제는 신경 전달 물질, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C)이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(A:U)이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제3 유도제를 추가로 포함하며, 제3 유도제는 저산소 상태, 저산소증 모방물, 에리트로포이에틴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제4 유도제를 추가로 포함하며, 제4 유도제는 제3 유도제와 상이하며 저산소 상태, 저산소증 모방물, 에리트로포이에틴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 유도된 다능성 줄기 세포 집단에서 20배 초과의 CXCL9 mRNA 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 30배 초과의 CXCL9 mRNA 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 50배 초과의 CXCL9 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원은 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 기재한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1 및 제2 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드이고, 제2 유도제는 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 LPS이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제3 유도제를 추가로 포함하며, 제3 유도제는 저산소 상태, 저산소증 모방물, 에리트로포이에틴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 배지는 제4 유도제를 추가로 포함하며, 제4 유도제는 제3 유도제와 상이하며, 저산소 상태, 저산소증 모방물, 에리트로포이에틴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 유도된 다능성 줄기 세포 집단에서 20배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 30배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 비자극 다능성 줄기 세포 집단에서보다 50배 초과의 TNFSF10 mRNA의 유도를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원은 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 기재한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 분극화된 다능성 줄기 세포 집단은 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 분비된 인자를 기재한다. 특정 실시양태에서, 인자는 자극된 다능성 줄기 세포와 접촉하는 배지로부터 단리되었다. 특정 실시양태에서, 단리 방법은 원심분리, 추출, 침전, 여과, 및 동결 중 어느 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인자는 염증 유발성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 항염증성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 세포외 소포이다. 특정 실시양태에서, 인자는 사이토카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 케모카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 miRNA이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C)이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(A:U)이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 지질 다당류이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물이다. 특정 실시양태에서, 저산소 상태는 저산소증 모방물이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 에리트로포이에틴에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 히스타민에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 아세틸콜린에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 글루타메이트에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 에피네프린에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 세로토닌에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 리폭신 A4에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 류코트리엔 B4에 의해 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 인간 또는 동물 기원의 혈청이 없이 자극되었다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 1형 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 1형 중간엽 줄기 세포 TNFSF10 mRNA를 비자극 중간엽 줄기 세포 집단보다 높은 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 2형 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 2형 중간엽 줄기 세포 집단은 CXCL9 mRNA를 비자극 중간엽 줄기 세포 집단보다 높은 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 인자는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 TLR4 리간드를 포함하는 배지로 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 TLR3 리간드를 포함하는 배지로 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 분비된 인자의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 다능성 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 자극된 다능성 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 인자의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배지로부터 인자를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리하는 단계는 원심분리, 추출, 침전, 여과, 및 동결 중 어느 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인자는 염증 유발성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 항염증성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 세포외 소포이다. 특정 실시양태에서, 인자는 사이토카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 케모카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 miRNA이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C)이다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(A:U)이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 지질 다당류이다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트이다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 에리트로포이에틴이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 동물 기원의 혈청을 함유하지 않는다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 유도된 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 성체 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 인간 다능성 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포는 1형 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 1형 중간엽 줄기 세포 집단은 TNFSF10 mRNA를 비자극 중간엽 줄기 세포 집단보다 높은 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 자극된 다능성 세포 집단은 2형 중간엽 줄기 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 2형 중간엽 줄기 세포 집단은 CXCL9를 비자극 중간엽 줄기 세포 집단보다 높은 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 인자는 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 유방암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 인자는 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포의 생산 방법으로서, 비자극 중간엽 줄기 세포 집단을 TLR4 리간드를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 중간엽 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 자극된 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 세포외 소포의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 난소암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포의 생산 방법으로서, 비자극 중간엽 줄기 세포 집단을 TLR3 리간드를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 중간엽 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 자극된 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 세포외 소포의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 당뇨병성 신경병증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 크론병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 급성 폐 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 급성 시신경염을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 크라베병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
도 1은 MyD88 의존적 톨 유사 수용체 경로를 나타낸다.
도 2는 세포외 소포 및 분비 인자를 사용하는 본원에 기재된 치료 방법의 개략적인 흐름도를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 TLR3와 병용된 유도제에 의한 자극에 반응하는 중간엽 줄기 세포에 의한 CXCL9 mRNA 발현의 유도를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 TLR4와 병용된 유도제에 의한 자극에 반응하는 중간엽 줄기 세포에 의한 TNFSF10(TRAIL로도 공지됨) mRNA 발현의 유도를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 TLR4(도 5a) 또는 TLR3(도 5b)에 의해 유도된 중간엽 줄기 세포에서 miRNA의 유도 또는 감소를 나타낸다.
본원에 기재된 방법은 염증 유발성 또는 항염증성 특성을 갖는 다능성 줄기 세포를 유도하는데 유용하다. 톨 유사 수용체(TLR) 결합(염증 유발성 특성에 대해 TLR4, 항염증 특성에 대해 TLR3)과 제2 제제의 병용은 TLR 결합을 단독으로 사용하는 것에 의한 것보다 더 강한 표현형을 생성한다. 이러한 더 강한 표현형(염증 유발성 또는 항염증성)이 치료에 유용하다. 예를 들어, 염증 유발성 다능성 줄기 세포는 신생물 (예를 들어, 종양 또는 암)과 싸우는데 유용하며, 항염증성 다능성 줄기 세포는 염증 또는 자가 면역 장애와 싸우는데 유용하다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 3(TRL3) 리간드이고, 제2 유도제는 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 4(TRL4) 리간드이고, 제2 유도제는 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 배지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1 및 제2 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 3(TRL3) 리간드이고, 제2 유도제는 신경 전달 물질, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1 및 제2 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체 4(TRL4) 리간드이고, 제2 유도제는 신경 전달 물질, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 분비된 인자를 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 TLR4 리간드를 포함하는 배지로 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 TLR3 리간드를 포함하는 배지로 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포를 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원은 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 분비된 인자의 생산 방법으로서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 유도제를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 다능성 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 자극된 다능성 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 인자의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포의 생산 방법으로서, 비자극 중간엽 줄기 세포 집단을 TLR4 리간드를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 중간엽 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 자극된 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 세포외 소포의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포의 생산 방법으로서, 비자극 중간엽 줄기 세포 집단을 TLR3 리간드를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 비자극 중간엽 줄기 세포 집단과 배지를 인큐베이션하는 단계; 및 배지를 채취하는 단계를 포함하며, 배지와의 인큐베이션은 비자극 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 자극된 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하고, 자극된 중간엽 줄기 세포 집단으로부터 하나 이상의 세포외 소포의 분비를 일으키는 것인 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 배지는 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다.
특정 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 단수 형태 "하나의"("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 모든 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약"은 명시된 양에 근접한, 예를 들어 10%, 5% 또는 1%까지의 양을 의미한다.
용어 "다능성 줄기 세포"는 다수의 상이한 유형의 세포를 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 용어 "중간엽 줄기 세포"는 원래 중간엽으로부터 유래한 줄기 세포를 의미한다. 이 용어는 골아 세포, 연골 세포, 지방 세포, 또는 근육 세포 중 적어도 2가지 이상으로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 중간엽 줄기 세포(MSC: mesenchymal stem cell)는 모든 유형의 성인 조직으로부터 단리된다. 전형적으로 중간엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 탯줄, 또는 말초 혈액으로부터 단리된다. 바람직한 측면에서, MSC는 골수 또는 지방 조직으로부터 얻어지는 지방 흡인물(lipoaspirates)로부터 얻는다. 용어 "다능성(multipotent)" 또는 "만능성(pluripotent)"은 유도된 다능성 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포, 또는 화학적 또는 유전적 수단을 사용하여 만능성 단계로 유도된 세포도 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다능성 또는 만능성 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다.
용어 "생물학적 활성"은 전사; 번역; 인산화, 아세틸화, 또는 분해와 같은 번역 후 단백질 변형; 분비; 세포 분열; 아폽토시스; 또는 세포 운동성 중 하나 이상을 지칭한다. 생물학적 활성을 유도하는 물질은 이러한 생물학적 활성을 증가시키거나 감소시킬 것이다.
본원에 기재된 다능성 및 중간엽 줄기 세포에 관련하여 용어 "집단"은 분자적으로 동일하거나 매우 유사한 다수의 세포를 나타낸다. 집단은 인간 조직에서 단리되거나 배양되거나 배양물에서 증식될 수 있다. 본원에서 제공된 모든 집단은 다능성 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포와 같이 나열된 세포로 "본질적으로" 이루어질 수 있다. 본원에서 사용되는 "본질적으로 이루어지는"은 세포 집단이 세포 조성물 관점에서 실질적으로 순수하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포는 약 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%보다 더 순수할 수 있다.
용어 "세포 요법(치료)" 또는 "세포 기반 요법"은 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하기 위한 인간 또는 동물 세포의 이식, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 손상된 조직 또는 장기의 대체 또는 복구, 면역 반응의 조절 및 염증 증상 및 암의 감소를 의미한다. 세포 요법은 유도 배지로부터 채취된 줄기 세포-다능성 또는 중간엽-세포의 치료 유효량을 투여함으로써 달성될 수 있다.
용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 또는 마우스) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 또는 인간)를 포함한 포유동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
용어 "저산소 상태" 또는 "저산소증"은 약 11%의 정상적인 생리학적 산소 수준과 비교하여 산소가 고갈된 조건하에서의 세포 배양 또는 배지를 나타낸다.
환자 또는 대상체와 관련하여 직접적으로 사용될 때 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 임의의 암, 임의의 종양 또는 신생물, 염증성 장애, 자가 면역 질환 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 비롯한 면역학적으로 매개되는 질환을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 개선을 의미하며, 상기 개선은 본 발명에 의해 수득한 면역 조절(즉, 면역학적으로 분극화된) 세포, 또는 본 발명에 의해 수득한 면역 조절 세포를 포함하는 약학 조성물을 상기 치료가 필요한 대상체에게 투여한 결과이다.
용어 "비자극(자극되지 않은)(unstimulated)" 또는 "미접촉(naive)"은 본 발명의 방법에 의해 처리되지 않은, 분극화되지 않은 또는 유도되지 않은 세포 집단을 지칭한다. 신선한 또는 동결된 1차 단리된 중간엽 줄기 세포는 비자극 또는 미접촉인 것으로 간주한다. 톨 유사 수용체 리간드, 에리트로포이에틴, 저산소증 또는 저산소증 모방물 중 적어도 하나가 결여된 화합물 또는 조성물로 이전에 처리된 적이 있는 세포는 자극되지 않은 것으로 간주한다.
용어 "자가 면역 장애"는 대상체가 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 면역적으로 반응하여 야기된 세포, 조직 및/또는 장기 손상을 특징으로 하는 대상체의 병태를 의미한다.
용어 "염증성 질환"은 면역 세포의 활성화 증가, 사이토카인, 케모카인 또는 면역 세포의 활성화 또는 동원을 유도하는 다른 인자의 분비를 특징으로 하는 병태를 나타낸다.
용어 "세포외 소포"는 혈액, 림프액, 소변, 타액 및 세포 배양물의 조건화 배지를 포함하는 진핵세포액 중에 존재하는 세포 유래 소포를 지칭한다. 이러한 세포외 소포는 세포 엔도좀 막과 원형질막에서 유래하며, DNA, RNA(miRNA 포함), 단백질, 폴리펩티드, 지질, 및 소분자를 포함할 수 있다. 세포외 소포는 세포 유래의 작은 소포이며 엑소좀, 미세소포, 및 아폽토시스 소체(apoptotic body)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 엑소좀을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 질환의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 인간 질환의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 수의학 질환의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 비인간 동물의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 비인간 동물은 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 또는 염소이다.
배지
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 인간 또는 다른 동물 기원의 세포, 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 중간엽 줄기 세포를 배양하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 인간 또는 다른 동물 기원의 세포, 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 중간엽 줄기 세포에서 별개의 표현형을 생산하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 본원에서 구체적으로 기재된 성분 이외에 세포 배양을 위한 표준 배지 성분을 포함한다. 예를 들어, 특정 비제한적인 실시양태에서, 배지는 비타민, 미네랄, 염, 당, 아미노산, 피루베이트, 호르몬, 인간 혈청, 태아 소 혈청, 태아 송아지 혈청, 지질, 단백질, 염료, pH 완충액, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 농축 배양 보충물이다. 특정 실시양태에서, 배지는 2x 이상 농축된다. 특정 실시양태에서, 배지는 10x 이상 농축된다. 특정 실시양태에서, 배지는 100x 이상 농축된다. 특정 실시양태에서, 배지는 비제한적인 예로서 물과 같은 임의의 적합한 수성 용매의 첨가에 의해 수화된 건조 분말 제제이다. 특정 실시양태에서, 배지는 멸균 상태이다. 특정 실시양태에서, 배지는 임의의 적합한 용기에 미리 포장되어 공급된다. 특정 실시양태에서, 배지는 멸균 여과된다. 특정 실시양태에서, 배지는 비제한적인 예로써 MEM, DMEM, 또는 RPMI와 같은 표준 배양 배지 제제를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 인간 또는 다른 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다.
TLR4 리간드
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 포함하고, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함하는 것인 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 지질 다당류를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 약 10 pg/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 100 pg/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 10 pg/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 100 pg/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 1 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 100 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 1 ㎍/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 적어도 10 ㎍/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 1 g/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 100 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 10 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 1 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 500 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 200 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 100 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다.
TLR3 리간드
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 포함하고, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함하는 것인 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(A:U)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 약 10 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 100 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.25 ㎍/mL 내지 약 7.5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 1.5 ㎍/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 10 pg/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 100 pg/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 1 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 100 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 1 ㎍/mL 이상의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 적어도 10 ㎍/㎖의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 1 g/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 100 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 10 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 1 mg/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 500 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 200 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 100 ㎍/mL 미만의 농도로 존재한다.
추가 물질
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 포함하고, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함하는 것인 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 도 1을 참조하면, 제2 유도제는 TLR 신호 전달 경로의 억제제 또는 활성화 인자를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 제1 유도제와 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 소분자, 폴리펩티드, 또는 지질이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에피네프린이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 B4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4이다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 에리트로포이에틴이 아니다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물이 아니다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 염화코발트가 아니다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 데스페리옥사민이 아니다. 특정 실시양태에서, 히스타민, 아세틸콜린, 글루타메이트, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH) 및 류코트리엔 B4는 모두 MSC2 유도를 증가시키거나 강화시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 히스타민, 아세틸콜린, 글루타메이트, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH), 및 류코트리엔 B4는 모두 MSC1 유도를 증가시키거나 강화시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 아세틸콜린, 글루타메이트, 및 리폭신 A4는 MSC2 유도를 증가시키거나 강화시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 및 류코트리엔 B4는 MSC1 유도를 증가시키거나 강화시키는데 유용하다.
아세틸콜린( AcH )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린을 포함한다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 약 1 나노몰 내지 약 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, AcH의 농도는 10 나노몰 미만이다.
알파-멜라닌 세포 자극 호르몬( MSH )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH)을 포함한다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 약 100 피코몰 내지 약 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 적어도 100 피코몰이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 10 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MSH의 농도는 1 나노몰 미만이다.
멜라토닌( MEL )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 멜라토닌(MEL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 약 1 나노몰 내지 약 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 10 나노몰 미만이다.
세로토닌(5-HT)
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 세로토닌(5-HT)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 약 100 피코몰 내지 약 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 적어도 100 피코몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, MEL의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 10 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, 5-HT의 농도는 1 나노몰 미만이다.
글루타메이트 ( GLU )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 글루타메이트(GLU)를 포함한다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 약 10 나노몰 내지 약 1 밀리몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 적어도 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 1 밀리몰 미만이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, GLU의 농도는 100 나노몰 미만이다.
노르에피네프린( NEPI )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 노르에피네프린(NEPI)을 포함한다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 약 100 피코몰 내지 약 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 적어도 100 피코몰이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 10 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, NEPI의 농도는 1 나노몰 미만이다.
히스타민(HIS)
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 히스타민(HIS)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 약 10 나노몰 내지 약 1 밀리몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 적어도 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 1 밀리몰 미만이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, HIS의 농도는 100 나노몰 미만이다.
리폭신 A4( LXA4 )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 리폭신 A4(LXA4)를 포함한다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 약 100 피코몰 내지 약 1 밀리몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 100 피코몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 적어도 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 1 밀리몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 10 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LXA4의 농도는 1 나노몰 미만이다.
류코트리엔 B4( LTB4 )
특정 실시양태에서, 제2 유도제는 류코트리엔 B4(LTB4)를 포함한다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 약 100 피코몰 내지 약 1 밀리몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 100 피코몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 1 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 10 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 100 나노몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 1 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 10 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 적어도 100 마이크로몰이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 1 밀리몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 100 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 10 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 1 마이크로몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 100 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 10 나노몰 미만이다. 특정 실시양태에서, LTB4의 농도는 1 나노몰 미만이다.
저산소증
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 포함하고, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함하는 것인 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 활성을 갖는 분자는 다른 톨 유사 수용체 리간드, 신경 전달 물질, 신경 전달 물질 유사 분자, 비에리트로포이에틴 폴리펩티드, 또는 지질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 활성을 갖는 분자는 히스타민, 아세틸콜린, 글루타메이트, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌, 리폭신 A4, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH), 및 류코트리엔 B4로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제3 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물이다. 특정 실시양태에서, 제3 유도제는 에리트로포이에틴을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 저산소 상태를 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소 상태는 저산소 또는 산소 결핍 환경에서의 인큐베이션을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 10% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 8% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 6% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 5% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 4% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 3% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 2.5% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 2.0% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 1.5% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 1.0% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 미만의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 사실상 0% 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 내지 3.0%의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 내지 2.5%의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 내지 2.0%의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 내지 1.5%의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 0.5% 내지 1.0% 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 1.0% 내지 2.0%의 산소를 보유한다. 특정 실시양태에서, 저산소 환경은 1.5% 내지 2.0%의 산소를 보유한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 염화코발트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 50 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 100 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 200 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 400 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 500 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 600 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 700 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 800 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 900 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 1 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 10 μM 내지 약 1 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 10 μM 내지 약 800 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 10 μM 내지 약 500 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 10 μM 내지 약 400 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 10 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 50 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 100μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 염화코발트는 약 150 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저산소증 모방물은 데스페리옥사민을 포함한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 50 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 200 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 300μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 400 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 500 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 600 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 700 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 800 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 900 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 1 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 10 μM 내지 약 1 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 10 μM 내지 약 800 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 10 μM 내지 약 500 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 10 μM 내지 약 400 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 10 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 50 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 100 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 데스페리옥사민은 약 150 μM 내지 약 300 μM의 농도로 존재한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 배지는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 배지는 재조합 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 배지는 인간 재조합 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.1 ng/mL 내지 약 1.0 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.1 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.2 ng/mL 내지 약 0.8 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 약 0.3 ng/mL 내지 약 0.6 ng/mL이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 10 mg/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 5 mg/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 1 mg/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 100 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 30ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 10 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 5 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 4 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 1 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 0.8 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 1 ng/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 5 U/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 1 U/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 0.5 U/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 0.1 U/mL 미만이다. 특정 실시양태에서, 에리트로포이에틴의 양은 0.05 U/mL 미만이다.
특정 실시양태에서, 본원은 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단을 생산하기 위한 배지로서, 제1 및 제2 유도제를 포함하며, 제1 유도제는 톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 포함하고, 제2 유도제는 생물학적 활성을 갖는 분자를 포함하는 것인 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, TLR 리간드는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 유도제는 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 배지는 제3 유도제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제3 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제3 유도제는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 제4 유도제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제4 유도제는 에리트로포이에틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제4 유도제는 저산소 상태 또는 저산소증 모방물을 포함한다.
다능성 줄기 세포
특정 실시양태에서, 본원은 다능성 줄기 세포와 함께 사용하기 위한 방법 및 배양 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 본원은 다능성 줄기 세포 집단과 함께 사용하기 위한 방법 및 배양 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 다능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 미접촉 다능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 비자극 다능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 자극된 다능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 인간 기원이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 1차 인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 혈액으로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 제대혈로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 태반으로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 치수(dental pulp)로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 월경 혈로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 태아로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 지방 흡입물로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 생검으로부터 단리된다.
중간엽 줄기 세포
특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포와 함께 사용하기 위한 방법 및 배양 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 본원은 중간엽 줄기 세포 집단과 함께 사용하기 위한 방법 및 배양 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 미접촉 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 비자극 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 자극된 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 인간 기원이다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 1차 인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 혈액으로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 제대혈로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 태반으로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 치수로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 월경 혈로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 태아로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 지방 흡인물로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 생검으로부터 단리된다.
1형 분극화된 다능성 줄기 세포
특정 실시양태에서, 본원은 다능성 또는 중간엽 줄기 세포에서 면역학적 분극화의 유도 방법을 개시한다. 특정 실시양태에서, 본원은 다능성 줄기 세포에서 면역학적 분극화를 유도하는 배지를 개시한다. 특정 실시양태에서, 본원은 분극화된 다능성 줄기 세포를 개시한다. 특정 실시양태에서, 세포는 1형 분극화를 나타낸다. 1형 분극화는 염증 유발성 매개 인자의 발현 또는 분비를 특징으로 한다. TLR4 리간드로 처리된 세포는 1형 분극화를 나타낼 것이다. 1형 분극화는 TNFSF10(TRAIL)의 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 2배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 5배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 10배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 50배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 100배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 200배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 500배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 1,000배의 TNFSF10의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 10,000배의 TNFSF10의 발현을 유도한다.
특정 실시양태에서, 본원은 1형 분극화된 다능성 또는 중간엽 줄기 세포를 개시한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 2배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 5배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 10배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 50배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 100배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 500배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 1,000배 많은 TNFSF10을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 1,000배 많은 TNFSF10을 발현한다.
특정 실시양태에서, 본원은 1형 분극화된 다능성 또는 중간엽 줄기 세포를 개시한다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 다능성 줄기 세포와 비교하여 상승된 수준의 특정 miRNA를 발현한다. 특정 실시양태에서, 상승된 miRNA는 miR-146, miR-155, miR-1305, miR-575, 및 miR-1973중 어느 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상승된 miRNA는 miR-146, miR-155, miR-1305, miR-575, 및 miR-1973중 어느 1, 2, 3, 4, 또는 5가지 모두를 포함한다. 이들 miRNA 중 어느 하나의 수준은 비자극 다능성 줄기 세포 집단과 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 상승될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 다능성 줄기 세포와 비교하여 감소된 수준의 특정 miRNA를 발현한다. 특정 실시양태에서, 감소된 miRNA는 miRNA-24-3p를 포함한다. 이 miRNA의 수준은 비자극 다능성 세포 집단과 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 감소될 수 있다.
2형 분극화된 다능성 줄기 세포
특정 실시양태에서, 본원은 다능성 또는 중간엽 줄기 세포에서 면역학적 2형 분극화의 유도 방법을 개시한다. 특정 실시양태에서, 본원은 다능성 줄기 세포에서 2형 분극화를 유도하는 배지를 개시한다. 2형 분극화는 항염증성 매개 인자의 발현 또는 분비를 특징으로 한다. TLR3 리간드로 처리된 세포는 2형 분극화를 나타낼 것이다. 2형 분극화는 CXCL9의 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 2배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 5배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 10배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 50배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 100배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 200배의 CXCL9의 발현을 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 비자극 세포와 비교하여 500배의 CXCL9의 발현을 유도한다.
특정 실시양태에서, 본원은 2형 분극화된 다능성 또는 중간엽 줄기 세포를 개시한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 2배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 5배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 10배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 50배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 100배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 200배 많은 CXCL9를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포와 비교하여 500배 많은 CXCL9를 발현한다.
본원에 개시된 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 또는 중간엽 줄기 세포는 비자극 세포 집단과 비교할 때 임의의 하기 유전자를 2배 이상 발현한다: CXCL9; EGFR; IRF1; A2M; FAS; IL2RG; MMP3; GBP1; ISG15; FCGR1; NFKB1; NOS2A; USF1; YY1; JAK2; STA2, STAT4; STAT5; SOCS1; 또는 IRF1. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포 집단과 비교할 때 임의의 하기 유전자를 2배 이상 발현한다: EPOR; F2R; STAM; PDGFRA; PIAS2; MYC; SH2B1; 또는 CSF2RB . 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포 집단과 비교할 때 임의의 하기 유전자를 10배 이상 발현한다: CXCL9; GBP1; ISG15; SOCS1; MMP3; JAK2 또는 IRF1. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 세포 집단과 비교할 때, 임의의 하기 유전자를 20배 이상 발현한다: CXCL9; GBP1; ISG15; 또는 SOCS1.
특정 실시양태에서, 본원은 2형 분극화된 다능성 또는 중간엽 줄기 세포를 개시한다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 다능성 줄기 세포와 비교하여 상승된 수준의 특정 miRNA를 발현한다. 특정 실시양태에서, 상승된 miRNA는 miR-Let 7a/d, miR-17_1, miR-222, miR-92a, 및 miR-1260a 중 어느 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상승된 miRNA는 miR-Let 7a/d, miR-17_1, miR-222, miR-92a, 또는 miR-1260a 중 어느 1, 2, 3, 4, 또는 5가지 모두를 포함한다. 이 miRNA 중 어느 하나의 수준은 비자극 다능성 세포 집단과 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 상승될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2형 분극화된 다능성 줄기 세포는 비자극 다능성 줄기 세포와 비교하여 감소된 수준의 특정 miRNA를 발현한다. 특정 실시양태에서, 감소된 miRNA는 miRNA-222를 포함한다. 이 miRNA의 수준은 자극받지 않은 다능성 세포 집단과 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 감소될 수 있다.
세포의 균일성
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 배양 후 분극화된 다능성 세포의 균일성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 60% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 70% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 80% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 90% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 95% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 98% 초과의 세포가 1형 마커를 발현한다. 특정 실시양태에서, 1형 마커는 TNFSF10이다. 마커는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 면역 조직 화학법, ELISA, 유동 세포 계측법, 웨스턴 블롯, qRT-PCR, 노던 블롯, 또는 디지털 PCR로 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 배양 배지는 배양 후 분극화된 다능성 세포의 균일성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 60% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 70% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 80% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 90% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 95% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 98% 초과의 세포가 2형 마커를 발현한다. 특정 실시양태에서, 2형 마커는 CXCL9이다. 마커는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 면역 조직 화학법, ELISA, 유동 세포 계측법, 웨스턴 블롯, qRT-PCR, 노던 블롯, 또는 디지털 PCR로 측정할 수 있다.
방법
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 배양 배지와 다능성 줄기 세포 사이에 특정한 양의 접촉을 제공한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 24시간 미만 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 8시간 미만 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 4시간 미만 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 2시간 미만 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 1시간 미만 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 1분 초과 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 1시간 초과 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 2시간 초과 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 4시간 초과 동안 접촉한다. 특정 실시양태에서, 다능성 세포는 본 발명의 배지 또는 유도제와 8시간 초과 동안 접촉한다.
염증 유발성 분비 인자
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 배양 배지는 자극된 다능성 줄기 세포가 치료에 유용한 인자를 분비하게 한다. 특정 실시양태에서, 인자는 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된다. 특정 실시양태에서, 인자는 염증 유발성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR4 리간드에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 LPS 또는 아미노알킬 글루코사미니드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR4 리간드 및 에리트로포이에틴 및 저산소 상태에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR4 리간드 및 에리스로포이에틴 및 저산소 상태 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 사이토카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR4 리간드 및 하기부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-6을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-17을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 인터페론 베타를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 케모카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 LIF를 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 GM-CSF를 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 MIG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 MCP-1을 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 TRAIL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 miRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, miRNA는 miR-146을 포함한다. 특정 실시양태에서, miRNA는 miR-155를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 사이토카인, 케모카인, 또는 miRNA의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 자극된 세포 배양 배지로부터 단리되지 않고, 대상체를 치료하거나 투여되는 세포 집단과 대상체를 접촉시키는데 사용될 수 있는 조건화 배지 내 나머지 모두와 함께 존재한다.
항염증성 분비 인자
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 배양 배지는 자극된 다능성 줄기 세포가 치료에 유용한 인자를 분비하게 한다. 특정 실시양태에서, 인자는 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된다. 특정 실시양태에서, 인자는 항염증성이다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR3 리간드에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C) 또는 폴리(A:U)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR3 리간드, 에리트로포이에틴 및 저산소 상태에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR3 리간드, 에리스로포이에틴, 저산소 상태, 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 조합. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 사이토카인이다. 특정 실시양태에서, 인자는 TLR3 리간드 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 사이토카인이다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-4를 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-10을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 IL-13을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토킨은 TGF베타를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 케모카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 CXCL9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 CCL5를 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 CXCL10을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 miRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, miRNA는 miR-Let 7a/d를 포함한다. 특정 실시양태에서, miRNA는 miR-17/92a를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 사이토카인, 케모카인, 또는 miRNA의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 인돌아민 2,3-디옥시게나 아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 자극된 세포 배양 배지로부터 단리되지 않고, 대상체를 치료하거나 투여되는 세포 집단과 대상체를 접촉시키는데 사용될 수 있는 조건화 배지 내 나머지 모두와 함께 존재한다.
분비 인자의 단리
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 분비 인자는 본 발명의 자극된 다능성 줄기 세포 집단과 접촉한 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 분비 인자는 본 발명의 자극된 중간엽 줄기 세포 집단과 접촉한 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 1시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 2시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 4시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 8시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 24시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 여과, 원심분리, 침전, 크로마토그래피, 및 동결을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 방법에 의해 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 분비 인자는 배양 배지로부터 단리되지 않는다.
분비되는 염증 유발성 세포외 소포
세포외 소포는 혈액, 소변, 및 세포 배양물의 조건화 배지를 포함하여, 많은 아마도 모든 진핵생물에 존재하는 세포 유래 소포이다. 이러한 세포외 소포는 세포 엔도좀 막과 원형질막에서 유래하며, DNA, RNA(miRNA 포함), 단백질, 폴리펩티드, 지질, 및 소분자를 포함할 수 있다. 세포외 소포는 세포 유래의 작은 소포이며 엑소좀, 미세소포, 및 아폽토시스 소체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 엑소좀을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 배양 배지는 자극된 다능성 줄기 세포가 치료에 유용한 세포외 소포를 분비하게 한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 염증 유발성이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR4 리간드에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드는 LPS 또는 아미노알킬 글루코사미니드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR4 리간드, 에리트로포이에틴, 및 저산소 상태에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR4 리간드, 에리스로포이에틴, 저산소 상태, 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR4 리간드 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 조합. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 사이토카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-6을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-17을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 인터페론 베타를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 케모카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 LIF를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 GM-CSF를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 MIG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 MCP-1을 포함한다. 특정 실시양태에서, 케모카인은 TRAIL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miR-146을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miR-155를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 사이토킨, 케모카인, 또는 miRNA의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염증 유발성 세포외 소포는 비자극 미접촉 다능성 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포와 비교하여 상승된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 단백질은 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH), 연접 플라코글로빈(JUP), 데스모플라킨(DSP), 모에신(MSN), 비멘틴(VIM), 액틴(ACTB), 또는 아넥신 A2(ANXA2) 중 어느 하나 이상을 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH), 연접 플라코글로빈(JUP), 데스모플라킨(DSP), 모에신(MSN), 비멘틴(VIM), 액틴(ACTB), 또는 아넥신 A2(ANXA2) 중 어느 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7가지 모두를 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질 중 임의의 단백질은 비자극 다능성 세포와 비교하여 2배, 3배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상 상승될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염증 유발성 세포외 소포는 비자극 미접촉 다능성 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포와 비교하여 감소된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 단백질은 트롬보스폰틴-1(THBS1), 콜라겐 알파-2 (Ⅵ) 쇄 (COL6A2), 데코린(DCN), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(IGFBP7), 리실 옥시다아제 상동체 2(LOXL2), 비글리칸(BGN), 또는 콜라겐 알파-3 (VI) 쇄(COL6A3) 중 어느 하나 이상을 감소된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 트롬보스폰틴-1(THBS1), 콜라겐 알파-2 (Ⅵ) 쇄 (COL6A2), 데코린(DCN), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(IGFBP7), 리실 옥시다아제 상동체 2(LOXL2), 비글리칸 BGN), 또는 콜라겐 알파-3 (VI) 쇄(COL6A3) 중 어느 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7가지 모두를 감소된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질 중 임의의 단백질은 비자극 다능성 세포와 비교하여 2배, 3배, 5배, 10배 또는 그 이상 감소될 수 있다.
분비되는 항염증성 세포외 소포
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 배양 배지는 자극된 다능성 줄기 세포가 치료에 유용한 세포외 소포를 분비하게 한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 항염증성이다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR3 리간드에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드는 폴리(I:C) 또는 폴리(A:U)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR3 리간드, 에리트로포이에틴, 및 저산소 상태에 의한 자극에 반응하여 분비된다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR3 리간드, 에리스로포이에틴, 저산소 상태, 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 사이토카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TLR3 리간드 및 하기로부터 선택된 추가 유도제에 의한 자극에 반응하여 분비된다: 아세틸콜린, 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬, 멜라토닌, 세로토닌, 글루타메이트, 노르에피네프린, 히스타민, 리폭신 A4, 류코트리엔 B4, 및 이들의 임의의 조합. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 사이토카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-4를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-10을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 IL-13을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 TGF 베타를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 케모카인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 CXCL9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 CCL5를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 CXCL10을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miR-Let 7a/d를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 miR-17/92a를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 사이토킨, 케모카인, 또는 miRNA의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 인돌아민 2,3-디옥시게나아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항염증 세포외 소포는 비자극 다능성 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포와 비교하여 상승된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 단백질은 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 또는 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2) 중 어느 하나 이상을 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 상승된 수준을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 또는 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2) 중 어느 2, 3, 또는 4가지 모두를 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 상승된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질 중 임의의 단백질은 비자극 다능성 세포와 비교하여 2배, 3배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상 상승될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항염증 세포외 소포는 미접촉 비자극 다능성 세포 집단으로부터 분비된 세포외 소포와 비교하여 감소된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 단백질은 콜라겐 알파-1 (I) 쇄(COL6A3), 설프히드릴 옥시다아제 1(QSOX1), 데코린-7(DCN), 콜라겐 알파-2 (VI) 쇄(COL6A2), 트롬보스폰딘-1(THBS1) 또는 콜라겐 알파-1 (I) 쇄(COL1A1) 중 어느 하나 이상을 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 감소된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 콜라겐 알파-1 (I) 쇄(COL6A3), 설프히드릴 옥시다아제 1(QSOX1), 데코린-7(DCN), 콜라겐 알파-2 (VI) 쇄(COL6A2), 트롬보스폰딘-1(THBS1), 또는 콜라겐 알파-1 (I) 쇄(COL1A1) 중 어느 2, 3, 4, 5 또는 6가지 모두를 미접촉 비자극 다능성 줄기 세포로부터의 세포외 소포와 비교하여 감소된 수준으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질 중 임의의 단백질은 비자극 다능성 세포와 비교하여 2배, 3배, 5배, 10배 또는 그 이상 감소될 수 있다.
세포외 소포의 단리
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 본 발명의 자극된 다능성 줄기 세포 집단과 접촉한 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 본 발명의 자극된 중간엽 줄기 세포 집단과 접촉한 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 1시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 2시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 4시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 8시간 초과 동안 접촉된다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 자극된 세포 집단과 24시간 초과 동안 접촉된다. 세포외 소포는 배양 배지로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다. 배양 배지로부터 세포외 소포를 단리하기 위한 적합한 방법은 당 업계에 공지되어있다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 여과, 원심분리, 초원심분리, 밀도 구배 분리, 침전, 면역 친화성 분리, 크로마토그래피, 및 동결을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 방법에 의해 배양 배지로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 세포외 소포는 배양 배지로부터 단리되지 않는다.
치료 방법
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 배양 배지, 세포, 분비 인자, 및 세포외 소포는 치료에 유용하다. 예를 들어, 도 2는 본원에 기재된 방법, 배양 배지, 세포, 분비 인자, 및 세포외 소포의 비제한적 치료 프로토콜의 흐름도를 도시한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 배양 배지, 세포, 분비 인자, 및 세포외 소포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 배양 배지, 세포, 분비 인자, 및 세포외 소포는 자가 면역 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 배양 배지, 세포, 분비 인자, 및 세포외 소포는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드를 포함하는 배지로 처리된 다능성 줄기 세포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드를 포함하는 배지로 처리된 다능성 줄기 세포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드를 포함하는 배지로 처리된 중간엽 줄기 세포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드를 포함하는 배지로 처리된 중간엽 줄기 세포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다.
특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포를 TLR4 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 다능성 줄기 세포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포를 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 다능성 줄기 세포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 TLR4 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 중간엽 줄기 세포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 중간엽 줄기 세포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다.
특정 실시양태에서, TLR4 리간드를 포함하는 배지로 처리된 다능성 줄기 세포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR4 리간드를 포함하는 배지로 처리된 다능성 줄기 세포로부터 분비된 인자 또는 세포외 소포는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드를 포함하는 배지로 처리된 중간엽 줄기 세포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, TLR3 리간드를 포함하는 배지로 처리된 중간엽 줄기 세포로부터 분비된 인자 또는 세포외 소포는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다.
특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포를 TLR4 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 다능성 줄기 세포로부터 분비된 세포외 소포 또는 인자는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포를 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 다능성 줄기 세포로부터 분비된 세포외 소포 또는 인자는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 TLR4 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 치료된 중간엽 줄기 세포로부터 분비된 세포외 소포 또는 인자는 암을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 처리된 중간엽 줄기 세포로부터 분비된 세포외 소포 또는 인자는 자가 면역 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용하다.
본 발명은 세포 치료 방법으로서, (a) 다능성 줄기 세포 집단을 제공하는 단계; (b) 줄기 세포 집단을 본원에 기재된 임의의 배지와 접촉시키는 단계; (c) 적절한 조건하에 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 자극된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 세포 치료 방법으로서, (a) 중간엽 줄기 세포 집단을 제공하는 단계; (b) 줄기 세포 집단을 본원에 기재된 임의의 배지와 접촉시키는 단계; (c) 적절한 조건하에 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 자극된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 용기로부터의 제거, 원심분리, 초원심분리, 여과, 투석, 세척, 및 멸균 중성 완충 식염수와 같은 적절한 희석액 중의 현탁을 포함하는 단계에 의해 세포 및 배지 모두를 포함하는 용기로부터 채취된다.
자가 면역 및 염증성 질환
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 자가 면역 질환의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 급성 시신경염, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가 면역성 애디슨병, 부신의 자가 면역 질환, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역성 간염, 자가 면역성 난소염 및 고환염, 자가 면역성 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유사 천포창, 폐쇄 세기관지염, 심근 병증, 실리악 스프루 피부염, 만성 피로 면역 기능 장애 증후군(CFIDS: chronic fatigue immune dysfunction syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증, 척크-스트라우스 증후군, 반흔성 유사 천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 원반 모양 홍반 루푸스, 본태성 혼합 한랭 글로불린 혈증, 섬유 근육통-섬유 근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소 자반병(ITP: idiopathic thrombocytopenia purpura), IgA 신경 병증, 연소성 관절염, 편평태선, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절 다발 동맥염, 다발 연골염, 다선성 증후군, 류마티스 다발근통, 다발성 근염 및 피부 근염, 원발성 무감마 글로불린 혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 건선 관절염, 레이노드 현상, 라이터 증후군, 사르코이드증, 피부경화증, 진행성 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 굿파스처 증후군, 강직 인간 증후군, 전신 홍반 루푸스, 홍반 루푸스, 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포성 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 포진성 피부염 혈관염과 같은 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 항-사구체 기저막병, 항인지질 증후군, 신경계의 자가 면역 질환, 가족성 지중해열, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 교감성 안염, 다발성 내분비 병증, 또는 건선의 치료를 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 염증성 장애의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 염증성 장애는 크론병, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 하시모토병, 이식편 대 숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨병, 피부경화증, 굿파스처 증후군, 궤양성 대장염, 자가 면역 용혈성 빈혈, 불임증, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우병, 혈소판 감소 자반증, 길랭-바레 증후군, 알레르기, 천식, 아토피성 질환, 동맥경화증, 심근염, 심근병증, 사구체신염, 저형성 빈혈, 및 장기 이식 후 거부 반응이다. 특정 실시양태에서, 염증성 장애는 급성 시신경염, 당뇨병 신경병증, 크라베병, 급성 폐 손상, 크론병, 실리악병, 류마티스 관절염(RA: rheumatoid arthritis), 염증성 장 질환(IBD: Inflammatory Bowel Disease), 천식, 뇌염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 염증성 골용해, 알레르기 질환, 패혈성 쇼크, 폐섬유증(특발성 폐섬유증), 염증성 혈관염(예를 들어, 결절 다발 동맥염, 베게너 육아종증, 타까야수 동맥염, 측두 동맥염, 및 림프종 모양 육아종증), 외상 후 혈관 성형술(예를 들어, 혈관 성형술 후 재발 협착증), 미분화 척추 관절 병증, 미분화 관절 병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 간염, 또는 만성 바이러스 또는 세균 감염으로 인한 만성 염증이다.
암
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 암 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 종양 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 암 치료를 증대시키기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병, 성인; 급성 림프모구성 백혈병, 소아; 급성 골수성 백혈병, 성인; 급성 골수성 백혈병, 소아; 부신피질 암종; 에이즈 관련 암; 에이즈 관련 림프종; 항문암; 충수암; 성상 세포종; 비정형 기형/횡문근양 종양; 기저 세포 암종; 간 외 담도암; 방광암; 골암, 골육종 및 악성 섬유 조직구종; 뇌간 교종; 뇌종양; 중추 신경계 배아종; 성상세포종; 두개인두종; 상의 모세포종; 뇌종양, 상의세포종; 수모세포종; 수질 상피종; 중등도 분화의 송과체 실질 종양; 천막위 원시 신경 외배엽 종양 및 송과체 모세포종; 뇌 및 척수 종양; 유방암; 유방암, 남성; 기관지 종양; 버킷 림프종; 유암종; 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양; 중추 신경계 배아종; 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 자궁경부암; 자궁경부암; 소아암; 척색종; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수 증식성 질환; 결장암; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T 세포 림프종; 배아종, 중추 신경계; 자궁내막암; 상의 모세포종; 상의세포종; 식도암; 감각 신경 모세포종; 종양의 유잉 육종 패밀리; 두개 외 생식세포 종양; 고환 외 생식세포 종양; 간외 담도암; 안암, 안구 내 흑색종; 안암, 망막세포종; 담낭암; 위(Gastric/Stomach) 암; 위장관 유암종; 위장관 기질 종양(GIST: Gastrointestinal Stromal Tumor); 생식세포 종양, 두개 외; 생식세포 종양, 고환 외; 생식세포 종양, 난소; 임신성 융모성 종양; 신경교종; 모양 세포성 백혈병; 두경부암; 심장암; 간세포(간) 암, 성인(원발성); 간세포(간) 암; 조직구종, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아; 하인두암; 안구 내 흑색종; 췌도세포종(내분비 췌장); 카포시 육종; 신장(신세포) 암; 신장암; 랑게르한스 세포 조직구종; 후두암; 후두암, 소아; 급성 림프모구성 백혈병, 성인; 급성 림프모구성 백혈병, 소아; 급성 골수성 백혈병, 성인; 급성 골수성 백혈병, 소아; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 모양 세포성 백혈병; 구순 및 구강암; 간암, 성인(원발성); 간암; 폐암, 비소세포; 폐암, 소세포; 림프종, AIDS-관련; 버킷 림프종; 림프종, 피부 T 세포; 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아; 비호지킨 림프종, 성인; 비호지킨 림프종, 소아; 림프종, 원발성 중추 신경계(CNS); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 뼈의 악성 섬유 조직구종 및 골육종; 수모세포종; 수질 상피종; 흑색종; 흑색종, 안구 내(눈); 메르켈 세포암; 중피종, 성인 악성; 중피종; 잠복 원발성의 전이성 편평 상피 경부암; 구강암; 다발 내분비샘 종증; 다발성 골수종/형질세포 신생물; 균상식육종; 골수형성 이상 증후군; 골수형성이상/골수증식 신생물; 골수성 백혈병, 만성; 골수성 백혈병, 성인 급성; 골수성 백혈병, 소아 급성; 골수종, 다발성; 골수증식 질환, 만성; 비강 및 부비동 암; 비인두 암; 신경모세포종; 비호지킨 림프종, 성인; 비호지킨 림프종, 소아; 비소세포 폐암; 구강(Oral)암; 구강(Oral Cavity) 암, 구순암; 구강인두암; 골육종 및 뼈의 악성 섬유성 조직구종; 난소암; 상피성 난소암; 난소 생식세포 종양; 난소 저악성 잠재성 종양; 췌장암; 췌장암, 췌도세포 종양; 유두종증; 부비동 및 비강 암; 부갑상선 암; 음경암; 인두암; 중등도 분화의 송과체 실질 종양; 뇌하수체 종양; 형질세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐 모세포종; 임신성 유방암; 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종; 전립선암; 직장암; 신세포(신장) 암; 신우 및 요관, 이행세포암; 15번 염색체상에 변화를 가진 기도암; 망막세포종; 횡문육종; 침샘암; 침샘암; 육종, 유잉 육종 패밀리 종양; 카포시 육종; 연부조직 육종, 성인; 연부조직 육종, 소아; 자궁육종; 시자리 증후군; 피부암(비-흑색종); 피부암; 피부암(흑색종); 피부암, 메르켈 세포; 소세포 폐암; 소장암; 연부조직 육종, 성인; 연부조직 육종, 소아; 편평 세포 암종; 잠복 원발성의 전이성 편평 상피 경부암; 위(Stomach/Gastric)암; 천막위 원시 신경 외배엽 종양; T 세포 림프종, 피부; 고환암; 인후암; 흉선종 및 흉선암; 갑상선암; 신우 및 요관의 이행세포 암; 영양막 종양, 임신성; 원발부위 불명 암종; 요관 및 신우, 이행 세포암; 요도암; 자궁내막암; 자궁육종; 포도막 흑색종; 질암; 외음부암; 발텐스트롬 마크로글로불린 혈증; 또는 윌름스 종양이다.
투여 일정
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 암, 자가 면역 장애, 또는 염증성 장애의 치료가 필요한 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 및 유도 배지는 상이한 투여 경로를 포함한다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 피하, 두정 내, 근육 내, 정맥 내, 종양 내, 안 내, 망막 내, 유리체 내, 또는 두개 내이다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 부위 또는 염증 부위에 직접 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 배양 배지, 세포외 소포, 및 분비 인자는 암, 자가 면역 장애, 또는 면역 매개 염증 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법, 세포, 및 유도 배지는 상이한 투여 빈도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 방법은 1일 1회, 주 1회, 월 1회, 또는 연 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 방법은 1일 2회, 주 2회, 월 2회, 또는 연 2회 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 방법은 1일 3회, 주 3회, 월 3회, 또는 연 3회 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 방법은 1일 4회, 주 4회, 월 4회, 또는 연 4회에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1차 치료 후에 유지 용량을 연 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12회 투여한다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 계속된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 1x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 2x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 3x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 4x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 5x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 6x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 7x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 8x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 9x106개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 1x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 2x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 3x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 4x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 5x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 6x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 7x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 8x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 9x107개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 1x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 2x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 3x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 4x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 5x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 6x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 7x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 8x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 9x108개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 1x109개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 2x109개 이상의 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 당 3x109개 이상의 세포가 투여된다.
약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및 담체
본 발명의 세포, 배지, 및 세포외 소포는 투여, 안정성, 균일성, 생체 이용률, 또는 이들의 임의의 조합을 개선하고 향상시키기 위해 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 또는 담체와 배합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포외 소포 또는 세포는 무균 용액 중에 현탁 투여된다. 특정 실시양태에서, 용액은 0.9% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용액은 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트, 중탄산염 또는 히드록시메틸아미노메탄(트리스(Tirs)); 계면 활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20), 또는 폴록사머 188; 폴리올/이당류/다당류, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트로스, 만노오스, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로스, 또는 덱스트란 40; 아미노산, 예를 들어 글리신 또는 아르기닌; 산화 방지제, 예를 들어 아스코르브산 또는 메티오닌; 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 EGTA 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포외 소포는 투여하기 전에 포장/보관되고 동결 건조되고 재구성된다. 특정 실시양태에서, 동결 건조된 세포외 소포 제제는 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로스, 및 덱스트란 40과 같은 증량제를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이며 제한하기 위해 제공하는 것은 아니다.
실시예 1: 톨 유사 수용체 및 특정 유도제의 병용에 의한 중간엽 줄기 세포 프라이밍의 향상
도 3a 및 도 3b를 참조하면, TLR3에 의한 2형 중간엽 줄기 세포 프라이밍은 아세틸콜린(ACH), 글루타메이트(GLU), 및 리폭신 A4(LAX4)에 의해 더욱 향상된다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 폴리(I:C)와 0.5 ng/mL의 인간 재조합 에리스로포이에틴을 사용하여 2형 중간엽 줄기 세포로 유도하였다. 전체 RNA를 단리하고 정제하여 cDNA로 역전사하였다. SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix)를 이용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 데이터는 정량적인 비교 CT 방법을 사용하여 분석하였고, 표적 유전자 발현을 18S rRNA 항존 유전자에 대해 정규화하여, 미처리 대조군에 대해 배율 증가로서 나타냈다. 유도 후 CXCL9 유전자 발현이 유의하게 증가하였다. 오차 막대는 평균의 +/- 표준 오차(SEM: standard error of the mean)를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b의 두 개의 독립적인 실험에서 볼 수 있듯이, ACH(약 24배 도 3a; 약 37배 도 3b), GLU(약 317.4배 도 3a; 약 59배 도 3b), LAX4(약 32배 도 3a; 약 47배 도 3b), 또는 조합된 3가지 모두(약 108배 도 3b)와 TLR3의 조합에 의한 중간엽 줄기 세포의 자극은 어느 하나의 단독 TLR3(약 8.8배 도 3a; 약 22배 도 3b), ACH(약 3.7배 도 3a; 약 20배 도 3b), GLU(약 1.4배 도 3a; 약 16배 도 3b), 또는 LAX4(약 2배 도 3a; 약 13배 도 3b)보다 CXCL9의 발현을 더 크게 유발하였다.
도 4a 및 도 4b를 참조하면, TLR4에 의한 1형 중간엽 줄기 세포 프라이밍은 류코트리엔 B4(LTB4), 세로토닌(5-HT), 멜라토닌(MEL)으로 더욱 향상된다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 지질 다당류(LPS)와 0.5 ng/mL의 인간 재조합 에리트로포이에틴을 사용하여 1형 중간엽 줄기 세포로 유도하였다. 전체 RNA를 단리하고 정제하여 cDNA로 역전사하였다. SYBR 그린 마스터 믹스를 이용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 데이터는 정량적인 비교 CT 방법을 사용하여 분석하였고, 표적 유전자 발현을 18S rRNA 항존 유전자에 대해 정규화하여, 미처리 대조군에 대해 배율 증가로서 나타냈다. TNFSF10(TRAIL로도 알려짐) 유전자 발현은 유도 후 유의하게 증가하였다. 오차 막대는 평균의 +/- 표준 오차(SEM)를 나타낸다. 도 4a 및 도 4b의 두 개의 독립적인 실험에서 볼 수 있듯이, LTB4(약 875,457배 도 4a; 약 15,437배 도 4b), 5-HT(약 12,323배 도 4b), MEL(약 5,555배 도 4b), 또는 조합된 3가지 모두(약 22,328배 도 4b)와 TLR4의 조합에 의한 중간엽 줄기 세포의 자극은 어느 하나의 단독 TLR4(약 425,854배 도 4a; 약 7,567배 도 4b), LTB4(약 49배 도 4a; 약 49배 도 4b), 5-HT(약 333배 도 4b), 또는 MEL(약 489배 도 4b)보다 TNFSF10의 발현을 더 크게 유발하였다.
실시예 2: 프라이밍된 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된 인자의 분석
광범위한 생체 활성 분자(즉, 분비 단백질체(secretome))의 분비는 MSC가 그들의 치료 효과를 달성하고 표적화된 질병 조직에 가장 큰 영향을 줄 가능성이 있는 중요한 기전이다. 본 발명자들은 이러한 생체 활성 인자의 공지된 제공자로서 엑소좀(세포외 소포라고도 함; EV(extracellular vesicle) 또는 다소포체; MEB(multi-vesicular body))을 포함한다. 엑소좀은 이웃 세포에 영향을 줄 수 있는 분비 소포이다. 본 발명자들은 MSC가 제공할 가능성이 있는 분자로서 미토겐, 세포외 기질(ECM: Extracellular Matrix) 단백질, 안지오겐, 엑소좀, 및 염증/면역 조절 생체 활성 인자를 포함한다.
미접촉 MSC, MSC1, 및 MSC2 분비 단백질체/엑소좀을 제조사의 지시(Human Group I & II; Bio-Rad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)에 따른 바이오-플렉스 생체 활성 인자 분석(Bio-Plex Bioactive Factor Assays), 시스테믹사(Sistemic Inc)(영국 소재), 팔랑크스 바이오테크 그룹(Phalanx Biotech group, 캘리포니아주 소재)에 의한 miRNA 분석, LC-MS/MS 시스템 바이오사이언스(System Biosciences)(SBI. 캘리포니아주 소재)에 의한 차세대 단백질 시퀀싱에 의해 시험한 후, 웨스턴 블롯 분석, ELISA, 유동 세포 계측법, 및 RT-qPCR로 확인하였다.
미접촉 MSC, MSC1 및 MSC2의 조건화 배지를 수집하고 원심분리에 의해 투명하게 한 후 생체 활성 인자 분석을 수행하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 10 ng/mL의 LPS로 48시간 처리하여 MSC1을 자극하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 1 ㎍/mL의 폴리(I:C)를 사용하여 48시간 처리하여 MSC2를 자극하였다. 모든 수준은 샘플의 총 단백질 농도에 의해 그리고 추가로 미처리된 미접촉 MSC 수준에 의해 정규화하였다. 4배 초과하는 수준을 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 데이터는 3회 초과의 독립적인 실험을 나타내며 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석으로 추가로 확인되었다. 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112018108090517-pct00001
결과는 MSC1 및 MSC2에 의해 분비되는 분비 인자가 뚜렷하게 중첩되지 않는 세트임을 나타낸다. 일반적으로 염증 유발성 인자는 MSC1에 의해 분비되고 항염증 인자는 MSC2에 의해 분비된다.
실시예 3: 프라이밍된 중간엽 줄기 세포에 의해 분비된 세포외 소포의 단백질 함량의 분석
미접촉 MSC, MSC1 및 MSC2로부터의 세포외 소포를 단리하고 엑소퀵-TC(ExoQuick-TC) 키트(System Biosciences, Inc)를 사용하여 액체 크로마토그래피[LC]- 질량 분광법[MS]/MS에 의해 분석하였다. 간략하게, 미접촉, MSC1 및 MSC2의 조건화 배지를 혈청/동물 무첨가 배지에서 48시간 인큐베이션한 후 수집하고 원심분리에 의해 투명하게 하였다. 10 ng/mL의 LPS와 5 ng/mL의 인간 재조합 에리스로포이에틴을 사용하여 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 48시간 처리하여 MSC1을 자극한 후 분석하였다. 1 ㎍/mL의 폴리(I:C)와 5ng/mL의 인간 재조합 에리트로포이에틴을 사용하여 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 48시간 처리하여 MSC2를 자극한 후 분석하였다. 세포외 소포 펠렛을 200 ㎕의 변형된 RIPA 완충액(2.0% SDS, 150mM NaCl, 50mM 트리스, pH 8.5, 1X 완전 프로테아제 억제제(Roche))에서 100℃에서 15분간 용해하였다. 용해액을 원심분리에 의해 투명하게 하고 쿠비트(Qubit) 형광 측정기(Invitrogen)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 10 ㎍의 추출된 단백질을 MES 완충 시스템에서 10% 비스 트리스 뉴페이지 미니 겔(Bis Tris NuPage mini-gel)(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE를 거첬다. 이동 윈도우(2cm 레인)를 절제하고 프로제스트 로봇(ProGest robot)(DigiLab)을 사용하여 겔 내 분해를 수행하였다. 각각의 분해된 샘플의 절반을 서모피셔 Q 익스트랙티브(ThermoFisher Q Exactive)에 접속된 워터스(Waters) 나노어퀴티(NanoAcquity) HPLC 시스템을 이용하여 나노 LC-MS/MS로 분석하였다. 펩티드를 트래핑 칼럼에 로딩하고 75 ㎛ 분석 칼럼 상에서 2시간 역상 구배를 사용하여 350 nL/분으로 용출하였다; 두 칼럼을 모두 루나(Luna) C18 수지(Phenomenex)로 충전하였다. MS/MS에 대해 15개의 가장 풍부한 이온을 선택하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
Figure 112018108090517-pct00002
실시예 4: 프라이밍된 중간엽 줄기 세포에 의해 발현된 miRNA의 분석
마이크로 RNA[miRNA]는 약 20년 전에 선충에서 세포의 운명을 결정하는데 중요하다고 처음 개시되었다. 인간에서 miRNA의 존재는 10년 전에 처음 개시되었다. miRNA 프로파일 연구는 miRNA가 상이한 장기와 상이한 발생 단계에서 선택적으로 발현된다는 것을 입증하였다. MSC의 상이한 조직 출처에 대한 miRNA 시그니쳐는 증식, 자가 재생, 및 분화 능력과 같은 줄기 세포 특성의 유지에 관여하는 miRNA 양상을 정의하였다. MSC1 및 MSC2 miRNA 프로파일을 프라이밍된 세포로부터 분석하여 미처리된 미접촉 MSC와 비교하여 고유한 발현 양상을 밝혔다. 데이터는 3명 초과의 개별 기증자로부터의 3회 이상의 독립적인 실험을 나타낸다. 데이터는 미접촉 MSC=1과 비교하여 상대적인 발현으로 나타낸다. 예를 들어 MSC1에서 확립된 염증 유발성 miRNA155의 발현 상승은 이의 예측되는 염증 표현형과 일치한다.
인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 10 ng/mL의 LPS와 5 ng/mL의 인간 재조합 에리트로포이에틴으로 4시간 처리하여 MSC1을 자극한 후에 분석하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 1 ㎍/mL의 폴리(I:C)와 5 ng/mL의 인간 재조합 에리트로포이에틴으로 4시간 처리하여 MSC2를 자극한 후에 분석하였다.
도 5a(MSC1) 및 도 5b(MSC2)는 이들 실험 결과를 나타낸다. MSC1로 자극된 세포외 소포 경우, miR-146(약 2.7배), miR-155(약 3.3배), miR-1305(약 2.3배), miR-575(약 2.1배), 및 miR-1973(약 2.3배)의 수준은 모두 비자극 MSC와 비교하여 2배 초과하여 유도되었지만, miR-24-3p의 수준은 약 2배 감소하였다. MSC2로 자극된 세포외 소포 경우, miR-Let 7a/d(약 3.4배), miR-17_1(약 6.5배), miR-92a(약 6.5배), 및 miR-1260a 약 2.4배)의 수준은 모두 비자극 MSC와 비교하여 2배 초과하여 유도되었지만, miR-222의 수준은 약 2 배 감소하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 본원에 제시하고 설명하였지만, 당업자에게는 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것이 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 대체가 이루어질 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 다양한 대안이 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (58)

  1. (a) 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드; 및
    (b) 아세틸콜린
    을 포함하는 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, TLR3 리간드는 폴리(I:C), 폴리(A:U), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 저산소증 모방물(hypoxia mimetic) 및/또는 에리트로포이에틴을 추가로 포함하는 배지.
  4. 제3항에 있어서, 저산소증 모방물은 염화코발트, 데스페리옥사민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 배지.
  5. 제1항 또는 제2항의 배지 및 다능성 줄기 세포 집단을 포함하는 세포 배양물.
  6. 제5항에 있어서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함하는 것인 세포 배양물.
  7. 제5항에 있어서, CXCL9 mRNA의 20배 초과의 유도가 다능성 줄기 세포 집단에서 일어나는 것인 세포 배양물.
  8. 제5항에 있어서, miR-Let 7a/d, miR-17_1, miR-222, miR-92a, 및 miR-1260a로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 miRNA의 2배 초과의 유도가 다능성 줄기 세포 집단에서 일어나는 것인 세포 배양물.
  9. 제5항의 세포 배양물로부터 채취된 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단.
  10. 제9항에 있어서, 중간엽 세포 집단을 포함하는 다능성 줄기 세포 집단.
  11. 제9항의 다능성 줄기 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 염증성 또는 자가 면역 병태를 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  13. 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1항 또는 제2항의 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 비자극 다능성 줄기 세포 집단으로부터 면역학적으로 분극화된 다능성 줄기 세포 집단의 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  15. 비자극 다능성 줄기 세포 집단을 제1항 또는 제2항의 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포외 소포의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 비자극 다능성 줄기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 세포외 소포는 배지로부터 단리 및/또는 정제되는 것인 방법.
  18. 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 또는 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2) 단백질 또는 이의 일부 중 어느 하나 이상을, 미접촉 비자극 중간엽 줄기 세포에 의해 생산된 세포외 소포에 존재하는 수준과 비교하여 상승된 수준으로 포함하는, 제15항의 방법에 의해 제조된 단리 및 정제된 세포외 소포.
  19. 제18항에 있어서, 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 또는 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2) 중 어느 2가지 이상을 상승된 수준으로 포함하는 단리 및 정제된 세포외 소포.
  20. 제18항에 있어서, 미오신-1(MYH1), 미오신-2(MTH2), 미오신-7(MYH-7), 및 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2)의 4가지 모두를 상승된 수준으로 포함하는 단리 및 정제된 세포외 소포.
  21. 제18항의 단리 및 정제된 세포외 소포 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 염증성 또는 자가 면역 병태를 가진 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  23. 제5항에 있어서, 배양은 저산소 조건하에 수행되는 것인 세포 배양물.
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