CN115975918A - 一种皮肤组织来源外泌体的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纤维细胞分离技术领域，具体为一种皮肤组织来源外泌体的提取方法包括以下步骤：皮肤组织预处理；原代成纤维细胞提取；细胞接种扩增；所得细胞培养液过滤；切向流超滤TFF设备纯化、浓缩；有益效果为：本发明提出的皮肤组织来源外泌体的提取方法从真皮层中提取成纤维细胞，能增加提取细胞的纯度和活性，在细胞增值能力上相对全皮提取的细胞大大提升，更容易扩增和产生更多的外泌体产量；初过滤有效减少了大的杂质，然后使用切向流超滤(TFF)设备，过程可控、操作简便，所得外泌体纯度、产量较高。
Description
技术领域
本发明涉及纤维细胞分离技术领域，具体为一种皮肤组织来源外泌体的提取方法。
背景技术
外泌体是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，因其携带复杂的生物信息，如信使RNA(mRNA)、微小核醣核酸(microRNAs)等，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中。
现有技术中，外泌体在医疗领域有着巨大应用前景，可以协助疾病的诊断和治疗，随着科技的发展，外泌体也在越来越多的疾病领域得到运用。在皮肤疾病领域，外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成；可以帮助促进血管生成；可以帮助伤口愈合、抑制瘢痕形成、调节免疫反应等。在临床上，外泌体可以用于治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡，再生健康皮肤；在护肤方面，外泌体可以修复受损肌肤，从而全面改善肤质，让肌肤回到健康、年轻的状态。
但是，用于皮肤治疗的外泌体主要来源于人皮肤组织提取的细胞上清液中，其中以成纤维细胞较为常见。传统的成纤维细胞提取方法是使用全皮的消化试剂盒对整块组织进行消化配合物理剪切的方式提取成纤维细胞，此方法缺点是：(1)杂细胞种类、数量较多，难以获得纯度、活性较高的成纤维细胞；(2)使用此细胞扩增后从上清液中提取的外泌体有所差别。在对接下去上清液中的外泌体提纯过程中，传统的方法是使用超滤管进行浓缩，此方法的缺点是：(1)超滤管有产生漏液的风险而无法截留到足够多的外泌体；(2)产量很低，仅能用于科研；(3)配合离心机使用，外泌体所受离心力无法控制，容易破裂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，该提取方法包括以下步骤：
皮肤组织预处理；
原代成纤维细胞提取；
细胞接种扩增；
所得细胞培养液过滤；
切向流超滤TFF设备纯化、浓缩。
优选的，皮肤组织预处理时，无菌操作将样本组织放入加有2％青霉素、链霉素的PBS 10ml的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管杂质，清洗5遍。
优选的，原代成纤维细胞提取时，细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml分散酶II浸泡组织一定时间后，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒消化液进行过夜消化12-18小时；加入两倍体积的完全培养基终止消化。
优选的，原代成纤维细胞提取时，50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管；50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞。
优选的，细胞接种扩增时，上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后根据细胞数量加入一定量的完全培养基混匀后加入若干个T25培养瓶内接种培养，将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％ CO2条件培养。
优选的，细胞接种扩增时，细胞融合度达到80％以上则进行传代操作：按T75培养瓶计，吸出旧培养基，加入5mlPBS缓冲液洗涤吸去，添加0.25％含EDTA胰酶3mL，T25瓶为1ml，消化2-4min，加入2倍以上胰酶体积的完全培养基终止消化，将细胞冲洗下来，细胞悬液吸出至50ml离心管；200g/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，取100μL悬液计数，根据细胞计数用完全培养基稀释后接种至若干个T75培养瓶，接种浓度(1.5-2.0)*10^6个/瓶，37℃培养箱静置培养。
优选的，所得细胞培养液过滤时，组装一次性过滤瓶，滤膜为0.8μm孔径，收集瓶可根据收集上清液的量更换为适合大小的一次性无菌瓶或灭菌玻璃瓶，过滤瓶连接抽吸装置管路。
优选的，所得细胞培养液过滤时，打开过滤瓶盖子，吸取离心管内收集的上清液加入过滤瓶上层进液端；吸取10mL PBS溶液对离心管进行润洗后，再加入过滤瓶上层进液端；检查管路连接正常，过滤瓶盖子旋紧后，开启抽吸装置，开始过滤；待进液端液体抽干后，吸取10mlPBS溶液清洗滤膜，可适当增加清洗步骤直到进液端无气泡残留；进液端液体抽干后，断开管路，关闭抽吸装置，取下收集瓶，盖上收集瓶盖子放入4℃冷藏箱暂存。
优选的，向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，试剂准备：无菌水、1％NAOH溶液、1*PBS溶液、0.1％磷酸溶液、0.5％清洁剂、75％乙醇，以上溶液都经0.22μm滤膜过滤，4℃冰盒准备；TFF预设管路套装连接，整体灭菌套装连接设备；打开TFF软件，选择“自动模式”，按照预设程序进行操作；PBS溶液润洗10min后停止，中空纤维柱及管路完成润洗。
优选的，向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，准备好PBS溶液装于50mL离心管内，将原液端管路放入PBS溶液中，点击开始运行，注意观察离心管上刻度，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；再次将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，同样吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；最后将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，吸取5-10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，待回流干净后即可停止系统，取得的回流液即为最终的EV浓缩液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出的皮肤组织来源外泌体的提取方法从真皮层中提取成纤维细胞，能增加提取细胞的纯度和活性，在细胞增值能力上相对全皮提取的细胞大大提升，更容易扩增和产生更多的外泌体产量；初过滤有效减少了大的杂质，然后使用切向流超滤(TFF)设备，过程可控、操作简便，所得外泌体纯度、产量较高；
针对上游从皮肤组织原代分离成纤维细胞，使得所得成纤维细胞纯度更高、活性更强的方法和一种针对下游从细胞上培养液中纯化、浓缩外泌体提高产量、浓度的方法。本发明对原代细胞提取进行了明显改进，使得成纤维细胞更利于表达外泌体；对外泌体纯化使用了不同的原理设备，增加了产量和得率，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案进行清楚、完整地描述，及优点更加清楚明白，以下结合附图对本发明实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，该提取方法包括以下步骤：
皮肤组织预处理；无菌操作将样本组织放入加有2％青霉素、链霉素的PBS10ml的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管杂质，清洗5遍；
原代成纤维细胞提取；细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml分散酶II浸泡组织一定时间后，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒消化液进行过夜消化12-18小时；加入两倍体积的完全培养基终止消化；50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管；50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞；
细胞接种扩增；上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后根据细胞数量加入一定量的完全培养基混匀后加入若干个T25培养瓶内接种培养，将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％ CO2条件培养；细胞融合度达到80％以上则进行传代操作：按T75培养瓶计，吸出旧培养基，加入5mlPBS缓冲液洗涤吸去，添加0.25％含EDTA胰酶3mL，T25瓶为1ml，消化2-4min，加入2倍以上胰酶体积的完全培养基终止消化，将细胞冲洗下来，细胞悬液吸出至50ml离心管；200g/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，取100μL悬液计数，根据细胞计数用完全培养基稀释后接种至若干个T75培养瓶，接种浓度(1.5-2.0)*10^6个/瓶，37℃培养箱静置培养；
所得细胞培养液过滤；组装一次性过滤瓶，滤膜为0.8μm孔径，收集瓶可根据收集上清液的量更换为适合大小的一次性无菌瓶或灭菌玻璃瓶，过滤瓶连接抽吸装置管路；打开过滤瓶盖子，吸取离心管内收集的上清液加入过滤瓶上层进液端；吸取10mL PBS溶液对离心管进行润洗后，再加入过滤瓶上层进液端；检查管路连接正常，过滤瓶盖子旋紧后，开启抽吸装置，开始过滤；待进液端液体抽干后，吸取10mlPBS溶液清洗滤膜，可适当增加清洗步骤直到进液端无气泡残留；进液端液体抽干后，断开管路，关闭抽吸装置，取下收集瓶，盖上收集瓶盖子放入4℃冷藏箱暂存；
切向流超滤TFF设备纯化、浓缩；试剂准备：无菌水、1％NAOH溶液、1*PBS溶液、0.1％磷酸溶液、0.5％清洁剂、75％乙醇，以上溶液都经0.22μm滤膜过滤，4℃冰盒准备；TFF预设管路套装连接，整体灭菌套装连接设备；打开TFF软件，选择“自动模式”，按照预设程序进行操作；PBS溶液润洗10min后停止，中空纤维柱及管路完成润洗；准备好PBS溶液装于50mL离心管内，将原液端管路放入PBS溶液中，点击开始运行，注意观察离心管上刻度，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；再次将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，同样吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；最后将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，吸取5-10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，待回流干净后即可停止系统，取得的回流液即为最终的EV浓缩液。
实施例二
在实施例一的基础上，一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，包括以下步骤：
(1)皮肤组织预处理：无菌操作将样本组织一例放入加有2％青霉素、链霉素的PBS(10ml)的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管等杂质，连续5个培养皿清洗5遍；
(2)原代成纤维细胞提取：细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml浓度为10mg/ml分散酶II(SIGMA,货号D4693-1G)浸泡组织过夜(12-18h，4℃)，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后(7.0cm2)进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒(Whole Skin Dissociation Kit,human，Miltenyi，货号130-101-540)消化液(配置详情：吸取6351μL Buffer L和182.5μL酶P至50mL离心管小心混合成消化液1；吸取730μL酶D和36.5μL酶A小心混合成消化液2；消化液1和消化液2混合成最终消化液)进行过夜消化(12-18小时)；加入两倍体积的完全培养基终止消化；
50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；
用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管中；
50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞；
(3)细胞接种扩增：上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后(1.76*10^7个)根据细胞数量加入1个T25培养瓶内接种培养，细胞标记为P0代；
将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％ CO2条件培养；
观察细胞，每隔2天进行更换培养基，直至细胞融合度达到80％以上则进行传代操作：吸出旧培养基，加入5mlPBS缓冲液洗涤吸去，添加0.25％含EDTA胰酶1ml，消化3min，加入2倍以上胰酶体积的完全培养基(3ml)终止消化，将细胞冲洗下来，细胞悬液吸出至50ml离心管；200g/min离心5min，弃去上清液，加入5ml完全培养基重悬细胞，取100μL悬液计数，根据细胞计数(2.05*10^6个)用完全培养基5ml稀释后接种1个T75培养瓶(接种浓度2.05*10^6个/瓶)，37℃培养箱静置培养，细胞标记为P1代；继续培养扩增传代至P5代细胞进行外泌体收集。
(4)所得细胞培养液过滤：组装一次性过滤瓶，滤膜为0.8μm孔径，使用1升的一次性无菌瓶作为收集瓶，过滤瓶连接抽吸装置管路；
打开过滤瓶盖子，待细胞传代至P5代24小时后即吸取细胞培养瓶内培养液加入收集瓶，全部培养液加入过滤瓶上层进液端；
吸取10mL PBS溶液对离心管进行润洗后，再加入过滤瓶上层进液端；检查管路连接正常，过滤瓶盖子旋紧后，开启抽吸装置，开始过滤；
待进液端液体抽干后，吸取10mlPBS溶液清洗滤膜，可适当增加清洗步骤直到进液端无气泡残留；
进液端液体抽干后，断开管路，关闭抽吸装置，取下收集瓶，盖上收集瓶盖子放入4℃冷藏箱暂存；
(5)切向流超滤(TFF)设备纯化、浓缩：
试剂准备：无菌水、1％NAOH溶液、1*PBS溶液、0.1％磷酸溶液、0.5％清洁剂(酶)、75％乙醇，以上溶液都经0.22μm滤膜过滤，4℃冰盒准备。
TFF预设管路套装连接，整体灭菌套装连接设备；
打开TFF软件，选择“自动模式”，按照预设程序进行操作；150mlPBS溶液润洗10min后停止，中空纤维柱及管路完成润洗；
EV浓缩换液：将收集的原液800ml放在冰盒上，原液端管路喷洒酒精并擦拭后浸入原液，同时把回流端管路喷洒酒精并擦拭后也放入原液瓶；进行参数设置：变压阀设置3psi，起步20％；主泵设置35mL/min流速，根据实际管路连接选择“正转”；点击开始运行，泵开始转动，等到瓶内原液全部吸干净后，暂停系统，注意观察瓶内原液的量，尽量不要进空气；
准备好40mlPBS溶液装于50mL离心管内，将原液端管路放入PBS溶液中，点击开始运行，注意观察离心管上刻度，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；
再次将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，同样吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；
最后将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，待回流干净后即可停止系统，取得的回流液即为最终的外泌体浓缩液9ml。
(6)NTA设备检测外泌体含量：外泌体浓缩液经过检测数量为：2.41*10^11个-1.01*10^12个。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于，该提取方法包括以下步骤：
皮肤组织预处理；
原代成纤维细胞提取；
细胞接种扩增；
所得细胞培养液过滤；
切向流超滤TFF设备纯化、浓缩。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：皮肤组织预处理时，无菌操作将样本组织放入加有2％青霉素、链霉素的PBS 10ml的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管杂质，清洗5遍。
3.根据权利要求2所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：原代成纤维细胞提取时，细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml分散酶II浸泡组织一定时间后，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒消化液进行过夜消化12-18小时；加入两倍体积的完全培养基终止消化。
4.根据权利要求3所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：原代成纤维细胞提取时，50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管；50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：细胞接种扩增时，上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后根据细胞数量加入一定量的完全培养基混匀后加入若干个T25培养瓶内接种培养，将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％CO2条件培养。
6.根据权利要求5所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：细胞接种扩增时，细胞融合度达到80％以上则进行传代操作：按T75培养瓶计，吸出旧培养基，加入5mlPBS缓冲液洗涤吸去，添加0.25％含EDTA胰酶3mL，T25瓶为1ml，消化2-4min，加入2倍以上胰酶体积的完全培养基终止消化，将细胞冲洗下来，细胞悬液吸出至50ml离心管；200g/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，取100μL悬液计数，根据细胞计数用完全培养基稀释后接种至若干个T75培养瓶，接种浓度(1.5-2.0)*10^6个/瓶，37℃培养箱静置培养。
7.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：所得细胞培养液过滤时，组装一次性过滤瓶，滤膜为0.8μm孔径，收集瓶可根据收集上清液的量更换为适合大小的一次性无菌瓶或灭菌玻璃瓶，过滤瓶连接抽吸装置管路。
8.根据权利要求6所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：所得细胞培养液过滤时，打开过滤瓶盖子，吸取离心管内收集的上清液加入过滤瓶上层进液端；吸取10mL PBS溶液对离心管进行润洗后，再加入过滤瓶上层进液端；检查管路连接正常，过滤瓶盖子旋紧后，开启抽吸装置，开始过滤；待进液端液体抽干后，吸取10mlPBS溶液清洗滤膜，可适当增加清洗步骤直到进液端无气泡残留；进液端液体抽干后，断开管路，关闭抽吸装置，取下收集瓶，盖上收集瓶盖子放入4℃冷藏箱暂存。
9.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，试剂准备：无菌水、1％NAOH溶液、1*PBS溶液、0.1％磷酸溶液、0.5％清洁剂、75％乙醇，以上溶液都经0.22μm滤膜过滤，4℃冰盒准备；TFF预设管路套装连接，整体灭菌套装连接设备；打开TFF软件，选择“自动模式”，按照预设程序进行操作；PBS溶液润洗10min后停止，中空纤维柱及管路完成润洗。
10.根据权利要求9所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，准备好PBS溶液装于50mL离心管内，将原液端管路放入PBS溶液中，点击开始运行，注意观察离心管上刻度，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；再次将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，同样吸取10mLPBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；最后将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，吸取5-10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，待回流干净后即可停止系统，取得的回流液即为最终的EV浓缩液。
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