CN107058218A - 孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法。其步骤为：取孕鼠胎盘，预处理后注入含有琼脂糖、四氧化三铁、无血清的DMEM F12培养基和青霉素链霉素的混合液，待凝结后将胎盘剪碎，在磁力作用下吸附含铁的胎盘组织，用胶原酶II溶液重悬，酶消化后加入DMEM F12完全培养基钝化胶原酶II，洗涤后再加入DMEM F12完全培养基重悬，得到的组织块在贴壁生长后长出血管平滑肌细胞，进行传代培养。本发明提供的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法与传统方法相比，能够简便高效的提取胎盘血管平滑肌细胞，整个过程不需要把血管游离出来，操作更加简单，减少了组织暴露于空气中的时间，降低了细胞污染的风险。

Description

孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法。
背景技术
孕鼠胎盘血管平滑肌细胞是从孕晚期孕鼠胎盘动脉血管中分离得来并可体外培养的细胞，由于人胎盘不易获取且个体差异大，而鼠作为常用的动物模型其标本易获得并且其对药物等刺激的反应与人体相似度高，可以很好的模拟人体，故孕鼠胎盘血管平滑肌细胞是研究胎盘血管病变医学基础的重要工具。
然而目前尚没有成熟的方法可以从孕鼠胎盘上分离培养血管平滑肌细胞。我们在分离的过程中发现，虽然传统分离血管平滑肌细胞的方法有组织贴块法和酶消化法，但这两种方法的前提是要分离出血管，而孕鼠胎盘血供丰富，绒毛组织与血管紧密相连，只要在胎盘上出现开口就会涌出血液而使得视野内看不清血管，故胎盘血管分离难度很高而且耗费时间，使得分离的血管数量少、活性差、污染风险高，其分离培养的细胞数目少且成功率低。
发明内容
为了解决孕鼠胎盘血管分离难度大等问题，本发明的目的在于提供一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法，更为简便高效的来提取胎盘血管平滑肌细胞的方法。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
本发明提供一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离方法，其包括以下步骤：
将孕鼠胎盘置于预冷的PBS液中；从脐带血管打入PBS液以冲洗胎盘血管残存的血液；
按照琼脂糖、四氧化三铁、无血清的DMEM F12培养基和青霉素链霉素以(0.05g-2g)：(0.05g-2g)：(9.9mL-100mL)：(0.1mL-5mL)的比例称取并混合煮沸得到琼脂糖混合液，将琼脂糖混合液打入脐动脉，然后将胎盘置入冰冷的PBS液中，从而使琼脂糖混合液凝固；
去除胎盘脐带及胎盘外包绕的结缔组织，并将胎盘剪成碎块；将胎盘碎块置入含有冰冷的PBS液的培养管中，并将培养管固定于磁力架上，使含铁的胎盘组织吸附至管内侧壁；
在磁力作用下，用冰冷的PBS液洗涤被吸附的含铁的胎盘组织，然后用胶原酶II溶液重悬含铁的胎盘组织；
培养用胶原酶II溶液重悬的含铁的胎盘组织以消化血管外连带组织，然后于磁力作用下吸附含铁组织至培养管内侧壁，然后加入DMEM F12完全培养基钝化所吸附组织中的胶原酶II，并用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬，重悬后的组织块经贴壁生长得到孕鼠胎盘血管平滑肌细胞。
上述分离方法中，优选地，消化血管外连带组织的步骤为：
培养用胶原酶II溶液重悬的含铁的胎盘组织，培养过程中每隔10-30min，用滴管吹吸组织，使其外层细胞脱落，培养时间为60-120min。
上述分离方法中，优选地，所述胶原酶II溶液为用无血清的DMEM F12培养基配制的浓度为80U/mL经过滤后的胶原酶II溶液。
上述分离方法中，优选地，所述培养条件为37℃，5％CO2的环境。
上述分离方法中，优选地，所述DMEM F12完全培养基为含有15％血清和1％青霉素链霉菌素的DMEM F12培养基。
本发明还提供一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的传代方法，其包括以下步骤：
将上述经DMEM F12完全培养基重悬的组织块置于培养皿中培养至第2天，取上清液，并用PBS液洗涤培养皿，将洗涤后的洗涤液和上清液混合置于培养管中，在磁力作用下，用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬残存的组织块，并置于培养皿中继续培养，记为板1；
培养至第6天，取板1上清液，并用PBS液洗涤板1培养皿，将洗涤后的洗涤液和板1上清液混合置于培养管中，在磁力作用下，用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬在板1中未贴壁的组织块，将重悬后的组织块置于培养皿中继续培养，记为板2；而吸取上清液和洗涤后的板1的培养皿中，加入DMEM F12完全培养基并继续培养；
培养至第10天，吸取弃除板1和板2的上清液，然后向板1和板2的培养皿中分别加入DMEM F12完全培养基继续培养；
培养至培养皿中的细胞长满皿底时开始进行传代，首先用PBS液对培养皿中细胞进行清洗，然后弃去PBS液，接着向培养皿中加入胰酶进行消化，消化后弃去胰酶，然后加入DMEM F12完全培养基并吹打细胞使其从皿底脱落，混均板1和板2细胞，混均后接种至培养皿中，得到第2代孕鼠胎盘血管平滑肌细胞；接着培养至次日，更换DMEM F12完全培养基，继续培养至下次传代。
上述传代方法中，优选地，向培养皿中加入胰酶进行消化的步骤为：向培养皿中加入含0.25％EDTA的胰酶，并将培养皿置于培养箱中培养30-120s。
上述传代方法中，优选地，所述培养条件为37℃，5％CO2的环境。
上述传代方法中，优选地，所述DMEM F12完全培养基为含有15％血清和1％青霉素链霉菌素的DMEM F12培养基。
上述分离及传代方法中，所述分离和传代方法均在无菌环境中进行，所述工具、器皿为无菌处理过的，所述PBS液和所述DMEM F12培养基为无菌处理过的。
本发明提供的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法，其主要运用了磁铁与四氧化三铁相吸的原理。
本发明提供的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法与传统方法相比，能够简便高效的提取胎盘血管平滑肌细胞，整个过程不需要把血管游离出来，操作更加简单，减少了组织暴露于空气中的时间，降低了细胞污染的风险。
附图说明
图1为本发明实施例中孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法步骤示意图；
图2为本发明实施例中分离培养的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞在第1代至第5代细胞形态图；
图3为本发明实施例中平滑肌特异性marker蛋白α-SMA和MYH11及内皮细胞特异性marker蛋白VII因子免疫荧光染色图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例
本实施例提供一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离方法，其示意图如图1所示，其包括以下步骤：
麻醉孕鼠后(50mg/kg戊巴比妥钠)，用75％的酒精喷洒进行消毒处理，开腹后，迅速分离子宫并置于预冷的无菌PBS液中；
在超净台中剪开子宫，把胎盘从子宫上剥离下来，从胎儿与脐带连接处剪断，把分离下的带有脐带的胎盘至于预冷的无菌PBS液中，把组织放于4℃冰箱或冰上存放；
把1个胎盘放入置于冰上的并含有预冷的无菌PBS液的黑胶皿中，把30G 1/2IN无菌注射针连于5mL(或及以上容量)无菌注射器针筒上，吸取3mL预冷的无菌PBS液，在体式或解剖显微镜下，把30G 1/2IN无菌注射针刺入脐动脉，用动脉夹夹住注射针及脐动脉从而固定注射针，打入PBS液以冲洗血管内残存的血液；
称量0.05g的琼脂糖、0.05g的四氧化三铁粉末、9.9mL的无菌无血清的DMEM F12培养基和0.1mL的青霉素链霉素(终浓度1％)混合煮沸得到混合液，用1mL的注射器吸取0.5-1mL的混合液，并将注射器置于冰上快速旋转冷却至室温并保持混合液未凝固；
把吸取PBS液的针筒从注射针上卸下，将含有混合液的注射器的针筒连接30G 1/2IN无菌注射针，并将混合液打入脐动脉；取下动脉夹，将注射针与脐带分离，把胎盘放入装有3mL冰冷无菌PBS液的EP管中以使琼脂糖凝固，使四氧化三铁可以固定在血管中，把装有PBS液及胎盘的EP管放入4℃冰箱或冰上存放(可存放4小时)，接着对其余胎盘重复上述步骤；
配制胶原酶II溶液，所述胶原酶II溶液为用无血清的DMEM F12培养基配制的浓度为80U/mL经过滤后的胶原酶II溶液；
从PBS液中取2个含有四氧化三铁的胎盘放入一个有2mL冰冷无菌PBS液的35mm培养皿中，去除脐带及胎盘外包绕的结缔组织；把胎盘移动到一个35mm培养皿中，用剪刀把胎盘剪成约1mm3的碎块；
向培养皿中加入2mL的冰冷无菌PBS液，用无菌滴管吸取组织块至15mL的锥形管中，向培养皿中再加入3mL左右冰冷无菌PBS液来洗涤培养皿，以使所有组织块进入15mL的锥形管中；并将锥形管固定于磁力架上，待含铁的胎盘组织吸附至管内侧壁后，弃去PBS液及未被磁力吸附的组织；
在磁力作用下，用冰冷的PBS液洗涤被吸附的含铁的胎盘组织3次，每次3mL，然后用6mL的胶原酶II溶液重悬含铁的胎盘组织；
将重悬的含铁的胎盘组织用滴管吸至60mm的培养皿中，将培养皿置于培养箱中消化血管外连带组织，培养过程中每隔30min，用滴管吹吸组织，使其外层细胞脱落，培养时间为100min，使组织更加充分的与酶接触；用滴管把组织和胶原酶液转移至15mL的锥形管中，置于磁力架上，在磁力作用下弃去液体和未被磁力吸附的组织；在磁力作用下，加入5mL的DMEM F12完全培养基(含有15％血清和1％青霉素链霉菌素的DMEM F12培养基)钝化胶原酶II，并用PBS液洗涤2次，每次3mL；接着加入2mL的DMEM F12完全培养基重悬组织，得到的组织块可贴壁生长，用滴管吸至35mm的培养皿中，记为板0，在37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜，对其余胎盘重复上述同样的步骤。
将上述分离出的组织块置于培养皿中于培养箱中培养至第2天，吸取板0的上清液至15mL锥形管中，用PBS液涮洗板0，每次1mL共2次，把涮洗后的液体吸取至15mL的锥形管中，由于板0中贴壁的组织块多长出成纤维细胞因此弃板0；将锥形管置于磁力架上，在磁力作用下，用PBS液洗涤洗3次，每次3mL；接着加入2mL的DMEM F12完全培养基重悬残存下的组织块，然后吸至35mm的培养皿中，并置于培养皿中于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养，记为板1；显微镜下可以看到血管中有黑色颗粒；
培养至第6天，吸取板1的上清液至15mL锥形管中，用PBS液涮洗板1，每次1mL共2次，把涮洗后的液体吸取至15mL的锥形管中，将锥形管置于磁力架上，在磁力作用下，用PBS液洗涤洗3次，每次3mL；接着加入2mL的DMEM F12完全培养基重悬在板1中为贴壁的组织块，然后吸至35mm的培养皿中，并置于培养皿中于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养，记为板2；
而吸取上清液和洗涤后的板1的培养皿中，加入2mL的DMEM F12完全培养基并置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养；
培养至第10天，吸取弃除板1和板2的上清液，然后向板1和板2的培养皿中分别加入2mL的DMEM F12完全培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养，此时可见板1中组织块周边有细胞长出，为孕鼠胎盘血管平滑肌细胞(第1代)；
培养至培养皿中的细胞长满皿底时开始进行传代，首先分别用1mL的PBS液对每个35mm的培养皿中细胞进行清洗，然后弃去PBS液，接着向培养皿中加入胰酶进行消化，具体为：加入含0.25％EDTA的胰酶0.5mL，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养90s，消化后弃去胰酶，然后加入DMEM F12完全培养基终止胰酶的反应并吹打细胞使其从皿底脱落，混均板1和板2细胞，混均后接种至1个60mm的培养皿中，再加入2mL的DMEM F12完全培养基混均细胞，得到第2代孕鼠胎盘血管平滑肌细胞；对其他培养皿重复同样的操作，得到第2代孕鼠胎盘血管平滑肌细胞；接着培养至次日，每个60mm的培养皿中更换4mL的DMEM F12完全培养基，继续培养至下次传代。
本实施例提供的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法，整个过程不需要把血管游离出来，操作更加简单，减少了组织暴露于空气的时间，降低了细胞污染的风险。此方法分离培养所得细胞在第1代到第5代形态均呈梭形符合平滑肌细胞的特征(如图2所示)，而平滑肌特异性marker蛋白α-SMA和MYH 11染色其阳性率大于96.9％，内皮细胞特异性marker蛋白VIII因子未见显色(如图3所示)，表明该方法可以有效的分离培养出胎盘血管平滑肌细胞。
综上所述，本发明提供的孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离及传代方法与传统方法相比，能够简便高效的提取胎盘血管平滑肌细胞，整个过程不需要把血管游离出来，操作更加简单，减少了组织暴露于空气中的时间，降低了细胞污染的风险。

Claims (9)

1.一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的分离方法，其包括以下步骤：
将孕鼠胎盘置于预冷的PBS液中，从脐带血管打入PBS液以冲洗胎盘血管残存的血液；
按照琼脂糖、四氧化三铁、无血清的DMEM F12培养基和青霉素链霉素以(0.05g-2g)：(0.05g-2g)：(9.9mL-100mL)：(0.1mL-5mL)的比例称取并混合煮沸得到琼脂糖混合液，将琼脂糖混合液打入脐动脉，然后将胎盘置入冰冷的PBS液中，从而使琼脂糖混合液凝固；
去除胎盘脐带及胎盘外包绕的结缔组织，并将胎盘剪成碎块；将胎盘碎块置入含有冰冷的PBS液的培养管中，并将培养管固定于磁力架上，使含铁的胎盘组织吸附至管内侧壁；
在磁力作用下，用冰冷的PBS液洗涤被吸附的含铁的胎盘组织，然后用胶原酶II溶液重悬含铁的胎盘组织；
培养用胶原酶II溶液重悬的含铁的胎盘组织以消化血管外连带组织，然后于磁力作用下吸附含铁组织至培养管内侧壁，然后加入DMEM F12完全培养基钝化所吸附组织中的胶原酶II，并用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬，重悬后的组织块经贴壁生长后得到孕鼠胎盘血管平滑肌细胞。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其中，消化血管外连带组织的步骤为：
培养用胶原酶II溶液重悬的含铁的胎盘组织，培养过程中每隔10-30min，用滴管吹吸组织，使其外层细胞脱落，培养时间为60-120min。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其中，所述胶原酶II溶液为用无血清的DMEMF12培养基配制的浓度为80U/mL经过滤后的胶原酶II溶液。
4.根据权利要求1或2所述的分离方法，其中，所述培养条件为37℃，5％CO2的环境。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其中，所述DMEM F12完全培养基为含有15％血清和1％青霉素链霉菌素的DMEM F12培养基。
6.一种孕鼠胎盘血管平滑肌细胞的传代方法，其包括以下步骤：
将权利要求1-5任一项中的经DMEM F12完全培养基重悬的组织块置于培养皿中培养至第2天，取上清液，并用PBS液洗涤培养皿，将洗涤后的洗涤液和上清液混合置于培养管中，在磁力作用下，用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬残存的组织块，并置于培养皿中继续培养，记为板1；
培养至第6天，取板1上清液，并用PBS液洗涤板1培养皿，将洗涤后的洗涤液和板1上清液混合置于培养管中，在磁力作用下，用PBS液洗涤，接着加入DMEM F12完全培养基重悬在板1中未贴壁的组织块，将重悬后的组织块置于培养皿中继续培养，记为板2；而吸取上清液和洗涤后的板1的培养皿中，加入DMEM F12完全培养基并继续培养；
培养至第10天，吸取弃除板1和板2的上清液，然后向板1和板2的培养皿中分别加入DMEM F12完全培养基继续培养；
培养至培养皿中的细胞长满皿底时开始进行传代，首先用PBS液对培养皿中细胞进行清洗，然后弃去PBS液，接着向培养皿中加入胰酶进行消化，消化后弃去胰酶，然后加入DMEMF12完全培养基并吹打细胞使其从皿底脱落，混均板1和板2细胞，混均后接种至培养皿中，得到第2代孕鼠胎盘血管平滑肌细胞；接着培养至次日，更换DMEM F12完全培养基，继续培养至下次传代。
7.根据权利要求6所述的传代方法，其中，向培养皿中加入胰酶进行消化的步骤为：向培养皿中加入含0.25％EDTA的胰酶，并将培养皿置于培养箱中培养30-120s。
8.根据权利要求6或7所述的传代方法，其中，所述培养条件为37℃，5％CO2的环境。
9.根据权利要求6所述的传代方法，其中，所述DMEM F12完全培养基为含有15％血清和1％青霉素链霉菌素的DMEM F12培养基。
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