CN108815016A - 一种包裹干细胞生长因子原液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，公开了一种包裹干细胞生长因子原液，该包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠17‑22％、中分子量透明质酸钠8‑12％、低分子量透明质酸钠4.0‑5.8％、丙二醇15‑25％、甘油35‑46％、PE9010 1.6‑2.5％以及无菌水2.2‑5.0％；该包裹干细胞生长因子原液能够有效保持并延长冻干粉中活性成分的活性，而且后期添加到生物护肤制剂中操作简单，融合性高，活性保持时间长，能够延长最终产品的保质期。

Description

一种包裹干细胞生长因子原液
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种包裹干细胞生长因子原液。
背景技术
干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factors)是一种具有刺激自体内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合，也是体外培养干细胞必不可少的各种细胞生长因子的组合，富含表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)等多重有效成分。在美国哈弗大学麻省理工大学进行的临床实验中，156名受试者中有147名出现与对照组明显的差异，证明干细胞生长因子可以提高记忆、延缓衰老等好处。
干细胞生长因子属于生物技术制剂，具有特殊的生物活性，添加到化妆品中往往会与化妆品中的高分子有机化合物和表面活性剂发生化学反应而失去活性；此外，化妆品的生产需要加热并具有一定酸碱性，但干细胞生长因子在温度高于37℃、在中性以外的pH条件下均易失活。因此，如何保持干细胞生长因子体外活性是严重影响干细胞生长因子应用的一大重要因素。传统的保存方法只要以冻干粉为主，但是干细胞生长因子在冻干粉工艺中，不能解决内毒素以及外源性污染等问题。本申请人通过3T3细胞模型试验，发现了一种能够有效延长干细胞生长因子活性的原液，在本原液包裹后的干细胞生长因子冻干粉失活率降低至80％，而且后期添加到生物护肤制剂中操作简单，融合性高，同时能够延长最终产品的保质期。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种包裹干细胞生长因子原液，该包裹干细胞生长因子原液能够有效保持并延长冻干粉中活性成分的活性，而且后期添加到生物护肤制剂中操作简单，融合性高，活性保持时间长，能够延长最终产品的保质期。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种包裹干细胞生长因子原液，该包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠17‐22％、中分子量透明质酸钠8‐12％、低分子量透明质酸钠4.0‐5.8％、丙二醇15‐25％、甘油35‐46％、PE9010 1.6‐2.5％以及无菌水2.2‐5.0％；所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000‐400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000；
所述包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得。
在本发明中，进一步的，所述包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括；高分子量透明质酸钠20％、中分子量透明质酸钠10％、低分子量透明质酸钠5％、丙二醇20％、甘油40％、PE9010 2％以及无菌水3％。
一种所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉，用所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉中冻干粉原料与所述包裹干细胞生长因子原液的配料比为：每1g冻干粉原料对应1L所述包裹干细胞生长因子原液；
用所述包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌20‐40min，转速为1‐2rad/s，即得。
在本发明中，进一步的，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉稀释液，所述冻干粉稀释液的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、丙二醇0.1‐5％、PE 0.1‐0.5％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1‐1.7×108IU/mL。
在本发明中，进一步的，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉原液，所述冻干粉原液的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、透明质酸0.05‐0.1％、丙二醇0.1‐5％、PE0.1‐0.5％、甲酯0.05‐0.3％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1‐1.7×108IU/mL。
在本发明中，进一步的，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉半成品，所述冻干粉半成品的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、透明质酸0.05‐0.1％、甘油60‐80％、丙二醇0.1‐5％、PE 0.1‐0.5％、甲酯0.05‐0.3％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1‐1.7×108IU/mL。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明中采用高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠、低分子量透明质酸钠、丙二醇、甘油、PE9010以及无菌水配合使用，其中透明质酸是一种酸性粘多糖，大量存在于人体的结缔组织及真皮层中；高分子量透明质酸钠可在皮肤表面形成一层透气薄膜，令肌肤柔嫩、光泽，使皮肤产生良好的光滑感和湿润感；中分子量透明质酸钠能紧致肌肤、长久保湿，使皮肤富有弹性；低分子量透明质酸钠能渗入真皮，对肌肤深层补水、加快皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、去皱、增加弹性、防止衰老；本发明人经过多方面研究，研制出如文高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照特定分子量限定范围以及特定配比，再组合丙二醇、甘油起到润滑作用，及PE 9010优良的化妆品用液体防腐剂；使得该包裹干细胞生长因子原液具有良好的透皮吸收能力，添加到生物护肤制剂中操作简单，融合性高，同时其包裹的冻干粉中干细胞生长因子活性高，保持活性时间长，能够延长最终产品的保质期。
(2)本发明的包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉后，能够制备冻干粉稀释液、冻干粉原液及冻干粉半成品，有效地保持干细胞生长因子活性，可显著提高干细胞生长因子的稳定性，同时，具有亲和力强、无毒副作用，能够大大提高干细胞生长因子的适用范围，从而提高其生物利用度。
(3)本发明中包裹干细胞生长因子原液的制备工艺简单，适于规模化生产，适应性强。
附图说明
图1为冻干粉原料的液相色谱图。
图2为实施例3制备的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例，进一步阐述本发明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所用的原料均可从市面上购买。
实施例1
一种包裹干细胞生长因子原液：
(1)包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠17％、中分子量透明质酸钠12％、低分子量透明质酸钠5.8％、丙二醇25％、甘油35％、PE90102.0％以及无菌水3.2％；(所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000‐400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000)
(2)包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得；
(3)用所述包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L步骤(2)制得的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌20min，转速为2rad/s，即得用所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉。
(4)应用：①制备冻干粉稀释液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、丙二醇0.1％、PE 0.5％，其余为无菌水；
②制备冻干粉原液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.05％、丙二醇0.1％、PE 0.5％、甲酯0.3％，其余为无菌水；
③制备冻干粉半成品按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.05％、甘油60％、丙二醇0.1％、PE 0.5％、甲酯0.3％，其余为无菌水。
实施例2
一种包裹干细胞生长因子原液：
(1)包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠20％、中分子量透明质酸钠10％、低分子量透明质酸钠5.5％、丙二醇22％、甘油38％、PE90101.8％以及无菌水2.7％；(所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000‐400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000)
(2)包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得；
(3)用所述包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L步骤(2)制得的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌25min，转速为2rad/s，即得用所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉。
(4)应用：①制备冻干粉稀释液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、丙二醇0.5％、PE 0.3％，其余为无菌水；
②制备冻干粉原液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.08％、丙二醇0.5％、PE 0.3％、甲酯0.2％，其余为无菌水；
③制备冻干粉半成品按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.08％、甘油66％、丙二醇0.5％、PE 0.3％、甲酯0.2％，其余为无菌水。
实施例3
一种包裹干细胞生长因子原液：
(1)包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠20％、中分子量透明质酸钠10％、低分子量透明质酸钠5％、丙二醇20％、甘油40％、PE9010 2％以及无菌水3％；(所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000‐400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000)
(2)包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得；
(3)用所述包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L步骤(2)制得的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌35min，转速为1rad/s，即得用所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉。
(4)应用：①制备冻干粉稀释液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、丙二醇1.0％、PE 0.2％，其余为无菌水；
②制备冻干粉原液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.08％、丙二醇1.0％、PE 0.2％、甲酯0.12％，其余为无菌水；
③制备冻干粉半成品按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.08％、甘油72％、丙二醇1.0％、PE 0.2％、甲酯0.12％，其余为无菌水。
实施例4
一种包裹干细胞生长因子原液：
(1)包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：高分子量透明质酸钠22％、中分子量透明质酸钠8％、低分子量透明质酸钠4.0％、丙二醇25％、甘油36％、PE90102.5％以及无菌水2.5％；(所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000‐400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000)
(2)包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得；
(3)用所述的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L步骤(2)制得的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌40min，转速为1rad/s，即得用包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉。
(4)应用：①制备冻干粉稀释液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、丙二醇5.0％、PE 0.1％，其余为无菌水；
②制备冻干粉原液按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.1％、丙二醇5.0％、PE 0.1％、甲酯0.05％，其余为无菌水；
③制备冻干粉半成品按照质量百分比计包括：步骤(3)中制得的冻干粉2％、透明质酸0.1％、甘油80％、丙二醇5.0％、PE 0.1％、甲酯0.05％，其余为无菌水。
对比例1：未包裹干细胞生长因子原液的冻干粉原料(购买至天津强微特生物技术有限公司)；
应用：制备冻干粉稀释液按照质量百分比计包括：冻干粉原料2％、丙二醇1.0％、PE 0.2％，其余为无菌水。
下面通过实验来考察本发明包裹干细胞生长因子原液的作用效果：
(一)采用液相色谱仪对冻干粉原料，及实施例3制备的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉进行检测：
色谱条件：岛津20A高效液相色谱仪；
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶Hypersi cold 150×4.6mm，柱体0.8mL；
检测波长：280nm；
流速：1mL/min；
流动相：流动相A:0.05％三氟乙酸水溶液；流动相B：配置体积比为9：1的乙腈水，并于1000mL乙腈水加入0.042mL三氟乙酸，制备得到流动相B。
在室温条件下，分别取10.0mg冻干粉原料及实施例3制备的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉用纯化水溶解后，定容至100mL容量瓶中，摇匀，用0.45um过滤膜过滤，进样体积20uL，流动性A由10％至70％进行梯度洗脱于高效液相色谱仪中检测；冻干粉原料的液相色谱图如图1所示，实施例3制备的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉的液相色谱图如图2所示。
由图1和图2可见，图1中杂峰较多，主峰1出现在t＝3.722min；图2中杂峰较少，主峰2出现在t＝2.999min，并通过特征峰对比及标准进样法，主峰2包含原冻干粉的吸收峰，说明由实施例3制备的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉具有较好的吸收峰，并且仍保持原有冻干粉原料的特性，不会对冻干粉原料有影响。
(二)选取实施例1‐4及对比例1制备的冻干粉稀释液在37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中保存，在570nm波长下测其吸光值，重复3次；每个试验例重复5次(实验测试条件基于复旦细胞中心/上海基础研究实验中心)；具体数据如表1所示：
表1
注：①ab小写字母表示5％显著性差异；AB大写字母表示1％极显著性差异。
由表1可见，本发明实施例1‐4制备的冻干粉稀释液在90天内活性保持在原活性的80.0％左右，而对比例1的活性下降了51.5％；同时从实施例3与对比例1的对比来看，对比例1制备的冻干粉稀释液的活性在第7天至第90天时下降十分快速，综合说明用本发明的包裹干细胞生长因子原液包裹后冻干粉制备的冻干粉稀释液中干细胞生长因子活性高，保持活性时间长，能够延长冻干粉稀释液的保质期。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (6)

1.一种包裹干细胞生长因子原液，其特征在于，该包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括：
高分子量透明质酸钠 17-22％、
中分子量透明质酸钠 8-12％、
低分子量透明质酸钠 4.0-5.8％、
丙二醇 15-25％、
甘油 35-46％、
PE9010 1.6-2.5％
以及无菌水 2.2-5.0％；
所述高分子量透明质酸钠的分子量大于400,000；所述中分子量透明质酸钠的分子量为200,000-400,000；所述低分子量透明质酸钠钠的分子量小于10,000；
所述包裹干细胞生长因子原液的制备方法：先将高分子量透明质酸钠、中分子量透明质酸钠及低分子量透明质酸钠按照比例混合，待溶胀后，加热至42℃，搅拌均匀；然后分别加入丙二醇及甘油，再加入PE9010，最后加入无菌水，搅拌均匀，即得。
2.根据权利要求1所述包裹干细胞生长因子原液，其特征在于，所述包裹干细胞生长因子原液按照质量百分比计包括；高分子量透明质酸钠20％、中分子量透明质酸钠10％、低分子量透明质酸钠5％、丙二醇20％、甘油40％、PE9010 2％以及无菌水3％。
3.根据权利要求1或2所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉，其特征在于，用所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉中冻干粉原料与所述包裹干细胞生长因子原液的配料比为：每1g冻干粉原料对应1L所述包裹干细胞生长因子原液；
用所述包裹干细胞生长因子原液包裹冻干粉的方法包括以下步骤：将1g冻干粉原料加入到1L的所述包裹干细胞生长因子原液中，在常温下，缓慢搅拌20-40min，转速为1-2rad/s，即得。
4.根据权利要求3所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉，其特征在于，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉稀释液，所述冻干粉稀释液的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、丙二醇0.1-5％、PE 0.1-0.5％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1-1.7×108IU/mL。
5.根据权利要求3所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉，其特征在于，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉原液，所述冻干粉原液的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、透明质酸0.05-0.1％、丙二醇0.1-5％、PE 0.1-0.5％、甲酯0.05-0.3％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1-1.7×108IU/mL。
6.根据权利要求3所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉，其特征在于，所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉制成冻干粉半成品，所述冻干粉半成品的组成按照质量百分比计包括：所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉2％、透明质酸0.05-0.1％、甘油60-80％、丙二醇0.1-5％、PE 0.1-0.5％、甲酯0.05-0.3％以及其余为无菌水；所述包裹干细胞生长因子原液包裹的冻干粉的活性单位为1-1.7×108IU/mL。
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