ES2691928T3 - Composición cosmética que contiene extracto de fermento de halomonas, y uso del mismo - Google Patents

Composición cosmética que contiene extracto de fermento de halomonas, y uso del mismo Download PDF

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Núria Almiñana Domènech
Albert Soley Astals
Antonio Ferrer Montiel
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Abstract

Uso del extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalia para tratamiento cos-mético, no terapéutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o uñas.

Description

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DESCRIPCION
Composicion cosmetica que contiene extracto de fermento de halomonas, y uso del mismo Campo de la invencion
La tecnologfa divulgada se refiere a un extracto de fermento y a un exopolisacarido de origen bacteriano para el tratamiento del envejecimiento. Dicho producto es secretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. Igualmente, la presente invencion se refiere al uso de dicho extracto de fermento o exopolisacarido de origen bacteriano en composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas para el trataminto y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas.
Antecedentes de la invencion
La epidermis humana es un tejido cohesivo, multicapa, con una unica arquitectura funcional y ella forma la barrera primaria al medioambiente exterior. Los queratinocitos son el componente principal de la epidermis y su cohesion es esencial con el fin de asegurar la renovacion y diferenciacion celular. Las celulas epidermicas estan unidas entre sf mediante construcciones especiales denominadas “uniones”. Existen diferentes tipos de uniones, con diferentes papeles, tales como rigidez (uniones de anclaje), resistencia al agua (uniones estrechas) y comunicacion celular (uniones comunicantes). Las uniones comunicantes son agrupaciones de canales intercelulares que permiten el intercambio mediante difusion de iones (Ca2+, Mg2+) y pequenos metabolitos (glucosa), nutrientes, y moleculas de senalamiento (adenosina monofosfato dclica, cMAP, o guanosina monofosfato dclica, cGMP) de menos de 1 kDa entre celulas adyacentes. Este intercambio citoplasmico directo de metabolitos e iones se estima que coordina la homeostasis epidermica. La comunicacion intercelular mediada por union comunicante (GJIC) es importante en diferentes procesos fisiologicos incluyendo la diferenciacion celular, proliferacion y transmision electrica y, ademas, contribuye al senalamiento intracelular [Scott CA y otros, “Connexins in epidermal homeostasis and skin disease”, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1818, (n° 8), pags. 1952-61, (Agosto 2012)]. Este mecanismo esta estrictamente regula- do y puede producirse una GJIC anormal en diversos trastornos patologicos.
Los canales de uniones comunicantes consisten en protemas de membrana integrales denominadas conexinas (Cx). En base a similitudes de secuencias, las conexinas se han clasificado en 2 grupos filogeneticos, ay p, y se han nombrado de acuerdo con su masa molecular. La oligomerizacion de seis protemas conexinas forma un hemicanal, tambien denominado conexon. Este conexon puede formarse o bien a partir de un unico tipo de conexina (homome- rica) o a partir de mas de un tipo (heteromerica). Ademas, las uniones comunicantes pueden ser homotfpicas, cuan- do se ensamblan dos conexones identicos, o heterotfpicas, cuando se ensamblan dos conexones diferentes entre las celulas que interactuan. [Dbouk HA y otros, “Connexins: a myriad of functions extending beyond assembly of gap junction channels”, Cell Communication and Signaling, vol.7, pag 4, (2009)]. Debido al numero de combinaciones potenciales de las aproximadamente veinte conexinas disponibles, las uniones comunicantes compuestas de diferentes tipos de conexinas pueden tener diferentes propiedades, por ejemplo, diferente permeabilidad a moleculas e iones. Por ello, la expresion de multiples protemas conexinas en un tipo de celula es probable que confiera diferentes propiedades para la GJIC en la piel. Los queratinocitos expresan temporalmente y espacialmente tantas como 10 conexinas diferentes dependiendo de su grado de diferenciacion. No todas las conexinas forman hemicanales compatibles que permiten GJIC. La capacidad de las conexinas para formar hemicanales heteromericos parece estar restringida a miembros del mismo subgrupo filogenetico. La compatibilidad e incompatibilidad de conexinas incre- menta igualmente el espectro de comunicacion intercelular, puesto que permite la generacion de compartimentos de comunicacion separados para moleculas diferentes [Scott Ca y Kelsell DP. “Key functions for gap junctions in skin and hearing”, Biochem. J., vol. 438 (n° 2), pags. 245-54, (1 Sep., 2011)]. Los hemicanales son llevados a la superfi- cie de la celula mediante vesmulas transportadas a traves de micotubulos y, finalmente, los hemicanales se funden con la membrana plasmatica para formar uniones comunicantes [Mese G y otros, “Gap Junctions: Basic Structure and Function”, J. Investig. Dermatol., vol. 127, pags. 2516-2524, (2007)]. El nivel de GJIC de una celula podna regu- larse de manera dinamica a todos los niveles de smtesis, ensamblado y degradacion de conexinas, pero tambien parece que depende de la funcion de otras moleculas de adhesion de celulas, componentes de uniones estrechas y elementos citoesqueletales [Dbouk HA y otros, “Connexins: a myriad of functions extending beyond assembly of gap junction channels”, Cell Communication and Signaling”, vol.7, pag 4, (2009)].
La comunicacion Intercelular mediada por union comunicante (GJIC) es importante en diferentes procesos fisiologi- cos incluyendo la diferenciacion celular, proliferacion, transmision electrica e inflamacion [Scott CA y otros, “Connexins in epidermis homeostasis and skin disease”, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1818, (n° 8), pags. 1952-61, (Agosto 2012)]. La expresion de algunas conexinas, tal como Cx20 y cx30, esta sobre-regulada durante la respuesta inicial a la cicatrizacion de heridas, y la Cx26 esta sobre-regulada en las lesiones de psoriasis hiperproliferativa humana. Por ello, la sobre-regulacion de conexinas, y particularmente de Cx26 y/o Cx30, podna ser una estrategia para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de la piel y/o la cicatrizacion de heridas.
La disminucion en la comunicacion de celulas es uno de los mecanismos resultantes en el envejecimiento de la piel, es decir, la sub-regulacion de conexinas esta relacionada con alteraciones en las uniones comunicantes [Dumont S y otros, “Two new lipoaminoacids”, Int. J. Cosmet. Science, vol.32, pags. 9-27, (2020)]. Los signos de disminucion de la comunicacion celular se revelan sobre la superficie de la piel en forma de finas lmeas, arrugas, aspereza superfi
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cial, perdida de elasticidad, tono de piel desigual, perdida de firmeza, o sequedad. Este deterioro relacionado con la edad de la piel por la sub-regulacion de conexinas, se acelera de manera particular con la menopausia. Despues de la menopausia, muchas mujeres sufren un envejecimiento de la piel acelerado; la piel se vuelve mas fina con dismi- nucion del contenido en colageno, disminucion de elasticidad, incremento de arrugas e incremento de sequedad. En mujeres post-menopausicas, el espesor de la piel disminuye en un 1,3% por ano post-menopausico, con una disminucion asociada en el contenido de colageno (2% por ano post-menopausico). El contenido de colageno (tipos I y II) de la piel se estima que disminuye tanto como un 30% en los cinco primeros anos despues de la menopausia [Thornton MJ, “Estrogens and aging skin”, Dermatoendocrinol., vol. 5, (n° 2), pags. 264-70, (2013)]. El colageno es secretado principalmente por fibroblastos con otras protemas de matriz extracelular que proporcionan firmeza y elasticidad a la piel.
Por ello, un incremento en los niveles de protemas conexinas mejorana la comunicacion de las celulas y tratana y retardana los signos de envejecimiento de la piel tales como arrugas, pigmentacion irregular de la piel, perdida de elasticidad, colageno, firmeza de la piel, espesor y sequedad.
De manera sorprendente, el solicitante de la presente invencion ha encontrado un extracto de fermento y un exopolisacarido de origen bacteriano que es una alternativa a los problemas anteriormente mencionados.
Sumario de la invencion
La tecnologfa divulgada proporciona una solucion para el problema del envejecimiento de la piel, mediante el uso del extracto de fermento o exopolisacarido secretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina.
Descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere a un extracto de fermento o un exopolisacarido excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina, al extracto de fermento o al exopolisacarido para su uso en el tratamiento terapeutico de la piel y/o membranas mucosas, al uso del extracto de fermento o el exopolisacarido para el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas, y a composiciones cosmeticas o der- mofarmaceuticas que comprenden el extracto de fermento o exopolisacarido. De manera sorprendente, los invento- res de la presente invencion han encontrado que el extracto de fermento o exopolisacarido anteriormente mencionados tratan o previenen el envejecimiento de la piel. En una realizacion, el incremento en el nivel de conexinas trata o previene el envejecimiento de la piel.
Definiciones
Con el fin de facilitar la comprension de la presente invencion, se incluyen los significados de algunos terminos y expresiones tal como se usan en el contexto de la invencion.
Tal como se usa en la presente invencion, el termino transitorio “comprende”, el cual es sinonimo de “incluye”, “con- tiene” o “caracterizado por”, es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de procedimientos no citados, adicionales. No obstante, en cada mencion de “comprende” en la presente invencion, se da por entendido que el termino abarca igualmente, como realizaciones alternativas, las frases “consiste esencialmente en” y “consiste en”, en donde “consiste en” excluye todo elemento o etapa no especificada y “consiste esencialmente en” permite la inclusion de elementos o etapas no mencionadas adicionales que no afecten materialmente las caractensticas esen- ciales o basicas y nuevas de la composicion o procedimiento bajo consideracion.
En el contexto de la presente invencion, los terminos “producido”, “secretado” y excretado” se usan indistintamente.
En el contexto de la presente invencion, por “piel” se entiende las capas que la comprenden, desde la capa mas exterior o estrato corneo a la capa mas interior o hipodermis, ambas inclusives. Estas capas estan compuestas de diferentes tipos de celulas tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y/o adipocitos, entre otras. En el contexto de la presente invencion, el termino “piel” incluye el cuero cabelludo.
El termino “tratamiento”. tal como se usa en el contexto de la presente memoria descriptiva, cuando no esta acom- panado por las calificaciones “cosmetico, no terapeutico”, significa la administracion de un compuesto de acuerdo con la invencion para aliviar o eliminar una enfermedad o trastorno, o reducir o eliminar uno o mas smtomas asocia- dos con esta enfermedad o trastorno. El termino “tratamiento” cubre igualmente la capacidad para aliviar o eliminar las consecuencias fisiologicas de la enfermedad o trastorno.
Cuando el termino “tratamiento” esta acompanado por las calificaciones “cosmetico, no terapeutico”, se refiere a la aplicacion del compuesto a la piel, membranas mucosas, cabello y/ unas, tfpicamente con el objetivo de mejorar las calidades cosmeticas de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas tales como, sin limitarse a ellas, su nivel de hidratacion, elasticidad, firmeza, brillo, tono o textura, entre otras. El termino “cuidado” en la presente invencion se refiere al mantenimiento de las calidades de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas. Estas calidades estan sometidas a mejora y mantenimiento mediante un tratamiento cosmetico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas, tanto en sujetos sanos como en aquellos que presenten enfermedades y/o trastornos de la
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piel y/o membranas mucosas, asf como, sin limitarse a ellas, ulceras y lesiones de la piel, psoriasis, dermatitis, acne o rosacea, entre otras.
El termino “prevencion”, tal como se usa en la presente invencion, se refiere a la capacidad de un compuesto de la invencion para prevenir, retardar o impedir la aparicion o desarrollo de una enfermedad, trastorno, estado o cambio antes de su aparicion.
En el contexto de la presente invencion, el termino “envejecimiento” se refiere a los cambios experimentados por la piel con la edad (crono-envejecimiento) o a traves de la exposicion al sol (fotoenvejecimiento) o a agentes medioam- bientales tales como humo de tabaco, condiciones climaticas extremas de frio, calor o viento, contaminantes qmmi- cos o polucionantes, e incluye todos los cambios visibles y/o perceptibles externos al tocarla, tales como, y no res- tringidos a ellos, el desarrollo de discontinuidades sobre la piel tales como arrugas, lmeas finas, surcos, irregularida- des o rugosidad, incremento en el tamano de los poros, perdida de elasticidad, perdida de firmeza, perdida de sua- vidad, perdida de la capacidad para recuperar la deformacion, combamiento de la piel tal como combamiento de mejillas, la aparicion de bolsas bajo los ojos o la aparicion de un doble menton, entre otras, cambios en el color de la piel tales como manchas, enrojecimiento, bolsas bajo los ojos o la aparicion de areas hiperpigmentadas tales como manchas de la edad o pecas entre otras, diferenciacion anomala, jhiperqueratinizacion, elastosis, queratosis, piel de cascara de naranja, perdida de estructura del colageno y otros cambios histologicos del estrato corneo, hipo- dermis, dermis, epidermis, sistema vascular (por ejemplo, la aparicion de venas en forma de arana o telangiectasias) o de aquellos tejidos cercanos a la piel, entre otros. El termino de “fotoenvejecimiento” agrupa juntos el conjunto de procesos debidos a la exposicion prolongada de la piel a la radiacion ultravioleta, lo cual da como resultado el envejecimiento prematuro de la piel, y presentan las mismas caractensticas ffsicas que el envejecimiento, tales como, sin restringirse a ellas, flacidez, combamiento, cambios de color o irregularidades en la pigmentacion, anormal y/o exce- siva queratinizacion.
Por ello, un primer aspecto de la presente invencion se refiere al extracto de fermento excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina para su uso en el tratamiento terapeutico de la piel, membranas mucosas y/o unas. En una realizacion, el extracto de fermento tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el extracto de fermento contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un exopolisacarido excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina para su uso en el tratamiento terapeutico de la piel, membranas mucosas y/o unas. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa.
En una realizacion, el tratamiento terapeutico de la piel, membranas mucosas y/o unas se refiere a la re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, al tratamiento y/o prevencion de la inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o al tratamiento y/o prevencion o aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas. En una realizacion, el tratamiento terapeutico de la piel, membranas mucosas y/o unas se refiere a la re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, al tratamiento y/o prevencion de inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o al tratamiento y/o prevencion o aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, y el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos unexopolisacarido, o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa.
En una realizacion, la inflamacion de la piel y/o membranas mucosas esta seleccionada, por ejemplo, sin restringirse a ellas, entre el grupo formado por psoriasis, piel sensible, dermatitis, dermatitis atopica, dermatitis por contacto, dermatitis por panales, dermatitis seborreica, eczema, rosacea, acne, enfermedad hiperproliferativa de la piel, que- maduras, quemaduras del sol, paroniquia, inflamacion de la piel despues de cirugfa, despues de tratamiento con terapia de luz pulsada intensa (IPL), despues de tratamiento con terapia de luz pulsada monocromatica (laser), despues de tratamiento con agentes exfoliantes qmmicos o despues de sobre-exposicion a agentes externos agresivos, inflamacion de la membrana mucosa de la vagina, inflamacion de la membrana mucosa oral, gingivitis, periodontitis, rinitis, rinitis alergica, entre otras. En una realizacion, el incremento en el nivel de conexinas Cx26 y/ Cx30 trata y/o previene la inflamacion de la piel y/o membranas mucosas.
En una realizacion, los estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, estan seleccionados entre el grupo formado por xerosis, hiper- queratosis, hiperqueratosis reactiva, hiperqueratosis palmar y plantar, callos o callosos, queratosis actmica, queratosis no actmica,dermatitis atopica, eczema por contacto, dermatitis seborreica, gorros para bebes, acne, rosacea, nevo, ictiosis, psoriasis, paraqueratosis, pitiriasis, liquen plano, queratoderma palmoplantar, cuperosis, sequedad vaginal.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del extracto de fermento excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina para el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membrana mucosa, cabello y/o unas. En una realizacion, el extracto de fermento tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el extracto de fermento contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el extracto de fermen-
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to de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecualr de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membrana mucosa, cabello y/o unas es un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de enveje- cimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de la perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa, contiene al menos un exopolisacarido y el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas es un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de la perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del exopolisacarido excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina para el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membrana mucosa, cabello y/o unas es un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de la perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas es un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de la perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas.
En otra realizacion, el tratamiento terapeutico, el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel incre- menta los niveles de conexinas en la piel. De acuerdo con la presente invencion, el incremento en el nivel de cone- xinas en la piel se sobrentiende como el incremento en la cantidad de al menos una conexina en los queratinocitos de la piel. En una realizacion, la conexina es conexina 26, conexina 30, conexina 30.3, conexina 31, conexina 31.1, conexina 37, conexina 43, conexina 46 o conexina 58, tambien denominada como conexina 59. En una realizacion, el tratamiento terapeutico, el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel incrementa los niveles de conexinas en la piel y el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa, contiene al menos un exopolisacarido, o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa.
En otra realizacion, el tratamiento y/o cuidado de la piel se lleva a cabo mediante aplicacion topica o transdermica.
En otra realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571. Dicha cepa ha sido depositada el 10 de Octubre de 2014 en la Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM)/Laboratorium voor Microbiologie-Bacterieverzameling (LMG) (BCCM/LMG) (University Ghent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgica) como institucion legalmente reco- nocida para dicho fin, de acuerdo con el Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms el 28 de Abril de 1977.
En una realizacion, el exopolisacarido o el exopolisacarido contenido en el extracto de fermento excretado por la cepa bacteriana de la especie Halomonas eurihalina contiene los monosacaridos rhamnosa, galactosa, glucosa, mannosa y D-glucosamina. Opcionalmente, el exopolisacarido contiene tambien fucosa y/o acido glucuronico. Tfpi- camente, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571. En una realizacion, el exopolisacarido muestra una composicion en peso de 0,5% a 45% de rhamnosa, 0,1% a 25% de galactosa, 0,5% a 30% de mannosa, 50% a 95% para la suma de glucosa y D- glucosamina y 0% a 10% de fucosa y 0% a 12% de acido glucuronico, con la condicion de que la suma de los por- centajes no exceda de 100%. En otra realizacion, el exopolisacarido muestra una composicion en peso de 1% a 35% de rhamnosa, 0,5% a 20% de galactosa, 1% a 25% de mannosa, 55% a 90% para la suma de glucosa y D- glucosamina y 0% a 5% de fucosa y 0% a 6% de acido glucuronico, con la condicion de que la suma de los porcen- tajes no exceda de 100%. En otra realizacion, el exopolisacarido muestra una composicion en peso de 1,5% a 30% de rhamnosa, 1% a 10% de galactosa, 1,5% a 20% de mannosa, 65% a 85% para la suma de glucosa y D- glucosamina y 0% a 3% de fucosa y 0% a 4% de acido glucuronico, con la condicion de que la suma de los porcen- tajes no exceda de 100%. En una realizacion, la relacion de glucosa:D-glucosamina esta entre 90:1 y 1:35, entre 85:1 y 1:25, o entre 75:1 y 1:15.
En otra realizacion, el exopolisacarido excretado por la cepa bacteriana de la especie Halomonas eurihalina, tiene un tiempo de retencion entre 4 y 8,5 minutos, o entre 5 y 8 minutos, en un analisis cromatografico de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), con una columna cromatografica PLAQUAGEL-OH 8 pm AQUEUS SEC COLUMNS y acetato sodico 0,1 M en agua como eluyente. En una realizacion, el exopolisacarido de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa, y el exopolisacarido excretado tiene un tiempo de
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retencion entre 4 y 8,5 minutes, o entre 5 y 8 minutes, en un analisis cromatografico de cromatograffa Ifquida de alto rendimiento (HPLC), con una columna cromatografica PLAQUAGEL-OH 8 pm AQUEUS SEC COLUMNS y acetato sodico 0,1 M en agua como eluyente con un caudal de 0,8 ml/min. Tfpicamente, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571. La PLA- QUAGEL-OH 8 pm AQUEUS SEC COLUMNS es una columna para cromatogna acuosa de exclusion por tamanos, con un empaquetamiento que tiene la capacidad para separar compuestos dependiendo de sus pesos moleculares, aplicada a poifmeros solubles en agua, neutros, anionicos y cationicos y con un tamano de partteula de 8 pm, un tamano de poro de 50 Ay una longitud/diametro interno de 300 mm x 7,5 mm.
En otra realizacion, el extracto del fermento se obtiene mediante la fermentacion de una cepa de la especie Halomonas eurihalina en un medio de cultivo adecuado, convencionalmente agitado y aireado para la smtesis y secrecion de dicho producto al medio de cultivo, seguido del aislamiento y purificacion. La fermentacion puede llevarse a cabo en un medio agitado y aireado a una temperatura entre 15°C y 40°C, tfpicamente a 32°C, conteniendo el medio un pH de entre 5,5 y 9, tfpicamente alrededor de 7,0, ajustandolo, si es necesario, durante la fermentacion. La duracion de la fermentacion es de entre 12 a 120 horas; en una realizacion entre 24 y 72 horas; en otra realizacion entre 30 y 48 horas. Tfpicamente, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571.
En una realizacion, el procedimiento de aislamiento y purificacion del extracto de fermento se lleva a cabo mediante los procedimientos conocidos por la persona experta en la tecnica tales como centrifugacion, filtracion, ultrafiltracion y y dialisis. En una primera etapa, las etapas de centrifugacion y filtracion estan dirigidas a separar la cepa de la especie Halomonas eurihalina del sobrenadante en el cual se encuentra el extracto de fermento. En una realizacion, la ultrafiltracion y dialisis del sobrenadante se llevan a cabo con una membrana de polietersulfona, la cual retiene moleculas de un peso molecular mayor de 10.000 Da y se obtiene el extracto de fermento con un peso molecular de al menos 10 kDa. En otra realizacion, el exopolisacarido se purifica a partir del sobrenadante por precipitacion mediante adicion de etanol, acetona o isopropanol. En otra realizacion, la ultrafiltracion y dialisis del sobrenadante se lleva a cabo con una membrana de polietersufona que retiene moleculas de un peso molecular mayor de 10.000 Da y la precipitacion se lleva cabo mediante la adicion de etanol, acetona o isopropanol para obtener el exopolisacarido con un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571.
En otra realizacion, en la fermentacion de la cepa de la especie Halomonas eurihalina, puede usarse un medio de cultivo que contiene azucares exogenos, tales como, y sin limitarse a ellos, galactosa, glucosa, mannosa, amigdali- na, celobiosa, maltosa, almidon, glucogeno, lactosa, mezclas de los mismos y/o extractos conteniendo mezclas de estos azucares como una fuente de carbono. En una realizacion, se proporiona una administracion exogena de glucosa de 2 a 40 g/l, o desde 5 hasta 25 g/l.
En otra realizacion, el medio de cultivo puede comprender fuentes de nitrogeno o carbono adicionales tales como extractos de levaduras, extractos de malta o peptonas, con concentraciones de cada uno de estos componentes de 0,1 a 20 g/l, o desde 0,5 a 10 g/l.
En otra realizacion, se proporcionan igualmente sales minerales para el cultivo de fermentacion de la cepa de la especie Halomonas eurihalina, y estas estan seleccionadas entre sales que proporcionan los iones Na+, K+, NH4+, Ca2+, Mg2+, PO43', SO42', Cl', CO32', o elementos traza tales como Cu, Mn, Fe y Zn.
En otra realizacion, el exopolisacarido comprendido en el extracto de fermento producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina, contiene una sulfatacion natural, sin mediar ninguna modificacion qmmica, de hasta 7% de sulfatos, o de hasta 5% de sulfatos.
En otra realizacion, el exopolisacarido comprendido en el extracto de fermento producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina, contiene una modificacion qmmica conocida por persona experta en la tecnica tal como fosfo- rilacion, sulfonacion, acilacion con, por ejemplo grupos acetilo, piruvoilo, propionilo, succinilo, lactoilo o 3- hidroxibutilo, esterificacion, por ejemplo, con glicerilo, formacion de complejos metalicos del exopolisacarido y/o sulfatacion qmmica mayor del 7%.
Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion cosmetica o dermofarmaceutica caracterizada porque comprende una cantidad cosmeticamente o dermofarmaceuticamente eficaz del extracto de fermento del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina y al menos un excipiente y/o ingrediente cosmeticamente o dermofarmaceuticamente aceptable. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido, o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. Tfpicamente, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571. Dichas composiciones pueden prepararse mediante los procedimientos convencionasles conocidos por la persona experta en la tecnica [“Harry's Cosmetology”, Seventh edition, (1982), Wikilson J.B., Moore R.J., ed. Longman House, Essex, GB].
La cantidad cosmeticamente y dermofarmaceuticamente eficaz del extracto de fermento del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina en la composicion de la invencion a administrar, asf como su
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dosificacion, dependera de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la naturaleza o severidad del estado, trastorno o enfermedad a tratar y/o cuidar, la via y la frecuencia de administracion del extracto de fer- mento o del exopolisacarido.
Por “cantidad cosmeticamente y dermofarmaceuticamente eficaz”, se entiende que es una cantidad no toxica pero suficiente del extracto de fermento o exopolisacarido, como para proporcionar el efeto deseado. En una realizacion, el extracto de fermento o el exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina se usa a concentraciones cosmeticas o dermofarmaceuticas para lograr el efecto deseado; en una realizacion, con respecto al peso total de la composicion, entre 0,0000000001% (en peso) y 20% (en peso), entre 0,00000001% (en peso) y 10% (en peso), entre 0,000001% (en peso) y 5% (en peso) o entre 0,0001% (en peso) y 5% en peso).
En otra realizacion, el extracto de fermento o el exopolisacarido de la invencion puede igualmente incorporarse en sistemas de administracion cosmetica y/o dermofarmaceutia y/o sistemas de liberacion sostenida. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido, o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa.
El termino “sistemas de administracion” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, vehnculo o aditivo con el cual se administra el extracto de fermento o el exopolisacarido de la invencion. Estos vehnculos cosmeticos o dermo- farmaceuticos pueden ser lfquidos, tal como agua, aceites o tensioactivos, incluyendo los de origen del petroleo, animal, plantas o sinteticos, tales como, y sin restringirse a ellos, aceite de cacahuete, aceite se soja, aceite mineral, aceite de sesamo, aceite de ricino, polisorbatos, esteres de sorbitano, eter sulfatos, sulfatos, betamas, glucosidos, maltosidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxameros, polioxietilenos, polietileno glicoles, dextrosa, glicerol, digi- tonina y similares. Una persona experta en la tecnica conoce los diluyentes, adyuvantes o excipientes que pueden usarse en los diferentes sistemas de administracion, en los cuales el extracto de fermento o el exopolisacarido de la invencion puede ser administrado.
El termino “liberacion sostenida” se usa en un sentido convencional con relacion a un sistema de administracion de un compuesto que proporciona la liberacion gradual de este compuesto durante un periodo de tiempo y, en una realizacion, aunque no necesariamente, con niveles de liberacion de compuesto relativamente constantes a lo largo de un periodo de tiempo.
Los ejemplos de sistemas de administracion o de liberacion sostenida incluyen, sin un sentido de limitacion, liposo- mas, liposomas mezclados, oleosomas, niosomas, etosomas, milipartfculas, micropartfculas, nanopartfculas y nano- partfculas de lfpidos solidas, soportes de lfpidos nanoestructurados, esponjas, ciclodextrinas, vesfculas, micelas, micelas mezcladas de tensioactivos, micelas mezcladas de tensioactivos-fosfolfpidos, miliesferas, microesferas y nanoesferas, lipoesferas, milicapsulas, microcapsulas y nanocapsulas, asf como microemulsiones y nanoemulsio- nes, las cuales pueden agregarse para lograr una mayor penetracion del extracto de fermento y/o para mejorar las propiedades farmacocineticas y farmacodinamicas del mismo. En una realizacion, los sistemas de administracion o de liberacion sostenida son liposomas, micelas mezcladas de tensioactivo-fosfolfpido y microemulsiones, y microemulsiones de agua en aceite, con una una estructura de micela inversa interna y nanopartfculas conteniendo mi- croemulsiones.
Los sistemas de liberacion sostenida pueden prepararse mediante procedimientos conocidos en la tecnica anterior, y las composiciones que los contienen pueden administrarse, por ejemplo, mediante administracion topica o transder- mica, incluyendo parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos y parches microelectricos, o mediante administracion sistemica, por ejemplo y no restringido a los mismos, via oral o parenteral, incluyendo nasal, rectal o implantacion subcutanea o inyeccion, o implantacion directa o inyeccion dentro de una parte espedfica del cuerpo. En una realizacion, el sistema de liberacion sostenida debe liberar una cantidad relativamente constante del extracto de fermento o del exopolisacarido de la invencion. La cantidad de extracto de fermento o de exopolisacarido conte- nido en el sistema de liberacion sostenida dependera, por ejemplo, de en donde ha de administrarse la composicion, las cineticas y duracion de la liberacion del extracto de fermento o exopolisacarido de la invencion, asf como la naturaleza del estado, trastorno y/o enfermedad a tratar y/o prevenir.
La composicion que contiene el extracto de fermento o el exopolisacarido de la presente invencion, puede igualmente ser adsorbida sobre polfmeros organicos solidos o soportes minerales solidos, tales como y sin restringirse a ellos, talco, bentonita, sflice, almidon o maltodextrina, entre otros.
Las composiciones que contienen el extracto de fermento o el exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina pueden igualmente incorporarse en telas, telas no tejidas o dispositivos medicos que estan en contacto directo con la piel, liberando, de esta forma, el extracto de fermento o el exopolisacarido de la invencion, bien sea por la biodegradacion del sistema de union a la tela, tela no tejida o dispositivo medico, o debido a la fric- cion entre ellos y el cuerpo, debido a la humedad corporal, al pH de la piel o a la temperatura del cuerpo. Ademas, el extracto de fermento o exopolisacarido de la invencion puede incorporarse las telas y telas no tejidas usadas en la fabricacion de ropas de vestir que estan en contacto directo con el cuerpo. En una realizacion, las telas, telas no tejidas y dispositivos medicos que contienen el extracto de fermento o el exopolisacarido de la invencion se usan para el tratamieto y/o la prevencion de estados, trastornos y/o enfermedades que mejoran o se han prevenido mediante el incremento de los niveles de conexinas en la piel.
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Los ejemplos de telas, telas no tejidas, ropas de vestir, dispositivos medicos y medios para la inmovilizacion de compuestos a las mismas, entre los cuales estan los sistemas de administracion y/o los sistemas de liberacion sos- tenida descritos anteriormente, pueden encontrarse en la literatura y son conocidos en la tecnica anterior [Schaab C.K., HAPPI May 1986; Nelson G., “Application of micoencapsulation in textiles”, Int. J. Pharm., vol. 242, (n° 1-2), pags. 55-62, (2002); “Biofunctional Textiles and the Skin”, Curr. Probl. Dermatol., vol. 33, (2006), Hipler U.C. and ElsnerP, eds., S. Karger AG, Basel, Switzerland; Malcolm R.K. y otros, “Controlled release of a model antibacterial drug from a novel self-lubricating silicone biomaterial”, J. Cont. Release, vol. 97, (n°. 2), pags. 313-320, (2004)]. En una realizacion, las telas, telas no tejidas, ropas de vestir y dispositivos medicos son vendas, gasas, camisetas, calcetines, mallas, ropa interior, cinturones, guantes, panales, compresas sanitarias, apositos, cubrecamas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microelectricos y/o mascarillas.
Las composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas que contienen el extracto de fermento o el exopolisacarido de la presente invencion pueden usarse en diferentes tipos de composiciones de aplicacion topica o transdermica, in- cluyendo opcionalmente excipientes cosmeticamente y/o dermofarmaceuticamente aceptables necesarios para formular la forma de administracion deseada.
Las composiciones de aplicacion topica o transdermica puede producirse en cualquier formulacion solida, lfquida o semisolida, tal como y no restringidas a ellas, cremas, emulsiones multiples tales como y no restringidas a ellas, aceite y/o silicona en emulsiones de agua, emulsiones de agua en aceite y/o silicona, emulsiones del tipo agua/aceite/agua o agua/silicona/agua, y emulsiones del tipo aceite/agua/aceite o silicona/agua/silicona, cristales lfquidos, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, balsamos, espumas, lociones, geles, geles de cremas, soluciones hidroalcoholicas, soluciones hidroglicolicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, cham- pus, acondicionadores, sueros, pelmulas de polisacaridos, unguentos, cremas batidas, pomadas, polvos, barras, lapices y esprais o aerosoles (esprais), incluyendo formulaciones de aplicacion y de limpieza. Estas formulaciones de aplicacion topicas y transdermicas pueden incorporarse usando tecnicas conocidas para la persona experta en la tecnica dentro de diferentes tipos de accesorios solidos, tales como y no restringidos a ellos, vendas, gasas, camise- tas, calcetines, mallas, ropa interior, cinturones, guantes, panales, compresas sanitarias, apositos, cubrecamas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microelectricos o mascarillas, o pueden incorporarse dentro de diferentes productos de maquillaje, tales como base de maquillaje, tales como bases fluidas y bases compactas, lociones para eliminar maquillajes, leches para eliminar maquillajes, correctores de oje- ras, sombras de ojos, lapiz de labios, protectores labiales, brillo de labios y polvos, entre otros.
Las composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas de la invencion pueden incluir agentes que incrementen la absorcion percutanea de los compuestos de la presente invencion, por ejemplo y no restringidos a ellos, dimetil sulfoxido, dimetilacetamida, dimetilformamida, tensioactivos, azona (l-dodecilazaciclohepta-2-ona), alcohol, urea, etoxidiglicol, acetona, propileno glicol o polietileno glicol, entre otros. Ademas, las composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas de la presente invencion pueden aplicarse a areas locales a ser tratadas mediante iontoforesis, sonoforesis, electroporacion, parches microelectricos, presion mecanica, gradiente de presion osmotica, cura oclusi- va, microinyecciones o inyecciones sin aguja mediante presion, tal como inyecciones mediante presion de oxfgeno, o cualquier combinacion de los mismos, para lograr una mayor penetracion del extracto de fermento o el exopolisa- carido de la invencion. El area de aplicacion estara determinada por la naturaleza del estado, trastorno y/o enferme- dad a tratar y/o prevenir.
Entre los excipientes y/o ingredientes cosmeticamente o dermofarmaceuticamente aceptables contenidos en las composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas descritas en la presente invencion, se encuentran ingredientes adicionales comunmente usados en composiciones cosmeticas o dermofarmaceuticas, tales como y no restringidos a ellos, agentes que inhiben la exocitosis neuronal, agentes anticolinergicos, agentes que inhiben la contraccion muscular, agentes anti-envejecimiento, agentes anti-arrugas, humectantes, substancias que retienen la humedad, alfa hidroxi acidos, beta hidroxi acidos, humectantes, agentes estimuladores de la smtesis de macromoleculas der- micas o epidermicas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradacion, agentes estimuladores de la smtesis de cola- geno, agentes estimuladores de la smtesis de elastina, agentes estimuladores de la smtesis de decorina, agentes estimuladores de la smtesis de laminina, agentes estimuladores de la smtesis de defensina, agentes estimuladores de la smtesis de chaperona, agentes estimuladores de la smtesis de cAMP, agentes que modulan la AQP-3, agentes que modulan la smtesis de aquaporina, protemas procedentes de la familia de la aquaporina, agentes estimuladores de la smtesis de acido hialuronico, agentes estimuladores de la smtesis de glucosaminoglucano, agentes estimuladores de la smtesis de fibronectina, agentes estimuladores de la smtesis de sirtuina, protemas de choque termico, agentes estimuladores de la smtesis de protemas de choque termico, agentes que reducen la cantidad de nocturni- na, agentes inhibidores de la expresion de nocturnina, agentes lipolfticos o agentes estimuladores de la lipolisis, agentes venotonicos, agentes moduladores de la expresion de PGC-1a, agentes inhibidores de la actividad de PPARy, agentes que reducen el contenido en triglicerido de adipocitos, agentes anti-celulitis, agentes retardadores de la diferenciacion de lipocitos, agentes que disminuyen la produccion de sebo, agentes anti-seborreicos, agentes matificantes, agentes anti-acne, agentes anti-transpirantes, agentes anti-inflamatorios y/o analgesicos, agentes anti- escozores, agentes calmantes, agentes anestesicos, inhibidores de la agregacion de receptores de acetilcolina, agentes que inhiben la acetilcolinesterasa, agentes relajantes de la piel, agentes estimuladores o inhibidores de la smtesis de melanina, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes auto-bronceado, agentes inhibidores de la NO-sintasa, agentes inhibidores de la 5a-reductasa, agentes inhibidores de la lisil- y/o propil-hidroxilasa, antioxidantes, purificadores de radicales libres y/o agentes contra la polucion atmosferica, purifi-
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cadores de especies carbonilo reactivas, agentes anti-glucacion, agentes antihistamina, agentes antivmcos, agentes antiparasitarios, emulsificadores, emolientes, disolventes organicos, propulsores Kquidos, acondicionadores de la piel, enzimas hidrolfticas epidermicas, vitaminas, aminoacidos, protemas, pigmentos o colorantes, tintes, biopolfme- ros, poKmeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, agentes suavizantes, emulsificadores, agentes aglomerantes, conservantes, agentes capaces de reducir o tratar las bolsas de debajo de los ojos, agentes exfoliantes, agentes queratolfticos, agentes desescamantes, agentes antimicrobianos, agentes antihongos, agentes fungistaticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostaticos, agentes estimuladores de la smtesdis de componentes del estrato corneo, ceramidas, acidos grasos, agentes que inhiben la degradacion del colageno, agentes que inhiben las metaloprotei- nas de la matriz, agentes que inhiben la degradacion de elastina, agentes que inhiben serina proteasas tales como calicremas, leucocito elastasa o catepsina G, agentes estimuladores de la proliferacion de fibroblastos, agentes estimuladores de la proliferacion de queratinocitos, agentes estimuladores de la proliferacion de melanocitos, agentes estimuladores de la diferenciacion de queratinocitos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedolfticos, agentes anti-psoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, agentes protectores de celulas ma- dre, estabilizadores, agentes para el tratamiento y/o cuidado de piel sensible, agentes reafirmantes, agentes anti- marcas de estiramientos, agentes astringentes, agentes que inhiben la actividad de PAR-2, agentes estimuladores de la cicatrizacion de heridas, agentes coadyuvantes de la cicatrizacion de heridas, agentes estimuladores de la re- epitelizacion, agentes coadyuvantes de la re-epitelizacion, factores de crecimiento de citocina, agentes que actuan sobre la circulacion y/o microcirculacion de la capilaridad, agentes estimuladores de la angiogenesis, agentes que inhiben la permeabilidad vascular, agentes que actuan sobre el metabolismo de la celula, agentes para mejorar la union dermica-epidermica, agentes inductores del crecimiento del cabello, agentes inhibidores o retardantes del crecimiento del cabello, agentes retardantes de la cafda del cabello, conservantes, perfumes, productos cosmeticos y/o absorbentes y/o desodorantes enmascaradores de olores corporales, agentes quelantes, extractos de plantas, aceites esenciales, extractos marinos, agentes obtenidos a partir de procesos biotecnologicos, sales minerales, extractos de celulas, cremas solares y agentes fotoprotectores organicos o minerales activos contra los rayos ultra- violeta A y/o B y/o rayos infrarrojos A, o mezclas de los mismos, a condicion de que sean ffsicamente y qmmicamen- te compatibles con el resto de los componentes en la composicion y con el extracto de fermento o exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. En una realizacion, el extracto de fermento de la espe- cie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido. Igualmente, la naturaleza de estos ingredientes adicionales no debena de alterar de manera inaceptable los benefi- cios del extracto de fermento o exopolisacarido de la presente invencion. La naturaleza de estos ingredientes adicionales puede ser sintetica o natural, tales como extractos de plantas, o provenir de procesos biotecnologicos, o de una combinacion de un proceso de smtesis y un proceso biotecnologico. Pueden encontrarse ejemplos adicionales en el CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary & Handbook, 12 th Edition (2008). En el contexto de la presente invencion, por proceso biotecnologico se entiende cualquier proceso para producir el ingrediente activo, o parte del mismo, en un organismo, o en parte de el.
En una realizacion, la composicion cosmetica y/o dermofarmaceutica de la invencion contiene:
. entre 0,0000000001% (en peso) y 20% (en peso) del extracto de fermento o del exopolisacarido excretado por una cepa de la especie Halomonas eurihalina;
. entre 0,1% (en peso) y 20% (en peso) de un humectante seleccionado entre el grupo de (Nombres INCI) Glicerina, Propileno glicol, Butileno glicol, Pentileno glicol, Caprilil glicol, Acido lactico, Urea, Hialuronato sodico;
. entre 0,1% (en peso) y 20% (en peso) de un emoliente o acondicionador de la piel seleccionado entre el grupo de (Nombres INCI) Dimeticona, Estearato de glicerilo, Triglicerido capnlico/caprico, Alcohol ceteanlico, Lecitina, Ben- zoato de alquilo de C12-15, Escualano, Lanolina, Alcohol behemlico, Acetato de tocoferilo, Panthenol, Manteca de Butirosperma Parkii, Palmitato de retinol, Retinol;
. entre 0,1% (en peso) y 20% (en peso) de un tensioactivo seleccionado entre el grupo de (Nombres INCI) Goma xantano, Laureth sulfato sodico, Acido estearico, Polisorbato 20, Polisorbao 80, Alcohol esteanlico, Alcohol cetilico, Steareth-2, Stearth-20, Cocoamidopropil betama.
En una realizacion, el agente anti-arrugas y/o anti-envejecimiento esta seleccionado, por ejemplo y no restringido a ellos, entre el grupo formado por los extractos o extractos hidrolizados de Vitis vin^fera, Rosa canina, Curcuma longa, Theobroma cacao,Ginkgo biloba, Leontopodium alpinum o Dunaliella salina entre otros Matrixyl® [INCI: Palmitoil pentapepdido-4], Matrixyl® 3000® [INCI: Palmitoil tetrapepdido-7, Palmitoil oligopeptido], Matrixyl® Synthe'6TM [INCI: Glicerina, Agua, Hidroxipropil ciclodextrina, Palmitoil tripeptido-38], Essenskin™ [INCI: Hidroximetionina calcica], Renovage [INCI: Teprenona, Resistem™ [INCI: Fermento de Globularia cordifolia], Beautifeye [INCI: Extracto de corteza de Albizia Julibrissin, Darutosida], Meiritage [INCI: Extracto de rafz de Astragalus membranaceus, extracto de rafz de Atractiloides macrocephala, extracto de rafz de Bupleurum Falcatum], Senestem [INCI: Extracto de hoja de Plantago lanceolata], Venuceane [INCI: Fermento de Thermus thermophillus] o Dermaxyl® [INCI: Palmitoil oligo- peptido] comercializado por Sederma/Croda, Vialox® [INCI: Pentapeptido-3], Syn®-Ake® [INCI: Dipeptido dia- minobutirol bencilamida diacetato], Syn®-Coll [INCI: Palmitoil Tripeptido-5], Phytaluronate [INCI: Goma de la falsa acacia (Ceratonia siliqua)], Regu-Scence [INCI: Extracto de tallo de Asparagus officinalis, benzoato sodico, sorbato potasico, gluconolactona, gluconato calcico], Syn-TC [INCI: Tetradecil aminobutiroilvalilaminobutmco urea trifluo- roacetato, Palmitoil tripeptido-5, Palmitoil dipeptido-5 diaminobutiroil hidroxitreonina] o Preregen® [INCI: protema de
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Glycine soja (soja), oxido reductasas] comercializado por Pentapharm/DSM, Myoxinol™ [INCI: extracto hidrolizado de Hibiscus esculentus], Syniorage™ [INCI: Acetil tetrapeptido-11], Demican™ [INCI: Acetil tetrapeptido-9], Sha- downyl [INC": extracto de alga, hexileno glicol, caprilil glicol, goma xantano] o DN AGETM LS [INCI: extracto de hoja de Cassia alata] comercializado por Laboratories Serobiologiques/Cognis/BASF, Algisum C® [INCI: metilsilanol mannuronato], Exage [INCI: imidazoliletil diaminopropanamida] o Hydroxyprosilane CN® [INCI: metilsilanol hidroxi- prolina aspartato] comercializada por Exymol, Argireline® [INCI: Acetil hexapeptido-8], SNAP-7 [INCI: Acetil hepta- peptido-4], SNAP-8 [INCI: Acetil octapeptido-3], Serilesine® [INCI: heptapeptido-10], Leuphasyl® [INCI: Pentapepti- do-18], Inyline® [INCI: Acetil hepapeptido-30], Aldenine® [INCI: Protema de trigo hidrolizada, Protema de soja hidro- lizada, Tripeptido-1], Preventhelia® [INCI: Diaminopropionoil tripeptido-33], Decorinyl® [INCI: Tripeptido-10 citrulina], Decorinol® [INCI: Tripeptido-9 citrulina], Trylagen® [INCI: Extracto de fermento de pseudomonas, Protema de trigo hidrolizada, Protema de soja hidrolizada, Tripeptido-10 citrulina, Tripeptido-1], Eyeseryl® [INCI: Acetil Tetrapeptido- 5], Peptide AC29 [INCI: Acetil Tetrapeptido-30 citrulina], Resiltase® [INCI: Acetilarginiltriptofil difenililglicina], Ther- mostressine® [INCI: Acetil tetrapeptido-22], LipochromanTM [INCI: Dimetilmetoxi cromanol], Chromabright® [INCI: Dimetilmetoxi cromanil palmitato], Antarcticine® [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas], dGlyage™ [INCI: Lisina HCl, Lecitina, Tripeptido-9 citrulina], Vilastene™ [INCI: Lisina HCl, Lecitina, Tripeptido-10 citrulina], Hya- disineTM [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas], HyanifyTM [INCI: Sacarido isomerato], Diffuporine™ [INCI: Acetil hexapeptido-33], SilusyneTM [INCI: Aceite de soja (Glycine soja), Sorbitano sesquiolato, Isohexadecano, Hialuronato sodico, Protema de soja laurildiamonio hidroxipropil hidrolizada, Acetil hexapeptido-39], Adifyline™ INCI: Acetil hexapeptido-38], UpleviteTM [INCI: Acetil tetrapeptido-21], JuvelevenTM [INCI: Acetil hexaheptido amida], SeacodeTM [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas], Nocturshape™ [INCI: Extracto de placton], Ac- tigymTM [INCI: Extracto de plancton], o Telangyn™ [INCI: Acetil tetrapeptido-40] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Kollaren® [INCI: Tetrapeptido-1, Dextrano], comercializado por el Institut Europeen de Biologie Cellulaire, Collaxyl® IS [INCI: Heptapeptido-9], Laminixyl ISTM [INCI: Heptapeptido], OrsitineTM GL [INCI: Extracto de Oryza sativa (arroz)], D'Orientine™ IS [INCI: Extracto de semilla de Phoenix dactylifera (datil)], Phytoquintescine™ [INCI: Extracto de es- canda (Triticum monococcum)], Peptide Q10 [INCI: Pentapeptido-34 trifluoroacetato], Telosense [INCI: Protema de levadura hidrolizada, Protema de soja hidrolizada] o Quintescine™ IS [INCI: Dipeptido-4] comercializado por Vin- cience/ISP/Ashland, BONT-L-Peptide [INCI: Palmitoil hexapeptido-19] comercializado por Infinitec Activos, Deepali- neTM PVB [INCI: Protema de trigo palmitoil hidrolizada] o Sepilift® DPHP [INCI: Dipalmitoil hidroxiprolina] comercializada por Seppic, Gatuline® Expression [INCI: Extracto de Acmelia oleracea], Gatuline® In-Tense [INCI: Extracto de flor de Spilanthes acmelia] o Gatuline® Age Defense 2 [INCI: Extracto de semilla de Juglans regla (nuez)] comercializada por Gattefose, Thalassine™ [INCI: Extracto de algas] comercializada por Biotechmarine, ChronNOline™ [INCI: Caprooil tetrapeptido-3] o Thymulen-4TM [INCI: Acetil tetrapeptido-2] comercializado por Atrium/Unipex Innovations, EquiStat [INCI: Extracto del fruto de Pyrus malus, extracto de semilla de Glycine soja] o Juvenesce [INCI: Etoxidigli- col y triglicerido capnlico, Retinol, Acido ursomlico, Fitonadiona, Ilomastat] comercializado por Coletica/Engel- hard/BASF, Ameliox [INCI: Carmosina, Tocoferol, Extracto del fruto de Sylibum marianum], Phytocelltec Symphytum [INCI: Isomalta, Cultivo de celulas de la rafz de Symphitum Officinale, Lecitina, Benzoato sodico], Snow Algae Powder [INCI: Extracto de Clamydocapsa, Maltodextrina, Lecitina], Dermcon [INCI: Goma de Acacia Senegal, Extracto de bulbo de Crocus Chrysanthus], Anagain [INCI: Extracto de vastago de Pisum Sativum (Guisante)] o Phyto- CellTec Malus Domestica [INCI: Cultivo de celulas del fruto de Malus domestica] comercializado por Mibelle Biochemistry, Bioxilift [INCI: Extracto de Pimpinella anisum*, Vitagenyl [INCI: Extracto de hoja del Prunus Persica (Meloco- ton)] o SMS Anti-Winkles® [INCI: Extracto de semilla de Annona squamosa] comercializada por Silab, Symvital Age- repair [INCI: Extracto de rafz de Zingiber officinale (Jengibre)] comercializado por Symrise, Citrustem [INCI: Goma xantano, Benzoato sodico, Gluconolactona, Gluconato sodico], Melavoid [INCI: Extracto de rafz de Boerhavia Diffusa], Darkout [INCI: Extracto de rizoma de Hypoxis Rooperi, Goma de Caesalpinia Spinosa] o Linefill [INCI: Dimetil isosorbida, Extracto de semilla de Sesamum Indicum (Sesamo)] comercializada por Provital, Adipofill'in [INCI: Orniti- na, Fosfolfpidos, Glucolfpidos], Elix-IR [INCI: Extracto de Polygonum Aviculare] o Progeline [INCI: Trifluoroacetil Tripeptido-2] comercializado por Lucas Meyer, Amiperfect [INCI: Extracto de hoja de Gaultheria Procumbens (Gaul- teria)] o Repulpami ER [INCI: Extracto de pulpa de Adansonia Digitata. Extracto de flor de Hibiscus Sabdariffa] comercializada por Alban Muller, Celloxyl [INCI: Extracto de hojas de Uapaca Bojeri] o Resistress [INCI: Extracto de flores de Sophora Japonica] comercializada por Solabia, Actiporine 8G [INCI: Extracto de Jania Rubens] o EPS Se- afill [INCI: Extracto de plancton] comercializada por Cofif, Novhial Biotech G [INCI: Fosfato de diacetil glucosamina] o Rubixyl [INCI: Heptapeptifdo-47] comercializado por Induchem, antagonistas del canal de Ca2+ tales como y no res- tringido a ellos, alverina, sales de manganeso o magnesio, ciertas aminas secundarias o terciarias, retinol y sus derivados, idebenona y sus derivados, coenzima Q10 y sus derivados, acido boswellico y sus derivados, GHK y sus derivados y/o sales, carnosina y sus derivados, enzimas reparadoras del ADN tales como y no restringido a ellas, fotoliasa o T4 endonucleasa V, o agonistas del canal de cloruro entre otros, y/o mezclas de los mismos.
En otra realizacion, el agente reafirmante y/o redensificante y/o reestructurante esta seleccionado, por ejemplo, y no restringido a ellos, entre el grupo formado por extractos de Malpighia punicitolia, Cynara scolymus, Gossipium her- baceum, Aloe Bardadensis, Panicum miliaceum, Morus nigra, Sesamum indicum, Glycine soja, Triticum vulgare, Pronalen® Refirming HSC [INCI: Triticum vulgare, Silybum marianum, Glycine soja, Equisetum arvense, Alchemilla vulgaris, Medicago sativa, Raphanus sativus], Lipoout [INCI: Extracto de plancton] o Polyplant® Refirming [INCI: Equinacea, Centella asiatica, Fuco, Heno griego] comercializado por Provital, Lanablue® [INCI: Sprbitol, Extracto de algas] comercializado por Atrium Biotechnologies/Unipex Innovations, Pepha®-Nutrix [INCI: Factor de nutricion natural] comercializado por Pentapharm/DSM, extractos de plantas conteniendo isoflavonas, Biopeptide ELTM [INCI: Palmitoil oligopeptido]. Biopeptide CLTM [INCI: Palmitoil oligopeptido]. Vexel® [INCI: Agua (Aqua), Propileno glicol,
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Lecitina, Cafema, Palmitoil carnitina], Matrixyl® [INCI: Palmitoil pentapeptido-3], Matrixyl® 3000 [INCI: Palmitoil te- trapeptido-3],, Palmitoil oligopeptido] o BioBustilTM [INCI: Gliceril polimetacrilato, Fermento de protema de soja Rah- nella, Agua (aqua), Propileno glicol, Glicerina, PEG-8, Palmitoil oligopeptido], comercializado por Sederma/Croda, Dermosaccharides® HC [INCI: Glicerina, Agua (Aqua), Glucosaminoglucanos, Glucogeno], Aglycal® [INCI: Mannitol, Ciclodextrina, Glucogeno, Extracto de hoja de Aratostaphylos Uva Ursi], Cytokinol® LS [INCI: Casema hidrolizada, Protema de levadura hidrolizada, Lisina HCl] o Firmiderm® LS9120 [INCI: Extracto de hoja de Terminalia Catappa, Extracto de flores de Sambucus Negra, PVP, Acido tanico] comercializado por Laboratories Serobiologi- ques/Cognis/BASF, Liftline® [INCI: Protema de trigo hidrolizada], Raffermine® [INCI: Harina de soja hidrolizada] o Ridulisse C® [INCI: Protema de soja hidrolizada] comercializada por Silab, Serilesine® [INCI: Hexapeptido-10], De- corinyl™ [INCI: Tripeptido-10 citrulina], Trylagen® [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas, protema de trigo hidrolizada, Protema de soja hidrolizada, Tripeptido-10 citrulina, Tripeptido-1], Silusyne™ [INCI: Aceite soja (Glycine soja), Sesquioleato de sorbitano, Isohexadecno, Hialuronato sodico, Protema de soja laurildiamonio hidroxi- propil hidrolizada, Acetil hexapeptido-39] o Adifyline™ [INCI: Acetil hexapeptido-38] comercializado por Lipo- tec/Lubrizol, Ursolisome® [INCI: lecitina, Acido ursolico, Atelocolageno, Goma xantano, Condroitin sulfato sodico], Epiruline [INCI: Maltodextrina, Extracto de corteza de Eperua falcata] o Collalift®[INCI: Extracto de malta hidrolizada] comercializada por Coletica/Engelhard/BASF, Syn®-Coll [INCI: Palmitoil tripeptido-5] comercializado por Pentap- harm/DSM, Hydriame® [INCI: Agua (Aqua), Glucosaminoglucanos, Goma Sclerotium] comercializado por Atrium Biotechnologies/Unipex Innovations, Sphingokine™ [INCI: Caproil fitosfingosina] comercializado por Evonik, Body3 Complex [INCI: Bentonita, Extracto de nuez de Butirospermum parkii (Shea), Extracto de fruto del Persea gratissima (Avocado)] comercializado por Lucas Meyer, Prosynergen DF [INCI: Filtrado de extracto de fermento de Lactobaci- llus/Ulkenia amoeboidea] comercializado por Lonza o IP2000 [INCI: Dextrano, Trifluoroacetil tripeptido-2] comercializado por el Institut Europeen de Biologie Cellulaire/Unipex Innovations, entre otros.
En otra realizacion, el agente estimulador de la smtesis de macromoleculas dermicas o epidermicas esta seleccio- nado, por ejemplo y no restringido a ellos, entre el grupo formado por agentes estimuladores de la smtesis de cola- geno, agentes estimuladores de la smtesis de elastina, agentes estimuladores de la smtesis de decorina, agentes estimuladores de la smtesis de laminina, agentes estimuladores de la smtesis de caperona, agentes estimuladores de la smtesis de sirtuina, agentes activadores de sirtuina, agentes moduladores de la smtesis de acuaporina, agentes estimuladores de la smtesis de fibronectina, agentes que inhiben la degradacion del colageno, agentes que inhi- ben la degradacion de elastina, agentes que inhiben serina proteasas tales como kalicreinas, leucocito elastasa o catepsina G, agentes estimuladores de la proliferacion de fibroblastos, y agentes reparadores de ADN y/o agentes protectores del ADN, tales como y no restringido a ellos, extractos de Centella asiatica, Saccharomyces cerevisiae, Solanum tuberosum, Rosmarinus officinalis, Vaccinium angustifolium, extracto de las algas Macrocystis pyrifera, Padina pavonica, extracto de soja, malta, lino, salvia, trebol comun, kakkon, plantas de altramuz blanco, extracto de avellanas, extracto de mafz, extracto de levadura, extractos de vastagos de haya, extracto de semilla de legumino- sas, extracto de hormona de plantas, tales como giberelinas, auxinas o citoquininas, entre otros, o extracto de zoo- plancton Salina, el producto de fermentacion de leche con Lactobacillus bulgaricus, asiaticosidos y sus derivados, vitamina C y sus derivados, acido cinnamico y sus derivados, Matrixyl® [INCI: Palmitoil pentapeptido-3], Matrixyl® 3000 [INCI: Palmitoil tetrapeptido-3, Palmitoil oligopeptido] o Biopeptide CLTM [INCI: Gliceril polimetacrilato, propileno glicol, Palmitoil oligopeptido] comercializado por Sederma/Croda, Antarcticine® [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas], Decorinyl™ [INCI: Tripeptido-10 citrulina], Serilesine® [INCI: Heptapeptido-10], Leptide [INCI: Protema vegetal hidrolizada], Aldenine® [INCI: Protema de trigo hidrolizada, Protema de soja hidrolizada,Tripeptido-1], Relistase™ [INCI: Acetilargieniltriptofil difenilglicina] Thermostressina™ [INCI: Acetil tetrapeptido-22], Peptide AC29 [INCI: Acetil tripeptido-30 citrulina], Diffuporine™ [INCI: Acetil hexapeptido-37], SilusyneTM [INCI: Aceite de soja (Glycine soja), Sorbitano sesquioleato, Isohexadecano, Hialuronato sodico, Protema de soja laurildiamonio hidroxi- propilo hidrolizada, Acetil hexapeptido-39] o Adifiline™ [INCI: Acetil hexapeptido-38] comercializado por Lipo- tec/Lubrizol, Drieline® PF [ICNI: Levadura betaglucano] comerciaslizada por Alban Muller, Phytovyl C® [INCI: Aqua, Extracto de Zea mays] comercializado por Solabia, Collalift® [INCI: Extracto de malta hidrolizada] comercializado por Coletica/Engelhard/BASF, Phytocohesine PSPTM [INCI: Beta-sitosterol sulfato sodico] comercializado por Vincien- ce/ISP/Ashland, minerales tales coo calcio, entre otros, retinoides y sus derivados, isoflavonoides, carotenoides, licopeno, pseudopeptidos, retinoides y sus derivados tales como retinol y palmitato de retinilo, entre otros, o hepari- noides, entre otros.
En otra realizacion, el agente estimulador de la cicatrizacion de heridas, el coadyuvante de la cicatrizacion de heri- das, el agnte estimulador de la reepitelizacion y/o el agente coadyuvante de la reepitelizacion esta seleccionado, por ejemplo y no restringido a ellos, al grupo formado por extractos de Aristoloquia clamatis, Centella asiatica, Rosa moschata, Echinacea angustifolia, Symphytum officinale, Equisetum arvense, Hypericum perforatum, Mimosa tenui- flora, Persea gratisima, Prunus africanum, Tormentilla erectea, Aloe vera, Poliplant® Epithelizing [INCI: Calendula officinalis, Hypericum perforatum, Chamomilla recutita, Rosmarinus oficinales], comercializada por Provital, Cytokinol® LS 9028 [INCI: Casema hidrolizada, Protema de levadura hidrolizada, Lisina HCl] comercializada por Laboratories Serobiologiques/Cognis o Deliner® [INCI: Extracto de pepita de Zea may (Grano)] comercializada por Coletica/Engelhard/BASF, alatoma, cadherinas, integrinas, selectinas, receptores de acido hialuronico, inmunoglobulinas, factores de crecimiento de fibroblastos, factos de crecimiento de tejido connectivo, factores de crecimiento proceden- tes de plaquetas, fatores de crecimiento endoteliales vasculares, factores de crecimiento epidermicos, factores de crecimiento de tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor estimulador de colonias, factor beta de crecimiento de transformacion, factor-alfa de necrosis de tumores, interferones, interleuquinas, metaloprotemas de
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matriz, tirosino proteasas de protema receptora, Antarcticina® [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas], Decorinyl® [INCI: Tripeptido-10 citrulina], Trylagen® [INCI: Extracto de fermento de pseudoalteromonas, Protema de trigo hidrolizada, Protema de soja hidrolizada, Tripeptido-10 citrulina, Tripeptido-1], Bodifensine™ [INCI: Acetil dipep- tido-3 aminohexanoato], Delisens™ [INCI: Acetil hexapeptido-49] o Diffuporine™ [INCI: Acetil hexapeptido-37] co- mercializado por Lipotec/Lubrizol, entre otros.
Aplicaciones
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del extracto de fermento producido por una cepa de la espe- cie Halomonas eurihalina en la preparacion de una composicion cosmetica o dermofamaceutica para tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas. En una realizacion, el extracto de fermento tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el extracto de fermento contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina en la preparacion de una composicion cosmetica o dermofamaceutica para tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
En una realizacion, el tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas se refiere a un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de perdi- da de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas, re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, tratamiento y/o prevencion de inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o tratamiento y/o prevencion de aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas. En una realizacion, el tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas se refiere al tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas, re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, tratamiento y/o prevencion de inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o tratamiento y/o prevencion de aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, y el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
En una realizacion, la inflamacion de la piel y/o membranas mucosas esta seleccionada, por ejemplo, sin restringirse a ellas, entre el grupo formado por psoriasis, piel sensible, dermatitis, dermatitis atopica, dermatitis por contacto, dermatitis por panales, dermatitis seborreica, eczema, rosacea, acne, enfermedad hiperproliferativa de la piel, que- maduras, quemaduras del sol, paroniquia, inflamacion de la piel despues de cirugfa, despues de tratamiento con terapia de luz pulsada intensa (IPL), despues de tratamiento con terapia de luz pulsada monocromatica (laser), despues de tratamiento con agentes exfoliantes qmmicos o despues de sobre-exposicion a agentes externos agresivos, inflamacion de la membrana mucosa de la vagina, inflamacion de la membrana mucosa oral, gingivitis, periodontitis, rinitis, rinitis alergica, entre otras. En una realizacion, el incremento en el nivel de conexinas Cx26 y/o Cx30 trata y/o previene la inflamacion de la piel y/o membranas mucosas.
En una realizacion, los estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, estan seleccionados entre el grupo formado por xerosis, hiper- queratosis, hiperqueratosis reactiva, hiperqueratosis palmar y plantar, callos o callosos, queratosis actmica, querato- sis no actmica, dermatitis atopica, eczema por contacto, dermatitis seborreica, gorros de bebes, acne, rosacea, ne- vo, ictiosis, psoriasis, paraqueratosis, pitiriasis, liquen plano, queratoderma palmoplantar, cuperosis, sequedad vaginal.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina en la preparacion de una composicion cosmetica o dermofarmaeutica para tratamiento y/o cuidado de la piel que incrementa los niveles de conexinas en la piel. De acuerdo con la presente invencion, el incremento en el nivel de conexinas en la piel se sobrentiende como el incremento en la cantidad de al menos una conexina en los queratinocitos de la piel. En una realizacion, la conexina es conexina 26, conexina 30, conexina 30.3, conexina 31, conexina 31.1, conexina 37, conexina 43, conexina 46 o conexina 58, tambien denomina como conexina 59. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa, contiene al menos un exopolisacarido y el tratamiento y/o cuidado de la piel incrementa los niveles de conexinas en la piel.
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En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina en la preparacion de una composicion cosmetica o dermofarmaeutica para tratamiento y/o cuidado de la piel que incrementa los niveles de conexinas en la piel. De acuerdo con la presente invencion, el in- cremento en el nivel de conexinas en la piel se sobrentiende como el incremento en la cantidad de al menos una conexina en los queratinocitos de la piel. En una realizacion, la conexina es conexina 26, conexina 30, conexina 30.3, conexina 31, conexina 31.1, conexina 37, conexina 43, conexina 46 o conexina 58, tambien denomina como conexina 59. En una realizacion, el exopolisacarido de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa, y el tratamiento y/o cuidado de la piel incrementa los niveles de conexinas en la piel.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas, el cual comprende la administracion de una cantidad cosmeticamente o dermofarmaceuticamente eficaz del extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. En una realizacion, el extracto de fermento tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el extracto de fermento contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con nume- ro de deposito LMG-P28571.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas, el cual comprende la administracion de una cantidad cosmeticamente o dermofarmaceuticamente eficaz del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG- P28571.
En una realizacion, el procedimiento de tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas se refiere a un procedimiento de tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrie- tados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas, re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, tratamiento y/o prevencion de inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o tratamiento y/o prevencion de aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas. En una realizacion, el procedimiento de tratamiento y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas se refiere a un procedimiento de tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas, re-epitelizacion y/o cicatrizacion de heridas de la piel, membranas mucosas y/o unas, tratamiento y/o prevencion de inflamacion de la piel y/o membranas mucosas, o tratamiento y/o prevencion de aquellos estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, y el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido o el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
En una realizacion, los estados, trastornos y/o enfermedades que son un resultado de la falta o disminucion en la hidratacion de la piel, membranas mucosas y/o unas, estan seleccionados entre el grupo formado por xerosis, hiper- queratosis, hiperqueratosis reactiva, hiperqueratosis palmar y plantar, callos o callosos, queratosis actmica, querato- sis no actmica, dermatitis atopica, eczema por contacto, dermatitis seborreica, gorros de bebes, acne, rosacea, ne- vo, ictiosis, psoriasis, paraqueratosis, pitiriasis, liquen plano, queratoderma palmoplantar, cuperosis, sequedad vaginal.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento de incremento de los niveles de conexinas en la piel, el cual comprende la administracion de una cantidad cosmeticamente o farmaceuticamente eficaz del extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. En una realizacion, el extracto de fermento tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, el extracto de fermento contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, el extracto de fermento de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa y contiene al menos un exopolisacarido. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento de incremento de los niveles de conexinas en la piel, el cual comprende la administracion de una cantidad cosmeticamente o farmaceuticamente eficaz del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina. En una realizacion, el exopolisacarido tiene un peso molecular de al menos 10 kDa. En una realizacion, la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG-P28571.
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En otro aspecto, el extracto de fermento o el exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eu- rihalina puede administrarse por cualquier medio que cause su contacto con el sitio de accion en un cuerpo de ma- irnfero, tfpicamente siendo el de un cuerpo humano, y en la forma de una composicion que lo contiene. La administracion del fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina se lleva cabo topicamente o trans- dermicamente. En una realizacion, la aplicacion topica o transdermica se lleva cabo mediante iontoforesis, sonofore- sis, electroporacion, presion mecanica, gradiente de presion osmotica, cura oclusiva, microinyecciones, mediante inyecciones sin aguja por medios de presion, mediante parches microelectricos, mascaras faciales o cualquier com- binacion de los mismos.
La frecuencia de la aplicacion o administracion puede variar ampliamente, dependiendo de las necesidades de cada sujeto, lo que sugiere un intervalo de aplicacion o administracion de desde una vez al mes hasta 10 veces al dfa, desde una vez por semana hasta 4 veces al dfa, desde tres veces por semana hasta tres veces al dfa, o una vez al dfa.
Deposito de material biologico
La cepa de la especie Halomonas eurihalina ha sido depositada en el Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM) / Laboratorium voor Microbiologie-Bacterieverzameling (LMG) (University Ghent, K.L. Ledeganckstra- at 35, 9000 Ghent, Belgium) bajo las condiciones del Budapest Treaty. El deposito se realizo el 10 de octubre de 2014 y el numero de deposito fue LMG P-28571.
Ejemplos
Cada uno de los documentos referidos anteriormente estan incorporados en la presente invencion como referencia, incluyendo cualquier solicitud anterior, esten o no espedficamente listadas anteriormente, de las cuales se reivindi- can su prioridad. La mencion de cualquiera de dichos documentos no es una admision de que dicho documento le califique como tecnica anterior o constituya el conocimiento general de la persona experta en cualquier jurisdiccion. Excepto en los Ejemplos, o en cualquier otra parte en que se especifique explfcitamente, todas las cantidades nume- ricas en la presente descripcion que especifiquen cantidades de materiales, condiciones de reaccion, pesos molecu- lares, numero de atomos de carbono, y similares, ha de entenderse como aproximados, es decir, sometidos a una variabilidad de ± 5%, ± 3%, ± 1%, ± 0,1%, o ± 0,01% del valor indicado. Se da por entendido que los lfmites superio- res e inferiores de cantidad, intervalo y relaciones establecidos en la presente invencion pueden combinarse inde- pendientemente. De manera similar, los intervalos y cantidades de cada elemento de la tecnologfa descrita en la presente invencion puede usarse conjuntamente con intervalos y cantidades de cualquiera de los otros elementos.
Ejemplo 1: Obtencion del exopolisacarido secretado por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571
A) Procedimiento de cultivo de la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P28571.
La cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 se cultivo en un fermentador a 32°C y un pH de 7,0 en un medio de cultivo conteniendo agua, 10 g/l de glucosa como fuente de carbono, 3 g/l de extracto de levadura y 3 g/l de extracto de malta y 5 g/l de peptona de guisante como fuente de carbono y nitrogeno, y una solucion de sal conteniendo 9,8 g/l de NaCl, 1,7 g/l de cloruro magnesico heptahidrato, 2,5 g/l de sulfato mag- nesico heptahidrato, 0,25 g/l de cloruro potasico, 0,05 g/l de cloruro calcico dehidrato, 0,05 g/l de bicarbonato sodico, sales traza de bromuro sodico y cloruro de hierro. Este se inoculo, a una absorbancia de 520 nm, de 0,2 Unidades de Absorbancia procedentes de un pre-cultivo en un estado exponencial de desarrollo y la duracion de la fermenta- cion se extendio hasta aproximadamente 40 horas de cultivo. Al cultivo se le suministro un suministro de aire sufi- ciente, y se agito a velocidades de agitacion de entre 300 y 600 rpm.
B) Purificacion del exopolisacarido de la cepa de la especie Halomonas eurihalina depositada bajo el numero de deposito LMG P-28571.
La bacteria se separo del caldo de fermentacion resultante descrito en el Ejemplo 1a) conteniendo el exopolisacarido mediante centrifugacion a 18.000 g durante 1 hora. La separacion de la bacteria se completo mediante filtracion a un tamano de poro final de 0,2 pm. A continuacion, el caldo filtrado se dializo con membrana de corte de 10.000 Da, reteniendose el exopolisacarido por la membrana. La purificacion final se llevo a cabo mediante secado por congela- cion del exopolisacarido dializado.
Ejemplo 2: Caracterizacion fisicoquimica del exopolisacarido excretado por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571
Se realizaron analisis de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) y de espectroscopfa infrarroja (IR) (detector de mdice refractivo) para la caracterizacion fisicoquimica del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 y sobre el contenido del exopolisacarido obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1.
Analisis de cromatoarafia liquida de alto rendimiento (HPLC) y de espectroscopia infrarroja (IR)
Con el fin de realizar los cromatogramas de HPLC-IR, se prepararon muestras a partir del exopolisacarido obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, diluyendolas en agua a 2 mg/ml y filtrandolas con filtros de polietersulfona de 0,2 pm. El analisis de HPLC se realizo usando una inyeccion de 100 pl de la muestra sobre un equipo de cromatograffa 5 SHIMADZU LC20A. La columna cromatografica usada es AQUEUS SEC COLUMNS PL AQUAGEL-OH de 8 pm, y el detector, el Refractive Index Detector RID-10A (Shimadzu). El disolvente usado fue acetato sodico 0,1 M en agua y caudal de 0,8 ml/min. La AQUEUS SEC COLUMNS PL AQUAGEL-OH de 8 pm es una columna para cromatogra- ffa de exclusion por tamano acuosa, con un empaquetamiento con la capacidad para separar compuestos depen- diendo de su peso molecular, aplicada a polfmeros neutros, anionicos y cationicos y con un tamano de partfcula de 8 10 pm, un tamano de poro de 50 Ay una longitud/diametro interno de 300 mm x 7,5 mm.
El resultado del analisis muestra un tiempo de retencion de entre 5 y 8 minutos.
Analisis de monosacaridos
Con el fin de realizar el analisis de monosacarido a partir del solido, se siguio el procedimiento descrito por Kamer- ling y otros, Biochem. J., vol. 151, pags. 491-495, (1975) tal como posteriormente ha sido modificado por Montreuil y 15 otros, en Glicoproteins. In Carbohydrate Analisys: A practical approach, (1986), Eds Chaplin et Kennedy, I,R.L Press, Oxford, Washington D.C., pags. 143-204. La modificacion de los monosacaridos hidrolizados se llevo a cabo de acuerdo con procedimientos de la literatura [Rojas Escudero y otros, J. Chromatogr. A., vol. 1027, pags. 117-120, (2004)]. Para el analisis cromatografico se uso una columna zEbRON ZB-1701 (Phenomenex), una temperatura del inyector de 250°C, una temperatura del detector de 280°C y una programacion de la rampa de temperatura de la 20 estufa de 160°C a 250°C.
El analisis del exopolisacarido obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, dio los resultados de: 75% de glucosa, 13% de mannosa, 2% de rhamnosa, 2% de D-glucosamina, 7% de galacosa y 1% de fucosa.
En una segunda repeticion del cultivo y preparacion del exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1, los porcenta- jes resultantes del analisis fueron: 52% de glucosa, 10% de mannosa, 12% de rhamnosa, 20% de D-glucosamina, 25 6% de galacosa, 1% de fucosa y 1% de acido glucuronico.
Ejemplo 3: Estudio del incremento de comunicacion intercelular de uniones comunicantes en la lrnea celular HaCaT de queratinocito humano mediante carga de raspados ytransferencia de clorante
La comunicacion intercelular de uniones comunicantes (GJIC) de las celulas se comprobo mediante la tecnica de carga de raspados ytransferencia de colorante (SLDT) descrita por el-Fouly MH, y otros [“Scrape-loading and dye 30 transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication”, Exp. Cell Res., vol. 168 (n°, 2), pags. 422-30, (Feb. 1987)] con algunas modificaciones. El efecto del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 sobre GJIC, se estudio sobre la lrnea celular HaCaT de queratinocito humano.
Las celulas HaCaT (DKFZ) se sembraron a 1,0x105 celulas/pocillo en placas de24 pocillos y se incubaron en medio 35 de cultivo (DMEM, con alto contenido en glucosa, GlutaMAx™ Supplement, suplementado con 10% de suero bo- vino fetal) (Gibco®) a 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. A continuacion, las celulas se trataron durante 24 horas con el exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 0,5 mg/ml en medio de cultivo, y medio de cultivo (DMEM, con alto contenido en glucosa, GlutaMAX™ Supplement, suplementado con 10% de suero bovino fetal) (Gibco®) (como 40 condiciones basales) a 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Todos los tratamientos se realizaron con dos pocillos para cada condicion. Al final del periodo de incubacion, las celulas se lavaron dos veces con solucion salina tampo- nada con fosfato (PBS). La PBS se retiro y a los pocillos se agregaron 400 pl de PBS conteniendo Lucifer Yellow (LY) (Life Technologies) (0,5 mg/ml), un trazador permeable de uniones comunicantes, y compuesto no permeable de uniones comunicantes Rhodamine Dextran (RhD) (Life Technologies) (0,5 mg/ml). Para crear una lrnea de raspa- 45 dos a lo largo de la monocapa celular se uso un escalpelo. Las celulas se incubaron durante 30 minutos en la oscu- ridad a temperatura ambiente para permitir la transferencia del colorante. A continuacion, las celulasse lavaron 4 veces con PBS y se fijaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 4% (p/v) de paraformaldehido. La dis- tancia a la cual el colorante fluosrescente se difunde mas alla de la lrnea de raspados durante un cierto penodo en indicativo del mdice de GJIC dentro de un cultivo. La transferencia de colorante de uniones comunicantes se obser- 50 vo con un microscopio de fluorescencia (Zeiss) usando un objetivo 10x. La distancia de migracion del colorante Lucifer Yellow se midio a partir de la capa de celulas en el raspado hasta el borde del frente del colorante que era vi- sualmente detectable. Se ralizaron cuatro ensayos independientes por duplicado (2 pocillos por condicion). Las fotos tomadas se analizaron usando el software de analisis de imagenes (Zen lite 2012 (blue edition), Zeiss). La Tabla 1 muestra los valores medios de 4 experimentos independientes.
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25
30
35
40
45
Producto
Concentracion Induccion al duplicado de GJIC con respecto a condiciones basales
Exopolisacarido del Ejemplo 1
0,5 mg/ml 1,47
En el ensayo SLDT, el exopolisacarido de la invencion muestra un incremento en la distancia a la cual el colorante fluorescente se difunde con respecto a la condicion basal (Medio), lo que demuestra que es eficaz en mejorar la GJIC en celulas HaCat.
Ejemplo 4: Estudio de la modulacion de la expresion de ARN en queratinocitos epidermicos humanos pro- cedentes de adultos usando el ensayo RT PCR de uniones comunicantes humanas
El RT-PCR es un procedimiento sensible para la deteccion de mdices de expresion de ARNm y puede ser una he- rramienta util para la identificacion de compuestos que activan la expresion de uniones comunicantes. El candidato potencial y no-citotoxico se evaluo para determinar la activacion de la expresion y modulacion de uniones comunicantes (GJs) de la expresion de ARN usando el panel de 96 pocillos predisenado de uniones comunicantes humanas para uso con SYBR® Green (BioRad) en queratinocitos epidermicos humanos, procedentes de adultos (HEKA) (Cascade Biologics). Este kit estudia los perfiles de expresion de 84 gens clave que codifican componentes, interac- tores y reguladores de uniones comunicantes, ademas de tres genes consecutivos y cinco controles. El perfil de expresion de componentes y reguladores de uniones comunicantes puede conducir a un mejor conocimiento del mecanismo molecular que esta detras de la biologfa celular mediada por uniones comunicantes. Usando PCR de tiempo real, se analizo el patron espedfico del perfil de ARN inducido por el exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenida de acuerdo con el Ejemplo 1, a 0,5 mg/ml, en comparacion con los niveles basales de celulas no tratadas (control negativo) en HEKa.
Las celulas HEKa se sembraron a 5,0x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron en Epilife con su- plemento de crecimiento definido (EDGR) (Gibco) a 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Despues de 24 horas, el medio se retiro y las celulas se incubaron con 0,5 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, y como control basal, se incubaron dos celulas HEKa con medio unicamente (Epilife con suplemento de crecimiento definido (EDGR) (Gibco). 24 horas despues de la incubacion, las celulas se lisaron directamente en los pocillos, y el ARN se extrajo y purifico a partir de cada replica y cada condicion mediante el kit RNeasyPlus Mini de Qiagen. Las celulas lisadas se homogeneizaron y las RNasas se inactivaron. El ADN genomico se separo de las muestras usando co- lumnas de centrifugacion gDNA Eliminator. A continuacion, las muestras se pasaron a praves de columnas de union de ARN y, despues de varios lavados por microcentrifugacion para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluyo con 50 pl de agua ultrpura. Despues de elucion del ARN, se llevo a cabo la cuantificacion y anali- sis de pureza de las muestras de ARN con un biofotometro (Eppendorf). Por cada muestra, se retro-transcribieron 7,5 pg de ARN de alta calidad con iScript Advanced (BioRad) en un volumen final de 20 pl. La mezcla de reaccion completa se incubo en un ciclador termico (Eppendorf) a 42°C durante 30 minutos, interrumpiendose la reaccion a 85°C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifico mediante qPCR en un termocliclador PCR de tiempo real (BioRad) usando super-mezcla SYBR Green (BioRad) en el panel de 96 pocillos pre-disenado para uniones comunicantes humanas para uso con SYBR® Green (BioRad). La SYBR Green se une a moleculas de ADN de doble hebra y emite fluorescencia que es cuantificada, siendo la intensidad de fluorescencia proporcional a la canti- dad del producto en la reaccion PCR. Las condiciones de ciclado en el instrumento CFX96 BioRad son: 95°C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 5 segundos, reasociacion y alargamiento a 60°C durante 30 segundos. Como controles endogenos se usaron GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato deshidrogena- sa), TBP (protema de union de caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforibosiltransferasa). El cambio de numero de veces con relacion a la expresion de los genes de la muestra y los genes de referencia se calculo usando el procedimiento de expresion normalizada (AA(Ct)), con valores de umbral de defectos usando el CFX Manager Software (BioRad).
Los resultados obtenidos para el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1 se muestran en las tablas siguientes.
Tabla 2
Genes de conexina regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo1
Nombre de la protema
Sfmbolo del gen Nombre del gen Induccion de numero de veces
Cx43
GJA1 Protema alfa-1 de union comunicante 2,05
Cx46
GJA3 Protema alfa-3 de union comunicante 3,30
(continuacion)
Genes de conexina regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplol
Nombre de la protema
S^bolo del gen Nombre del gen Induccion de numero de veces
Cx37
GJA4 Protema alfa-4 de union comunicante 2,69
Cx58
GJA9 Protema alfa-9 de union comunicante 2,45
Cx26
GJB2 Protema beta-2 de union comunicante 1,63
Cx31
GJB3 Protema beta-3 de union comunicante 1,14
Cx30
GJB6 Protema beta-6 de union comunicante 3,70
5
Tabla 3
Genes de senalizacion de celulas regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1
Sfmbolo
Nombre del gen Induccion de numero de veces
ADCY3
Adenilato ciclasa 3 1,49
MAP3K2
Protema quinasa quinasa quinasa 2 activada por mitogeno 3,08
MAPK3
Protema quinasa 3 activada por mitogeno 1,12
MAPK7
Protema quinasa 7 activada por mitogeno 1,86
PRKCB
Protema quinasa C, beta 2,43
PRKG1
Protema quinasa, dependiente de cGMP, tipo I 1,20
GRB2
Protema 2 unida a receptor de factor de crecimiento 1,48
Tabla 4
Conexina de interaccion con genes de protema regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1
Sfmbolo
Nombre del gen Induccion de numero de veces
DNB1
Debrina 2,05
TJP1
Protema 1 de union estrecha 1,25
Tabla 5
Genes de tubulina regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1
Sfmbolo
Nombre del gen Induccion de numero de veces
TUBA1C
Tubulina, alfa 1c 4,93
TUBA4A
Tubulina, alfa 4a 1,7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Otros genes regulados por el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1
Sfmbolo
Nombre del gen Induccion de numero de veces
B2M
Beta-2-microglobulina 1,61
GUSB
Glucuronidasa, beta 1,34
ITPR2
inositol 1,4,5-trisfosfate receptor, tipo 2 1,35
PANX1
Pannexina 1 1,29
PANX2
Pannexina 2 2,15
Los resultados obtenidos para el exopolisacarido de acuerdo con el Ejemplo 1 muestran que incrementa la expresion de genes implicados en la comunicacion de celulas a diferentes niveles en HEKa, tal como smtesis de conexinas, transporte de hemicanales a las membranas y ensamblado, recambio y modulacion de uniones comunicantes.
Ejemplo 5: Efecto del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 sobre la comunicacion de celula a celula epidermica-dermica
El envejecimiento reduce el proceso de comunicacion entre celulas. La diafoma entre fibroblastos y queratinocitos es esencial para la regeneracion, reparacion y crecimiento de la piel, e implica la actividad de un cierto numero de men- sajeros tales como factores de crecimiento y citocinas. Los queratinocitos son la fuente primaria de factores de crecimiento, los cuales pueden estimular no solamente los propios queratinocitos, sino tambien fibroblastos a traves de la senal paracrina y afectan en gran medida la constitucion molecular de la matriz extracelular (ECM) (Werner S, Krieg T, Smola H. “Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing”. J. Invest. Dermatol. Vol. 127 (n° 5), pags 998-1008, (Mayo 2007). En el presente estudio, el efecto del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, sobre la comunicacion de queratinocito-fibroblasto procedente de un donante de 54 anos de edad, se evaluo y comparo con la comunicacion de queratinocito-fibroblasto procedente de un donante joven (39 anos de edad). Los fibroblastos pro- cedentes del donante de 54 anos de edad se incubaron con sobrenadantes de queratinocitos que habfan sido trata- dos primeramente con el exopolisacarido candidato. La expresion de las protemas de matriz en fibroblastos proce- dentes del donante de 39 anos de edad y del donante de 54 anos de edad se analizaron mediante PCR cuantitativo.
Las celulas de queratinocitos epidermicos humanos (HEK) (Aplicaciones de celulas) procedentes de un donante de 39 anos de edad y de un donante de 54 anos de edad se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 3- 5x103 celulas/cm2 en Epilife suplementado con EDGS (Gibco) y las celulas de fibroblasto dermico humano (HDF) (Aplicaciones de celulas) procedentes de un donante de 39 anos de edad y de un donante de 54 anos de edad se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 7-8x103 celulas/cm2 en medio 106 suplementado con LSGS a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2 durante 7 dfas. Despues de este tiempo, las HEK se desdoblaron y, a continuacion, se sembraron para tratamiento. Las celulas HEK procedentes de los donantes de 39 anos de edad y de 54 anos de edad se sembraron a una densidad de 6x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro. Las celulas HEK procedentes del donante de 54 anos de edad se incubaron con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 en medio de cultivo recien preparado. Como un control basal, se incubaron unicamente con medio tres pocillos de celulas HEK procedentes del donante de 54 anos de edad. Como un basal positivo, se incubaron unicamente con medio tres pocillos de celulas HEK procedentes del donante de 39 anos de edad. Las condiciones de incubacion fueron de 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Todos los tratamientos se realizaron en tres pocillos por conjunto de condiciones de cultivo. Las celulas HDF se sembraron a una densidad de 1,7-2,4x106 celulas/pocillo en matraces de 25 cm2. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro y las celulas HDF se incubaron con los sobrenadantes de los cultivos de queratinocitos.
Despues de 24 horas de incubacion, las HDF se lisaron directamente en los pocillos siguiendo el protocolo descrito en el kit RNeasy Mini (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas lisadas se homogeneizaron y las RBasas se inactivaron. El ADN genomico se separo de las muestras usando columnas de centrifugacion gDNA Eliminator. A continuacion, las muestras se pasaron a traves de columnas de union de ARN especiales y, despues de varios lavados de microcentrifugacion para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluyo con 50 |jl de agua ultrapura. La cuantificacion y analisis de pureza de las muestras de ARN se llevo a cabo despues de elucion del ARN con un biofotometro (Eppendorf). Se retrotranscribieron 3 jg de ARN de alta calidad con iScript advanced (BioRad, Hercules, CA, USA) en un volumen final de 20 jl. La mezcla de reaccion completa se incubo en un ciclador termico (Eppendorf) a 42°C durante 30 minutos, la reaccion se interrumpio a 85°C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifico mediante qPCR en un termociclador PCR de tiempo real (BioRad) usando super-
mezcla SYBRgreen (BioRad) en el panel de 96 pocillos predisenado de matriz extracelular para uso con SYBR® Green (BioRad). El SYBR Green se une a las moleculas de ADN de doble hebra y emite fluorescencia que es cuanti- ficada y es proporcional a la cantidad del producto en la reaccion de PCR. Las condiciones de ciclado en el instrument BioRad CFX96 son de 95°C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 5 5 segundos, reasociacion y alargamiento a 60°C durante 30 segundos. Como controles endogenos se usaron GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa), TBP (protema de union de caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforibosil- transferasa 1). El cambio de numero de veces con relacion a la expresion de los genes de la muestra y los genes de referencia se calculo usando el procedimiento de expresion normalizada (AA(Ct)), con valores de umbral de defectos usando el CFX Manager Software (BioRad).
10 Los resultados obtenidos con respecto al control basal (100%) de HDF del donante de 54 anos de edad, se mues- tran en la Tabla 7. El valor representa la media de 5 experimentos diferentes.
Tabla 7
Sfmbolo
Nombre del gen HDF de donan- te de 39 anos de edad Niveles relati- vos (%) HDF de donante de 54 anos de edad con sobre- nadante procedente de queratinocitos de donante de 54 anos de edad tratados con exopolisacarido Niveles relativos (%)
COL3A1
Colageno, Tipo II, Alfa 1 284,5 123,7
ITGA1
Integrina, Alfa 1 Adhesion de celula vascular 217,6 133,8
VCAM1
Molecula 1 Metalopeptidasa con trombos- pondina Tipo 1 1908,5 185,6
ADAMTS1
Motivo, 1 76,4 77,6
HYAL1
Hialuronoglucosaminidasa 40,1 41,3
MMP9
Matriz metaloproteinasa 9 26,1 69,2
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion sobre-regula los genes implicados en la smtesis de 15 la matriz extracelular e infra-regula los genes implicados en la degradacion de la matriz extracelular en fibroblastos procedentes del donante de mayor edad.
Ejemplo 6: Induccion de niveles de expresion de protema conexina sobre la epidermis humana reconstruida mediante tratamiento con el exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, usando un ensayo inmunohistoquimico
20 Los uniones comunicantes (GJs) son canales formados por protemas de membrana integrales denominadas conexi- nas (Cxs). En el compartimento epidermico, una alteracion inducida por la edad relacionada con GJs es la infra- regulacion de Cxs. Para estudiar la expresion de las protemas conexinas Cx37, Cx30.3, Cx30 y Cx59 en queratino- citos humanos, los autores de la presente invencion han usado un sistema de cultrivo tridimensional, tejido epidermico humano reconstruido (RHE), que reproduce in vitro la organizacion histologica de la epidermis humana in situ.
25 Los modelos de tejido humano SkinEthic (EPISKIN) se retiraron de la solucion de nutriente de agarosa en la placa multipocillos inmediatamente despues de llegar y se colocaron en una placa de 6 pocillos, en la cual cada pocillo se habfa llenado previamente con madio de desarrollo SkinEthic (EPISKIN). Despues de una noche de incubacion a 37°C, 5% de CO2, el RHE se trato con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, y con medio unicamen- 30 te (condiciones basales), durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. Despues de 24 horas de tratamiento, los modelos de tejidos se fijaron en paraformaldehido (Sigma) al 4% durante 3 horas a 40°C y se lavaron 4 veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma). A continuacion, las muestras se trataron hasta un gradiente de sacaro- sa de desde 0,6 M hasta 2,3 M con incubaciones de 3 horas a temperatura ambiente. Despues de la ultima incubacion, los modelos de tejidos se embebieron en el compuesto Tissue Teck OCT (Aname). Las secciones de tejido 35 congeladas de aproximadamente 10 pm de espesor se cortaron usando un criomicrotomo (Leica, CM3050), se reco- gieron sobre portaobjetos recubiertos y finalmente se almacenaron a -20°C.
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La expresion de conexinas espedficas se evaluo mediante inmunohistoqmmica con anticuerpos primarios espedfi- cos y un anticuerpo secundario marcado mediante fluorescencia. Los portaobjetos descongelados se fijaron con solucion congelada de acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuacion, se lavaron con PBS. Los sitios no espedficos se saturaron con suero de cabra normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de lavado con Tween al 0,2% en PBS, los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios (anticuerpo Anti-Connexin 37/GJA4, 30.3/GJB4, 59/GJA10 (Abcam), anti-Connexin 30 de conejo (Invitrogen) (diluido en suero de cabra al 10% en PBS) en una camara humidificada a temperatura ambiente durante 2 horas. Al final de la incubacion, los portaobjetos se lavaron con Tween al 0,2% en PBS y se incubaron con anticuerpo secundario anti- conejo IgG (H+L) Alexa Fluor®488 Goat (Invitrogen, colorante de emision de fluorescencia verde) durante 1 hora a temperatura ambiente en una camara humidificada oscura. Despues de lavado con PBS, las secciones se montaron en un reactivo anti-decoloracion Gold prolongado con Dapi (Invitrogen).
Las observaciones microscopicas se llevaron a cabo con un microscopio de fluorescencia Zeiss y con la camara asociada se tomaron fotograffas de cada condicion. A partir de cada imagen de fluorescencia de las conexinas, los valores de ID (Densidad Integrada) se cuantificaron y normalizaron mediante control. Al menos se recogieron 4 ima- genes representativas de cada condicion y se analizaron con el software de Imagen J. La media representa los da- tos de 1 o 2 experimentos independientes.
Los resultados obtenidos con respecto a las condiciones basales (100%) se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Protema conexina
Niveles de protemas (%)
Protema Cx59
127,8
Protema Cx37
205,1
Protema Cx30
152,3
Protema Cx30.3
156,5
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion induce un incremento significativo en la expresion de protemas conexinas en queratinocitos procedentes de epidermis humana reconstruida a la concentracion ensayada.
Ejemplo 7: Restauracion de los niveles de expresion de conexina en un modelo de menopausia in vitro mediante tratamiento con el exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571
El envejecimiento de la piel se produce por factores extrmsecos asf como intrmsecos, entre ellos una disminucion en la funcion de la glandula endocrina y una reduccion en los niveles de hormonas en circulacion. La menopausia causa el hipoestrogenismo, lo que acelera el deterioro relacionado con la edad de la piel. A continuacion de la menopausia, muchas mujeres detectan un comienzo acelerado del envejecimiento de la piel; la piel se vuelve mas fina con un contenido decreciente de colageno, disminucion de la elasticidad, incremento de arrugas e incremento de la sequedad. En la piel de mujeres post-menopausicas el espesor disminuye un 1,13% por ano post-menopausico, con una disminucion asociada en el contenido en colageno (2% por ano post-menopausico). La comunicacion intercelu- lar de uniones comunicantes (GJIC) se considera que juega un papel importante en el control del crecimiento, dife- renciacion, mantenimiento de la homeoestasis y morfogenesis celular. La GJIC esta regulada por varios factores, incluyendo factores de crecimiento, oncogenes, Ca2+, pH y hormonas. Las hormonas estan implicadas en la regula- cion de la comunicacion intracelular mediante la GJIC. El objeto del presente estudio es investigar la relacion entre la disminucion de la comunicacion intercelular de uniones comunicantes y el envejecimiento de la piel hormonal. De acuerdo con ello, los autores del presente estudio han desarrollado un modelo in vitro de menopausia en queratinocitos mediante el tratamiento de los mismos con niveles de hormonas de mujeres menopausicas. Los queratinocitos tratados con niveles de hormonas de mujeres no menopausicas se usaron como un control basal. En el presente estudio, la eficacia del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, en la restauracion de los niveles de conexinas en queratinocitos menopausicos se evaluo mediante sistema de matriz RT-qPCR.
Las celulas de queratinocitos epidermicos humanos (HEK) (Aplicaciones de celulas) procedentes de un donante de 19 anos de edad se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 3-5x103 celulas/cm2 en Epilife suple- mentado con EDGS (Gibco) al 10% a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2 durante 7 dfas. Despues de este tiempo, se desdoblaron y, a continuacion, se sembraron para tratamiento. Las celulas HEK se sembraron a una densidad de 6-7,5x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos en Epilife suplementado con EDGS al 0,1%. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro. A continuacion, para es- timular las condiciones de menopausia, los queratinocitos se incubaron con concentraciones de hormonas menopausicas y con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con nume-
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ro de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, y con medio unicamente con concentraciones de hormonas menopausicas. Dos pocillos de estas celulas se incubaron con concentraciones de hormonas no me- nopausicas como un control basal. Las condiciones de incubacion fueron de 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Todos los tratamientos se realizaron en dos pocillos por conjunto de condiciones de cultivo.
Las concentraciones de hormonas en condiciones de no menopausicas y menopausicas se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Hormona
Concentracion en condiciones no menopausicas Concentracion en condiciones menopausicas
p-Estradiol
750 pM 60 pM
Progesterona
60 nM 6 nM
Deshidroepiendrosterona
20 nM 2 nM
Hormona del crecimiento humano
0,005 pg/ml 0,0015 pg/ml
Factor 1 de crecimiento tipo insulina
0,2 pg/ml 0,1 pg/ml
Despues de 24 horas de incubacion, las celulas se lisaron directamente en los pocillos siguiendo el protocolo descri- to en el kit RNeasy Mini (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas lisadas se homogeneiza- ron y las RBasas se inactivaron. El ADN genomico se separo de las muestras usando columnas de centrifugacion gDNA Eliminator. A continuacion, las muestras se pasaron a traves de columnas de union de ARN especiales y, despues de varios lavados de microcentrifugacion para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluyo con 50 pl de agua ultrapura. La cuantificacion y analisis de pureza de las muestras de ARN se llevo a cabo despues de elucion del ARN con un biofotometro (Eppendorf). Se retrotranscribieron 3 pg de ARN de alta calidad con iScript advanced (BioRad) en un volumen final de 20 pl. La mezcla de reaccion completa se incubo en un cicla- dor termico (Eppendorf) a 42°C durante 30 minutos, la reaccion se interrumpio a 85°C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifico mediante qPCR en un termociclador PCR de tiempo real (BioRad) usando supermezcla SYBRgreen (BioRad) en el panel de 96 pocillos predisenado de uniones comunicantes humano para uso con SYBR® Green (BioRad). El SYBR Green se une a las moleculas de ADN de doble hebra y emite fluorescencia que es cuantificada y es proporcional a la cantidad del producto en la reaccion de PCR. Las condiciones de ciclado en el instrumento BioRad CFX96 son de 95°C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 5 segundos, reasociacion y alargamiento a 60°C durante 30 segundos. Como controles endogenos se usaron GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa), TBP (protema de union de caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforibosiltransferasa 1). El cambio de numero de veces con relacion a la expresion de los genes de la muestra y los genes de referencia se calculo usando el procedimiento de expresion normalizada (AA(Ct)), con valores de um- bral de defectos usando el CFX Manager Software (BioRad).
Los resultados obtenidos con respecto a las celulas HEK en condiciones no menopausicas (100%) se muestran en la Tabla 10. El valor representa la media de 5 experimentos independientes.
Tabla 10
Sfmbolo
Nombre del gen HEK menopausicas Niveles relativos (%) HEK menopausicas tratadas con exopolisa- carido Niveles relativos (%)
GJA3
Protema alfa-3 de union comuni- cante 74,48 262,69
GJA4
Protema alfa-3 de union comuni- cante 71,99 173,31
GJA9
Protema alfa-9 de union comuni- cante 76,02 247,65
GJB3
Protema beta-3 de union comuni- cante 83,22 130,25
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(continuacion)
GJB4
Protema beta-4 de union comuni- 89,31 212,99
cante
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion restablece los niveles de conexinas en queratinoci- tos menopausicos.
Ejemplo 8: Restauracion de los niveles de expresion de conexina en queratinocitos mas viejos con trata- miento del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de depo- sito LMG P-28571
El envejecimiento es un resultado del dano acumulado dentro de la piel, la cual ha perdido la parte de su red de comunicacion. En el compartimento epidermico, una alteracion inducida por la edad se refiere a uniones comunican- tes, es decir canales transmembrana entre dos celulas vecinas, que permiten el intercambio de iones. Realmente, la expresion de sus componentes, las conexinas (Cx), esta sub-regulada durante el envejecimiento. De acuerdo con ello, el objetivo del presente estudio es investigar la eficacia anti-edad del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, mediante la evaluacion de la expresion de conexina en queratinocitos mas viejos comparados con queratinocitos mas jovenes, mediante el sistema de matriz RT-qPCR.
Las celulas de queratinocitos epidermicos humanos (HEK) (Aplicaciones de celulas) se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 2-4x103 celulas/matraz en Epilife suplementado con EDGS (Gibco) a 37°C en aire humidi- ficado con 5% de CO2 durante 7 dfas. Despues de este tiempo, se desdoblaron y, a continuacion, se sembraron para tratamiento. Las celulas HEK procedentes del donante de 39 anos de edad y del donante de 54 anos de edad se sembraron a una densidad de 6x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos en el medio de cultivo. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro. Los queratinocitos procedentes del donante de 54 anos de edad se incubaron con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 en medio de cultivo recien preparado. Dos pocillos de estas celulas se incubaron con medio recien preparado como control basal. Como un control positivo, se incubaron dos pocillos de queratinocitos procedentes de un donante de 39 anos de edad con medio recien preparado. Las condiciones de incubacion fueron de 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Todos los tratamientos se realizaron en dos pocillos por conjunto de condiciones de cultivo.
Despues de 24 horas de incubacion, las celulas se lisaron directamente en los pocillos siguiendo el protocolo descri- to en el kit RNeasy Mini (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas lisadas se homogeneiza- ron y las RBasas se inactivaron. El ADN genomico se separo de las muestras usando columnas de centrifugacion gDNA Eliminator. A continuacion, las muestras se pasaron a traves de columnas de union de ARN especiales y, despues de varios lavados de microcentrifugacion para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluyo con 50 pl de agua ultrapura. La cuantificacion y analisis de pureza de las muestras de ARN se llevo a cabo despues de elucion del ARN con un biofotometro (Eppendorf). Se retrotranscribieron 3 pg de ARN de alta calidad con iScript advanced (BioRad) en un volumen final de 20 pl. La mezcla de reaccion completa se incubo en un cicla- dor termico (Eppendorf) a 42°C durante 30 minutos, la reaccion se interrumpio a 85°C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifico mediante qPCR en un termociclador PCR de tiempo real (BioRad) usando supermezcla SYBRgreen (BioRad) en el panel de 96 pocillos predisenado de uniones comunicantes humanas para uso con SYBR® Green (BioRad). El SYBR Green se une a las moleculas de ADN de doble hebra y emite fluorescencia que es cuantificada y es proporcional a la cantidad del producto en la reaccion de PCR. Las condiciones de ciclado en el instrumento BioRad CFX96 son de 95°C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 5 segundos, reasociacion y alargamiento a 60°C durante 30 segundos. Como controles endogenos se usaron GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa), TBP (protema de union de caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforibosiltransferasa 1). El cambio de numero de veces con relacion a la expresion de los genes de la muestra y los genes de referencia se calculo usando el procedimiento de expresion normalizada (AA(Ct)), con valores de um- bral de defectos usando el CFX Manager Software (BioRad).
Los resultados obtenidos con respecto al control basal de HEK de donante de 54 anos de edad (100%) se muestran en la Tabla 11. El valor representa la media de 4 experimentos independientes.
5
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Sfmbolo
Nombre del gen HEK de donante de 39 anos de edad HEK de donante de 54 anos de edad tratada con exopolisacarido
Niveles relativos (%) Niveles relativos (%)
GJA1
Proteina alfa-1 de union comunicante 149,2 162,16
GJA9
Proteina alfa-9 de union comunicante 128,3 189,6
GJB2
Proteina beta-2 de union comunicante 142,6 183,2
GJB6
Proteina beta-6 de union comunicante 211,8 194,9
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion restablece la expresion de conexina en queratinoci- tos procedentes de un donante de 54 anos de edad a la que se encuentra en celulas de piel mas jovenes.
Ejemplo 9: Restauracion de los niveles de expresion de proteina conexina en un modelo in vitro de meno- pausia en tejido epidermico humano reconstruido mediante tratamiento con el exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, usando un ensayo inmunohistoquimico
El envejecimiento de la piel se produce por factores extrmsecos as^ como intrmsecos, entre ellos una disminucion en la funcion de la glandula endocrina y una reduccion en los mdices de hormonas en circulacion. La menopausia causa el hipoestrogenismo, lo que acelera el deterioro relacionado con la edad de la piel. A continuacion de la menopausia, muchas mujeres detectan un comienzo acelerado del envejecimiento de la piel; la piel se vuelve mas fina con un contenido decreciente de colageno, disminucion de la elasticidad, incremento de arrugas e incremento de la sequedad. En la piel de mujeres post-menopausicas el espesor disminuye un 1,13% por ano post-menopausico, con una disminucion asociada en el contenido en colageno (2% por ano post-menopausico). La comunicacion intercelu- lar de uniones comunicantes (GJIC) se considera que juega un papel importante en el control del crecimiento, dife- renciacion, mantenimiento de la homeoestasis y morfogenesis celular. La GJIC esta regulada por varios factores, incluyendo factores de crecimiento, oncogenes, Ca2+, pH y hormonas. Las hormonas estan implicadas en la regula- cion de la comunicacion intracelular mediante la GJIC. El objeto del presente estudio es investigar la relacion entre la disminucion de la comunicacion intercelular de uniones comunicantes y el envejecimiento de la piel hormonal. De acuerdo con ello, los autores del presente estudio han desarrollado un modelo in vitro de menopausia en queratino- citos en tejido epidermico humano reconstruido (RHE) tratado con niveles de hormonas de mujeres menopausicas. Como comparacion, se uso el tejido epidermico humano reconstruido (RHE) tratado con niveles de hormona de mujeres no menopausicas. En el presente estudio, la eficacia del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, en la restauracion de los niveles de protemas conexinas, Cx59 y Cx37, se evaluo mediante inmunohistoqmmica.
Los modelos de tejido humano SkinEthic (EPISKIN) se retiraron de la solucion de nutriente de agarosa en la placa multipocillos inmediatamente despues de llegar y se colocaron en una placa de 6 pocillos, en la cual cada pocillo se habfa llenado previamente con medio de desarrollo SkinEthic (EPISKIN). Despues de una noche de incubacion a 37°C, 5% de CO2, el medio se elimino. A continuacion, para estimular las condiciones de menopausia, el RHE se incubo con concentraciones de hormonas menopausicas y con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, y con medio unicamente unicamente con concentraciones de hormonas menopausicas. El RHE se incubo con concentraciones de hormonas no menopausicas como un control positivo. Las condiciones de incubacion fueron de 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Las muestras de RHE se embebieron en compuesto Tissue Teck OCT (Aname). To- dos los tratamientos se llevaron a cabo en dos muestras de RHE por grupo de condiciones de cultivo.
Las concentraciones de hormonas para las condiciones no menopausicas y menopausicas se muestran en la Tabla 12.
Hormona
Concentracion en condiciones no Concentracion en condiciones
menopausicas menopausicas
p-Estradiol
750 pM 60 pM
Progesterona
60 nM 6 nM
Deshidroepiendrosterona
20 nM 2 nM
Hormona del crecimiento humano
0,005 pg/ml 0,0015 pg/ml
Factor 1 de crecimiento tipo insulina
0,2 pg/ml 0,1 pg/ml
Despues de 24 horas de tratamiento, los modelos de tejidos se fijaron en paraformaldehido (Sigma) al 4% durante 3 horas a 40°C y se lavaron 4 veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma). A continuacion, las 5 muestras se trataron hasta un gradiente de sacarosa de desde 0,6 M hasta 2,3 M con incubaciones de 3 horas a temperature ambiente. Despues de la ultima incubacion, los modelos de tejidos se embebieron en el compuesto Tissue Teck OCT. Las secciones de tejido congeladas de aproximadamente 10 pm de espesor se cortaron usando un criomicrotomo (Leica, CM3050), se recogieron sobre portaobjetos recubiertos y finalmente se almacenaron a - 20°C.
10 La expresion de conexinas espedficas se evaluo mediante inmunohistoqmmica con anticuerpos primarios espedfi- cos y un anticuerpo secundario marcado mediante fluorescencia. Los portaobjetos descongelados se fijaron con solucion congelada de acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuacion, se lavaron con PBS. Los sitios no espedficos se saturaron con suero de cabra normal al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de lavado con Tween al 0,2% en PBS, los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios (an- 15 ticuerpo Anti-Conexina 37/GJA4 y 59/GJA10 (Abcam), diluido en suero de cabra al 10% en PBS) en una camara humidificada a temperatura ambiente durante 2 horas. Al final de la incubacion, los portaobjetos se lavaron con Tween al 0,2% en PBS y se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor®488 Goat (Invi- trogen, colorante de emision de fluorescencia verde) 1 hora a temperatura ambiente en una camara humidificada oscura. Despues de lavado con PBS, las secciones se montaron en un reactivo anti-decoloracion Gold prolongado 20 con Dapi (Invitrogen).
Las observaciones microscopicas se llevaron a cabo con un microscopio de fluorescencia Zeiss y con la camara asociada se tomaron fotograffas de cada condicion. A partir de cada imagen de fluorescencia de las conexinas, los valores de ID (Densidad Integrada es el producto del area y del valor gris medio) se cuantificaron y normalizaron para control. Al menos se recogieron 12 imagenes representativas de cada condicion y se analizaron con el software 25 ZEN (Zeiss). El valor representa la media de 3 experimentos independientes.
Los resultados obtenidos con respecto al RHE de control basal bajo condiciones menopausicas (100%) se muestran en la Tabla 13.
Tabla 13
Protema conexina
RHE no menopausica Niveles de protema (%) RHE menopausica tratada con exopolisacarido Niveles de protema (%)
Protema Cx59
135,4 144,0
Protema Cx37
156,1 167,2
30 Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion restablece los niveles de conexina en el RHE meno- pausico a condiciones no menopausicas.
Ejemplo 10: Efecto del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con nume- ro de deposito LMG P-28571 sobre la comunicacion celula a celula epidermica-dermica en modelo menopau- sico
35 El envejecimiento reduce el proceso de comunicacion entre celulas. La diaforna entre fibroblastos y queratinocitos es esencial para la regeneracion, reparacion y crecimiento de la piel, e implica la actividad de un cierto numero de men-
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sajeros tales como factores de crecimiento y citocinas. Los queratinocitos son la fuente primaria de factores de cre- cimiento, los cuales pueden estimular no solamente los propios queratinocitos, sino tambien fibroblastos a traves de la senal paracrina y afectan en gran medida la constitucion molecular de la matriz extracelular (ECM) (Werner S, Krieg T, Smola H. “Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing”. J. Invest. Dermatol. Vol. 127 (n° 5), pags 998-1008, (Mayo 2007). En este estudio, los presentes autores tienen el objetivo en primer lugar de mostrar que la disminucion hormonal podna reducir la comunicacion paracrina entre queratinocitos y fibroblastos afectando con ello la smtesis de la matriz extracelular. El efecto del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, entre la comunicacion de queratinocito-fibroblasto menopausico se evaluo y comparo con la comunicacion de queratinocito-fibroblasto no mnopausico. La expresion de las protemas de matriz en fibroblastos tratados con sobrenadante procedente de queratinocitos menopausicos y con sobrenadante procedente de queratinocitos no menopausicos se analizo mediante PCR cuantitativo.
Las celulas de queratinocitos epidermicos humanos (HEKa) (Aplicaciones de celulas) procedentes de un donante de 19 anos de edad se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 5x103 celulas/cm2 en Epilife suplemen- tado con EDGS (Gibco) y las celulas de fibroblasto dermico humano de adulto (HDFa) procedentes de un donante de 18 anos de edad se desarrollaron en matraces de 75 cm2 a una densidad de 7-8x103 celulas/cm2 en medio 106 suplementado con LSGS (GIBCO) a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2 durante 7 dfas. Despues de este tiempo, las HEKa se desdoblaron y, a continuacion, se sembraron para tratamiento. Las celulas HEKa se sembraron a una densidad de 8,5x105 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos en Epilife suplementado con EDGS al 0,1%. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro. A continuacion, para estimular las condiciones menopausicas, los queratinocitos se incubaron con hormonas menopausicas y con 0,02 mg/ml del exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, y con medio unicamente con hormonas menopausicas como un control basal. Tres pocillos de estas celulas se incubaron con hormonas no menopausicas como un control positivo. Las condiciones de incubacion fueron de 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas. Todos los tratamientos se realizaron en tres pocillos por conjunto de condiciones de cultivo. Las celulas HDFa se sembraron a una densidad de 1,5x106 celulas/pocillo en matraces de 25 cm2. Despues de 24 horas de incubacion a 37°C en aire humidificado con 5% de CO2, el medio se retiro y las celulas HDFa se incubaron con los sobrenadantes de los cultivos de queratinocitos.
Las concentraciones de hormonas para las condiciones no menopausicas y menopausicas se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14
Hormonas
Concentracion para condiciones no menopausicas Concentracion para condiciones menopausicas
p-Estradiol
750 pM 60 pM
Progesterona
60 nM 6 nM
Deshidroepiendrosterona
20 nM 2 nM
Hormona del crecimiento humano
0,005 jg/ml 0,0015 jg/ml
Factor 1 de crecimiento tipo insulina
0,2 jg/ml 0,1 jg/ml
Despues de 24 horas de incubacion, las HDFa se lisaron directamente en los pocillos siguiendo el protocolo descrito en el kit RNeasy Mini (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas lisadas se homogeneizaron y las RBasas se inactivaron. El ADN genomico se separo de las muestras usando columnas de centrifugacion gDNA Eliminator. A continuacion, las muestras se pasaron a traves de columnas de union de ARN especiales y, despues de varios lavados de microcentrifugacion para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluyo con 50 |jl de agua ultrapura. La cuantificacion y analisis de pureza de las muestras de ARN se llevo a cabo despues de elucion del ARN con un biofotometro. Se retrotranscribio 1 jg de ARN de alta calidad con iScript advanced (BioRad) en un volumen final de 20 jl. La mezcla de reaccion completa se incubo en un ciclador termico (Eppendorf) a 42°C durante 30 minutos, la reaccion se interrumpio a 85°C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifico mediante qPCR en un termociclador PCR de tiempo real (BioRad) usando supermezcla SYBRgreen (BioRad) en el panel de 96 pocillos predisenado de matriz extracelular para uso con SYBR® Green (BioRad). El SYBR Green se une a las moleculas de ADN de doble hebra y emite fluorescencia que es cuantificada y es proporcional a la canti- dad del producto en la reaccion de PCR. Las condiciones de ciclado en el instrumento BioRad CFX96 fueron de 95°C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 5 segundos, reasociacion y alar- gamiento a 60°C durante 30 segundos. Como controles endogenos se usaron GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato
deshidrogenasa), TBP (protema de union de caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforibosiltransferasa 1). El cambio de numero de veces con relacion a la expresion de los genes de la muestra y los genes de referencia se calculo usando el procedimiento de expresion normalizada (AA(Ct)), con valores de umbral de defectos usando el CFX Manager Software (BioRad).
5 Los resultados obtenidos con respecto al control basal de HDFa tratados con sobrenadante procedente de quera- tinocitos menopausicos (100%) se muestran en la Tabla 15. El valor representa el dato de un experimento.
Tabla 15
Sfmbolo
Nombre del gen HDFa tratado con sobrena- dante procedente de quera- tinocitos no menopausicos HDFa tratado con sobrenadante procedente de queratinocitos menopausicos tratados con exopolisacarido
Niveles relativos (%) Niveles relativos (%)
ACTN1
Actinina, alfa 1 126,5 137,3
COL11A1
Colageno, tipo XI, alfa 1 130,2 122,6
COL12A1
Colageno, tipo XII, alfa 1 126,1 123,7
COL16A1
Colageno, tipo XVI, alfa 1 146,0 148,2
COL6A2
Colageno, tipo VI, alfa 2 127,3 127,6
COL7A1
Colageno, tipo VII, alfa 1 192,6 149,4
HAS1
Hialuronano sintasa 1 197,6 156,9
ICAM1
Molecula 1 de adhesion intercelular 123,7 200,0
ITGA5
Integrina, alfa 5 132,8 132,5
ITGA7
Integrina, alfa 7 141,4 122,9
ITGA8
Integrina, alfa 8 119,1 175,4
ITGAV
Integrina, alfa V 121,6 134,1
ITGB5
Integrina, beta V 120,2 136,6
LAMB3
Laminina, beta 3 152,6 196,9
LAMC1
Laminina, gamma 1 138,6 121,2
TGFB1
Factor de crecimento de transformacion, beta- inducido, 68kDa 137,4 126,6
THBS3
Trombospondina 3 216,6 117,9
TLN!
Talina 1 136,2 135,7
VCAN
Versican 121,6 117,9
VTN
Vitronectina 499,8 242,3
MMP13
Matrix metalopeptidasa 13 41,1 29,1
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion sobre-regula genes implicados en la smtesis de la 10 matriz extracelular y sub-regula genes implicados en la degradacion de la matriz extracelular (MMP13) en fibroblas- tos tratados con sobrenadante procedente de queratinocitos menopausicos.
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Ejemplo 11: Estudio del incremento de la acumulacion de lipidos en preadipocitos subcutaneos humanos primarios producidos por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571
Una alteracion de la piel relacionada con la edad es una reduccion en la grasa subcutanea. La comunicacion interce- lular de uniones comunicantes (GJIC) parece jugar un papel importante en el proceso de adipogenesis, el proceso por el cual los preadipocitos pasan a ser adipocitos en la masa de grasa.
La cuantificacion de la adipogenesis se evaluo con el reactivo de ensayo de adipogenesis AdipoRed™ (Lonza). El incremento de la acumulacion de lfpidos se determino midiendo la senal de fluorescencia de Rojo Nilo en preadipocitos subcutaneos humanos primerios despues de tratamiento con exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 en medio de diferenciacion de adipocitos. Las celulas tratadas con medio de diferenciacion de adipocitos solamente se usaron como control basal.
Preadipocitos humanos (procedentes de un donante de 22 anos de edad) (ZENBIO) se sembraon (13.000 celu- las/pocillo, 5 pocillos por condicion) en'placas transparentes de 96 pocillos en medio de desarrollo de preadipocitos (ZENBIO). La celulas se incubaron durante 24 horas a 37°C en una atmosfera saturada en agua de 95% de aire y 5% de CO2. Despues de la incubacion, el medio se retiro y las celulas se incubaron con exopolisacarido producido por la cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 0,02 mg/ml en medio de diferenciacion de adipocitos (ZENBIO) (con el fin de inducirla diferenciacion de preadipocitos en adipocitos) durante 8 dfas a 37°C y 5% de CO2. En el control basal, los preadipocitos se trataron unicamente con el medio de diferenciacion de adipocitos. Como un control negativo, los preadipocitos se trataron con el medio de diferenciacion de adipocitos y cafema.
La cuantificacion de la acumulacion de lfpidos se llevo a cabo mediante ensayo con el reactivo AdipoRed™ (Lonza). Siguiendo las instrucciones del fabricante, las celulas de preadipocitos diferenciadas para cada condicion se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con calcio y magnesio (Sigma) y se agrego reactivo AdipoRed diluido. Tras completarse la adicio de reactivo, las celulas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuacion, la fluorescencia de los lfpidos neutros se midio usando el lector ClarioStar (S/N 430-01109) (BMG) con longitudes de onda de excitacion y emision de 485 nm y 530 nm, respectivamente. Se calculo el porcentaje de acumulacion de lfpidos normalizados comparada con el control basal.
Los resultados obtenidos, con respecto a las condiciones basales (100%), se muestran en la Tabla 16. El valor re- presenta la media de 3 experimentos independientes.
Tabla 16
Producto
Concentracion % de acumulacion de lfpido frente a control basal
Exopolisacarido
0,02 mg/ml 117,93
Cafema 200 pg/ml
2,5 pg/ml 87,50
Los resultados muestran que el exopolisacarido de la invencion incrementa los porcentajes de acumulacion de lfpido intracelular durante el proceso adipogenico en cultivos de preadipocitos subcutaneos humanos.
Aunque se han mostrado ciertas realizaciones y detalles representativos con el fin de ilustrar el sujeto de la invencion, resultara evidente para los expertos en la tecnica que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del ambito del sujeto de la invencion. A este respecto, el alcance de la invencion esta unicamente limitado por las reivindicaciones siguientes.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
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    REIVINDICACIONES
    1. Uso del extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalia para tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas.
  2. 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membrana mucosa, cabello y/o unas es un tratamiento de estimulacion de smtesis de colageno, tratamiento y/o prevencion de envejecimiento de la piel, tratamiento y/o prevencion de arrugas de la piel, tratamiento para mejorar la firmeza de la piel y/o para la prevencion de la perdida de firmeza de la piel, tratamiento y/o prevencion de la piel seca, labios agrietados, caspa, cabello seco, cabello y/o unas quebradizas.
  3. 3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membrana mucosa, cabello y/o unas incrementa el nivel de conexinas en la piel.
  4. 4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina tiene un peso molecular de al menos 10 kDa.
  5. 5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el extracto de fermento producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina contiene al menos un exopolisacarido.
  6. 6. Uso del exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina para el tratamiento cosmetico, no terapeutico y/o cuidado de la piel, membranas mucosas, cabello y/o unas.
  7. 7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que el exopolisacarido contiene los monosa- caridos rahmnosa, galactosa, glucosa, mannosa y D-glucosamina.
  8. 8. Uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el exopolisacarido tiene una composicion en peso de 0,5% a 45% de rahmnosa, 0,1% a 25% de galactosa, 0,5% a 30% de mannosa, 50% a 95% para la suma de glucosa y D-glucosamina, 0% a 10% de fucosa y 0% a 12% de acido glucuronico, con la condicion de que la suma de los porcentajes no exceda de 100%.
  9. 9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la cepa de la especie Halomonas eurihalina es una cepa de la especie Halomonas eurihalina con numero de deposito LMG P-28571.
  10. 10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el tiempo de retencion del exopolisacarido producido por una cepa de Halomonas eurihalina esta entre 4 y 8,5 minutos en un analisis de HPLC con una columna cromatografica para cromatograffa acuosa de exclusion por tamano, con un tamano de partmula de 8 pm, un tamano de poro de 50 A y una longitud/diametro interno de 300 mm x 7,5 mm y acetato sodico 0,1 M en agua como eluyente con un caudal de 0,8 ml/min.
  11. 11. Composicion cosmetica que comprende una cantidad eficaz cosmeticamente de un extracto de fermento o exopolisacarido producido por una cepa de la especie Halomonas eurihalina, y al menos un excipiente y/o in- grediente aceptable cosmeticamente.
  12. 12. Composicion cosmetica de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que el extracto de fermento se incorpora dentro de un sistema de administracion cosmetica y/o sistema de liberacion sostenido o es absorbido en un po- lfmero organico solido o soporte mineral solido.
  13. 13. Composicion cosmetica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que la composicion se presenta en una formulacion seleccionada entre el grupo formado por cremas, emulsiones multiples, solu- ciones, cristales lfquidos, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, balsamos, espumas, lociones, geles, geles de cremas, soluciones hidroalcoholicas, soluciones hidroglicolicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champus, acondicionadores, sueros, pelmulas polisacaridas, unguentos, cremas batidas, po- madas, polvos, barras, lapices, esprais o aerosoles.
  14. 14. Composicion cosmetica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, la cual se incorpora en una tela, tela no tejida o dispositivo medico.
  15. 15. Composicion cosmetica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que el excipiente y/o ingrediente aceptable cosmeticamente esta seleccionado entre el grupo formado por agentes que inhiben la exocitosis neuronal, agentes anticolinergicos, agentes que inhiben la contraccion muscular, agentes anti- envejecimiento, agentes anti-arrugas, humectantes, substancias que retinen la humedad, alfa hidroxi acidos, beta hidroxi acidos, humectantes, agentes estimuladores de la smtesis de macromoleculas dermicas o epider- micas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradacion, agentes estimuladores de la smtesis de colageno, agentes estimuladores de la smtesis de elastina, agentes estimuladores de la smtesis de decorina, agentes estimuladores de la smtesis de laminina, agentes estimuladores de la smtesis de defensina, agentes estimuladores de la smtesis de chaperona, agentes estimuladores de la smtesis de cAMP, agentes que modulan la AQP- 3, agentes que modulan la smtesis de aquaporina, protemas procedentes de la familia de la aquaporina, agentes estimuladores de la smtesis de acido hialuronico, agentes estimuladores de la smtesis de glucosaminoglu-
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    cano, agentes estimuladores de la smtesis de fibronectina, agentes estimuladores de la smtesis de sirtuina, protemas de choque termico, agentes estimuladores de la smtesis de protemas de choque termico, agentes que reducen la cantidad de nocturnina, agentes inhibidores de la expresion de nocturnina, agentes lipoltticos o agentes simuladores de la lipolisis, agentes venotonicos, agentes moduladores de la expresion de PGC-1a, agentes inhibidores de la actividad de PPARy, agentes que reducen el contenido en triglicerido de adipocitos, agentes anti-celulitis, agentes retardadores de la diferenciacion de lipocitos, agentes que disminuyen la produc- cion de sebo, agentes anti-seborreicos, agentes matificantes, agentes anti-acne, agentes anti-transpirantes, agentes anti-inflamatorios y/o analgesicos, agentes anti-escozores, agentes calmantes, agentes anestesicos, inhibidores de la agregacion de receptores de acetilcolina, agentes que inhiben la acetilcolinesterasa,, agentes relajantes de la piel, agentes estimuladores o inhibidores de la smtesis de melanina, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes auto-bronceado, agentes inhibidores de la NO-sintasa, agentes inhibidores de la 5a-reductasa, agentes inhibidores de la lisil-y/o propil-hidroxilasa, antioxidantes, puri- ficadores de radicales libres y/o agentes contra la polucion atmosferica, purificadores de especies carbonilo reactivas, agentes anti-glucacion, agentes antihistamina, agentes antivmicos, agentes antiparasitarios, emulsifi- cadores, emolientes, disolventes organicos, propulsores lfquidos, acondicionadores de la piel, enzimas hidrolfti- cas epidermicas, vitaminas, aminoacidos, protemas, pigmentos o colorantews, tintes, biopolfmeros, polfmeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, agentes suavizantes, emulsificadores, agentes aglomerantes, conser- vantes, agentes capaces de reducir o tratar las bolsas de debajo de los ojos, agentes exfoliantes, agentes que- ratolfticos, agentes desescamantes, agentes antimicrobianos, agentes antihongos, agentes fungistaticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostaticos, agentes estimuladores de la smtesdis de componentes del estrato corneo, ceramidas, acidos grasos, agentes que inhiben la degradacion del colageno, agentes que inhiben las metaloproteinas de la matriz, agentes que inhiben la degradacion de elastina, agentes que inhiben las serina proteasas, agentes estimuladores de la proliferacion de fibroblastos, agentes estimuladores de la proliferacion de queratinocitos, agentes estimuladores de la proliferacion de melanocitos, agentes estimuladores de la dife- renciacion de queratinocitos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedoltticos, agentes anti-psoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, agentes protectores de celulas madre, estabilizadores, agentes para el tratamiento y/o cuidado de piel sensible, agentes reafirmantes, agentes anti-marcas de estira- mientos, agentes astringentes, agentes que inhiben la actividad de PAR-2, agentes estimuladores de la cicatri- zacion de heridas, agentes coadyuvantes de la cicatrizacion de heridas, agentes estimuladores de la re- epitelizacion, agentes coadyuvantes de la re-epitelizacion, factores de crecimiento de citocina, agentes que ac- tuan sobre la circulacion y/o microcirculacion capilar, agentes estimuladores de la angiogenesis, agentes que inhiben la permeabilidad vascular, agentes que actuan sobre el metabolismo de la celula, agentes para mejorar la union dermica-epidermica, agentes inductores del crecimiento del cabello, agentes inhibidores o retardantes del crecimiento del cabello, agentes inhibidores de la cafda del cabello, conservantes, perfumes, producto cos- meticos y/o absorbentes y/o desodorantes enmascaradores de olores corporales, agentes quelantes, extractos de plantas, aceites esenciales, extractos marinos, agentes obtenidos a partir de procesos biotecnologicos, sales minerales, extractos de celulas, cremas solares y agentes fotoprotectores organicos o minerales activos contra los rayos ultravioleta A y/o B y/o rayos infrarrojos A, o mezclas de los mismos.
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