CN115252649B - 嗜热菌发酵产物在防脱发和/或生发中的用途、组合物及其制剂 - Google Patents

嗜热菌发酵产物在防脱发和/或生发中的用途、组合物及其制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了嗜热栖热菌发酵产物在制备防脱发和/或生发方面的制剂中的用途。本发明还提供了一种防脱发和/或生发组合物及制剂。嗜热栖热菌发酵产物可以深入毛囊内部发挥作用，为毛囊补充ATP，帮助激活毛囊内的多种新陈代谢活动，在调控毛囊发育的关键信号通路Wnt‑β连环蛋白信号通路和促进毛发再生方面有显著的效果，尤其是可以预防因雄激素刺激造成的毛囊生长过程中关键信号通路受阻以及毛囊细胞的活性下降，可以作为制品或添加剂应用于头皮护理产品和/或头皮洗护产品，发挥促生发的功效。另外，本发明的嗜热栖热菌发酵产物在使用时是安全的，可以避免常规防脱生发药物给头皮带来的刺激和不适感，依从性高，可以长期使用。

Description

嗜热菌发酵产物在防脱发和/或生发中的用途、组合物及其 制剂
技术领域
本发明属于日化用品技术领域，尤其涉及一种嗜热菌发酵产物在防脱发和/或生发中的用途、组合物及制剂。
背景技术
目前最常见的脱发类型主要有以下几类：
第一类是雄激素源性脱发（AGA），是临床上进行毛发咨询最常见原因之一。引起AGA除遗传因素外主要有以下几种原因：5α-还原酶的活性过高、雄激素受体表达增加、真菌细菌感染及皮肤炎症、毛囊的氧化作用等造成的毛囊非瘢痕性进行性微小化，并伴随生长期缩短，从而导致终毛向毳毛的逐渐转变；
第二类是休止期脱发（AE），是最常见的脱发疾病之一，常具有发病诱因。引起休止期脱发主要有以下几种因素：生理性（产后、新生儿脱发、季节性脱发），疾病相关性（发热后及感染），压力性（严重创伤、大手术、巨大心理压力、剧烈运动），营养性（营养不良、速效饮食），局部因素（毛发移植、接触性皮炎、头皮炎症、头皮感染）等，最终表现为生长期提前停滞和缩短以及细胞过早凋亡。
通过上述两类常见脱发类型的发病机制和表现可知，脱发主要是由于毛囊细胞活性受损，使得毛囊生长周期发生改变，提前进入退行期。为了对抗脱发，常见的措施是预防毛囊细胞活性受损和预防毛囊生长周期变短：如阻断雄激素对毛囊的刺激（抑制5-α还原酶活性，抑制雄激素受体的活性），增强毛囊对雄激素的抵抗力（激活细胞新陈代谢能力，帮助合成更多角蛋白或者细胞外基质中关键成分，增加毛囊体积），抑制微炎症对毛囊细胞的刺激（如1L-1β，1L-6，1L-8等炎症因子的过度表达），阻断毛囊生长周期变短等（抑制TGF-β2凋亡因子的表达）。
在脱发类型中，雄激素源性脱发（AGA）是临床上最为常见的脱发性疾病，约占脱发的90%，所以相应的治疗药物和治疗仪器手段等应运而生。目前，《中国人雄激素性脱发诊疗指南》中提到的常见治疗方法有：非那雄胺、螺内酯、米诺地尔、毛发移植、PRP和LLLT激光。其中治疗雄激素性脱发常用的化学生发剂药物米诺地尔、非那雄胺等，效果疗效较好，但副作用明显，米诺地尔会导致头皮发干、头屑、头皮红斑、炎症、刺激等，并且会影响血压，非那雄胺具有男性荷尔蒙活性抑制作用；另外医美植发也是一种常见的治疗手段，毛发移植是将非脱发区域（如后枕部、胡须、腋窝等）的毛囊提取并处理后再移植至脱发或秃发区域，以达到外形美观的方法，此种治疗手段，虽然可以快速看到疗效，但形成的手术创伤大，患者恢复时间长，而且费用较高。
LLLT低能量激光治疗是最新流行起来的辅助治疗方法，此方法已被FDA批准用于治疗AGA，并相继开发了多种形式的市售家用产品，其主要原理是通过将光束传递到头皮，甚至穿透表皮层，进而改善毛囊微环境，激活线粒体功能，上调生长因子，从而促进细胞新陈代谢，减缓雄激素对毛囊造成刺激（Mahyar Ghanaat，Southern Medical Journal，2010，103（9）:917-921）；另外，还有研究表明，LLLT治疗后头皮局部炎症减轻，这种作用机制可以预防毛囊提前进入退行期，减缓毛发脱掉。但这种长期激光使用，会造成头皮的光敏性（Antonella Tosti et al,实用毛发与头皮疾病治疗）。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嗜热菌发酵产物在防脱发和/或生发中的用途、组合物及制剂，该嗜热菌发酵产物可以预防因雄激素刺激造成的毛囊生长过程中关键信号通路受阻以及毛囊细胞的活性下降，防脱发效果优于米诺地尔。
本发明提供了一种嗜热栖热菌发酵产物在制备预防和/或治疗脱发的制剂中的用途。
本发明还提供了一种嗜热栖热菌发酵产物在制备促进毛发生长的制剂中的用途。
具体而言，本发明提供了嗜热栖热菌发酵产物防脱发和/或生发方面的用途。实验结果表明：
（1）嗜热栖热菌发酵产物能够显著下调毛乳头细胞中 IL-1β和1L-6 含量，有效对抗因雄激素（DHT）刺激造成的真皮毛乳头细胞产生的炎症，抑制炎症反应诱导的毛乳头细胞凋亡，从而防治脱发；
（2）嗜热栖热菌发酵产物能够显著下调毛乳头细胞TGFβ2 基因的表达，抑制因雄激素刺激毛乳头细胞造成的凋亡因子-TGFβ2的过度表达，从而抑制脱发，效果优于米诺地尔；
（3）嗜热栖热菌发酵产物在5%的浓度范围内对表皮层角质形成细胞和真皮层成纤维细胞没有明显的细胞毒性，不会对头皮产生刺激；
（4）嗜热栖热菌发酵产物在不同浓度梯度下（1%，5%）可以显著下调角质形成细胞1L-8含量，有效对抗角质形成细胞的炎症，从而减少毛囊脱落，防治脱发；
（5）嗜热栖热菌发酵产物可以有效促进成纤维细胞促进I型胶原蛋白的生成，进而可以补充毛囊细胞外基质，帮助增加毛囊体积，强固毛发，增强毛囊对雄激素的抵抗力，预防脱发；
（6）嗜热栖热菌发酵产物可以显著促进Wnt/β-连环蛋白信号通路中β-catenin 基因的表达，从而有效激活毛囊发育的关键调控通路，最终帮助毛发的再生；
（7）嗜热栖热菌发酵产物可以有效恢复因雄激素刺激造成的毛乳头细胞增殖活性受影响的状况，且随着时间增加，毛乳头细胞的细胞增殖率逐渐增加，到72h时，毛乳头细胞的增殖率达到12.61%，甚至优于明星药物成分米诺地尔。
在本申请的一个实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物包括嗜热栖热菌发酵滤液、胞内物、细胞壁和具有F0F1ATP合成酶属性的跨膜蛋白中的一种或多种。含有F0F1ATP合成酶的跨膜蛋白即分子马达。
在一个实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物可以按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌培养至对数生长期后期后，将收集的菌液冷冻，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物。
本发明首先将嗜热栖热菌进行培养，本发明对所述嗜热栖热菌没有特殊限制，可以为嗜热栖热菌ATCC27502、嗜热栖热菌HB27或嗜热栖热菌ATCC33923等，优选为嗜热栖热菌HB27。首先将嗜热栖热菌在培养基中进行培养，本发明对所述培养基的组成没有特殊限制，根据所选用的菌株进行选择即可，例如培养基可以包括：1g酵母抽提物、1g胰蛋白胨、1.3g（NH4）2SO4、0.247gMgSO4·7H2O、0.28g KH2PO4、0.074g CaCl2·4H2O、0.019gFeCl3·6H2O、1mL盐溶液、1L蒸馏水。本发明对所述培养的条件没有特殊限制，例如50~65℃，100~200rpm条件下进行培养。
培养至对数生长期后期后，将收集的菌液冷冻，优选在-80℃下冷冻然后，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物。
在一些实施例中，所述缓冲液包括：
1~80nM tris.HCl；
0.1~5.0mM β-巯基乙醇；
0.1~2nM EDTA；
0.1~0.5M 蔗糖；
1~10mM MgCl2。
在一些实施例中，所述缓冲液包括：
80nM tris.HCl；
1.0 mM β-巯基乙醇；
0.1 mM EDTA；
0.25M 蔗糖；
4 mM MgCl2。
在提取过程中，可以采用超声波处理，本申请对所述超声波处理的参数没有特殊限制，本领域技术人员可以根据需要进行调整。本发明对所述嗜热栖热菌发酵产物并无特殊限制，可以按照上述方法制备，也可以从市场上购买，例如购自优玛达公司的市售产品POLARKI®。
具体而言，所述制剂可以为药物或者日化用品，日化用品包括化妆品、护肤品、洗发水等。
本发明还提供了一种防脱发和/或生发组合物，包括：嗜热栖热菌发酵产物和第二防脱固发活性成分。所述嗜热栖热菌发酵产物与其他具有防脱固发功效的活性成分可以组合使用，共同发挥防脱发和/或生发的功效。
在一些具体实现方式中，所述第二防脱固发活性成分可以选自血管舒张剂、5α-还原酶抑制剂、雄激素受体拮抗剂、消炎抑菌剂、钾离子通道开放性剂、赖氨酸羟化酶抑制剂、抗氧化应激损伤剂、调控皮脂分泌剂、滋养毛囊剂、植物提取物或固发剂中的一种或多种。其中，所述血管舒张剂选自柚皮素、辣椒碱、6-姜酚、胡芦巴碱和葛根黄酮中的一种或几种；
所述5α-还原酶抑制剂类选自PCA锌、肌氨酸、石竹素、辛酰甘氨酸、山萘酚、齐敦果酸、植物鞘氨醇、鹰角豆素a和锯棕榈中的一种或几种；
所述雄激素受体拮抗剂选自槲皮素、苦参碱、黄芩苷和亚油酸中的一种或几种；
所述消炎抑菌剂选自积雪草提取物、积雪草苷、羟基积雪草甙、甘草类提取物、甘草酸二钾、甘草亭酸、乳酸菌发酵溶胞产物、乳酸杆菌发酵产物、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物、芽孢杆菌发酵产物、菊粉和葡聚糖寡糖中的一种或几种；
所述钾离子通道开放性剂选自吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物；
所述赖氨酸羟化酶抑制剂选自二氨基嘧啶氧化物；
所述抗氧化应激损伤剂选自植物多酚类、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷（EGCG）、姜黄素、四氢姜黄素类和2,4-二乙基吡啶羧酸（斯坦莫辛）中的一种或几种；
所述调控皮脂分泌剂选自水杨酸、白柳树皮提取物、视黄酸及其衍生物、视黄醇和视黄酯类中的一种或几种；
所述滋养毛囊剂选自维生素、腺苷、精氨酸、水解玉米蛋白和外源性补充ATP类中的一种或几种；
所述植物提取物选自具有防脱发和/或生发功效的姜根、生姜、人参、旱金莲、知母、黄柏、熟地黄、当归、何首乌、川芎、灵芝和咖啡因中的一种或几种；
所述固发剂选自乙酰基四肽-3、肉豆蔻酰五肽-17、肉豆蔻酰六肽-16、肉豆蔻酰五肽-4、生物素三肽-1、蓝铜胜肽、三肽-1和八肽-2中的一种或几种。
申请人创造性的发现，嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3联合使用能够起到协同增效的作用，相比于其单独使用，在对TGFβ2 基因的表达的下调、促进内皮生长因子（VEGF）的表达和促进毛乳头细胞的增殖等方面具有显著性差异。
本发明还提供了一种组合物，包括嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为10:1~1：10。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为1:7~4:1。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为1:5~2:1。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为2：1或1:5。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为3125：1562。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为3125：15620。
本发明还提供了一种防脱发和/或生发制剂，包括嗜热栖热菌发酵产物和辅料。
具体而言，本发明提供的防脱发和/或生发制剂适用于皮肤表面，优选为头皮外表面，可以为洗去型或驻留型，例如，可以为头皮护理产品或头皮洗护产品等日化用品。
在一个实施例中，所述防脱发和/或生发制剂为头皮护理液，例如将嗜热栖热菌发酵产物分散于醇-水混合体系，其典型配方可以包括：
0.01wt%~30wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
10wt%~70wt%的水；
10wt%~70wt%的醇。
其中，醇可以为乙醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、1,2-己二醇和1,2-戊二醇中的一种或多种。
在另外一些实施例中，头皮护理液的配方包括：
40~70wt%的水；
20~30wt%的乙醇；
1~10wt%的丁二醇；
1~10wt%的1,2-戊二醇；
0.1~15wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
0.1~1wt%的泛醇；
0.01~0.5wt%的甘草酸二钾；
0.01~0.5%的焦亚硫酸钠；
0.001~0.1wt%的乳酸；
0.001~0.01wt%的苦橙叶油或苦橙嫩枝油。
在另外一些实施例中，头皮护理液的配方包括：
40~70wt%的水；
20~30wt%的乙醇；
1~10wt%的丁二醇；
1~10wt%的1,2-戊二醇；
0.3~10wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
0.1~1wt%的泛醇；
0.01~0.5wt%的甘草酸二钾；
0.01~0.5%的焦亚硫酸钠；
0.001~0.1wt%的乳酸；
0.001~0.01wt%的苦橙叶油或苦橙嫩枝油。
使用上述头皮护理液产品，D28、D14相比D0，头发脱落显著得到缓解，脱发下降率分别为21.76%、34.12%，明显优于对照组，脱发变化率分别为5.56%、-6.17%，由此可见，上述头皮护理液具有显著的防脱发效果。
在一些具体的实施例中，所述防脱发和/或生发制剂为洗发水。洗发水的一个典型配方包括：嗜热栖热菌发酵产物、水、表面活性剂、发用调理剂、pH调节剂、防腐剂、螯合剂、增稠剂等。其中，嗜热栖热菌发酵产物的含量为0.01~30wt%，优选为0.1~15wt%，最优选为0.3~10wt%。
其中，所述表面活性剂包括但不限于椰油基葡糖苷、椰油酰胺丙基甜菜碱、癸基葡糖苷、PEG-7 甘油椰油酸酯、椰油酰胺 MEA、月桂酰两性基乙酸钠、月桂醇聚醚-4、聚甘油-4癸酸酯、月桂酰谷氨酸钠、肉豆蔻酰谷氨酸钠、椰油酰甘氨酸钾、椰油酰氨基丙酸钠、十三烷醇聚醚-9、椰油酰羟乙磺酸酯钠、椰油酰羟乙磺酸酯钠、椰油酰谷氨酸二钠、椰油酰谷氨酸钠、月桂酰谷氨酸 TEA 盐、月桂酰谷氨酸钠、月桂酰肌氨酸钠、甲基椰油酰基牛磺酸钠、月桂基甲基葡糖醇聚醚-10、月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱、月桂酰燕麦氨基酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱和月桂醇聚醚硫酸酯钠中的一种或多种。
其中，所述防腐剂包括但不限于苯氧乙醇、苯甲酸钠、乙基己基甘油、辛酸甘油酯、尼泊金酯、对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸、山梨坦辛酸酯和月桂酰精氨酸乙酯盐酸中的一种或多种。
其中，所述发用调理剂包括但不限于低聚果糖、透明质酸酸、聚季铵盐-10，PCA锌、葡糖糖酸锌、丝氨酸、精氨酸、腺苷和甘氨酸中的一种或多种。
其中，所述增稠剂包括但不限于卡波姆钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶、纤维素卡波姆、聚丙烯酸钠接枝淀粉、淀粉辛烯基琥珀酸铝、小核菌（SCLEROTIUMROLFSSII）胶和氯化钠中的一种或多种。
其中，所述螯合剂包括但不限于EDTA 二钠、EDTA 四钠和植酸钠中的一种或多种。
其中，所述pH调节剂包括但不限于氢氧化钠、乳酸、柠檬酸、磷酸二氢钠和磷酸钠的一种或多种。
具体而言，防脱发和/或生发洗发水的一个典型组成包括：
40~70wt%的水；
10~30wt%的椰油酰胺丙基甜菜碱；
5~20wt%的月桂醇聚醚硫酸酯钠；
5~20wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
0.1~2wt%的透明质酸；
0.1~1wt%的苯甲酸钠；
0.1~1%的苯氧乙醇；
0.1~1wt%的乳酸；
0.1~1wt%的甘草酸二钾；
0.05~1wt%的聚季铵盐-10；
0.05~0.5wt%的EDTA二钠；
0.01~0.5wt%的香精；
0.001~0.05wt%的氯化钠。
本发明提供的洗发水在改善头皮瘙痒感、感知掉发有减少甚至得到缓解、感知头发更稳固不易脱落等维度的满意度打分，明显优于对照组，由此可见，上述洗发水具有显著的舒缓、防脱发等功能。
在一些实施例中，所述防脱发和/或生发制剂还包括第二防脱固发活性成分。所述第二防脱固发活性成分可以选自血管舒张剂、5α-还原酶抑制剂、雄激素受体拮抗剂、消炎抑菌剂、钾离子通道开放性剂、赖氨酸羟化酶抑制剂、抗氧化应激损伤剂、调控皮脂分泌剂、滋养毛囊剂、植物提取物或固发剂中的一种或多种。所述第二防脱固发活性成分可以参考上文所述，本发明在此不再赘述。
申请人创造性的发现，嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3联合使用能够起到协同增效的作用，相比于其单独使用，在对TGFβ2 基因的表达的下调、促进内皮生长因子（VEGF）的表达和促进毛乳头细胞的增殖等方面具有显著性差异。
本发明还提供了一种防脱发和/或生发制剂，包括嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为10:1~1：10。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为1:7~4:1。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为2：1或1:5。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为3125：1562。在一些实施例中，所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为3125：15620。
实验结果表明，嗜热栖热菌发酵产物可以深入毛囊内部发挥作用，其含有ATP合成酶，可以为毛囊补充ATP，帮助激活毛囊内的多种新陈代谢活动，在调控毛囊发育的关键信号通路Wnt-β连环蛋白信号通路和促进毛发再生方面有显著的效果，尤其是可以预防因雄激素刺激造成的毛囊生长过程中关键信号通路受阻以及毛囊细胞的活性下降，可以作为制品或添加剂应用于头皮护理产品和/或头皮洗护产品，发挥促生发的功效。另外，本发明的嗜热栖热菌发酵产物在使用时是安全的，可以避免常规防脱生发药物给头皮带来的刺激和不适感，依从性高，可以长期使用。
附图说明
图1为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞IL-1β 含量结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组；
图2为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞 IL-6 含量结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组；
图3为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组；
图4为嗜热栖热菌发酵产物A对角质形成细胞 MTT检测结果图；
图5为嗜热栖热菌发酵产物A对成纤维细胞 MTT检测结果图；
图6为嗜热栖热菌发酵产物A基于角质形成细胞1L-8含量结果汇总图；
图7为嗜热栖热菌发酵产物A基于成纤维细胞I型胶原蛋白α1含量结果汇总图，其中，其中，从左到右依次为24h和48h；
图8为β-catenin 基因检测结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组；
图9为细胞增殖检测结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组；
图10为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组、嗜热栖热菌发酵产物A组、乙酰基四肽-3组、嗜热栖热菌发酵产物A组+乙酰基四肽-3组（0.3125%+0.1562%）和嗜热栖热菌发酵产物A组+乙酰基四肽-3组（0.03125%+0.1562%）；
图11为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞VEGF 生长因子检测结果汇总图，其中，从左到右依次为BC组、NC组、PC组和嗜热栖热菌发酵产物A组、乙酰基四肽-3组和嗜热栖热菌发酵产物A组+乙酰基四肽-3组；
图12为细胞增殖检测结果汇总图，从左到右依次为BC组、NC组、PC组、嗜热栖热菌发酵产物A组、乙酰基四肽-3组、嗜热栖热菌发酵产物A组+乙酰基四肽-3组（0.3125%+0.1562%）和嗜热栖热菌发酵产物A组+乙酰基四肽-3组（0.03125%+0.1562%）。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例中，嗜热栖热菌发酵产物A按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌HB27（购买于美国ATCC物种库，保藏编号为BAA-163）按照1:100接入液体培养基中，60℃，150rpm培养至对数生长期后期，收集菌液；其中，液体培养基包括：1g酵母抽提物、1g胰蛋白胨、1.3g（NH4）2SO4、0.247gMgSO4·7H2O、0.28g KH2PO4、0.074gCaCl2·4H2O、0.019gFeCl3·6H2O、1mL盐溶液、1L蒸馏水；
将所述菌液经-80℃冷冻保存后，将500g菌液放入1L缓冲液（80mM tris.HCl，PH8.0，其中含1.0mM β-巯基乙醇，0.1 mM EDTA，0.25M蔗糖，4mM MgCl2）中悬浮，用超声波处理菌液使菌体破碎，得到嗜热栖热菌发酵产物A，所述嗜热栖热菌发酵产物A包括发酵滤液、胞内物和细胞壁。
嗜热栖热菌发酵产物B按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌ATCC33923（购买于美国ATCC物种库）按照1:100接入液体培养基中，60℃，150rpm培养至对数生长期后期，收集菌液；其中，液体培养基包括：1g酵母粉、1g胰蛋白胨、1.3g（NH4）2SO4、0.247gMgSO4·7H2O、0.28g KH2PO4、0.074g CaCl2·4H2O、0.019gFeCl3·6H2O、1mL盐溶液、1L蒸馏水；
将所述菌液经-80℃冷冻保存后，将500g菌液放入1L缓冲液（80mM tris.HCl，PH8.0，其中含1.0mM β-巯基乙醇，0.1 mM EDTA，0.25M蔗糖，4mM MgCl2）中悬浮，用超声波处理菌液使菌体破碎，得到嗜热栖热菌发酵产物B，所述嗜热栖热菌发酵产物B包括发酵滤液、胞内物和细胞壁。
实施例1
探究嗜热栖热菌发酵产物对毛乳头细胞的影响，尤其是对因雄激素(DHT)造成真皮毛乳头细胞过度产生的炎症因子的影响，即抗炎活性研究。
1.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、IL1β ELISA 试剂盒（Abcam）、IL-6 ELISA 试剂盒（Abcam）、无菌 ddH2O（Takara）；
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）。
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
1.2 方法与步骤
表1 基于毛乳头细胞评估抗炎功效测试方案
Figure DEST_PATH_IMAGE001
1）接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2）DHT 刺激及给药：根据表 1所示的测试方案，待 6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h， 48h 以及 72h，对于需要孵育 48h 以及 72h 的组别每天进行给药和换液操作；
3）ELISA 检测：孵育 24h 后，收集细胞上清液，根据 ELISA 试剂盒的操作说明书进行检测分析。
4）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD；各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
1.3 测试结果
结果参见表2、表3、图1和图2，其中，表2为基于毛乳头细胞 IL-1β 含量结果汇总表，表3为基于毛乳头细胞IL-6 含量结果汇总表，图1为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞IL-1β 含量结果汇总图，图2为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞 IL-6 含量结果汇总图。
表2 基于毛乳头细胞 IL-1β 含量结果汇总表
Figure 222637DEST_PATH_IMAGE002
备注：用 t-test 方法进行统计分析时，BC 组与 NC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为## ，样品组与 NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
表3 基于毛乳头细胞IL-6 含量结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE003
备注：用 t-test 方法进行统计分析时，BC 组与 NC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为## ，样品组与 NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**
与 BC 组相比，NC 组的 IL-1β和1L-6 含量显著升高，说明本次测试刺激条件有效。
与 NC 组相比，PC 组的 IL-1β和1L-6 含量显著下降，说明本次阳性对照测试有效。
与 NC 组相比，嗜热栖热菌发酵产物A的 IL-1β和1L-6 含量显著下降，下调率分别为 58.04%和38.67%；嗜热栖热菌发酵产物B的 IL-1β和1L-6 含量也显著下降。
由表2、表3、图1和图2可以看出，0.3125% 的嗜热栖热菌发酵产物可以有效对抗因雄激素（DHT）刺激造成的真皮毛乳头细胞产生的炎症，炎症反应会进一步加强毛囊损伤，诱发毛发脱落。因此，从抗炎维度可以得出，本发明提供的嗜热栖热菌发酵产物通过抑制 IL1β/IL-6 两种炎症因子的分泌，进而抑制炎症反应诱导的毛乳头细胞凋亡，最终可以预防因雄激素刺激造成的脱发。
实施例2
探究嗜热栖热菌发酵产物基于毛乳头细胞的影响，尤其是对因雄激素(DHT)刺激造成毛乳头细胞过度表达凋亡因子TGFβ2的影响，即生长因子活性研究。
2.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、RNAiso Plus（Takara）、反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent Kit）（Takara）、SYBR Premix Ex Taq™ II 荧光染料（Takara）、无菌 ddH2O（Takara）；
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）、普通 PCR 仪（博日）、荧光定量 PCR 仪（BioRad，CFX-96）；
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
2.2 方法与步骤
表4 基于毛乳头细胞评估防脱测试方案
Figure 202095DEST_PATH_IMAGE004
1) 接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2) HT 刺激及给药：根据表4所示的测试方案，待 6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺 激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h、48h 以及 72h，对于需要孵育 48h 以及 72h 的组别每天进行给药和换液操作；
3) 基因表达检测：培养 24h 后，收集细胞上清后，1mL/孔 PBS 清洗两次，每孔加入 1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。提取 RNA，反转录至 cDNA 后，进行荧光定量PCR 检测，采用 2 -△△CT方法进行结果计算。
4）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
2.3 测试结果
结果参见表5和图3，表5为基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总表，图3为嗜热栖热菌发酵产物A基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总图。
表5 基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE005
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时，将 BC组 mRNA 扩增倍数归一处理， NC 组与 BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##；PC 组和样品组与 BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组 TGFβ2 基因的表达明显上调，说明本次测试刺激条件有效；
与 NC 组相比，PC 组 TGFβ2 基因的表达明显下调，说明本次阳性对照测试有效；
与 NC 组相比，嗜热栖热菌发酵产物A对 TGFβ2 基因的表达有明显的下调作用，下调率为 18.81%；嗜热栖热菌发酵产物B对 TGFβ2 基因的表达也有明显的下调作用。
由表5和图3可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以显著抑制因雄激素刺激毛乳头细胞造成的凋亡因子-TGFβ2的过度表达。已知毛乳头细胞中在雄激素（DHT） 与雄激素受体（AR）的启动激活下分泌大量的 TGFβ 2， TGFβ 2 的分泌进一步会诱导毛囊表皮成份如毛基质细胞的凋亡，从而促进脱发现象的发生，因此抑制 TGFβ 2 的分泌可以达到抑制脱发的作用。由此可知从基因调控维度可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物通过抑制凋亡因子的表达进而发挥防脱的功效，且效果优于米诺地尔。
实施例3
探究嗜热栖热菌发酵产物基于表皮层角质形成细胞细胞活力的影响。
3.1 材料与试剂
人永生化角质细胞系Hacat，MEM培养基，噻唑蓝（MTT）溶液，CO2培养箱，96孔板，酶标仪；
嗜热栖热菌发酵产物A。
3.2 方法与步骤：
1）受试样品制备：选无菌生理盐水作为受试物溶剂，将嗜热栖热菌发酵产物配制成50%浓度的溶液或均匀混悬液，用0.22μm滤膜过滤除菌，再依次2倍稀释成若干梯度浓度的溶液或均匀混悬液，备用。
2）接种：细胞浓度为1×105/ml，按每孔100μL细胞悬液接种于96孔板，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
3）给药：在备好的细胞融合度达80%以上的96孔板中，往各孔中加入50ul的梯度受试样品，每个样品做3个复孔。
4）显色、测定：吸出样品溶液，用100μL磷酸盐缓冲液冲洗2次。然后每孔中加入100μl MTT（0.5mg/mL）溶液，放入37℃ 5%CO2培养箱中培养4h，吸出MTT溶液，加入100μL DMSO作用5min提取MTT甲瓒（室温暗室中操作），然后在多功能酶标仪中测定570nm处吸光度值(OD570值)。
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
3.3 测试结果
结果参见表6和图4，其中，表6为嗜热栖热菌发酵产物A对角质形成细胞 MTT检测结果，图4为嗜热栖热菌发酵产物A对角质形成细胞 MTT检测结果图。
表6 嗜热栖热菌发酵产物A对角质形成细胞 MTT检测结果
Figure 293416DEST_PATH_IMAGE006
由表6和图4可以看出，嗜热栖热菌发酵产物A基于表皮层角质形成细胞，在5%的浓度范围内，细胞活力在90%以上，即在5%浓度范围内没有明显的细胞毒性。由此可以得出，嗜热栖热菌作为一种具有防脱功效的原料（通过实施例1和实施2看出），即使在5%如此高的浓度下，依然未对表皮层的单细胞（角质形成细胞）产生细胞毒性，即可以证明本发明的嗜热栖热菌发酵产物是相对安全和温和的，不会对头皮产生刺激。
实施例4
探究嗜热栖热菌发酵产物对真皮层成纤维细胞细胞活力的影响
4.1 材料与试剂
人皮肤成纤维细胞HSF、原代细胞、DMEM/F12培养基、噻唑蓝（MTT）溶液、CO2培养箱，96孔板，酶标仪；
嗜热栖热菌发酵产物A。
4.2 方法与步骤：
1）受试样品制备：选无菌生理盐水作为受试物溶剂，将嗜热栖热菌发酵产物配制成50%浓度的溶液或均匀混悬液，用0.22μm滤膜过滤除菌，再依次2倍稀释成若干梯度浓度的溶液或均匀混悬液，备用。
2）接种：细胞浓度为1×105/ml，按每孔100μL细胞悬液接种于96孔板，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
3）给药：在备好的细胞融合度达80%以上的96孔板中，往各孔中加入50ul的梯度受试样品，每个样品做3个复孔。
4）显色、测定：吸出样品溶液，用100μL磷酸盐缓冲液冲洗2次。然后每孔中加入100μl MTT（0.5mg/mL）溶液，放入37℃ 5%CO2培养箱中培养4h，吸出MTT溶液，加入100μL DMSO作用5min提取MTT甲瓒（室温暗室中操作），然后在多功能酶标仪中测定570nm处吸光度值(OD570值)。
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD 各组间 比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
4.3 测试结果
结果参见表7和图5，表7为嗜热栖热菌发酵产物A对成纤维细胞 MTT检测结果，图5为嗜热栖热菌发酵产物A对成纤维细胞 MTT检测结果图。
表7 嗜热栖热菌发酵产物B对成纤维细胞 MTT检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE007
由表7和图5可以看出，嗜热栖热菌发酵产物基于真皮层成纤维细胞，在5%的浓度范围内，细胞活力在90%以上，即在5%浓度范围内没有明显的细胞毒性。由此可以得出，嗜热栖热菌作为一种具有防脱功效的原料（通过实施例1和实施2看出），即使在5%如此高的浓度下，依然未对真皮层的单细胞（成纤维细胞）产生细胞毒性，即可以证明本发明的嗜热栖热菌发酵产物是相对安全和温和的，不会对头皮产生刺激。
实施例5
探究不同浓度嗜热栖热菌发酵产物（1%和5%）对角质形成细胞抗炎的功效。嗜热栖热菌发酵产物可以有效抑制角质形成细胞分泌的过多炎症因子1L-8，毛囊的微炎症会进一步诱导毛乳头细胞的凋亡，进而导致毛发脱落。
5.1 材料与试剂
人永生化角质细胞系Hacat、MEM培养基、CO2培养箱，96孔板，酶标仪；
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
5.2 方法与步骤：
1）受试样品制备：选无菌生理盐水作为受试物溶剂，将嗜热栖热菌发酵产物配制成所需浓度的溶液或均匀混悬液，用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
2）接种：细胞浓度为1×105/ml，按每孔100μL细胞悬液接种于96孔板，（37℃，CO2）培养箱孵育，约3~4天后给药。
3）给药：在备好的细胞融合度达80%以上的96孔板中，开展给药操作。样品孔中加入受试样品，空白对照孔中加入受试物溶剂，每个样品做3个复孔，共培养48h。
4）ELISA 检测：孵育 48h 后，收集细胞上清液，根据 ELISA 试剂盒的操作说明书进行检测分析。
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
5.3 测试结果
结果参见表8和图6，表8为嗜热栖热菌发酵产物基于角质形成细胞1L-8含量结果汇总表，图6为嗜热栖热菌发酵产物A基于角质形成细胞1L-8含量结果汇总图。
表8 基于角质形成细胞1L-8含量结果汇总表
Figure 750942DEST_PATH_IMAGE008
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时， PC 组和样品组与BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
由表8和图6可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物在不同浓度梯度下（1%，5%），均可以有效对抗角质形成细胞的炎症，炎症因子存在会诱导毛乳头细胞发生凋亡，进而造成毛囊脱落。结合实施例1和实施例5，分别探究本发明嗜热嗜热菌发酵产物对真皮毛乳头细胞和表皮角质形成细胞的抗炎功效，从抗炎维度可以得出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以预防因多种细胞分泌炎症因子进而导致的毛发脱落。
实施例6
探究嗜热栖热菌发酵产物基于成纤维细胞促进I型胶原蛋白生成的功效。本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以有效促进成纤维细胞促进I型胶原蛋白的生成，毛囊细胞外基质缺乏时，会造成毛囊体积变小，毛发由硬而粗的终毛变为细而软的毳毛，最终导致毛发脱落。
6.1 材料与试剂
人皮肤成纤维细胞HSF、原代细胞、DMEM/F12培养基、CO2培养箱， 6孔板，酶标仪；
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
6.2 方法与步骤：
1）受试样品制备：选无菌生理盐水作为受试物溶剂，将嗜热栖热菌发酵产物配制成所需浓度的溶液或均匀混悬液，用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
2）接种：调整细胞浓度为1×107/ml。按每孔200μL细胞悬液接种于6孔板，每孔加入3ml完全培养基，（37℃，CO2）培养箱孵育，约1~2天后给药。
3）给药：在备好的细胞融合度达80%以上的6孔板中，加入受试物溶液共同作用24~48h，空白对照孔中加入受试物溶剂，每个样品做3个复孔。
4）ELISA 检测：孵育 48h 后，收集细胞上清液，根据《人Ⅰ型胶原蛋白α1ELISA试剂盒使用说明书》使用试剂盒进行检测。
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
6.3 测试结果
结果参见表9和图7，表9为基于成纤维细胞I型胶原蛋白α1含量结果汇总表，图7为嗜热栖热菌发酵产物A基于成纤维细胞I型胶原蛋白α1含量结果汇总图。
表9 基于成纤维细胞I型胶原蛋白α1含量结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE009
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时， PC 组和样品组与 BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
由表9和图7可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以有效促进成纤维细胞I型胶原蛋白的生成，且提高率相比BC组具有极显著差异，进而可以补充毛囊细胞外基质，帮助增加毛囊体积，强固毛发，增强毛囊对雄激素的抵抗力，预防脱发。
实施例8
表10 头皮护理液配方
Figure 378364DEST_PATH_IMAGE010
按照表10所示的配方制备头皮护理液，具体步骤如下：
按照合适的清洁消毒程序对设备进行清洁，保证设备是干净且沥干的。
将甘草酸二钾与水混合溶解，获得甘草酸二钾溶液；
将焦亚硫酸钠与水混合溶解，获得焦亚硫酸钠溶液；
将乙醇与苦橙叶/嫩枝油混合溶解，获得油溶液；
将丁二醇、1,2-戊二醇、泛醇和甘草酸二钾溶液加入主锅，边搅拌边升温至80-82℃，确认全部原料混合溶解均匀后，保温搅拌10min，确认均匀后开始降温；
降温至45℃，加入焦亚硫酸钠溶液、嗜热栖热菌发酵产物A和乳酸，维持搅拌，确认均匀后继续降温；
降温至28-32℃，加入有溶液，维持密闭搅拌10~15min；
确认搅拌均匀后，分别取顶底样检测，检测合格后，600目滤布过滤出料，得到头皮护理液。
防脱功效测试方法：选取60名女性志愿者，年龄30±10岁，这些志愿者有脱发多和头发轻度稀疏困扰，且按60次梳发法脱发计数大于10根，近1个月内没有进行过染发、烫发、定型等特殊美发处理者，受试者试验期间每次访视前24±4小时内不能洗头，且每次访视前不洗头发的时间基本保持一致，访视当天不能自行梳发。将60名志愿者均分为两组，一组为实验组，另一组为对照组。实验组每天晚上使用实验组的头皮护理液，涂抹产品于发缝处，并轻轻按摩至吸收，每次预计使用2ml/支，早晚各使用一支，连续使用28天；同理，对照组每天晚上使用对照组的头皮护理液，连续使用28天；然后分别在14天和28天时进行回访，采用60次梳发法梳理受试者头发，对脱落头发计数，并记录；结果参见表11，表11为头皮护理液人体防脱评价测试结果汇总。
表11头皮护理液人体防脱评价测试结果汇总
Figure DEST_PATH_IMAGE011
备注：采用 t-test 方法进行统计分析时， D14和D28分别与 D0 相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
由表11可知，本发明的防脱功效成分嗜热栖热菌发酵产物应用到头皮护理液配方后，进行人体功效测试评价，结果显示，实验组，即使用含本发明防脱功效成分的头皮护理液配方产品，D28、D14相比D0，头发脱落显著得到缓解，脱发下降率分别为21.76%、34.12%，明显优于对照组，即不含本发明防脱功效成分的实验产品的基质配方产品，脱发变化率分别为5.56%、-6.17%；
实施例9
表12 洗发水配方
Figure 263143DEST_PATH_IMAGE012
按照表12所示的配方制备头皮护理液，具体步骤如下：
1、将水、EDTA 二钠、月桂醇聚醚硫酸酯钠加入主锅中，70℃~80℃加热，充分混合溶解均匀，搅拌。
2、将聚季铵盐-10加入水中，搅拌完全分散好后加入主锅中，保温搅拌10min，降温。
3、冷却至40℃-50℃，将嗜热栖热菌发酵产物B、小分子透明质酸、甘草酸二钾、苯甲酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱、苯氧乙醇、香精、乳酸和氯化钠依次加入主锅内，搅拌10min。
4、冷却至室温，脱泡过滤，出料（半成品），取样检测、料体转移。
5、灌装（成品），得到洗发水。
功效评价方法：选取60名女性志愿者，年龄30±10岁，这些志愿者有脱发多和头发轻度稀疏困扰，志愿者平均分为两组，即实验组和对照组，实验组定期使用含本发明防脱成分嗜热栖热菌发酵产物的洗发水配方产品，对照组使用不含本发明防脱功效成分的试验产品的基质配方产品，两组均连续使用28天。最后测试者依据产品使用过程中，对含或不含本发明嗜热栖热菌发酵产物的洗发水配方的满意度进行打分，相关满意度指标包括：头皮舒缓感、 产品有助于缓解脱发困扰、产品使用后掉发有减少、产品使用后头发更稳固不易脱落等，具体结果汇总如下表13，表13为洗发水配方产品人体满意度评价结果汇总。
满意度评分标准如下：1分：一点都没得到缓解；2分：可能得到缓解；3分：轻微得到缓解；4分：很好得到缓解；5分：非常有效的缓解，表示强烈意愿想要继续使用。
表13 洗发水配方产品人体满意度评价结果汇总
Figure DEST_PATH_IMAGE013
由表11可知，本发明的防脱舒缓功效成分嗜热栖热菌发酵产物应用到洗发水配方后，进行人体满意度评价，结果显示，实验组，即使用含本发明防脱舒缓功效成分的洗发水配方产品，对产品在改善瘙痒感、感知掉发有减少甚至得到缓解、感知头发更稳固不易脱落等维度的满意度打分，明显优于对照组，即不含本发明防脱功效成分的实验产品的基质配方产品。
实施例10
探究本发明的嗜热栖热菌发酵产物对Wnt/β-连环蛋白信号（β-catenin）通路的影响。Wnt/β-连环蛋白信号通路被认为是调控毛囊发育最重要的通路，该通路的核心因素是β-连环蛋白，在此实施例中发现，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以显著增加β- catenin基因的表达，即证明可以有效激活毛囊发育的关键调控通路，最终帮助毛发的再生。
10.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、RNAiso Plus（Takara）、反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent Kit）（Takara）、SYBR Premix Ex Taq™ II 荧光染料（Takara）、无菌 ddH2O（Takara）；
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）、普通 PCR 仪（博日）、荧光定量 PCR 仪（BioRad，CFX-96）;
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
10.2 方法与步骤
表14 基于毛乳头细胞评估生发功效测试方案
Figure 530177DEST_PATH_IMAGE014
1) 接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2) DHT 刺激及给药：根据表14所示的测试方案，待6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h，48h 以及72h，对于需要孵育 48h 以及 72h 的组别每天进行给药和换液操作。
3）基因表达检测：培养 24h 后，收集细胞上清后，1mL/孔 PBS 清洗两次，每孔加入 1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。提取 RNA，反转录至 cDNA 后，进行荧光定量PCR 检测，采用 2 -△△CT方法进行结果计算。
4）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
10.3 测试结果
结果参见表15和图8，表15为β-catenin 基因检测结果汇总表，图8为嗜热栖热菌发酵产物A组中β-catenin 基因检测结果汇总图。
表15 β-catenin 基因检测结果汇总表
Figure 876599DEST_PATH_IMAGE016
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时，将BC 组 mRNA 扩增倍数归一处理， NC 组与 BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##；PC 组和样品组与 BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组 β-catenin 基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效； 与 NC 组相比，PC 组 β-catenin 基因的表达明显上调，说明本次阳性对照测试有效；与 NC 组相比，嗜热栖热菌发酵产物对β-catenin 基因的表达有明显的上调作用，上调率为 67.16%。
由表15和图8可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以显著促进Wnt/β-连环蛋白信号通路中β-catenin 基因的表达，上调率达到67.16%，有效对抗因雄激素刺激造成的毛乳头细胞β-catenin 基因表达下降的现象，进而促进毛发的再生。另外，从上表中数据可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物对β-catenin 基因表达的促进作用与药用生发成分米诺地尔效果相近。因此通过此实施例可以有效证明，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以有效缓解毛囊因雄激素刺激造成的毛发延缓生长的情况。
实施例11
探究本发明的嗜热栖热菌发酵产物对毛乳头细胞增殖的影响。基于实施例10可知，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以帮助产生ATP，进而为毛囊赋能，缓解因毛囊受损引起的新陈代谢下降的现象，一定程度上，为毛乳头细胞的增殖提供所需的能量；另外，通过实施例10可知，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以显著上调β-catenin 基因的表达，此蛋白的表达，可以激活C-Myc、周期蛋白D1等下游靶基因的转录，进而促进毛囊干细胞的活化、增殖和定向分化。基于实施例9和实施例10都可以证明，本发明的嗜热栖热菌发酵产物，具有促进毛乳头细胞增殖的功效，进而促进毛发的生长。
11.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、MTT（Sigma）、SYBR Premix Ex Taq™ II 荧光染料（Takara）、无菌 ddH2O（Takara）；
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）、普通 PCR 仪（博日）、荧光定量 PCR 仪（BioRad，CFX-96）；
嗜热栖热菌发酵产物A和嗜热栖热菌发酵产物B。
11.2 方法与步骤
表16 基于毛乳头细胞评估促进细胞增殖功效测试方案
Figure DEST_PATH_IMAGE017
1) 接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2) DHT 刺激及给药：根据表17所示的测试方案，待6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h，48h 以及72h，对于需要孵育 48h 以及72h 的组别每天进行给药和换液操作。
3）细胞增殖检测：待细胞孵育培养结束后，弃掉上清，加入 MTT 工作液（0.5mg/mL，现配现用），37℃避光孵育 4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加 150µL DMSO，在 490nm处读取 OD 值。同时，48h 和 72h 后，进行上述 MTT 检测操作。
4) 细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力（%）=（样品孔 OD-调零孔OD）/（溶剂对照孔OD-凋零孔OD）*100%；
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
11.3 测试结果
结果参见表17和图9，表17为细胞增殖检测结果汇总表，图9为嗜热栖热菌发酵产物A组中细胞增殖检测结果汇总图。
表17 细胞增殖检测结果汇总表
Figure 607794DEST_PATH_IMAGE018
备注：用 t-test 方法进行统计分析时，NC 组与SC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##。PC 组、样品组与 NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组的细胞增殖率显著下降，说明本次测试刺激条件有效。
与 NC 组相比，PC 组的细胞增殖率显著上升，说明本次阳性对照检测有效。
与 NC 组相比，样品嗜热栖热菌发酵产物A给药 24h、48h、72h 后细胞活力均表现出显著增长趋势，细胞增殖率分别为 3.89%、9.52%、12.61%；嗜热栖热菌发酵产物B给药24h、48h、72h 后细胞活力也均表现出显著增长趋势。
由表17和图9可以看出，本发明的嗜热栖热菌发酵产物可以有效恢复因雄激素刺激造成的毛乳头细胞增殖活性受影响的状况，且随着时间增加，毛乳头细胞的细胞增殖率逐渐增加，到72h时，毛乳头细胞的增殖率达到12.61%，甚至优于明星药物成分米诺地尔。由此可知，本发明的嗜热栖热菌可以有效促进毛发生长的关键主体细胞真皮毛乳头细胞的增殖，随着细胞活性和数量的增加，有活力的毛囊数也会随之增加，最终使得毛发再生。
实施例12
探究组合物嗜热栖热菌发酵产物A和乙酰基四肽-3对于毛乳头细胞的影响，TGFβ2生长因子的表达会诱发毛囊从生长期提前进入退行期，即缩短毛囊的生长周期，诱发毛囊的凋亡，最终导致毛发脱落。本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3协同使用时，可以有效对抗对因雄激素(DHT)刺激造成毛乳头细胞过度表达凋亡因子TGFβ2的现象。
12.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、RNAiso Plus（Takara）、反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent Kit）（Takara）、SYBR Premix Ex Taq™ II 荧光染料（Takara）、无菌 ddH2O（Takara）；
CO2培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）、普通 PCR 仪（博日）、荧光定量 PCR 仪（BioRad，CFX-96）；
嗜热栖热菌发酵产物A；
乙酰基四肽-3。
12.2 方法与步骤
表18 基于毛乳头细胞评估防脱测试方案
Figure DEST_PATH_IMAGE019
1) 接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2) DHT 刺激及给药：根据表19所示的测试方案，待 6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h，48h 以及72h，对于需要孵育48h以及72h的组别每天进行给药和换液操作；
3) 基因表达检测：培养24h后，收集细胞上清后，1mL/孔 PBS 清洗两次，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。提取RNA，反转录至cDNA 后，进行荧光定量 PCR检测，采用 2 -△△CT方法进行结果计算。
4）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
12.3 测试结果
结果参见表19和图10，表19为基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总表，图10为基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总图。
表19 基于毛乳头细胞TGFβ2 基因检测结果汇总表
Figure 679787DEST_PATH_IMAGE020
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时，将 BC组 mRNA 扩增倍数归一处理， NC 组与 BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##；PC 组和样品组与 BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组 TGFβ2 基因的表达明显上调，说明本次测试刺激条件有效；
与 NC 组相比，PC 组 TGFβ2 基因的表达明显下调，说明本次阳性对照测试有效；
与 NC 组相比，0.3125% 嗜热栖热菌发酵产物对 TGFβ2 基因的表达有明显的下调作用，下调率为 18.81%。
与 NC 组相比，0.1562%乙酰基四肽-3对 TGFβ2 基因的表达没有明显的下调作用。
与 NC 组相比，当上述两种原料组合到一起应用时，即0.3125%嗜热栖热菌发酵产物和0.1562%乙酰基四肽-3组合应用或者0.03125%嗜热栖热菌发酵产物和0.1562%乙酰基四肽-3组合应用，对 TGFβ2 基因的表达有明显下调作用，下调率为25.94%和30.83%，且要显著优于单一嗜热栖热菌发酵产物的下调率，即证明嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3组合到一起应用时，具有协同增效的作用。
由表19和图10可以看出，本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3，可以发挥协同增效的作用，显著抑制因雄激素刺激毛乳头细胞造成的凋亡因子-TGFβ2的过度表达。已知毛乳头细胞中在雄激素（DHT） 与雄激素受体（AR）的启动激活下分泌大量的TGFβ 2， TGFβ 2 的分泌进一步会诱导毛囊表皮成份如毛基质细胞的凋亡，从而促进脱发现象的发生。因此抑制 TGFβ 2 的分泌可以达到抑制脱发的作用。由此可知从基因调控维度可以看出，本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3可以发挥协同增效的作用，通过抑制凋亡因子的表达进而发挥防脱的功效，且效果优于米诺地尔。
实施例13
探究组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-8对血管内皮生长因子（VEGF）的影响，毛囊基底部的毛乳头细胞里可以分泌大量的 VEGF，另外毛囊基底部含有丰富的毛细血管神经和组织，能够营养毛囊，即VEGF的表达，可以通过刺激真皮乳头血管生成而促进毛发生长初期阶段毛发的生长；
13.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、VEGF ELISA 试剂盒（Abcam）、无菌ddH2O（Takara）；
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）；
嗜热栖热菌发酵产物A；
乙酰基四肽-3。
13.2 方法与步骤
表20基于毛乳头细胞评估促生发测试方案
Figure DEST_PATH_IMAGE021
1) 接种：按 1.1×104 个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2)DHT 刺激及给药：根据表21所示的测试方案，待 6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养 24h，48h 以及72h，对于需要孵育48h 以及72h 的组别每天进行给药和换液操作
3) ELISA 检测：孵育 24h 后，收集细胞上清液，根据 ELISA 试剂盒的操作说明书进行检测分析。
4）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
13.3 测试结果
结果参见表21和图11，表21为基于毛乳头细胞VEGF 生长因子检测结果汇总表，图11为基于毛乳头细胞VEGF 生长因子检测结果汇总图。
表21 基于毛乳头细胞VEGF 生长因子检测结果汇总表
Figure 230854DEST_PATH_IMAGE022
备注：采用 2-△△CT 方法进行结果计算，用 t-test 方法进行统计分析时，将 BC组 mRNA 扩增倍数归一处理， NC 组与 BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##；PC 组和样品组与 BC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组 VEGF含量显著降低，说明本次测试刺激条件有效；
与 NC 组相比，PC 组 VEGF 含量显著升高，说明本次阳性对照测试有效；
与 NC 组相比，0.3125%嗜热栖热菌发酵产物的VEGF含量无显著变化；
与 NC 组对比，0.1562%乙酰基四肽-3的VEGF含量显著升高，提高率为14.68%；
与 NC 组相比，当上述两种原料组合到一起应用时，即0.3125%嗜热栖热菌发酵产物和0.1562%乙酰基四肽-3组合物，此组合物的VEGF含量显著上升，提升率为20.84%，且此提升率显著优于单一的乙酰基四肽-3，即证明此组合物具有协同增效的作用。
由表21和图11可以看出，本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3可以通过协同作用，显著促进内皮生长因子（VEGF）的表达，已知VEGF的表达，可以刺激真皮乳头血管生成，进而营养毛囊，并促进毛发生长初期阶段毛发的生长。由此可知，本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3可以通过协同作用促进VEGF的表达，进而促进毛发生长的功效，且效果显著优于明星药用生发成分米诺地尔。
实施例14
探究本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3对毛乳头细胞协同增殖的影响。基于实施例13可知，本发明的组合物可以促进内皮生长因子VEGF的表达，此生长因子可以促进真皮毛乳头细胞中血管生成，进而营养毛囊，为毛乳头细胞的增殖提供更多的营养成分，使得毛乳头细胞得以增殖，进而促进毛发的生长。
14.1 材料与试剂
MSCM 培养液、PBS（博士德）、米诺地尔（Sigma）、DMSO（Sigma）、二氢睾酮（DHT，Sigma）、MTT（Sigma）、SYBR Premix Ex Taq™ II 荧光染料（Takara）、无菌 ddH2O（Takara）。
CO2 培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、恒温箱（泰斯特）；
嗜热栖热菌发酵产物A；
乙酰基四肽-3。
14.2 方法与步骤
表22 基于毛乳头细胞评估促生发测试方案
Figure DEST_PATH_IMAGE023
1) 接种：按 1.1×104个/孔的接种密度接种毛乳头细胞至 6 孔板中，（37℃，CO2）培养箱孵育过夜。
2) DHT 刺激及给药：根据表23所示的测试方案，待 6 孔板中细胞铺板率达到 50~60%左右时，进行给药和对有 DHT 刺激条件的组别进行 DHT 刺激，结束后置于（37℃，CO2）培养箱中孵育培养24h，48h以及72h，对于需要孵育48h以及72h 的组别每天进行给药和换液操作。
3）细胞增殖检测：待细胞孵育培养结束后，弃掉上清，加入 MTT 工作液（0.5mg/mL，现配现用），37℃避光孵育 4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加 150µL DMSO，在 490nm处读取 OD 值。同时，48h 和 72h 后，进行上述 MTT 检测操作。
4) 细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力（%）=（样品孔OD-凋零孔OD）/（溶剂对照孔OD-凋零孔OD）*100%；
5）结果统计分析：应用 GraphPad Prism 作图，结果表示为 Mean±SD，各组间比较采用 t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。
14.3 测试结果
结果参见表23和图12，表23为细胞增殖检测结果汇总表，图12为细胞增殖检测结果汇总图。
表23 细胞增殖检测结果汇总表
Figure 967866DEST_PATH_IMAGE024
备注：用 t-test 方法进行统计分析时，NC 组与SC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01 表示为##。PC 组、样品组与 NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。
与 BC 组相比，NC 组的细胞增殖率显著下降，说明本次测试刺激条件有效。
与 NC 组相比，PC 组的细胞增殖率显著上升，说明本次阳性对照检测有效。
与 NC 组相比，样品0.3125%嗜热栖热菌发酵产物给药72h后细胞活力表现出显著增长趋势，细胞增殖率为 12.61%。
与NC 组相比，样品0.1562%乙酰基四肽-3给药72h后细胞活力表现出显著增长趋势，细胞增殖率为3.72%。
与NC 组相比，当上述两种原料组合应用时，即0.3125%嗜热栖热菌发酵产物和0.1562%乙酰基四肽-3组合物和0.03125%嗜热栖热菌发酵产物和0.1562%乙酰基四肽-3组合物给药72h后，真皮毛乳头细胞活力表现出显著增长趋势，细胞增殖率为21.87%和，且此增殖率显著优于组合物中单一的嗜热栖热菌发酵产物或乙酰基四肽-3，即证明此组合物具有协同增效的作用；
由表23和图12可以看出，本发明的组合物嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3可以有效恢复因雄激素刺激造成的毛乳头细胞增殖活性受影响的状况，且随着时间增加，毛乳头细胞的细胞增殖率逐渐增加，到72h时，组合物的毛乳头细胞的增殖率达到21.87%和23.49%，且显著优于组合物中的任一单一成分，甚至优于明星药物生发成分米诺地尔。由此可知，本发明的组合物通过协同作用，可以有效促进毛发生长的关键主体细胞真皮毛乳头细胞的增殖，随着细胞活性和数量的增加，有活力的毛囊数也会随之增加，最终使得毛发再生。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (8)

1.一种嗜热栖热菌发酵产物在制备预防和/或治疗脱发的制剂中的用途；所述制剂中，所述嗜热栖热菌发酵产物的浓度为0.03125%~5%；
所述嗜热栖热菌发酵产物按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌培养至对数生长期后期，将收集的菌液冷冻，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物；
所述缓冲液包括：
1~80nM tris.HCl；
0.1~5.0mM β-巯基乙醇；
0.1~2mM EDTA；
0.1~0.5M 蔗糖；
1~10mM MgCl2；
所述嗜热栖热菌发酵产物包括嗜热栖热菌发酵滤液、胞内物和细胞壁。
2.一种嗜热栖热菌发酵产物在制备促进毛发生长的制剂中的用途；所述制剂中，所述嗜热栖热菌发酵产物的浓度为0.03125%~5%；
所述嗜热栖热菌发酵产物按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌培养至对数生长期后期，将收集的菌液冷冻，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物；
所述缓冲液包括：
1~80nM tris.HCl；
0.1~5.0mM β-巯基乙醇；
0.1~2mM EDTA；
0.1~0.5M 蔗糖；
1~10mM MgCl2；
所述嗜热栖热菌发酵产物包括嗜热栖热菌发酵滤液、胞内物和细胞壁。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述制剂包括药物或日化用品。
4.一种防脱发和/或生发组合物，包括：嗜热栖热菌发酵产物和第二防脱固发活性成分；
所述嗜热栖热菌发酵产物按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌培养至对数生长期后期，将收集的菌液冷冻，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物；
所述缓冲液包括：
1~80nM tris.HCl；
0.1~5.0mM β-巯基乙醇；
0.1~2mM EDTA；
0.1~0.5M 蔗糖；
1~10mM MgCl2；
所述嗜热栖热菌发酵产物包括嗜热栖热菌发酵滤液、胞内物和细胞壁；
所述第二防脱固发活性成分为乙酰基四肽-3；
所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为1:5或2:1。
5.一种防脱发和/或生发制剂，其特征在于，包括嗜热栖热菌发酵产物和辅料；
所述嗜热栖热菌发酵产物按照以下方法制备：
将嗜热栖热菌培养至对数生长期后期，将收集的菌液冷冻，在缓冲液中进行提取，得到嗜热栖热菌发酵产物；
所述缓冲液包括：
1~80nM tris.HCl；
0.1~5.0mM β-巯基乙醇；
0.1~2mM EDTA；
0.1~0.5M 蔗糖；
1~10mM MgCl2；
所述嗜热栖热菌发酵产物包括嗜热栖热菌发酵滤液、胞内物和细胞壁。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，为头皮护理液；
所述头皮护理液包括：
40~70wt%的水；
20~30wt%的乙醇；
1~10wt%的丁二醇；
1~10wt%的1,2-戊二醇；
0.3~15wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
0.1~1wt%的泛醇；
0.01~0.5wt%的甘草酸二钾；
0.01~0.5%的焦亚硫酸钠；
0.001~0.1wt%的乳酸；
0.001~0.01wt%的苦橙叶油或苦橙嫩枝油。
7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，为洗发水；
所述洗发水包括：
40~70wt%的水；
10~30wt%的椰油酰胺丙基甜菜碱；
5~20wt%的月桂醇聚醚硫酸酯钠；
5~20wt%的嗜热栖热菌发酵产物；
0.1~2wt%的透明质酸；
0.1~1wt%的苯甲酸钠；
0.1~1%的苯氧乙醇；
0.1~1wt%的乳酸；
0.1~1wt%的甘草酸二钾；
0.05~1wt%的聚季铵盐-10；
0.05~0.5wt%的EDTA二钠；
0.01~0.5wt%的香精；
0.001~0.05wt%的氯化钠。
8.根据权利要求5~7任意一项所述的制剂，其特征在于，还包括第二防脱固发活性成分；
所述第二防脱固发活性成分为乙酰基四肽-3；
所述嗜热栖热菌发酵产物和乙酰基四肽-3的质量比为1:5或2:1。
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