CN117717589B - 芦荟发酵物及含其的皮肤免疫微环境调节剂、制法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芦荟发酵物及含其的皮肤免疫微环境调节剂、制法及应用，属于生物医药技术领域。本发明的芦荟发酵物由新鲜芦荟与斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）发酵制得。本发明的皮肤免疫微环境调节剂中包括芦荟发酵物、尿素、甘油、95%乙醇；用水补至规定剂量。本发明公开了上述芦荟发酵物或皮肤免疫微环境调节剂在制备针对特应性皮炎免疫微环境调节的制剂中的应用。实验表明，本发明的芦荟发酵物能促进人外周血淋巴转化，促进小鼠纤维肉瘤细胞3T3细胞增殖；本发明皮肤免疫微环境调节剂能有效调节特应性皮炎局部的免疫微环境，使皮损得到修复、改善、痊愈。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及芦荟发酵物及含其的皮肤免疫微环境调节剂、制法及应用。
背景技术
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种常见的瘙痒性炎症性皮肤疾病。病因十分复杂，其发病机制可能与遗传、免疫、环境、感染、精神心理、皮肤屏障受损等多种因素有关。但引发疾病的因素可大致分为以下四点：一、遗传因素，大部分AD患者存在家族遗传史，尤其是过敏性体质的遗传史。在患者家族成员中，有过敏性哮喘、过敏性鼻炎，或是其他变态反应疾病的家族史。二、免疫的异常，虽然目前免疫发病的机制仍不清楚，但是免疫异常在AD的发病过程中起到非常重要的作用。普遍认为Th2细胞的免疫的异常是AD主要发病机制之一，由Th2细胞分泌出来的细胞因子，促进了AD的发生。三、皮肤屏障的功能异常，当皮肤屏障功能受损，将导致患者极易受到外界过敏因素的刺激，从而诱发疾病的发生。所以，保护皮肤屏障对治疗AD非常重要。四、感染，根据过去许多相关研究显示，皮肤屏障功能受损后，会激发部分细菌感染，尤其金葡菌感染。而细菌定植的增加，也会诱发加重AD。
现有技术中对该类皮肤损伤的治疗方法：去除并避免可能的致病因素，对症治疗。包括润肤膏的常规应用、局部外用糖皮质激素、合并感染的抗感染治疗、非激素类的局部免疫调节剂、抗组胺药口服治疗、光疗、大剂量静脉注射免疫球蛋白等。
因此，提供一种用于调节特应性皮炎患者皮损局部免疫微环境的制剂，其不含有激素，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种芦荟发酵物，其由新鲜芦荟与斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）发酵制得。
本发明的目的之二在于，提供该芦荟发酵物的制备方法。
本发明的目的之三在于，提供一种皮肤免疫微环境调节剂，其包括上述的芦荟发酵物。
本发明的目的之四在于，提供该皮肤免疫微环境调节剂的制备方法。
本发明的目的之五在于，提供上述芦荟发酵物或皮肤免疫微环境调节剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开的一种芦荟发酵物，由新鲜芦荟与斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）发酵制得。
本发明公开的上述芦荟发酵物的制备方法，包括如下步骤：将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比5~20：1混合后，灭菌，加入OD600值为0.8~1.0的斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）菌液，培养，培养完成后，向发酵液中加入活性炭，再离心、过滤，收集上清液，即得芦荟发酵物；
其中芦荟匀浆液与斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）菌液的质量比为100：0.5~2；
发酵液与活性炭的质量比为10:0.5~2。
本发明的部分实施方案中，培养条件为37±0.5℃、100~400转/分钟条件下振荡培养24-96小时；
更优选地，于37±0.5℃、200转/分钟条件下振荡培养48小时。
本发明的部分实施方案中，离心条件为3000~5000 rpm离心沉淀10~20min；优选为3000 rpm离心沉淀15min。
本发明的部分实施方案中，所述芦荟匀浆液的制备方法为：取新鲜采摘的芦荟，去除腐烂、损伤部分，清水洗净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用50μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液；
所述3YT培养基的制备方法为：于0.9L水中加入蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，再用1N NaOH溶液调整pH至7.0，再补足水至1L。
本发明的部分实施方案中，将收集的上清液经滤膜过滤处理，优选地，滤膜孔径为0.22μm。
本发明公开的一种皮肤免疫微环境调节剂，包括上述的芦荟发酵物。
本发明的部分实施方案中，每1000ml皮肤免疫微环境调节剂中包括以下重量份的组分：芦荟发酵物5~20ml，尿素40~60g，甘油80~120ml，95%乙醇200~240ml；用水补足1000ml。
本发明公开的上述皮肤免疫微环境调节剂的制备方法，包括如下步骤：
取芦荟发酵物、尿素、甘油，加水搅拌至液体清澈透明；而后加入95%乙醇，混合均匀，加水补足至1000ml；即得所述皮肤免疫微环境调节剂。
本发明的部分实施方案中，加水补足至1000ml后再用乳酸调节pH为5.0±0.5。
本发明公开的上述的芦荟发酵物或皮肤免疫微环境调节剂在制备针对特应性皮炎的局部免疫微环境调节制剂中的应用。
本发明所述的芦荟为百合科植物库拉索芦荟Aloe barbadensisMiller、好望角芦荟Aloe feroxMiller或其他同属近缘植物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙，利用新鲜芦荟浆液与斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）发酵制备得到芦荟发酵物，该发酵物用于制备皮肤免疫微环境调节剂，发酵物中的微生物能降解芦荟中的多糖、蛋白等提供适当的营养组份，同时其代谢产物中含有多种生物活性因子，该组合物辅以保湿、皮肤细胞膜稳定剂，从而达到调节皮肤免疫微生态的作用。实验表明，本发明的芦荟发酵物能促进人外周血淋巴转化，促进小鼠纤维肉瘤细胞3T3细胞增殖；本发明皮肤免疫微环境调节剂可以有效抑制特应性皮炎模型小鼠皮肤的炎症细胞浸润，使恢复特应性皮炎模型小鼠的皮损恢复正常。
附图说明
附图1为本发明试验例1的淋巴细胞转化实验结果图；
附图2为本发明试验例2的对3T3细胞增殖实验结果图；
附图3为本发明试验例3的采用本发明的皮肤免疫微环境调节剂对特应性皮炎小鼠模型治疗后实验组与对照组小鼠皮肤HE染色对比图；
附图4为本发明试验例3的采用本发明的皮肤免疫微环境调节剂对特应性皮炎小鼠模型治疗后实验组与对照组小鼠皮损对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中所用的菌种为斯氏芽孢杆菌（BacillusSpizizenii）菌株（MultiShot 550）保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，可市售购买。
本发明实施例中所述的3YT培养基的制备方法为：于0.9L水中加入蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，再用1N NaOH溶液调整pH至7.0，再补足水至1L。
本发明实施例中所述的3YT琼脂平板的制备方法为：称取琼脂1.2g，加入100ml3YT培养基，121℃高压蒸汽消毒15分钟。消毒结束，取出。室温冷却至60℃左右，即时倒入φ9 cm无菌平皿中，轻轻旋转使琼脂培养基均匀分布至平板底部待冷。
实施例1
本实施例公开了本发明的芦荟发酵物的制备方法，具体如下：
S1. 制备芦荟匀浆液：取新鲜采摘的芦荟，常规去除腐烂、损伤部分，清水彻底洗涤干净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用20μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液；
S2. 将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比10:1混合、分装；于121℃条件下灭菌15分钟，备用；
S3. 取经步骤S2消毒备用的芦荟匀浆液，将芦荟匀浆液：菌种活化液=100:1（w/w）加入新鲜活化菌液，于37℃、200转/分钟条件下振荡培养48小时；其中活化菌液的OD600值为0.8；
S4. 培养结束后，称取活性炭（按质量比发酵液：活性炭=10:1）加入发酵液中搅拌混匀静置1小时；收集上清液，3000 rpm离心沉淀15min；
S5. 收集离心所得上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液-20℃保存备用。
实施例2
本实施例公开了本发明的芦荟发酵物的制备方法，具体如下：
S1. 制备芦荟匀浆液：取新鲜采摘的芦荟，常规去除腐烂、损伤部分，清水彻底洗涤干净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用50μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液；
S2. 将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比5:1混合、分装；于121℃条件下灭菌15分钟，备用；
S3. 取经步骤S2消毒备用的芦荟匀浆液，将芦荟匀浆液：菌种活化液=100:2（w/w）加入新鲜活化菌液，于37℃、200转/分钟条件下振荡培养48小时；其中活化菌液的OD600值为1.0；
S4. 培养结束后，称取活性炭（按质量比发酵液：活性炭=10:0.2）加入发酵液中搅拌混匀静置1小时；收集上清液，3000 rpm离心沉淀10min；
S5. 收集离心所得上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液-20℃保存备用。
实施例3
本实施例公开了本发明的芦荟发酵物的制备方法，具体如下：
S1. 制备芦荟匀浆液：取新鲜采摘的芦荟，常规去除腐烂、损伤部分，清水彻底洗涤干净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用50μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液；
S2. 将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比20:1混合、分装；于121℃条件下灭菌15分钟，备用；
S3. 取经步骤S2消毒备用的芦荟匀浆液，将芦荟匀浆液：菌种活化液=100:0.5（w/w）加入新鲜活化菌液，于37℃、200转/分钟条件下振荡培养48小时；其中活化菌液的OD600值为0.8；
S4. 培养结束后，称取活性炭（按质量比发酵液：活性炭=10:2）加入发酵液中搅拌混匀静置1小时；收集上清液，5000 rpm离心沉淀15min；
S5. 收集离心所得上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液-20℃保存备用。
实施例4
本实施例公开了本发明的芦荟发酵物的制备方法，具体如下：
S1. 制备芦荟匀浆液：取新鲜采摘的芦荟，常规去除腐烂、损伤部分，清水彻底洗涤干净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用50μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液；
S2. 将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比15:1混合、分装；于121℃条件下灭菌15分钟，备用；
S3. 取经步骤S2消毒备用的芦荟匀浆液，将芦荟匀浆液：菌种活化液=100:1.5（w/w）加入新鲜活化菌液，于37℃、200转/分钟，条件下振荡培养48小时；其中活化菌液的OD600值为1.0；
S4. 培养结束后，称取活性炭（按质量比发酵液：活性炭=10:0.5）加入发酵液中搅拌混匀静置1小时；收集上清液，5000 rpm离心沉淀10min；
S5. 收集离心所得上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液-20℃保存备用。
实施例5
本实施例公开了本发明的皮肤免疫微环境调节剂的制备。本实施例的每1000ml的皮肤免疫微环境调节剂含有：
芦荟发酵物10ml，尿素50g，甘油（丙三醇）100g，95%医用乙醇220ml，加去离子水补至1000ml。
1. 准备：生产前应首先根据生产量准备足量的去离子水；所有生产用器，包括容器、管道等均应充分洗涤。尤其是过滤器应经大量去离子水反复循环冲洗，并使其洗涤液pH为中性。
2. 制备方法具体为：
（1）首先向已处理好的搅拌器中加入500g的去离子水；
（2）精确量取发酵液10ml、尿素50g、甘油（丙三醇）100g，投入搅拌器内，开启搅拌器进行搅拌至液体清澈透明；
（3）加入95%医用乙醇220ml；
（4）补充去离子水至1000ml，继续搅拌直至搅拌器内液体清澈透明；
（5）用乳酸调pH为5.0±0.5；
（6）出料、分装至塑料喷瓶中，即得皮肤免疫微环境调节剂。
实施例6
本实施例公开了本发明的皮肤免疫微环境调节剂的制备。本实施例的每1000ml的皮肤免疫微环境调节剂含有：
芦荟发酵物20ml，尿素40g，甘油（丙三醇）80g，95%医用乙醇200ml，加去离子水补至1000ml。
1. 准备：同实施例5的“准备”项下。
2. 制备方法具体为：
（1）首先向已处理好的搅拌器中加入500g的去离子水；
（2）精确量取发酵液15ml、尿素40g、甘油（丙三醇）80g，投入搅拌器内，开启搅拌器进行搅拌至液体清澈透明；
（3）加入95%医用乙醇200ml；
（4）补充去离子水至1000ml，继续搅拌直至搅拌器内液体清澈透明；
（5）用乳酸调pH为5.0±0.5；
（6）出料、分装至塑料喷瓶中，即得皮肤免疫微环境调节剂。
实施例7
本实施例公开了本发明的皮肤免疫微环境调节剂的制备。本实施例的每1000ml的皮肤免疫微环境调节剂含有：
芦荟发酵物5ml，尿素60g，甘油（丙三醇）120g，95%医用乙醇240ml，加去离子水补至1000ml。
1. 准备：同实施例5的“准备”项下。
2. 制备方法具体为：
（1）首先向已处理好的搅拌器中加入500g的去离子水；
（2）精确量取发酵液5ml、尿素60g、甘油（丙三醇）120g，投入搅拌器内，开启搅拌器进行搅拌至液体清澈透明；
（3）加入95%医用乙醇240ml；
（4）补充去离子水至1000ml，继续搅拌直至搅拌器内液体清澈透明；
（5）用乳酸调pH为5.0±0.5；
（6）出料、分装至塑料喷瓶中，即得皮肤免疫微环境调节剂。
试验例1
本试验例公开了采用本发明的芦荟发酵物的淋巴细胞转化实验。本试验例所用的芦荟发酵物为按实施例1的方法制得。
具体试验步骤如下：
1. 准备：常规采集正常人外周血，肝素抗凝。常规分离单个核细胞（PBMC），用含5%FBS的RPMI 1640培养基，调细胞浓度为2×106个/ml，备用。
2. 方法：
（1）在无菌条件下，将芦荟发酵物按100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0（细胞对照）μg/ml梯度稀释；
（2）将稀释后的芦荟发酵物转移至96孔细胞培养板中，每孔100μl、每一浓度3复孔；
（3）每孔加入细胞浓度为2×106个/ml的PBMC细胞悬液100μl/孔；
（4）置饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养72小时；
（5）培养结束前4小时，每孔加入CCK8检测试剂10μl；
（6）培养结束，用酶标仪测定OD450值；
（7）计算：按如下公式计算淋转百分率，
；然后以浓度和淋转百分率作图。
3. 结果如附图1所示。
4. 结论：本发明的芦荟发酵物能促进人外周血淋巴转化，并且在浓度为10μg/ml时，具有最强刺激人外周血淋巴细胞转化的生物学功能。
试验例2
本试验例公开了采用本发明的芦荟发酵物对小鼠纤维肉瘤细胞3T3细胞增殖的影响实验。本试验例所用的芦荟发酵物为按实施例1的方法制得。
1. 准备：常规复苏小鼠纤维肉瘤细胞株3T3，用含10% FBS的DMEM培养基，扩增培养。收集处于对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心洗涤、弃上清，用含10% FBS的DMEM培养基悬浮细胞沉淀物，并调细胞浓度为5×104个/ml。
接种至96孔细胞培养板中，每孔100μl，37℃、5%二氧化碳、饱和湿度孵箱，培养24小时。
2. 方法：
（1）在无菌条件下，将芦荟发酵物按100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0（细胞对照）μg/ml梯度稀释；
（2）将稀释后的芦荟发酵物转移至“准备”过程中的96孔细胞培养板中，每孔100μl、每一浓度3复孔，轻轻振荡混匀；
（3）置37℃、5%二氧化碳、饱和湿度孵箱，培养20小时；
（4）培养结束前4小时，每孔加入CCK8检测试剂10μl；
（5）培养结束，用酶标仪测定OD450值；
（6）计算：按如下公式计算淋转百分率，
；然后以浓度和增殖百分率作图。
3. 结果：如附图2所示。
4. 结论：本发明的芦荟发酵物能刺激3T3细胞增殖，并且在浓度为6.25μg/ml时，具有最强刺激3T3细胞增殖的生物学功能。
试验例3
本试验例公开了采用本发明的皮肤免疫微环境调节剂对特应性皮炎模型小鼠进行治疗。
本试验例所用的皮肤免疫微环境调节剂为按实施例5的方法制得。
本试验例所用的特应性皮炎小鼠模型采用5%咪喹莫特药膏按照50mg/cm2剂量均匀涂抹在脱毛部位，1次/天，连续涂抹7天。
使用方法：将模型小鼠分为两组（实验组和对照组）。实验组常规清洁患处表面，用喷雾方式，将皮肤免疫微环境调节剂喷于皮损局部，每天1到2次；对照组不处理，继续饲养直至实验结束。动态观察和记录皮损改变及瘙痒改善情况，约7天实验组小鼠患处皮肤恢复正常、瘙痒消失。常规分别取实验组和对照组小鼠皮瓣进行石蜡包埋切片、HE染色。
观察结果：该复配皮肤免疫微环境调节制剂，对特应性皮炎模型小鼠皮损和瘙痒具有显著的治疗作用。具体表现如附图4中实验组小鼠所示：皮损恢复正常，皮肤瘙痒症状消失，对照组小鼠皮损明显。HE染色显示（如附图3所示），采用本发明后实验组小鼠皮肤炎性细胞浸润较对照组明显降低，恢复正常皮肤HE染色状态。
结论：本发明的皮肤免疫微环境调节制剂，具有调节皮肤免疫微环境功效，消除皮损局部的炎性细胞浸润作用，使皮损得到恢复、瘙痒症状消除。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上做出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种芦荟发酵物，其特征在于，由新鲜芦荟与斯氏芽孢杆菌BacillusSpizizenii发酵制得；
所述芦荟发酵物的制备方法包括如下步骤：将芦荟匀浆液与3YT培养基按质量比5~20：1混合后，灭菌，加入OD600值为0.8~1.0的斯氏芽孢杆菌BacillusSpizizenii菌液，培养，培养完成后，向发酵液中加入活性炭，再离心、过滤，收集上清液，即得芦荟发酵物；
其中芦荟匀浆液与斯氏芽孢杆菌BacillusSpizizenii菌液的质量比为100：0.5~2；
发酵液与活性炭的质量比为10:0.5~2；
培养条件为37±0.5℃、100~400转/分钟条件下振荡培养24-96小时；
所述3YT培养基的制备方法为：于0.9L水中加入蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，再用1N NaOH溶液调整pH至7.0，再补足水至1L。
2.根据权利要求1所述的芦荟发酵物，其特征在于，离心条件为3000~5000 rpm离心沉淀10~20min。
3.根据权利要求1所述的芦荟发酵物，其特征在于，所述芦荟匀浆液的制备方法为：取新鲜采摘的芦荟，去除腐烂、损伤部分，清水洗净，晾干后，采用组织匀浆仪对其破碎匀浆，而后用50μm的尼龙筛过滤，去除残渣，得到芦荟匀浆液。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的芦荟发酵物，其特征在于，将收集的上清液经滤膜过滤处理。
5.一种皮肤免疫微环境调节剂，其特征在于，每1000ml皮肤免疫微环境调节剂中包括以下组分：芦荟发酵物5~20ml，尿素40~60g，甘油80~120ml，95%乙醇200~240ml；用水补足1000ml，所述芦荟发酵物为权利要求1所述的芦荟发酵物。
6.根据权利要求5所述的皮肤免疫微环境调节剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取芦荟发酵物、尿素、甘油，加水搅拌至液体清澈透明；而后加入95%乙醇，混合均匀，加水补足至1000ml；即得所述皮肤免疫微环境调节剂。
7.根据权利要求6所述的皮肤免疫微环境调节剂的制备方法，其特征在于，加水补足至1000ml后再用乳酸调节pH为5.0±0.5。
8.权利要求1所述的芦荟发酵物或权利要求5所述的皮肤免疫微环境调节剂在制备针对特应性皮炎局部免疫微环境调节制剂中的应用。
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| CN117717589A (zh) | 2024-03-19 |
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