CN104740643A - 一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液及其制备方法。本发明的溶液以透明质酸和／或透明质酸盐为基质，负载有一种或多种生物活性蛋白或多肽(0～10％，W／V)，同时复配有透明质酸酶抑制剂(0～0.1％，W／V)、蛋白活性保护剂(0～10％，W／V)和／或促渗剂(0～20％，W／V)，通过基于正负电荷相互作用的层层自组装方式组成超分子溶液，医学上可用于烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤、微创伤皮肤的治疗，亦可外用于完整皮肤起到紧致祛皱的美容作用。

Description

一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及到一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液、其制备方法及其应用。

背景技术

透明质酸(HA)是一种天然多糖类，在人体中填充在细胞与胶原纤维的空间中，且覆盖在某些结缔组织上，具有保持皮肤弹性的功能，还能锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，也是作为眼球水晶体、关节润滑液等物质的构成成分。

医学界一直在利用透明质酸的特性进行各种治疗，典型的例子是用于退化的关节及眼睛手术。而在美容界，由于HA可以锁住大量的水分，具有相当重要的地位，特别是在保湿类和抗衰类产品中更是应用广泛。HA凝胶还作为皮肤填充剂使用，如Restylane及Juvederm，注射入皮肤可以增加皮下的支撑，令凹陷的两腮恢复高耸，还能让嘴唇变得丰厚迷人，甚至可用于减淡鼻旁及嘴角的纹理。除了填充之外，HA自身亦可促进及刺激增生胶原蛋白，令皮肤透亮光润。目前，HA在美容界的地位无可替代。

生物活性蛋白是一类来自于机体并参与机体多种生物学活动的蛋白质或多肽。科学家已在人体中发现了100多种生物活性蛋白和多肽，这些蛋白和多肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要，因此，科学家建议，针对身体需求，在满足了人体的基本营养摄入后，适当补充肽营养，对于健康和疾病康复是大有好处的。传统的护肤品，使用维生素A酸、果酸等酸性物质，在使用后会引发复杂的皮肤反应，在抗衰老美白的同时，也会引起刺激，导致脱皮、红肿等，而来自于人源的重组细胞因子类蛋白则较少发生此类反应。细胞因子能促进创伤皮肤的主动愈合，特别是在难愈性慢性创伤方面表现出了卓越的优势，在美容界亦被广泛应用于抗衰产品之中。但生物活性蛋白体外活性的不稳定性，迄今依然是它大量应用的瓶颈。

发明内容

为解决上述问题，本发明将透明质酸作为基质材料，通过层层自组装方式得到一种稳定的负载生物活性蛋白、多肽的透明质酸溶液，该溶液亦可冷冻干燥成粉状，医学上可用于烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤、微创伤皮肤的治疗，亦可外用于完整皮肤起到紧致祛皱的美容作用。

本发明提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液及其制备方法。

本发明的溶液以透明质酸和／或透明质酸盐为基质，负载有一种或多种生物活性蛋白或多肽(0～10％，W／V)，同时复配有透明质酸酶抑制剂(0～0.1％，W／V)、蛋白活性保护剂(0～10％，W／V)和促渗剂(0～20％，W／V)，基于正负电荷相互作用的层层自组装方式组成超分子溶液。所述溶液医学上可用于烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤、微创伤皮肤的治疗，亦可外用于完整皮肤起到紧致祛皱的美容作用。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，此溶液含有0.001％～95％(W／V)的至少一种生理上可接受的透明质酸或透明质酸盐，其分子量为3000～100万Da。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸盐可选透明质酸的钠盐、钾盐或锌盐，优选为透明质酸钠盐。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，其中的生物活性蛋白或多肽为各种细胞因子、金属硫蛋白、白介素、干扰素，优选细胞因子，例如，但不限于aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF、KGF、FGF21。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸酶抑制剂为常用的透明质酸酶抑制剂，优选为天然植物来源的化合物，例如茶多酚、松果菊苷或类叶升麻苷等。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，其中的蛋白活性保护剂为常用的多糖(例如，但不限于，乳糖、半乳糖、海藻糖、壳聚糖、蔗糖)、多元醇(例如，但不限于，甘露醇、甘油)、表面活性剂、氨基酸类(例如，但不限于，组氨酸、精氨酸、甘氨酸)，蛋白类(例如，但不限于，人血白蛋白、牛血清蛋白)，优选壳聚糖和／或人血白蛋白。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于，其中的促渗剂为天然植物来源的化合物，如胡椒素、人参皂甙R、乳香提取物，优选人参皂甙。

根据本发明的一个方面，提供了一种制备稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液的方法，其特征在于所述方法采用层层(LbL)白组装技术得到的超分子体，所述方法包括下述步骤：

(1)将多糖以1％～5％，W／V溶于pH5.6的0.05％冰醋酸中，加入人血白蛋白或牛血清蛋白，使蛋白浓度为0.1～5％W／V，优选0.25％W／V，得到溶液A；

(2)透明质酸或透明质酸盐制备成0.75％W／V水溶液B，内含透明质酸酶抑制剂0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的透明质酸或透明质酸盐，得到凝胶状溶液；

(4)再将步骤(3)的凝胶状溶液浸入含有有效量的生物活性蛋白或多肽的带负电荷的右旋糖酐溶液中，所述右旋糖酐溶液中右旋糖酐浓度为0.1％，W／V，pH5.6，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所述稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，

任选地，所述方法还包括将步骤(4)得到的透明质酸溶液进一步冷冻干燥后得到粉末状的分散物的步骤。

其中步骤(1)中所用的多糖可以选自，但不限于，壳聚糖(例如，巯基化壳聚糖)，乳糖，半乳糖，海藻糖或蔗糖等。

其中所述生物活性蛋白或多肽选自各种细胞因子、白介素、干扰素，优选细胞因子，例如，但不限于，aFGF、bFGF、EGF、KGF、FGF21。

其中所用的透明质酸或透明质酸盐的分子量为3000～100万Da。透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐或锌盐，优选为透明质酸钠盐。

其中的生物活性蛋白或多肽为细胞因子、金属硫蛋白、白介素或干扰素，优选为细胞因子。

其中所用的透明质酸酶抑制剂为常用的透明质酸酶抑制剂，优选为天然植物来源的化合物，例如茶多酚、松果菊苷、类叶升麻苷等。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述制备稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液的方法包括下述步骤：

(1)壳聚糖(1％～5％，W／V)溶于0.05％冰醋酸中(pH5.6)，加入人血白蛋白，使其浓度为0.1～5％(W／V)，优选0.25％(W／V)，得到溶液A；

(2)透明质酸钠(HA，2.6Mda)制备成0.75％(W／V)水溶液B，内含茶多酚0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的HA；

(4)再浸入带负电荷的右旋糖酐溶液(0.1％，W／V)，pH5.6，含EGF100ng／m1)中，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所需要的稳定的负载生物活性蛋白、多肽的透明质酸溶液。

其中，加入右旋糖酐溶液可以利用电荷作用再铺一层膜，推动层层自组装技术的完成。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于该溶液还可冷冻干燥后得到粉末状的分散物。

根据本发明的一个方面，提供了一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于该溶液外用于烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤、微创伤皮肤的治疗，亦可用于完整皮肤起到紧致丰润的作用。

本发明还涉及本发明的稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液在制备用于皮肤治疗或皮肤美容的药剂中的应用。

本申请人已经为本发明的透明质酸溶液产品申请了商标：“时光梭”。

综上所述，本发明提供下述各项：

1.一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于其是以透明质酸和／或透明质酸盐为基质溶液，负载有一种或多种生物活性蛋白或多肽，所述一种或多种生物活性蛋白或多肽的含量为0～10％，W／V，同时复配有：透明质酸酶抑制剂，其含量为0～0.1％，W／V；蛋白活性保护剂，其含量为0～10％，W／V；和／或促渗剂，其含量为0～20％，W／V。

2.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，所述溶液含有0.001％～95％W／V的至少一种生理上可接受的透明质酸或透明质酸盐，其分子量为3000～100万道尔顿。

3.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐或锌盐，优选为透明质酸钠盐。

4.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的生物活性蛋白或多肽为细胞因子、金属硫蛋白、白介素或干扰素，优选为细胞因子。

5.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸酶抑制剂为常用的透明质酸酶抑制剂，优选为天然植物来源的透明质酸酶抑制剂，例如茶多酚、松果菊苷或类叶升麻苷。

6.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的蛋白活性保护剂为多糖，例如乳糖、半乳糖、海藻糖、壳聚糖、蔗糖，多元醇，例如甘露醇、甘油，表面活性剂，氨基酸类，例如组氨酸、精氨酸、甘氨酸，蛋白，例如人血白蛋白、牛血清蛋白，啤酒酵母多糖，优选壳聚糖和／或人血白蛋白。

7.根据第1项所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的促渗剂为天然植物来源的化合物，例如胡椒素、人参皂甙R或乳香提取物，优选人参皂甙。

8.根据第1项所述的透明质酸溶液，所述溶液外用于完整皮肤或损伤皮肤，其中所述损伤皮肤包括烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤或微创伤皮肤。

9.第1项所述的透明质酸溶液在制备用于皮肤治疗或皮肤美容的药剂中的应用。

10.制备第1项所述的稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液的方法，其特征在于所述方法采用层层(LbL)自组装技术得到超分子体，所述方法包含下述步骤：

(1)将多糖以1％～5％，W／V溶于pH5.6的0.05％冰醋酸中，加入人血白蛋白或牛血清蛋白，使蛋白浓度为0.1～5％W／V，优选0.25％W／V，得到溶液A；

(2)透明质酸或透明质酸盐制备成0.75％W／V水溶液B，内含透明质酸酶抑制剂0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的透明质酸或透明质酸盐，得到凝胶状溶液；

(4)再将步骤(3)的凝胶状溶液浸入含有有效量的生物活性蛋白或多肽的带负电荷的右旋糖酐溶液中，所述右旋糖酐溶液中右旋糖酐浓度为0.1％，W／V，pH5.6，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所述稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，

任选地，所述方法还包括将步骤(4)得到的透明质酸溶液进一步冷冻干燥后得到粉末状的分散物的步骤。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1是受试者1正位对比照片。(a)治疗前，面部干燥，颜色暗淡，可见明显皱纹；(b)治疗2周后，可见面部皮肤滋润，弹性增强，有饱满感，皱纹明显变浅，线条变细。

图2是受试者2侧位对比照片。(a)治疗前，面部干燥，颜色暗淡，毛孔粗大，可见明显色素沉着；(b)治疗2周后，可见面部皮肤滋润，毛孔有收缩，有立体感，色斑明显减弱

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

本发明技术人员应该理解，除非另外说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。

实施例1.制备稳定的负载表皮生长因子(EGF)的透明质酸溶液

(1)壳聚糖(1％，W／V)溶于0.05％冰醋酸中(pH5.6)，加入人血白蛋白，使其浓度为0.25％(W／V)，得到溶液A；

(2)透明质酸钠(HA，2.6Mda)制备成0.75％水溶液B，内含茶多酚0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的HA；

(4)再浸入带负电荷的右旋糖酐溶液(0.1％(w／v)，pH5.6，含EGF100ng／m1)中，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所需要的稳定的负载生物活性蛋白、多肽的透明质酸溶液。

实施例2.制备稳定的负载aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)的透明质酸溶液

(1)壳聚糖(1％，W／V)溶于0.05％冰醋酸中(pH5.6)，加入人血白蛋白，使其浓度为0.25％(W／V)，得到溶液A；

(2)透明质酸钠(HA，2.6Mda)制备成0.75％水溶液B，内含茶多酚0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的HA；

(4)再浸入带负电荷的右旋糖酐溶液(0.1％(w／v)，pH5.6，含aFGF100ng／m1)中，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所需要的稳定的负载生物活性蛋白、多肽的透明质酸溶液。

(5)将此透明质酸溶液冷冻干燥成粉末后分装备用。

实施例3.制备稳定的负载金属硫蛋白(MT)的透明质酸溶液

(1)巯基化壳聚糖(1％，W／V)溶于0.05％冰醋酸中(pH5.6)，加入甘氨酸，使其浓度为0.25％(W／V)，得到溶液A；

(2)透明质酸锌(HA，2.6Mda)制备成0.75％(W／V)水溶液B，内含透明质酸酶抑制剂0.1％(W／V)；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的透明质酸锌；

(4)再浸入带负电荷的啤酒酵母多糖溶液(0.1％(w／v)，pH5.6，含金属硫蛋白(MT)100ng/ml，人参皂苷R11μg/ml)中，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的啤酒酵母多糖，得到的溶液即为所需要的稳定的透明质酸溶液；

(5)将此透明质酸溶液冷冻干燥成粉末后分装备用。

实施例4.效果验证实验

方法：招募29名健康受试者(已与参与实验的受试者签订知情同意书)，早晚给予实施案例1制备的透明质酸溶液(由本申请人之一“广州伽蓝医疗科技发展有限公司”按照实施例1的方法制备)，每日2次，共2周。于治疗前后，进行主观评价、仪器检测皮肤红斑指数(erythema index，EI)及角质层含水量，于治疗后由受试者进行满意度评价。

结果：治疗侧导入治疗2周后，评价明显改善者0例，中度改善者6例(20.69％)，轻度改善者18例(62.07％)；受试者满意率为89.66％。无其他不良反应发生。具体可参见图1和图2。

图1是受试者1正位对比照片：(a)治疗前，面部干燥，颜色暗淡，可见明显皱纹；(b)治疗2周后，可见面部皮肤滋润，弹性增强，有饱满感，皱纹明显变浅，线条变细。

图2是受试者2侧位对比照片：(a)治疗前，面部干燥，颜色暗淡，毛孔粗大，可见明显色素沉着；(b)治疗2周后，可见面部皮肤滋润，毛孔有收缩，有立体感，色斑明显减弱。

结论：透明质酸原液可一定程度地改善皮肤皱纹，且无不良反应。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (10)

1.一种稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，其特征在于其是以透明质酸和／或透明质酸盐为基质溶液，负载有一种或多种生物活性蛋白或多肽，所述一种或多种生物活性蛋白或多肽的含量为0～10％，W／V，同时复配有：透明质酸酶抑制剂，其含量为0～0.1％，W／V；蛋白活性保护剂，其含量为0～10％，W／V；和／或促渗剂，其含量为0～20％，W／V。

2.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，所述溶液含有0.001％～95％W／V的至少一种生理上可接受的透明质酸或透明质酸盐，其分子量为3000～100万道尔顿。

3.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐或锌盐，优选为透明质酸钠盐。

4.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的生物活性蛋白或多肽为细胞因子、金属硫蛋白、白介素或干扰素，优选为细胞因子。

5.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的透明质酸酶抑制剂为常用的透明质酸酶抑制剂，优选为天然植物来源的透明质酸酶抑制剂，例如茶多酚、松果菊苷或类叶升麻苷。

6.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的蛋白活性保护剂为多糖，例如乳糖、半乳糖、海藻糖、壳聚糖、蔗糖，多元醇，例如甘露醇、甘油，表面活性剂，氨基酸类，例如组氨酸、精氨酸、甘氨酸，蛋白，例如人血白蛋白、牛血清蛋白，啤酒酵母多糖，优选壳聚糖和／或人血白蛋白。

7.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，其特征在于，其中的促渗剂为天然植物来源的化合物，例如胡椒素、人参皂甙R或乳香提取物，优选人参皂甙。

8.根据权利要求1所述的透明质酸溶液，所述溶液外用于完整皮肤或损伤皮肤，其中所述损伤皮肤包括烧伤皮肤、切伤皮肤、烫伤皮肤或微创伤皮肤。

9.权利要求1所述的透明质酸溶液在制备用于皮肤治疗或皮肤美容的药剂中的应用。

10.制备权利要求1所述的稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液的方法，其特征在于所述方法采用层层(LbL)自组装技术得到超分子体，所述方法包含下述步骤：

(1)将多糖以1％～5％，W／V溶于pH5.6的0.05％冰醋酸中，加入人血白蛋白或牛血清蛋白，使蛋白浓度为0.1～5％W／V，优选0.25％W／V，得到溶液A；

(2)透明质酸或透明质酸盐制备成0.75％W／V水溶液B，内含透明质酸酶抑制剂0.5％W／V；

(3)将等体积的溶液A覆盖在溶液B上，室温孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的透明质酸或透明质酸盐，得到凝胶状溶液；

(4)再将步骤(3)的凝胶状溶液浸入含有有效量的生物活性蛋白或多肽的带负电荷的右旋糖酐溶液中，所述右旋糖酐溶液中右旋糖酐浓度为0.1％，W／V，pH5.6，4℃孵育24h，超纯水中洗涤3次，除去过量的右旋糖酐，得到的溶液即为所述稳定的负载生物活性蛋白或多肽的透明质酸溶液，

任选地，所述方法还包括将步骤(4)得到的透明质酸溶液进一步冷冻干燥后得到粉末状的分散物的步骤。