CN102170868A - 包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物 - Google Patents

包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102170868A
CN102170868A CN2009801391387A CN200980139138A CN102170868A CN 102170868 A CN102170868 A CN 102170868A CN 2009801391387 A CN2009801391387 A CN 2009801391387A CN 200980139138 A CN200980139138 A CN 200980139138A CN 102170868 A CN102170868 A CN 102170868A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
heart
granule
tissue
igf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801391387A
Other languages
English (en)
Inventor
B·纳达尔希纳德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coretherapix SL
Original Assignee
Coretherapix SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39846672&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102170868(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Coretherapix SL filed Critical Coretherapix SL
Publication of CN102170868A publication Critical patent/CN102170868A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及例如在靶器官或组织上游给予时，适于靶向特定组织和/或器官的含有配制的活性成分的药物制剂，并且涉及该制剂在治疗中的应用，给予该制剂的治疗方法以及制备该制剂的方法。本发明的药物制剂用于向靶组织胃肠外给药，并且包括含有活性成分和生物可降解的赋形剂的颗粒，其中90％或90％以上的颗粒具有10和20微米之间的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米以及小于5微米的颗粒，使得在靶组织上游给予该制剂时，活性物通过靶组织并进入全身循环的能力受到限制。

Description

包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物
发明领域
本发明涉及适于靶向特定组织和/或器官的含有经配制的活性成分的药物制剂，例如在靶器官或组织上游给予。本发明也涉及该制剂在治疗中的应用，给予该制剂的治疗方法以及制备该制剂的方法。
特别地，通过利用诸如导管的装置，使用不同的生长因子和细胞因子活化实体组织的驻留干细胞群来刺激它的固有再生能力，该装置用于活性化合物向靶组织的局部递送。
发明背景
多数药品/药物是通过诸如口服、静脉内、疫苗、肌内等来全身给予的。值得注意的例外是涂有活性成分的支架，某些直接递送到肺的呼吸制剂、某些针对于靶区域的放射疗法以及某些局部给予的皮肤病学、眼科和耳科治疗。
然而，适当的时候，能够将药物主要递送至患病组织或器官是有益的，因为这将降低所需剂量并且也使副作用最小化。这样的方法将尤其对于两种主要方面的药品是有益的：a)施用能够活化特定组织中的驻留干细胞的生长和分化的生长因子和细胞因子。由于这些分子的潜在生物活性，希望将它们的作用限制在目的组织，而对于身体其它部分的溢出作用最小或没有；b)癌症化疗剂的递送，因为如果能够特异靶向癌组织，那么就可允许向靶细胞给予更高的剂量同时减小其可怕的毒副作用，至少达到显著的程度。
在更为急性的情况下，如心脏病发作和中风，如果能特异地靶向受影响的器官，那么更好的治疗是可能的，尤其是针对于受损组织再生的那些治疗。在慢性疾病的情况下，如帕金森病、糖尿病或肺纤维化，局部给予能够使缺陷细胞类型重构的试剂对于改善该疾病的预后是有潜能的。
然而，以治疗有效的方式将活性成分向靶组织或靶器官的可重复的递送在很大程度上受到所用组分(包括赋形剂)、它们的物理特性、递送剂量和模式的影响。
附图简要说明
图1、示出c-kitpos心脏细胞在成年猪心脏中的分布和特征。
图2、示出显示多种扩增的猪心脏细胞的光学显微镜图像。
图3、示出GF处理的猪心脏的H&E染色。
图4、示出内源CSC活化的证据。
图5、示出小的新形成的细胞的再生带。
图6、示出新形成的组织的多种图像。
图7、示出按照实施例1制备的具有IGF-1的PLGA颗粒的光学显微镜图像。
图8、示出按照实施例1制备的具有IGF-1的PLGA颗粒的电子显微镜图像。
图9、示出猪心脏的切片。
图10、示出给予聚苯乙烯微球或PLGA和生长因子微球后的猪心肌切片。
图11、示出猪心脏切片，其中内源心脏干细胞被突出显示。
图12、示出对照和受损四头肌的组织学图像。
图13A、比较用两种类型的微球组合AMI处理后，对猪的再生心脏肌细胞数目的影响。
图13B、示出由不同微球组合处理的猪的超声波心动描记法所测定的，AMI之前、AMI后马上以及AMI后4周的左心室射血分数。
本发明提供用于向靶组织胃肠外，尤其是动脉内给药的药物制剂，包括含有活性成分和生物可降解的聚合物赋形剂的颗粒，其中30％以上的颗粒具有25微米或以下的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米的颗粒，使得在靶组织上游给予该制剂时，活性成分通过靶组织并进入全身循环的能力受到限制。也就是说，活性成分被保留在靶组织中同时它通过靶组织并进入全身循环的能力受到严格限制或者消除。因此，在本发明的具体方面，提供用于向心脏组织胃肠外给药的药物制剂，所述药物组合物包括含有活性成分以及生物可降解的赋形剂的颗粒，其中90％或90％以上的颗粒具有10和20微米之间的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米和小于5微米的颗粒，使得在靶组织上游给予该制剂时，活性成分通过靶组织并进入全身循环的能力受到限制。在一个实施方式中，本发明药物的至少90％的颗粒具有在15和20微米之间的直径。
在本发明一个方面，提供用于向心脏组织胃肠外如动脉内给药的药物制剂，所述药物组合物包括含有活性成分以及生物可降解的赋形剂的颗粒，该活性成分选自由HGF和IGF-1组成的组，其中90％或90％以上的颗粒具有10和20微米之间的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米和小于5微米的颗粒，使得在心脏组织上游给予该制剂时，活性物通过心脏组织并进入全身循环的能力受到限制。
不希望受任何理论所限，认为本发明的制剂在靶组织或器官的上游动脉血给予时，通过循环被带入靶组织或器官中，并且由于颗粒大小和分布安置(lodge)，换言之，被该组织或器官的直径约5-10μm的毛细管所捕获或俘获。通常并不希望颗粒安置在毛细管中并阻断血流，但是受本发明制剂所影响的毛细管的数目相对很小，特别是因为该制剂允许使用极低的治疗剂量。此外，生物可降解的赋形剂融化、溶解、降解或以一些方式自身从活性物分离并因此最终除去“阻断”。因此，通过安置在毛细管中而限制/阻碍颗粒移动，即，使毛细管在短时间后返回天然状态的可逆过程。短时间内阻碍颗粒移动允许活性物在靶标附近维持适量的时间以促进局部作用或者活性物在组织血管外空间的吸收。
设计制剂使得即使不是全部活性物，但大多数活性物在固定在靶组织血管床的同时从颗粒释放。将颗粒设计为一旦活性物负载释放，则其降解并且其释放到大循环中的组成物质将被代谢或者将通过肝和/或肾清除。
本发明提供用于向靶组织胃肠外给药的药物制剂，包括含有活性成分和生物可降解的赋形剂的颗粒，其中30％或30％以上的颗粒具有25微米或25微米以下的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米的颗粒，使得在靶组织上游给予该制剂时，活性成分在该靶组织或器官中保留治疗上有效的时间。
特别地，本发明的制剂允许使用更少量的活性成分，这是因为多数活性物都被保留在靶组织中而不是被带入全身循环。这似乎增加了活性物的治疗窗。也就是说，使该成分为治疗上有效的剂量范围增加，允许给予更小的绝对量。更少剂量的局部给药意味着可能使副作用减小。
适当的剂量为例如，在0.05μg/Kg至约10μg/Kg的范围，例如0.1μg/Kg至约0.5μg/Kg，特别是0.15、0.2、0.25、0.35、0.4或0.45μg/Kg。
对于已知对刺激瘤发生有潜能的潜在分子如生长因子，局部给予更低剂量用于治疗效果尤其重要。虽然在正确的情形下，此种分子产生治疗上有益的效果，但是这些潜在的有害副作用限制了它们的应用。
本发明的制剂不使用包括聚苯乙烯、二氧化硅或其它非生物可降解的珠在内的附着有活性成分的微球，因为持久的弹性材料，即非生物可降解的材料如聚苯乙烯和二氧化硅可造成对局部毛细管的损害，并且可作为外来物并产生局部炎性反应。此外，此种非生物可降解的珠可能最终进入全身循环并可能随后例如在远组织如肺和肝中积累，而这些都是不希望的。
通常，各颗粒将包括活性物和赋形剂。对制剂的说明并不旨在指在简单共混物中的活性物的分散颗粒以及生物可降解的聚合物的分离颗粒。
上文中使用的基本上不含超过50微米的颗粒指满足按照美国药典和/或欧洲药典中记录的胃肠外制剂的给药要求的制剂。
在一个实施方式中，基本上不含可包括含有少于5％的所述颗粒，特别是少于1％，例如少于0.5％，例如少于0.1％。
在一个实施方式中，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，例如至少99％的颗粒具有25微米或25微米以下的直径。
在一个实施方式中，颗粒大小在6至25微米的范围，例如10至20微米，特别是15或20微米，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，例如至少99％的颗粒是相关尺寸或在所述范围内。因此，在本发明的一个实施方式中，至少95％，至少98％或至少99％的药物组合物的颗粒具有10和20微米之间的直径。在另一实施方式中，至少95％，至少98％或至少99％的药物组合物的颗粒具有15和20微米之间的直径。
在一个实施方式中，制剂不含有直径小于1微米的颗粒。
在一个实施方式中，制剂不含有直径小于5微米的颗粒。
在一个实施方式中，至少30％具有活性物的颗粒在给药后保留在靶组织中，例如至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，例如至少80％或80％以上的活性颗粒被保留。
在一个实施方式中，活性颗粒在靶组织或器官中保留5分钟至24小时范围的时间，例如30分钟至5小时，例如1、2、3或4小时。
制剂保留在相关组织或器官中的时间主要取决于所用赋形剂或所用赋形剂的组合。因此，体内赋形剂所需的特性是：
·它是生物相容的(即通常是非毒性的并且适于给予人和/或动物)，
·在给药后的合适的时间框架内，它起维持颗粒完整性的作用，使得足以阻碍颗粒移动，通过例如使颗粒在靶组织或器官中的毛细管或小动脉中安置，
·它是身体可生物降解的(即它能够被加工或代谢)以释放该活性物以及在活性物被释放后是可降解的。
因此，适用于本发明的生物可降解的聚合物赋形剂是在体内没有长驻留时间的聚合物或共聚物，它应不包括实体如聚苯乙烯、聚丙烯、高密度聚乙烯以及具有相似性质的材料。生物可降解的聚合物必须是非毒性的并且优选局部分解成非毒性亚基，使得来自赋形剂的循环片段/碎片的量最小。
适当的赋形剂可见于美国药典(USP)并且包括无机以及有机的天然和人造聚合物。实例可包括聚合物如聚乳酸、聚乙交酯或其组合即聚乳酸乙醇酸共聚物(polylactic co-glycolic acid)、聚己酸内酯(它具有比聚乳酸乙醇酸共聚物更慢的生物降解速率)、聚羟基丁酯或其组合。聚氨基甲酸酯、聚糖、蛋白质和多氨基酸、碳水化合物、kitosane、肝素、聚透明质酸等也可能是适合的。赋形剂通常是颗粒的形式，近似球形(微球)，活性物可以附着或者活性物与之相连或包含在其中。
脂质体不是本发明定义中的生物可降解的的聚合物赋形剂。脂质体是通常包括胆固醇的磷脂双层的介载体。对于诸如由动脉硬化诱导的心肌梗死的疾病，胆固醇水平作为该疾病的风险因子之一被监测，因此，建议避免向这种患者给予含有胆固醇的制剂。此外，肝硬化患者代谢脂和膳食脂肪的困难可能增加，因此，不建议向这种患者给予脂质体。
在一个实施方式中，生物可降解的赋形剂不是水凝胶(相应胶状分散相的连续相)。
因此，活性物“释放”速率和颗粒“溶解”速率可以通过改变赋形剂或/和将活性物与赋形剂结合的方法来改变，因此例如使用聚己酸内酯将提供比相应使用聚乳酸乙醇酸共聚物的颗粒花更长时间来溶解或崩解的颗粒。如果活性物包埋到赋形剂中，它将比在颗粒表面上时的释放更慢。如果在颗粒表面并且通过静电电荷相结合，它将比共价结合时的释放更快。
在一个实施方式中，赋形剂包括聚乳酸乙醇酸共聚物。
在一个实施方式中，基本上所有的颗粒，例如80、85、90、95、96、97、98、99或100％的颗粒包括聚乳酸乙醇酸共聚物。
在一个实施方式中，分别地，聚乳酸乙醇酸共聚物为75∶25的比例。
在一个实施方式中，赋形剂包括两种或两种以上的不同聚合物，术语聚合物包括共聚物。
在一个实施方式中，赋形剂可包括丙烯酸酯聚合物，例如丙烯酸甲酯聚合物。
在一个实施方式中，颗粒包括藻酸盐。
在一个实施方式中，赋形剂包括生物可降解形式的聚氨基甲酸酯。
在一个实施方式中，赋形剂是微球的形式。
在一个实施方式中，本发明使用聚乙烯醇微球制剂。
在一个实施方式中，微球不是白蛋白。
在一个实施方式中，所用活性物封装在例如选自Eudragit范围的生物可降解包衣中。
在一个实施方式中，一或多个活性分子包埋在颗粒中。
对于按本发明所述执行该活性化合物，它们需要作为微粒给予循环，该微粒因为它的尺寸、形态学和组成将随血流运动以达到它的靶组织。在该靶标处，颗粒应以可控的方式释放它的活性物负载。为了实现这一目标，一旦卸载，该颗粒应被降解并且它的组成或者被代谢或者被递送到全身循环中以通过身体的正常排泄系统被清除。
为了实现这些目标，微粒应满足下面的特征：
该微粒应为均一尺寸和形态以便确保它们达到在循环系统的设计位置并得到安置。尺寸和形状的均一性在颗粒为球形时受到更好控制。
多数毛细管床允许具有直径＜6微米的颗粒自由通过，本发明的微球应具有＞6微米的直径，并且优选约15微米。直径在20微米范围或更大的颗粒安置在前毛细管小动脉或小动脉中并立即阻断血液流到若干毛细管中。因此，它们可产生微观梗死。因此，为了再生疗法的递送，微球的最适当的直径在15微米的范围内。然而，此外，根据本发明考虑使用直径为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25微米的颗粒。
一旦活性化合物到达它们的靶标，那么释放它们所需的时间可在几分钟至几天甚至几周的范围，这取决于微球类型以及治疗目的。
微球应该用生物可降解的且无毒的化合物来制造。颗粒的稳定性以及它的降解时间将取决于微球的组成和类型。它可设计为在它开始降解前递送它的负载；或者它可设计为在颗粒递送负载时发生它的崩解。
用作赋形剂的聚合物的性质、它的尺寸、单体之间的键的不稳定性以及交联程度如果有就会影响活性物的释放速率以及颗粒的稳定性和降解性。
在所有实施方式中，微球应在溶液中足够稳定以使它们在给药到循环以及它们到达靶血管床所需的时间期间基本上不会分解或降解。
在本发明的适当实施方式中，每种颗粒将携带一种类型的活性化合物。当认为化合物的混合物对于治疗目的有益时，可给予每种微粒负载有单一化合物类型的微粒的混合物。这一设计简化了治疗性化合物的生产并且提供更大的治疗灵活性，从而允许迅速制备的个性化药物满足患者的个体特定需求。
在一个实施方式中，所用颗粒只使一种类型的活性分子与其结合。
在一个实施方式中，所用颗粒使混合物如二、三或四种活性分子与其结合。
活性化合物可在其形成时加载到颗粒上，例如遍布颗粒分散。
活性化合物可封装在由赋形剂形成微球壳的颗粒中。
在一个实施方式中，活性物通过共价键与颗粒结合，例如多肽或蛋白质通过用醛如甲醛或戊二醛处理而通过交联来与微球结合，例如通过在活性物、适当的醛存在下，乳化微球(或微球的成分)并且在适合形成所需尺寸的颗粒条件下，使混合物均质化。或者，活性物可结合到位于赋形剂微球上的羰基基团上。
在一个实施方式中，活性物通过静电力(电荷)与颗粒结合。
在一个实施方式中，活性物通过聚电解质与颗粒结合，聚电解质如包括钠、钾、镁和/或钙离子与氯化物对离子的水性溶液。
在一个实施方式中，活性物在聚电解质层之间与颗粒结合。
活性化合物可通过电荷(静电力)或共价结合而加载到颗粒表面。在一个实施方式中，活性物通过静电电荷与颗粒结合。
在一个实施方式中，活性物通过聚电解质与颗粒结合，例如利用覆盖该颗粒的聚电解质壳，活性物通过电荷附着在其上。
活性化合物可在颗粒表面形成单层或者可沉积为连续或通过聚电解质层分离的多层。
活性化合物可通过“连接物”与颗粒结合，该“连接物”一方面与赋形剂基质结合，另一方面与活性化合物结合。这些键合可为静电的或共价的。
例如，微粒可通过冻干法而稳定。微粒在冷冻时也可为稳定的。
在一个实施方式中，赋形剂在几分钟至几小时，或者在更长时间如几周至几个月的范围内快速降解。
在一个实施方式中，制剂是使得一旦在循环中，一种或多种活性物例如在1至30分钟至约1至12小时范围的时间内快速释放。
在一个实施方式中，本发明涉及颗粒的混合群，也就是说，具有不同“溶解”速率的颗粒，其可用于提供受控释放或脉冲释放的试剂。
因此，本发明的制剂可以包括具有不同释放动力和降解速率的颗粒。
在一个实施方式中，活性物在1至24小时的时间释放。
在一个实施方式中，活性物在1天至7天的时间释放。
因此，在一或多个实施方式中，本发明的所有制剂在给药7天内被代谢。
在一个实施方式中，一旦在个体循环中，活性物在几周至几个月的期间缓慢释放，例如1周至1、2或3个月。
在一个实施方式中，颗粒群被充分表征并且例如具有相同的特性。也就是说，每种颗粒的物理和/或化学特性落入很窄的限定范围内。
在一个实施方式中，微球的尺寸是单分散(monodispersed)的。
因此，在一个实施方式中，制剂的颗粒的平均颗粒大小具有小的标准差，例如至少68％的颗粒具有平均值+/-1微米的尺寸，例如99％的颗粒具有平均值+/-1微米的颗粒大小(例如15+/-1微米)。此外，本发明也包含具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％或至少98％的颗粒在平均值+/-1微米内的组合物。
在一个实施方式中，制剂包括颗粒群，其特征为所述群含有至少两种不同类型的颗粒，例如，不同的颗粒可具有不同的活性物、包衣、颗粒大小或其组合。
在一个实施方式中，本发明涉及混合的颗粒群，其包括活性物颗粒与一种或多种其他不同的活性物的颗粒共混。
似乎制剂的颗粒大小和分布影响该制剂的体内谱，包括该制剂如何在组织内分布。似乎这对于简化颗粒平均颗粒大小在10至20微米范围内是不够的，因为这允许一些颗粒具有更大的颗粒大小以及一些还具有更小的颗粒大小。这一变化可以在体内造成问题，因为例如，小颗粒未保留在相关组织中而较大的颗粒可以损害组织。
所用活性物∶赋形剂的量可为10％∶99％w/w、5％∶95％w/w、10％∶90％w/w、20％∶80％w/w、30％∶70％w/w、40％∶60％w/w、50％∶50％w/w、60％∶40％w/w、70％∶30％w/w、80％∶20％w/w或90％∶10％w/w的比率，取决于需要哪种释放谱。如果需要在体内快速或者立即释放活性物，那么可选择较高的活性物与赋形剂的比率。
在一个实施方式中，所用微球具有约16小时的半衰期。
在一个实施方式中，制剂是冻干的。
在另一实施方式中，制剂是冷冻的。
本发明的颗粒的磁性并未到可感知的程度。
活性成分可以是可按本发明的颗粒形式给予的任何药品或药物。
在一个实施方式中，给予15×106个颗粒(微球)，例如给予14×106、13×106、12×106、11×106、10×106、9×106、8×106、7×106、6×106、5×106、4×106、3×106、2×106或1×106个颗粒。
在此使用的颗粒可包括例如，微粒化的药物、半固体或水合实体如按分散颗粒来制备的蛋白质或生物源活性物，只要颗粒维持它的结构足够的时间以执行所需功能。本发明也延及具有液体核心的颗粒，只要该颗粒的外部完整性使它可以在体内执行它的功能。本发明不延及具有气体核心的颗粒。
可通过使聚合物溶液乳化，随后蒸发溶剂来制造微球。在其它情形下，将单体乳化然后热聚合或UV聚合。或者将聚合物熔融物乳化并相继冷却以使微滴凝固。乳剂的尺寸减少可以通过使主体均质化或超声处理而获得。该微球可以通过过滤和/或离心反应混合物而收集。
很久以前就知晓了多种形式的用于不同药物组合物和治疗性大分子的受控释放和靶向递送的生物可降解的微球和生物聚合物的微胶囊，特别是如本发明所述的相对大直径的那些(参见D.D.Lewis“Biodegradable polymers and drug delivery systems”M.Chasin和R.Langer编辑(Marcel Dekker，New York，1990)；J.P.McGee等人，J.Control.Release 34：77，1995)。
微球和微胶囊是通过机械物理方法如将组成型单体喷射到该尺寸的微滴中，随后进行干燥或聚合步骤而常规生产的。此种微颗粒也可以通过乳化随后除去乳化溶剂而形成(B.Miksa等人，Colloid Polym.Sci.273：47，1995；G.Crotts等人，J.Control.Release 35：91，1995)。这些方法的主要挑战是生产形状和大小恰当的颗粒的单分散群。例如，这可以使用流动聚焦技术而实现，其中使用毛细管喷雾器来形成适当尺寸的微滴。在该工艺中，该组分浸入用于溶解/悬浮微粒组分的收获溶液/溶剂，随后进行溶剂蒸发来提供凝固的微粒。
这一工艺可能需要微粒的所有组分都组合成单一混合物(聚焦的化合物)，从该混合物产生将形成微粒的微滴。由于许多用于药物递送的聚合物是疏水的，而多数治疗性大分子并且特别是蛋白质是亲水的，因此该混合物需要乳化以确保在形成微粒之前获得均质组合物。
或者，例如可通过在阳极/阴极型设置下，将活性物的溶液从带有净电电荷的喷嘴朝带有相反电荷的板或实体的运流电流中吸至微球中来制备颗粒。
在一个实施方式中，所用颗粒具有净电电荷，例如正电荷或负电荷。这可例如辅助滞留在靶组织或器官中的颗粒移动。该净电荷可在用于给药的制剂中被小尺寸(如小于5微米)的相反离子球(例如没有活性物)所平衡，这些离子球在给药后不会在靶组织中滞留。
在一个实施方式中，该活性成分是生物分子或源自生物分子，例如蛋白质如抗体或生长因子，细胞因子或实体的组合。
特别地，本发明的制剂尤其用于靶向/活化在相关组织中发现的驻留干细胞。
在一个优选的实施方式中，本发明用于活化特定组织或器官的驻留干细胞、祖细胞和/或前体细胞以刺激所述细胞或器官的再生。
在一个实施方式中，本发明涉及局部给予由在出生后组织中存在的干细胞所表达的受体的配体以起始该组织的再生。该配体可例如为在此所述的生长激素。
在一个实施方式中，给予配体以活化在各靶组织中存在的多数未分化干细胞上存在的受体。这些细胞表达所谓的“多能基因”，例如Oct 4、Sox2、Nanog等并且它们具有潜在的再生能力(下文称作表达Oct4的干细胞)。
在一个实施方式中，向心脏给予配体以使例如由心肌梗死造成的组织损伤最小和/或使组织再生。
当动脉受阻时，主要影响是阻塞下游的组织的损失。冠状动脉阻塞的特定结果是心肌梗死(MI)，它造成部分心肌的不可逆损失。这一损失导致心肌的收缩能力以及心脏的泵送能力的降低，这些降低在足够明显时限制它提供适合的心脏输出的能力并且产生个人能力的严重的以及进行性的限制(综述于Nadal-Ginard等人，Circ.Res.2003；92：139)。
在美国和欧洲，每年各有超过150万心肌梗死得到治疗并且超过1100万心肌梗死存活者(American Heart Association，2007；British Heart Association，2007)。这些之中，超过30％在梗死后第一年期间死亡。心肌梗死后的存活在很大程度上依赖于由于缺血事件而造成的梗死大小(肌肉量损失％)。当该损失影响约40-45％的左心室质量时，它产生均致死的不可逆的心源性休克(Page等人，1971.N.Engl.J.Med.285；133)。这一部分心肌损失造成剩余心肌的重新组织，具有因细胞凋亡而增加的细胞死亡，存活肌细胞的肥大，增加的组织纤维化以及室腔的膨胀(Pfeffer，M.A.& Braunwald，E.，1990.Circulation 81：1161)。这一重新组织，称作“重塑”，由于它对收缩性的负面影响，频繁参与心力衰竭(CF)。在心肌梗死后的CF首次发作后，平均存活率＜5年，每年死亡率为约18％(American Heart Association，2000)。
多数或者所有治疗由于缺血或其它成因的实质组织损失的疗法都针对保持或改善存活组织的功能。在心肌梗死的情形下，目前所有用于治疗心脏收缩肌损失的后果的疗法都针对保留或者增强存活组织的收缩功能以及减少这些肌肉细胞因凋亡或坏死的连续损失(参见Anversa &Nadal-Ginard，2002.Nature 415：240；Nadal-Ginard等人，2003.Circ.Res.92：139)。目前，没有一种设计用于再生或代替心肌梗死中的肌细胞损失，并且以此方式，恢复心脏收缩功能的改善疗法。此外，到目前为止所述的所有实验手段都针对于通过刺激毛细管网络的增加来改善向缺血/坏死区的血流，最常见地，通过直接或者间接将或者以蛋白质形式或者以cDNA形式的生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)递送到受影响的区域。没有一种疗法针对于组织中的驻留干细胞以刺激它们繁殖和分化以便一起再生因血管事件造成的实质和微循环损失。
对于急性心肌梗死的治疗方法的目标是尽可能早地恢复受损肌肉的血流以预防进一步的肌肉损失。这些再灌注疗法包括使用溶血栓剂、气囊血管成形术或搭桥手术。1998年，在美国，进行了＞500,000例血管成形术以及相似数量的搭桥手术。这些疗法通常在恢复缺血肌肉的血流方面是成功的，但是没有一种能够在干预时期替换已经损失的单个肌肉细胞。如果这一损失是大量的，那么长期结果是不能产生所需的心脏输出，这将不可阻挡地演变为末期的心力衰竭。
迄今为止，有效治疗末期心力衰竭的唯一选择是心脏移植，它承担所有医药(免疫抑制疗法)、后勤和经济问题。即使可以绕开这些问题，但是供体的短缺也使得这一疗法可用于＞1％的心力衰竭患者。
本发明的制剂允许通过刺激已经存在于组织中的干细胞再生，将待给予的治疗有效的分子以可以特异靶向组织或器官如心脏的形式给药以再生组织，例如由动脉阻塞所损坏的组织。
用于组织再生的干细胞疗法---近来，已经开发了一些实验手段来替代器官移植，该手段旨在代替被目的器官或组织损失的一些细胞的。这些手术在已经进行了半个世纪的骨髓移植中的成功而模式化。在移植到免疫活性适格个体时，骨髓中的小细胞群产生所有血细胞类型的能力令人信服地证明了成年组织含有能够产生和再生组织或整个器官的“干细胞”。这一概念上的突破造成使用不同类型的干细胞来修复受损组织的实验手段的发展，所述干细胞分离自待处理的个体(自体细胞疗法)或分离自与接受它们的个体不同的个体(异源细胞疗法)。这些细胞或者是大量分离的或者首先在培养基中扩增然后移植以产生对受影响的组织的需要的修复。这些细胞疗法手段利用干细胞的天然再生特性用于组织再生。
在此使用术语“干细胞”来指具有自体更新特性(产生许多像它自己的细胞)、形成无性系的(可以从单细胞开始扩增的)以及多潜能的细胞；也就是说，它可以产生将分化成通常存在于它们所处的组织中的不同细胞类型的后代。也即，起源自干细胞的细胞将获得该干细胞所起源的或者它移植到的组织或器官的特定细胞特异化特征(Stem Cells：A Primer.2000.National Institutes of Health USA)。
术语“多能的”指能够分化成多种不同细胞类型的细胞。在本申请的上下文中，术语“四能的”指尽管可能不是全能的(能够产生整个个体)，但是能够产生四种不同细胞类型；例如心肌细胞、血管内皮和平滑肌细胞以及结缔组织成纤维细胞。
术语“祖细胞”指这样的干细胞后代，其已经置于特定分化途径并且因此具有比干细胞更加受限的分化潜能。祖细胞具有很强的增殖能力，并且尽管它不再表达分化标记，但是它具有产生比其自身更加分化的后代的能力。例如，该术语可指未分化的细胞或者已经在一定程度上分化成除其最终分化细胞以外的细胞。这一细胞能够增殖并且产生更多的祖细胞，因此具有产生大量母细胞的能力，该母细胞可以接下来产生分化的或可分化的子细胞。特别地，术语“祖细胞”指广义的母细胞，它们的后代通常以不同方向特化，例如通过获得完整的个体特性，如在胚细胞和组织的进展性多样化中发生的。祖细胞比实际的干细胞更进一步分化，因为祖细胞已经在一定程度上限制了它所起源的干细胞的多能性。
如在此使用，除非上下文另有指明，否则干细胞指干细胞、祖细胞和/或前体细胞。
细胞分化是通常通过多个细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可源自多能细胞，该多能细胞自身又源自多能细胞，等等。尽管可将这些多能细胞中每个都当成干细胞，但是每种可以产生的细胞类型范围可能变化很大。一些分化的细胞也具有产生更大发育潜能的细胞的能力。此种能力可以是天然的或者可以通过用多种因子处理来人工诱导，如近来证明用iESCs(诱导的胚胎干细胞)诱导(Takahashi等人，2007.Cell 131：1-12)。
“前体细胞”是祖细胞的后代，它进一步经历分化途径并且已投入向单细胞类型分化，尽管它可能尚未表达这一细胞类型的任何可鉴定的标记。前体细胞通常是在可鉴定的分化表型出现前经历最后一轮扩增的细胞。
干细胞存在于囊胚泡的内细胞团、早期胚的生殖脊、胎盘中以及在成年动物(包括人)的多数组织中。相比于源自囊胚泡的内细胞团的干细胞，通常，从成年组织分离的干细胞实际上是真正的干细胞、祖细胞和前体细胞以及在它们最终分化的最早期的细胞的混合物。现在在实践中已在所有源自三个胚细胞层(内胚层、中胚层和外胚层)中每层的组织(骨髓、中枢和外周神经系统、所有结缔组织、皮肤、肠、肝、心脏、内耳等)中鉴定了成体干细胞。
似乎这些成体干细胞具有再生能力。出人意料地，尽管缺血性心脏病在所有发达国家中的高普遍性、严重性以及高经济成本，但是目前为止没有对于靶向成人心肌的再生方法的研究。这一反常的原因之一是直到近来都认为心脏是其收缩性细胞不具有任何固有再生能力的最终分化的器官(MacLellan，W.R.& Schneider，M.D.2000.Annu Rev.Physiol.62：289；Reinlib.L.和Field，L.2000.Circulation 101：182；Pasumarthi，K.R.S.和Field，L.J.2002.Circ.Res.90：1044；MacLellan，W.R.2001.J.Mol.Cell Cardiol.34：87；Perin，E.C.等人2003.Ciculation 107：935；参见Anversa，P.和Nadal-Ginard，B.2002.Nature 415：240；Nadal-Ginard，B.等人，2003Circ.Res.92：139)。这一概念是基于实验上充分证明的事实，即在成年心脏中，大多数心肌细胞是最终分化的并且它们再次进入细胞循环的能力被不可逆地阻断。因此，毫无疑问这些肌细胞不能再生来产生新的肌细胞。
将心肌作为没有再生潜能的组织这一普遍观点的一个结果是至今实施的所有的所谓实验“再生疗法”都是基于在受损心脏内引入不同细胞类型，这些细胞或者是胎儿肌细胞或者被认为是在分化成这一细胞类型具有一些潜能或进入毛细管和微小动脉方面以取代在梗死期间损失的细胞。以此方式，进行动物实验来移植胎儿和成人骨骼肌前体细胞、胎儿心肌细胞以及或者处于其未分化状态或者在它投入心肌细胞途径之后的胚胎干细胞(Kocher等人，2001.Nature Med.7：430)。
除了可以是自体的骨骼肌前体(不能转变成心肌细胞并且不能与心肌细胞电偶联)(Menasche等人，2001.Lancet 357：279；C Guo等人，2007.J Thoracic and Cardiovasc Surgery 134：1332)以外，列出的所有其它细胞类型必需是异源的并因此或者伴有免疫抑制疗法或者移植物被免疫系统迅速消除。事实是这些手段中没有一种被证明对于临床前期是非常有效的并且所有都具有许多缺陷。
一些成体干细胞的最令人感兴趣的特征之一是它们的“可塑性”。这一特性指这样的事实：当将某些干细胞放在与它们起源的细胞不同的组织中时，它们可以适应这一新环境并分化成特征是宿主组织而非供体组织的细胞类型。尽管这一可塑性的外延和本质对于许多细胞类型仍旧是有争议的(Wagers & Weissman，2004.Cell 116：636-648；Balsam等人，2004 Nature428，668-673；Murray等人，2004.Nature 428，664-668；Chien，2004.Nature428，607-608)，但是它已经产生了无数的临床前方案以及临床试验。
在迄今所述的成体干细胞中，主要研究了来自骨髓的干细胞以及显示出更大程度的“可塑性”的干细胞(Kocher等人，2001.Nature Med.7：430)。也广泛使用源自脂肪组织的所谓的“充质干细胞”(Rangappa，S.等人，2003.Ann.Thorac Surg 75：775)。
骨髓和脂肪组织源性干细胞再次在不同组织和器官的受损区成群的能力、其分离的相对容易性以及Asahara等人，(1999；Circ.Res.85：221-228)的早期工作一起证明了对于在实验动物(Orlic等人，2001.Nature 410：701；Orlic等人，2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：10344；Nadal-Ginard等人，2003.Circ.Res.92：139)和人(Tse等人，2003.Lancet 361：47；Perin等人，2003.Circulation 107：2294)中再生心肌的细胞疗法的目的是有益的。尽管受到一些质疑，(Balsam，L.B.等人，2004.Nature 428：668；Murry，C.E.等人，2004.Nature 428：664)，但是很明显骨髓源性干细胞在某些条件下能够产生心肌细胞、毛细管和微小动脉，特别是在移植到实验心肌梗死的边缘区中时(Quaini，F.等人，2002.New Engl.J.Med.346：5；Bayes-Geis，A.等人，2003.Cardiovasc.Res.56：404；Bayes-Genis，A.等人，2004.Eur.J.Heart Fail.6：399；Thiele，H.等人，2004.Transplantation77：1902)。没有从用骨髓或脂肪组织源性干细胞进行的细胞疗法的众多临床试验中得到相似信息，因为没有可靠的组织病理学数据可用于评估。
用于心肌细胞疗法的技术的主要缺陷是细胞移植手术自身的复杂性以及低效性。当通过冠状动脉分支来移植细胞时，只有3-5％保留在心肌中而其余则遍及身体分布。如果直接将细胞注射到心肌中，那么需要胸廓切开术或者使用复杂且耗时的设备(Noga-型系统)以便鉴定靶标区域。这一技术需要专业的操作人员并且只能在专业的医疗中心中使用。此外，经心内膜(Noga)或者经心外膜(手术)途径的心肌内注射仍旧将＜50％的细胞递送到组织中。
无一例外，迄今开发用来在实验动物或人心肌梗死后产生心肌再生的所有细胞疗法手段都彻底忽视心肌具有由其驻留干细胞所代表的固有再生能力的事实(Nadal-Ginard，B.，等人，2003.J.Clin.Invest.111：1457；Beltrami等人，2003.Cell 114：763-776；Torella，D.，等人，2004.Circ.Res.94：514；Mendez-Ferrer，S.等人，2006.Nature Clin.Prac.Cardiovasc.Med.3 Suppl 1：S83；Torella等人，2007.Cell.Mol.Life Sci.64：661)。
如上所述，迄今，已接受的范例将成年哺乳动物心脏当作有丝分裂后的没有再生能力的器官。尽管过去数年中这一概念已开始发展，但是心肌再生的所有实验和临床手段还一直基于老教条。出于这一原因，所有的心脏再生方案都基于细胞移植以便为心肌提供具有再生潜能的细胞。
现在，似乎当在适当条件下给予本发明的制剂时，驻留在组织或器官(例如心脏)中的“干细胞”的固有再生能力可以受到刺激或活化以使该组织或器官再生。
因此，在一方面，本发明提供在包括人在内的活体哺乳动物中再生实体组织的方法，该方法包括局部递送由待再生的出生后组织中存在的干细胞所表达的受体之配体。这些细胞在生理上或药理学上受到刺激时原位扩增并分化为特征为包含它们的组织或器官的实质细胞。
在正常心脏和诸如心肌梗死和心力衰竭的病理条件中都检测到新的心肌细胞形成(Beltrami，A.P.等人，2001.New Engl.J.Med.344：1750；Urbanek，K.等人，2003.Proc.Netl.Acad.Sci.USA.100：10440；Nadal-Ginard，B.等人，2003.J.Clin.Invest.111：1457；Nadal-Ginard，B.等人，2003.Circ.Res.92：139)。令人感兴趣地，这些新的肌细胞在心肌梗死的边缘区明显更充裕，它们在边缘区比在年龄匹配的健康个体的心肌中多一个数量级。这些观察表明成年人心肌具有通过试图替代死亡肌细胞的没有结果的再生过程来响应细胞死亡的急性和慢性增加的能力(Anversa，P.& Nadal-Ginard，B.2002.Nature 415：240；Anvrsa，P.和Nadal-Ginard，B.2002.New Engl.J.Med.346：1410；Nadal-Ginard，B.等人，2003.Circ.Res.92：139)。
成体心脏干细胞(CSC)首先描述于2003年(Beltrami等人，2003.Cell114：763-776)并且由许多作者在相同或其他物种中进行了确认(参见Torella，D.等人，2004.Circ.Res.94：514；Mendez-Ferrer，S.等人，2006.Nature Clin.Prac.Cardiovasc.Med.3 Suppl 1：S83；Torella等人，2007.Cell.Mol.Life Sci.64：661)。这些CSC是自体再生的、产生克隆的以及多能的，因为它们产生心肌细胞、内皮和平滑肌血管细胞以及结缔组织成纤维细胞。它们通过表达与干细胞相关的膜标记如SCF的受体c-kit、Sca I、MDR-1和Isl-I而被鉴定。目前已清楚在成年心脏中形成的新的肌细胞源自心肌中驻留的CSC。这些CSC在梗死边缘注射时具有使作为大量心肌梗死结果而损失的收缩性细胞和微脉管系统再生的能力(Beltrami等人，2003.Cell：114：763-776；Laugwitz等人，2005；Mendez-Ferrer等人，Torella等人，2006；Torella等人，2007)。
在健康个体的心脏中，几乎所有的CSC都处于静止期(G0)或者在生物体的生命期期间非常缓慢地循环。在任何给定的时间，这些细胞中只有极小部分是活跃的，经历恰好足够代替通过耗损而死亡的细胞的复制和分化。相反，大量(有时是大多数)CSC被活化以响应生理或病理应激。通常，在应激程度和在响应中激活的CSC数量之间存在直接相关。这一活化的CSC的数量接下来也直接与产生的新的心肌细胞数量相关。这一从鼠到人都发生的响应(Nadal-Ginard，B.等人，2003.Circ.Res.92：139)揭示了通过造成CSC活化的应激所引发的生物途径的存在。
在驻留干细胞和它们的环境(至少在心肌中)之间的通讯，是由心肌细胞之间的反馈回路所调控的，其感知心脏输出时增加的生理或病理需求而产生的壁应激的改变，并且干细胞负责通过产生新的收缩性细胞和营养它们的微循环来产生肌肉量的增加。肌细胞具有对于应激的固有(stereotypical)响应，而不管它是生理的或病理的(Ellison等人，2007.J.Biol.Chem.282：11397-11409)。这一响应由下述物质的一连串的快速活化表达和分泌所组成：生长因子和细胞因子如HGF(肝细胞生长因子)，IGF-1(胰岛素样生长因子1)，PDGF-β(血小板源生长因子β)，FGF(成纤维细胞生长因子)家族，SDF-1(基质细胞源因子1)，VEGF(血管内皮生长因子)，促红细胞生成素(EPO)，表皮生长因子(EGF)，激活蛋白A和TGFβ(转化生长因子β)，WINT3A和神经调节蛋白等。这一分泌响应除了通过自动/旁分泌回路来刺激肌细胞自身的肥大以外，还引发它们附近的CSC的活化，因为这些细胞表达针对这些肌细胞分泌的生长因子的受体并响应它们。这一响应使负责细胞存活、增殖和分化的受体下游的遗传途径活化。此外，这些受体的活化也使得CSC自身的反馈回路活化，其通过CSC来刺激各配体的产生，从而使应答单个刺激的自体维持的响应可以保持活跃数周或直到所产生的增加的量将心肌壁应激水平恢复到正常水平。因此，CSC通过允许维持对短期刺激的持久响应的自动/旁分泌应答来响应旁分泌刺激。因此，正常心脏细胞体内平衡通过在肌细胞和CSC之间的连续的反馈被维持，以产生和维持产生所需血液心脏输出所需之合适的收缩性肌肉质量。不能分裂的肌细胞依赖CSC来维持或增加它们的细胞数以及毛细管密度以保证它们的氧气和营养供给。另一方面，CSC根据并响应通过它们周围的肌细胞所产生的生化诱因来调节它们的静止vs活化状态。
除了上述组织特异性干细胞外，我们近来发现包括人在内的哺乳动物的心肌，以及多数其它组织，都含有小量极度未分化的细胞，这些细胞与长期被认为是多能的胚胎干细胞(ESC)具有许多相似性；即单细胞在放入适当的环境中时能够产生于它所起源的生物体相同的整个生物体。这些细胞的主要特征是它们表达一连串的所谓的“多能基因”如Oct4、Sox2、Nanog等(参见美国临时申请系列号61/127,067)，这些多能基因赋予这些细胞多潜能，使得与它们的组织来源无关，它们似乎能够产生身体中即使不是所有但也是大多数的细胞类型。特别地，分离自成人心脏的表达Oct4的细胞能够产生骨骼肌、神经元、心脏、肝等。它们的再生能力似乎比组织特异性干细胞更稳健且更广。
相信表达Oct4的细胞尽管不是所有，但也是每种器官的多数组织特异性干细胞的来源，并且它们的刺激是每一个体组织的再生能力的主要来源。因此，这些细胞的刺激是在此所述的治疗手段的主要靶标。
如已经实验证明，与干细胞产生心肌细胞的能力和/或效率无关，当将大量干细胞引入组织时，不管它们的组织来源如何，它们在移植到心肌和其它组织时都具有重要的旁分泌作用。通过移植细胞所产生的生长因子和细胞因子的复杂混合物对于处于风险的区域中的心肌细胞和其它细胞都具有潜在的抗凋亡作用，并且也使繁殖且分化成肌细胞以及微脉管系统的内源干细胞活化。这一旁分泌作用在细胞移植后很快就开始并且可以在体外证明。
似乎通过在此的实施例中进行的工作，刺激组织的驻留干细胞(包括表达Oct4的细胞)，在这一情形下为心肌，由受应激肌细胞产生的并且由CSC应答的生长因子和细胞因子可以与细胞移植一样有效地引发再生反应，或者更加有效。胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子的组合可尤其有效。
在一个实施方式中，驻留干细胞被活化，例如以刺激组织再生，增加靶细胞的肌肉密度和/或细胞功能。
如果靶细胞是心肌，那么增加的功能将例如是更大的/增加的收缩功能。
在肾衰竭的患者中，如果靶细胞是肾脏细胞，那么增加的功能可以是增加的产生EPO的能力。
如果靶细胞是胰细胞，那么增加的功能可以是增加的产生胰岛素的能力。
似乎本发明的制剂能够刺激/活化驻留在“成熟组织”中的干细胞，从而避免向患者给予“干细胞”治疗的需要，因为驻留干细胞受到刺激而经历有丝分裂和生长。
刺激驻留干细胞与血管生成不同。血管生成是刺激毛细管(可在组织或肿瘤中)生长的过程(参见Husnain，K.H.等人，2004.J.Mol.Med.82：539；Folkman，J.，和D’Amore，P.A.1996.Cell 87：1153)。相反，当使用适当配体给予本发明制剂时，在组织中驻留的干细胞，如多能细胞、祖细胞和/或前体细胞被活化以产生新的/其它的组织细胞如肌肉细胞。
迄今已描述的所有再生手段因为它们的生物靶标的性质、所用再生试剂和/或给药途径及模式而存在严重的限制。大多数所谓的再生疗法都针对于使用多种生物因子如血管内皮生长因子(VEGF)来再生缺血心肌的毛细管网络，VEGF的主要作用是刺激在受损组织中的存活内皮细胞的生长以扩展毛细管网络并改善血液供给(Isner，J.M.和Losordo，D.W.1999.Nature Medicine 5：491；Yamaguchi，J.，等人，2003.Circulation 107：1322；Henry，T.D.，等人，2003.Circulation 2003.107：1359)。这些疗法既未尝试也未实现执行组织或器官特征功能的实质细胞的再生；例如心脏中的收缩性心肌细胞、肝中的肝细胞、胰腺中的产胰岛素β细胞等。这些疗法充其量具有适度的效果并且它们中没有一种成为了标准医学实践的一部分。另一方面，所有设计为代替组织或器官中的功能细胞的再生疗法至今都基于被认为能够取代靶组织中丢失的特性细胞的移植。这些手段仍旧处于临床试验中。所用的所有再生手段的主要缺点是将再生试剂递送到受损组织并且限制它们遍及身体的其余部分的传播。这即使在通过组织的冠状动脉分支向被治疗者给予再生试剂时也是严重的问题。在通过冠状动脉给药的心肌细胞疗法的情形下，所给予的细胞中只有极小部分保留在心脏中，而大多数(＞95％)快速进入全身循环并且它遍及身体来分布。这也在将再生试剂经心外膜地或经心内膜地直接注射到心肌中发生，如用细胞悬液给药重复证明。此外，经心外膜给药需要通过胸廓切开术而暴露心脏，而经心内膜给药需要复杂的、耗时且昂贵的操作以绘制心内膜来鉴定适于给药的区域(Noga型设备)，该手术只在数目极有限的中心以及专家操作员的参与下可用。在两种情形下，最多50％的给药化合物被保留在受损组织中，而剩余的化合物遍及胸腔或者通过全身循环来传播。本发明的制剂可与向靶组织或器官的干细胞递送组合使用并且相比于其它递送机制，增加局部保留的数量。
然而，本发明描述了既不基于细胞移植也不基于存活内皮细胞的生长刺激(以便改善向目的组织或器官的供血)使组织或器官的实质细胞(即功能“显著”细胞)再生的新型方法。替代地，在此所述方法是基于利用局部递送特异生长因子/细胞因子来原位，即在组织内刺激此种组织的驻留干细胞，该生长因子/细胞因子能刺激该干细胞活化、复制和分化以产生损失的实质细胞以及对于它们的生长、存活以及功能所需的微脉管系统。这是可能的，因为即使不是所有，但多数成体组织，哺乳动物组织包括人组织含有能够在适当刺激时产生该组织或器官特异性细胞类型，以及伴随它们的血管和间质支持细胞的驻留干细胞。
由于刺激干细胞的一些再生试剂极其活跃并且可刺激与它们相互作用的多种细胞(包括潜在赘生性细胞)的生长和转移，这些因子中许多的潜在临床应用将需要以非常局部的方式给予最小的治疗剂量以便尽可能地限制暴露于要再生的细胞。因此，给药越局部，所需剂量越低，并且由于在相同或不同器官中的旁邻细胞的刺激，所以不想要的副作用风险越低。更具体地，本发明描述了使用局部而非全身或组织范围内给予和递送治疗有效剂量的不同生长因子来产生实体组织的特异区域的再生的新方法。由于活性化合物的递送局限于受损组织，因此所需的治疗剂量是用其它可用递送方法所需剂量的很小部分。除了其它应用，本发明的制剂能够在心肌梗死和/或慢性心力衰竭后再生心肌和它的微脉管系统。
在一个实施方式中，制剂是在受损组织的边缘处给予，例如在边缘处或缺血区。
干细胞的适当的配体包括生长因子，例如表1中列举的那些。
表1：适当的本发明干细胞配体的实施例
Figure BDA0000053693060000241
在一个实施方式中，采用的生长因子是人类的。
在一个实施方式中，采用的生长因子选自HGF、IGF(如IGF-1和/或IGF-2)和FGF，特别是HGF和IGF-1。这些因子似乎尤其对刺激驻留干细胞是有效的。
也可利用生长因子的组合并且它们例如可选自上述列表，例如HGF和IGF-1以及任选地VEGF。
在一个实施方式中，用于再生/活化干细胞的制剂并非由作为唯一的活性物的VEGF组成而是例如可包括有VEGF的活性物的组合。
然而，该制剂适于VEGF作为血管生成因子的局部递送。
在一个实施方式中，生长因子制剂与血管生成因子组合使用，例如通过相同途径或不同途径同时或顺序地给予。
在一个实施方式中，制剂包括细胞因子，例如选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-18和/或干扰素。
在一个实施方式中，制剂包括活性物的组合，例如，生长因子和细胞因子。
然而在组合制剂中，每种活性物的剂量可例如与单独给予该活性物时使用的剂量相同。
本发明制剂和/或方法中使用的组分，尤其是生物类活化物可源自天然来源。
在一个实施方式中，通过重组DNA技术制备所用的生物型活性物。
在一个实施方式中，所给予的活性物可以是具有想要的治疗效果的生物分子的肽段。
在一或多个实施方式中，所用分子为具有想要的治疗作用的生物分子(例如受体的配体)的突变体，其具有对相应的生物分子相同、较高或者较低的亲和性。
在一个实施方式中，所用物质/活性物是适体(aptomer)(与受体而不是天然配体结合的小RNA分子)。
在一个实施方式中，所用物质/活性物是识别并结合靶受体的抗体，并且特别是对该靶受体具有适当的特异性和/或亲和力。理想地，抗体具有上调受体或下调受体所需的活性从而适当的时候产生所述受体的活化或阻断活化。
在一个实施方式中，活性物是地喹(diaquine)，它是识别并结合两种目的受体的人工抗体分子，造成一种和/或另一种受体的活化或阻断。
在一个实施方式中，所用物质/活性物是分子量为＜5,000道尔顿的小分子。
在一个实施方式中，所用一或多种活性物可以是合成来源的。
对于在此公开的制剂，靶向想要的器官或组织，则该制剂应给予该器官或组织的上游。也就是说，应引入循环中使得血流携带制剂进入想要的组织/器官。
该制剂可以采用适当的装置如导管导入器官例如心脏的上游。可以以此方式到达其它主要器官。类似地，尽管罕见，但是也能够使用导管来进入肝脏。
在其它情况下，制剂可以通过策略性地动脉内注射或通过逆行静脉注射和/或靶组织前的插管来导入。
制剂的给予也可通过灌注或者通过泵驱动递送装置如注射泵，例如在导管插入期间给予肝素或吗啡或造影剂时使用的类型。适当的流速可例如为0.5mL/min。
制剂也可通过所谓的灌注导管来给予，它利用动脉内气囊允许减缓注射位点下游的血流速率，同时通过导管的第二内腔维持组织的灌注。
在特别适合的实施方式中，将该制剂给予到靶组织或器官上游的动脉。
在一个实施方式中，使用导管来将本发明的制剂递送到供给靶组织或器官的动脉中。特别地，制剂可唯一地(主要或基本上)递送到供给组织或器官的区域的部分动脉中。
在一个实施方式中，所用导管是气囊导管。
在一个实施方式中，导管在其远端携带滤网，按需要，该滤网孔径足够小到阻止或阻碍＞50，25或20μm的微粒聚集物释放。
在一个实施方式中，靶细胞是驻留在出生后心脏中的心脏干细胞。
在一个实施方式中，获得的再生单独地或组合地，包括心肌细胞和由毛细管(内皮细胞)和/或小动脉(内皮以及血管平滑肌细胞)组成的血管结构的再生。
在一个实施方式中，再生是在急性或慢性心肌梗死(MI)后的任何时间所诱导，例如急性梗死后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、高至24小时诱导。
在一个实施方式中，再生是在具有或没有心肌梗死的缺血性心脏病个体中诱导。
在一个实施方式中，再生是在患有急性或慢性心力衰竭(CF)的个体的心脏中诱导。
在一个实施方式中，再生是在具有缺血性、感染性、退行性或特发性心肌炎的个体中诱导。
在一个实施方式中，靶细胞是在内分泌胰腺中驻留的干细胞(Langerhans岛的干细胞)。
在一个实施方式中，在糖尿病个体中诱导再生。
在一个实施方式中，靶细胞是中枢神经系统(CNS)的神经干细胞。
在一个实施方式中，靶干细胞是脊髓的神经干细胞。
在一个实施方式中，在脊髓损伤的个体中诱导再生。
在一个实施方式中，靶细胞是脑黑质的干细胞，例如在患有帕金森疾病的个体中。
在一个实施方式中，在脑血管意外(中风)个体中诱导再生。
不希望受限于理论，相信本发明制剂中使用的配体能够穿过血脑屏障以治疗中风等。此外，在脑血管意外中，相信血脑屏障受损并且化学实体可以更加容易地通过该屏障。
在一个实施方式中，靶细胞是肝的干细胞并且例如再生是在肝损伤如硬化个体中诱导的。
在一个实施方式中，靶细胞是肺的干细胞并且例如再生是在肺损伤如肺气肿的患者中诱导的。
在一个实施方式中，靶细胞是骨骼肌的干细胞并且例如再生是在特定骨骼肌缺陷如骨质疏松或佩吉特病的个体中诱导的。
在一个实施方式中，靶细胞是上皮细胞的干细胞。
在一个实施方式中，靶干细胞是肾脏的干细胞。
在此使用的靶细胞指要被刺激并且具有提供想要的再生潜能的细胞。
本发明的制剂提供最优参数和材料以确保对于靶组织或器官的相关活性物的准确和/或可复制剂量。
在替代的实施方式中，可使用本发明的制剂通过允许局部递送肿瘤组织的抗肿瘤药，例如通过肿瘤内注射来治疗实体瘤。
适于肿瘤治疗的活性物包括依托泊苷、环磷酰胺、染料木黄酮、顺铂、阿霉素、长春地辛、米托胍腙、氟尿嘧啶和紫杉醇。
在一个实施方式中，该制剂不用于癌症治疗。
在一个实施方式中，本发明不直接给药至肿瘤或组织。
根据本发明的方法可使用活性物的组合，单独例如同时或顺序地给予，或者以一种(一锅(one-pot))配制的制剂给予。
本发明的制剂可作为液体溶液/悬液(例如在等渗载体中)给予，例如作为缓冲的溶液(例如磷酸盐缓冲液，生理盐水或葡萄糖溶液)给予。
本发明的制剂可任选地包括一种以上种其它赋形剂。赋形剂应适于给予人类和/或动物。
在一个实施方式中，制剂包括在溶液中的白蛋白，该白蛋白可例如使制剂中的小量活性物稳定，例如1％至20％w/vol的白蛋白(如人血清白蛋白)可足以实现所需稳定化。
本发明也延及如在此所限定的制剂在治疗上的应用，特别是治疗心肌梗死；缺血性心脏病；心力衰竭；缺血性、感染性、退行性或特发性心肌炎，硬变，硬化，肺气肿，糖尿病等。
在一个实施方式中，本发明涉及在此所述的制剂在治疗，尤其是在上述疾病的治疗中的应用。
本发明也延及治疗方法，包括向有需要的患者给予治疗有效量的在此所述的制剂，特别是治疗在此所述的疾病。
本发明也延及配体，如在此所公开的配体在体内刺激驻留干细胞以活化该细胞的应用。
本发明也包括适当的生长因子在制造用于在体内刺激驻留干细胞的药物的应用。
现在将参照实施例来描述本发明。
实施例
介绍
通过暂时性气囊阻断第一间隔分支远端的冠状动脉前降支，在母猪中产生前壁心肌梗死。这一手术导致可重复的适当尺寸的心尖前壁梗死。通过在梗死的猪心肌中局部给予不同剂量的因子，检测组合的胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子的心肌再生潜能。对照动物用安慰剂处理
在23头猪中，就在出现第一隔动脉下面的左冠状动脉前降支中，通过气囊扩张关闭胸腔产生急性后-心肌梗死的实验模型中，直接给予含有重组人IGF-1和HGF的混合物的溶液，相比于进行相同处理的6个安慰剂对照，首先检测用小量治疗剂的局部给药产生治疗效果的可能性。
材料和方法
在心肌梗死后的几天到一个月的不同时间点分析心脏。结果显示在用人IGF-1和HGF处理的猪的缺血区及其边缘中，被活化的干细胞和祖细胞数量的显著增加。在缺血区观察到显著的肌肉再生，该缺血区也含有新形成的小动脉和血管。再生应答似乎与所给予的生长因子的剂量成比例。从这些初始数据可见，CSC的治疗性原位活化可以产生大量新的心肌组织的形成并且显著改善在大小以及解剖学上与人心脏相似的动物心脏的左心室功能。
c-kitpos猪心脏细胞的分离
从母Yorkshire白猪(23±4kg；n＝3)的不同心脏区域(左和右心房，右和左心室以及心尖)获得多个心脏样品(每个约2g)。将一些样品固定及包埋在石蜡中用于组化分析。将其它样品酶解并按照前述通过改良来制备心肌细胞缺失的心脏细胞悬液(Beltrami，A.P.等人，2003.Cell114：763)。简言之，在37℃下，用在Hanks’平衡盐(HBSS)缓冲液中的0.1％胶原酶(Worthington Biochemicals)，0.1％胰蛋白酶(Sigma)，0.1％DNAse I消化切碎的心脏组织并通过离心收集小心脏细胞部分。用抗人CD117(c-kit)Ab(Miltentyi Biotechnology)孵育小心脏细胞并通过荧光活化的细胞分选(FACS；MoFlo(Dako Cytomation)细胞分选仪)或磁活化的微免疫珠(MACS)来分选。在FACS之前加入碘化丙碇(PI)以排除死亡细胞。
使用FacsCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，BD)来分析c-kitpos猪心脏细胞的造血细胞、间充质细胞和内皮细胞标记。所用抗体为抗-猪CD45(Serotec，Clon：MCA1447)，抗-人CD34(BD，clon 8G12)，抗-人CD90(BD，Clon：5E10，猪交叉反应)和抗-人CD166(BD，Clon：3A6，猪交叉反应)，抗-人CD105(Caltag Laboratories，Clon：SN6，猪交叉反应)和抗-人CD133(Miltenyi Biotec，clon AC133，猪交叉反应)。对于PECAM、E-钙黏着蛋白、CD11b、CD13、CD14、CD29、CD31、CD33、CD36、CD38、CD44、CD49、CD62、CD71、CD73、CD106特异的抗-人抗体购自BD Biosciences。使用各自的同种型对照(Pharmingen)作为所有FACS过程的阴性对照。使用CellQuest软件分析数据。
猪c-kitpos心脏细胞培养、克隆和分化潜能
在含有10％FBS，bFGF(10ng/ml)，胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)以及EPO(2.5U)的Dulbecco’s MEM/Ham’s F12(DMEM/F12)改良培养基中以2×104细胞/ml将c-kitpos细胞铺平板培养7-10天。回收后，将一些细胞移到改良的心球(cardiosphere)形成培养基(mCSFM)：1∶1的DMEM/F12，bFGF(10ng/ml)，EGF(20ng/ml)，ITS，2-β-巯基乙醇(0.1mM)以及补充有B27和N2补充物(Gibco)的Neural Basal Media用于产生心球。为了检测克隆发生，通过流式细胞仪或者连续稀释将单个c-kitpos细胞接种到96-孔明胶包被Terasaki板的孔中。使单个c-kitpos细胞在DMEM/F12改良的培养基中生长1-3周后，克隆得到鉴定并扩增。c-kitpos细胞的克隆发生是通过对每个96-孔板中产生的克隆计数测定并以百分数表示。对每个心脏区域分析总计10个板。将克隆发生的细胞和心球转移到特异的生心分化培养基(从42改良)中用于肌细胞、血管平滑肌和内皮细胞特异化。
按照制造商的说明(Chemicon)，使用改良的Boyden室进行细胞迁移检测。将200ng/ml HGF或200ng/ml IGF-1放在24孔板的下室24小时。对于增殖检测，将2.5×104pCSC放在24×35mm皿中并且在0％血清DMEM/F12基础培养基中进行血清饥饿36hr。将6个皿用作基准对照并且在固定前补充BrdU(1ug/ml)而1小时后染色。然后向其余的12个皿中加入补充有3％FBS和200ng/ml HGF(n＝6皿)或200ng/ml IGF-1(n＝6皿)的DMEM/F12基础培养基。6个皿用作对照，不向培养基中加入生长因子。每6小时加入1μg/ml的BrdU。在24小时后固定细胞并使用BrdU检测系统试剂盒(Roche)评估BrdU掺入。用1μg/ml的DNA结合染料4，6-二脒基-2-苯吲哚(DAPI，Sigma)对细胞核复染色。使用荧光显微镜(Nikon E1000M)来评估细胞。对于每个皿，对20倍放大下的10个随机视野计数并且将数量表示为BrdU阳性细胞相对于计数到的全部细胞数的百分数。
免疫细胞化学
将细胞在玻璃室载片(BD Falcon)上培养2天，用4％PFA固定20min然后染色。对于细胞内染色，使用0.1％Triton X-100使细胞透化。用一抗在4℃过夜孵育细胞，洗涤3次然后用FITC-或Texas Red-结合的二抗在37℃孵育1hr。然后洗涤细胞3次，并且用DAPI对细胞核复染色。使荧光可视化并用共聚焦显微镜(Zeiss LSM510)获得图像。使用下面的抗体进行细胞染色：Oct3/4、Nanog、Isl-1、c-kit、Flk-1和Nkx2.5(R & D Systems)；Bmi-1、c-met和IGF-1r(Santa Cruz Biotechnology)、端粒酶(Abcam)。在玻璃室载片中培养24小时后用c-kit对心球染色。培养4-6天以允许细胞从球中长出并分化后，用针对平滑肌肌动蛋白、α-肌节的肌动蛋白(Sigma)和von Willebrand因子(DAKO)的抗体对它们进行染色。所有二抗都购自Jackson Immunoresearch。
Western印迹分析
按前述(Ellison等人，2007.J.Biol.Chem.282：11397)，使用蛋白裂解物进行检测IGF-1(IGF-1R)和HGF(c-met)受体的免疫印记，该蛋白裂解物获自经历血清饥饿培养24小时，随后补充200ng/ml IGF-1或200ng/ml HGF持续10-20分钟的c-kitpospCSC。按照制造商建议的稀释度，使用下面的抗体：兔多克隆Abs IGF-1R、磷-IGF1R、Akt、磷-Akt、c-met(Cell Signalling)、磷-c-met(Abcam)、FAK和磷-FAK(Upstate)。
组织学
在心房切除后，用垂直于长轴的切口将心脏从心尖到基部分成5个冠状面切片。从每只猪的每个水平获得梗死的、梗死周围的和远端心肌样品。用PBS洗涤样品，在10％福尔马林中固定并用石蜡包埋。在薄片切片机(Sakura)上制备5μm切片并固定在显微镜载片上。根据标准程序(Ellison等人，2007.J.Biol.Chem.282：11397)，用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色。使用Lucia G软件，在光显微镜(Nikon E1000M)上，测量在来自C和D水平的梗死周围区的H&E切片(每只动物3个载片)中，横穿细胞核的肌细胞直径。
为了测定心肌纤维质生成，用Sirius红按照早前所述(Lee，C.G.等人，2001.J.Exp.Med.194：809)对梗死心肌切片进行染色。将一系列切片在PBS中的10％福尔马林中固定20min。用蒸馏水洗涤5min后，将切片在室温下于pH 9的0.1％Fast Blue RR之Magnesium Borate缓冲液(Sigma)中孵育30min。然后用蒸馏水洗涤切片，随后在室温下，在0.1％Sirius红的饱和苦味酸(Sigma)中孵育10min。在切片脱水、清洁并固定前进一步用蒸馏水洗涤它们。在这一方案中，结缔组织(主要是胶原)染成红色而肌肉染成黄色/橙色。使用Lucia G图像分析，以40倍放大进行心肌结缔组织量的半定量评估。在整个梗死区测定胶原百分数(阳性染色面积百分数)。对于每个水平，评估每只动物的总计3个载片，并且获得平均值。
免疫组化和共聚焦显微检测
为了鉴定CSC，用针对干细胞抗原的抗体c-kit(兔多克隆，Dako)来染色横切的猪心脏切片。由于对于造血的、神经的以及骨骼肌谱系(21)标记的染色呈阴性，将c-kitposCSC鉴定为谱系阴性(Linneg)。对于在对照猪的不同心脏区域的CSC心肌分布的量化，以63倍放大对总计5个切片的c-kitpos(linneg)细胞和心肌细胞数计数。然后测量每个横截面的面积，并测定每个单位面积的CSC和心肌细胞数。由于发现在左和右心房中的c-kitposCSC数之间有一些差异，因此集合对于心房的数据。CSC数目以每106肌细胞表示。
通过BrdU(Roche)和Ki67(Vector labs)染色来鉴定周期细胞。将祖细胞对于c-kit以及转录因子Nkx2.5(R&D Systems)，Ets-1和GATA6(Santa Cruz Biotechnology)染色为阳性。用针对BrdU、Ki67和α-肌节的肌动蛋白(Sigma)、心肌肌钙蛋白I(Santa Cruz Biotechnology)或慢心肌肌球蛋白重链(Sigma)的抗体鉴定新形成的肌细胞。通过对BrdU和α-平滑肌肌动蛋白(鼠单克隆，Sigma)或vWF(兔多克隆，Dako)染色来检测新形成的血管结构。使用共聚焦显微镜(Zeiss 510 LSM)获得图像。对于每个水平中的梗死的、梗死周围的以及远端的区域，量化CSC，肌细胞祖细胞(c-kitpos/Nkx2.5pos)以及新形成的肌细胞(BrdUpos和ki67pos)数。对每个区域以63倍放大对总计3000个细胞(约20个视野)计数。每只动物评估3个载片。数目表示为相对于计数的全部细胞数的百分数。使用Lucia G软件在梗死和梗死周围区域测量每只动物的50BrdUpos新形成肌细胞的尺寸。
通过用针对vWF(DAKO)的抗体染色来评估梗死区域中的毛细管密度。所用的二抗是与HRP结合的驴抗-兔抗体(Santa Cruz)。用在PBS中的3％的过氧化氢在室温下使切片中的内源性过氧化物酶封闭15分钟。使用色原3，3-二氨基联苯胺(DAB)(Sigma)使血管可视化。用苏木精对载片复染色用于细胞核的鉴定。通过对在C和D水平以40倍放大而对梗死区中的每个切片10个视野计数来测定毛细管数目(定义为跨vWF-阳性血管圆周的1或2个内皮细胞)。评估总计每个动物3个载片。毛细管数目以每0.2mm2表示。
为了检测细胞凋亡，用兔抗-人活化的胱天蛋白酶-3的一抗(R&DSystems)和驴抗-兔HRP-结合的二抗来对切片染色。使用色原DAB(Sigma)使凋亡的心肌细胞可视化。然后用苏木精对切片复染色并且在用光显微镜检查前永久固定。通过在40倍放大下以每个切片20个随机视野来计数而测定在C和D水平的梗死周围区中胱天蛋白酶-3阳性肌细胞的数量。评估总计每个动物3个载片。胱天蛋白酶-3阳性肌细胞的量表示为相对于计数的总肌细胞数的百分数。
统计分析
以平均值±SD来报道数据。通过Student′s t检验以及通过方差分析的多重比较(ANOVA)来测定2组之间的显著性。使用Bonferroni post hoc方法定位该差异。显著性设定为P＜0.05。
实施例1、PLGA微球的制备
制备PLGA和藻酸盐的两组微球；一组含有人血清白蛋白(HSA)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的混合物，另一组含有HAS和肝细胞生长因子(HGF)的混合物。考虑到所需的非常小量的生长因子，使用HAS来填充以提供足够的量用于乳化。
用于形成PLGA微球的条件如下：
在液-液组态中使用喷雾器Flow Focussing of Ingeniatrics(D＝150μm，H＝125)，其中经聚焦的液体是PLGA+HSA+生长因子的乳液并且聚焦液是水。
脂相组成：在EtOAc(乙酸乙酯)中的5％PLGA
水相组成：在H2O中，5％HAS，0.1％生长因子，0.45％NaCL，0.25％Tween 20。
将两相的混合物超声处理30min。
在2％聚乙烯醇(PVA，Fluka Chemica)浴中产生微滴。
通过经聚焦的(Qd)流体和聚焦(Qt)流体的流量来控制颗粒大小。为了获得15±1微米的颗粒，使用Qd＝3.5mL/h和Qt＝3mL/h。HSA+IGF-1混合物的封装效率为37％。
通过光学和电子显微镜确定颗粒大小(参见图8)。
使用相同程序稍作修改来制备含HGF的PLGA颗粒。
实施例2、生产直径为15μm的单分散PLGA微球的优化
为了优化封装效率以便降低要给予的微球数，用以下参数的修改优化所用条件：
a.-在脂相中掺入乳化液。发现最佳组合是Tween 80和Span 60的混合物，其产生能稳定至多5小时的乳液。
b.-蛋白质浓度的优化(人血清白蛋白，HSA)，用20％的HSA来代替5％。
c.-将NaCl在水相中的浓度优化至0.2％来代替0.45％。
d.-将PLGA在EtOAc中的浓度优化至5.5％来代替5％。
e.-HGF-1在初始混合物中的浓度为0.4％。
因此水相由20％HAS，0.4％IGF-1；0.2 NaCl；0.1 Tween 20；0.15 Span60组成。有机相由在EtOAc(乙酸乙酯)中的5.5％PLGA组成。
使用实施例1中描述的条件，通过简单的流动聚焦获得微粒。
如通过SEM所测定，颗粒的尺寸为14.36μm，其SD为0.91，封装效率为82.4，截留13.1％。通过定量ELISA补充的蛋白测定报道每1×106微球携带3μg的IGF-1和348μg的HSA。通过IGF-1结合并活化活细胞的IGF-1受体能力所检测的微球中含有的IGF-1的体外生物检测显示出在一轮冻干和重悬后，所封装的IGF-1维持原始生物活性的82％。因此，每一百万个微球具有相当于2.5μg天然IGF-1的生物活性。
使用类似的方案来封装HGF，最终结果是每1×106颗粒封装1.7μgHGF，其生物活性为初始的63％。因此，每一百万HGF微球可以递送相当于1μg的活性HGF。
c-kit受体的配体SCF(干细胞因子)的封装产生了每1×106微球含有2.3μg SCF的颗粒，其活性为原始溶液的76％，如通过c-kit受体的活化所测定。
结论：所用的单个流动聚焦方法对于HSA和不同生长因子的混合物的封装非常有效。改变HSA与生长因子的初始比例，能够实现每1×106个直径为15μm的PLGA微球中高达350μg的想要的药物蛋白的负载值，变异系数≤6％。
实施例3、单分散藻酸盐微球的生产和IGF-1的封装
用于生产微球的试剂和仪器如下：
-藻酸盐：Protanal LF 10/60；FMCBioPolymer(G/M≥1,5)；ProtanalLF10/60LS；FMCBioPolymer(G/M≤1)。
-HSA(人血清白蛋白97-99％，A9511)，来自Sigma-Aldrich
-IGF-1，来自PreProtect
-CaCl2；柠檬酸三钠
-简易喷雾器FF，液-气组态：L2(D＝100μm，H＝100)和L3(D＝100μm，H＝100)。
-Harvard泵11+。
在用于建立适当条件的大于120个检测后，显然藻酸盐的混合物给出比单个藻酸盐更好的结果。比例为0.7％∶.3％的Protanal LF10/60：Protanal LF10/60LS给出最佳结果。发现雾化的最佳距离是10cm。混合物中的HAS最佳浓度为14％而IGF-1是0.3％。在液-气组态(ΔPt＝300mbar，Qd＝5mL/h，使用气体作为聚焦流体)中，使用FF(D＝100μm，H＝100)来使这一混合物雾化。在振荡浴中，将喷雾器放在10cm的3％CaCl2的溶液中，30min后通过离心收集并洗涤以除去CaCl2。通过流式细胞仪和SEM测定颗粒的尺寸分布。HAS的封装效率由蛋白质定量和标准曲线测定。如实施例2所述，通过ELISA测定hrHGF-1的封装。
如通过SEM所测定，颗粒的尺寸为15.87μm，其SD为1.83，封装效率为71.4，截留11.6％。通过定量ELISA互补的蛋白测定报道每1×106微球携带约2μg的IGF-1和269μg的HSA。通过IGF-1结合并活化活细胞的IGF-1受体能力所检测的微球中含有的IGF-1的体外生物检测显示出在一轮冻干和重悬后，所封装的IGF-1维持原始生物活性的67％。因此，每一百万个微球具有相当于约1.5μg天然IGF-1的生物活性。
使用FF喷雾器以及其它喷射方法，可以调整这一方案以用于不同类型的聚合物，如聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)和聚环氧乙烷(PEO)
Figure BDA0000053693060000361
的聚醚-聚酯片段化嵌段共聚物。
结论：藻酸盐是生产具有15μm的适当直径的单分散微球以及封装大量蛋白质的适当聚合物。可以修改所用方案将IGF-1与HAS的比例增加至高达60∶40，这使活性化合物的负载增加了两个以上的量级。从所获得的结果看，当使用PLGA时，在15μm峰值周围的尺寸范围比与在此检测的藻酸盐组合时要窄。考虑到大量不同的藻酸盐制剂，可能能够显著改善在此发现的微粒均匀性。
实施例4
为了生产活性化合物位于颗粒表面上的微球，使用与结合的活性物具有相反电荷电性的聚电解质代替PLGA来生产上面所示的微球是可能的。此种聚电解质的实例是阿拉伯胶、果胶、蛋白质、核酸、多糖、透明质酸、肝素、羧甲基纤维素、壳聚糖、海藻酸以及多种合成聚合物。当聚电解质具有与活性化合物相反电性的电荷时，通过从活性物的溶液中吸收将活性物与微粒附着是可能的。
实施例5、在冠状动脉内给药后，直径15μm的微球对于毛细管截留而没有向全身循环溢出而言是最佳的
使母Yorkshire白猪(n＝2)(27kg)服用镇静剂Telazol(100mg，I.M.)，插管并刮毛。将静脉内导管放在外周耳静脉中。将动物移入手术室，放在支架板上，并四肢约束而固定在手术台上。用异氟烷(在O2中为2.5％)保持动物麻醉并且贯穿手术持续监测它们的EKG。使用便携式辐射源(GE STENOSCOP，GE Medical Systems USA)用于透视导向，用特异为本方案设计的40cm长的6F导引导管JR 3.5(Cordynamic-Iberhospitex S.A.Barcelona，西班牙)对左主冠状动脉插管。执行基准冠状动脉造影。
在两只动物中，用直径2mm的冠状动脉导引导管在导引线(Hi-Torque Balance Middle-Weight 0，014”)的引导下前进到左冠状动脉的起点。内径0.014”(0.3mm)的微导管通过这一导管并前进，并且它的头部位于左前壁冠状动脉(LAD)的近端部分，就在第一穿动脉的起点下。这与用于产生实验用心肌梗死以及用于给予上述生长因子溶液的位置相同。另一导管放在冠状窦中以在手术期间收集心脏静脉血样。在开始给药前，收集外周、冠状静脉和动脉血样。在大量的室性期外收缩或心室纤颤的情形下，静脉内给予1-3mg/kg利多卡因。在手术前一天给予75mg氯吡格雷(clopidrogel，Plavix)和250mg阿司匹林作为术前用药。每日给予由75mg氯吡格雷(Plavix)和125mg阿司匹林组成的术后用药直至处死。
为了测定完全被毛细管网络捕获的微球的最佳尺寸，将各用不同染料标记的直径为2μm、4μm、6μm、10μm；12μm和15μm的荧光聚苯乙烯微球(购自Invitrogen和购自Polysciences Inc.，Cat # F8830，F8858；F8824；Polybead Black染色微球6.0μm，Megabead NIST 12.0μm和F8842)混合物在20mL的PBS悬液中混合并振荡5min以确保均质的悬液，6种尺寸中每种微球的浓度为每mL含1×106个微球。这一悬液在三只猪的左冠状动脉的起点通过血管造影术导管由Harvard泵以1mL/min的速率给予。给予每mL(1百万微球)后，注射暂停3min，这期间，取冠状窦血样。就在获得血样后马上制备血涂片载片以检查荧光微粒的存在。完全给予20mL微球悬液后，以每30min间隔再收集冠状窦血样，持续额外的3小时。实验最后，处死动物并切下心脏，固定以及取样用于切片，随后进行组织学和荧光显微镜检查。
由于以相同数量给予不同尺寸的微球，所以它们在冠状窦静脉流中以及在心肌中的比例应彼此互为镜像。在实验最后，那些经过毛细管床的颗粒应在冠状窦血液中具有高浓度而在心肌中具有低浓度。对于没有经过毛细管床的颗粒，相反的结果是真实的。如下所述，只有尺寸≤10μm被有效保留在心肌中，但是即使是10和12μm的微粒也在具有意义的程度上进行了渗漏，因为这些微粒中各有19和8％之间进入了全身循环。另一方面，≥1％的15μm颗粒通过毛细管床并且到达冠状窦。
表2
  微球尺寸，μm：  2   4   6   10   12  15
  向冠状窦的外流量(计算的)，％  95   73   53   19   8 ≥1
  给药3h后在心肌中的保留，％  ≤3   15   41   77   90 ≥99
为了测定上面示出的结果是否是对于心肌特异的或者能否延及其它组织，使用相同的方案通过右腿股动脉给予相同的微球悬液。从股静脉收集血样并分析四头肌样品来测定不同微球在骨骼肌中的持久性。结果总结在表3中。
表3
  微球尺寸，μm：  2   4   6   10   12 15
  向静脉回流的外流量(计算的)，％  92   67   59   12   11 ≥1
  3h后在骨骼肌中的保留，％  ≤1   11   27   72   83 ≥99
结论：确保在目的组织中有≥99％驻留的最小尺寸的微球直径为15μm。由于使用最小有效尺寸对于使通过前毛细管小动脉阻塞而产生的缺血性微病灶最小化是很重要的，因此这一直径尺寸对于向特定组织通过毛细管床局部递送物质是最佳的。
实施例6、在冠状循环中的微球给药
在PBS中制备20mL浓度为1×106/mL的15μm的聚苯乙烯荧光微球(Invitrogen，Cat # F8842，
Figure BDA0000053693060000391
聚苯乙烯微球)悬液并振荡5min。这一悬液在主左冠状动脉的起点通过血管造影术导管由Harvard泵以1mL/min的速率给予。给予每mL(1百万微球)后，使注射暂停3分钟，这期间，取完整的EKG和冠状窦血样。就在获得血样后马上制备血涂片载片以检查荧光微粒的存在。保留其余的样品用于酶测定。持续该手术直到心电图显示出与心肌缺血相一致的最小改变。在实验开始以及在给予颗粒悬液后测量冠状血流(TIMI)。使两只猪恢复，在24小时再检查，此后处死。
结果：
在#1动物中，在给予16mL的悬液(1600万微球)后，检测到首先的EKG改变。在第二动物中，直到给予18mL(1800万微球)后才出现EKG改变。在两只动物中，在手术最后，冠状血流为TIMI 3(正常)。#1动物在灌注终止后24小时处死。在处死前收集完整的EKG以及血样。处理心脏用于宏观和微观检查。
#2动物在24小时时具有正常EKG和冠状血流(TIMI 3)。在获得一组血样后，处死动物并处理心脏用于宏观和微观检查。
通过荧光显微镜以低倍和高倍放大来检查所有来自#1和#2动物的冠状窦和来自全身循环的样品的血涂片。在任何的样品中都没有检测到荧光珠。这表明直径15μm的微球被捕获在毛细管网络中是很有效的。此外，如果利用这一通过Thebesius静脉注射的方法，有任何从冠状动脉到右心室的功能性分流，那么它们是微小的并且未被在此使用的方法检测到。
酶测量(表4)示出#1动物产生了小的心肌梗死，如由血液中心脏特异的肌钙蛋白T(TnT)水平增加所示(数值高于0.01ng/ml是不正常的)，而#2动物的数值是正常的并且表明这一动物在给予颗粒期间仅产生了瞬间缺血并且恢复而没有任何永久的心肌损伤。这一解释由下面示出的病理学所确认。#1动物的心脏的宏观切片示出坏死的微病灶(暗色区)而#2动物的切片正常。这一结论由组织病理学所确认(数据未示出)。
表4
Figure BDA0000053693060000401
结论：在心脏中，在通过左前降动脉(LAD)供给(irrigate)的区域中给予高达15×106个直径15μm的微球是充分耐受的并且不会产生心肌损伤。高于15×106个微球的剂量存在产生小的可能留下永久疤痕的缺血区的高风险。因此，由PLGA作为聚合物，获得直径15μm的每1×106个微球含1mg蛋白质的处于中间数值范围的负载，能够将高达15mg的治疗性试剂递送到由左冠状动脉供给的心肌的毛细管床中。
实施例7、装载有生长因子的PLGA微珠的给药
一旦测定了15μm微球的安全剂量范围，使用相同的方案向心肌的相同区域给予10×106PLGA微球(直径15μm)。该微球悬液由4×106个装载有总计2μg人重组胰岛素样生长因子1(IGF-1)的PLGA微球；4×106个装载有总计1μg人重组肝细胞生长因子(HGF)的PLGA微球所构成。这两种微球也装载有绿色荧光染料以使得更容易在血液和组织学切片中观察到它们。此外，该悬液含有来自Invitrogen的2×106个橙色范围的聚苯乙烯荧光物。包括Invitrogen球用作PLGA微球的稳定性和分布的对照。按上所述，将在10mL生理PBS中的悬液给予装备好(instrument)的猪。
向两只动物的给药悬液很顺利并且没有缺血的心电图迹象。在手术期间和之后的毛细管血流是正常的(TIMI 3)。一只动物(#3猪)在手术后30min处死而另一只(#4猪)在手术后24小时处死。处理两个心脏用于宏观和微观分析。
在多个血涂片中，这两只动物的外周和冠状窦血样都没有显示出Invitrogen或PLGA珠的存在。这两只动物的肺、肝和脾的初步分析也没有检测到任一种类型的微球的存在。
表5
Figure BDA0000053693060000411
表4和5的说明。标记：CK，肌酸激酶；MB，肌酸激酶的心脏特异的MB同种型；TrT，心肌肌钙蛋白T，它是心肌损伤最特异的且最敏感的标记。INJ CS前，在手术开始时从冠状窦取得的血样；INJ前，在手术开始时取得的全身血样；CS后，在手术最后从冠状窦取得的血样；后，在手术最后从全身循环取得的血样；14H后，在手术后14小时取得的全身血样；24H后，在手术后24小时，处死动物前取得的全身血样。
这两只动物的宏观切片完全正常(未示出)。#3猪在荧光显微镜下的切片分析示出PLGA珠(绿色)和聚苯乙烯珠(红/橙)在毛细管血管中的分布接近1∶4的比例(下图10)，如从所给予的混合物组成中所预期的。没有证据表明在所检查的心脏的任何区域中有任何微观组织损伤。在#4猪中，PLGA珠(绿)的数量已经显著减少并且这些珠与聚苯乙烯珠(红/橙)的比例接近1∶1(见图11)，表明PLGA珠以约16小时的半衰期降解。
在微球中给予的IGF-1和HGF对刺激驻留心脏干细胞的效力。
如上所述，通过冠状动脉给予IGF-1和HGF的组合在刺激驻留心脏干细胞活化方面非常有效。在这一初步检测中，监控到在递送微球后，该区域中的干细胞活化，并将它与没有左冠状动脉供给的左心室区相比较。如可以从图11的图像中看出，在未处理的心肌中的多数驻留干细胞都是不活动的(由箭号/箭头高亮显示)，而处理区中的那些都进入了细胞循环，如由细胞循环标记ki-67的表达所证明(在细胞核中的黄色信号，在图中高亮区中的光“点”)。因此，给予在固体底物上的生长因子以将它们递送到毛细管中并且将它们保持在那里直到它们被卸载而进入周围间质空间是用于刺激内源干细胞群的生长因子给药的有效方法。
结论：利用具有一定直径的生物可降解的微珠将IGF-1和HGF局部递送到心肌的特定区域对于刺激组织的特定区域的驻留干细胞而不影响不被该疗法所靶向的区域是有效的，该直径不允许该微珠穿过毛细管并进入全身循环。
实施例8、猪c-kitpos心脏干细胞和祖细胞是多能的并且与其他动物种类的那些细胞表型相似
通过共聚焦显微镜检查3只重24±3kg的Yorkshire猪的心肌组织学切片中对于常用干细胞标记c-kit呈阳性的细胞的存在，c-kit是干细胞因子的受体，已知由多数CSC所表达。对于c-kit呈阳性的(c-kitpos)小细胞遍及心房和心室心肌分布(图1A-B)，相比于其它心脏区(图1C)，在心房(左右心房无差异，数据未示出)和心室心尖中的密度更高。这一分布模式与在其他动物种类包括人的心脏中的c-kitposCSC的解剖学位置相匹配。因此，c-kitpos细胞在猪心脏中的密度与人和啮齿动物心肌类似：每约1,000肌细胞1个细胞或每克组织约50,000c-kitpos细胞。
对来自不同猪心脏区的心肌组织样品酶促消化以获得肌细胞缺失的细胞群。c-kitpos细胞分别组成来自心房、心室和心尖的初始肌细胞缺失的心脏细胞群的10±3％、3±2％和7±3％(图1D)。
使用MACS技术(21)分离c-kitpos细胞，该技术产生由＞90％的c-kitpos细胞构成的高富集细胞群(图1E)。FACS分析显示c-kitpos富集的心脏细胞对于泛白细胞标记CD45和内皮/造血祖细胞标记CD34是阴性的(图1E)。高比例(87％)的c-kitpos猪心脏细胞表达CD90(常用的非特异的间充质细胞标记)和CD166(粘附分子)(图1E)。只有小部分对于造血/内皮祖细胞的标记CD105和CD133是阳性的(增补图1)。当分析一组对于其它造血、间充质细胞和内皮细胞家系特异的CD标记时，包括CD13，CD14、CD31、CD38、CD44、CD33，c-kitpos心脏细胞是阴性的。从这些分析可以得出结论，猪c-kit分选的心脏细胞是c-kitpos、CD90pos、CD166pos、CD105low、CD133low和CD45neg、CD34neg、CD31neg、CD44neg。
将来自心房、心室和心尖的新分离的c-kitpos心脏细胞在培养基中扩增(4次传代)然后以单细胞沉积在96孔Terasaki板以产生单细胞克隆(图2A-B)。猪细胞的克隆效率在所有心脏位置相似并且与之前报道的啮齿动物CSC的克隆效率相似(图2C)(Beltrami等人，Cell 2003)。随机从心房、心室和心尖源细胞选择2个克隆并进一步扩增它们。这些克隆显示～30小时的倍增时间并且目前倍增超过65次传代以及每10次传代系列的亚克隆，而没有达到生长停止或衰老。这些c-kitpos心脏细胞克隆维持了正常的核型而没有可检测到的染色体改变。
使用免疫细胞化学对克隆的c-kitpos猪心脏细胞分析干性(stemness)标记和心脏-谱系定向。细胞显示出对于c-kit(90±8％)、Flk-1(86±9％)、Oct3/4(62±11％)、Nanog(46±5％)、端粒酶(81±10％)、Bmi-1(70±14％)、Nkx2.5(52±8％)、Isl-1(8±6％)为阳性(图2D)。由于该克隆源自单细胞，因此多能基因在它们后代中的广泛表达表明这些基因在母细胞群中的表达水平非常高。遗憾的是，c-kitpos细胞的原代群体是CSC、祖细胞和前体的混合物并且我们确实有对于“真正”CSC特异的标记。因此，只可能通过分析这些细胞的后代来推断它们的表型。
当将克隆的c-kitpos猪心脏细胞放在细菌学培养皿(Corning)中的改良的心球形成培养基(mCSFM)中，它们悬浮生长并产生球形克隆，称作心球(图2E)(Beltrami，A.P.等人，2003.Cell 114：763；Oh H，Bradfute SB，Gallardo TD等人，Cardiac progenitor cells from adult myocardium：homing，differentiation，and fusion after infarction.Proc Natl Acad Sci USA 2003；100(21)：12313-12318；Matsuura K，Nagai T，Nishigaki N等人，Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.J Biol Chem 2004；279(12)：11384-11391)。当将心球放在具有生心分化培养基的层粘连蛋白涂布的塑料皿中时，它们附着并且细胞从球散布出去获得平的形态(图2E)。铺板后4至6天，这些外周平滑细胞表达对于肌细胞(27±4％)、内皮(10±6％)和平滑肌细胞(34±5％)谱系特异的蛋白(图2E)。这些结果显示猪c-kitpos心脏细胞具有真正的干细胞特征，即它们表达干性标记，是克隆发生的、自体更新的并且是多能的。因此，猪c-kitpos心脏干细胞(下文称作pCSC)具有与分离自其他物种的c-kitposCSC一致(Ellison等人，2007.J.Biol.Chem.282：11397)的基因表达模式和表型。
猪CSC表达调节它们的活化的完整的IGF-1、HGF和SCF信号途径
结果显示在猪心脏中存在真正的pCSC。
pCSC在体内和体外表达IGF-1和c-met受体(图2F)。当在培养基中生长时，新分离的pCSC通过细胞增殖(图2G)和迁移(图2H)响应hrIGF-1、hrHGF和hrSCF的刺激。当配体结合时，pCSC中特异的下游效应子活化(图2I)。用来自扩增的单细胞克隆的细胞获得类似的结果(数据未示出)。因此，pCSC具有功能性耦合的GF受体系统，可以在体内开发它用于检测心肌再生方案。
实施例9、在猪中产生心肌梗死，通过用生长因子原位刺激驻留心脏干细胞监控心室功能和心肌再生
西班牙de León，León的Escuela Veterinariay医院自身(proper)的委员会批准了所有动物研究。使母Yorkshire白猪(n＝26)(27±3kg)服用镇静剂Telazol(100mg，I.M.)，插管并刮毛。将静脉内导管放在外周耳静脉中。将动物移到手术室，放在支架板上，并四肢约束而固定在手术台上。用异氟烷(在O2中为2.5％)保持动物麻醉。在所有26只动物中，冠状气囊导管在导线的引导下前进并且定位于左前壁冠状动脉(LAD)的近端部分，就在第一穿动脉的起点下。在诱导梗死前，给予猪125UI/kg肝素然后在梗死过程期间灌注肝素(10UI/kg/h)。为了诱导梗死，通过气囊膨胀(直径2.5mm)75min来堵塞LAD冠状动脉。对于抗心率不齐的药物，从梗死前15分钟开始，在整个过程连续向猪灌注胺碘酮(Trangorex)(5mg/kg/h)。在大量的室性期外收缩或心室纤颤的情形下，静脉内给予1-3mg/kg的利多卡因。以75mg氯吡格雷(Plavix)和250mg阿司匹林作为术前用药在手术前一天给予。每日给予由75mg氯吡格雷(Plavix)和125mg阿司匹林组成的术后用药直至处死。
在冠状动脉再灌注(reperfusion)后，通过前进到恰恰在第一隔动脉起点远端处的灌注气囊导管将人重组IGF-1和HGF(Peprotech)以不同剂量(2μg至8μg的IGF-1和0.5μg至2μg的HGF的范围)给予17只猪，持续30分钟。GF在15ml的PBS中以2.5ml每分钟的速率给予，在每5ml给药后再灌注2min。使用相同的方案对另外9只MI猪单独注射生理盐水(生理盐水-安慰剂对照组；CTRL)。在急性心肌梗死(AMI)期间，26只动物中有5只(CTRL组中2只和GF组中3只)死亡(急性致死率为约30％)。随后，3只动物死于手术后期间：一只动物在第一天(CTRL组)，一只动物在第13天(CTRL组)而一只动物在第14天(GF组)。以剩下的18只猪完成研究方案，13只在GF处理组而5只在CTRL组。特别地，在存活的18只动物中，GF处理动物中，4只接受1×剂量的GF(2μg IGF-1和0.5μg HGF；GF-1×)，5只接受2×剂量(4μg IGF-1和1μgHGF；GF-2×)以及4只动物接受4×剂量(8μm的IGF-1和2μm的HGF GF-4×)。在GF或单独的生理盐水给药后，立即将装有10ml的0.5M的BrdU溶液的渗透泵植入所有存活动物并持续研究的整个期间。在MI和生长因子给药后21天将猪处死。进行免疫组化分析的调查者并不知晓每只猪所属的组。
心脏功能测量。在基准、冠状堵塞后立即以及处死前通过超声波心动描记法来测量心脏功能。简言之，用M-模式和2维回波图像获得胸骨旁长轴和短轴视图。在中脊索水平垂直于心室长轴测量LV尺寸(LVEDD和LVESD)。计算LV射血分数和径向应变。
在急性心肌梗死后，局部冠状动脉内注射IGF-1/HGF保留梗死组织的结构并且改善心肌细胞存活
在急性心肌梗死后通过冠状动脉内注射30分钟向猪给予不同剂量的人重组IGF-1和HGF(下文简称IGF-1/HGF或GF)。其它猪用相同体积的单独的生理盐水注射，从而组成对照组(CTRL)。
如通过测面积法按冠状动脉外周面积百分数进行测定，梗死尺寸在GF-处理组和CTRL组之间没有差别(在GF-1×、-2×和-4×中分别为28±5％，26±7％，29±5％，而在CTRL中为27±4％)。
H&E和Sirius红对远端的、边缘的和梗死区的心脏组织横截面染色揭示在梗死区的纤维疤组织中分布的存活心肌组织岛。这些存活的心肌组织岛在GF处理的心肌中梗死区中比在CTRL处理的动物中更加丰裕(图3A-B)。通过共聚焦显微镜分析对于切片的α-肌节的肌动蛋白和BrdU双免疫荧光染色揭示这些岛主要由大的α-肌节的肌动蛋白阳性的，BrdU阴性的心肌细胞组成，此表型将它们的存活和它们的成熟甚至肥大种类确认为梗死前的心肌(图3C)。此外，相比于CTRL，GF处理的猪心脏在梗死区具有明显更少的纤维组织(图3D-F)。更有意思的是，这一减少展现出与GF给药剂量的正线性关系(图3F)。
该研究并非特异适合监控GF疗法对早期细胞死亡的影响。然而，从下面展示的结果看，很明显，在冠状动脉阻塞/再灌注事件后的很长时间，在梗死周围/边缘区的肌细胞死亡持续很高。这可能是由于病理重塑的影响，已知病理重塑在形态学适应和连续的细胞死亡之间建立了错误的循环。如图3G-H所示，相比于CTRL，IGF-1/HGF给药以剂量依赖的方式显著降低后期肌细胞死亡，如通过对活化的胱天蛋白酶-3为阳性的肌细胞数量的减少所示。与解剖形态学的保留、肌细胞存活和重塑减少一致，GF处理的心脏相比于CTRL展现出减少的肌细胞肥大响应(图3I)。将这些结果放在一起表明在急性心肌梗死后的IGF-1/HGF给药对于保留心肌细胞数量和心肌壁结构、降低在存活肌细胞上的负载有重要作用，这造成心肌重塑得以改善和对于肌细胞死亡以及存活心肌的肥大的刺激减少。
在急性心肌梗死后冠状动脉内给予IGF-1/HGF使驻留pCSC活化
如通过免疫组化所检测，在正常(未示出)和心肌梗死后的心脏中，约90％c-kitpospCSC原位表达IGF-1和c-met(HGF)受体(图4A-B)。因此，在心肌梗死后21天，GF-处理的梗死猪心脏显示出在边缘区中明显增加的c-kitpospCSC数量，并且在梗死区更高(图4C-D)。这一c-kitpospCSC增加是GF给药的结果，通过它与GF-剂量给药直接相关而被确认(图4D)。在最高GF剂量处，c-kitpospCSC在梗死区的数量比在CTRL心脏中高＞6倍(图4D，附表)。此外，在1×和4×剂量之间的线性增加表明并没有达到产生最大再生响应的饱和剂量。pCSC中许多是BrdU阳性的，这是证明它们在心肌梗死产生后出生的特征(fixture)(图4E)。它们的周期性质通过Ki-67染色所确认，Ki-67标记处于或者刚进入细胞循环的细胞(数据未示出)。许多c-kitpos细胞表达转录因子Nkx-2.5、Ets-1或Gata6，表明它们朝主要的心脏谱系，即肌细胞、内皮和平滑肌细胞的分化(图4F-I)。定量分析揭示c-kitposNkx2.5pos细胞(定向到肌细胞/血管前体)的数量，以GF-剂量依赖方式在GF处理的猪心脏中的梗死和边缘区显著增加(图4G)，达到比CTRL心脏中高＞10倍的水平。
急性心肌梗死后，IGF-1/HGF治疗产生稳健的心肌再生
GF处理的心脏在梗死和梗死周围/边缘区中都具有大量极小的新形成的BrdUpos肌细胞，而它们尚未达到最终的分化状态(图5)。这些数据被Ki67在小的新形成肌细胞中的表达所确认(图5C和F)，新形成的肌细胞中的一些处于有丝分裂和胞质分裂，证明它们未成熟的性质(图5I)。新形成的BrdUpos肌细胞也存在于未处理的生理盐水注射的CTRL猪的梗死周围/边缘区。然而，它们的数量是处理心脏的约1/10并且它们实际上于梗死区中不存在(图5)。
这确实是pCSC的情况，在梗死和边缘区中，在小BrdUpos/Ki67pos新形成肌细胞数量和GF-剂量之间存在直接相关(图5G-H)。在GF-处理的心肌中，在梗死区中，小的BrdUpos肌细胞组织为一簇再生带。随着GF剂量增加，这些再生带在结构上组织更好，并且更加紧实致密(图5A-B)。最终，在GF处理和CTRL动物之间，在梗死远端区中(备用的(spared)心肌)，新形成的肌细胞(BrdUpos或Ki67pos)的数量和外观都没有明显的不同(数据未示出)。
新形成的BrdU-阳性血管结构在边缘和梗死心肌中也是明显的(图6A-C)。相比于生理盐水处理的CTRL，GF-处理的心脏展示出在梗死区中增加的毛细管和小动脉的数量，并且这一响应是剂量依赖的(图6D-F)。有意思的是，围绕在上面提及的梗死区内的存活的心肌岛，新的微血管最加明显，它也具有更高密度的新形成的小BrdUpos肌细胞和再生带(Gandia，C.等人，008.Stem Cells 26：638)。这一组织表明通过成年备用的肌细胞对pCSC的作用产生心脏修复因子(cardiopoietic)(Behfar，A.等人，2007.J.Exp.Med.2007 204：208)。
心肌梗死后21天，在梗死区中的再生肌细胞是不成熟的，如通过它们的尺寸，以及通过它们中的许多仍旧进入细胞周期的事实所证明，该细胞周期由Ki-67的表达所证明(图5I F)。与成熟肌细胞的心脏修复因子作用这一建议的作用一致，与成熟肌细胞接触或紧邻它们(即，在边缘区)的新形成的肌细胞比在疤痕中间而不接近备用组织的那些具有明显更大的尺寸(图5)。也很明显的是，GF处理对肌细胞成熟起作用，这由随GF剂量增加平均肌细胞尺寸所显示。
考虑到猪心脏的尺寸和梗死区的体积，不能准确地测定肌细胞损失的数量或者通过GF处理再生的肌细胞数量。然而，对于梗死区和梗死周围/边缘区的仔细取样无疑证明在第28天，GF处理的梗死心脏具有即使不是全部，但也是再生了大部分的损失肌细胞。
实施例10、冠状动脉内GF给药保留并且可能改善心室功能
超声波心动描记法图像显示在冠状阻塞后，左心室射血分数(LVEF)在CTRL和GF-处理的猪中显著降低(图6G)。然而，AMI后28天，LVEF在CTRL中稍有恶化，而相比于CTRL，通过GF-处理使LVEF显著保留/改善(图6G)。为了获得对区域性心脏功能的进一步洞悉，使用组织多普勒超声波心动描记法来测量前隔径向应变，相比于CTRL，其在GF处理的猪中显著得到改善(图6H-I)。心脏功能保留/改善与增加的GF剂量相关(图6)。
实施例11、冠状动脉内给予在15μm直径的PLGA微球中封装的高达50μg的IGF-1没有溢出到全身循环
如通过实施例#5所证明，≥99％的直径15μm的微球被靶组织(并且特别是心肌)的毛细管网络所捕获。然而，这些数据没有涉及当卸载活性分子时，是否其保留在组织中或者它泄漏到毛细管循环和静脉回流中的问题。为了探讨这一问题，遵循实施例#5-7中列出的相同给药方案，将装载有总计50μg的rhIGF-1的5×106个微球在左动脉前降支的起点处冠状动脉内给予。主要的不同是导管通过颈动脉进入冠状窦。给药期间，在手术后三小时以及然后在接下来的3天中每12小时通过从冠状窦收集血样和从耳静脉收集静脉血。制备血清并且将样品冷冻在LN2中直到收集完成。通过使用不与猪IGF-1交叉反应的人IGF-1检测试剂盒(R&D，Minneapolis，Minnesota，USA)的ELISA来分析所有的样品。无论来自冠状窦或是来自全身静脉回流的样品都没有被记为阳性。在我们的工作中，该检测法对于IGF-1的最小检测极限是52.5ng/ml。因此，尽管可能发生低于ELISA检测水平的一定泄漏，但是很明显大多数IGF-1从未离开心肌。
实施例12、动脉内向受损骨骼肌局部给予IGF-1/HGF诱导肌肉干细胞的活化并刺激再生。
为了检测用于治疗受损心肌的方案是否对治疗其它组织有效，使用相同的方案来处理3只猪右腿的缺血后的骨骼肌，其中缺血损伤是通过股动脉的45min完全的气囊阻塞所产生的。如在心肌的情形下，在通过气囊放气的30min再灌注后，按照在实施例#2中所述来制备20mL含有IGF-1和HGF的直径15μm微球的PBS悬液，总剂量为8μm的IGF-1和2μm的HGF。3周后处死动物并且通过免疫组织学来分析四头肌的活组织切片以测定在损伤处的干细胞活化程度。
如上面对心肌所述，在股动脉阻塞后，向动物植入渗透泵来连续递送已知有效地标记所有复制细胞的BrdU溶液。以此方式，在开始治疗后出生的所有细胞都被BrdU标记，这允许比较对照和处理动物之间的再生反应。在每种情形下，左腿四头肌用作未损伤对照。
如图12和表6所示，相比于缺血但用安慰剂处理的对照，局部给予封装在直径为15μm的PLGA微球中的IGF-1/HGF对于在被治疗的腿中刺激肌肉再生是非常有效的，而在对侧的腿中并非如此。
表6、响应生长因子的局部给药的骨骼肌再生
Figure BDA0000053693060000511
结论：如对于靶向受损组织/器官的毛细管网络的递送系统所期待的，向并非心肌的受损组织局部给予生长因子对于位于微球给药位点下游区域的受损组织之再生反应具有刺激作用。
实施例13、冠状动脉内注射IGF-1/HGF/SCF比单独注射IGF-1/HFG对于活化CSC并保留心室功能具有更有效的作用
为了检测向前面实施例所述方案中添加新的因子是否将改善梗死后的心肌的再生反应，向一组3只动物给予实施例#9中使用的较高剂量的IGF-1(8μg)和HGF(2μg)以及4μg的SCF。如实施例#2所述，这些因子中每种都封装在直径15μm的PLGA微球中。产生梗死、监控和给予微球悬液的方案按实施例#5-7所述。动物在处理后4周处死。
如图13A和13B所示，通过三种生长因子方案所产生的再生比通过IGF-1/HGF组合的再生无论在再生水平以及再生肌细胞成熟水平方面都明显更好。细胞和组织学以及功能参数如表？？？所示，其确认了所用因子之间的协同作用并且证明本发明产生改变再生反应的治疗性化合物的多种变体的适合性。从这些数据来进行下述推断是合理的，即除了加入或减去含有特定因子的颗粒以外，其他变化可涉及改变特定因子或一组因子的剂量、特定因子的释放/卸载谱、加载程度等。
结论：本发明允许从有限套的基础材料配制几乎无限数量的特异的治疗化合物的组合，其中每种因子可以在不同剂量、不同释放模式并与不受限的其它因子组合使用。这允许在靶向特定组织的单一给药中有不同的治疗剂组合，每种治疗剂可在不同时间、不同细胞靶标作用并且需要不同的有效剂量。这些可能性对于不能重复进入的难于进入的组织如心肌和多数内部器官尤其有益。
附图说明
图1、c-kitpos心脏细胞在成年猪心脏中的分布和特征。
(A-B)表示在正常猪心脏的右心房(A)和左心室(B)中的c-kit阳性(c-kitpos；白色)细胞的共聚焦图像。心肌细胞被α-肌节的肌动蛋白(α-sarcact)染为红色(图中以灰色示出)而细胞核由DAPI染为蓝色。(C)c-kitpos细胞遍及心房的和心室的心肌分布，相比于左右心室(RV，LV)，在心房和心尖中密度更高。＊p＜0.05 vs RV和LV。(D)c-kitpos细胞在对于心房、心室(RV)和心尖的肌细胞-缺失的心脏细胞群中的代表性FACS分析。(E)使用MACS获得的c-kitpos细胞显示出＞90％的富集。对富集的c-kitpos猪心脏细胞的FACS分析揭示它们对于造血细胞谱系标记CD45和CD34是阴性的。另外，高比例的c-kitpos猪心脏细胞表达间充质细胞谱系标记CD90和CD166。
图2、c-kitpos猪心脏细胞表达干性标记，具有克隆发生的、自体再生的形成心球以及多能的干细胞特性，并且表达调节它们活性的完整的IGF-1/HGF信号系统。
(A)示出在第4次传代的扩增的c-kitpos猪心脏细胞的光学显微图像。(B)在将单个c-kitpos猪心脏细胞放入用于产生单个细胞克隆的Terasaki板的孔中后，克隆的光学显微图像。(C)整个心脏的腔室中，以及与鼠和啮齿动物CSC相比，c-kitpos猪心脏细胞的克隆发生相似。(D)克隆的c-kitpos猪心脏细胞的免疫荧光染色证实了c-kit(白色)的表达，并且揭示了Flk-1、Oct-4、Nanog、Tert、Bmi-1、Nkx2.5和Isl-1(都显示为灰色)的表达，这表明它们是心脏干细胞以及祖细胞的混合物。图像是20倍放大，以放大捕捉的作为插入图。(E)克隆的c-kitpos猪心脏细胞形成心球(a)。当将c-kitpos(白色)心球(b)放在涂布有层粘连蛋白的皿的生心培养基中时，心球细胞从球(c)中散布出来。四至六天后，球外周的细胞增加对于心肌细胞(α-肌节的肌动蛋白，α-Sarc Act；d)、平滑肌(平滑肌肌动蛋白，SMA；e)和内皮(von Willebrand因子，vWF；f)细胞的生物标记的表达(都显示为灰色荧光)。(F)免疫荧光染色显示出c-kitpos猪CSC具有IGF-1和HGF受体(灰色，分别为Igf-1R和c-met)。(G-H)当在培养基中生长时，新分离的猪c-kitpos心脏细胞通过细胞增殖(G；＊p＜0.05 vs.基准，p＜0.05 vs.CTRL，p＜0.05 vs.HGF)和迁移(H；p＜0.05 vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1)响应IGF-1和HGF的刺激。(I)Western印迹分析揭示在配体结合时，在c-kitpos猪心脏细胞中的特异性下游效应子途径被激活。phos＝磷酸化的，FAK＝粘着斑激酶。
图3、AMI后，冠状动脉内注射IGF-1和HGF改善心肌细胞重塑。
(A)GF-处理的猪心脏的H&E染色揭示在梗死区的存活心肌组织的岛(箭号)，置于在再生和纤维层之间。(B)这些心肌岛在生理盐水处理的CTRL猪心脏中是罕见以及结构上较少定义的。(C)这些心肌岛由主要是BrdU阴性心肌细胞(心肌肌钙蛋白I，cTnI，灰色，它们的细胞核为细胞中央的黑色圆圈)所构成，证明它们存活的和成熟的表型。在梗死后出生的细胞是BrdU阳性的并且它们的细胞核显示为白点。(D-E)在GF处理的(D)和生理盐水处理的CTRL(E)猪心脏中，Sirius红染色在梗死区的横截面鉴定出纤维组织(灰色染色)和肌肉(黄色染色)。(F)相比于生理盐水处理的CTRL猪，GF-处理的(IGF-1/HGF)猪心脏在梗死区具有减少的纤维化面积分数百分比。＊p＜0.05 vs.CTRL.p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×。(G)对于活化的胱天蛋白酶-3染色(棕色；箭头)揭示在AMI后，CTRL猪心脏的梗死周围/边缘区的凋亡肌细胞。(H)相比于生理盐水处理的CTRL，IGF-1和HGF注射造成在梗死周围/边缘区的凋亡肌细胞的数量减少。＊p＜0.05，vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 2×。(I)肌细胞直径的分析显示，相比于生理盐水处理的CTRL动物，GF处理的猪在AMI后具有减少的肌细胞肥大响应。正常＝CTRL心脏的梗死区域远端区。^p＜0.05 vs.正常，＊p＜0.05 vs.CTRL.p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×。
图4、在AMI后，IGF-1和HGF给药活化内源CSC，驱动它们定向心脏谱系
(A-B)多数猪ckitposCSC(白色)在体内表达Igf-1(A，灰色)和c-met(B，灰色)受体。DAPI将细胞核染成蓝色。(C)在GF-4×处理的猪心脏的梗死区中的一簇ckitposCSC(白色)。(D)与生理盐水处理的CTRL相比，GF处理的猪中，c-kitposCSC的数量在边缘处显著增加，但梗死区域中更多。＊p＜0.05，vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 2×。(E)在GF处理的猪心脏中，许多c-kitposCSC(白色)对BrdU(灰色)呈阳性，表明它们新形成的状态。(F)c-kitposCSC(白色)表达代表心脏祖细胞的心脏转录因子Nkx2.5(灰色)。细胞核被DAPI染色(蓝色)。(G)在GF处理的猪心脏中，c-kitposNkx2.5pos心脏祖细胞的数目在梗死区和边缘区中都增加，＊p＜0.05，vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 2×。(H-I)一些c-kitposCSC(白色)表达分别代表平滑肌和内皮细胞分化的转录因子GATA6(H；灰色)和Ets-1(I；灰色)。
图5、AMI后，IGF-1/HGF冠状动脉内给药诱导大量新的肌细胞形成。
(A-B)在GF-1×(A)和GF-4×(B)处理的猪心脏的梗死区域中，小的新形成的BrdUpos(白色)肌细胞(灰色；α-肌节的肌动蛋白，α-Sarc Act)的再生带。注意在4×GF给药量后增加的再生带的尺寸。并且在4×GF给药量后，肌细胞更加致密，紧实并且结构上更像心肌。(C)在梗死区的这些再生带中有小Ki67pos(白色)增殖肌细胞(灰色；α-Sarc Act)。(D-E)在GF-1×(D)和GF-4×(E)剂量后，在边缘区中新形成的小BrdUpos(白色细胞核)肌细胞(灰色；α-Sarc Act细胞质)。(F)GF注射后，小Ki67pos(白色)肌细胞(灰色；α-Sarc Act)也存在于边缘区中。(G-H)在GF注射后，小BrdUpos和Ki67pos肌细胞部分在边缘区中显著增加，但是在梗死区中更多。＊p＜0.05，vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 1×，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 2×.(I)GF-4×处理的猪心脏的梗死区中的小Ki67pos有丝分裂的肌细胞。
图6、对梗死猪心脏的生长因子给药增加新的血管结构的产生并改善心脏功能。
(A)在GF-处理的猪心脏的梗死区域中，明显见到新形成的动脉结构(BrdU，白色；α-平滑肌肌动蛋白，SMA，白色；Myosin重链，MHC，灰色；DAPI，蓝色)。(B-C)在IGF-1和HGF注射后，在梗死区域也明显见到新形成的毛细管(BrdU，白色；vWF，灰色；DAPI，深灰色)。(D-F)相比于生理盐水处理的(深灰色系)CTRL，在GF处理的猪中梗死区域的毛细管数量显著增加。＊p＜0.05 vs.CTRL，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF1×，p＜0.05 vs.IGF-1/HGF 2×。图像(20×放大)显示在生理盐水处理的CTRL(D)和GF-4×(E)处理的心脏中的vWF染色vWF(深灰色)。毛细管定义为由1或2内皮细胞组成的血管。(G-H)相比于生理盐水处理的CTRL，GF-处理的猪显示出提高的左心室(LV)射血分数(G)和径向应变(H)。＊p＜0.05 vs.基准，#p＜0.05 vs.AMI，p＜0.05 vs.CTRL，p＜0.05 vs.GF-1×。(I)跟踪自CTRL(a-c)和GF-4×(d-f)处理的猪的代表性组织多普勒径向应变。在90分钟的冠状动脉阻塞(AMI)后，CTRL(b)和GF-4×(e)处理的猪的前间隔收缩具有相同的去同步性。处死时(MI后)，去同步收缩在CTRL(c)中更差，而在GF-处理的(f)猪中得以改善。
上面所示结果证明微克剂量的这些生长因子改善心肌重塑，培养驻留CSC的活化，这使用临床上可实施的方案，产生了大量新的心肌形成，以剂量依赖方式改善尺寸和解剖学上与人相似的动物心脏的LV功能。因此，IGF-1/HGF注射对于心脏重塑和自体细胞再生产生了大量的有益效果，这与GF给药的剂量成比例。
图7、示出通过上述处方获得的含有IGF-1的PLGA颗粒的光学显微图像。
图8、示出上图所示的相同批次的颗粒的电子显微图。
图9、示出#1猪(左图)和#2猪(右图)的心脏切片。#1猪的左冠状动脉所供给的左心室前壁显示出一些微梗死(暗色区)，而#2猪的心肌是正常的，如可从均一的染色示出。
图10A、在给予聚苯乙烯(该图示出的红珠为灰色、较大直径的平滑圈)和PLGA+生长因子(该图示出的绿珠为白色、较小直径且更加不规则的形状)珠混合物后30分钟处死的#3猪的心肌切片。在红色和绿色颗粒之间的表观尺寸差异是由于红色的高荧光性。
图10B和10C、示出在给予聚苯乙烯(该图示出的红珠为灰色、较大直径的平滑圈)和PLGA+生长因子(该图示出的绿珠为白色、较小直径且更加不规则的形状)珠混合物后24小时处死的#4猪的心肌切片。绿色与红色珠的比例由于PLGA微粒的降解而在这一动物中明显更低。在左侧的四栏中，只有红色珠被检测到，而在右侧中的那些，比率接近1∶1.
图11、示出#4猪的两个区域的显微切片。肌细胞是灰色的。细胞核是深灰色的。内源性心脏干细胞(CSC)由箭头(上)和箭号(下)指出。它们的膜标记为暗绿色。在上图中，由于细胞是不活跃的，因而细胞核是清晰的。在下图中，所有CSC具有暗灰色染色的细胞核，其鉴定出进入了细胞周期的细胞的标记物蛋白Ki-67。
图12、局部给予在15μm PLGA微球中封装的IGF-1和HGF增强了受损骨骼肌的再生。
对照和受损的四头肌的组织学图像。A栏：在右侧肌肉产生损伤后5天，左侧肌肉(对照)的组织学图像。没有对这条腿给予处理。B栏：产生该损伤且未处理(损伤对照)后5天，右侧四头肌的组织学切片。箭头指向若干大面积细胞坏死中的两个，其中细胞核的浓度似乎启动再生反应。C栏：在用装载有IGF-1的微球和装载有HGF的微球的混合物(以相当于16μg IGF-1和4μg HGF给药)处理损伤后3天，右侧四头肌的活组织检查。箭头指向在再生过程中，受损区中的新的微纤维。D栏：两天后(损伤5天后)对在C栏中示出的相同肌肉的活组织检查。更小尺寸的深色纤维是由针对胚胎肌球蛋白重链的抗体(再生纤维的标记)所标记的再生纤维。这一栏中的图像相当于B栏中的图像。两图像间的明显差异显示出治疗的效力。
图13、在冠状动脉内给予封装在直径15μm的PLGA微球中的IGF-1/HGF/SCF组合增强了心肌再生能力。
图13A的柱形图比较了在用两种类型的微球组合处理AMI后的猪，白色柱(一个装载有IGF-1而另一个装载有HGF)以及用三种类型的微球(hrIGF-1、hrHGF和hrSCF)组合处理的动物(黑色柱)中，再生心肌细胞的数量。显然在所用的三种不同浓度下，各装载有不同因子的三种类型的微球的组合比仅有两种的组合要好。CTRL＝用安慰剂处理的对照动物；白色柱：给予装载有相当于2μg IGF-1和0.5μg HGF 1×生物物活性的微球的动物；2×＝4μg IGF-1和1μg HGF以及4×剂量＝8μg的IGF-1和2μg的HGF。黑色柱：与由白色柱表示的用于动物的相同量IGF-1和HGF再加上装载有相当于2、4和8μg生物活性hrSCF的SCF的微球。
图13B示出在对用不同的微球组合处理的猪的超声波心动描记法测定的AMI之前、AMI后马上以及AMI后四周的左心室射血分数。基准＝就在AMI之前的LV射血分数；AMI＝AMI后的LV射血分数；AMI后＝AMI以及局部GF处理后四周的LV射血分数。C＝AMI后用安慰剂处理的对照动物；○＝用在溶液中4×剂量的IGF-1+HGF冠状动脉内处理的动物；
Figure BDA0000053693060000571
恰好在冠状动脉阻塞位点下游给予而处理的动物；Δ＝用4×剂量的各单独封装在PLGA微球中的IGF-1+HGF+SCF，恰好在冠状动脉阻塞位点下游给予而处理的动物。
贯穿说明书和所附权利要求，除非上下文另有需要，否则措词“包括”及其变化如“包括有”和“包括了”将理解为暗示包括所述整体或步骤或整体的组合，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组合。
因此本发明的实施方式描述为包括整体。本发明也延及由所述整体组成或者主要由所述整体组成的单独的实施方式。
也特别地设想只要技术上可行，本发明延及在此所述的一或多个实施方式的组合。
在此所指的所有专利和专利申请通过整体引用它们而作为参考。
这一说明书和权利要求形成本申请的部分，而本申请可用作关于任何后续申请的优先权基础。这种后续申请的权利要求可涉及在此所述的任何特征或特征的组合。它们可采用产品、组合物、方法或用途权利要求的形式并且作为实例可包括所述权利要求，但不限于此。

Claims (33)

1.一种向靶组织胃肠外给药的药物制剂，包括含有活性成分和生物可降解的赋形剂的颗粒，其中90％或90％以上的颗粒具有10和20微米之间的直径并且该制剂基本上不含直径大于50微米以及小于5微米的颗粒，使得在靶组织上游给予该制剂时，活性物通过靶组织并进入全身循环的能力受到限制。
2.根据权利要求1的药物制剂，基本上不含直径大于20微米和小于5微米的颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的药物制剂，其中至少90％的颗粒具有在15和20微米之间的直径。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中至少95％、至少98％或至少99％的颗粒具有在10和20微米之间的直径。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中至少95％、至少98％或至少99％的颗粒具有在15和20微米之间的直径。
6.根据权利要求1-5中任一项的药物组合物，其中颗粒的大小是单分散的。
7.根据权利要求6的药物组合物，其中至少68％的颗粒具有平均颗粒大小+/-1微米的尺寸。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中至少99％的颗粒具有平均颗粒大小+/-1微米的尺寸。
9.根据权利要求1-8中任一项的药物组合物，其中颗粒具有15微米的平均尺寸。
10.根据权利要求1-9中任一项的药物组合物，用于胃肠外给药于缺血组织。
11.根据权利要求10的药物组合物，用于胃肠外给药于心脏缺血组织。
12.根据权利要求11的药物制剂，进一步包括选自下述的生长因子：HGF(肝细胞生长因子)；IGF(胰岛素样生长因子)如IGF-1；PDGF(血小板源生长因子)如PDGF-β，FGF(成纤维细胞生长因子)如aFGF(FGF-1)或bFGF(FGF-2)和FGF-4；SDF-1(基质细胞源因子1)；EGF(表皮生长因子)；VEGF(血管内皮生长因子)；促红细胞生成素(EPO)；TGFβ(转化生长因子β)；G-CSF(粒细胞集落刺激因子)；GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)，骨形态发生蛋白(BMP，BMP-2，BMP-4)；激活蛋白A；IL-6；神经营养蛋白如NGF(神经生长因子)，BDNF(脑源神经营养因子)，NT-3(神经营养蛋白-3)，NT-4(神经营养蛋白-4)和与NGF，BDNF，NT-3及NT-4结构上不相关的神经营养蛋白(神经营养蛋白-1)；TPO(血小板生成素)；GDF-8(肌肉生长抑制素)；GDF9(生长分化因子-9)；骨膜蛋白，Wint3A或神经调节素。
13.根据权利要求1-12中任一项的药物组合物，含有选自包括HGF和/或IGF的组的活性成分。
14.根据权利要求13的药物组合物，进一步包括PDGF(血小板源生长因子)如PDGF-β，FGF(成纤维细胞生长因子)如aFGF(FGF-1)或bFGF(FGF-2)和FGF-4；SDF-1(基质细胞源因子1)；EGF(表皮生长因子)；VEGF(血管内皮生长因子)；促红细胞生成素(EPO)；TGFβ(转化生长因子β)；G-CSF(粒细胞集落刺激因子)；GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)，骨形态发生蛋白(BMP，BMP-2，BMP-4)；激活蛋白A；IL-6；神经营养蛋白如NGF(神经生长因子)，BDNF(脑源神经营养因子)，NT-3(神经营养蛋白-3)，NT-4(神经营养蛋白-4)和与NGF，BDNF，NT-3及NT-4在结构上不相关的(神经营养蛋白-1)；TPO(血小板生成素)；GDF-8(肌肉生长抑制素)；GDF9(生长分化因子-9)；骨膜蛋白，Wint 3A或神经调节素。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其进一步包括SCF-1。
16.根据权利要求1-15中任一项的药物组合物，其中活性成分的浓度在每1×106个颗粒1ng高至每1×106个微球4mg的范围内。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物制剂，其中至少30％的活性成分在给药后保留在靶组织中。
18.根据权利要求17所述的药物制剂，其中至少40％、至少50％、至少60％、至少70％，如至少80％的活性成分得到保留。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中胃肠外给药是动脉内给药。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的药物制剂，用于治疗。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的药物制剂，用于靶向所选择的组织或器官。
22.根据权利要求21所述的药物制剂，其中所述器官选自心脏、肺、肝、肾、膀胱、子宫、睾丸、胰腺、脾或小肠。
23.根据权利要求22所述的药物制剂，用于靶向心脏组织。
24.根据权利要求23所述的药物制剂，用于治疗急性或慢性心肌梗死(MI)、具有或不具有心肌梗死的缺血性心脏病。
25.一种局部递送方法，包括将如权利要求1-19中任一项所述的药物组合物给予心脏组织的循环上游的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中局部递送是通过动脉内给药。
27.HGF或IGF-1的应用，用于通过刺激成熟心脏组织中驻留的干细胞在心脏组织再生。
28.根据权利要求12所述的生长因子的应用，用于诱导免于缺血损伤的心脏组织特异干细胞的细胞保护以及减少它们通过凋亡和/或坏死的死亡。
29.根据权利要求12所述的生长因子的应用，用于刺激表达Oct4的干细胞。
30.根据权利要求12所述的生长因子的应用，其中心脏组织特异的干细胞也受到刺激。
31.根据权利要求1-19中任一项所述的药物制剂，用于治疗脑血管意外(中风)。
32.根据权利要求1-19中任一项所述的药物制剂，用于治疗作为任何其它组织的血流减少(缺血)或退行性疾病的结果而产生的任何细胞损失。
33.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物包括混合的颗粒群，所述群包括具有第一活性成分的颗粒与具有一或多种其它不同的活性成分的颗粒共混合。
CN2009801391387A 2008-08-05 2009-08-05 包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物 Pending CN102170868A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0814302.6 2008-08-05
GBGB0814302.6A GB0814302D0 (en) 2008-08-05 2008-08-05 Compounds and methods
PCT/EP2009/060171 WO2010015665A2 (en) 2008-08-05 2009-08-05 Compounds and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102170868A true CN102170868A (zh) 2011-08-31

Family

ID=39846672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801391387A Pending CN102170868A (zh) 2008-08-05 2009-08-05 包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20120195939A1 (zh)
EP (1) EP2323626B1 (zh)
JP (1) JP5623400B2 (zh)
KR (1) KR101639827B1 (zh)
CN (1) CN102170868A (zh)
AU (1) AU2009279086B2 (zh)
BR (1) BRPI0917571B1 (zh)
CA (1) CA2732785C (zh)
CL (1) CL2011000244A1 (zh)
ES (1) ES2677005T3 (zh)
GB (1) GB0814302D0 (zh)
MX (1) MX2011001261A (zh)
WO (1) WO2010015665A2 (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
GB0814302D0 (en) 2008-08-05 2008-10-01 Coretherapix Slu Compounds and methods
WO2014022685A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Recruitment of mesenchymal cells using controlled release systems
EP2882445B1 (en) 2012-08-13 2019-04-24 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
WO2014066545A1 (en) * 2012-10-26 2014-05-01 Cedars-Sinai Medical Center Therapeutic cells depleted of specific subpopulations of cells for use in tissue repair of regeneration
EP2948543A1 (en) * 2013-01-24 2015-12-02 Bernardo Nadal-Ginard Modulation of cardiac stem-progenitor cell differentiation, assays and uses thereof
EP2759595B1 (en) * 2013-01-24 2016-09-14 Pierre Fabre Médicament S.A.S. Composition comprising an encapsulated antagomir
US11357799B2 (en) 2014-10-03 2022-06-14 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
CN104650333B (zh) * 2015-02-05 2016-08-24 浙江大学 聚乳酸/氢化聚丁二烯热塑性超分子弹性体及其制备方法
WO2016139606A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-09 Accurate Medical Therapeutics Ltd. Preventing non-target embolization
KR102557319B1 (ko) 2015-03-30 2023-07-18 타리스 바이오메디컬 엘엘씨 상부 요로로의 약물의 국부적인 전달을 위한 장치 및 방법
WO2017123662A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
WO2017220611A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Virbac Oral pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically active agent, at least one cationic bioadhesive polymer and at least two anionic polymers
WO2018057542A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
JP7336769B2 (ja) 2017-04-19 2023-09-01 シーダーズ―シナイ メディカル センター 骨格筋ジストロフィーを治療する方法及び組成物
IL274383B2 (en) 2017-11-02 2024-03-01 Accurate Medical Therapeutics Ltd Catheter for embolization with integral filter
EP3727351A4 (en) 2017-12-20 2021-10-06 Cedars-Sinai Medical Center MODIFIED EXTRACELLULAR VESICLES FOR IMPROVED TISSUE DELIVERY
WO2022159658A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 University Of Connecticut Synthetic artificial stem cells (sasc)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1350518A1 (en) * 1995-10-12 2003-10-08 Schering Aktiengesellschaft Prolonged release of GM-CSF
WO2004022000A2 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Ambrose Catherine G Antibiotic microspheres for treatment of infections and osteomyelitis

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6007845A (en) 1994-07-22 1999-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers
ES2191721T3 (es) 1994-12-16 2003-09-16 Elan Drug Delivery Ltd Microparticulas reticuladas y su utilizacion como vehiculos terapeuticos.
CA2161863A1 (en) 1995-10-31 1997-05-01 Michael Vivian Sefton Angiogenic material and uses thereof
US6511477B2 (en) 1997-03-13 2003-01-28 Biocardia, Inc. Method of drug delivery to interstitial regions of the myocardium
JP2001524096A (ja) * 1997-04-24 2001-11-27 ニコムド イメージング エイエス コントラスト剤を含む不溶性微粒子または小胞を使用する塞栓治療
ATE220564T1 (de) 1997-08-14 2002-08-15 Sulzer Innotec Ag Zusammensetzung und vorrichtung zur reparatur von knorpelgewebe in vivo bestehend aus nanokapseln mit osteoinduktiven und/oder chondroinduktiven faktoren
AU1384199A (en) * 1997-11-07 1999-05-31 Chiron Corporation Method for producing igf-1 sustained-release formulations
WO2000021548A2 (en) 1998-10-13 2000-04-20 Chiron Corporation Angiogenically effective unit dose of fgf and method of administering
BR9915462A (pt) 1998-11-18 2001-12-11 Univ Florida Processos para preparação de partìculas dedroga revestidas e as suas formulaçõesfarmacêuticas
US7651703B2 (en) 1999-10-15 2010-01-26 Genentech, Inc. Injection vehicle for polymer-based formulations
US7547674B2 (en) 2001-06-06 2009-06-16 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
WO2003059375A1 (fr) * 2002-01-17 2003-07-24 Cardio Incorporated Therapie complexe pour la regeneration des tissus
US20030199464A1 (en) 2002-04-23 2003-10-23 Silviu Itescu Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization
US20070122487A1 (en) * 2003-03-19 2007-05-31 University Of Kentucky Research Foundation (Poly(acryloyl-hydroxyethyl starch)-plga composition microspheres
US20050142205A1 (en) * 2003-07-18 2005-06-30 Julia Rashba-Step Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
CA2915574C (en) * 2003-07-18 2017-02-07 Oakwood Laboratories, L.L.C. Prevention of molecular weight reduction of the polymer, impurity formation and gelling in polymer compositions
JP4532092B2 (ja) * 2003-09-30 2010-08-25 泰彦 田畑 血管新生剤
WO2005055949A2 (en) 2003-12-09 2005-06-23 The Children's Hospital Of Philadelphia Sustained release preparations composed of biocompatible complex microparticles
JP5048323B2 (ja) * 2004-03-31 2012-10-17 株式会社ツーセル 損傷組織の治療剤と治療方法
US7854944B2 (en) 2004-12-17 2010-12-21 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Tissue regeneration
ES2273572B1 (es) * 2005-05-04 2008-04-01 Universidad De Sevilla Procedimiento de preparacion de particulas de tamaño micro y nanometrico con productos labiles y particulas obtenidas.
WO2007028053A2 (en) 2005-09-02 2007-03-08 X-Cell Medical Incorporated Methods of treating and preventing cardiac disorders
KR100718329B1 (ko) 2005-09-08 2007-05-14 광주과학기술원 다당류로 기능화된 수화젤막을 가지는 나노입자와 이를포함하는 서방형 약물전달시스템 및 그 제조방법
WO2007055561A1 (en) * 2005-11-11 2007-05-18 Vascular Biosciences R-ras activity in vascular regulation
EP1948246B1 (en) * 2005-11-14 2017-05-03 Theragene Pharmaceuticals, Inc. Stem cell factor therapy for tissue injury
CU23388B6 (es) 2006-01-31 2009-07-16 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composición farmacéutica de microesferas para prevenir la amputación del pie diabético
ES2459743T3 (es) * 2006-10-19 2014-05-12 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Preparación de liberación sostenida para terapia de regeneración tisular
WO2008108736A1 (en) 2007-03-06 2008-09-12 Agency For Science, Technology And Research Particles for delivery of bioactive factors
EP2244697A1 (en) 2008-01-29 2010-11-03 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Therapeutic compositions
WO2009100128A1 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Particulate delivery vehicles for embryoid bodies
US20090297621A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-03 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Microparticles For The Treatment Of Disease
GB0814302D0 (en) 2008-08-05 2008-10-01 Coretherapix Slu Compounds and methods

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1350518A1 (en) * 1995-10-12 2003-10-08 Schering Aktiengesellschaft Prolonged release of GM-CSF
WO2004022000A2 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Ambrose Catherine G Antibiotic microspheres for treatment of infections and osteomyelitis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付寒等: "粒径均一单分散载药微球的制备技术及其应用", 《中国医药工业杂志》 *
王娟等: "单分散聚合物微球的合成术", 《材料工程》 *
田瑞等: "快速膜乳化法制备粒径均一的PLGA微球和微囊", 《过程工程学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009279086A1 (en) 2010-02-11
US20130315997A1 (en) 2013-11-28
JP5623400B2 (ja) 2014-11-12
BRPI0917571B1 (pt) 2022-01-04
WO2010015665A3 (en) 2010-10-07
CA2732785C (en) 2016-11-22
ES2677005T3 (es) 2018-07-27
KR101639827B1 (ko) 2016-07-14
EP2323626A2 (en) 2011-05-25
CL2011000244A1 (es) 2011-07-15
JP2011529946A (ja) 2011-12-15
KR20110051212A (ko) 2011-05-17
AU2009279086B2 (en) 2014-05-22
MX2011001261A (es) 2011-08-08
WO2010015665A2 (en) 2010-02-11
US20120195939A1 (en) 2012-08-02
GB0814302D0 (en) 2008-10-01
US8846099B2 (en) 2014-09-30
BRPI0917571A2 (pt) 2020-08-11
US20130189321A1 (en) 2013-07-25
CA2732785A1 (en) 2010-02-11
EP2323626B1 (en) 2018-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102170868A (zh) 包含介于10和20微米之间直径的微球的胃肠外给药组合物
Tobias et al. Alginate encapsulated BDNF-producing fibroblast grafts permit recovery of function after spinal cord injury in the absence of immune suppression
Yao et al. Biomimetic injectable HUVEC‐adipocytes/collagen/alginate microsphere co‐cultures for adipose tissue engineering
US8114668B2 (en) Composition for cold storage of stem cells
CN102388127B (zh) 肺的组织改造
US11786581B2 (en) Directed stem cell recruitment
US20050180957A1 (en) Method of using fibrin-bound angiogenic factors to stimulate vascularization of transplant site of encapsulated cells
US20140017304A1 (en) Method for encapsulated therapeutic products and uses thereof
US20050214377A1 (en) Microparticles for cell delivery
KR20030043937A (ko) 혈관분포된 조직 이식편
US20230256196A1 (en) A Hybrid Bioscaffold-Intravascular Catheter for Cellular Therapies
US20180008648A1 (en) Scaffold-seeded oral mucosa stem cells
Barcons Development of a chick embryo spinal cord injury model as a platform to test neural tissue engineering strategies
Wang Functionalised self-assembled peptide hydrogel for cell transplantation
Yu Biomaterial-based tissue engineering approaches to repair myocardial infarction

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110831