MX2011001261A - Composicion parenteral que comprende microesferas con un diametro entre 10 y 20 micrometros. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas adecuadas para dirigirse a tejidos y/u órganos particulares con un ingrediente activo formulado, por ejemplo cuando se administran corriente arriba del órgano o tejido objetivo, y al uso de las mismas en el tratamiento, métodos de tratamiento administrando los mismos y métodos de preparación de las formulaciones. Las formulaciones farmacéuticas de la invención son para la administración parenteral a un tejido objetivo y comprenden partículas que contienen un ingrediente activo, y un excipiente biodegradable, en donde 90% o más de las partículas tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros y la formulación está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrómetros y menor de 5 micrómetros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido objetivo, se restringe la habilidad del agente activo para pasar a través del tejido objetivo y pasar hacia la circulación sistémica.

Description

COMPOSICION PARENTERAL QUE COMPRENDE MICROESFERAS CON UN DIAMETRO ENTRE 10 Y 20 MICROMETROS Campo de la Invención La presente descripción se refiere a las formulaciones farmacéuticas adecuadas para dirigirse a tejidos y/u órganos particulares, con un ingrediente activo formulado, por ejemplo cuando se administra corriente arriba del órgano o tejido objetivo. La descripción también se refiere al uso de las mismas en el tratamiento, los métodos de tratamiento administrando las mismas y los métodos de preparación de las formulaciones.

En particular, diferentes factores de crecimiento y citocinas son empleados para estimular la capacidad regenerativa intrínseca de los tejidos sólidos mediante activación de su población residente de células madre utilizando un dispositivo, tal como un catéter, para la distribución localizada de los compuestos activos hacia los tejidos objetivo.

Antecedentes de la Invención La mayoría de los medicamentos/productos farmacéuticos son administrados sistémicamente , por ejemplo oralmente, intravenosamente, por vacuna, intramuscularmente o similares. Excepciones notables son los stents recubiertos con ingredientes activos, ciertas formulaciones respiratorias distribuidas directamente a los pulmones, ciertas Ref. : 217379 ? radioterapias que son dirigidas a las áreas objetivo y ciertos tratamientos dermatológicos, oftalmológicos, y otológicos, que son administrados tópicamente.

No obstante, cuando es apropiado, seria ventajoso ser capaces de administrar el producto farmacéutico principalmente a un tejido u órgano enfermo, debido a que esto podría reducir la dosis requerida, y también reducir al mínimo los efectos colaterales. Tal procedimiento sería particularmente ventajosamente para dos áreas principales de medicina: a) la administración de los factores de crecimiento y las citocinas capaces de activar el crecimiento y diferenciación de las células madres residentes en un tejido particular. Debido a la potente actividad biológica de estas moléculas, sería deseable limitar su acción al tejido destinado, con derramamiento mínimo o nulo al resto del cuerpo; b) la distribución de los agentes quimioterapéuticos para el cáncer debido a que si el tejido canceroso pueda ser específicamente establecido como blanco entonces esto puede permitir la dirección de más altas dosis a las células objetivo mientras que se reducen al mínimo los efectos colaterales tóxicos, terribles de los mismos, al menos a un grado significativo.

En situaciones más agudas tales como en ataques cardiacos y apoplejías, pueden ser posibles tratamientos mejores, particularmente aquellos dirigidos a regenerar el tejido dañado, si los órganos afectados pudieran ser específicamente tomados como blancos. En situaciones crónicas, tal como la enfermedad de Parkinson, diabetes, o la fibrosis pulmonar, la administración local de agentes capaces de reconstituir el o los tipos celulares deficientes, tienen el potencial para mejorar el pronóstico del trastorno.

No obstante, la distribución reproducible de ingredientes activos al tejido objetivo o un órgano objetivo de una manera terapéuticamente efectiva es influenciado a un grado mayor sobre los componentes (incluyendo excipientes) empleados, sus características físicas, la dosis y el modo de administración .

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A a 1E muestran la distribución y caracterización de las células cardiacas c-kitpos en el corazón porcino adulto.

Las Figuras 2A a 21 muestran imágenes de microscopía de luz que muestran diversas células cardiacas porcinas, expandidas.

Las Figuras 3A a 31 muestran la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de corazones porcinos tratados con GF.

Las Figuras 4A a 41 muestran la evidencia de activación de CSCs endógenas.

Las Figuras 5A a 51 muestran bandas de regeneración de células pequeñas, recién formadas.

Las Figuras 6A a 61 muestran diversas imágenes, de tejido recién formado.

La Figura 7 muestra una imagen de microcopio óptico de las partículas de PLGA con IGF-1 preparada como en el Ejemplo 1.

La Figura 8 muestra una micrografía electrónica de partículas de PLGA con IGF-1 preparadas como en el Ejemplo 1.

La Figura 9 muestra secciones de corazón porcino. Las Figuras 10A a 10C muestran secciones de miocardio porcino después de la administración de microesferas de poliestireno o PLGA y microesferas del factor de crecimiento.

La Figura 11 muestra secciones de corazón porcino en donde las células madres cardiacas, endógenas, son puestas de manifiesto. .

Las Figuras 12A a 12D muestran imágenes histológicas de músculo de cuadríceps control y dañado.

La Figura 13A compara el efecto en el número de miocitos cardiacos regenerados en cerdos post-AMI tratados con una combinación de dos tipos de microesferas.

La Figura 13B muestra la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo antes de, inmediatamente después de y 4 semanas después de AMI, como es determinado mediante ecocardiografía de los cerdos tratados con diferentes combinaciones de microesferas.

Descripción detallada de la invención La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica para la administración parenteral, especialmente intra-arterial , a un tejido objetivo, que comprende partículas que contienen un ingrediente activo y un excipiente polimérico biodegradable , en donde 30% o más de las partículas tienen diámetro de 25 micrómetros o menos, y la formulación es sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrómetros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido objetivo, la habilidad de los ingredientes activos para pasar a través del tejido objetivo y pasar hacia la circulación sistémica, es restringida. Es decir, el ingrediente activo es retenido en el tejido objetivo, mientras que su habilidad para pasar a través del tejido objetivo y pasar hacia la circulación sistémica es severamente restringida o abolida. De este modo, en un aspecto particular de la invención, se proporciona una formulación farmacéutica para la administración parenteral a un tejido cardiaco, la composición farmacéutica comprende partículas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde 90% o más de las partículas tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros y la formulación está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrómetros y menos de 5 micrómetros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido objetivo, la habilidad del ingrediente activo para pasar a través del tejido objetivo y pasar hacia la circulación sistémica es restringida. En una modalidad al menos 90%, de las partículas de la invención farmacéutica, tienen un diámetro que está entre 15 y 20 micrómetros .

En un aspecto de la invención, se proporciona una formulación farmacéutica para la administración parenteral, por ejemplo, intra-arterial , a un tejido cardiaco, la composición farmacéutica comprende partículas que contienen un ingrediente activo, seleccionado del grupo que consiste de HGF e IGF-1, y un excipiente biodegradable, en donde el 90% o más de las partículas tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros, y la formulación está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrómetros y menor de 5 micrómetros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido cardiaco, se restringe la habilidad del ingrediente activo a pasar a través del tejido cardiaco y pasar hacia la circulación sistémica.

Mientras que no se desea estar comprometido por alguna teoría, se piensa que las formulaciones de la presente descripción, cuando son administradas en la sangre arterial corriente arriba del tejido objetivo u órgano objetivo, son llevadas hacia el tejido objetivo u órgano objetivo por la circulación, y debido al tamaño de partícula y la residencia de distribución, en otras palabras son atrapadas o capturadas en los capilares en el tejido u órgano, que son de aproximadamente 5-10 ym de diámetro. Las partículas que se alojan en los capilares y que bloquean el flujo sanguíneo no son en general deseables, pero el número de capilares afectados por la formulación de la descripción es relativamente pequeño, particularmente ya que la ' formulación hace posible que sean empleadas dosis terapéuticas muy bajas. Además, el excipiente biodegradable se funde, se disuelve, se degrada o de alguna manera se disocia a si mismo, del ingrediente activo y de este modo al final es eliminado el "bloqueo" . De este modo, el movimiento de la partícula es restringida/retardado por el alojamiento en los capilares, un proceso reversible que regresa a los capilares nuevamente a la condición natural después de un periodo breve. El retardo del movimiento en la partícula por un periodo corto permite que el ingrediente activo sea mantenido en la cercanía del objetivo por una cantidad apropiada de tiempo para facilitar la acción o la absorción locales del ingrediente activo hacia el espacio extravascular del tejido.

La formulación está diseñada tal que la mayoría, sino es que todo el ingrediente activo es liberado de la partícula, mientras que está inmovilizado en el lecho vascular del tejido objetivo. Una vez que la carga activa es liberada, la partícula es diseñada para ser degradada y sus materiales constituyentes liberados hacia la circulación general para ser ya sea metaboli zados o eliminados a través del hígado y/o el riñon.

La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica para la administración parenteral hacia tejidos objetivos que comprende partículas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde 30% o más de las partículas tienen un diámetro de 25 micrómetros o menos, y la formulación es sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrómetros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido objetivo, el ingrediente activo es retenido en el tejido objetivo u órgano por un periodo terapéuticamente efectivo.

En particular, las formulaciones de la presente descripción permiten que sean empleadas cantidades menores del ingrediente activo debido a que la mayor parte del ingrediente activo es retenida en el tejido objetivo, en vez de ser recogida hacia la circulación sistémica. Esto parece incrementar la ventana terapéutica del ingrediente activo. Es decir, el intervalo de dosis sobre el cual el ingrediente es terapéuticamente activo, es incrementado permitiendo sean administradas cantidades absolutas más pequeñas. La administración local de una dosis menor significa que es probable que los efectos colaterales sean reducidos al mínimo .

La Dosis adecuada están, por ejemplo en el intervalo de 0.05 g/Kg hasta aproximadamente 1? µ?/?a, tal como 0.1 ug/Kg hasta aproximadamente 0.5pg/Kg, en particular 0.15, 0.2, 0.25, 0.35, 0.4 ó 0.45 g/Kg.

La administración de dosis más bajas localmente para el efecto terapéutico, particularmente importante para moléculas potentes, por ejemplo factores de crecimiento, que se sabe tienen potencial para estimular la oncogénesis. Estos efectos colaterales potencialmente peligrosos limitan la utilidad de tales moléculas aún cuando en la circunstancia correcta éstas producen efectos terapéuticamente benéficos.

Las formulaciones de la presente descripción no emplean microesferas que comprenden un poliestireno, sílice u otra esfera no biodegradable con el ingrediente activo acoplado a ésta, debido a que los materiales elásticos que perduran, por ejemplo, los materiales no biodegradables tales como el poliestireno y la sílice pueden provocar daño a los capilares locales, y pueden actuar como cuerpos extraños y producir reacciones inflamatorias locales. Además, tales esferas no biodegradables pueden tarde o temprano tener acceso a la circulación sistémica y pueden entonces, por ejemplo acumularse en tejidos distintos tales como los pulmones y el hígado, todos los cuales son indeseables.

En general, cada partícula comprenderá el ingrediente activo y el excipiente. No se pretende que la descripción de la formulación se refiere a partículas discretas del ingrediente activo y partículas separadas de polímero biodegradable en mezcla simple.

Sustancialmente libres de partículas superiores a 50 micrómetros, como se emplea más arriba, se pretende referirse a las formulaciones que cumplan los criterios para ser administradas como una formulación parenteral establecida en la farmacopea de los Estados Unidos y/o en la farmacopea Europea .

En una modalidad, sustancialmente libre puede incluir que contiene menos de 5% de las partículas, particularmente menos de 1%, por ejemplo menos de 0.5%, tal como menos de 0.1%.

En una modalidad, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% tales como al menos 99% de las partículas tienen un diámetro de 25 micrómetros o menos.

En una modalidad, el tamaño de partícula está en el intervalo 6 a 25 micrómetros, tal como 10 a 20 micrómetros, particularmente 15 ó 20 micrómetros, por ejemplo al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% tal como al menos 99% de las partículas son del tamaño relevante dentro de dicho intervalo. De este modo, en una modalidad de la invención al menos 95%, al menos 98% ó al menos 99% de las partículas de la composición farmacéutica tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros. En otra modalidad más, al menos 95%, al menos 98% ó al menos 99% de las partículas de la composición farmacéutica tienen un diámetro de entre 15 y 20 micrometros.

En una modalidad, la formulación no contiene partículas menores de 1 micrómetro de diámetro.

En una modalidad, la formulación no contiene partículas menores de 5 micrometros de diámetro.

En una modalidad, al menos 30% de las partículas con el ingrediente activo son retenidas en el tejido objetivo después de la administración, por ejemplo al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, tal como al menos 80% o más de las partículas activas son retenidas.

En una modalidad, la partícula activa es retenida en el tejido objetivo u órgano por un periodo en el intervalo 5 minutos a 24 horas, por ejemplo 30 minutos a 5 horas, tal como 1 , 2, 3 ó 4 horas.

El periodo en que la formulación es retenida en el tejido u órgano relevante, depende principalmente del excipiente o de la combinación de los excipientes empleados. De este modo, las propiedades requeridas del excipiente in vivo son que: • éste sea biocompatible (por ejemplo, en general no tóxico y adecuado para la administración a humanos y/o animales) , · dentro de un marco de tiempo apropiado después de la administración, esto contribuya a mantener la integridad de la partícula suficientemente para que el movimiento de la partícula sea retardado por, por ejemplo el alojamiento en un capilar o arteriola en el tejido objetivo u órgano, y · sea biodegradable (es decir, sea capaz de ser procesado o metabolizado) por el cuerpo para liberar el ingrediente activo y después de que el ingrediente activo ha sido liberado.

De este modo, un excipiente polimérico biodegradable, adecuado para el uso en la presente descripción es un polímero o copolímero que no tiene un tiempo de residencia prolongado in vivo, por ejemplo, no podría incluir entidades tales como poliestireno, polipropileno, polietileno de alta densidad y material con propiedades similares. Los polímeros biodegradables pueden ser no tóxicos y desintegrados en sub-unidades no tóxicas preferentemente localmente, tal que la cantidad de los fragmentos/desechos en circulación del excipiente se reducen al mínimo.

Los excipientes adecuados pueden ser encontrados en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) e incluyen polímeros inorgánicos así como orgánicos, naturales y otros polímeros. Los ejemplos pueden incluir polímeros tales como ácido poliláctico, poliglicólido, o una combinación de los mismos, específicamente ácido poliláctico co-glicólico, policaprolactona (que tiene una velocidad más lenta de biodegradación que el ácido poliláctico co-glicólico) , polihidroxibutirato o combinaciones de los mismos. Los poliuretanos , polisacáridos , proteínas y poliaminoácidos , carbohidratos, quitosano, heparina, ácido polihialurónico, etc., pueden ser adecuados, el excipientes está en general en la forma de una partícula, una esfera proximal (microesfera) a la cual puede ser enlazado el ingrediente activo o con el cual el ingrediente activo es asociado e incorporado.

Los liposomas no son excipientes poliméricos biodegradables dentro del significado de la presente descripción. Los liposomas son vesículas de una bicapa fosfolipídica que comprende en general colesterol. Para trastornos tales como infarto al miocardio inducido por los niveles de colesterol en la arterioesclerosis , son monitor izadas como uno de los factores de riesgo para el trastorno, y de este modo puede ser aconsejable evitar la administración de formulaciones que contengan colesterol a tales pacientes. Además, los pacientes con cirrosis hepática pueden tener dificultad incrementada para metabolizar los lípidos y las grasas de la dieta, y por lo tanto la administración de liposomas a tales pacientes puede no ser aconsejable.

En una modalidad, el excipiente biodegradable no es un hidrogel (una fase continua de una fase dispersa coloidal correspondiente) .

De este modo, la velocidad de "liberación" del ingrediente activo y la velocidad de "disolución" de la partícula puede ser alterada al alterar el excipiente y/o el método de enlazar el ingrediente activo al excipiente, de modo que por ejemplo empleando la policaprolactona se podría ¦ proporcionar una partícula a la . que le tome más tiempo disolverse o desintegrarse, o una partícula correspondiente empleando el ácido poliláctido co-glicólico . Si el ingrediente activo es incrustado dentro del excipiente éste será liberado más lentamente que si éste está sobre la superficie de la partícula. Si está sobre la superficie y enlazada por carga electrostática, éste será liberado más rápidamente que si se enlaza covalentemente .

En una modalidad, el excipiente comprende ácido poliláctico co-glicólico.

En una modalidad, sustancialmente todas las partículas, por ejemplo 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% de las partículas comprenden ácido poliláctico co-glicólico.

En una modalidad, el ácido poliláctico co-glicólico está en la proporción de 75:25 respectivamente.

En una modalidad, el excipiente comprende dos o más polímeros distintos, el término polímero incluye co- polímeros .

En una modalidad, el excipiente puede incluir un polímero de acrilato, por ejemplo un polímero de metacrilato.

En una modalidad, la partícula comprende alginato.

En una modalidad, el excipiente comprende una forma biodegradable de poliuretano.

En una modalidad, el excipiente está en la forma de una microesfera.

En una modalidad, la descripción emplea una formulación de microesferas de alcohol polivinilico.

En una modalidad, las microesferas no son albúmina. En una modalidad, el o los activos empleados son encapsulados dentro de un recubrimiento biodegradable, por ejemplo, seleccionado de la gama de Eudragit.

En una modalidad, una o más moléculas activas son incrustadas dentro de la partícula.

Para que los compuestos activos funcionen, como se describe en la presente descripción, éstos necesitan ser administrados hacia la circulación como una micropartícula que debido a su tamaño, morfología y composición, viajará con el flujo sanguíneo para llegar a su tejido objetivo. En el objetivo, la partícula debe liberar su carga de ingrediente activo de una manera controlable. Para lograr esta meta, una vez descargada, la partícula debe ser degradada y sus constituyentes metabolizados o bien distribuidos hacia la circulación para ser eliminados por los sistemas de excreción normales del cuerpo.

Para lograr estas metas, las micropartículas deben cumplir las siguientes características: Las micropartículas deben ser de tamaño y morfología uniformes con el fin de asegurar que éstas lleguen y se deben alojar al nivel designado del sistema circulatorio. La uniformidad del tamaño y la forma es mejor controlada cuando las partículas son esféricas.

La mayoría de los lechos capilares permite el paso libre de las partículas con un diámetro de <6 micrómetros de diámetro, las microesferas de esta descripción deben tener. un diámetro >6 micrómetros, y preferentemente de ~ 15 micrómetros. Las partículas en el intervalo de 20 micrómetros de diámetro o más grande se alojan dentro de las arteriolas pre-capilares o las arteriolas y bloquean el flujo sanguíneo hacia varias capilares de una sola vez. Por lo tanto, éstas pueden crear infartos microscópicos. De este modo, para la distribución de terapias regenerat ivas , el diámetro más pequeño de las microesferas están en el intervalo de 15 micrómetros. Además, no obstante, las partículas que tienen diámetros de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25 son contempladas para el uso de acuerdo con la presente invención .

El tiempo requerido para liberar el compuesto activo una vez que éste ha llegado a su objetivo, podría estar en el intervalo de minutos a días e incluso semanas, dependiendo del uso de microesfera y la meta terapéutica.

Las microesferas deben ser elaboradas con un compuesto biodegradable y no tóxico. La estabilidad de la partícula y su tiempo de degradación dependerá de la composición y del tipo de la microesfera. Ésta puede ser diseñada para distribuir su carga antes de que comience a degradarse. Alternativamente, ésta puede ser diseñada de modo que la distribución de su cargo ocurre conforme la partícula se desintegra.

La naturaleza del polímero utilizado como excipiente, su tamaño, la labilidad de los enlaces entre los monómeros y el grado de reticulación, si lo hay, afectará la velocidad de liberación del ingrediente activo así como la estabilidad y la capacidad de degradación de la partícula.

En todas las modalidades, las microesferas deben ser lo suficientemente estables en solución para que sustancialmente no se rompan o se degraden durante su administración hacia la circulación y el tiempo requerido para que ellas lleguen al lecho vascular objetivo.

En una modalidad adecuada de la descripción, cada partícula llevará un tipo simple de compuesto activo. Cuando se piensa que una mezcla de compuestos es benéfica para los propósitos terapéuticos, pueden ser administradas una mezcla de micropartículas , cada una cargada con un tipo simple de compuesto. Este diseño simplifica la producción de los compuestos terapéuticos, y ofrece mayor flexibilidad terapéutica, por lo cual se permiten que sean preparados medicamentos individualizados rápidamente para cumplir las necesidades especificas individuales del paciente.

En una modalidad, una o varias partículas empleadas tienen únicamente un tipo de molécula activa enlazada a ellas .

En una modalidad, una o varias partículas empleadas tiene una mezcla, tal como dos, tres o cuatro moléculas activas, enlazadas a éstas.

El compuesto activo puede ser cargado sobre la partícula al tiempo de su formación y, por ejemplo, ser dispersado a todo lo largo de la partícula.

El compuesto activo puede ser encapsulado dentro de la partícula donde el excipiente forma la envoltura de la microesfera .

En una modalidad, el o los ingredientes activos son enlazados a una o varias partículas por enlaces covalentes, por ejemplo un polipéptido o proteína que es enlazada a una microesfera a través de reticulación mediante tratamiento con un aldehido tal como formaldehído o glutaldehído, por ejemplo mediante emulsificación de la microesfera (o el ingrediente de las microesferas ) en presencia de o de los ingredientes activos, un aldehido adecuado y la homogeneización de la mezcla bajo condiciones adecuadas para la formación de partículas del tamaño requerido. Alternativamente, el ingrediente activo puede ser enlazado a un grupo carboxilato localizado sobre la microesfera del excipiente.

En una modalidad, el o los ingredientes activos son enlazados a una o varias partículas mediante fuerzas electrostáticas (carga) .

En una modalidad, el o los ingredientes activos son enlazados a una o varias partículas a través de un polielectrolito tal como, por ejemplo que comprende iones sodio, potasio, magnesio y/o calcio con iones contrarios de cloruro en solución acuosa.

En una modalidad, el o los ingredientes activos son enlazados a una o varias partículas entre las capas de polielectrolitos .

El compuesto activo puede ser cargado sobre la superficie de la partícula ya sea por carga (fuerzas electrostáticas) o covalentemente enlazadas. En una modalidad el o los ingredientes activos se enlazan a la partícula por carga electrostática.

En una modalidad, el o los ingredientes activos se enlazan a la partícula mediante polielectrolitos, por ejemplo por medio de una envoltura de polielectrolito que cubre la partícula dentro de la cual el ingrediente activo se acopla por carga.

El compuesto activo puede formar una capa simple sobre la superficie de la partícula o puede ser depositado en múltiples capas ya sea contiguas o separadas por las capas de polielectrolito .

El compuesto activo puede ser enlazado a la partícula por medio de "enlazadores" los cuales, por una parte, se enlazan a la matriz del excipiente y por otra parte al compuesto activo. Estos enlaces pueden ser ya sea electrostáticos o covalentes.

Las micropartículas pueden ser por ejemplo estabilizadas mediante liofilización. La micropartícula puede también ser estable cuando está congelada.

En una modalidad, el excipiente es degradado rápidamente en el intervalo de minutos a horas, o en un periodo prolongado tal como semanas a meses.

En una modalidad, la formulación es tal gue una vez en la circulación, uno o más ingredientes activos son rápidamente liberados por ejemplo en un periodo en el intervalo de 1 a 30 minutos hasta aproximadamente 1 a 12 horas.

En una modalidad, la descripción se refiere a una población mixta de partículas es decir, partículas con diferentes velocidades de "disolución", gue pueden ser utilizadas para proporcionar una formulación con liberación controlada o pulsada.

De este modo, las formulaciones de la descripción pueden comprender partículas con diferentes cinéticas de liberación y velocidades de degradación.

En una modalidad, el ingrediente activo es liberado en un periodo de 1 a 24 horas.

En una modalidad, el ingrediente activo es liberado en un periodo de 1 día a 7 días.

De este modo, en una o más modalidades, todas las formulaciones de la descripción son metabolizadas dentro de 7 días de la administración.

En una modalidad, una vez en la circulación del individuo, el o los ingredientes activos son liberados muy lentamente en periodo de semanas a meses, por ejemplo, 1 semana a 1, 2, ó 3 meses.

En una modalidad, la población de partículas está bien caracterizada y por ejemplo tiene las mismas características. Es decir, las propiedades físicas y/o químicas de cada partícula caen dentro de un intervalo definido estrecho.

En una modalidad, el tamaño de las microesferas es monodispersa .

De este modo, en una modalidad la partículas de la formulación tienen un tamaño medio de partícula con una desviación estándar que tiene, por ejemplo al menos 68% de las partículas que tienen un tamaño +/- 1 micrómetro de la media, tal como 99% de las partículas que tienen un tamaño. de partícula +/- 1 micrómetro de la media (por ejemplo, 15 +/- 1 micrómetro) . Además, las composiciones en donde las partículas tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, ó al menos 98% de partículas dentro de +/- 1 micrómetro de la media, son contempladas por la presente invención .

En una modalidad, la formulación comprende una población de partículas caracterizadas en que las. poblaciones contienen al menos dos tipos distintos de partículas, por ejemplo las partículas distintas pueden tener diferentes ingredientes activos, recubrimientos, tamaño de partícula o una combinación de los mismos.

En una modalidad, la descripción se refiere a una población mixta de partículas que comprenden partículas del ingrediente activo en mezcla con partículas de uno o más ingredientes activos distintos adicionales.

Parece que el tamaño de partícula y la distribución de la formulación, influye el perfil in vivo de la formulación, incluyendo cómo es distribuida la formulación en el tejido. Parece que es suficiente con tener simplemente un tamaño medio de partícula dentro del intervalo de 10 a 20 micrómetros, debido a que éste permite que algunas partículas tengan un tamaño de partícula mucho más grande y también un tamaño de partícula mucho más pequeño. Esta variación puede provocar problemas in vivo debido a que, por ejemplo las partículas pequeñas no son retenidas con el tejido relevante y las partículas más grandes pueden dañar el tejido.

La cantidad de ingrediente activo : excipiente empleada puede estar en el intervalo de 1%:99% p/p, 5%: 95% p/p, 10%:90% p/p, 20%:80% p/p, 30%:70% p/p, 40%:60 p/p, 50%:50% p/p, 60%:40% p/p, 70%:30% p/p, 80%:20% p/p ó 90%:10% p/p, dependiendo de que perfil de liberación se requiere. Si se requiere que el ingrediente activo se libere rápidamente o inmediatamente in vivo, puede ser elegida una más alta proporción del ingrediente activo al excipiente.

En una modalidad, la microesfera empleada tiene una vida media de aproximadamente 16 horas.

En una modalidad, la formulación es liofilizada.

En otra modalidad más, la formulación es congelada. Las partículas de la descripción no son magnéticas a un grado apreciable. El ingrediente activo puede ser cualquier medicamento o producto farmacéutico que puede ser administrado en la forma de una partícula de acuerdo a la descripción .

En una modalidad, son administradas 15 x 106 partículas (microesferas ) , tal como 14 x 106, 13 x 106, 12 x 106, 11 x 106, 10 x 106, 9 x 106, 8 x 106, 7 x 106, 6 x 106, 5 x 106, 4 x 106, 3 x 106, 2 x 106 ó 1 x 106 partículas son administradas .

Una partícula como es empleada en la presente, puede comprender, por ejemplo el fármaco micronizado, entidades semi-sólidas o hidratadas tales como proteínas o ingredientes activos biológicamente derivados formulados como partículas discretas, con la condición de que la partícula conserve su estructura por un periodo suficiente para realizar la función requerida. La descripción también se extiende a las partículas con un núcleo líquido, con la condición de que la integridad externa de la partícula sea tal que ésta pueda realizar su función in vivo. La descripción no se extiende a las partículas con un núcleo gaseoso .

Las microesferas pueden ser fabricadas mediante la emulsificación de una solución polimérica, seguido por evaporación del solvente. En otros casos, los monómeros son emulsificados seguido por la polimerización térmica o por UV. Alternativamente, un fundido polimérico es emulsificado y sucesivamente enfriado para solidificar las gotitas. Una reducción de tamaño de la emulsión puede ser obtenida mediante la homogeneización o sonicación del granel. Las microesferas pueden ser recolectadas mediante filtración y/o centrifugación de la mezcla de reacción.

Las microesferas y microcápsulas biodegradables de los biopolímeros para la liberación controlada y la distribución dirigida de los compuestos farmacéuticos diferentes y las macromoléculas terapéuticas, han sido conocidas por mucho tiempo en un número de formas, particularmente aquellas de diámetros relativamente grandes, como se describe en la presente descripción (ver D. D. Lewis "Biodegradable polymers and drug delivery systems" M. Chasin y R. Langer, editores (Marcel Dekker, New York, 1990); J.P. McGee et al, J. Control. Reléase 34:77, 1995) .

Las microesferas y microcápulas son rutinariamente producidas mediante métodos mecánicos-físicos tales como la aspersión de los monómeros constituyentes en microgotitas del tamaño seguido por un paso de secado o polimerización. Tales micropartículas pueden ser también formadas a través de emulsificación seguida por eliminación del solvente emulsificante (B. Miksa et al., Colloid Polym. Sci. 273: 47, 1995; G. Crotts et al., J. Control. Reléase 35:91, 1995). El reto principal de estos métodos es la producción de una población monodispersa de partículas en forma y tamaño. De este modo, por ejemplo esto puede ser logrado empleando una técnica de enfoque de flujo en el cual es utilizado un nebulizador capilar para formar microgotitas del tamaño adecuado. En el proceso, los componentes son sumergidos en una solución/solvente de cosecha que sirve para disolver/suspender los componentes de la micropartícula, seguido por la evaporación del solvente para proporcionar micropart ículas solidificadas.

Este proceso puede requerir que todos los componentes de la micropartícula sean combinados en una mezcla simple (el compuesto enfocado) a partir del cual son generadas las microgotitas que formarán las microparticulas . Ya que muchos de los polímeros utilizados para la distribución de los fármacos son hidrofóbicos, mientras que la mayoría de las macromoléculas terapéuticas, y particularmente las proteínas, son hidrofílicas , la mezcla requiere la emulsificación para asegurar que se obtenga una composición homogénea antes de que se formen las microparticulas .

Alternativamente, las partículas pueden ser preparadas, por ejemplo mediante aspiración de una solución de ingrediente activo en microesferas en una corriente de convección, desde una boquilla con una carga eléctrica neta hacia una placa o entidad con una carga contraria, en un arreglo tipo ánodo/cátodo.

En una modalidad, las partículas empleadas tienen una carga eléctrica neta, por ejemplo una carga positiva o carga negativa. Esto puede, por ejemplo ayudar al movimiento de las partículas que son retardadas en el tejido u órgano objetivo. Esta carga neta puede ser balanceada en la formulación para la administración por esferas de iones contrarios (por ejemplo, sin el ingrediente activo) de una dimensión pequeña, por ejemplo de menos de 5 micrómetros , que no son retenidas dentro del tejido objetivo después de la administración .

En una modalidad, el ingrediente activo es una molécula biológica o derivada de ésta, por ejemplo una proteina tal como un anticuerpo o un factor de crecimiento, una citosina o combinación de entidades.

En particular, las formulaciones de la descripción son particularmente útiles para dirigirse a/activar células madre residentes encontradas en el tejido relevante.

En una modalidad preferida, la descripción es utilizada para activar las células madre residentes, progenitores y/o precursores de un tejido particular u órgano particular, para estimular la regeneración del tejido u órgano.

En una modalidad, la descripción se refiere a la administración localizada de los ligandos para los receptores expresados por las células madre presentes en el tejido postnatal, para el inicio de la regeneración del mismo. El ligando puede ser, por ejemplo una hormona de crecimiento como se describe en la presente.

En una modalidad, los ligandos son administrados para activar los receptores presentes sobre la mayoría de las células madre no diferenciadas presentes en cada tejido objetivo. Estas células expresan los denominados "genes multipotenciales " , tales como Oct 4, Sox2, Nanog, etc., y éstos tienen una capacidad regenerativa potente (de aquí en adelante conocidas como células madre que expresan 0ct4) .

En una modalidad, el ligando es administrado al corazón para reducir al mínimo y/o regenerar el daño tisular provocado, por ejemplo, por infarto al miocardio.

Cuando una arteria es obstruida, el efecto principal es una pérdida del tejido corriente abajo de la obstrucción. La consecuencia específica de la obstrucción de una arteria coronaria es un infarto del miocardio (MI) el cual da como resultado la pérdida irreversible de una porción del músculo cardiaco. Esta pérdida da como resultado una disminución de la capacidad de contracción del miocardio y la capacidad de bombeo del corazón la cual, cuando es suficientemente significativa, limita su capacidad para proporcionar el rendimiento cardiaco apropiado, y produce una limitación seria y progresiva de la capacidad de la persona (revisado en Nadal-Ginard et al., Circ. Res. 2003; 92:139) .

En los Estados Unidos y en Europa únicamente más de 1.5 millones de infartos al miocardio son tratados cada año y existen más de 11 millones de sobrevivientes de MI (American Heart Association, 2007; British Heart Association, 2007) . De éstos, más del 30% mueren durante el primer año postinfarto. La supervivencia post-MI depende en gran medida del tamaño del infarto (% de masa muscular perdida) debido al evento isquémico. Cuando la pérdida afecta ~ 40-45% de la masa ventricular izquierda, ésta produce un choque cardiogénico irreversible que es uniformemente letal (Page et al., 1971. N. Engl . J. Med. 285; 133) . Esta pérdida miocardiaca segmentaria produce una reorganización del miocardio remanente con muerte celular incrementada mediante apoptosis, hipertrofia de los miocitos supervivientes, fibrosis incrementadas del tejido y dilatación de la cámara ventricular (Pfeffer, M.A. y Braunwald, E., 1990. Circulation 81:1161) . Esta reorganización, conocida como "remodelación", debido a sus efectos negativos sobre la contractilidad, frecuentemente evoluciona a insuficiencia cardiaca (CF, por sus siglas en inglés) . Después del primer episodio de CF post-MI la supervivencia promedio es de <5 años con una mortalidad anual de -18% (American Heart Association, 2000) .

La mayoría o todas las terapias para tratar la pérdida del tejido parenquimal debido a isquemia o a otras causas, están dirigidas a preservar o a mejorar la función del tejido sobreviviente. En el caso de un MI, todas las terapias actualmente en uso para tratar las consecuencias de la pérdida del músculo contráctil cardiaco, están dirigidas a preservar o aumentar la función contráctil del tejido sobreviviente y a reducir la pérdida continua de estas células musculares por apoptosis o necrosis (ver Anversa y Nadal-Ginard, 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard et al. 2003.

Circ. Res. 92:139) . A la fecha, no existe una terapia aprobada simple diseñada para regenerar o para reemplazar los miocitos perdidos en el MI y, de esta manera, para restaurar la función contráctil del corazón. Además, todos los procedimientos experimentales descritos hasta ahora, están dirigidos a mejorar el flujo sanguíneo al área isquémica/necrótica por estimulación del incremento en la red capilar, más frecuentemente al distribuir directa o indirectamente al área afectada los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ya sea en forma de proteína o en la forma de cADN . Tampoco una terapia simple es dirigida a las células madre residentes en el tejido para estimularlas a multiplicarse y diferenciarse, con el fin de regenerar conjuntamente el parenquima y la microcirculación perdida por el accidente vascular .

La meta de los procedimientos terapéuticos al MI agudo es restaurar el flujo sanguíneo del músculo dañado, tan pronto como sea posible para prevenir la pérdida muscular adicional. Estas terapias de reperfusión incluyen el uso de agentes trombolíticos , angioplastia del globo o cirugía de derivación. En los Estados Unidos en 1998, >500,000 angioplastias y un número similar de derivaciones quirúrgicas fueron realizadas. Estas terapias a menudo son exitosas para restaurar el flujo sanguíneo hacia el músculo isquémico, pero ninguna de ellas son capaces de reemplazar una célula muscular simple ya perdida al tiempo de la intervención. Si esta pérdida ha sido sustancial, la consecuencia a largo plazo es una incapacidad para regenerar el rendimiento cardiaco requerido el cual inexorablemente evolucionará a insuficiencia cardiaca terminal.

Hasta ahora, la única opción para atacar efectivamente la insuficiencia cardiaca terminal ha sido el trasplante cardiaco con todos los problemas médicos (terapia inmunosupresora) , logisticos y económicos que éste involucra. Incluso si esos problemas pudieran ser evitados, la escasez de donadores hace a esta terapia disponible a >1% de los pacientes con insuficiencia cardiaca.

Las formulaciones de la presente descripción permiten la administración de las moléculas terapéuticamente activas para ser administradas en una forma donde el tejido u órgano tal como el corazón puede ser tomado como objetivo específicamente para regenerar el tejido, por ejemplo dañado por obstrucción de una arteria, al estimular las células madre ya presentes en el tejido, para regenerarse.

Terapia con células madre para regeneración de tejidos. - Recientemente, han sido desarrollados algunos procedimientos experimentales como alternativas al trasplante de órganos que están dirigidos a reemplazar algunas de las células perdidas por el órgano o el tejido de interés. Estos procedimientos han sido modelados en el éxito de los trasplantes de médula ósea llevados a cabo por más de medio siglo. La capacidad de una población pequeña de células en la médula ósea para generar todos los tipos de células sanguíneas, cuando son trasplantadas en un individuo inmunológicamente competente, probaron convincentemente que los tejidos de adulto contenían "células madre" capaces de generar y regenerar un tejido o un órgano completo. Este descubrimiento conceptual ha conducido a los desarrollos de procedimientos experimentales para reparar tejidos dañados utilizando diferentes tipos de células madre aisladas del individuo que va a ser tratado (terapia con células autólogas) o aisladas de un individuo diferente de aquel que las va a recibir (terapia de células heterológas ) . Estas células son ya sea aisladas en masa o primeramente expandidas en cultivo antes de ser trasplantadas para producir la reparación deseada del tejido afectado. Estos procedimientos de terapia celular toman ventaja de las propiedades regenerativas naturales de las células madre para la regeneración de tejidos.

El término "células madre" es utilizado en la presente para identificar una célula que tiene las propiedades de auto-renovación (generar más células como si misma) , es clonogénica (puede ser expandida comenzando a partir de una célula simple) y es pluripotencial; es decir puede producir una progenie que se diferenciará en diferentes tipos celulares, a menudo presentes en el tejido donde éstas residen. Es decir, las células originadas de una célula madre adquirirán especializaciones celulares particulares, características del tejido u órgano del cual se originó la célula madre o dentro del cual ésta es trasplantada (Stem Cells: A Primer. 2000. National Institutes of Health USA).

El término "pluripotencial" se refiere a las células que son capaces de diferenciarse en un número de diferentes tipos celulares. En el contexto de esta solicitud, el término "tretrapotencial" se refiere a una célula que aunque puede no ser totipotencial (capaz de generar un individuo completo) , es capaz de generar cuatro tipos diferentes de células; por ejemplo, cardiomiocitos, células endoteliales vasculares y células del músculo liso, y fibroblastos de tejido conectivo.

El término "célula progenitora" se refiere a un descendiente de una célula madre que ya se ha comprometido a una vía de diferenciación particular y, por lo tanto, tiene un potencial de diferenciación más restringido en la célula madre. La célula progenitora tiene una gran capacidad de amplificación y, aunque ésta todavía no expresa marcadores de diferenciación, tiene la capacidad para crear una progenie que está más diferenciada que ella misma. Por ejemplo, el término puede referirse a una célula no diferenciada o a una célula que se ha diferenciado a un grado cerca de su diferenciación final. Esta célula es capaz de realizar la proliferación y dar origen a más células progenitoras , teniendo por lo tanto la habilidad para generar un número grande de células madre que pueden a su vez dar origen a células hijas diferenciadas o diferenciables . En particular, el término célula progenitora se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en direcciones diferentes, por ejemplo, al adquirir caracteres completamente individuales, como ocurre en la diversificación progresiva de las células embrionarias y tejidos embrionarios. Una célula progenitora está más diferenciada que una célula madre verdadera debido a que ésta ha restringido ya en cierta medida la multipotencia de la célula madre la cual se origina.

Como se utiliza en la presente, a no ser que el contexto lo indique de otro modo, la células madre se refiere a las células madres, células progenitoras y/o células precursoras .

La diferenciación celular es un proceso complejo que ocurre típicamente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivarse de una célula multipotencial que por si misma es derivada de una célula multipotencial, y así sucesivamente. Mientras que cada una de estas células multipotenciales puede ser considerada células madre, la gama de tipos celulares a la que cada una da origen puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas tienen también la capacidad para dar origen a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede ser inducida artificialmente después del tratamiento con diversos factores como han sido recientemente demostrados con las iESCs (células madre embrionarias inducidas) (Takahashi et al., 2007. Cell 131:1-12) .

Una "célula precursora" es un descendiente de la célula progenitora que ha ido adicionalmente hacia la vía de diferenciación y se ha llegado a comprometer para diferenciarse en un tipo celular simple aún cuando pueda no expresar todavía ninguno de los marcadores identificables para este tipo celular. La célula precursora es usualmente una que sufre la última ronda de amplificación antes de la aparición del fenotipo diferenciado identificable .

Las células madres están presentes en la masa interna de células del blastocito, los rebordes genitales del embrión temprano, la placenta y en la mayoría de los tejidos de los animales adultos, incluyendo el humano. En contraste a la célula madre derivada de la masa interna celular del blastocito, en general, las células madre aisladas de tejidos de adulto son una mezcla de células madre verdaderas, progenitoras y precursoras, junto con células en la etapa más temprana de diferenciación final. Las células madre adultas han sido identificadas prácticamente en todos los tejidos originados de cada una de las tres capas de células embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo) , que van desde la médula ósea, el sistema nervioso central y periférico, todos los tejidos conectivos, la piel, los intestinos, el hígado, el corazón, el oído interno, etc.

Parece que estas células madre adultas tienen capacidad regenerat iva . Sorprendentemente, a pesar de la alta prevalencia, la severidad y los altos costos económicos de la cardiopatía isquémica en todos los países desarrollados, hasta fechas recientes no había existido investigación para procedimientos dirigidos a la regeneración del miocardio de adultos. Una de las razones para esta anomalía ha sido que hasta fechas muy recientes el corazón era considerado un órgano terminalmente diferenciado sin ninguna capacidad regenerativa intrínseca de sus células contráctiles (MacLellan, W. R. y Schneider, M.D. 2000. Annu Rev. Physiol. 62:289; Reinlib. L. y Field, L. 2000. Circulation 101: 182; Pasumarthi, K.R.S. and Field, LJ. 2002. Circ. Res. 90:1044; MacLellan, W.R. 2001. J. Mol. Cell Cardiol. 34:87; Perin, E.C. et al 2003. Ciculation 107:935; see Anversa, P. y Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard, B. et al 2003 Circ. Res. 92:139) . Este concepto está basado en el hecho experimentalmente bien documentado de que en el corazón adulto la gran mayoría de los cardiomiocitos son terminalmente diferenciados y su capacidad para re-entrar al ciclo celular ha sido irreversiblemente bloqueada. De este modo, no existe duda de que estos miocitos no son capaces de reproducirse para generar nuevos miocitos.

Una consecuencia del concepto prevalente del miocardio como un tejido sin potencial regenerativo ha sido que todas las denominadas "terapias regenerativas " experimentales implementadas hasta ahora, han estado basadas en la introducción, dentro de corazón dañado de diferentes tipos celulares que son ya sea miocitos fetales o se cree que tienen cierto potencial para diferenciarse en este tipo celular o en capilares y microarteriolas con el fin de sustituir las células perdidas durante el infarto. De esta manera, los experimentos con animales han sido realizados trasplantando células precursoras, de músculo esquelético, fetales y de adulto, miocitos cardiacos fetales, y células madre embrionarias, ya sea en su estado no diferenciado o después de su compromiso hacia la vía de los cardiomiocitos (Kocher et al., 2001. Nature Med. 7: 430) .

Con la excepción del precursor de músculo esquelético (los cuales son incapaces de convertirse en cardiocitos y son incapaces de llegar a acoplarse eléctricamente a las células miocardiaca) (Menasche et al., 2001. Lancet 357: 279; C Guo et al. 2007. J Thoracic y Cardiovasc Surgery 134:1332) que pueden ser autólogos, otros tipos celulares listados son por necesidad de origen heterólogo, y por lo tanto, tienen que ser acompañados ya sea por terapia inmunosupresora, o el trasplante es rápidamente eliminado por el sistema inmune. El hecho es que ningunos otros procedimientos han probado ser efectivos en ensayo preclinicos y todos tienen muchas pequeñas fallas. Una de las características más intrigantes de algunas de las células madre adultas es su "plasticidad". Esta propiedad se refiere al hecho de que cuando ciertas células madre son colocadas dentro de un tejido diferente de aquel del que originaron, éstas pueden adaptarse a este nuevo ambiente y diferenciarse en los tipos celulares característicos del tejido hospedero, en vez del tejido donador. Aunque el grado de naturaleza de esta plasticidad para muchos tipos celulares todavía sigue siendo controversial ( agers y eissman, 2004. Cell 116:636-648; Balsam et al., 2004 Nature 428, 668-673; Murray et al, 2004. Nature 428, 664-668; Chien, 2004. Nature 428, 607-608), éste ha generado incontables protocolos preclinicos y pruebas clínicas .

Entre las células madre adultas descritas hasta ahora, aquellas de la médula ósea han sido las más estudiadas, y aquellas que han mostrado un mayor grado de "plasticidad" (Kocher et al., 2001. Nature Med. 7: 430) .

También han sido ampliamente utilizadas las denominadas "células madre mesenquimales " derivadas del tejido adiposo (Rangappa, S. et al 2003. Ann. Thorac Surg 75:775) .

La capacidad de la médula ósea y las células madre derivadas del tejido adiposo para repoblar las áreas dañadas de tejidos y órganos diferentes, la facilidad relativa de tratamiento, junto con el trabajo previo de Asahara et al (1999; Circ. Res.85: 221-228), ha probado que es ventajoso para los objetivos de la terapia celular para regenerar el músculo cardiaco en animales experimentales (Orlic et al, 2001. Nature 410:701; Orlic et al, 2001. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98: 10344; Nadal-Ginard et al, 2003. Circ. Res. 92:139;) y en el humano (Tse et al., 2003. Lancet 361:47; Perin et al.', 2003. Circulation 107:2294) . Aunque ha sido cuestionado por algunos, (Balsam,. L.B. et al. 2004. Nature 428: 668; Murry, CE. et al. 2004. Nature 428: 664), es claro que las células madre derivadas de médula ósea, bajo ciertas condiciones, son capaces de generar cardiomiocitos , capilares y microarteriolas , particularmente cuando son trasplantadas en el área limite de un infarto al miocardio experimental. (Quaini, F. , et al., 2002. New Engl . J. Med. 346:5; Bayes-Geis, A. et al., 2003. Cardiovasc. Res.56: 404; Bayes-Genis, A. et al., 2004. Eur . J. Heart Fail. 6:399; Thiele, H. et al., 2004. Transplantation 77:1902) . No está disponible ninguna información similar a partir de las numerosas pruebas clínicas de la terapia celular ya sea con médula ósea - o células madre derivadas de tejido adiposo debido a que no está disponible ningún dato histopatológico confiable para la evaluación.

Un inconveniente mayor de las técnicas utilizadas para la terapia de las células miocardiacas es la complejidad y la ineficiencia del procedimiento de trasplante celular mismo. Cuando las células son trasplantadas a través del árbol arterial coronario, únicamente 3-5% permanece en el miocardio, mientras que el resto es dispersado a todo lo largo del cuerpo. Si las células son inyectadas directamente dentro del miocardio, esto requiere ya sea una toracotomía o el uso de instrumentación completa y que consume tiempo (sistemas tipo Noga) con el fin de identificar el área objetivo. Esta técnica requiere operadores especializados y está únicamente disponible en centros médicos especializados. Además, las inyecciones intramiocardiacas , ya sea por la ruta transendocardial (Noga) o t ransepicardiaca (quirúrgica) distribuye todavía <50% de las células al tejido.

Sin excepción, todos los procedimientos de terapia celular utilizados hasta la fecha actual para producir regeneración miocardiaca después del infarto al miocardio, ya sea en animales experimentales o en humanos, han sido desarrollados ignorando completamente el hecho de que el miocardio tuvo una capacidad regenerativa intrínseca representada por sus células madre residentes (Nadal-Ginard, B.; at al., 2003. J. Clin. Invest. 111:1457; Beltrami et al, 2003. Cell 114:763-776; Torella, D., et al, 2004. Circ. Res. 94:514; Méndez- Ferrer , S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1:S83; Torella et al, 2007. Cell. Mol. Life Sci. 64:661) .

Como se indicó anteriormente, solo hasta fechas recientes, el paradigma aceptado consideraba al corazón de mamífero de adulto como un órgano post-mitót ico sin capacidad regenerativa . Aunque en los pocos años pasados este concepto ha comenzando a evolucionar, todos los procedimientos experimentales y clínicos para la regeneración miocardiaca han continuado estando basados en el viejo dogma. Por esta razón, todos los protocolos de regeneración cardiaca han estado basados en el trasplante de células con el fin de proporcionar la miocardia a las células con potencial regenerat ivo .

Parece ahora que cuando las formulaciones de la presente descripción son administradas bajo condiciones apropiadas, que la capacidad regenerativa intrínseca de las "células madre" residentes en el tejido u órgano (tal como el corazón) puede ser estimulada" o activada para regenerar el tejido u órgano.

De este modo, en un aspecto la descripción proporciona un método para la regeneración de tejidos sólidos en mamíferos vivos, incluyendo humanos, que incluye la localización local de ligandos para los receptores expresados por las células madres presenten en el tejido post-natal que va a ser regenerado. Estas son células que cuando son estimuladas fisiológicamente o farmacológicamente, se multiplican in situ y se diferencian hacia células parenquimales características del tejido o el órgano que las alberga .

Ha sido detectada ahora la formación de cardiomiocitos en corazón normal y en condiciones patológicas tales como MI e insuficiencia cardiaca (Beltrami, A. P. et al., 2001. New Engl. J. Med. 344:1750; Urbanek, K. et al, 2003. Proc. Netl. Acad. Sci . USA. 100: 10440; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. J. Clin. Invest. 111:1457; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139) . De manera interesante, estos nuevos miocitos son significativamente más abundantes en la zona límite de Mis donde éstos son un orden de magnitud más abundantes que en el miocardio de individuos saludables de igual edad. Estas observaciones sugirieron que el miocardio de humano adulto tiene la capacidad para responder a incrementos agudos y crónicos en la muerte celular con un proceso regenerativo abortivo que intenta reemplazar los miocitos muertos (Anversa, P. y Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415: 240; Anvrsa, P. y Nadal-Ginard, B. 2002. New Engl. J. Med. 346:1410; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92: 139) .

Las células madre cardiacas adultas (CSCs, por sus siglas en inglés) fueron primeramente descritas en 2003 (Beltrami et al. 2003. Cell 114:763-776) y confirmadas por varios autores en las mismas o en otras especies (ver Torella, D., et al., 2004. Circ. Res. 94:514; Mendez-Ferrer, S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1:S83; Torella et al., 2007. Cell. Mol. Life Sci . 64:661). Estas CSCs son de auto-renovación, clonogénicas y multipotenciales , debido a que éstas dan origen a cardiomiocitos, células vasculares endoteliales y del músculo liso, asi como a fibroblastos de tejido conectivo. Éstas fueron identificadas por la expresión de marcadores membranales asociadas con las células madre tales como c-kit, el receptor para SCF, Sea I, MDR-1 e Isl-I. Es claro ahora que los nuevos miocitos formados en el corazón de adulto son derivados de las CSCs residentes en el miocardio. Estas CSCs, cuando son inyectadas en el limite de un infarto, tiene la capacidad para regenerar las células contráctiles y la microvasculatura perdida como consecuencia del MI masivo (Beltrami, et al, 2003. Cell: 114:763-776; Laugwitz, et al. 2005; Méndez- Ferrer et al., Torella et al., 2006; Torella et al. , 2007) .

En el corazón de un individuo saludable, casi todas las CSCs están en un estado en reposo (G0) o en ciclos muy lentos durante el lapso de vida del organismo. ? cualquier tiempo dado, únicamente una fracción muy pequeña de estas células está activa, sufriendo replicación y diferenciación solo lo suficiente para reemplazar las células que mueren por desgaste y rompimiento. En contraste, una fracción grande de las CSCs - algunas veces la mayoría — es activada en respuesta a un estrés fisiológico o patológico. En general, existe una correlación directa entre la magnitud del estrés y el número de CSCs que se llegan a activar en respuesta. Este número de CSCs activadas están a su vez también directamente correlacionado con el número de nuevas células miocardiacas generadas. Esta respuesta, la cual ocurre del ratón al humano (Nadal-Ginard> B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139), revela la existencia de una vía bioquímica disparada por el estrés que da como resultado la activación de las CSCs.

La comunicación entre las células madre residentes y su ambiente, al menos en el miocardio, es regulada por un bucle de retroalimentación entre los cardiomiocitos, que detectan los cambios en el estrés de la pared, producido por demandas fisiológicas o patológicas incrementadas en el rendimiento cardiaco, y las células madre responsables de producir un incremento en la masa muscular a través de la generación de nuevas células contráctiles y la microcirculación para nutrirlas. Los miocitos tienen una respuesta estereotípica al estrés, independientemente de si éste es fisiológico o patológico (Ellison et al., 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397-11409) . Esta respuesta consiste en activar rápidamente la expresión y la secreción de una gran batería de factores de crecimiento y citocinas tales como HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) , IGF-1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina), PDGF-ß (factor ß de crecimiento derivado de plaquetas) , una familia de FGFs (factor de crecimiento de fibroblastos) , SDF-1 (factor 1 derivado de células estromales) , VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , eritropoyetina (EPO) , factor de crecimiento epidérmico (EGF), activina A y TGF ß (factor ß de crecimiento transformante) , WINT3A y neurogeulina entre otros. Esta respuesta secretora, además de estimular la hipertrofia de los miocitos mismos a través de un bucle auto/parácrino, también dispara la activación de CSCs en su cercanía, debido a que estas células expresan receptores para estos factores secretados por miocitos, y responden a ello. Esta respuesta activa las vías genéticas corriente abajo del receptor, que son responsables de la supervivencia celular, la multiplicación y la diferenciación de las mismas. Además, la activación de estos receptores también activan un bucle de retroalimentación en las CSCs mismas que estimulan la producción del ligando respectivo por las CSCs, uniendo de este modo en su lugar una respuesta auto-suspendida a la cual, en respuesta a un estimulo simple, puede permanecer activa por varias semanas, o hasta que la masa incrementada producida haya restaurado el estrés de la pared miocardiaca a niveles normales. Por lo tanto, la CSCs responde a un estimulo parácrino con una respuesta auto/parácrina que permite el mantenimiento de una respuesta sostenida a una estimulación de corta vida. De este modo, la homeostasis celular cardiaca normal es mantenida a través de una retroalimentación continua entre los miocitos y las CSCs para producir y mantener la masa muscular contráctil apropiada, requerida para generar el rendimiento cardiaco sanguíneo necesario. Los miocitos, los cuales son incapaces de dividirse dependen de las CSCs para mantener o incrementar su número celular y la densidad capilar para garantizar su suministro de oxígeno y de nutrientes. Las CSCs, por otra parte, dependen y responden a las señales bioquímicas producidas por miocitos circunvecinos para regular su estado de reposo versus activado.

Además de las células madre específicas del tejido descritas anteriormente, se ha encontrado recientemente que el miocardio de mamíferos, incluyendo el humano, así como la mayoría de otros tejidos, contienen una pequeña población de células muy desdiferenciadas que tienen muchas similitudes con las células madre embrionarias (ESCs) que han sido conocidas por un largo tiempo como multipontenciales ; es decir, una célula simple es capaz, cuando es colocada en el ambiente adecuado de generar un organismo completo idéntico a aquel del cual se originó. La característica principal de estas células es su expresión de una batería de los denominados "genes de multipotencia" tales como 0ct4, Sox2, Nanog, etc (ver la solicitud provisional de los Estados Unidos número de serie 61/127,067) que confiere multipotencia a esas células, de modo que, independientemente de su tejido de origen éstas parecen ser capaces de dar origen a la mayoría, si no es que a todos los tipos celulares del cuerpo. En particular, las células que expresan Oct4 aisladas del corazón de adulto son capaces de dar origen a músculo esquelético, neuronas, corazón, hígado, etc. Su capacidad regenerativa parece más robusta y más amplia que aquella de las células madre específicas de tejido.

Se cree que las células que expresan Oct4 son de origen de la mayoría, sino es que de todas, las células madre específicas de tejido de cada órgano y que su estimulación es la fuente principal de la capacidad regenerativa de cada tejido individual. Por lo tanto, la estimulación de estas células es un objetivo primario para los procedimientos terapéuticos descritos en la presente.

Independientemente de su habilidad y/o eficiencia para generar células miocardiacas , cuando un gran número de células madre son introducidas dentro de un tejido, no obstante de su tejido de origen, éstas tienen un efecto parácrino importante cuando son transplantadas dentro del miocardio y otros tejidos, como ha sido probado experimentalmente . La mezcla compleja de factores de crecimiento y citocinas producidas por las células trasplantadas tienen un potente efecto ant i-apoptót ico sobre los cardiomiocitos y otras células en el área en riesgo, y también en la activación de las células madre endógenas que se multiplican y se diferencian en células musculares y microvasculatura . Este efecto parácrino comienza muy pronto después del trasplante de células y puede ser documentado in vitro .

A partir del trabajo realizado en los ejemplos de la presente, parece que estimular las células madre residentes de un tejido (incluyendo las células que expresan Oct4), en este caso el miocardio, los factores de crecimiento y las citocinas producidas por los miocitos sometidos a estrés y a los cuales las CSCs responden, podría ser tanto o más efectivo que el trasplante de células para disparar una respuesta regenerativa . Una combinación del factor 1 de crecimiento similar a insulina y el factor de crecimiento de hepatocitos puede ser particularmente efectiva.

En una modalidad, las células madre residentes son activadas, por ejemplo para estimular la regeneración del tejido, para incrementar la densidad muscular y/o la función celular de las células objetivo.

Si las células objetivo son del músculo cardiaco entonces la función incrementada podría ser mayor y/o incrementar la función contráctil.

Si las células objetivo son células renales, en un paciente con insuficiencia renal, entonces la función incrementada puede ser la capacidad incrementada para generar EPO.

Si las células objetivo son células pancreáticas entonces la función incrementada puede ser la capacidad incrementada para generar insulina.

Parece que las formulaciones de la descripción son capaces de estimular/activar las células madre residentes en el "tejido maduro" con lo cual se evita la necesidad para administrar la terapia con "células madre" al paciente, ya que las células madre residentes son estimuladas para sufrir mitosis y crecer.

La estimulación de las células madre residentes es distinta de la angiogénesis . La angiogénesis es el proceso de estimular el crecimiento de capilares (que puede ser en tejidos o en tumores) (ver Husnain, K.H. et al. 2004. J. Mol.

Med. 82:539; Folkman, J. , y D'Amore, PA. 1996. Cell 87:1153) .

En contraste, cuando las formulaciones de la presente descripción que emplean ligandos apropiados, son administradas a las células madre residentes en el tejido, tales como las células pluripotenciales , las células progenitoras y/o células precursoras, éstas son activadas para generar nuevas células/tisulares adicionales tales como células musculares.

Todos los procedimientos regenerat ivos descritos hasta ahora tienen varias limitaciones ya sea debido a la naturaleza de su objetivo biológico, el agente regenerativo utilizado y/o la ruta y modo de administración. La gran mayoría de las denominadas terapias regenerat ivas han sido dirigidas para regenerar la red capilar del miocardio isquémico utilizando una variedad de factores biológicos, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , cuyo papel principal es estimular el crecimiento de las células endoteliales sobrevivientes en el tejido dañado, con el fin de expandir la red capilar y mejorar el suministro de sangre (Isner, J.M. y Losordo, D. . 1999. Nature Medicine 5:491; Yamaguchi, J. , et al, 2003. Circulation 107:1322; Henry, T.D., et al, 2003. Circulation 2003. 107:1359) . Estas terapias no intentan ni logran la regeneración de las células parenquimales que realizan la función característica del tejido o el órgano; por ejemplo, los cardiomiocitos contráctiles en el corazón, los hepatocitos en el hígado, las células ß productoras de insulina en el páncreas, etc. A lo mejor, estas terapias han tenido efectos modestos y ninguna de ellas se ha vuelto parte de la práctica médica estándar.

Por otra parte, todas las terapias degenerativas diseñadas para reemplazar las células funcionales del tejido o el órgano han estado basadas hasta ahora en el trasplante de células que se cree son capaces de tomar las características de las células faltantes en el tejido objetivo. Estos procedimientos están todavía en pruebas clínicas. Un inconveniente principal para todos los procedimiento regenerativos utilizados han sido distribuir el agente regenerativo al tejido dañado y limitar su dispersión a todo lo largo del resto del cuerpo. Este es un problema serio incluso cuando los agentes regenerativos son administrados a través del árbol arterial coronario del tejido que va a ser tratado. En los casos de terapia con células miocardiacas por administración coronaria, únicamente una fracción pequeña de las células administradas es retenida en el corazón, mientras que la mayoría (> 95%) entra rápidamente a la circulación sistémica y es distribuida a todo lo largo del cuerpo. Esto ocurre también cuando los agentes . regenerativos son directamente inyectados dentro del miocardio ya sea trans-epicardialmente o trans-endocardialmente , como ha sido repetidamente demostrado con la administración de una suspensión celular. Además, la administración trans-epicardial requiere exponer al corazón a una toracotomía, mientras que la administración trans-endocardial requiere un procedimiento sofisticado, que consume tiempo y costoso' para mapear el endocardio, para identificar la región adecuada para la inyección (un instrumento tipo Nog) , un procedimiento disponible en un número muy limitado de centros y la participación de un manipulador experto. En ambos casos, a lo mejor 50% del compuesto administrado es retenido en el tejido dañado, mientras que el resto es dispersado ya sea a todo lo largo de la cavidad toráxica o a través de la circulación sistémica. Las formulaciones de la descripción pueden ser utilizadas en combinación con la distribución de células madre a un tejido u órgano objetivo, y para incrementar el número que son localmente retenidas .en comparación a otros mecanismos de distribución.

No obstante, esta descripción detalla un nuevo método para regenerar las células parenquimales (es decir, las células preferidas "nobles" funcionales) de un tejido u órgano que no está basado ni en el trasplante celular ni en la estimulación del crecimiento de las células endoteliales sobrevivientes, con el fin de mejorar el suministro de sangre al tejido u órganos de interés. Más bien, los métodos descritos aquí están basados en la estimulación in situ, es decir, dentro del tejido, de las células madre residentes de tal tejido por medio de la distribución local de factores de crecimiento específicos y/o citocinas que son capaces de estimular su activación, replicación y diferenciación, para generar las células parenquimales perdidas así como la microvasculatura necesaria para su crecimiento, supervivencia y función. Esto es posible debido a que la mayoría, sino es que todos los tejidos de mamífero de adulto, incluyendo el tejido humano, contienen células madre residentes que son capaces, cuando son adecuadamente estimuladas, de regenerar los tipos celulares que son específicos para el tejido u órgano, así como las células de soporte vascular y mesenquimal que las acompañan.

Debido a que algunos de los ejemplos regenerativos que estimulan las células madre son muy activos y pueden estimular el crecimiento y la translocación de una variedad de células con las que éstas actúan, entre ellas las células neoplásicas latentes, la aplicación clínica potencial de muchos de esos factores requerirán la administración de dosis terapéuticas más pequeñas en un número muy localizado con el fin de, tanto como sea posible, limitar la exposición de las células que van a ser regeneradas. De este modo, entre más localizada sea la administración serán requeridas menos dosis y menor será el riesgo de e fectos colaterales no deseados, debido a la estimulación de células circundantes en el mismo o en otros órganos. Más específicamente, la descripción detalla un nuevo procedimiento para el uso de dosis terapéuticas de diferentes factores de crecimiento administrados y distribuidos localmente, en vez de sistémicamente o a través de los tejidos para producir la regeneración de áreas especificas de un tejido sólido. Debido a que la distribución del compuesto activo está localizada hacia el tejido dañado, la dosis terapéutica requerida es una fracción diminuta de la que podría ser necesaria con otros métodos de distribución disponibles. La formulación de la descripción es capaz, entre otras aplicaciones, de regenerar un músculo cardiaco y su microvasculatura después de un infarto al miocardio y/o en insuficiencia cardiaca crónica.

En una modalidad, la formulación es administrada en el límite del tejido dañado, por ejemplo en el límite de una zona isquémica.

Los ligandos adecuados para las células madre incluyen factores de crecimiento tales como aquellos listados en la Tabla 1 TABLA 1: Ejemplos de ligandos de células madre adecuados de HGF (factor de crecimiento de hepatocito) , IGF (factor de crecimiento similar a insulina) tal como IGF- 1, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaqueta) tal como PDGF-ß, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) tal como aFGF (FGF-1) o bFGF (FGF-2) y FGF-4 , En una modalidad, el o los factores de crecimiento empleados son humanos.

En una modalidad, el factor de crecimiento empleados se selecciona de HGF, IGF (tal como IGF-1 y/o IGF- 2) y FGF, en particular HGF e IGF-1. Estos factores parecen ser particularmente efectivos en la estimulación de células madre residentes.

Las combinaciones de factores de crecimiento pueden ser también empleadas y, por ejemplo, pueden ser seleccionadas de la lista anteriormente definida, tal como HGF e IGF-1 y opcionalmente VEGF.

En una modalidad, la formulación para regenerar/activar células madre no consiste de VEGF como el único agente activo, sino por ejemplo puede comprender una combinación de agentes activos incluyendo VEGF.

No obstante, la formulación es adecuada para la distribución localizada de VEGF como factor de angiogénesis .

En una modalidad, la formulación del factor de crecimiento es empleada en combinación con un factor de angiogénesis, por ejemplo administrar concomitantemente o secuencialmente por la misma ruta o una ruta diferente.

En una modalidad, la formulación comprende una citosina, por ejemplo seleccionada de IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18 y/o interferón.

En una modalidad, la formulación comprende combinaciones de agentes activos, por ejemplo un factor de crecimiento y una citocina.

En las formulaciones en combinación entonces la dosis de cada agente activo puede, por ejemplo, ser la misma dosis empleada cuando el agente activo es administrado solo.

Los componentes empleados en las formulaciones y/o métodos de la descripción, especialmente agentes activos biológicos pueden ser derivados de origen natural.

En una modalidad, un agente activo tipo biológico empleado es preparado mediante tecnología de ADN recombinante .

En una modalidad, el activo o activos administrados pueden ser fragmento peptídicos de una molécula biológica, con el efecto terapéutico deseado.

En una o más modalidades, las moléculas empleadas son mutantes de una molécula biológica (por ejemplo un ligando de un receptor) con el efecto terapéutico deseado que tiene la misma, . más alta o menor afinidad por la molécula biológica correspondiente.

En una modalidad, la o las sustancias/agentes activos empleados es un aptámero (una molécula de ARN pequeña que se enlaza a un receptor en vez del ligando natural) .

En una modalidad, la sustancia/agente activo empleado es un anticuerpo que reconoce y se enlaza a un receptor objetivo, y en particular tiene una especificidad y/o avidez adecuadas para el mismo. De manera deseable, el anticuerpo tiene la actividad requerida para suprarregular el receptor o subregular el receptor, con lo cual produce activación o bloqueo del mismo, como sea apropiado.

En una modalidad, el agente activo es una diaquina, que es una molécula de anticuerpo artificial que reconoce y se enlaza a dos de los receptores de interés dando como' resultado ya sea la activación o bien el bloqueo de uno y/o el otro.

En una modalidad, la sustancia/agente activo empleado es una molécula pequeña con un peso molecular < 5,000 Daltones.

En una modalidad, uno o más activos empleados pueden ser de origen sintético.

Para la formulación descrita en la presente, para dirigirse al órgano o tejido deseado entonces la formulación debe ser administrada corriente arriba del órgano o tejido. Es decir, ésta debe ser introducida hacia la circulación tal que el flujo de sangre lleve la formulación hacia el te ido/órgano deseado.

La formulación puede ser introducida corriente arriba de un órgano tal como el corazón, empleando un dispositivo adecuado tal como un catéter. Otros órganos mayores pueden ser alcanzados de esta manera. Similarmente, mientras que es raro es también posible utilizar catéteres para tener acceso al hígado.

En otros casos, la formulación puede ser introducida por inyección intra-arterial estratégica o por inyección venosa retrógrada y/o canular antes del tejido obj etivo .

La formulación puede ser también administrada mediante venoclisis o un dispositivo de distribución accionado por bomba, tal como una bomba de jeringa, por ejemplo del tipo empleado en la administración de heparina o morfina o agentes de contraste durante la cateterización. Una velocidad de flujo adecuado puede ser por ejemplo de 0.5 ml/min .

La formulación puede ser también administrada a través de los denominados catéteres de perfusión que permiten retardar la velocidad del flujo sanguíneo corriente abajo del sitio de inyección, con un globo intra-arterial , mientras que se mantiene la perfusión del tejido a través de una segunda luz del catéter.

En una modalidad particularmente adecuada, la formulación es administrada dentro de una arteria corriente arriba del tejido y órgano objetivo.

En una modalidad, un catéter es utilizado para distribuir la formulación de la descripción hacia la arteria que suministra al tejido u órgano objetivo. En particular, la formulación puede ser distribuida exclusivamente (principalmente o sustancialmente) a la arteria segmentaria que suministra el área del tejido u órgano.

En una modalidad, el catéter empleado es un catéter de globo.

En una modalidad, el catéter lleva una malla de filtro en su extremo distal con un tamaño de poro suficientemente pequeño para prevenir o impedir la liberación de agregados de microparticulas > 50, 25 ó 20 µp?, como se requiera.

En una modalidad, las células objetivo son las' células madres cardiacas residentes en el corazón postnatal.

En una modalidad, la regeneración obtenida incluye conjunta o separadamente la regeneración de cardiomiocitos y estructuras vasculares compuestas de capilares (células endoteliales ) y/o arteriolas (células del endotelio y del músculo liso vascular) .

En una modalidad, la regeneración es inducida a cualquier tiempo después de un infarto al miocardio (MI) ya sea agudo o crónico, por ejemplo 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11 hasta 24 horas después de un infarto agudo.

En una modalidad, la regeneración es inducida en un individuo con trastorno cardiaco isquémico, con o sin un infarto del miocardio.

En una modalidad, la regeneración es inducida en los corazones de individuos que han desarrollado insuficiencia cardiaca (CF) ya sea aguda o crónica.

En una modalidad, la regeneración es inducida en individuos con cardiomiopatia isquémica, infecciosa, degenerativa o idiopática.

En una modalidad, las células objetivo son las células madres residentes en el páncreas endocrino (células madres de los islotes de Langerhans) .

En una modalidad, la regeneración es inducida en un individuo con diabetes.

En una modalidad, las células objetivo son las células madres neurales del sistema nervioso central (CNS) .¦ En una modalidad, las células madre objetivo son las células madres neurales de la médula espinal.

En una modalidad, la regeneración es inducida en un individuo con una lesión de la médula espinal.

En una modalidad, las células objetivo son las células madres de la sustancia nigra del cerebro, por ejemplo en un individuo con enfermedad de Parkinson.

En una modalidad, la regeneración es inducida en un individuo con un accidente vascular cerebral (apoplejía).

Mientras que no se desea estar comprometido por alguna teoría, se cree que los ligandos empleados en las formulaciones de la descripción son capaces de cruzar la barrera sangre-cerebro para tratar apoplejías similares. Además, en el accidente vascular cerebral se cree que la barrera sangre-cerebro se llega a deteriorar y las entidades químicas pueden pasar más fácilmente a través de la barrera.

En una modalidad, las células objetivo son las células madre hepáticas, y por ejemplo la regeneración es inducida en un individuo con daño hepático tal como cirrosis.

En una modalidad, las células madre objetivo son las células madres de o de los pulmones y por ejemplo .la regeneración es inducida en un paciente con el daño pulmonar, por ejemplo, enfisema.

En una modalidad, las células objetivo son las células madre del músculo esquelético, y por ejemplo, la regeneración es inducida en un individuo con un déficit particular del daño esquelético, tal como osteoporosis o enfermedad de paget .

En una modalidad, las células objetivo son las células madres del epitelio.

En una modalidad, las células madre objetivo son las células madre de los ríñones.

Las células objetivo como son empleadas en la presente, se refieren a las células que van a ser estimuladas y que tienen el potencial para proporcionar la regeneración deseada .

La formulación de la descripción proporciona parámetros y materiales optimizados para asegurar la dosificación precisa y/o reproducible del agente activo relevante hacia el tejido u órgano objetivo.

En una modalidad alternativa, las formulaciones de la descripción pueden ser empleadas para tratar los tumores sólidos, al permitir la distribución local del antineoplásico al tejido tumoral, por ejemplo mediante inyección intra-tumoral .

Los agentes activos adecuados para el tratamiento de tumores incluyen, etopósido, ciclofosfamida, genisteina, cisplatino, adriamicina, vindesina, mitoguazona, fluorouracilo y paclitaxel.

En una modalidad, la formulación no es para el tratamiento del cáncer.

En una modalidad, la invención no es la administración directamente a un tumor o tejido.

Los métodos de acuerdo a la descripción pueden emplear combinaciones de agentes activos administrados separadamente, por ejemplo concomitante o secuencialmente, o formuladas como una formulación (un solo recipiente).

Las formulaciones de la descripción pueden ser administradas como soluciones/suspensiones liquidas, por ejemplo en un portador isotónico, por ejemplo como una solución amortiguada tal como un amortiguador de fosfato, solución salina o solución de glucosa.

Las formulaciones de la descripción pueden comprender opcionalmente uno o más excipientes adicionales. Los excipientes deben ser adecuados para la administración a humanos y/o animales.

En una modalidad, la formulación comprende albúmina en solución, que puede por ejemplo estabilizar las cantidades pequeñas del agente activo en las formulaciones, por ejemplo de 1% a 20% peso/volumen de albúmina, tal como albúmina sérica humana, puede ser suficiente para lograr la estabilización requerida.

La descripción también se extiende al uso de, como una formulación como se define en la presente, para el tratamiento, particularmente para el tratamiento de infarto del miocardio; trastorno cardiaco isquémico; insuficiencia cardiaca; cardiomiopatia isquémica, infecciosa, degenerativa, o idiopática, esclerosis, cirrosis, enfisema, diabetes y similares .

En una modalidad, la descripción se refiere a una formulación como se describe en la presente, para el uso del tratamiento, particularmente para el tratamiento de una enfermedad descrita anteriormente.

La descripción también se extiende a los métodos de tratamiento que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación descrita en la presente, a un paciente en necesidad de la misma, particularmente para el tratamiento de un trastorno descrito anteriormente .

La descripción también se extiende al uso de un ligando, por ejemplo como se describe en la presente, para estimular una células madre residente in vivo para activar la célula .

La descripción también incluye los usos de un factor de crecimiento adecuado para la fabricación de un medicamento para estimular las células madres residentes in vivo .

La descripción será ahora ilustrada con referencia a los Ejemplos.

EJEMPLOS Introducción Fueron producidos infartos del miocardio anterior en cerdos hembra mediante la oclusión temporal por globo de la arteria coronaria descendente anterior, distal a la primera ramificación septal. Este procedimiento dio como resultado infartos antero-apicales de tamaño moderado, reproducible . El potencial de regeneración al miocardio del factor 1 de crecimiento similar a insulina y el factor de crecimiento de hepatocitos, combinados fue probado al administrar localmente los factores a diferentes dosis en el miocardio de cerdo infectado. Los animales control fueron tratados con placebo.

La factibilidad para producir efectos terapéuticos con la administración local de cantidades diminutas de agentes terapéuticos fue probado primeramente mediante administración directa a una solución que contenia una mezcla de IGF-1 y HGF humano, recombinante, en el post-MI agudo producido en un modelo experimental con pecho cerrado mediante dilatación de globo en la arteria coronaria izquierda descendente, anterior, justo debajo de la emergencia de la primera arteria septal en 23 cerdos que fueron comparados a 6 controles con placebo idénticamente tratados .

Materiales y Métodos Los corazones fueron analizados a diferentes puntos de tiempo después del infarto del miocardio, que van de unos pocos días a 1 mes. Los resultados mostraron un incremento dramático en el número de células madre progenitoras activadas en el área isquémica y sus limites, de los cerdos tratados con IGF-1 y HGF humanos. La regeneración notable del músculo fue observada en el área isquémica, la cual también contenia arteriolas y vasos recién formados. La respuesta regenerativa pareció ser proporcionada a las dosis de los factores de crecimiento administrados. A partir de estos datos preliminares, la activación terapéutica in situ de las CSCs puede producir nueva formación extensa de tejido miocardiaco y mejorar significativamente la función ventricular izquierda en corazones de animales que son similares en tamaño y anatomía a los corazones humanos.

Aislamiento de las Células Cardiacas Porcinas c-kitpos Múltiples muestras cardiacas (de ~ 2 g cada una) fueron obtenidas de diferentes regiones cardiacas (atrio derecho e izquierdo, ventrículo izquierdo derecho e izquierdo y vértice) de cerdos blancos Yorkshire hembras (23 ± 4 kq; n = 3) . Alqunas muestras fueron fijadas e incrustadas en parafina para el análisis histoquímico . Las otras piezas fueron enzimát icamente diqeridas y las suspensiones de células cardiacas agotadas en cardiomiocitos fueron preparadas como se describe previamente con modificaciones (Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114:763) . En resumen, el tejido cardiaco desmenuzado fue digerido con 0.1% de colagenasa (Worthington Biochemicals) , 0.1% de Tripsina (Sigma) , 0.1% de ADNse I en amortiguador de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a 37 °C y la misma fracción de células cardiacas pequeñas recolectadas a través de centrifugación. Las células cardiacas pequeñas fueron incubadas con el anticuerpo anti-CDH7 humano (c-kit) Ab (Miltentyi Biotechnology ) y clasificadas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS; plastificador celular MoFlo (Dako Cytomation) ) o micro-inmunoesferas activadas magnéticas (MACS) . Se agregó yoduro de propidio (PI; 2 yg/ml) antes de FACS para excluir las células muertas.

Las células cardiacas porcinas c-kitpos fueron analizadas para los marcadores celulares hematopoyéticos , mesenquimales y endoteliales utilizando un citómetro de flujo FacsCalibur (Becton Dickinson, BD) . Los anticuerpos utilizados fueron anti-CD45 porcino (Serotec, Clon: MCA1447), anti-CD34 humano (BD, clon 8G12), anti-CD90 humano, (BD, Clon:5E10, reactividad cruzada con el cerdo) y anti-CD166 humano (BD, Clon: 3A6, reactividad cruzada con el cerdo), anti-CD105 humano (Caltag Laboratories, Clon: SN6, reactividad cruzada con el cerdo) y anti-CD133 humano (Miltenyi Biotec, clon AC 133, reactividad cruzada con el cerdo) . Los anticuerpos anti-humano específicos para PECAM, E-cadherina, CDllb, CD13, CD14, CD29, CD31, CD33, CD36, CD38, CD44, CD49, CD62, CD71, CD73, CD106, fueron adquiridos de BD Biosciences. Los controles de isotipo respectivos (Pharmingen) fueron utilizados como controles negativos para todos los procedimientos de FACS . Los datos fueron analizados utilizando el software CellQuest.

Cultivo, Clonación y Potencial de Diferenciación de Células Cardiacas Porcinas c-kitpos Las células c-kitpos fueron sembradas en placas por 7-10 días a 2 x 10 células/ml en MEM Dulbecco /modificado de F12 de Ham (DMEM/F12) que contenía 10% de FBS , bFGF (10 ng/ml) , insulina-transferrina-selenito (ITS), y EPO (2.5 U) . Después de la recuperación, algunas células fueron movidas hacia un medio de formación de cardioesferas modificado (mCSFM) : proporción 1 : 1 de DMEM/F12 , bFGF (10 ng/ml), EGF (20 ng/ml), ITS, 2^-mercapetanol (0.1 mM) y Medio Basal Neural suplementado con los suplementos B27 y N2 (Gibco) , para la generación de cardioesfesras . Para probar la clonogenicidad, células c-kitpos simples fueron sembradas individualmente dentro de pozos de placas Terasaki recubiertas con gelatina, de 96 pozos, mediante citometria de flujo o dilución serial. Las células c-kitpos individuales fueron desarrolladas en el medio modificado DMEM/F12 por 1-3 semanas cuando los clones fueron identificados y expandidos. La clonogenicidad de las células c-kitpos fue determinada mediante el conteo del número de clones generados en cada placa de 96 pozos y expresado como un porcentaje. Se analizaron un total de 10 placas por región cardiaca. Las células clonogénicas y las cardioesferas fueron transferidas a un medio de diferenciación cardiogénico (modificado a partir de 42) para especificación de miocitos, células del músculo liso vascular y células endoteliales .

El ensayo de migración celular fue llevado a cabo utilizando una cámara Boyden modificada, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Chemicon) . Se colocaron 200 ng/ml de HGF ó 200 ng/ml de IGF-1 en la cámara inferior de una placa de 24 pozos, por 24 horas. Para el ensayo de proliferación, se sembraron en placa 2.5 x 104 pCSCs en cajas de 24 x 35 mm y fueron agotadas de suero por 36 horas en el medio base DMEM/F12 de 0% de suero. 6 cajas actuaron como control de linea base y fueron suplementadas con BrdU (1 µ?/p??) antes de ser fijadas y teñidas 1 hora después. Luego, el medio base DMEM/F12 suplementado con 3% de FBS y 200 ng/ml de HGF (n = 6 cajas) ó 200 ng/ml de IGF-1 (n = 6 cajas) se agregaron a las 12 cajas restantes. 6 cajas actuaron como controles, sin factores de crecimiento agregados al medio. Se agregó BrdU, 1 pg/ml cada 6 horas. Las células fueron fijadas después de 24 horas y se evaluó la incorporación de BrdU utilizando el kit del sistema de detección de BrdU (Roche) . Los núcleos fueron contrateñidos con el colorante con base al ADN, 4 , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) a 1 µg/ml. Las células fueron evaluadas utilizando microscopía de fluorescencia (Nikon E1000 ) . 10 campos aleatorios a una amplificación de 20x fueron contados para cada caja, y los números expresados como un porcentaje de las células positivas a BrdU con relación al número total de células contadas.

Inmunocitoquimica Las células fueron cultivadas sobre portaobjetos con cámara de vidrio (BD Falcon) por 2 días, fijadas con PFA al 4% por 20 minutos, y luego teñidas. Para la tinción intracelular , las células fueron permeabili zadas utilizando 0.1% de Tritón X-100. Las células fueron incubadas con el anticuerpo primario toda la noche a 4°C, lavadas tres veces y luego incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a FITC o a Rojo Texas por 1 hora a 37°C. Luego, las células fueron lavadas tres veces, y los músculos fueron contrateñidos con DAPI . La fluorescencia fue visualizada y las imágenes adquiridas con el microscopio confocal (Zeiss LSM510) . Fueron utilizados los anticuerpos para la tinción celular: Oct3/4, Nanog, Isl-1, c-kit, Flk-l, y Nkx2.5 (R&D Systems); Bmi-1, c-met y IGF-lr (Santa Cruz Biotechnology) , telomerasa (Abeam) . Las cardioesferas fueron teñidas para c-kit después de 24 horas de cultivo en un portaobjetos con cámara de vidrio. Después de 4-6 días en cultivo para permitir el crecimiento hacia afuera y la diferenciación de las células a partir de la esfera, éstas fueron teñidas con anticuerpos contra la actina de músculo liso, actina a-sarcoméríca (Sigma) y factor de von Willebrand (DAKO) . Todos los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Jackson Immunoresearch .

Análisis de Western Blot Las inmunotransferecias para detectar los receptores de IGF-1 (IGF-1R) y HGF (c-met) fueron llevadas a cabo como se describió previamente (Ellison et al. 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397) utilizando lisados de proteina obtenidos de las pCSCs de c-kitpos sometidas al medio de inanición de suero por 24 horas, seguido por suplementación con 200 ng/ml de IGF-1 ó 200 ng/ml de HGF por 10-20 minutos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos a las diluciones sugeridas por los fabricantes: anticuerpos policlonales de conejo Abs IGF-1R, fósforo-IGFIR, Akt, fósforo-Akt, c-met (Cell Signalling) , fósforo-c-met (Abeam) , FAK, y fósforo-FAK (Upstate) .

Histología Después de la extirpación atrial los corazones fueron divididos en 5 rebanadas coronales desde el vértice hacia la base, con cortes perpendiculares al eje longitudinal. Las muestras del miocardio infartado, peri-infartado y distal fueron obtenidas de cada nivel de cada cerdo. Las muestras fueron lavadas con PBS, fijadas en 10% de formalina e incrustadas en parafina. Se prepararon secciones de 5 ym sobre un microtomo (Sakura) y se montaron sobre portaobjetos para microscopio. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) , de acuerdo a los procedimientos estándares (Ellison et al. 2007. J. Biol . Chem. 282: 11397) . El diámetro de los miocitos fue medido a través del músculo en secciones de H&E (3 portaobjetos por animal) de la región peri-infarto de los niveles C y D, sobre un microscopio de luz (Nikon E1000M) utilizando el software Lucia G. Un total de 200 miocitos por sección fueron analizados para cada cerdo.

Para determinar la fibrosis miocardiaca, las secciones del miocardio infartado fueron teñidas con rojo Sirius como se describió previamente (Lee, CG. et al., 2001. J. Exp. Med. 194:809) . Las secciones seriales fueron fijadas en 10% de formalina en PBS por 20 minutos. Después de lavar en agua destilada por 5 minutos, las secciones fueron incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos en 0.1% de Fast Blue RR en amortiguador de borato de magnesio a pH 9 (Sigma) . Luego, las secciones fueron lavadas en agua destilada antes de la incubación a temperatura ambiente por 10 minutos en 0.1% de rojo Sirius en ácido picrico saturado (Sigma) . Las secciones fueron posteriormente lavadas en agua destilada antes de que éstas fueran deshidratadas, despejadas y montadas. En este protocolo, el tejido conectivo (principalmente colágeno) se tiñe de rojo y el músculo se tiñe de amarillo/naranja. La evaluación semi-cuantitativa de la cantidad de tejido conectivo miocardiaco se llevó a cabo utilizando el análisis de imagen Lucia G a una amplificación de 40x. El porcentaje de colágeno (área porcentual de la tinción positiva) fue determinado en la zona de infarto completo. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos por animal para cada nivel, y se obtuvo un promedio.

Inmunohistoquimica y Microscopía Confocal Para identificar las CSCs, secciones transversales de corazón de cerdo fueron teñidas con anticuerpos contra el antigeno de célula madre, c-kit (policlonal de conejo, Dako) . Las CSCs de c-kitpos fueron identificadas como de linea negativa (Linneg) , mediante tinción negativa para los marcadores de las lineas hematopoyética , neural, y del músculo esquelético (21). Para la cuantificación de la distribución miocardiaca del CSC en las diferentes regiones cardiacas de los cerdos control, se contó el número de células de c-kitpos (linneg) y cardiomiocitos para un total de 5 secciones a una amplificación de 63x. El área de cada sección transversal fue luego medida, y el número de CSCs y cardiomiocitos por área unitaria fue determinado. Los datos para los atrios fueron combinados, debido a pocas diferencias encontradas entre el número de CSCs de c-kitpos en los atrios izquierdo y derecho. El número de CSCs fue expresado por 106 miocitos.

Las células de ciclo fueron identificadas por tinción de BrdU (Roche) y Ki67 (Vector labs) . Las células progenitoras se tiñeron positivas para c-kit y los factores de transcripción, Nkx2.5 ( R&D Systems), Ets-1 y GATA6 (Santa Cruz Biotechnology) . Los miocitos recién formados fueron identificados con anticuerpos contra BrdU, Ki67 y actina ot-sarcomérica (Sigma) , troponina cardiaca I (Santa Cruz Biotechnology) o una cadena pesada de miosina lenta (cardiaca) (Sigma) . Las estructuras vasculares recién formadas fueron detectadas mediante tinción para BrdU y actina del músculo liso a (monoclonal de ratón, Sigma) o vWF (policonal de conejo, Dako) . Las imágenes fueron adquiridas utilizando microscopía confocal (Zeiss 510 LSM) . El número de CSCs, células progenitoras de miocitos (c-kitpos/Nkx2.5pos) , y miocitos recién formados (BrdUpos y ki67pos) fueron cuantificados para las regiones de infarto, peri-infarto y distal en cada nivel. Se contaron un total de 3000 células (~ 20 campos) para cada región a una amplificación de 63x. - 3 portaobjetos por animal fueron evaluados. Los números fueron expresados como un porcentaje relativo al número total de células contadas. El tamaño de 50 miocitos BrdUpos recién formados, por animal en las regiones de infarto y peri-infarto, se midió utilizando el software Lucia G.

La densidad de los capilares en la región de infarto fue evaluada mediante tinción con un anticuerpo contra vWF (DAKO) . El 2° anticuerpo utilizado fue un anticuerpo de burro-conejo, conjuntado con HRP (Santa Cruz). La peroxidasa endógena en la sección fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS por 15 minutos a temperatura ambiente. El cromógeno 3 , 3-diaminobencidina (DAB) (Sigma) se utilizó para visualizar los vasos sanguíneos. Los portaobjetos fueron contrateñidos con hematoxilina para identificación de los núcleos. El número de capilares (definidos como 1 ó 2 células endoteliales que abarcan la circunferencia del vaso positivo a vWF) fue determinado mediante conteo de 10 campos/sección en la zona de infarto en los niveles C y D a una amplificación de 40x. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos/animal. El número de capilares fue expresado por 0.2 mm2.

Para detectar la apoptosis celular, las secciones fueron teñidas con el anticuerpo primario de conejo antihumano activado por caspasa-3 (R&D Systems) y un anticuerpo secundario de burro anti-conejo, conjugado a HRP. Se utilizó el cromógeno DAB (Sigma) para visualizar los cardiomiocitos apoptóticos. Las secciones fueron luego contrateñidas con hematoxilina y permanentemente montadas antes de ser examinadas por microscopía de luz. El número de miocitos positivos a la caspasa-3 en la zona peri-infarto de los niveles C y D se determinó mediante conteo de 20 campos aleatorios/sección a una amplificación de 40x. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos/animal. La cantidad de miocitos positivos a la caspasa-3 fue expresada como el porcentaje relativo al número total de miocitos contados.

Análisis Estadístico Los datos son reportados como la Media ± SD. La significancia entre 2 grupos fue determinada mediante la prueba t Student y en comparaciones múltiples mediante el análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) .

Se utilizó el método post hoc de Bonferroni para localizar las diferencias. La significancia fue establecida a P < 0.05.

Ejemplo 1 Preparación de Microesferas de PLGA Dos grupos de microesferas de PLGA y alginato fueron preparadas; un grupo contenia una mezcla de albúmina sérica humana (HSA) y factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF-1) , el otro grupo contenia una mezcla de HSA y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) . La HSA .se utilizó para proporcionar suficiente volumen para la emulsión, dadas las cantidades muy pequeñas de los factores de crecimientos necesarios.

Las condiciones utilizadas para formar las microesferas de PLGA son las siguientes: Un nebulizador de enfoque de flujo de Ingeniatrics (D= 150 µp, H= 125) fue empleado en una configuración líquido-liquido en la cual en liquido enfocado es la emulsión de PLGA + HSA + factor de crecimiento y el líquido de enfoque es agua.

La fase lipídica consistió en: 5% de PLGA en EtOAc (acetato de etilo) .

La fase acuosa consistió de: 5% de HSA, 0.1% de factor de crecimiento, 0.45% de NaCl, 0.25% de Tween 20 en H20.

La mezcla de las dos fases fue sonicada por 30 minutos .

Las microgotitas son producidas en un baño de alcohol polivinílico al 2% (PVA, Fluka Chemica) .

El tamaño de las partículas es controlado por el volumen de flujo de los fluidos enfocados (Qd) y de enfoque (Qt) . Para obtener partículas de 15+1 micrómetros, se utilizaron Qd = 3.5 mL/h y un Qt= 3 mL/h. La eficiencia de encapsulamiento de la mezcla HSA + IGF-1 fue de 37%.

El tamaño de las partículas fue averiguado mediante microscopía óptica y electrónica (ver Figura 8).

Se utilizaron los mismos procedimientos con modificaciones menores para preparar las partículas de PLGA que contenían HGF.

Ejemplo 2 Optimización de la producción de microesferas de PLGA monodispersas de 15 um de diámetro.

Para optimizar la eficiencia de encapsulamiento con el fin de reducir el número de microeferas que van a ser administradas, las condiciones utilizadas fueron optimizadas con modificación en los siguientes parámetros: a. - Incorporación de emulsificantes en la fase lipídica. Se encontró que la combinación óptima era una mezcla de Tween 80 y Span 60 que produjo una emulsión estable por hasta 5 horas. b. - Optimización de la concentración de proteína (Albúmina Sérica Humana), HSA de 20% en vez de 5%. c- Optimización de la concentración de NaCl en la fase acuosa a 0.2 % en vez de 0.45%. d. - Optimización de la concentración de PLGA a 5.5 % en vez de 5% en EtOAc. e. - La concentración de HGF-1 en la mezcla inicial fue de 0.4%.

Por lo tanto, la fase acuosa consistió de 20% de HSA, 0.4% de IGF-1; 0.2 NaCl; 0.1 Tween 20; 0.15 Span 60. La fase orgánica consistió de 5.5% de PLGA en EtOAc (acetato de etilo) .

Las microparticulas fueron obtenidas mediante enfoque de flujo simple utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo #1.

El tamaño de las partículas, como es determinado por SE fue de 14.36 µpa con una SD de 0.91 y una eficiencia de encapsulamiento de 82.4 con un atrapamiento de 13.1%. Las determinaciones de proteína complementadas por ELISAs cuantitativas documentaron que cada 1 x 106 microesferas llevaban 3 pg de IGF-1 y 348 pg de HSA. Los ensayos biológicos in vitro de IGF-1 contenido en las microesferas probadas por su capacidad para enlazarse y activar el receptor de IGF-1 de las células vivas, muestran que después de una ronda de liofilización y resuspensión del IGF-1 encapsulado, mantuvieron 82% de la actividad biológica original. Por lo tanto, cada millón de microesferas tuvo una actividad biológica equivalente a 2.5 pg del IGF-1 nativo.

Se utilizaron protocolos similares para encapsular HGF, con un resultado final de 1.7 pg HGF encapsulado por 1 x 106 partículas con una actividad biológica de 63% de la original. De este modo, cada millón de microesferas de HGF puede distribuir el equivalente de 1 pg del HGF activo.

El encapsulamiento de SCF (Factor de Células madre), el ligando para el receptor de c-kit, produjo partículas que contenían 2.3 g de SCF por 1 x 106 microesferas con una actividad de 76% de la solución original, como se determinó a través de la activación del receptor de c-kit.

Conclusión: El procedimiento de enfoque de flujo simple utilizado, es muy eficiente en el encapsulamiento de una mezcla de HSA y diferentes factores de crecimiento. El cambio de la proporción inicial de HSA al factor de crecimiento es posible para alcanzar valores de carga de hasta 350 \ig de la proteína farmacológica deseada por 1 x 106 microesferas de PLGA de 15 µ?pa de diámetro, con un coeficiente de variación de = de6¾ .

Ejemplo 3 Producción de microesferas monodispersas de ALGINATO y encapsulamiento de IGF-1 Los reactivos y el equipo utilizados para la producción de las microesferas fueron los siguientes: -Alginato: Protanal LF 10/60; FMCBioPolymer (G/M >1,5); Protanal LF10/60LS; FMCBioPolymer (G/M <1) .

-HSA (albúmina sérica humana, 97-99%, A9511) de Sigma-Aldrich -IGF-1 de PreProtect -CaCl2; citrato tribásico de sodio -Nebulizadores FF simples en la configuración liquido-gas: L2 (D= 100 µp?, H = 100) y L3 (D = 100 pm, H = 100) .

-Bomba Harvard 11 plus.

Después de más de 120 ensayos para establecer las condiciones apropiadas, se volvió evidente que una mezcla de alginatos dio mejores resultados que un alginato simple. El protanal LF 10/60: Protanal LF10/60LS a una proporción de 0.7%: 0.3% dieron los resultados óptimos. La distancia óptima para la nebulización se encontró que era de 10 cm. La concentración óptima de HAS en la mezcla fue de 14% y de IGF-1 0.3%. La mezcla es nebulizada utilizando el FF (D = 100 pm, H = 100) en la configuración liquido-gas (APt = 300 mbar, Qd = 5 mL/h utilizando gas como el fluido de enfoque) . El nebulizador es colocado a 10 cm de una solución de 3% de CaCl2 en un baño con agitación, recolectado por centrifugación después de 30 min y lavado para eliminar el CaCl2. La distribución de tamaño de las partículas es determinada mediante citometría de flujo y SEM. La eficiencia del encapsulamiento de HSA fue mediante cuantificación de proteína y curvas estándares. El encapsulamiento de hrHGF-1 fue determinado mediante ELISA como se describe en el Ejemplo #2.

El tamaño de las partículas, determinado mediante SEM fue de 15.87 pm con una SD de 1.83 y una eficiencia de encapsulamiento de 71.4 con un atrapamiento de 11.6%. Las determinaciones de proteina complementada por ELISAs cuantitativos documentaron que cada 1 x 106 microesferas llevaron aproximadamente 2 \iq de IGF-1 y 269 µq de HSA. Los ensayos biológicos in vitro del IGF-1 contenida en las microesferas, probados por su capacidad por enlazarse y activar el receptor de IGF-1 de las células vivas, muestran que después de una ronda de liofilización y de resuspensión, el IGF-1 encapsulado mantuvo su 67% de la actividad biológica original. Por lo tanto, cada millón de microesferas tuvo una actividad biológica equivalente a aproximadamente 1.5 iq del IGF-1 nativo.

Este protocolo puede ser adaptado para ser utilizado con diferentes tipos de polímeros tales como los copolímeros en bloques segmentados de poliéter-poliéster de tereftalato de polibutileno (PBT) y oxido de polietileno (PEO) , PolyActive® utilizando el nebulizador FF así como otros métodos de rociado.

Conclusión: El alginato es un polímero adecuado para la producción de microesferas monodispersas con un diámetro aproximado de 15 ym y para encapsular cantidades grandes de proteínas. Los protocolos utilizados pueden ser modificados para incrementar la proporción IGF-1 a HSA hasta 60:40, lo cual incrementa la carga del compuesto activo por más de dos órdenes de magnitud. A partir de los resultados obtenidos, el intervalo de tamaño es alrededor del pico de 15 µp\ es más estrecho cuando se utiliza PLGA que con la combinación de los alignatos probados aquí. Dado el gran número de diferencias de preparaciones de alginato es probable que la homogeneidad de las microparticulas encontradas aquí, pudiera ser significativamente mejorada. Ejemplo 4 Para producir microesferas donde el compuesto activo esté localizado sobre la superficie de la partícula, es posible producir las microesferas mostradas anteriormente utilizando un polielectrolito en vez de PLGA de signo de carga opuesta, al ingrediente activo que va a ser enlazado. Los ejemplos de tales pólielectrolitos son goma Arábiga, pectinas, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos , ácido hialurónico, heparina, carboximetilcelulosa, quitosano, ácido algínico y una pluralidad de polímeros sintéticos. Cuando el polielectrolito tiene una carga de signo opuesto al compuesto activo, es posible enlazarlo a la micropartícula por absorción a partir de una solución del activo.

Ejemplo 5 Microesferas de 15 g de diámetro son óptimas para el atrapamiento capilar después de la administración intracoronaria sin derramamiento hacia la circulación sistémica .

Cerdos blancos Yorkshire hembras (n=2) (27kg) fueron sedados con telazol (100 mg, I. .), intubados y afeitados. Se colocó un catéter intravenoso en una vena periférica de la oreja. Los animales fueron movidos a la sala de cirugía, colocados sobre un tablero de soporte, y asegurados a la mesa quirúrgica con ataduras de extremidades. Los animales fueron mantenidos anestesiados con isoflurano (2.5% en 02) y su EKG monitorizada continuamente a todo lo largo del procedimiento. Utilizando una fuente radiológica portátil (GE STENOSCOP, GE Medical Systems USA) para la guía fluoroscópica, la arteria coronaria principal izquierda fue intubada con un catéter de guía 6F, JR 3.5 de 40 cm de longitud especialmente diseñado para el protocolo (Cordynamic- Iberhospitex S. A. Barcelona, España). Fue realizada una angiografía coronaria de línea base.

En ambos animales, un catéter de guía coronaria de 2 mm de diámetro se hizo avanzar sobre un alambre de guía (Peso medio, de balance de alta torsión de 0.3 mm (0.014")) hacia el origen de la arteria coronaria izquierda. A través de este catéter se hizo avanzar un microcateter de 0.3 mm (0.014") de diámetro interno y su punta colocada en la porción proximal de la arteria coronaria anterior izquierdo (LAD) , justo debajo del origen de la primera arteria con perforación. Este es el mismo sitio utilizado para producir el infarto del miocardio experimental y para la administración de la solución de factores de crecimiento descritos anteriormente. Otro catéter fue colocado dentro del seno coronario para recolectar muestras de sangre venosa cardiaca durante el procedimiento. Antes de comenzar la administración se recolectó una muestra de sangre periférica, venosa coronaria y arterial. En el caso de extra-sistoles ventriculares abundantes o fibrilación ventricular, se administró intravenosamente Lidocaina de 1 a 3 mg/kg. La medicación pre-operatoria fue administrada como 75 mg clopidrogel (Plavix) y 250 mg de aspirina un día antes del procedimiento guirúrgico. La medicación postoperatoria consistió de 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 125 mg de aspirina diariamente hasta el sacrificio.

Para determinar el tamaño óptimo de las microesferas para ser completamente atrapadas en la red capilar, una red de microesferas de poliestireno fluorescente de diámetros de 2 µp?, 4 pm, 6 µt?, 10 µp? 12 µp? y 15 µ??, cada una marcada con un colorante diferente (adguirido de Invitrogen y de Polysciences Inc., Cat # F8830, F8858; F8824; microesfera teñida en negro Polybead de 6.0 µp\, Megabead NIST 12.0 µ?? y F8842) se mezclaron en una suspensión de 20 mL de PBS a una concentración de 1 x 106 microesferas de cada uno de lo 6 tamaños por mL, y se agitaron en torbellino por 5 minutos para asegurar una suspensión homogénea. Esta suspensión fue administrada en el origen de la arteria coronaria izquierda de tres cerdos a través del catéter de angiografia por una bomba de Harvard a una velocidad de 1 mL/min. Después de la administración de cada mL (1 millón de microesferas ) la inyección fue suspendida por 3 minutos, durante lo cuál se tomó el tiempo de una muestra de sangre del seno coronario. Inmediatamente después de obtener las muestras de sangre, se prepararon portaobjetos con frotis sanguíneos para verificar la presencia de las micropartículas fluorescentes. Después de la administración completa de 20 mL de la suspensión de microesferas se recolectaron muestras de sangre del seno coronario por 3 horas adicionales a intervalos de 30 minutos. A la conclusión del experimento los animales fueron sacrificados y el corazón extirpado, fijado y las muestras fueron tomadas para el seccionamiento seguido por examen histológico y con microscopio fluorescente.

Debido a que las microesferas de diferentes tamaños fueron administradas en números iguales, sus proporciones en el flujo del seno coronario y en el miocardio deben ser imágenes en el espejo una de la otra. Aquellas partículas que van a través del lecho capilar deben tener una alta concentración en la sangre del seno coronario, y baja en el miocardio al final del experimento. Lo inverso debe ser cierto para las partículas que no pasan a través del lecho capilar. Como se muestra mas adelante, únicamente tamaños = 10 ym son eficientemente retenidos en el miocardio, pero incluso microesferas de 10 y 12 µp? se fugan al través a un grado significativo ya que entre 19 y 8%, respectivamente de estas microesferas pasaron hacia la circulación sistémica. Por una parte, = 1% de las partículas de 15 pm pasaron a través del lecho capilar y llegaron hasta el seno coronario.

TABLA 2 Tamaño de microesferas en 2 4 6 10 12 15 um flujo hacia el seno 95 73 53 19 8 =1 coronario Seno calculado en % Retenido en miocardio 3 =3 15 41 77 90 =99 horas después de la administración en % Para determinar si los resultados mostrados anteriormente fueron específicos para el miocardio o pudieron ser extendidos a otros tejidos, se utilizó el mismo protocolo para administración una suspensión idéntica de microesferas a través de la arteria femoral de la pierna derecha. Las muestras de sangre fueron recolectadas de la vena femoral y las muestras del músculo cuadríceps fueron analizadas para determinar la permanencia de las diferentes microesferas en el músculo esquelético. Los resultados se resumen en la tabla #3.

TABLA 3 Conclusión: El tamaño mínimo de las microesferas que asegura una retención = de 99% en el tejido de interés es 15 pm de diámetro. Debido a que es importante utilizar el tamaño efectivo mínimo con el fin de reducir al mínimo la producción de microfocos de isquemia por la obstrucción de las arteriolas precapilares , este tamaño de diámetro es el óptimo para la distribución local de sustancias a un tejido particular a través de su lecho capilar.

Ejemplo 6 Administración de las microesferas en la circulación coronaria .

Una suspensión de 20 mL de microesferas fluorescentes de poliestireno de 15 µp\ (Invitrogen, Cat # F8842, microesferas de poliestireno FluoSpheres®) a una concentración de 1 x 106/mL en PBS fue preparada y agitada en torbellino por 5 minutos. Esta suspensión fue administrada a través del catéter de angiografía por una bomba de Harvard a una velocidad de 1 mL/min en el origen de la arteria coronaria izquierda principal. Después de la administración de cada mL (1 millón de microesferas ) la inyección fue suspendida por 3 min., tiempo durante el cual se tomó el EKG completo y una muestra de sangre de seno coronario. Inmediatamente después de obtener las muestras de sangre, se prepararon portaobjetos con frotis de sangre para verificar la presencia de micropartículas fluorescentes. El resto de la muestra fue guardado para las determinaciones enzimáticas. El procedimiento fue continuado hasta que el electro cardiograma mostró alteraciones mínimas consistentes con la isquemia miocardiaca. El flujo de sangre coronaria (TIMI) fue medido al inicio del experimento y después de la administración de la suspensión de partícula. Los dos cerdos se dejaron recuperar, se re-examinaron a las 24 horas y se sacrificaron después de esto.

Resultados : En el animal #1 las primeras alteraciones de EKG fueron detectadas después de las administración de 16 mL de la suspensión (16 millones de microesferas ) . En el segundo animal las alteraciones de EKG no aparecieron sino hasta después de la administración de 18 mL (18 millones de microesferas ) . En ambos animales, el flujo sanguíneo coronario fue TI I 3 (normal) al final del procedimiento. El animal # 1 fue sacrificado 24 horas después de la terminación de la venoclisis. Un EKG completo y las muestras de sangre fueron recolectados antes del sacrificio. El corazón fue procesado para el examen microscópico y macroscópico.

El animal #2 a las 24 horas tuvo un EKG normal y un flujo de sangre coronario normal (TIMI 3) . Después de obtener un grupo de muestras sanguíneas el animal fue sacrificado y el corazón procesado para el examen macroscópico y microscópico.

Todos los frotis sanguíneos de las muestras tomadas del seno coronario y de la circulación sistémica de los animales #1 y #2, fueron examinadas mediante microscopía fluorescente a baja y alta amplificación. No se detectaron esferas fluorescentes en ninguna de las muestras. Esto indica que el atrapamiento en la red capilar de las microesferas de 15 ym de diámetro, es muy eficiente. Además, si existen cualesquiera derivaciones funcionales de las arterias coronarias hacia el ventrículo derecho con este método de inyección a través de las venas de Thebesius, éstas son menores y no son detectadas por los métodos empleados aquí .

Las mediciones de enzimas (Tabla 4) muestran que el animal #1 desarrolló un pequeño infarto del miocardio como se muestra por el nivel incrementado del troponina T específica cardiaca (TnT) en sangre (valores más altos de 0.01 ng/ml son anormales) , mientras que los valores del animal #2 son normales y sugieren que este animal desarrolló únicamente isquemia transitoria durante la administración de las partículas y se recuperó sin ningún daño miocardiaco permanente. Esta interpretación fue confirmada por la patología como se muestra enseguida. La sección macroscópica del corazón del animal #1 muestra microfocos de necrosis (áreas pálidas) mientras que la sección del animal #2 es normal. Esta conclusión fue confirmada por la histopatología (dato no mostrado) .

Tabla 4 PRE PRE POST POST POST Marcador INY CS INY CS POST 14H 24H Cerdo CK 574 669 423 567 1920 1982 1 B 521 646 506 498 919 1231 TrT 0.01 0.01 0.01 0.01 1.72 1.35 Cerdo CK 1120 1114 1099 1073 1834 1895 2 MB 922 791 920 523 867 739 TrT 0.02 0.01 0.04 0.01 0.01 0.01 Conclusión: La administración de hasta 15xl06 microesferas de 15 µ?? de diámetro en el área irrigada por la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en un corazón es bien tolerada y no produce daño miocardiaco. Dosis por arriba de 15xl06 microesferas tienen un alto riesgo de producir áreas isquémicas pequeñas que pueden dejar cicatriz permanente. Por lo tanto, con una carga en el intervalo medio de las partículas obtenidas con el PLGA como el polímero de áreas de 1 mg de proteína por 1 x 105 microesferas de 15 \i de diámetro, es posible distribuir hasta 15 mg del agente terapéutico al lecho capilar del miocardio irrigado por la arteria coronaria izquierda.

Ejemplo 7 Administración de microesferas de PLGA cargadas con factores de crecimiento .

Una vez que ha sido determinado el intervalo de dosis de seguridad de las microesferas de 15 µp?, se utilizó el mismo protocolo para administrar lOxlO6 micoesferas de PLGA (de 15µp? de diámetro) a la misma región del miocardio. La suspensión de microesferas estuvo compuesta de 4xl06 microesferas de PLGA cargadas con un total de 2 pg del factor 1 de crecimiento similar a insulina, recombinante , humano (IGF-1); 4xl06 microesferas de PLGA cargadas con un total de 1 ]ig del factor de crecimiento de hepatocitos, recombinante, humano (HGF) . Estos dos tipos de microesferas fueron también cargadas con un colorante fluorescente verde con el fin de hacer más fácil su visualización en la sangre y en las secciones histológicas. Además, la suspensión contenía 2xl06 esferas de poliestireno fluorescentes en el intervalo naranja, de Invitrogen. Las esferas de Invitrogen fueron incluidas para servir como control para la estabilidad y la distribución de las microesferas de PLGA. La suspensión en 10 mL de PBS fisiológico, fue administrada a los cerdos instrumentados como se describe anteriormente.

La administración de la suspensión a los dos animales fue no uniforme y no existieron signos electrocardiogréficos de isquemia. El flujo de sangre capilar fue normal durante y después del procedimiento (TIMI 3) . Un animal (cerdo #3) fue sacrificado 30 minutos después del procedimiento y el otro (cerdo #4) a las 24 horas después del procedimiento. Ambos corazones fueron procesados para los análisis macroscópico y microscópico.

Ni las muestras de sangre periférica ni de sangre del seno coronario de estos dos animales mostraron la presencia de esferas de Invitrogen o PLGA en los múltiplos frotis sanguíneos. El análisis preliminar de las secciones del pulmón, del hígado y del bazo de estos dos animales también fallaron en detectar la presencia de cualquier tipo de microesferas.

Tabla 5 Leyenda para las tablas 4 y 5. Marcadores: CK, creatina-cinasa; MB, la isoforma MB de la creatina-cinasa que es específica del corazón; TrT, toponina T cardiaca, que es el marcador más específico y sensible para el daño miocardíaco. PRE INJ CS, muestra de sangre tomada del seno coronario al inicio del procedimiento; PRE INJ, muestra de sangre sistémica tomada al inicio del procedimiento; POST CS, muestra de sangre tomada del seno coronario al final del procedimiento; POST, muestra de sangre de la circulación sistémica tomada al final del procedimiento; POST 14H, muestra de sangre sistémica tomada a las 14 horas después del procedimiento; POST 24H, muestra de sangre sistémica tomada a las 24 horas después del procedimiento, antes de sacrificar el animal.

Las secciones macroscópicas de estos dos animales fueron completamente normales (no mostradas) . El análisis de la sección del cerdo #3 bajo el microscopio fluorescente, mostró la distribución de las esferas de PLGA (verdes) y las esferas de poliestireno (rojas/nara jas) en los bazos capilares en la proporción aproximada de 1:4 (Figs. 10A-10C más adelante), como seria esperado a partir de la composición de la mezcla administrada. No existió evidencia de ningún daño tisular microscópico en ninguna de las regiones del corazón examinado. En el cerdo #4, el número de esferas de PLGA (verdes) ha disminuido ya significativamente y la proporción de estas esferas a aquellas de poliestireno (rojas/naranjas) es más cercana a 1:1 (ver Figura 11), indicando que las esferas de PLGA se llegan a degradar con una vida media de aproximadamente 16 horas.

Efectividad de IGF-1 y HGF administrados en microesferas para estimular las células madre cardiacas residentes .

Como se describe anteriormente, la combinación de IGF-1 y HGF administradas a través de las arterias coronarias fue muy efectiva en estimular la activación de las células madre cardiacas residentes. En este ensayo preliminar se monitorizó la activación de las células madre en la región donde las microesferas fueron distribuidas y comparadas a una región del ventrículo izquierdo no irrigado por la arteria coronaria izquierda. Como se puede observar a partir de las imágenes en la figura 11, la mayoría de .las células madre residentes en el miocardio no tratado están en reposo (puestas de manifiesto por flechas/cabezas de flecha) , mientras que aquellas de la región tratada han entrado al ciclo celular, demostrado por la expresión del marcador ki-67 del ciclo celular (señal amarilla en el núcleo- en las figuras los "puntos" luminosos en las áreas iluminadas) . Por lo tanto, la administración de factores de crecimiento sobre un substrato sólido que los distribuye hacia los capilares, y los mantiene allí hasta que son descargados hacia el espacio intersticial circunvecino, es un método efectivo de la administración del factor de crecimiento para la estimulación de la población de células madre endógenas.

Conclusión: La distribución local de IGF-1 y HGF a regiones particulares del miocardio por medio de microesferas biodegradables del diámetro que no permite que éstas crucen los capilares y entren a la circulación sistémica, es efectiva en la estimulación de células madre residentes de regiones particulares del tejido, sin afectar aquellas que no son objetivo de la terapia.

Ejemplo 8 Células progenitores y células madre cardiacas c-kitpos porcinas , son multipotentes y fenotipicamente similares a aquellas de otras especies animales .

Secciones histológicas de miocardio proveniente de 3 cerdos Yorkshire que pesaban 24±3 kg fueron examinadas mediante microscopía confocal para la presencia de células positivas para el marcador común de células madre, c-kit, del receptor para el factor de células madre (SCF) , que se sabe es expresado por la mayoría de las CSCs. Las células pequeñas positivas para c-kit (c-kitpos) fueron distribuidas a todo lo largo del miocardio atrial y ventricular (Figuras 1A-1B) con una 'más alta densidad en el atrio (no hay diferencia entre el atrio izquierdo y derecho, datos no mostrados) y el vértice ventricular, comparado a otras regiones cardíacas (Figura 1C) . Este patrón de distribución concuerda con la posición anatómica de las CSCs c-kitpos en los corazones de otras especies animales, incluyendo humanos. En consecuencia, la densidad de las células c-kitpos en corazón de cerdo es similar al miocardio de humano y roedor: 1 célula por aproximadamente 1,000 miocitos o aproximadamente 50,000 c-kitpos por gramo de tejido.

Las muestras de tejido miocardiaco provenientes de diferentes regiones cardíacas porcinas, fueron enzimát reamente digeridas para obtener una población de células agotadas en miocitos. Las células c-kitpos constituyeron 10 ± 3%, 3 ± 2% y 7 ± 3% de la población inicial de células cardíacas agotadas en miocitos, provenientes del atrio, del ventrículo, y del vértice, respectivamente (Figura ID) .

Las células c-kitpos fueron separadas utilizando la tecnología MACS (21) que produjeron una preparación celular altamente enriquecida constituida por > de 90% de las células c-kitpos (Figura 1E) . El análisis de FACS mostró que las células cardíacas enriquecidas en c-kitpos fueron negativas para el marcador panleucocitario CD45 y el marcador progenitor endotelial /hematopoyético CD34 (Figura 1E) . Una alta fracción (87%) de las células cardiacas porcinas c-kitpos expresaron CD90, (un marcador mesenquimal no específico, común) y CD 166 (molécula de adhesión) (Figura 1E) . Únicamente una fracción pequeña fue positiva para los marcadores de progenitores hematopoyéticos/endoteliales, CD105 y CD133 (Suplemento de Figs. 1A a 1E) . Las células cardiacas c-kitpos fueron negativas cuando fueron analizadas para un panel de marcadores de CD específicos para otras líneas de células hematopoyéticas , mesenquimales y endoteliales, incluyendo CD13, CD14, CD31, CD38, CD44, CD33. A partir de estos análisis se puede concluir que las células cardiacas porcinas clasificadas como c-kit son c-kitpos, CD90pos, CD166pos, CD105low, CD133low y CD45neg, CD34neg, CD31neg, CD44neg.

Las células cardiacas c-kitpos recién aisladas provenientes del atrio, ventrículos y vértices fueron expandidas en cultivo (4 pases) y luego se depositaron como células simples dentro de placas Terasaki de 96 pozos para generar clones de células simples (Figuras 2A a 2B) . La eficiencia clonal de las células porcinas fue similar para todos los sitios cardiacos y para la eficiencia de clonación previamente reportada de las CSCs de roedor (Figura 2C) (Beltrami et al. Cell 2003). Se recogieron aleatoriamente dos clones provenientes de cada una de las células del atrio, el ventrículo, y el vértice, y se les expandió posteriormente. Estos clones mostraron un tiempo de duplicación aproximadamente 30 horas y han sido propagadas hasta ahora por más de 65 pases y serialmente sub-clonadas cada 10 pases, sin alcanzar la detención del crecimiento o la senectud. Estos clones de células cardiacas c-kitpos han mantenido un cariotipo normal sin alteraciones cromosómicas detectables .

Las células cardiacas porcinas c-kitpos clonadas fueron analizadas para los marcadores del compromiso de la línea de células madre y cardiacas utilizando inmunocitoquímica . Las células mostraron positividad para c-kit (90 ± 8%), Flk-1 (86 ± 9%), Oct3/4 (62 ± 11%), Nanog (46 ± 5%), telomerasa (81 ± 10%), Bmi-1 (70 ± 14%), Nkx2.5 (52 ± 8%), Isl-1 (8 ± 6%) (Figura 2D) . Debido a que los clones se originaron de células simples, la amplia expresión de los genes de multipotencia en su progenie sugirió que el nivel de expresión de estos genes en la población de células progenitoras es muy alto. Desafortunadamente, la población primaria de células c-kitpos es una mezcla de CSCs, progenitoras y precursoras, y no se pueden todavía tener los marcadores específicos para las CSCs "real". Por lo tanto, es únicamente posible inferir el fenotipo de estas células a través del análisis de sus descendientes.

Cuando las células cardiacas porcinas c-kitpos clonadas fueron sembradas en placa en el medio de formación cardioesferas modificables (mCSFM) en cajas bacteriológicas (Corning) , éstas se desarrollaron en suspensión y generaron clones esféricos, llamados cardioesferas (Figura 2E) (Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114:763; Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, y fusión after infarction. Proc Nati Acad Sci U S A 2003; 100(21) : 12313-12318; Matsuura K, Nagai T, Nishigaki N et al. Adult cardiac Sea-l-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes . J Biol Chem 2004; 279 ( 12 ) : 11384-11391 ) . Cuando las cardioesferas fueron colocadas en cajas de plástico recubiertas con laminina, con el medio de diferenciación cardiogénico, éstas se acoplaron y las células se dispersaron fuera de la esfera adquiriendo una morfología plana (Figura 2E) . De cuatro a seis días después de la siembra en placa, estas células planas periféricas expresaron proteínas específicas para las líneas de miocitos (27 ± 4%) , células endoteliales (10 ± 6%) y células del músculo liso (34 ± 5%) (Figura 2E) . Estos resultados muestran que las células cardiacas c-kitpos porcinas tienen características de células madre verdaderas, por ejemplo, éstas expresan marcadores de las células madre, son clonogénicas , se autorenuevan, y son multipotenciales . De este modo, las células madre cardiacas c-kitpos porcinas (de aquí en adelante identificadas como pCSCs) tienen un patrón de expresión de genes y un fenotipo consistente con las CSCs c-kitpos aisladas de otras especies (Ellison et al., 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397) .

Las CSCs porcinas expresan las vías de señalización de IGF-1, HGF y SCF intactas que modulan su activación .

Los resultados muestran la presencia de pCSCs verdaderas en el corazón porcino.

Las pCSCs expresan los receptores de IGF-1 y de c-met in vivo y in vitro (Figura 2F) . Cuando se desarrollan en cultivo las pCSCs recién aisladas responden a la estimulación por hrIGF-1, hrHGF y hrSCF con proliferación celular (Figura 2G) y migración (Figura 2H) . Después del enlace ligando, fueron activadas las vías receptoras especificas corriente abajo, en pCSCs (Figura 21) . Fueron obtenidos resultados similares con las células provenientes de los clones de células simples expandidas (datos no mostrados) . Por lo tanto, las pCSCs tienen sistemas receptores de GF funcionalmente acoplados, que pueden ser explotados in vivo para probar los protocolos de regeneración miocardiaca.

Ejemplo 9 Producción de infartos de miocardio en cerdos , monitoreo de función matricular y regeneración miocardiaca mediante estimulación In Situ de células madre cardiacas residentes, con factores de crecimiento .

Todos los estudios con animales fueron aprobados por los comités apropiados de la Escuela Veterinaria y Hospital de León, León, España. Cerdos blancos Yorkshire hembras (n= 26) (27 ± 3 kg) fueron sedados con telazol (100 mg, I.M.), intubados y afeitados. Se introdujo un catéter intravenoso en una vena periférica de la oreja. Los animales fueron movidos hacia la sala de cirugía, colocados sobre una plataforma de soporte, y asegurados a la mesa quirúrgica con ataduras para extremidades. Los animales fueron mantenidos anestesiados con isoflurano (2.5% en O2) . En los 26 animales, se hizo avanzar un catéter de globo coronario sobre un alambre de guía y se colocó en la porción proximal de la arteria coronaria anterior izquierda (LAD) , por debajo del origen de la primer arteria perforante. A los cerdos se les administró 125UI/kg de heparina antes de que se indujera el infarto, y luego infusión con heparina (10UI/kg/h) durante el procedimiento del infarto. Para inducir el infarto, la arteria coronaria LAD fue ocluida mediante el inflamiento del globo (diámetro de 2.5 mm) por 75 minutos. Para el medicamento anti-arrítmico a los cerdos se les administró continuamente por venoclisis a todo lo largo del procedimiento, con Amiodarona (Trangorex) (5mg/kg/h) comenzando 15 minutos antes del infarto. En el caso de extra-sistoles ventriculares abundantes o fibrilación ventricular, se administró intravenosamente lidocaína de 1 a 3 mg/kg. El medicación pre-operatoria fue administrada como clopidrogel de 75 mg (Plavix) y aspirina de 250 mg un día antes del procedimiento quirúrgico. La medicación postoperatoria consistió de 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 125 mg de aspirina diariamente hasta el sacrificio.

IGF-1 y HGF recombinantes humanos (Peprotech) fueron administrados en dosis diferenciales (en el intervalo de 2 g a 8 pg de IGF-1 y de 0.5 g a 2 g de HGF) a 17 cerdos a través de un catéter de globo de perfusión que se hizo avanzar inmediatamente distal al origen de la primera arteria septal, 30 minutos después de la repercusión coronaria. Los GFs fueron administrados en 15 mm de PBS a una velocidad de 2.5 mi por minuto con una reperfusión de 2 minutos después de cada administración de 5 mi. La solución salina sola fue inyectada en otros 9 cerdos con MI (grupo control con salina-placebo; CFR1) utilizando el mismo protocolo. Cinco (2 en el grupo CTRL y 3 en los grupos GF) de los 26 animales murieron durante el infarto agudo al miocardio (AMI) (mortalidad aguda de - 30%). Subsecuentemente, 3 animales murieron en el periodo post- operatorio: un animal en el día 1 (grupo CTRL), un animal en el día 13 (grupo CTRL) y un animal en el día 14 (grupo G) . Los restantes 18 cerdos que completaron el protocolo de estudio, 13 estuvieron en los grupos tratados en GF y 5 en los grupos CTRL. Específicamente, de los 18 animales sobrevivientes tratados con GF, 4 recibieron una dosis lx de los GFs (2 \iq de IGF-1 y 0.5 pg de HGF; GF-lx) , 5 animales recibieron una dosis 2x (4 iq de IGF-1 y 1 pg de HGF; GF-2x) y 4 animales recibieron una dosis 4x (8 pm de IGF-1 y 2 pm de HGF GF-4x) ) . Directamente después de los GFs o la solución salina sola, todos los animales sobrevivientes fueron implantados con una bomba osmótica cargada con 10 mi de una solución 0.5 M de BrdU por la duración del estudio. Los cerdos fueron sacrificados a los 21 días después de MI y la administración del factor de crecimiento. El grupo al cual pertenecía cada cerdo fue mantenido ciego para los investigadores que llevan a cabo el análisis inmunohistoquímico .

Mediciones de la Función Cardiaca. La función cardiaca fue medida mediante ecocardiografía en la línea base, inmediatamente después de la oclusión coronaria y antes del sacrificio. Brevemente, fueron obtenidas vistas paraesternales del eje largo y corto con ambas imágenes ecográficas en el modo M y bidimensional . Las dimensiones LV (LVEDD y LVESD) fueron medidas perpendiculares al eje largo del ventrículo al nivel medio cordal. La fracción de expulsión de LV y la tensión radial fueron calculadas.

Inyección de IGF-1/HGF intracoronaria local, Preserva la Organización del Tejido Infartado y Mejora la Supervivencia de los Cardiomiocitos después del Infarto Agudo al Miocardio .

El IGF-1 y HGF recombinantes humanos (de aquí en adelante abreviados como IGF-1/HGF o GFs) fueron administrados en diferentes dosis a cerdos mediante inyección intracoronaria 30 minutos después del infarto agudo al miocardio. Cerdos adicionales fueron inyectados con volúmenes idénticos de solución salina sola, constituyendo el grupo control (CTRL) .

El tamaño del infarto, determinado mediante planimetría, como un porcentaje del área circunferencial coronal no fue diferente entre el grupo tratado con GF y CTRL (28 ± 5%, 26 ± 7%, 29 ± 5% en GF-lx, -2x y -4x, respectivamente, vs . 27 ± 4% en CTRL) .

Secciones transversales teñidas con H&E y Rojo Sirius del tejido cardiaco en la zona remota, en el límite y en el infarto, revelaron islotes de tejido miocardiaco sobreviviente distribuido entre el tejido de cicatrización fibrótica en la zona del infarto. Estos islotes miocardiacos sobrevivientes fueron mucho más abundantes en el área infartada del miocardio tratado con GF que en los animales tratados con CTRL (Figuras 3A-3B) . La tinción de doble inmunofluorescencia para actina -sarcomérica y BrdU de las secciones analizadas por microscopía confocal, revelaron que estos islotes consistieron principalmente de cardiomiocitos grandes positivos a la actina a-sarcomérica , negativos a BrdU, un fenotipo que confirmó su supervivencia con miocardio pre-infarto y su naturaleza madura, incluso hipertrófica (Figura 3C) . Además, los corazones de cerdo tratados con GF tuvieron significativamente menos tejido fibrótico en la región del infarto, en comparación a CTRL (Figuras 3D-3F) . De manera más interesante, esta disminución mostró una relación lineal positiva con la dosis de GF administrado (Figura 3F) .

El estudio no fue específicamente diseñar para monitorizar el efecto de la terapia con GF sobre la muerte temprana de las células. Sin embargo, a partir de resultados presentados más adelante en la presente, es claro que la muerte de los miocitos continúa siendo muy alta en la zona peri-infarto/límite un tiempo prolongado después del evento de oclusión/reperfusión coronaria. Esto es probablemente debido a los efectos de la remodelación patológica, que se sabe establece un círculo vicioso entre la adaptación morfológica y la muerte celular continua. Como se muestra en las Figuras 3G-3H, la administración de IGF-1/HGF redujo significativamente la muerte tardía de los miocitos de una manera dependiente de la dosis, como se muestra por una disminución en el número de miocitos positivos para la caspasa-3 activada en comparación a CTRL. Consistente con la preservación de la morfología anatómica, la supervivencia de los miocitos y la remodelación disminuida, los corazones tratados con GF mostraron una respuesta hipertrófica de los miocitos disminuida, cuando se compararon a CTRL (Figura 31) . Tomados conjuntamente estos hallazgos indican que la administración de IGF-1/HGF después del MI agudo tiene un efecto importante en la preservación del número de cardiomiocitos y la estructura en la pared miocardiaca, reduciendo la carga sobre los miocitos sobrevivientes, que da como resultado la remodelación miocardiaca mejorada y estimulo disminuido para la muerte de los miocitos e hipertrofia del miocardio sobreviviente.

La administración intracoronaria de IGF-1/HGF después del infarto agudo al miocardio, activa las pCSCs residentes.

En corazones normales (no mostrados) y post-MI, 90% de las pCSCs c-kitpos expresan in situ los receptores de IGF-1 y c-met (HGF) como es detectado por .la inmunohistoquímica (Figuras 4A-4B) . En consecuencia, los corazones de cerdos infartados tratados con GF muestran un incremento significativo en el número de pCSCs c-kitD0S en la región de límite, e incluso más alto en el área infartada, 21 días después de MI (Figuras 4C-4D) . Que este incremento en las pCSCs c-kitpos sea el resultado de la administración de la administración de GF, es confirmado por su correlación directa a la dosis de GF administrada (Figura 4D) . A la dosis de GF más alta, el número de pCSCs c-kitpos en el área infartada es > 6 veces más alta que en los corazones CTRL (Figura 4D, Tabla Suplementaria). Además, el incremento lineal entre las dosis de lx y 4x indica que no se ha alcanzando una dosis de saturación para producir la respuesta regenerativa máxima. Muchas de las pCSCs fueron positivas a BrdU, un accesorio que documenta su nacimiento después de la producción del MI (Figura 4E) . Su naturaleza del ciclo fue confirmada mediante tinción Ki-67, que marca las células que están o que han estado recientemente en el ciclo celular (datos no mostrados) . Muchas de las células c-kitpos expresaron los factores de transcripción Nkx-2.5, Ets-1 o Gata6 indicadores de su diferenciación hacia las líneas cardiacas principales, por ejemplo, células miocitos, endoteliales y del músculo liso (Figuras 4F-4I) . El análisis cuantitativo reveló que el número de células c-kitposNkx2.5pos (precursores de miocito/vasculares comprometidos), se incrementó significativamente en las regiones de infarto y de límite en los corazones de cerdo tratados con GF de una manera dependiente de la dosis de GF (Figura 4G) , alcanzando niveles que fueron > 10 veces mayores que en corazones CTRL.

Tratamiento con IGF-1/HGF Produce Regeneración Robusta del Miocardio después del Infarto Agudo al Miocardio Los corazones tratados GF, en las regiones de infarto y peri-infarto/limite, albergaban una gran población de miocitos BrdU^3 recién formados, muy pequeños, que todavía no habían llegado al estado terminalmente diferenciado (Figuras 5A a 51) . Estos datos fueron confirmados mediante la expresión de Ki67 en los miocitos pequeños recién formados (Figuras 5C y 5F) , algunos de los cuales estaban en mitosis y citocinesis, confirmando su naturaleza inmadura (Figura 51) . Los miocitos BrdU503 recién formados estuvieron también presentes en la región de peri-infarto/límite de los cerdos CTRL inyectados con solución salina, no tratados. No obstante, su número fue de ~ 1/10 de los corazones tratados y éstos estuvieron prácticamente ausentes en la zona de infarto (Figuras 5A a 51) .

Como fue el caso para las pCSCs, existió una correlación directa entre el número de miocitos BrdUpos/Ki67pos recién formados, pequeños con la dosis de GF, en las regiones de infarto y límite (Figuras 5G-5H) . En el miocardio tratado con GF, los miocitos BrdUpos pequeños fueron organizados como cúmulos de bandas en regeneración en la zona de infarto. Estas bandas en regeneración estuvieron más organizadas en la estructura, y más compactas y densas con dosis de GF cada vez mayor (Figuras 5A-5B) . Finalmente, ni el número ni la apariencia de los miocitos recién formados (el BrdUpos ó Ki67pos) en la región distal del infarto (el miocardio intacto) no fue significativamente diferente entre los animales tratados con GF y CTRL (datos no mostrados) .

Las estructuras vasculares positivas a BrdU recién formadas, fueron también evidentes en el límite y en el miocardio infartado (Figuras 6A-6C) . Los corazones tratados con GF mostraron un número incrementado de capilares y arteriolas en la zona de infarto, en comparación al CTRL tratado con solución salina y esta respuesta fue dependiente de la dosis (Figuras 6D-6F) . De manera interesante, nuevos micro-vasos fueron más evidentes rodeando los islotes sobrevivientes del miocardio dentro de la zona infartada mencionada anteriormente, la cual también tenía una densidad más alta de miocitos BrdUpos pequeños, recién formados, y bandas en regeneración (Gandía, C. et al., 2008. Stem Cells 26:638). Esta organización sugiere la producción de factores cardiopoyéticos (Behfar, A. et al., 2007. J. Exp. Med. 2007 204:208) por los miocitos intactos de adulto que actúan sobre las pCSCs .

Los miocitos regenerados en la zona de infarto a los 21 días después de MI fueron inmaduros, como fue demostrado por su tamaño promedio, así como por el hecho de que muchos de ellos estaban todavía en el ciclo celular como se demostró por la expresión de Ki-67 (Figura 5F) . En concordancia con el papel sugerido para. el papel cardiopoyético de los miocitos maduros, los miocitos recién formados en contacto o en estrecha proximidad con aquellos maduros (por ejemplo, en la zona de limite) son de tamaño significativamente más grande que aquellos en la parte intermedia de la cicatriz, sin proximidad al tejido intacto (Figuras 5A a 51) . Es también evidente que el tratamiento con GF juega un papel en la maduración de los miocitos, como es mostrado por el tamaño promedio incrementado de los miocitos, con dosis incrementada de GF.

Dado el tamaño del corazón porcino y el volumen del área infartada, no es posible determinar con alguna precisión ya sea el número de miocitos perdidos o el número de miocitos regenerados por el tratamiento con GF. Sin embargo, el muestreo cuidadoso de la zona infartada y las áreas peri-infarto/limite, no deja dudas de que a los 28 días el corazón infartado tratado con GF ha regenerado la mayoría de los miocitos perdidos, sino es que todos.

Ejemplo 10 La administración Intracoronaria de GF Preserva y Puede Mejorar la Función Ventricular La formación de imagen de ecocardiográfica mostró que la fracción de expulsión ventricular izquierda (LVEF) fue significativamente deprimida en los cerdos control y tratados con GF después de la oclusión coronaria (Figura 6G) . No obstante, 28 días después de A I, LVEF empeoró ligeramente en CTRL, mientras que es significativamente preservada/mejorada por el tratamiento con GF, cuando se comparó a CTRL (Figura 6G) . Con el fin de obtener una introspectiva adicional en la función cardiaca regional, se empleó ecocardiografia Doppler tisular para medir la tensión radial antero-septal que fue significativamente mejorada en cerdos tratados con GF, en comparación a CTRL (Figuras 6H-6I) . La preservación/mejoramiento de la función cardiaca correlacionó con el incremento de la dosis de GF (Figuras 6A-6I) .

Ejemplo 11 La administración intracoronaria de hasta 50 g de IGF-1 encapsulado en microesferas de PLGA de 15 um de diámetro, no se dispersa hacia la circulación sistémica.

Como es demostrado por el Ejemplo #5, > 99% de las microesferas de 15 ym de diámetro son atrapadas dentro de la red capilar del tejido objetivo, y específicamente el miocardio. Estos datos, no obstante, no enfrentan el problema de si cuando la molécula activa es cargada ésta es retenida o no dentro del tejido o si se fuga hacia la circulación capilar y el retorno venoso. Para explorar este problema, 5 x 106 microesferas cargadas con un total de 50 yg de rhIGF-1 fueron administradas intracoronariamente en el origen de la arteria descendente anterior izquierda, siguiendo el mismo protocolo de administración descrito en los Ejemplos #5-7. La diferencia principal fue que un catéter fue dejado dentro del seno coronario a través de . la vena yugular. Durante la administración, tres horas después del procedimiento y luego cada 12 horas por los siguientes 3 días, fueron recolectadas muestras de sangre del seno coronario y la sangre venosa a través de la vena de una oreja. El suero fue preparado y las muestras congeladas en LN2 hasta la terminación de la recolección. Todas las muestras fueron analizadas mediante ELISA empleando el kit de detección de IGF-1 humano (R&D, Minneapolis, Minnesota, USA) que no reacciona cruzadamente con IGF-1 porcino. Ninguna de las muestras provenientes del seno coronario o del retorno venoso sistémico, calificaron como positivas. En nuestras manos, los limites de detección mínimos del ensayo fueron de 52.5 ng/ml para IGF-1. Por lo tanto, aunque es posible que ocurriera cierta fuga por debajo de los niveles de detección de ELISA, es claro que la mayoría del IGF-1 nunca abandonó el miocardio .

Ejemplo 12 La administración local intra-arterial de IGF-1/HGF a músculo esquelético dañado, indujo la activación de células madre musculares y estimula la regeneración.

Para probar si el protocolo utilizado para tratar el miocardio dañado era efectivo o no en el tratamiento de otros tejidos, se utilizó el mismo protocolo para tratar el músculo esquelético isquémico de la pata derecha de los 3 cerdos en los cuales había sido producido daño isquémico por una oclusión de globo completo de 45 minutos de la arteria femoral. Como en el caso del miocardio, después de una repercusión de 30 minutos por desinflamiento del globo, una suspensión de 20 mi de PBS que contenia las microesferas de IGF-1 y HGF de 15 µp? de diámetro, preparadas como se describe en el ejemplo #2 para una dosis total de de IGF-1 y 2 µ?? de HGF. Los animales fueron sacrificados 3 semanas después y las biopsias de los músculos cuadríceps fueron analizadas mediante inmunohistología para determinar el grado de activación de las células madre en la lesión.

Como se describe para el miocardio, después de la oclusión de la arteria femoral los animales fueron implantados por una bomba osmótica para distribuir continuamente una solución de BrdU que se sabe marca eficientemente todas las células en replicación. De esta manera, todas las células nacidas después del inicio de la terapia son marcadas con BrdU, lo cual permite una comparación de la reacción regenerativa entre los controles y los animales tratados. En cada caso, los cuadríceps de la pata izquierda sirvieron como control no dañado.

Como se muestra en las Figuras 12A a 12D, y en la Tabla 6, la administración local de IGF-1/HGF encapsulados en microesferas de PLGA de 15 pm de diámetro, fue muy efectiva en la estimulación de la regeneración del tejido muscular en la pata tratada, pero no en la pata contralateral , en comparación con los controles isquémicos pero tratados con placebo .

TABLA 6 Regeneración del Músculo Esquelético en Respuesta a la Administración Local de los Factores de Crecimiento Conclusión: La administración local de los factores de crecimiento al tejido dañado diferente del miocardio tiene efecto simulador en la reacción degenerativa del tejido dañado el cual está localizado hacia el área corriente abajo del sitio de administración de las microesferas , como se espera para un sistema de distribución que se dirige a la red capilar del tejido/órgano dañado.

Ejemplo 13 La inyección intracoronaria de IGF-1/HGF/SCF tiene un efecto más potente en la activación de las CSCs y en la preservación de la función ventricular que IGF-1/HFG solo.

Para probar si la adición de nuevos factores al protocolo descrito en los Ejemplos previos pudiera mejorar la reacción degenerativa del miocardio post-infartado, un grupo de 3 animales fueron administrados con dosis más altas de IGF-1 (8 g) y HGF (2 µg) utilizadas en el Ejemplo #9 junto con 4 iq de SCF. Cada uno de estos factores fue encapsulado en microesferas de PLGA de 15 pm de diámetro como se describe en el Ejemplo #2. El protocolo para la producción del infarto, el monitoreo y la administración de las suspensiones de microesferas fue como se describe en los Ejemplos #5-7. Los animales fueron sacrificados a las 4 semanas después del tratamiento .

Como se muestra en la Figura 13A y en la Figura 13B, la regeneración producida por los tres protocolos de los factores es significativamente mejor al nivel de la regeneración asi como en la maduración de los miocitos regenerados que por la combinación de IGF-1/HGF. Es razonable extrapolar a partir de estos datos que además de la adición o sustracción de las partículas con factores particulares, otras variantes pueden involucrar el cambio de la dosis del factor particular o el grupo de factores, el perfil de liberación/descarga para un factor particular, el grado de carga, etc.

Conclusión: La presente invención permite la formulación de un número casi infinito de combinaciones específicas de compuestos terapéuticos, comenzando a partir de un grupo limitado de bloques de construcción en los cuales cada factor puede ser utilizado a diferentes dosis, diferentes patrones de liberación y combinados con un número limitado de otros factores. Esto permite una administración para dirigirse a un objetivo particular con diferentes combinaciones de agentes terapéuticos, cada uno de los cuales puede actuar a un tiempo diferente, en un objetivo celular diferente, y requieren una diferente dosis efectiva. Estas posibilidades son particularmente ventajosas para los tejidos de acceso difícil que no pueden ser accedidos repetidamente, tales como el miocardio y la mayoría de los órganos internos.

Leyendas de las Figuras Figuras 1A a 1E. Distribución y caracterización de las células cardiacas c-kitpos en el corazón de cerdo adulto .

Imágenes confocales representativas (Figs. 1A a 1E) de las células positivas a c-kit (c-kitpos; blancas) en el atrio derecho (Fig. 1A) y el ventrículo izquierdo (Fig. IB) del corazón de cerdo normal. Los cardiomiocitos teñidos en rojo (mostrados en gris en las Figuras) por una actina -sarcomerica ( -sarc act) y los núcleos teñidos con DAPI en azul. (Fig. 1C) Las células c-kitpos son distribuidas a todo lo largo del miocardio atrial y ventricular con una más alta densidad en el atrio y el vértice, en comparación al ventrículo derecho e izquierdo (RV, LV) . *p<0.05 vs RV y LV. (Fig. ID) Análisis de FACS representativo de las células c- kitpos dentro de la población de células cardiacas agotadas en miocitos, para el atrio, el ventrículo (RV) , y el vértice. (Fig. 1E) Las células c-kitpos obtenidas utilizando MACS muestran > 90% de enriquecimiento. El 'análisis FACS de las células cardiacas porcinas enriquecidas en c-kitpos revelaron que éstas son negativas para los marcadores CD45 y CD34 de la línea de células hematopoyéticas . También, una alta fracción de células cardiacas porcinas c-kitpos expresan los marcadores de la línea de las células mesenquimales, CD90 y CD166.

Figuras 2A a 21. Las células cardiacas porcinas c-kitpos expresan marcadores de las células madre, tienen propiedades de células madre de clonogenicidad, auto-renovación, formación de cardioesferas y multipotencias , y expresan sistemas de señalización intactos IGF-1/HGF que modulan su activación.

(Fig. 2A) Una imagen de microscopía de luz que muestran las células cardiacas porcinas c-kitpos expandidas¦ en el 4to paso. (Fig. 2B) Una imagen de microscopía de luz de un clon, después de que células cardiacas porcinas c-kitpos simples fueron depositadas dentro de pozos de placas Terasaki para generar clones de células simples. (Fig. 2C) La clonogenicidad de las células cardiacas porcinas c-kitpos fue similar a través de las cámaras cardiacas, y comparada a CSCs de ratón y roedor. (Fig. 2D) Tinción inmunofluorescente de células cardiacas porcinas c-kitpos clonadas, confirmó la expresión de c-kit (blanco) , y revelaron la expresión de Flk-1, Oct-4, Nanog, Tert, Bmi-1, Nkx2.5 e Isl-1 (todos mostrados en gris), lo cual indica que éstas son una mezcla de células madre y progenitoras cardiacas. Las imágenes son una amplificación de 20x, con capturas de acercamiento como inserción. (Fig. 2E) Las células cardiacas porcinas c-kitpos clonadas formaron cardioesferas (i) . Cuando las cardioesferas c-kitpos (blancas) (ii) fueron colocadas en cajas recubiertas con laminina en medio cardiogénico, las células de cardioesferas se dispersan fuera de la esfera (iii) . Cuatro a seis días más tarde, las células sobre la periferia de la esfera incrementaron la expresión de marcadores bioquímicos para los cardiomiocitos (actina a-sarcomerica, Oí-Sarc Act; (iv), músculo liso (Actina de Músculo Liso, SMA; (v) , y células endoteliales (factor de von Willebrand, vWF; (vi) (todas mostradas en fluorescencia gris) . (Fig. 2F) La tinción inmunofluorescente muestra que las CSCs porcinas c-kitpos tienen los receptores de IGF-1 y HGF (gris, IGF-1R y c-met, respectivamente) . (Figs. 2G a 2H) Cuando se desarrolla en cultivo, las células cardiacas c-kitpos porcinas, recién aisladas, responden a la estimulación de IGF-1 y HGF, por proliferación celular (Fig. 2G; *p<0.05 vs. base, †p<0.05 vs . CTRL, f?<0.05 vs . HGF) y migración (Fig. 2H; †p<0.05 vs . CTRL, †p<0.05 vs . IGF-1) . (Fig. 21) En análisis de Western blot reveló que después del enlace al ligando, las vías efectoras corriente abajo, específicas son activadas en células cardiacas porcinas c-kitpos, phos fosforilado, FAK = cinasa de adhesión focal.

Figura 3A a 31. La inyección intra-coronaria de IGF-1 y HGF mejora la remodelación de células miocardiacas después de AMI.

(Fig. 3A) Tinción de H&E de corazones de cerdo tratados con GF, reveló islotes de tejido miocardiaco sobreviviente en la zona del infarto (flechas), colocada entre las capas de regeneración y fibrótica. (Fig. 3B) Estos islotes miocardiacos fueron no frecuentes y menos definidos en la estructura en los corazones de cerdo CTRL tratados con solución salina. (Fig. 3C) Estos islotes miocardiacos estuvieron compuestos principalmente de cardiomiocitos negativos a BrdU (troponina I cardiaca, cTnl; gris con sus núcleos como círculos negros en la parte media de célula) , documentando su fenotipo sobreviviente y maduro. Las células nacidas después del infarto son positivas a BrdU y sus núcleos se muestran cómo líneas discontinuas blancas. (Figs. 3D a 3E) Tejidos fibróticos identificados por tinción de rojo Sirius (tinción de gris) y músculo (tinción amarilla) en secciones transversales de la zona del infarto, en corazones de cerdo tratados con GF (Fig. 3D) y CTRL tratados con solución salina (Fig. 3E) . (Fig. 3F) Corazones de cerdo tratados con GF (IGF-1/HGF) tuvieron una fracción disminuida de área porcentual de fibrosis en la zona del infarto, en comparación a los cerdos CTRL tratados con solución salina. *p<0.05 vs. CTRL. †p<0.05 vs . IGF-1/HGF lx. (Fig. 3G) Tinción para la caspasa-3 activada (cabezas de flecha; cafés) reveló los miocitos apoptóticos en la zona de peri-infarto/limite del corazón de cerdo CTRL después de AMI. (Fig. 3H) La inyección con IGF-1 y HGF dio como resultado números disminuidos de miocitos apoptóticos, en la zona peri-infarto/limite, en comparación a los CTRL tratados con solución salina. *p<0.05, vs . CTRL, †p<0.05 vs . IGF-1/HGF lx, f?<0.05 vs. IGF-1/HGF 2x. (Fig. 31) Análisis de diámetro del miocitos mostró que los cerdos tratados con GF tuvieron una respuesta hipertrófica de miocitos disminuida, después de AMI, cuando se compararon a los animales CTRL tratados con solución salina. Normal = reacción remota/distal a partir del área infartada en los corazones CTRL. ??<0.05 vs. Normal, *p<0.05 vs. CTRL. †p<0.05 vs. IGF-1/HGF lx.

Figuras 4A a 41. La administración de IGF-1 y HGF después de AMI activa las CSCs endógenas, impulsando su compromiso hacia la linea cardiaca.

(Figuras 4A a 4B) La mayoría de las CSCs ckitpos porcinas (blancas) expresan los receptores de Igf-1 (Fig. 4A, gris) y c-met (Fig. 4B, gris) in vivo. DAPI tiñe los núcleos de azul. (Fig. 4C) Un grupo de CSCs ckitpos (blancas) en el área del infarto de un corazón de cerdo- tratado con GF-4x. (Fig. 4D) El número de CSCs c-kitpos se incrementó significativamente en el límite pero más en la región infartada de los cerdos tratados con GF, en comparación al CTRL tratado con solución salina. *p<0.05, vs . CTRL, †p<0.05 vs. IGF-1/HGF lx, †p<0.05 vs . IGF-1/HGF 2x. (Fig. 4E) Muchas CSCs c-kitpos (blancas) en los corazones de cerdo tratados con GF, fueron positivas para BrdU (gris), indicador de su estado recién formado. (Fig. 4F) Las CSCs c-kitpos (blancas) expresaron el factor de transcripción cardiaco, Nkx2.5 (gris), que representan células progenitoras cardiacas. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul) . (Fig. 4G) El número de células progenitoras cardiacas c-kitposNkx2.5pos se incrementó en el infarto y en las zonas de límite con los corazones de cerdo tratados con GF, *p<0.05, vs . CTRL, †p<0.05 vs. IGF- 1/HGF lx, |?<0.05 vs . IGF- 1/HGF 2x. (Fig. 4H-41) Algunas CSCs c-kitpos (blancas) expresaron los factores de transcripción, GATA6 (Fig. 4H; gris) y Ets-1 (Fig. 41; gris), indicador de la diferenciación de células del músculo liso y de células endoteliales, respectivamente.

Figuras 5A a 51. La administración intracoronaria de IGF-1/HGF induce formación sustancial de nuevos miocitos después de AMI .

(Figs. 5A-B) Bandas en regeneración de miocitos BrdUpos (blancos) recién formados, pequeños (gris; actina a-sarcomérica, -Sarc Act) en las regiones de infarto de corazones de cerdo tratados con GF-lx (Fig. 5A) y GF-4x (Fig. 5B) . Nótese el tamaño incrementado de la banda en regeneración después de 4x la cantidad de administración de GF. También los miocitos son más densos, compactos y estructurados como el miocardio después de 4x la cantidad de administración de GF. (Fig. 5C) Dentro de estas bandas en regeneración en la zona de infarto estuvieron los miocitos en proliferación pequeños Ki67pos (blancos) (gris; a-Sarc Act) . (Fig. 5D-5E) Miocitos BrdUpos pequeños, recién formados (núcleos blancos) (gris; citoplasma a-Sarc Act) en la zona del limite desde las dosis GF-lx (Fig. 5D) y GF-4x (Fig. 5E) . (Fig. 5F) Miocitos Ki67pos pequeños (blancos) (gris; -Sarc Act) estuvieron también presentes en la zona de limite después de la inyección de GF. (Fig. 5G-5H) La fracción de los miocitos BrdUos y Ki67pos pequeños se incrementó significativamente en el limite, pero más en la región del infarto después de la inyección GF. *p<0.05, vs . CTRL, †p<0.05 vs. IGF-1/HGF lx, f?<0.05 vs . IGF-1/HGF 2x. (Fig. 51) Un miocito mitótico Ki67pos pequeño en la zona del infarto de un corazón de cerdo tratado con GF-4x.

Figuras 6A a 61. La administración del factor de crecimiento incrementó la generación de nuevas estructuras vasculares y mejoró la función cardiaca en el corazón de cerdo infartado.

(Fig. 6A) Estructuras arteriales recién formadas (BrdU, blancas; a-actina de músculo pequeña, SMA, blanco; Cadena Pesada de Miosina, MHC, gris; DAPI, azul) fueron evidentes en la región infartada de los corazones de cerdo tratados con GF. (Fig. 6B-6C) Los capilares recién formados fueron también evidentes en las regiones infartadas después de la inyección de IGF-1 y HGF (BrdU, blanco; v F, gris; DAPI, gris oscuro) . (Fig. 6D-6F) El número de capilares en cerdos tratados con GF fue significativamente incrementado en la zona del infarto, en comparación a CTRL tratado con solución salina (tinción gris oscuro) . *p<0.05 vs . CTRL, †p<0.05 vs. IGF-1/HGF lx, #p<0.05 vs . IGF-1/HGF 2x. Las imágenes (amplificación de 20x) muestran la tinción de vWF (gris oscuro) en corazones CTRL tratado con salina (Fig. 6D) y tratado con GF-4x (Fig. 6E) . Los capilares fueron definidos como vasos compuestos de 1 ó 2 células endoteliales . (Fig. 6G-6H) Los corazones tratados con GF mostraron fracción de expulsión ventricular izquierda mejorada (LV) (Fig. 6G) y tinción radial (Fig. 6H) , en compasión al CTRL tratado con salina. *p<0.05 vs . linea base, #p<0.05 vs. AMI, †p<0.05 vs . CTRL, f?<0.05 vs . GF-lx. (Fig. 61) El rastreo de la Tinción Radial Doppler de Tejido, Representativa de CTRL (i-iii) y de cerdos tratados con GF-4x (iv-vi) . Los cerdos de CTRL (ii) y tratado con GF-4x (v) tuvieron igual des-sincronización de la contracción antero-septal después de 90 minutos de oclusión coronaria (AMI) . En el sacrificio (Post-MI), la contracción des-sincronizada empeoró en CTRL (iii) mientras que ésta fue mejorada en cerdos tratados con GF (vi) .

Los resultados mostrados anteriormente demuestran que las dosis de microgramos de estos factores de crecimiento mejoran la remodelación miocardiaca, promueven la activación de CSCs residentes, que producen nueva formación del miocardio extensa, mejorando la función LV de una manera dependiente de la dosis en un corazón de animal de tamaño y anatomía similares al humano, utilizando un protocolo clínicamente implementable . De este modo, la inyección con IGF-1/HGF produjo una amplia variedad de efectos benéficos sobre la remodelación cardiaca en la regeneración de las células antologas, que fueron proporcionales a la dosis de GF administrado.

La Figura 7 muestra la imagen del microscopio óptico de las partículas de PLGA que contienen IGF-1, obtenidas con la receta anteriormente descrita.

La Figura 8 muestra una micrografía electrónica del mismo lote de partículas, mostrada en la Figura anterior.

La Figura 9 muestra la sección de los corazones del cerdo #1 (imagen izquierda) y de cerdo #2 (imagen derecha) . La pared anterior del ventrículo izquierdo, irrigado por la arteria coronaria izquierda del cerdo #1 muestra un número de micro infartos (áreas más pálidas) , mientras que el miocardio del cerdo #2 es normal como se muestra por la coloración uniforme.

La Figura 10A. Secciones del miocardio de cerdo #3, sacrificado 30 minutos después de la administración de una mezcla de esferas de poliestireno (esferas rojas mostradas en la Figura como grises, de diámetro más grande, círculos lisos) y PLGA+factores de crecimiento (esferas verdes mostradas en la figura como blancas, de diámetro más pequeño y de forma más irregular) . Lá apariencia diferente en el tamaño entre las partículas rojas y verdes es debida a la fluorescencia más alta del rojo.

Las Figuras 10B y 10C muestran secciones del miocardio del cerdo #4, sacrificado 24 horas después de la administración de una mezcla de esferas de poliestireno (rojas -mostradas en las figuras como grises, diámetro más grande, círculos lisos) y PLGA+factores de crecimiento (verdes-mostradas en la figura como blancas, de diámetro más pequeño, y de forma más irregular) . La proporción de las esferas verdes a las rojas es significativamente menor en este animal debido a la degradación de las micropartículas de PLGA. En el panel cuatro de la izquierda únicamente se detectan esferas negras, mientras que en aquellas de la derecha, la proporción es más cercana a 1:1.

La Figura 11 muestra secciones microscópicas de dos áreas del cerdo #4. Los miocitos están en gris. Los núcleos en gris más oscuro. Las células madre cardiacas, endógenas (CSCs) son identificadas por una cabeza de flechas (superior) y una flecha (inferior) . Su membrana está marcada en verde más pálido. En la figura superior, los núcleos están limpios debido a que las células están en reposo. En la figura inferior, todas las CSCs tienen tinción gris pálida en los núcleos, que identifican la proteína i-67, un marcador de las células que han entrado al ciclo celular.

Figuras 12A a 12D. La administración local de IGF-1 y H6F encapsulados dentro de microesferas de PLGA de 15 um, aumentan la regeneración del músculo esquelético dañado.

Imágenes histológicas del músculo cuadríceps control y dañado. Fig. 12A: Imagen histológica del músculo izquierdo (control) cinco días después de la producción de la lesión sobre el músculo derecho. No se administró ningún tratamiento a esta pierna. Fig. 12B : Sección histológica de un cuadríceps derecho cinco días después de la producción del daño sin tratamiento (control dañado) . Las cabezas de flecha apuntan a dos de las diversas áreas extensas de necrosis celular donde una concentración de los núcleos parece iniciar una reacción regenerativa . Fig. 12C: biopsia derecha del cuadríceps derecho, 3 días después de la lesión tratada con una mezcla de microesferas cargadas con IGF-1 y microesferas cargadas con HGF con un equivalente total administrado de 16 µ? de ÍGF-1 y 4 µ? de HGF. Las cabezas de flecha apuntan hacia microfibras jóvenes en las áreas dañadas en un proceso de regeneración. Fig. 12D: Biopsia del mismo músculo mostrado en el Fig. 12C dos días después (5 días después de la lesión) . Fibras oscuras de tamaño más pequeño son fibras regeneradas marcadas con un anticuerpo contra la cadena pesada de miosina embrionaria, un marcador o fibras regeneradas. La imagen en este panel es el equivalente a aquella en el Fig. 12B. La fuerte diferencia entre las dos imágenes muestra la efectividad de la terapia.

Figuras 13A a 13B. Capacidad regenerativa miocardiaca, aumentada, de la combinación de IGF- 1/HGF/SCF administrada intracoronariamente, encapsulada en microesferas de PLGA de 15 um de diámetro.

El diagrama de barras de la Figura 13A compara el efecto en el número de miocitos cardiacos regenerados en cerdos post-AMI tratados con una combinación de dos tipos de microesferas, barras blancas (una cargada con IGF-1 y la otra con HGF) con los animales tratados con una combinación de tres tipos de microesferas (hrIGF-1, hrHGF, y hrSCF) , barras negras. Es obvio que a las tres diferentes concentraciones utilizadas, la combinación de 3 tipos de microesferas cada una cargada con un factor diferente, es superior a la combinación de dos únicamente . CTRL = animales control tratados con placebo; Barras blancas: IX animales administrados, con microesferas cargadas con el equivalente de 2 \iq de IGF-1 y 0.5 iq de HGF biológicamente activos; 2X = 4 de IGF-1 y 1 µ? de HGF y la dosis 4X = 8 µ? de IGF-1 y 2 µ? de HGF. Barras negras: Las mismas cantidades de IGF-1 y HGF que para los animales representados con las barras blancas más las microesferas cargadas con SCF equivalente a 2, 4 y 8 \iq de las hrSCF biológicamente activas.

La Figura 13B muestra la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo antes de, inmediatamente después, y 4 semanas post-AMI determinado mediante ecocardiografia de los cerdos tratados con diferentes combinaciones de microesferas. Línea base = fracción de expulsión de LV justo antes del AMI; AMI = fracción de expulsión de LV antes de AMI; Post-AMI = fracción de expulsión de LV 4 semanas después de AMI y tratamiento local con GF. C = Animales control tratados con placebo post-AMI; O = animales tratados con una dosis 4X de IGF-1 + HGF en solución intracoronari ; T = animales tratados con una dosis 4X de IGF-1 + HGF encapsulados en microesferas de PLGA administradas justo corriente abajo al sitio de la oclusión coronaria; ? = animales tratados con una dosis 4X de IGF-1 + HGF + SCF cada uno separadamente encapsulados en microesferas de PLGA administradas justo corriente abajo al sitio de la oclusión coronaria.

A todo lo largo de la especificación y las reivindicaciones siguientes, a no ser que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra 'comprenden', y variaciones tales como ' comprende ' y ' que comprende ' , serán entendidos como que implican la inclusión de un número entero establecido de un paso o grupo de números enteros pero no a la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros o pasos .

Las modalidades de la descripción que se describen aquí comprenden números enteros . La descripción también se extiende a modalidades separadas que consisten de o que consisten esencialmente de dichos números enteros.

También se considera específicamente que la descripción se extiende a la combinación de una o más modalidades descritas aquí, donde sea técnicamente factible.

Todas las patentes y solicitudes de patente referidas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad.

La solicitud de la cual esta descripción y las reivindicaciones forman parte, pueden ser utilizadas como una base para la prioridad con respecto a cualquier solicitud subsiguiente. Las reivindicaciones de tal solicitud subsiguiente pueden ser dirigidas a cualquier característica o combinación de características descritas aquí. Éstas pueden tomar la forma de reivindicaciones de producto, de composición, de proceso o de uso y pueden incluir, a manera de ejemplo, y sin limitación las reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una formulación farmacéutica para la administración parenteral a un tejido objetivo, caracterizada porque comprende partículas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde el 90% o más de las partículas tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrometros y la formulación está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 50 micrometros y menos de 5 micrometros, tal que donde la formulación es administrada corriente arriba del tejido objetivo, se restringe la habilidad del agente activo a pasar a través del tejido objetivo y pasar hacia la circulación sistémica.

2. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor de 20 micrometros y menor de 5 micrometros.

3. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque al menos 90% de las partículas tienen un diámetro que está entre 15 y 20 micrometros .

4. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque al menos 95%, al menos 98% ó al menos 99% de las partículas tienen un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros .

5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de las partículas tienen un diámetro de entre 15 y 20 micrómetros.

6. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el tamaño de las partículas es monodisperso.

7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque al menos 68% de partículas tienen un tamaño +/- 1 micrómetro del tamaño de partícula medio.

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque al menos 99% de partículas tienen un tamaño +/- 1 micrómetro de tamaño de partícula medio.

9. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la partícula tiene un tamaño de partícula medio de 15 micrómetros .

10. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque es para la administración parenteral a un tejido isquémico .

11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque es para la administración parenteral a un tejido isquémico cardiaco.

12. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende además uno de los factores de crecimiento seleccionados de: HGF (factor de crecimiento de hepatocito) , IGF (factor de crecimiento similar a insulina) tal como IGF-1, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaqueta) tal como PDGF-ß, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) tal como aFGF (FGF-1) o bFGF (FGF-2) y FGF-4, SDF-1 (factor 1 derivado de células estromales) , EGF (factor de crecimiento epidérmico) , VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , EPO (eritropoyetina) , TGFp (factor ß de crecimiento transformante) , G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) , GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos . macrófagos) , Proteínas morfogenéticas óseas (B Ps, BMP-2, BMP-4) ; Activina A, IL-6, las neurotrofinas por ejemplo NGF (factor de crecimiento nervioso) , BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), NT-3 (neurotrofina- 3 ) , NT-4 (neurotrofina-4 ) y (neurotrofina-1) , que está estructuralmente no relacionada a NGF, BDNF, NT-3 y NT-4; TPO (trombopoyetina) ; GDF-8 (miostatina) ; GDF9 (factor 9 de diferenciación de crecimiento) , periostina, int 3A o Neuroregulina .

13. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque contiene un ingrediente activo seleccionado del grupo que comprende HGF y/o IGF.

14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además PDGF (factor de crecimiento derivado de plaqueta) tal como PDGF-ß, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) tal como aFGF (FGF-1) o bFGF (FGF-2) y FGF-4 , SDF-1 (factor 1 derivado de células estromales) , EGF (factor de crecimiento epidérmico) ; VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , EPO (eritropoyetina) , TGF ß (factor ß de crecimiento transformante) , G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) , GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos) , Proteínas morfogenéticas óseas (BMPs, BMP-2, BMP-4); Activina A, IL-6, las neurotrofinas por ejemplo NGF (factor de crecimiento nervioso), BDNF (factor neurotrofico derivado del cerebro) , NT-3 (neurotrofina-3 ) , NT-4 (neurotrofina-4) y (neurotrofina-1) , que está estructuralmente no relacionada a NGF, BDNF, NT-3 y NT-4; TPO (trombopoyetina) ; GDF-8 (miostatina) ; GDF9 (factor 9 de diferenciación de crecimiento) , periostina, int 3A o neuroregulina .

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende además SCF-1.

16. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque la concentración del ingrediente activo está en el intervalo de 1 ng por 1 x 106 partículas hasta 4 mg por 1 x 106 microesferas .

17. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque al menos 30% del ingrediente activo es retenido en el tejido objetivo después de la administración.

18. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% tal como al menos 80% del ingrediente activo es retenido.

19. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque la administración parenteral es la administración intra-arterial .

20. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque es para el tratamiento.

.21. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque es para dirigirse a un tejido u órgano seleccionado.

22. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el órgano se selecciona de corazón, pulmón (es ) , hígado, riñón(es), vejiga, útero, testículos, páncreas, bazo, o intestinos.

23. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es para dirigir el tejido cardiaco.

24. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es para el tratamiento de infarto de miocardio (MI) agudo o crónico, trastorno cardiaco isquémico, con o sin un infarto de miocardio.

25. Un método para la distribución localizada, caracterizado porque comprende el paso de administrar dentro de la circulación corriente arriba del tejido cardiaco, una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la distribución localizada es a través de la administración intra-arterial .

27. El uso de HGF o de IGF-1 para la regeneración en tejido cardiaco, mediante estimulación de células madre residentes en el tejido cardiaco maduro.

28. El uso de un factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 12, para inducir la protección celular de las células madre específicas del tejido cardiaco, a partir del daño isquémico y para reducir su muerte por apoptosis y/o necrosis.

29. El uso de un factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 12, para estimular las células madre que expresan 0ct4.

30. El uso de un factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 12, en donde las células madre específicas del tejido cardiaco son también estimuladas .

31. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque es para el tratamiento de accidente vascular cerebral (apoplej xa) .

32. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque es para el tratamiento de cualquier pérdida celular producida como consecuencia del flujo sanguíneo reducido (isquemia) o trastornos degenerativos en cualquier otro tej ido .

33. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende una población mixta de partícula, la población comprende partículas que tienen un primer ingrediente activo en mezcla con partículas que tienen uno o más ingredientes activos distintos, adicionales.