KR20110051212A - 10 내지 20 미크론의 직경을 갖는 미세구를 포함하는 비경구형 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예를 들어 표적 기관 또는 조직의 업스트림으로 투여하였을 때 제형화된 활성 성분으로 특정 조직 및/또는 기관(들)을 표적화하기에 적합한 약학 제형, 및 치료에서 상기 제형의 용도, 상기 제형을 투여하여 치료하는 방법 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학 제형은 표적 조직에 비경구 투여하기 위한 것으로, 활성 성분 및 생분해성 중합체 부형제를 함유하는 입자를 포함하되, 상기 입자의 90% 이상은 10 내지 20 미크론의 직경을 갖고 제형은 50 미크론 초과 및 5 미크론 미만의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림으로 투여되는 경우 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력이 제한된다.

Description

10 내지 20 미크론의 직경을 갖는 미세구를 포함하는 비경구형 조성물{PARENTERAL COMPOSITION COMPRISING MICROSPHERES WITH A DIAMETER BETWEEN 10 AND 20 MICRONS}

본 발명은 예를 들어 표적 기관 또는 조직의 업스트림으로 투여하였을 때 제형화된 활성 성분으로 특정 조직 및/또는 기관(들)을 표적화(targeting)하기에 적합한 약학 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료에서 상기 제형의 용도, 상기 제형을 투여하는 치료방법 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

특히 상이한 성장인자 및 사이토킨은 표적 조직에 활성 화합물의 국소 전달장치 예를 들어 카테터를 사용하여 상주줄기세포집단을 활성화함으로써 고체 조직의 내재적 재생능력을 자극하는데 사용된다.

대부분의 약제/약물은 전신적으로, 예를 들어 경구, 정맥내, 백신, 근육내 등으로 투여된다. 두드러진 예외는 활성 성분으로 코팅된 스텐트(stent), 폐에 직접 전달된 특정의 호흡성 제형, 표적 영역에 관한 특정 방사요법, 및 국소투여되는 특정한 피부병학, 안과학 및 이과학적(otological) 치료이다.

그럼에도 불구하고, 적절하게는 필요 용량을 감소시키고 또는 부작용을 최소화하기 때문에 약물을 기본적으로 병든 조직 또는 기관에 전달할 수 있는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접근법은 2가지의 주요한 의학 영역에 대해 유리하다: a) 특정 조직에서의 상주줄기세포의 성장 및 분화를 활성화할 수 있는 성장인자 및 사이토킨의 투여. 이들 분자의 강력한 생물학적 활성으로 인하여, 신체의 휴식에 대해 최소 또는 비과잉으로 그들의 작용을 의도된 조직으로 제한하는 것이 바람직하다; b) 종양성 조직이 특이적으로 표적화될 수 있는 경우 표적화된 세포에 고용량을 투여하면서 그의 지독한 독성 부작용을 적어도 상당한 정도로 최소화할 수 있다.

심장발작 및 뇌졸중과 같은 보다 급성인 상황에서 원활한 치료, 특히 침범당한(affected) 기관이 특이적으로 표적화되는 경우 손상된 조직을 재생시키는 것이 가능하다. 만성인 상황, 예를 들어 파킨슨병, 당뇨병, 또는 폐섬유증에서 결손세포유형(들)을 재구성할 수 있는 제제의 국부투여는 질병의 예후를 호전시키는 잠재력을 갖는다.

그러나, 치료학적으로 유효한 방식으로 표적 조직 또는 표적 기관을 표적화하는 활성 성분의 재생가능한 전달은 사용된 (부형제를 비롯한) 성분들, 그들의 물리적 특성, 용량 및 전달방식에 큰 영향을 준다.

도면의 간단한 설명

도 1은 성장한 돼지의 심장에서 c-kit^pos 심장세포의 분포 및 특징을 나타낸다.

도 2는 각종 팽창된 돼지 심장세포를 보여주는 광학현미경사진을 도시한다.

도 3은 GF-처리된 돼지 심장의 H&E 염색을 나타낸다.

도 4는 내인성 CSCs의 활성화 증거를 나타낸다.

도 5는 소형의 새로 형성된 세포의 재생대역을 도시한다.

도 6는 새로 형성된 조직의 각종 사진을 나타낸다.

도 7은 실시예 1에 따라 제조된 IGF-1을 갖는 PLGA 입자의 광학현미경사진을 도시한다.

도 8은 실시예 1에 따라 제조된 IGF-1을 갖는 PLGA 입자의 전자현미경사진을 도시한다.

도 9는 돼지 심장의 절편들을 나타낸다.

도 10은 폴리스티렌 미세구 또는 PLGA 및 성장인자 미세구의 투여후 돼지 심근의 절편들을 나타낸다.

도 11은 내인성 심장줄기세포가 밝게 비춰진 돼지 심장의 절편들을 도시한다.

도 12는 대조 및 손상된 사두근의 조직학적 사진을 나타낸다.

도 13a는 2가지 유형의 미세구의 조합으로 치료한 피그 포스트-AMI(pigs post-AMI)에서 재생된 심근세포의 수로 효과를 비교한 것이다.

도 13b는 이전, 직후 및 4주 포스트-AMI에 상이한 미세구의 조합으로 치료한 피그의 초음파검사에 의해서 측정된 좌심실 박출률을 나타낸다.

본 발명은 활성 성분 및 생분해성 중합체 부형제를 함유하는 입자를 포함하는 표적 조직에 대한 비경구, 특히 동맥내 투여를 위한 약학 제형을 제공하는 것으로, 상기 입자의 30% 이상은 25 미크론 이하의 직경을 갖고 상기 제형은 50 미크론 초과의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림으로 투여되는 경우 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력이 제한된다. 즉, 활성 성분은 표적 조직에 유지되는데 반해, 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력은 극도로 제한되거나 또는 소멸된다. 따라서, 본 발명의 특정한 양상에 있어서, 심장 조직에 비경구 투여하기 위한 약학 제형이 제공되며, 상기 약학 조성물은 활성 성분 및 생분해성 중합체 부형제를 함유하는 입자를 포함하되, 상기 입자의 90% 이상은 10 내지 20 미크론의 직경을 갖고 제형은 50 미크론 초과 및 5 미크론 미만의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림으로 투여되는 경우 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력이 제한된다. 한 양태에 있어서, 본 발명의 입자의 90% 이상은 15 내지 20 미크론의 직경을 갖는다.

본 발명의 한 양상에 있어서, 동맥조직에 대한 비경구, 예를 들어 동맥내 투여를 위한 약학 제형이 제공되며, 상기 약학 조성물은 HGF 및 IGF-1로 구성된 군으로부터 선택된 활성 성분을 함유하는 입자, 및 생분해성 부형제를 포함하되, 상기 입자의 90% 이상은 10 내지 20 미크론의 직경을 갖고 상기 제형은 50 미크론 초과 및 5 미크론 미만의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림으로 투여되는 경우 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력을 제한한다.

이론적으로 제한하고 싶지는 않지만, 본 발명의 제형은, 표적 조직 또는 기관의 동맥혈 업스트림으로 투여되는 경우 순환에 의해서 및 입자크기 및 분포 로지(lodge)로 인하여 표적 조직 또는 기관으로 운반되고, 즉 직경 약 5 내지 10㎛인, 조직 또는 기관 중의 모세혈관에 포집(trap)되거나 또는 포획된다. 모세혈관에 로징(lodging)하고 혈류를 차단하는 입자는 일반적으로 바람직하지 않지만, 특히 매우 낮은 치료학적 용량을 사용 가능하게 하는 제형인 본 발명의 제형에 의해 영향을 받은 모세혈관의 수는 비교적 적다. 더욱이, 생분해성 부형제는 용융, 용해, 분해 또는 어떻게든 활성 성분으로부터 자체 분리하며 따라서 궁극적으로 "차단"이 제거된다. 따라서 입자의 움직임은 모세혈관에 로징함으로써 제한/지연되며, 짧은 기간 후 모세혈관을 자연조건으로 복귀시키는 가역공정이다. 짧은 기간동안 입자의 움직임을 지연시키는 것은 조직의 혈관외 공간으로의 활성 성분의 국부작용 또는 흡수를 촉진시키기에 적절한 시간동안 표적의 근처에 활성 성분을 유지시킨다.

제형은, 전부는 아닐지라도 활성 성분 대부분이 입자로부터 방출되지만 표적 조직 혈관상에 고정되도록 설계된다. 일단 활성 로드가 방출되는 경우 입자는 분해되도록 설계되며 그의 구성물질은 일반 순환으로 방출되어 간 및/또는 신장을 통해서 대사 또는 제거된다.

본 발명은 활성 성분 및 생분해성 중합체 부형제를 함유하는 입자를 포함하되, 상기 입자의 30% 이상은 25 미크론 이하의 직경을 갖고 제형은 50 미크론 초과의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림으로 투여되는 경우 활성 성분이 치료학적 유효기간동안 표적 조직 또는 기관에 유지되는, 표적 조직에 대한 비경구 투여를 위한 약학 제형을 제공한다

특히 본 발명의 제형은 대부분의 활성 성분이 체순환으로 흡수되기 보다는 활성 성분의 대부분이 표적 조직에 유지되기 때문에 소량의 활성 성분을 사용할 수 있다. 이것은 활성 성분의 치료학적 창을 증가시키는 것으로 보인다. 즉 성분이 치료학적으로 활성인 용량 범위를 증가시켜서 보다 적은 절대량 투여를 가능하게 한다. 저용량의 국부투여는 부작용이 최소화될 수 있음을 의미한다.

적절한 용량은 예를 들어 0.05㎍/Kg 내지 약 lO㎍/Kg의 범위, 예를 들어 O.l㎍/Kg 내지 약 0.5㎍/Kg의 범위, 특히 0.15, 0.2, 0.25, 0.35, 0.4 또는 0.45㎍/Kg이다.

치료학적 효과를 위하여 저용량을 국부 투여하는 것이 효능 분자, 예를 들어 종양형성을 자극하는 잠재력을 가지는 것으로 알려진 성장인자에 있어서 특히 중요하다. 이들 잠재적으로 유해한 부작용은, 올바른 환경에서 분자들이 치료학적으로 유익한 효과를 생성할지라도 분자의 이용성을 제한한다.

본 발명의 제형은, 영구적 탄성 물질, 즉 비-생분해성 물질 예를 들어 폴리스티렌 및 실리카가 국부적 모세혈관을 손상킬 수 있고, 이종물질로서 작용하고 국부적 염증반응을 야기할 수 있기 때문에 활성 성분이 부착된 폴리스티렌, 실리카 또는 기타 비-생분해성 비드를 포함하는 미세구를 사용하지 않는다. 게다가, 상기 비생분해성 비드는 궁극적으로 체순환에 대한 접근에 도달하고, 이어서 예를 들어 폐 및 간과 같은 먼 조직에 축적될 수 있으며, 이들 모두는 바람직하지 않다.

일반적으로, 각각의 입자는 활성 성분 및 부형제를 포함한다. 제형에 관한 기술(記述)은 부가혼합물에서 활성 성분의 개별 입자(discrete particle) 및 생분해성 중합체의 분리 입자(separate particle)를 지칭한다.

위에서 사용된 바와 같은 50 미크론 초과의 입자가 실질적으로 없는 것은 미국 및/또는 유럽의 약전에 기록된 비경구 제형으로서 투여되는 기준에 부합하는 제형을 지칭한다.

한 양태에 있어서 '실질적으로 없는 것'은 상기 입자를 5% 미만, 특히 1% 미만, 예를 들어 0.5% 미만, 가령 0.1% 미만 함유하는 것을 포함할 수 있다.

한 양태에 있어서, 입자의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상은 25 미크론 이하의 직경을 갖는다.

한 양태에 있어서, 입자크기는 6 내지 25 미크론, 예를 들어 10 내지 20 미크론, 특히 15 또는 20 미크론이고, 예를 들어 입자의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 가령 99% 이상이 상응 크기 또는 상기 범위 내에 있다.

따라서, 본 발명의 한 양태에서 약학 조성물의 입자의 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상은 10 내지 20 미크론의 직경을 갖는다. 또 다른 양태에 있어서, 약학 조성물의 입자의 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 15 내지 20 미크론의 직경을 갖는다.

한 양태에 있어서, 본 제형은 직경 1 미크론 미만의 입자를 함유하지 않는다.

한 양태에 있어서, 본 제형은 직경 5 미크론 미만의 입자를 함유하지 않는다.

한 양태에 있어서, 활성 성분을 갖는 입자의 30% 이상은 투여 후 표적 조직에 유지되며, 예를 들어 입자의 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 가령 80% 이상이 유지된다.

한 양태에 있어서, 활성 입자는 5분 내지 24시간, 예를 들어 30분 내지 5시간 범위의 기간, 가령 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간동안 표적 조직 또는 기관에 유지된다.

제형이 관련 조직 또는 기관에 유지되는 기간은 기본적으로는 사용된 부형제 또는 부형제들의 혼합물에 의존한다. 따라서 생체내에서 부형제로부터 요구되는 특성은, 생체적합성이고(즉, 일반적으로 무독성이고 인간 및/또는 동물 투여용으로 적합하고); 투여후 적절한 시간 프레임 내에서 입자 움직임이 예를 들어 표적 조직 또는 기관에서 모세혈관 또는 세동맥에 로징함으로써 지연되기에 충분하게 입자 집적도를 유지하는데 기여하며; 활성 성분을 방출하는 신체에 의해서 및 활성 성분이 방출된 후 생분해성인(즉, 가공 또는 대사될 수 있는) 것이다.

따라서 본 발명에 사용하기 적합한 생분해성 중합체 부형제는 생체내에서 긴 체류시간을 갖지 않는, 즉 실체 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 고밀도 폴리에틸렌 및 유사 특성을 갖는 물질을 포함하지 않는 중합체 또는 공중합체이다. 생분해성 중합체는 부형제로부터의 분절(fragment)/조직파편(debris)의 양이 최소화되도록 무독성이고 바람직하게는 국부적으로 무독성 아단위(sub-unit)로 파쇄되어야 한다.

적절한 부형제는 미국약전(United States Pharmacopeia; USP)에서 찾을 수 있으며 무기 및 유기의 천연 및 인공 중합체를 포함한다. 이의 예는 폴리락트산, 폴리글리콜라이드 또는 이들의 조합물, 즉 (폴리락틱 코-글리콜산 보다 느린 생분해속도를 갖는) 폴리락틱 코-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 폴리우레탄, 다당류, 단백질 및 폴리아미노산, 카보하이드레이트, 키토산, 헤파린, 폴리하이알루론산 등은 적당할 수도 있다. 부형제는 일반적으로 활성 성분에 부착되거나 또는 활성 성분과 결합되거나 또는 내부에 도입될 수 있는 입자, 적절한 구(미세구)의 형태이다.

리포솜은 본원에서 정의된 의미 내의 생분해성 중합체 부형제가 아니다. 리포솜은 일반적으로 콜레스테롤을 포함하는 인지질 2층(bilayer)의 비히클이다. 동맥경화증에 의해서 유도된 심근경색과 같은 질병에 있어서 콜레스테롤 수준은 상기 질병에 대한 위험 인자 중 하나로서 모니터링되므로 그러한 환자에게는 콜레스테롤 함유 제형의 투여를 회피하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 간경화 환자는 지질 및 식이지방의 대사 곤란성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 상기 환자에 대한 리포솜의 투여는 바람직하지 않을 수 있다.

한 양태에 있어서, 생분해성 부형제는 하이드로겔(대응하는 콜로이드성 분산상의 연속상)이 아니다.

따라서, 활성 성분의 방출속도 및 입자의 용해속도는 둘 다 활성 성분을 부형제에 결합시키는 방법 및/또는 부형제를 변경시킴으로써 변경될 수 있으며, 따라서 예를 들어 폴리카프로락톤을 사용하는 것이 폴리락틱 코-글리콜산을 사용하는 대응 입자 보다 오랫동안 용해 또는 붕괴시키는 입자를 제공하게 된다. 활성 성분이 부형제 내에 임베딩(embedding)되는 경우가 그것이 입자의 표면상에 있는 경우 보다 느리게 방출된다. 표면 상에 있거나 정전하에 의해 결합되는 경우에는 공유결합된 경우 보다 빠르게 방출된다.

한 양태에 있어서, 부형제는 폴리락틱 코-글리콜산을 포함한다.

한 양태에 있어서, 실질적으로 모든 입자, 예를 들어 입자의 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%는 폴리락틱 코-글리콜산을 포함한다.

한 양태에 있어서, 상기 폴리락틱 코-글리콜산은 각각 75:25의 비이다.

한 양태에 있어서, 상기 부형제는 둘 이상의 별개의 중합체를 포함하며, 용어 '중합체'는 공중합체를 포함한다.

한 양태에 있어서, 부형제는 아크릴레이트 중합체, 예를 들어 메타크릴레이트 중합체를 포함할 수 있다.

한 양태에 있어서, 입자는 알기네이트를 포함한다.

한 양태에 있어서, 부형제는 생분해성 형태의 폴리우레탄을 포함한다.

한 양태에 있어서, 부형제는 미세구의 형태이다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 폴리비닐 알콜 미세구 제형을 사용한다.

한 양태에 있어서, 미세구는 알부민이 아니다.

한 양태에 있어서, 사용된 활성 성분(들)은 예를 들어 유드라지트(Eudragit) 범위로부터 선택된 생분해성 코팅 내에 엔캡슐화(encapsulatting)된다.

한 양태에 있어서, 하나 이상의 활성 분자들은 입자 내부에 임베딩된다.

본원에서 기술하는 바와 같이 실시하는 활성 화합물에 있어서는 그의 크기, 형태학 및 조성으로 인하여 혈류로 이행하여 그의 표적 조직에 도달하는 미립자로서의 순환형태로 투여되는 것이 필요하다. 표적에서 입자는 그의 활성 로드를 조절될 수 있는 방식으로 방출하여야 한다. 이러한 목표를 달성하기 위해서 일단 언로딩하는 경우 입자는 분해되어야 하고 그의 구성성분들은 체순환으로 대사 또는 전달되어 신체의 정상적인 배설 시스템에 의해서 제거되어야 한다.

상기 목표를 달성하기 위해서 미립자는 하기 특성들을 만족하여야 한다:

미립자는 그것들이 순환계의 지정된 수준에 도달하고 로징되는 것을 보장하기 위해서 균일한 크기 및 형태학이어야 한다. 크기 및 형상의 균일성은 입자가 구형인 경우에 보다 잘 조절된다.

대부분의 모세혈관 상(capillary bed)은 직경 6 미크론 미만인 입자의 자유 통과를 가능하게 하며, 본원에 개시된 미세구는 6 미크론 초과, 및 바람직하게는 대략 15 미크론의 직경을 갖는다. 직경 20 미크론 이상의 범위인 입자는 모세혈관이전세동맥(들)을 로징하고 몇몇 모세혈관에 대한 혈류를 즉시 차단한다. 따라서, 그들이 현미경적 경색을 일으킬 수 있다. 따라서 재생요법의 전달에 있어서 대부분의 미세구는 15 미크론의 범위이다. 그러나 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25 미크론의 직경을 갖는 입자가 본 발명에 따른 용도로 고려된다.

일단 표적에 도달한 활성 화합물을 방출하는데 요구되는 시간은 미세구의 형태 및 치료학적 목표에 따라서는 수 분 내지 수 일, 심지어는 수 주의 범위일 수 있다. 미세구는 생분해성이고 무독성인 화합물로 제조되어야 한다.

입자의 안정성 및 그의 분해시간은 미세구의 조성 및 유형에 의존한다. 분해를 시작하기 전에 그의 로드를 전달하도록 설계될 수 있으며, 대안으로 그의 로드의 전달이 입자가 붕괴하면서 일어나도록 설계될 수 있다.

부형제로서 사용된 중합체의 성질, 그의 크기, 단량체들 사이의 결합 불안정성 및 가교결합도는 필요에 따라 활성 성분의 방출속도 및 입자의 안정성 및 분해성에 영향을 주게 된다.

모든 양태에 있어서, 미세구는 순환으로의 그들의 투여도중 및 그들이 표적 혈관상에 도달하는데 필요한 시간동안 실질적으로 파쇄 또는 분해하지 않도록 용액 중에서 충분히 안정성이어야 한다.

본 발명의 적절한 양태에 있어서, 각각의 입자는 단일 유형의 활성 화합물을 가져야 한다. 화합물들의 혼합물이 치료학적 목적에 유익한 것으로 고려되는 경우 각각이 단일 유형의 화합물과 로딩된 미립자들의 혼합물이 투여될 수 있다. 이러한 설계는 치료학적 화합물의 생산을 단순화하고 보다 우수한 치료학적 유연성을 제공함으로써 개별화된 약제를, 환자의 개별적인 특수한 필요에 부합하도록 신속하게 제조할 수 있게 한다.

한 양태에 있어서, 사용된 입자(들)는 그것/그들에 결합된 오로지 하나의 유형의 활성 분자를 갖는다.

한 양태에 있어서, 사용된 입자(들)는 그것에 결합된 2종, 3종 또는 4종의 활성 분자를 갖는다.

활성 화합물은 그것을 형성할 때에 입자 위에 로딩될 수 잇으며, 예를 들어 입자 전반에 걸쳐서 분산될 수 있다.

활성 화합물은 부형제가 미세구의 쉘(shell)을 형성하는 경우 입자 내부에 엔캡슐레이팅될 수 있다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 공유결합에 의해서 입자(들)에 결합되며, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질은 알데하이드 예를 들어 포름알데하이드 또는 글루트알데하이드를 사용한 처리에 의한 가교결합을 통해서, 예를 들어 적절한 알데하이드인 활성 성분(들)의 존재하에 미세구 (또는 미세구의 성분)을 에멀젼화시키고 필요한 크기의 입자를 형성시키기 적절한 조건하에서 혼합물을 균질화시킴으로써 미세구에 결합된다. 또는, 활성 성분은 부형제 미세구 상에 위치된 카복실레이트 기에 결합될 수 있다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 정전기력(전하)에 의해서 입자(들)에 결합된다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 예를 들어 수용액 중에서 클로라이드 짝이온을 갖는 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및/또는 칼슘 이온을 포함하는 고분자전해질(polyelectrolyte)을 통해서 입자(들)에 결합된다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 고분자전해질 층들 사이에서 입자(들)에 결합된다. 활성 화합물은 전하(정전기력)에 의해서 또는 공유결합에 의해서 입자의 표면에 로딩될 수 있다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 정전하에 의해서 입자에 결합된다.

한 양태에 있어서, 활성 성분(들)은 예를 들어 고분자전해질 예를 들어 활성 성분이 전하에 의해 부착되는 입자를 커버링하는 고분자전해질 쉘에 의해서 입자에 결합된다.

활성 화합물은 입자의 표면 위에 단일 층을 형성할 수 있거나 또는 인접하거나 또는 고분자전해질 층에 의해 분리된 다중 층들로 침착될 수 있다.

활성 화합물은, 한편으로는 부형제 매트릭스와 결합하고 다른 한편으로는 활성 성분에 결합하는 "링커(linker)"에 의해서 입자에 결합될 수 있다. 이들 결합은 정전 또는 공유결합일 수 있다.

미세구는 예를 들어 동결건조에 의해서 안정화될 수 있다. 미립자는 또한 동결시에 안정될 수도 있다.

한 양태에 있어서, 부형제는 수 분 내지 수 시간의 범위에서, 또는 수 주 내지 수 개월의 장기간에 걸쳐서 신속하게 분해된다.

한 양태에 있어서, 제형은 순환에서의 경우 하나 이상의 활성 성분들이 예를 들어 1-30분 내지 약 1-2시간범위의 기간에 신속하게 방출되도록 하는 것이다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 혼합된 입자 집단(population), 즉 조절 또는 펄스(pulse)된 방출을 제공하는데 사용될 수 있는 상이한 용해속도를 갖는 입자에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 제형은 상이한 방출 동력학 및 분해속도를 갖는 입자를 포함할 수 있다.

한 양태에 있어서, 활성 성분은 1 내지 24시간의 기간에 걸쳐서 방출된다.

한 양태에 있어서, 활성 성분은 1일 내지 7일의 기간에 걸쳐서 방출된다.

따라서 하나 이상의 양태에 있어서 본 발명의 모든 제형은 투여후 7일 이내에 대사된다.

한 양태에 있어서, 개체의 순환에 있어서, 활성 성분(들)은 수 주 내지 수 개월, 예를 들어 1주 내지 1개월, 2개월 또는 3개월의 기간에 걸쳐서 매우 서서히 방출된다.

한 양태에 있어서, 입자들의 집단은 잘 특징지워 지며 예를 들어 동일 특성을 갖는다. 즉, 각각의 입자의 물리적 및/또는 화학적 특성은 좁게 정의된 범위에 속한다.

한 양태에 있어서, 미세구의 크기는 단분산된다.

따라서 한 양태에 있어서 제형의 입자는, 예를 들어 입자의 68% 이상이 평균입자크기의 +/- 1 미크론, 가령 입자들의 99% 이상이 평균입자크기의 +/- 1 미크론(예를 들어 15 +/- 1 미크론)을 갖는 작은 표준편차를 갖는 평균입자크기를 갖는다. 또한, 입자들이 평균의 +/- 1 미크론 내인 입자들의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상을 갖는 조성물이 본 발명에 의해서 고려된다.

한 양태에 있어서, 제형은 둘 이상의 별개 유형의 입자를 함유하며, 예를 들어 별개의 입자들이 상이한 활성 성분, 코팅, 입자 크기 및 이들의 조합을 가질 수 있음을 특징으로 하는 입자들의 집단을 포함한다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 추가적인 별개의 활성 성분들의 입자와 혼합되게 활성의 입자들을 포함하는 입자들의 혼합 집단에 관한 것이다.

제형의 입자크기 및 분포는 제형이 조직 내에서 어떻게 분포되는지를 비롯한 제형의 생체내 프로파일에 영향을 주는 것으로 보인다. 이것은 일부 입자들이 훨씬 큰 입자크기 및 훨씬 작은 입자크기를 가질 수 있게 하기 때문에 10 내지 20 미크론 범위 내의 평균입자크기를 갖는 것이 불충분한 것으로 보인다. 이러한 편차는, 예를 들어 작은 입자들이 상응 조직으로 유지되지 못하고 더 큰 입자들이 조직을 손상시킬 수 있기 때문에 생체 내에서 문제를 야기할 수 있다.

사용된 활성 성분:부형제의 양은, 필요한 방출 프로파일에 따라, 1%:99%w/w, 5%:95%w/w, 10%:90%w/w, 20%:80%w/w, 30%:70%w/w, 40%:60%w/w, 50%:50%w/w, 60%:40%w/w, 70%:30%w/w, 80%:20%w/w 또는 90%:10%w/w의 비일 수 있다. 활성 성분이 생체 내에서 신속하게 또는 즉시 방출되는 것이 요구되는 경우 보다 높은 부형제에 대한 활성 성분의 비가 선택될 수 있다.

한 양태에 있어서, 사용된 미세구는 약 16시간의 반감기를 갖는다.

한 양태에 있어서, 제형은 동결건조된다.

또 다른 양태에 있어서, 제형은 동결된다.

본 발명의 입자들은 눈에 띨 정도로 비자기성이다.

활성 성분은 본 발명에 따라 입자의 형태로 투여될 수 있는 약제/약물일 수 있다.

한 양태에 있어서, 15 x 10⁶개의 입자(미세구)가 투여되며, 예를 들어 14 x lO⁶개, 13 x lO⁶개, 12 x lO⁶개, 11 x 10⁶개, 10 x 10⁶개, 9 x 10⁶개, 8 x 10⁶개, 7 x 10⁶개, 6 x 10⁶개, 5 x 10⁶개, 4 x 10⁶개, 3 x 10⁶개, 2 x 10⁶개 또는 1 x 10⁶개의 입자가 투여된다.

여기서 사용되는 입자는, 상기 입자가 필요한 기능을 수행하는데 충분한 기간 동안 그의 구조를 유지하는 경우, 예를 들어 별개의 입자로서 제형화되되, 미분(微粉)된 약제, 반고체 또는 수화된 물질(entities) 예를 들어 단백질 또는 생물학적으로 유도된 활성 성분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 개시는 입자의 외부 집적도가 생체 내에서 그의 기능을 수행할 수 있도록 하는 것으로 제공된 액체 코어를 갖는 입자로 확장한다. 본 발명의 개시는 기체 코어를 갖는 입자로 확장하지는 않는다.

미세구는 중합체 용액을 에멀젼화시킨 다음 용매를 증발시킴으로써 제작될 수 있다. 다른 경우에 있어서 단량체는 에멀젼화된 다음, 열적 또는 UV 중합이 뒤따른다. 또는, 중합체 용융물을 에멀젼화시키고 연속적으로 냉각시켜서 소적을 고화시킨다. 에멀젼의 크기 감소는 벌크(bulk)를 균질화 및/또는 초음파 분해(sonicating)함으로써 달성할 수 있다. 미세구는 반응 혼합물을 여과 및/또는 원심분리함으로써 수집될 수 있다.

상이한 약학적 화합물 및 치료학적 거대분자의 조절 방출 및 표적화된 전달을 위한 생중합체의 생분해성 미세구 및 미세캡슐은 오랜동안 다수의 형태, 특히 본원에서 기술된 비교적 큰 직경의 것으로 알려져 왔다[D.D. Lewis "Biodegradable polymers and drug delivery systems" M. Chasin and R. Langer, editors (Marcel Dekker, New York, 1990); J.P. McGee et al, J. Control. Release 34:77, 1995].

미세구 및 미세캡슐은 예를 들어 구성 단량체들을 미세소적(microdroplet)의 크기로 분무한 다음 건조 또는 중합 단계를 수행하는 것과 같은 기계-물리적 방법에 의해서 통상적으로 제조된다. 이러한 미립자는 또한 에멀젼화 공정을 거친 후 에멀젼화 용매의 제거에 의해서 형성될 수 있다[B. Miksa et al., Colloid Polym. Sci. 273: 47, 1995; G. Crotts et al., J. Control. Release 35:91, 1995]. 이들 방법의 주요한 문제는 형상 및 크기에 있어서 입자들의 단분산 집단화의 생성이다. 이것은 예를 들어 적절한 크기의 미세소적을 형성하는데 모세관 분무기(capillary nebulizer)가 사용되는 유동집속(flow focusing)의 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 공정에서는 성분들을, 미립자 성분을 용해/현탁시키는 기능을 하는 수거 용액/용매 속에 넣은 다음, 용매를 증발시켜서 고화된 미립자를 제공한다.

상기 공정은 미립자의 모든 성분들이 미립자를 형성하는 미세소적이 생성되는 단일 혼합물(집속 화합물)로 결합되는 것이 요구된다. 약물 전달용으로 사용된 다수의 중합체는 소수성인데 반하여, 대부분의 치료학적 거대분자, 및 특히 단백질은, 미립자가 형성되기 전에 균일 조성물이 수득되는 것을 보장하도록 혼합물의 에멀젼화를 필요로 하는 친수성이다.

또는, 입자들은, 예를 들어 활성의 용액을, 애노드/캐쏘드 유형 정렬에서 알짜전하(net electric charge)를 갖는 노즐로부터 상대전하를 갖는 플레이트 또는 물질 쪽으로, 대류 전류에서 미세구로 흡인함으로써 제조될 수 있다.

한 양태에 있어서, 사용된 입자들은 알짜전하, 예를 들어 양전하 또는 음전하를 갖는다. 이것은 예를 들어 표적 조직 또는 기관에서 입자의 움직임이 지연되는 것을 돕는다. 이러한 망(net)은 투여 후 표적 조직 내에 유지되지 않는 작은 치수, 예를 들어 5 미크론 미만의 (예를 들어 활성이 없는) 짝이온 구에 의한 투여를 위한 제형에서 균형을 이룰 수 있다.

한 양태에 있어서, 활성 성분은 생물학적 분자 또는 그로부터 유도된 것, 예를 들어 단백질 가령 항체 또는 성장 인자, 사이토킨 또는 이들 물질의 조합물이다.

특히 본 발명의 제형은 상응 조직에서 발견된 상주줄기세포를 표적화/활성화시키는데 특허 유용하다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 제형은 특정 조직 또는 기관의 상주줄기, 원종(原種) 및/또는 전구체(precursor)를 활성화시켜서 상기 조직 또는 기관의 재생을 자극하는데 사용된다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 상기 재생의 개시를 위해 출생후 조직에 존재하는 줄기세포에 의해서 발현된 수용체를 위한 리간드의 국부 투여에 관한 것이다.

한 양태에 있어서, 리간드를 투여하여 각각의 표적 조직에 존재하는 대부분의 미분화 줄기세포 상에 존재하는 수용체를 활성화시킨다. 이들 세포는 이른바 "다효능 유전자(multipotency genes)", 예를 들어 Oct 4, Sox2, Nanog, 등을 발현하며, 또한 이들은 강력한 재생력(potent regenerative capacity)(이하, 'Oct4-발현 줄기세포'라 함)을 갖는다.

한 양태에 있어서, 리간드를 심장에 투여하여 예를 들어 심근경색에 의해 유발된 조직손상을 최소화하고/하거나 재생시킨다.

동맥이 폐쇄될 때 주요한 효과는 폐쇄로부터의 조직 다운스트림의 손실이다. 심장동맥의 폐쇄의 특이한 결과는 심근 일부의 비가역적 손실을 초래하는 심근경색(MI)이다. 이러한 손실은, 상당히 충분할 때 적절한 심장 출력을 제공하는 능력을 제한하고 인간의 능력을 심각하게 그리고 점진적으로 제한하는, 심장의 펌핑 능력 및 심근의 수축 능력의 감소를 초래한다[Nadal-Ginard et al., Circ. Res. 2003; 92:139에서 검토됨].

미국 및 유럽에서는 150만명 이상의 심근경색(MI)자들만이 매년 치료받고 있으며, 1,100만명 초과의 MI 생존자들이 있다(미국심장협회, 2007; 영국심장협회, 2007). 이들 중에서 30%를 상회하는 사람들이 심근경색 후 처음 첫해동안 사망한다. MI 후의 생존여부는 허혈 사건(ischemic event)으로 인한 경색의 크기(근육량 손실률(%))의 큰 정도에 의존한다. 손실률이 좌심실질량의 대략 40 내지 45%에 영향을 미치는 경우 균일하게 치사하는 비가역적 심장성 쇼크를 일으킨다[Page et al., 1971. N. Engl. J. Med. 285; 133]. 이러한 구역심근손실은 세포자멸사에 의한 증가된 세포사, 생존 근세포의 비대, 조직의 증가된 섬유화 및 심실의 팽창을 갖는 상기 심근의 재구성을 일으킨다[Pfeffer, M.A. & Braunwald, E., 1990. Circulation 81:1161]. "리모델링"으로서 알려진 상기 재구성은 수축에 대한 부정적 효과 때문에, 자주 심부전(CF)으로 발전한다. MI 후 CF의 제 1 에피소드 후에 5년 미만이며 매년 대략 18%의 치사율을 갖는다(미국심장협회, 2000).

허혈 또는 기타 원인에 의한 유조직의 손실을 치료하는 요법의 대부분 또는 모두는 생존 조직의 기능을 보존 또는 개선에 관한 것이다. MI의 경우에 있어서, 현재 심장수축근육의 손실의 결과를 치료하는데 사용중인 모든 요법은 생존 조직의 수축성 기능을 보존 또는 증강시키고 세포자멸사 또는 괴사에 의한 이들 근육 세포의 지속된 손실을 감소시키는 것에 관한 것이다[Anversa & Nadal-Ginard, 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard et al. 2003. Circ. Res. 92: 139 참조]. 현재, MI로 손실된 근세포를 재생시키거나 대체하고, 이러한 방식으로 심장의 수축기능을 복원하도록 설계된 승인된 요법은 하나도 존재하지 않는다. 더욱이, 지금까지의 모든 실험적 접근법은, 모세혈관망에서 증가를 자극하고, 가장 흔하게는 침범당한 영역에 혈관 내피 성장 인자(VEFG)를 단백질 형태 또는 cDNA의 형태로 직접 또는 간접적으로 전달함으로써 허혈성/괴사성 영역으로의 혈류를 개선시키는 것에 관한 것이다. 혈관사고에 의해 손실된 실질 및 미세순환(microcirculation)과 함께 재생하기 위해서 조직에서의 상주줄기세포를 배가 및 분화하도록 자극하는 요법은 하나도 존재하지 않는다.

급성 MI에 대한 치료학적 접근법의 목표는 추가적인 근육 손실을 방지하기 위해서 가능한 한 빨리 손상된 근육에 혈류를 복원시키는 것이다. 이러한 재관류 요법은 혈전용해제, 풍선혈관성형술 또는 우회로조성술(bypass surgery)의 사용을 포함한다. 1998년에 미국에서는 500,000회 초과의 혈관성형술 및 유사한 횟수의 우회로조성술이 수행되었다. 이들 요법은 종종 허혈성 근육에 혈류를 복원시키는데 있어서는 성공적이지만, 중재적시술(intervention) 시에 이미 손실된 단일 근육세포를 대체할 수는 없다. 이러한 손실이 실질적이었던 경우 장기간의 결론은 필요 심장 출력을 생성하는 능력이 없으며, 냉혹하게 말기 심부전으로 발전하는 것이다.

현재까지, 말기 심부전을 효과적으로 치료하는 유일한 선택은 의학적(면역억제 요법), 실행적(logistic) 및 경제적 문제를 모두 수반하는 심장이식이었다. 이들 문제점을 회피할 수 있을지라도 공여자의 부족으로 상기 요법은 1% 초과의 심부전 환자가 이용할 수 있다.

본 발명의 제형은 예를 들어 조직에 이미 존재하는 줄기세포가 재생하도록 자극함으로써 동맥의 폐쇄에 의해 손상된 조직을 재생하도록 심장과 같은 조직 또는 기관이 특이적으로 표적화될 수 있는 형태로 투여되는 요법 활성 분자의 투여를 가능하게 한다.

조직 재생을 위한 줄기세포요법

최근의 일부 실험적 접근법은 유익한 기관 또는 조직에 의해 손실된 세포의 일부를 대체하도록 표적화되는 기관 이식의 대안으로서 개발되었다. 이러한 방법은 반세기에 걸쳐서 실행된 골수이식의 성공으로 모델링되었다. 면역적격의 개체에 이식될 때, 모든 혈액 세포 유형을 생성하는 골수 중의 소집단 세포의 능력은, 성체 조직이 조직 또는 전체 기관을 생성하거나 또는 재생할 수 있는 "줄기세포"를 함유하는 것임이 설득력 있게 입증되었다. 이러한 개념적 해결책은 치료되는 개체로부터 분리되거나(자가세포요법) 또는 그들을 수용하는 것과 상이한 개체로부터 분리되는(이종세포요법) 상이한 유형의 줄기세포를 사용하여 손상된 세포를 복구시키는 실험적 접근법의 개발로 연결되었다. 이들 세포는 침범당한 조직의 원하는 복구를 유발하도록 이식되기 전에 매스(mass)로 분리되거나 또는 배양에서 먼저 팽 창된다. 이들 세포요법 접근은 조직 재생을 위한 줄기세포의 천연 재생특성을 이용한다.

본원에서 용어 "줄기 세포"는 자가-재생(self-renewal)(보다 많은 동일 세포를 자체 생성함)의 특성을 갖고, 클론원성이며(단일 세포로부터 출발하여 팽창될 수 있으며), 다능성(pluripotent)인(즉, 흔히 상주하는 조직 속에 존재하는 상이한 세포 유형으로 분화하는 자손을 생산하는) 세포를 동정하는데 사용된다. 즉, 줄기세포로부터 유래된 세포는 그 줄기세포가 유래되거나 또는 그것이 이식되는 조직 또는 기관의 특정한 세포적 분화특성을 획득하게 된다[Stem Cells: A Primer. 2000. National Institutes of Health USA].

용어 "다능성"은 다수의 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 본원과 관련하여 용어 "테트라효능"은 (전체 개체를 생성할 수 있는) 전형발육일 수는 없지만 4가지의 상이한 세포 유형, 예를 들어 심근세포, 혈관내피 및 평활근 세포 및 결합조직 섬유모세포를 재생시킬 수 있는 세포를 지칭한다.

용어 "원종세포"(progenitor cell)는 이미 특정한 분화경로로 넘어가고, 따라서 줄기세포 보다 더 제한된 분화 잠재력을 갖는 줄기세포의 자손을 지칭한다. 원종세포는 커다란 증폭 증력을 가지며 아직 분화의 표지를 발현하지 않을지라도 자신 보다 더 분화되는 자손을 생성하는 능력을 갖는다. 예를 들어 상기 용어는 미분화된 세포 또는 최종 분화에 못미치는 정도로 분화된 세포를 지칭할 수 있다. 이러한 세포는 증식능력이 있고 보다 많은 원종세포를 생산할 수 있으며, 따라서 분화되거나 또는 분화가능한 딸세포를 생산할 수 있는 다수의 모세포를 생성하는 능력을 가진다. 특히 용어 원종세포는, 예를 들어 배아세포 및 조직의 점진적 다양화로 나타나는 바와 같이, 개별적 형질을 완전히 획득함으로써 자손(후손)이 종종 상이한 방향으로 분화하는 일반화된 모세포를 지칭한다. 원종세포는, 유래되는 줄기세포의 다효능을 이미 제한하였기 때문에 참줄기세포 보다 더 분화된다.

문맥상 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 줄기세포는 줄기세포, 원종세포 및/또는 전구세포를 지칭한다.

세포분화는 전형적으로 많은 세포분할을 통해서 일어나는 복합공정(complex process)이다. 분화된 세포는 자체가 다효능 세포 등으로부터 유도되는 다효능 세포로부터 유도할 수 있다. 이들 다효능 세포 각각은 줄기세포인 것으로 고려될 수 있지만, 세포 유형 각각의 범위는 상당한 변화를 일으킬 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 보다 진전된 잠재력의 세포를 생산하는 능력을 갖는다. 이러한 능력은 천연적이거나 또는 최근에 iESCs(유도된 배아줄기세포)로 입증된 다양한 인자를 사용한 치료시에 인공적으로 유도될 수 있다[Takahashi et al., 2007. Cell 131:1-12].

"전구세포"는 분화경로를 더 거슬러 내려가고, 상기 세포 유형의 동정가능한 표지의 어느 것으로도 아직 발현할 수 없지만 단일 세포 유형으로 분화하는 것으로 되어 있는 원종세포의 자손이다. 전구세포는 통상 동정가능한 분화된 페노 유형의 출현 이전에 마지막 라운드의 증폭을 수행하는 것이다.

줄기세포는 포배의 내부 세포괴, 조기 배아의 생식기능선, 및 인간을 포함한 대다수의 성체 동물의 조직에 존재한다. 포배의 내부 세포괴로부터 유도된 줄기세포와는 대조적으로, 일반적으로 성체 조직으로부터 분리된 줄기세포는 그들의 최종 분화의 초기단계에서의 세포와 함께 참줄기세포, 원종체 및 전구체의 혼합물이다. 성체 줄기세포는 특히 골수로부터 중추 및 말초신경계, 모든 결합조직, 피부, 창자, 간, 심장, 내이(內耳) 등 까지의 3개의 배아세포층(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 각각으로부터 유도된 모든 조직을 동정하였다.

이들 성체 줄기세포는 재생능력을 보유한 것으로 나타난다. 놀랍게도, 모든 선진국에서 허혈성 심장병의 높은 유병률, 심각성 및 높은 경제적 비용에도 불구하고, 최근까지 성체 심근의 재생에 대해 표적화한 방법에 대한 연구가 없었다. 이러한 이상(anomaly)에 대한 이유 중의 하나가 매우 최근까지 심장은 그의 수축 세포가 내재적 재생능력을 갖지 않는 말기 분화된 기관인 것으로 고려되었다는 것이다[MacLellan, W. R. & Schneider, M.D. 2000. Annu Rev. Physiol. 62:289; Reinlib. L. and Field, L. 2000. Circulation 101:182; Pasumarthi, K.R.S. and Field, L.J. 2002. Circ. Res. 90:1044; MacLellan, W.R. 2001. J. MoI. Cell Cardiol. 34:87; Perin, E.C. et al 2003. Ciculation 107:935; Anversa, P. and Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard, B. et al 2003 Circ. Res. 92:139]. 이러한 개념은 성체 심장에서 압도적 다수의 심근세포들이 말기 분화되고 세포주기에 재진입하는 능력이 비가역적으로 차단된다는 실험적으로 익히 기록된 사실에 기초한다. 따라서 상기 근세포가 새로운 근세포를 생성하도록 재생성할 수 없는 것임에 의심의 여지가 없다.

재생 잠재력이 없는 조직으로서 심근의 우세적 개념의 결론 중 하나는 지금까지 실시된 이른바 실험적 "재생 요법들"은 모두 태아 근세포이거나, 또는 상기 세포 유형으로 또는 모세혈관 또는 미세동맥(microarteriole)으로 분화하여 경색도중에 손실된 세포를 대체하는 잠재력을 일부 가지는 것으로 여겨지는 것이었다. 이러한 방식으로 미분화 상태에서 또는 심근세포 경로에의 참여(commitment) 후에태아 및 성체 골격근 전구세포, 태아 심근세포, 및 배아줄기세포를 이식하는 동물실험을 수행하였다[Kocher et al., 2001. Nature Med. 7: 430].

자가성(autologous)일 수 있는 (심장세포로 전환할 수 없으며 심근세포와 전기적으로 커플링될 수 없는)[Menasche et al., 2001. Lancet 357: 279; C Guo et al. 2007. J Thoracic and Cardiovasc Surgery 134:1332] 골격근 세포를 제외하고, 수록된 다른 모든 세포 유형은 이종기원(heterologous origin)의 필요성에 기인하고 따라서 면역억제요법에 의해서 수반되어야 하거나 이식조직은 면역계에 의해서 신속하게 제거된다. 이러한 접근법 중 어느 것도 임상전 분석에서 매우 효과적인 것으로 입증되지 않았으며 모두는 많은 위험(pitfall)을 갖는다.

성체 줄기세포 일부의 가장 흥미를 자아내는 특성들 중 하나는 그들의 형성력(plasticity)이다. 이러한 특성은 특정 줄기세포가 그것과 상이한 조직 내부에 위치될 때 이러한 새로운 환경에 적응할 수 있으며 공여자 조직 대신에 숙주 조직의 특징인 세포 유형으로 분화할 수 있다. 많은 세포 유형에 대한 형성력의 정도 및 성질은 여전히 논쟁의 여지가 있지만[Wagers & Weissman, 2004.CeIl 116:636-648; Balsam et al., 2004 Nature 428, 668-673; Murray et al, 2004. Nature 428, 664-668; Chien, 2004. Nature 428, 607-608], 무수한 임상전 프로토콜 및 임상적 시도를 낳았다.

지금까지 기술한 성체 줄기세포 중에서 골수로부터의 줄기세포가 가장 많이 연구되고 보다 큰 정도의 형성력을 나타낸 것이다[Kocher et al., 2001. Nature Med. 7: 430]. 또한, 지방피막조직으로부터 유도된 이른바 "중간엽줄기세포"가 널리 사용되었다[Rangappa, S. et al 2003. Ann. Thorac Surg 75:775].

줄기세포로부터 유도된 골격근 및 지방피막조직의 손상된 영역의 조직 및 기관을 재집단화하는 능력, 그들의 분리의 상대적 용이성은 아사하라 등의 초기 연구[Orlic et al, 2001. Nature 410:701; Orlic et al, 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10344; Nadal-Ginard et al, 2003. Circ. Res. 92:139]와 함께 실험동물에서[Orlic et al, 2001. Nature 410:701; Orlic et al, 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10344; Nadal-Ginard et al, 2003. Circ. Res. 92:139] 및 인간에서[Tse et al., 2003. Lancet 361:47; Perin et al., 2003. Circulation 107:2294] 심장근육으로 재생시키는 세포요법의 목적에 대해 유리한 것으로 밝혀졌다. 일부가 이의를 제기하기는 하였지만[Balsam,L.B. et al. 2004. Nature 428: 668; Murry,C.E. et al. 2004. Nature 428: 664], 특정 조건하에서의 골격근 유도된 줄기세포는, 특히 실험적 심근경색의 경계영역에 이식된 경우 심근세포, 모세혈관 및 세동맥을 재생할 수 있음이 명백하다[Quaini, F., et al., 2002. New Engl. J. Med. 346:5; Bayes-Geis, A. et al., 2003. Cardiovasc. Res.56:404;; Bayes-Genis, A. et al., 2004. Eur. J. Heart Fail. 6:399; Thiele, H. et al., 2004. Transplantation 77:1902]. 평가를 위해 신뢰할만한 조직병리학적 데이터가 전혀 없기 때문에 골격근- 또는 지방피막-유도된 줄기세포를 사용한 무수한 세포요법의 임상적 시도로부터 유사한 정보를 얻을 수 없다.

심근세포요법에 사용된 기법의 주요한 결점은 세포이식과정 자체의 복잡성 및 비효율성이다. 세포가 심장동맥나무(coronary arterial tree)를 통해서 이식되는 경우 3 내지 5%만이 심근에 남으며 나머지는 신체 전반에 걸쳐서 확산된다. 세포가 심근속에 직접 주입되는 경우 표적영역을 동정하기 위해서 가슴절개 또는 복잡하고 시간 소모적인 기구(노가형 시스템(Noga-type system))의 사용을 요구한다. 이러한 기법은 전문성을 갖춘 조작자를 요구하며 전문적인 의료센터에서만 이용될 수 있다. 그 외에, 트랜스심장내막(Noga) 또는 트랜스심장외막(외과적) 경로 중 어느 하나에 의한 심근내 주입이 여전히 세포의 50% 미만을 조직으로 전달한다.

실험동물 또는 인간 중 어느 하나에서 심근경색후 심근 재생을 일으키기 위해서 현재까지 사용된 모든 세포요법적 접근법은 예외없이 심근이 그의 상주줄기세포에 의해서 표현되는 내재적 재생능력을 가진다는 사실을 완전히 무시한 채 개발되었다[Nadal-Ginard, B., at al., 2003. J. Clin. Invest. 111 :1457; Beltrami et al, 2003. Cell 114:763-776; Torella, D., et al, 2004. Circ. Res. 94:514; Mendez-Ferrer, S. et al.,2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1:S83; Torella et al, 2007. Cell. MoI. Life Sci. 64:661].

위에서 지적한 바와 같이, 최근까지 수용된 틀은 재생능력이 없는 포스트-유사분열 기관으로서 성체 포유동물 심장을 고려하였다. 이러한 개념은 과거 수 년에 걸쳐서 발전하기 시작하였지만, 심근 재생에 대한 모든 실험적 임상적 접근법은 낡은 도그마에 기초하여 지속되었다. 이러한 이유로, 모든 심장 재생 프로토콜은 심근에 재생 잠재력을 구비한 세포를 제공하기 위해서 세포이식에 기초하였다.

이제, 본 발명의 제형이 적절한 조건하에서 투여되는 경우 조직 또는 기관(예를 들어 심장)에 상주하는 "줄기세포"의 내재적 재생능력이 상기 조직 또는 기관을 재생하도록 자극 또는 활성화될 수 있게 된다.

따라서, 한 양상에 있어서, 본 발명은 재생대상 출산후 조직에 존재하는 줄기세포에 의해서 발현된 수용체에 대한 리간드의 국부전달을 포함하는, 인간을 비롯한 살아있는 포유동물에서 고체 조직의 재생방법을 제공한다. 이들은 생리학적으로 또는 약리학적으로 자극하였을 때 자체(in situ) 증식하고 그것들을 번식하는 조직 또는 기관의 유조직 세포 특징으로 분화하는 세포이다.

새로운 심근세포 형성은 정상 심장 및 병리학적 상태 예를 들어 MI 및 심부전 모두에서 검출되었다[Beltrami, A. P. et al., 2001. New Engl. J. Med. 344:1750; Urbanek, K. et al, 2003. Proc. Netl. Acad. Sci. USA. 100: 10440; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. J. Clin. Invest. 111:1457; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139]. 흥미롭게도, 상기 새로운 근세포는 그들이 연령 매칭된 건강한 개체의 심근에서 보다 풍부한 규모의 등급인 경우 MI의 경계 구역에서 보다 현저히 풍부하다. 이러한 관측은 성인의 심근이 죽은 근세포의 대체를 시도하는 부전재생공정으로 급성 및 만성의 세포사 증가에 반응하는 능력을 가짐을 시사하였다[Anversa, P. & Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415: 240; Anvrsa, P. and Nadal-Ginard, B. 2002. New Engl. J. Med. 346:1410; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139].

먼저 성체 심장줄기세포(CSCs)가 2003년에 문헌(Beltrami et al. 2003. Cell 114:763-776)에 기술되었으며, 동종 및 타종에서 몇몇 저자들에 의해서 확인되었다[Torella, D., et al., 2004. Circ. Res. 94:514; Mendez-Ferrer, S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1:S83; Torella et al., 2007. Cell. Mol. Life Sci. 64:661]. 이들 CSCs는 심근세포, 내피 및 평활근 혈관세포 뿐만 아니라 결합조직 섬유모세포를 발생시키기 때문에 자가-갱신성이며, 클론원성이고 다효능성이다. 이들은 SCF, Sca I, MDR-1 및 Isl-I에 대한 수용체인 c-kit와 같은 줄기세포와 결합된 막 표지(membrane marker)의 발현에 의해서 동정되었다. 이제, 성체 심장에 형성된 새로운 근세포는 심근에 상주하는 CSCs로부터 유도되는 것임이 명백하다. 이들 CSCs는 경색의 경계에 주입되는 경우 대량 MI의 결과로서 손실된 미세혈관계 및 수축세포를 재생하는 능력을 갖는다[Beltrami, et al, 2003. Cell: 114:763-776; Laugwitz, et al. 2005; Mendez- Ferrer et al., Torella et al., 2006; Torella et al., 2007].

건강한 개체의 심장에서, 거의 모든 CSCs는 휴지상태(G₀)에 있으며 유기체의 수명동안 매우 느리게 순환한다. 언제든지 주어진 시간에 상기 세포의 매우 작은 분율만이 마멸(wear) 및 파열(tear)에 의해서 죽은 세포를 대체하는데 충분한 복제 및 분화를 수행하는 활성이다. 대조적으로, 큰 분율의 CSCs-때로는 대부분-은 생리학적 또는 약리학적 응력에 대한 반응에서 활성화된다. 일반적으로, 응력의 규모와 응답에서 활성화되는 CSCs의 수 사이에는 직접적인 상관관계가 있다. 또한, 이러한 활성화된 CSCs의 수는 생성된 새로운 심근세포의 수와 직접적으로 상관된다. 마우스 내지 인간에서 발생하는[Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139] 상기 반응은 CSCs의 활성화를 일으키는 응력에 의해서 유발된 생화학적 경로의 존재를 나타낸다.

적어도 심근에서 상주줄기세포와 그들의 환경 사이의 연통은, 심장출력에서 증가된 생리학적 또는 병리학적 요구에 의해서 생성된 벽응력의 변화를 감지하는 심근세포와, 새로운 수축세포의 생성 및 미세순환을 통해서 근육 매스를 증가시켜서 길러질(nurture) 수 있는 줄기세포 사이의 피드-백 루프에 의해서 조절된다. 근세포는 생리학적 또는 병리학적인 것인지 여부에 상관없이 응력에 대한 독립적인 전형적인 반응을 가진다[Ellison et al., 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397-11409]. 이러한 반응은 커다란 일련의 성장인자 및 사이토킨, 그 중에서도 특히 예를 들어 HGF(간세포성장인자), IGF-1(인슐린-유사 성장인자 1), PDGF-β(혈소판-유도된 성장인자 β), FGFs(섬유모세포 성장인자)의 군, SDF-1(간질세포-유도된 성장인자 1), VEGF(혈관내피성장인자), 적혈구형성인자(EPO), 표피성장인자(EGF), 액티빈 A 및 TGF β(전환성장인자 β), WINT 3A 및 신경게울린(neurogeulin)의 발현 및 분비를 신속하게 활성화시키는 것으로 이루어진다. 자동/주변분비 루프를 통해서 근세포의 비대를 자극하는 것 이외에, 상기 분비반응은 또한 상기 세포들이 이들 근세포-분비된 인자에 대한 수용체를 발현하고 그것들에 반응하기 때문에 그들의 근처에서 CSCs의 활성화를 유도한다. 이러한 반응은 세포 생존, 증식 및 분화를 담당하는 수용체의 유전경로 다운스트림을 활성화시킨다. 그 외에, 상기 수용체들의 활성화는 CSCs에 의해서 각각의 리간드의 생성을 자극하는 CSCs 자체에서의 피드-백 루프를 활성화시키며, 따라서 단일 자극에 대한 반응에서 수 주 동안 또는 생성된 증가된 매스가 심근벽 응력을 정상 수준으로 복원할 때까지 자기-지속 반응을 실행한다. 따라서, CSCs는 단명 자극으로의 지속된 반응의 유지를 가능하게 하는 자동/주변분비 반응으로 주변분비자극에 반응한다. 따라서, 정상적인 심장세포 항상성은 근세포와 CSCs 사이의 연속적인 피드-백을 통해서 유지되어 필요한 혈액 심장 출력을 생성하는데 필요한 적절한 수축 근육 매스를 생성하고 유지한다. 분할할 수 없는 근세포는 그들의 세포수를 유지하거나 또는 증가시키는 CSCs 및 그들의 산소 및 영양소 공급을 보장하는 세포밀도에 의존한다. 한편, CSCs는 그들의 휴지상태 대 활성화 상태를 조절하는 그들을 둘러싼 근세포에 의해서 생성된 생화학적 신호인자(biochemical cue)에 의존하고 반응한다.

위에서 기술한 조직-특이적 줄기세포 이외에, 최근 본 발명자들은 인간을 포함한 포유동물의 심근뿐만 아니라 대부분의 다른 조직이, 장기간동안 다효능성인 것으로 알려진, 즉 적절한 환경에 놓이는 경우 단일 세포가 그것이 유래되는 것과 동일한 전체 조직을 생성하는 배아줄기세포(ESCs)와 많은 유사성을 가지는 소집단의 매우 미분화된 세포를 함유하는 것임을 밝혀냈다. 이들 세포의 주요한 특징은 상기 세포에 다효능성을 부여하여, 그들의 기원 조직과는 독립적으로, 신체의 세포 유형 전부는 아니지만 대부분을 발생시킬 수 있는 일련의 이른바 "다효능성 유전자" 예를 들어 Oct4, Sox2, Nanog 등의 발현이다[미국가출원 제61/127,067호]. 특히 성체 심장으로부터 분리된 Oct4-발현 세포는 골격근, 뉴런, 심장, 간 등을 발생시킬 수 있다. 그들의 대표적인 능력은 조직-특이적 줄기세포 보다 강건하고 넓을 수 있다.

본 발명자들은 Oct4-발현 세포가, 전부는 아니지만 모든 기관의 조직-특이적 줄기세포 대부분의 기원이며 그들의 자극이 모든 개체 조직의 재생 능력의 주요한 원천인 것으로 여긴다. 따라서, 이들 세포의 자극은 본원에서 기술한 치료학적 접근법이 일차적인 표적이다.

심근세포를 생성하는 능력 및/또는 효율과는 독립적으로, 대다수의 줄기세포가 기원 조직과는 무관하게 조직에 도입되는 경우 그들 줄기세포는 실험적으로 밝혀진 바와 같이 심근 및 기타 조직으로 이식될 때 중요한 주변분비효과를 갖는다. 이식된 세포에 의해서 생성된 사이토킨 및 성장인자의 복합 혼합물은 위험 영역에서 및 근육세포 및 미세혈관계로 증식 및 분화하는 내인성 줄기세포의 활성화에서 심근세포 및 다른 세포에 비해 강력한 항-세포자멸 효과를 갖는다. 이러한 주변분비효과는 세포이식 직후에 시작하여 시험관내에서 기록될 수 있다.

본원의 실시예에서 수행된 작업으로부터 (Oct4 발현 세포를 포함한) 조직의 상주줄기세포를 자극하기 위해서 이 경우 응력을 받은 근세포에 의해서 생성되고 CSCs가 반응하는 심근, 성장인자 및 사이토킨은 재생반응을 유발하는 세포 이식과 동일하거나 또는 그보다 효과적인 것으로 보인다. 인슐린-유사 성장인자 1과 간세포성장인자의 조합이 특히 효과적일 수 있다.

한 양태에 있어서, 상주줄기세포는 예를 들어 조직의 재생을 자극하고 표적 세포의 근밀도 및/또는 세포기능을 증진시키도록 활성화된다. 표적세포가 심근인 경우 증진된 기능은 예를 들어 커지거나 수축기능을 증가시키게 된다.

표적세포가 신부전 신장병 환자의 신장세포인 경우 증진된 기능은 EPO를 생성하는 능력을 증가시킬 수 있다.

표적세포가 췌장세포인 경우 증진된 기능은 인슐린을 생성하는 능력을 증가시킬 수 있다.

상기 개시의 제형은 "성숙 조직"에 상주하는 줄기세포를 자극/활성화시킴으로써, 상주줄기가 자극되어 유사분열을 수행하고 성장하므로 환자에게 "줄기세포" 요법을 실행할 필요성을 제거할 수 있다.

상주줄기세포를 자극하는 것은 혈관형성과는 구별된다. 혈관형성은 (조직 또는 종양에서 있을 수 있는) 모세혈관의 성장을 자극하는 과정이다[Husnain, K.H. et al. 2004. J. MoI. Med. 82:539; Folkman, J., and D'Amore, PA. 1996. Cell 87:1153 참조]. 대조적으로, 적절한 리간드를 사용하는 본 발명의 제형이 투여되는 경우 조직 내에 상주하는 줄기세포, 예를 들어 다능성 세포, 원종세포 및/또는 전구세포가 근육세포와 같은 새로운/추가적인 조직세포를 생성하도록 활성화된다.

지금까지 기술된 모든 재생적 접근법은 생물학적 표적의 성질, 사용된 재생제 및/또는 투여경로 및 방식으로 인하여 심각한 한계를 가진다. 이른바 '재생요법'의 대다수는, 모세혈관망을 확장시켜서 혈액 공급을 향상시키기 위해서 손상된 조직에 생존 내피세포를 자극하는 것이 주된 역할인 각종 생물학적 인자 예를 들어 혈관내피성장인자(VEGF)를 사용하여 허혈성 심근의 모세혈관망을 재생시키는 것에 관한 것이다[Isner, J.M. and Losordo, D.W. 1999. Nature Medicine 5:491; Yamaguchi, J., et al, 2003. Circulation 107:1322; Henry, T.D., et al, 2003. Circulation 2003. 107:1359]. 이들 요법에서는 조직 또는 기관의 특징적 기능을 수행하는 유조직 세포, 예를 들어 심장에서의 수축심근세포, 간에서의 간세포, 췌장에서의 인슐린-생성 β 세포 등의 재생을 시도하거나 달성하지 않았다. 상기 요법들은 기껏해야 적절한 효과를 가질 뿐이며 그 중 어느 것도 표준적인 의학적 실시의 일부가 되지 못한다. 한편, 조직 또는 기관의 기능성 세포를 대체하도록 설계된 현재까지의 모든 재생요법은 표적 조직에서의 손실세포의 특징에 관해 취할 수 있다고 여겨진 세포의 이식에 기초하여 왔다. 이러한 접근법들은 여전히 임상실험중에 있다. 사용된 모든 재생적 접근법들에 대한 주요한 결점은 재생제를 손상된 조직에 전달하고 신체의 나머지 전반에 걸쳐서는 그들의 확산을 제한하는 것이다. 이것은 재생제가 조직의 심장동맥나무를 통해서 치료대상에 투여되는 경우 심각한 문제이다. 심장 투여에 의한 심근세포요법의 경우 투여된 세포의 매우 작은 분율만이 심장에 유지되는데 반해, 그의 대부분(95% 초과)은 신속하게 체순환으로 진입하고 신체 전반에 걸쳐서 분포된다. 이것은, 세포 현탁액의 투여로 반복적으로 밝혀진 바와 같이, 재생제가 트랜스-심장외막 또는 트랜스-심장내막으로 심근에 직접 주입되는 경우에도 일어난다. 또한, 트랜스-심장외막 투여는 가슴절개를 통해서 심장을 노출시킬 것을 요구하며, 트랜스-심장내막 투여는, 주입에 적절한 영역을 식별하기 위해서(Noga-유형 기구) 심장내막을 맵핑(mapping)하여야 하는 복잡하고 시간 소모적이며 고비용인 과정, 매우 제한된 수효의 센터에서 이용될 수 있는 과정 및 전문적인 조작자의 참여를 필요로 한다. 두 경우 모두에 있어서, 투여 화합물의 50% 이하가 손상된 영역에 유지되고 나머지는 흉강 전반에 걸쳐서 또는 체순환을 통해서 확산된다. 본 발명의 제형은 표적 조직 또는 기관에 대한 줄기세포의 전달과의 조합으로 사용될 수 있으며 여타의 전달 메카니즘과 비교하여 국부적으로 유지되는 수를 증가시킨다.

그러나, 이러한 개시는 유익한 조직 또는 기관으로의 혈액 공급을 향상시키기 위해서 세포이식 또는 생존 내피세포의 자극 어느 것에도 기초하지 않고 조직 또는 기관의 유조직 세포(즉, 기능성의 "노블(noble)" 세포)를 재생하는 신규한 방법을 기술한다. 대신에, 본원에서 기술된 방법은 손실된 유조직 세포 뿐만 아니라 성장, 생존 및 기능을 위해서 필요한 미세혈관계를 재생하도록 그들의 활성, 복제 및 분화를 자극할 수 있는 특이적 성장인자 및/또는 사이토킨의 국부 전달에 의해서 상기 조직의 상주줄기세포의 자체 자극, 즉 조직 내부의 자극에 기초한다. 이것은, 모든 성체 조직 전부는 아니지만, 인간의 조직을 포함한 포유동물의 조직 대부분은, 적절히 자극될 때 조직 또는 기관에 특이적인 세포 유형 뿐만 아니라 그들을 수반하는 혈관 및 중간엽 지지 세포를 재생할 수 있는 상주줄기세포를 함유하기 때문에 가능하다.

줄기세포를 자극하는 재생제 중 일부는 매우 활성이고 잠복 종양세포 중에서 상호작용하는 각종 세포의 성장 및 이식을 자극할 수 있기 때문에 이들 다수의 인자들의 잠재적인 임상적 적용은 재생되어야 하는 세포에 대한 노출을 가능한 한 많이 제한하기 위해서 매우 국부화된 방식으로 최소 치료학적 용량의 투여를 요구한다. 따라서 투여를 국부화할수록 더욱 낮은 용량이 요구되고 동일하거나 상이한 기관에서의 방관(by-stander) 세포의 자극에 기인한 원치하는 부작용의 위험을 낮출 수 있다. 보다 특히, 전신 또는 조직-와이드 대신에 고체 조직의 특정 영역의 재생을 일으키도록 국부적으로 투여 및 전달된 상이한 성장인자의 치료학적 용량의 사용을 위한 새로운 접근법을 기술한다. 활성 화합물의 전달은 손상된 조직에 국한되기 때문에 요구되는 치료학적 용량은 다른 유용한 전달방법에 요구되는 것의 미소 분율이다. 본 발명의 제형은 다른 적용들 중에서 심근경색 후 및/또는 만성 심부전에서 심근 및 그의 미세혈관계를 재생시킬 수 있다.

한 양태에 있어서, 상기 제형은 손상된 조직의 경계, 예를 들어 경계 또는 허혈성 구역에 투여된다.

줄기세포에 적절한 리간드는 하기 표 1에 수록된 것과 같은 성장인자를 포함한다.

본 발명의 적절한 줄기세포 리간드의 예

HGF(간세포성장인자)

IGF(인슐린-유사 성장인자) 예를 들어 IGF-1

PDGF(혈소판-유도된 성장인자) 예를 들어 PDGF-β

FGF(섬유모세포 성장인자) 예를 들어 aFGF(FGF-1) 또는 bFGF(FGF-2) 및 FGF-4

SDF-1(간질세포-유도된 성장인자 1)

EGF(표피성장인자)

VEGF(혈관내피성장인자)

적혈구형성인자(EPO)

TGF β(전환성장인자 β)

G-CSF(과립구집락자극인자)

GM-CSF(과립구대식세포집락자극인자)

골형태원성단백질(BMPs, BMP -2, BMP-4)

액티빈 A

IL-6

신경영양성 예를 들어 NGF(신경성장인자), 신경레굴린(neuroregulin), BDNF(뇌-유도된 신경영양인자), NT-3(신경자극호르몬-3), NT-4(신경자극호르몬-4) 및, BDNF, NT-3 및 NT-4와 관련되지 않은 NT-1(신경자극호르몬-1)

TPO(혈전형성인자)

GDF-8(미오스타틴), 또는

GDF-9(성장분비인자-9)

페리오스틴(Periostin)

한 양태에 있어서, 사용된 성장인자(들)은 인간이다.

한 양태에 있어서, 사용된 성장인자는 HGF, IGF(예를 들어 IGF-1 및/또는 IGF-2) 및 FGF, 특히 HGF 및 IGF-1로부터 선택된다. 이들 인자는 상주줄기세포를 자극하는데 특히 효과적인 것으로 나타난다.

또한, 성장인자들의 조합이 사용될 수 있으며, 예를 들어 HGF 및 IGF-1 및 임의적으로 VEGF와 같이 상기 목록으로부터 선택될 수 있다.

한 양태에 있어서, 줄기세포를 재생/활성화시키기 위한 제형은 활성 성분만으로서 VEGF만 구성되지 않고 예를 들어 VEGF를 포함한 활성 성분들의 조합을 포함할 수 있다.

그럼에도 불구하고, 상기 제형은 혈관형성인자로서 VEGF의 국부화된 전달에 적합하다.

한 양태에 있어서, 성장인자제형은 혈관형성인자와의 조합으로 사용되며, 예를 들어 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해서 부수적으로 또는 순차적으로 투여된다.

한 양태에 있어서, 상기 제형은 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-6, IL-IO, IL-17, IL-18 및/또는 인터페론으로부터 선택된 사이토킨을 포함한다.

한 양태에 있어서, 상기 제형은 활성 성분들, 예를 들어 성장인자 및 사이토킨을 포함한다.

조합제형에 있어서, 활성 성분 각각의 용량은 예를 들어 활성 성분이 단독으로 투여되는 경우에 사용된 것과 동일 용량일 수 있다.

본 발명의 제형 및/또는 방법에 사용된 성분들, 특히 생물학적 유형의 활성 성분들은 천연 기원으로부터 유도될 수 있다.

한 양태에 있어서, 사용된 생물학적 유형 활성 성분은 재조합 DNA 기술에 의해서 제조될 수 있다.

한 양태에 있어서, 투여된 활성 성분(들)은 원하는 치료학적 효과를 갖는 생물학적 분자의 펩티드 분절일 수 있다.

하나 이상의 양태에 있어서, 사용된 분자들은 대응하는 생물학적 분자에 대해 동일하거나, 높거나 또는 낮은 친화도가 있는 원하는 치료학적 효과를 갖는 생물학적 분자(예를 들어 수용체의 리간드)의 돌연변이주이다.

한 양태에 있어서, 사용된 물질(들)/활성 성분은 앱토머(aptomer)(천연 리간드 대신에 수용체와 결합하는 작은 RNA 분자)이다.

한 양태에 있어서, 사용된 물질/활성 성분은 표적 수용체를 인식하고 그것에 결합하며, 특히 그에 대해 적절한 특이성 및/또는 항원항체 결합력(avidity)을 갖는 항체이다. 바람직하게는, 항체는 수용체를 상향 또는 하향 조절함으로써 그것을 적당히 활성화 또는 차단시키는데 필요한 활성을 갖는다.

한 양태에 있어서, 활성 성분은 유익한 2개의 수용체를 인식하고 그것에 결합하여 그 중 하나 및/또는 다른 것을 활성화 또는 차단시키는 인공 항체 분자인 디아퀸(diaquine)이다.

한 양태에 있어서, 사용된 물질/활성 성분은 5,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 분자이다.

한 양태에 있어서, 사용된 하나 이상의 활성 성분은 합성기원일 수 있다.

원하는 기관 또는 조직을 표적화하기 위해서 본원에 개시된 제형에 있어서 상기 제형은 기관 또는 조직의 업스트림으로 투여되어야 한다. 즉 혈류가 상기 제형을 원하는 조직/기관으로 운반하는 순환으로 도입되어야 한다.

상기 제형은 카테터와 같은 적절한 장치를 사용한 심장과 같은 기관의 업스트림으로 도입될 수 있다. 다른 주요한 기관은 이러한 방식으로 도달될 수 있다. 드물기는 하지만 유사하게는, 간에 대한 접근성을 획득하는 카테터를 사용할 수도 있다.

다른 경우에 있어서, 상기 제형은 전략적 동맥내 주사 또는 역방향 정맥주사 및/또는 표적 조직 앞의 캐뉼러(cannular)에 의해서 도입될 수 있다.

상기 제형은 또한 카테터 삽입도중 헤파린 또는 모르핀 또는 조영제의 투여에 사용된 유형의 주사기 펌프와 같은 펌프 구동 전달장치 또는 주입에 의해서 투여될 수 있다. 적절한 유속은 예를 들어 0.5 mL/min일 수 있다.

상기 제형은 또한 동맥내풍선으로 주사부위로부터의 혈류 다운스트림 속도를 느리게 하면서 카테터의 내강을 통해서 조직의 관류를 유지시키는 이른바 관류 카테터를 통해서 투입될 수 있다.

특히 적절한 양태에 있어서, 상기 제형은 표적 조직 또는 기관의 동맥 업스트림으로 투여된다.

한 양태에 있어서, 카테터는 본 발명의 제형을, 표적 조직 또는 기관을 공급하는 동맥으로 전달하는 것이 사용된다. 특히 상기 제형은 조직 또는 기관의 영역을 공급하는 분절적 동맥으로 배타적으로 (기본적으로 또는 실질적으로) 전달될 수 있다.

한 양태에 있어서, 사용된 카테터는 풍선 카테터이다.

한 양태에 있어서, 카테터는 필요한 50㎛ 초과, 25㎛ 초과, 20㎛ 초과의 미립자 응집물의 방출을 방지하거나 또는 저지하기에 충분히 작은 포어 크기를 갖는 필터 메쉬를 그의 원위말단에 지닌다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 출생후 심장에 상주하는 심장줄기세포이다.

한 양태에 있어서, 얻어진 재생은 함께 또는 개별적으로 모세혈관(내피세포) 및/또는 세동맥(내피 및 혈관평활근세포)을 포함한다.

한 양태에 있어서, 재생은 급성 또는 만성인 심근경색(MI)이 있은 후 언제든지, 예를 들어 급성 경색 후 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 24시간까지 유도된다.

한 양태에 있어서, 재생은 심근경색의 존재 또는 부재의 허혈성 심장병을 갖는 환자에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 재생은 급성 또는 만성인 심부전(CF)이 발생한 개체의 심장에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 재생은 허혈성, 감염성, 퇴행성 또는 특발성 심근병을 갖는 환자에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 내분비 췌장에 상주하는 줄기세포(랑게르한스섬의 줄기세포)이다.

한 양태에 있어서, 재생은 당뇨병을 갖는 개체에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 중추신경계(CNS)의 신경줄기세포이다.

한 양태에 있어서, 표적줄기세포는 척수의 신경줄기세포이다.

한 양태에 있어서, 재생은 척수병변을 갖는 개체에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 예를 들어 파킨슨병을 갖는 개체에서 뇌의 흑색질의 줄기세포이다.

한 양태에 있어서, 재생은 뇌혈관사고(뇌졸중)을 갖는 개체에서 유도된다.

이론에 의해서 제한되기를 원하지는 않지만, 본 발명의 제형에 사용된 리간드는 뇌졸중 등을 치료하도록 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 교차할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 뇌혈관사고에서 혈액뇌관문이 손상되고 화학물질이 상기 관문을 보다 용이하게 관통할 수 있는 것으로 여겨진다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 간줄기세포이며 예를 들어 재생은 간경화와 같은 간손상을 갖는 개체에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 폐의 줄기세포이며 예를 들어 재생은 기종과 같은 폐손상을 갖는 개체에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 골격근의 줄기세포이며 예를 들어 재생은 골다공증 또는 파제트병과 같은 특정한 골격근결핍을 갖는 개체에서 유도된다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 상피의 줄기세포이다.

한 양태에 있어서, 표적세포는 신장의 줄기세포이다.

본원에서 사용된 표적세포는 자극받고 원하는 재생을 제공하는 잠재력을 갖는 세포를 지칭한다.

본 발명의 제형은 표적 조직 또는 기관에 대한 상응 활성 성분의 정확한 및/또는 재현가능한 용량을 보장하도록 최적화된 파라미터 및 물질을 제공한다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 제형은 항종양제를 종양조직으로 예를 들어 종양내 주사에 의해서 국부 전달함으로써 고체 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 종양의 치료에 적절한 활성 성분은 에토포시드, 사이클로포스파미드, 제니스타인, 시스플라틴, 안드리아미신, 빈데신, 미토구아존, 피우로우라실 및 파클리탁실을 포함한다.

한 양태에 있어서, 상기 제형은 암 치료용이 아니다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 종양 또는 조직 내로의 직접 투여가 아니다.

본 발명에 따른 방법은 예를 들어 부수적으로 또는 순차적으로와 같이 개별적으로 투여된 활성 성분들의 조합물을 사용하거나 또는 하나의(1-포트) 제형으로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 제형은 예를 들어 인산염 완충액, 식염수(saline) 또는 글루코스 용액과 같은 등장성 담체 중의 액체 용액/현탁액으로서 투여될 수 있다.

본 발명의 제형은 임의적으로는 하나 이상의 추가적인 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 인간 및/또는 동물에게 투여하기에 적합하여야 한다.

한 양태에 있어서, 상기 제형은 예를 들어 제형 중에서 소량의 활성 성분을 안정화시킬 수 있는 용액 중의 알부민을 포함하며, 예를 들어 인간 혈청 알부민과 같은 알부민의 1% 내지 20% w/vol는 요구되는 안정화를 성취하는데 충분할 수 있다.

본 발명은 또한 치료를 위한, 특히 심근경색; 허혈성 심장병; 심부전; 허혈성, 감염성, 퇴행성 또는 특발성 심근병, 굳음증(sclerosis), 경화증(cirrhosis), 기종, 당뇨병 등의 치료를 위한 본원에서 정의된 제형으로서의 용도로 확장된다.

한 양태에 있어서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 특히 위에서 기술한 질병의 치료를 위한 본원에서 기술된 제형에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에서 기술된 치료학적 유효량의 제형을 투여하는 것을 포함하는 치료방법, 특히 위에서 기술한 질병의 치료방법으로 확장된다.

본 발명은 또한 생체내에서 상주줄기세포를 자극하여 그 세포를 활성화시키기 위한, 예를 들어 본원에서 기술된 바와 같은, 리간드의 용도로 확장된다.

본 발명은 또한 생체내에서 상주줄기세포를 자극하기 위한 약제의 제조에 적절한 성장인자의 용도를 포함한다.

본 발명은 실시예를 참조로 하여 설명된다.

실시예

개 요

제 1 중격가지(septal branch)에서 먼 전방하행심장동맥의 임시풍선폐쇄에 의해서 암컷 피그에서 전방심근경색(anterior myocardial infarction)을 발병시켰다. 이러한 과정은 재현가능한 적절한 크기의 전방-치근첨단경색을 일으켰다. 경색된 피그 심근에서 상이한 용량으로 결합된 인슐린-유사 성장인자 1 및 간세포성장인자를 국부 투여함으로써 상기 인자들의 심근 재생 잠재력을 시험하였다. 대조 동물들은 플라세보(placebo)로 처리하였다.

23마리의 피그에서 제 1 중격동맥의 이머젼시(emergence) 바로 아래의 전방하행좌심장동맥에서 풍선확장에 의해서 폐쇄된 가슴을 갖는 실험 모델에서 발병시킨 급성 포스트-MI에서의 재조합 인간 IGF-1 및 HGF의 혼합물을 함유하는 용액의 직접 투여에 의해서 미량의 치료학적 제제를 국부 투여할 때 치료학적 효과를 생성하는 실행가능성을 시험하고, 이를 동일하게 처리된 3개의 플라세보 대조군과 비교하였다.

물질 및 방법

수 일 내지 1개월의 심근경색 후 상이한 시점에서 심장을 분석하였다. 그 결과는 인간 IGF-1 및 HGF로 처리한 피그의 허혈 영역 및 그의 경계에서 활성화된 줄기 및 원종세포 수의 현격한 증가를 보여주었다. 근육의 두드러진 재생이 허혈성 영역에서 관측되었으며, 이것은 또한 새로이 형성된 세동맥 및 혈관을 함유하였다. 재생반응은 투여된 성장인자의 용량에 비례하는 것으로 보였었다. 이들 예비적 데이터로부터, CSCs의 치료학적인 자체 활성화가 대규모의 새로운 심근조직형성을 일으키며 인간 심장과 크기 및 해부학이 유사한 동물 심장에서 좌심실 기능을 상당히 증진킴을 알 수 있다.

c- kit ^pos 돼지심장세포의 분리

암컷 요크셔 화이트 피그들(23±4 kg; n=3)의 상이한 영역(좌우심방, 좌우 심실 및 어펙스(apex))로부터 여러 개의 심장 샘플(각각 대략 2g)을 얻었다. 조직화학적 분석을 위해 일부 샘플을 고정시키고 파라핀에 임베딩시켰다. 다른 조각을 효소적으로 증해(digest)시키고 변형으로 종래 문헌(Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114:763)에 기술된 바와 같이 심근세포-제거된 심장세포 현탁액을 제조하였다. 간략하게는, 민싱(mincing)된 심장조직을 37℃에서 한크 밸런싱된 염 용액(Hanks' balanced salt solution; HBSS) 완충액 중의 0.1% 콜라게나제(Worthington Biochemicals), 0.1% 트립신(Sigma), 0.1% DNAse I로 증해시키고 작은 심장 세포 분획을 원심분리를 통해서 수집하였다. 심장의 작은 세포를 항-인간 CD117(c-kit) Ab(Miltentyi Biotechnology)로 항온시키고 형광표지세포분류(FACS; MoFIo (Dako Cytomation) 세포 분류기) 또는 자기 활성화 미세면역비드(magnetic activated micro-immunobeads; MACS)에 의해서 분류하였다. 프로피오디움 요다이드(PI; 2㎍/mL)를 FACS 전에 첨가하여 사세포를 배제시켰다.

c-kit^pos 돼지 심장세포를 팍스칼리버 유동 세포측정기(FacsCalibur flow cytometer; 제조원: Becton Dickinson, BD)를 사용하여 조혈성, 중간엽 및 내피 세포 표지에 대해 분석하였다. 사용된 항체는 항-돼지 CD45(Serotec, Clon: MCA1447), 항-인간 CD34(BD, clon 8G12), 항-인간 CD90(BD, Clon:5E10, 피그 교차-반응성) 및 항-인간 CD 166(BD, Clon: 3A6, 피그 교차-반응성), 항-인간 CD 105(Caltag Laboratories, Clon: SN6, 피그 교차-반응성) 및 항-인간 CD 133(Miltenyi Biotec, clon AC 133, 피그 교차-반응성)이었다. PECAM, E-카드헤린, CDl Ib, CD13, CD14, CD29, CD31, CD33, CD36, CD38, CD44, CD49, CD62, CD71, CD73, CD106에 대해 특이적인 항-인간 항체는 비디 바이오사이언스(BD Biosciences)로부터 구입하였다. 각각의 이소타입 대조군(Pharmingen)을 모든 FACS 과정에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 셀퀘스트 소프트웨어(CellQuest software)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

돼지 c- kit ^pos 심장세포 배양, 클로닝 , 및 분화 잠재력

c-kit^pos 세포를, 10% FBS, bFGF(10ng/ml), 인슐린-트랜스페린-셀레나이트(ITS), 및 EPO(2.5U)를 함유하는 덜벡코스 MEM/함스 F12(Dulbecco's MEM/Ham's F12; DMEM/F12) 변형된 배지에서 2 x 10⁴개의 세포/ml로 7 내지 10일동안 평판 배양하였다. 회수 후, 심장구(cardiosphere)의 생성을 위해서 일부 세포들을, 변형된 심장구 형성 배지(mCSFM)로 옮겼다: 1:1의 비의 DMEM/F12, bFGF(10 ng/ml), EGF(20 ng/ml), ITS, 2-β-머캅에탄올(O.lmM) 및 B27 및 N2 보충제(Gibco)로 보충된 네우랄 바설 배지(Neural Basal Media). 클론원성(clonogenicity)에 대해 시험하기 위해서 단일 c-kit^pos 세포를 유동 세포측정기로 96-웰 젤라틴 코팅된 테라사키 플레이트의 웰(well)에 개별적으로 시딩(seeding)하였다. 클론이 식별되고 팽창되었을 때 개별적인 c-kit^pos 세포를 DMEM/F12 변형된 배지에서 1 내지 3주동안 성장시켰다. c-kit^pos 세포의 클론원성을 각각의 웰 플레이트에서 생성된 클론의 수를 계수함으로써 측정하고 이를 백분율로 나타내었다. 심장영역당 총 10개의 플레이트를 분석하였다. 클론원성 세포 및 심장구를, 근세포, 혈관평활근 및 내피세포 규격(specification)을 위한 특이적 심장 분화 배지(42로부터 변형됨)로 옮겼다.

제조업자 지침(Chemicon)에 따라 변형된 보이덴 챔버(Boyden chamber)를 사용하여 세포이동평가를 수행하였다. 200 ng/ml HGF 또는 200 ng/ml IGF-1를 24 웰 플레이트의 저부 챔버에 24시간동안 위치시켰다. 증식평가를 위해서 2.5 x 10⁴개의 pCSCs를 24 x 35mm 접시에서 평판 배양하고 0% 혈청 DMEM/F 12 베이스 배지에서 36시간동안 혈청 기아 배양(serum starvation)하였다. 6개의 접시를 베이스라인 대조군으로서 실행하고, BrdU(lug/ml)를 보충한 후 고정시키고 1시간 넘게 염색하였다. 이어서 3% FBS 및 200ng/ml HGF(n=6 접시) 또는 200 ng/ml IGF-1(n=6 접시)를 보충한 DMEM/F 12 베이스 배지를 나머지 12개의 접시에 부가하였다. 6시간 마다 BrdU를 1㎍/ml 첨가하였다. 24시간 후 세포를 고정시키고 BrdU 검출 시스템 키트(Roche)를 사용하여 BrdU 도입을 평가하였다. 핵을 DNA 결합 염료인 4,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, Sigma)를 1㎍/ml로 사용하여 대비 염색제로 염색하였다. 세포를 형광현미경(Nikon ElOOOM)을 사용하여 평가하였다. 각각의 접시에 대해 ×20배 확대에서 10개의 랜덤한 영역이 계수되었으며, 그 수를 계수된 세포의 총수에 대해 BrdU 양성 세포의 백분율로서 나타내었다.

면역세포화학

세포를 유리 챔버 슬라이드(BD Falcon)에서 2일동안 배양하고, 4% PFA로 20분동안 고정시킨 다음, 염색하였다. 세포내 염색을 위해서 세포를, 0.1% 트립톤 X-100을 사용하여 예비대사시켰다. 세포를 4℃에서 1차 항체로 밤새 배양하고, 3회 세척한 다음, FITC- 또는 텍사스 레드-콘쥬게이트된 2차 항체로 37℃에서 1시간동안 항온시켰다. 이어서, 세포를 3회 세척하고 핵을 DAPI를 사용하여 대비 염색제로 염색시켰다. 형광이 보였으며 동일초점 현미경(Zeiss LSM510)으로 사진을 얻었다. 세포 염색을 위해서 하기 항체를 사용하였다: Oct3/4, Nanog, Isl-1, c-kit, Flk-1 , 및 Nkx2.5(R&D Systems); Bmi-1, c-met 및 IGF-1r(Santa Cruz Biotechnology), 텔로머라제(telomerase)(Abcam). 유리 챔버 슬라이드에서 24시간 배양 후 심장구를 c-kit를 위해 염색하였다. 구로부터 세포의 성장 및 분화를 가능하게 하는 배양에서 4 내지 6일 경과 후 그것들을 평활근 액틴, α-사르코머릭 액틴(Sigma) 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)(DAKO)로 염색하였다. 모든 2차 항체는 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)로부터 구입하였다.

웨스턴 블롯 분석( Wester Blot Analysis )

혈청기아배지(serum starvation medium)에 24시간동안 적용시키고 200ng/ml IGF-1 또는 200ng/ml HGF로 10 내지 20분동안 보충시킨 c-kit^pos pCSCs로부터 얻은 단백질 용해물을 사용하여 종래 문헌(Ellison et al. 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397)에 기술된 바와 같이 IGF-1(IGF-1R) 및 HGF(c-met) 수용체를 검출하는 면역블롯을 수행하였다. 제조업자에 의해서 제안된 희석으로 다음 항체가 사용되었다: 래비트 다클론 Abs IGF-1R, 인광체-IGFIR, Akt, 인광체-Akt, c-met(Cell Signalling), 인광체-c-met(Abcam), FAK, 및 인광체-FAK(Upstate).

조직학

심방절제 후 심장을 종축에 수직인 절단으로 어펙스(apex)으로부터 기저(base)까지 5개의 관상 절편으로 분할시켰다. 각각의 피그로부터의 각각의 수준으로부터 경색, 경색주위 및 말단 심근의 샘플을 얻었다. 샘플을 PBS로 세척하고, 10% 포르말린 속에 고정시키고 파라핀 임베딩하였다. 5㎛ 절편들을 박절기(Sakura) 상에서 제조하고 현미경 슬라이드 상에 배치하였다. 절편들을 표준방법(Ellison et al. 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397)에 따라 헤마톡실-에오신(H&E)을 사용하여 염색하였다. 루시카 지 소프트웨어(Lucia G software)를 사용하는 광현미경(Nikon ElOOOM) 상에서 수준 C 및 D로부터의 경색주위 영역의 H&E 절편들(동물당 3개의 슬라이드)에서 핵에 대해 근세포 직경을 측정하였다. 각각의 피그에 대해 절편당 총 200개의 근세포가 분석되었다.

심근 섬유증을 측정하기 위해서, 경색된 심근의 절편들을 종래 문헌(Lee, CG. et al., 2001. J. Exp. Med. 194:809)에 기술된 바와 같이 시리어스 레드(Sirius red)를 사용하여 염색하였다. 연속 절편들을 PBS 중의 10% 포르말린 속에 20분동안 고정시켰다. 증류수 속에서 5분동안 세척한 후, 절편들을 pH9의 마그네슘 보레이트 완충액 중의 0.1% 패스트 블루 알알(Fast Blue RR; 제조원: Sigma) 속에서 실온에서 30분동안 항온시켰다. 이어서 절편들을 증류수 속에서 세척한 다음, 포화 피크릭산 중의 0.1% 시리어스 레드(Sigma)에서 실온에서 10분동안 항온시켰다. 절편들을 증류수 속에서 추가적으로 세척한 다음, 탈수시키고, 세정하고 배치하였다. 이러한 프로토콜에서, 결합조직(주로 콜라겐)은 레드 염색하고 근육은 옐로우/오렌지 염색한다. ×40 확대의 루시아 지 영상 분석(Lucia G image analysis)을 이용하여 심근결합조직의 양의 반정량평가(semi-quantitative evaluation)를 수행하였다. 전체 경색구역 중에서 콜라겐 백분율(포지티브 염색의 면적 백분율)을 측정하였다. 각각의 수준에 대해 동물당 총 3개의 슬라이드를 평가하고 평균을 구하였다.

면역조직화학 및 동일초점 현미경

CSCs를 동정하기 위해서 가로 피그 심장절편들을 c-kit(래비트 다클론; 공급원: Dako)인 줄기세포항원에 대한 항체로 염색하였다. c-kit^pos CSCs를, 조혈성, 신경성 및 골격근 계통(21)의 표지에 대해 네가티브 염색함으로써 계통-음성(Linne§)으로서 동정하였다. 대조 피그의 상이한 심장영역에서의 CSC 심근분포의 정량에 있어서, c-kit^pos (lin^neg) 세포 및 심근세포를 ×63 확대로 총 5개의 절편에 대해 계수하였다. 이어서 각각의 횡단면의 면적을 측정하고, 단위면적당 CSCs 및 심근세포의 수를 계측하였다. 심방에 대한 데이터는 우심방 및 좌심방에서 c-kit^pos CSCs의 수 사이에서 발견된 적은 차이로 인하여 풀링(pooling)되었다.

BrdU(Roche) 및 Ki67(Vector labs)에 의해서 주기세포를 동정하였다. 원종세포는 c-kit 및 전사인자, Nkx2.5(R&D Systems), Ets-1 및 GATA6(Santa Cruz Biotechnology)에 대해 포지티브 염색하였다. 새로 형성된 근세포를 BrdU, Ki67 및 α-사코머릭 액틴(Sigma), 심장 트로포닌 I(Santa Cruz Biotechnology) 또는 느린 (심장) 미오신 중쇄(Sigma)에 대한 항체로 동정하였다. BrdU 및 α-평활근 액틴(마우스 단클론; 제조원: Sigma) 또는 vWF(래비트 다클론; 제조원: Dako)에 대해 염색함으로써 새로 형성된 혈관구조를 검출하였다. 동일초점 현미경(Zeiss 510 LSM)을 사용하여 사진을 얻었다. CSCs, 근세포 원종세포(c-kit^pos/Nkx2.5^pos), 및 새로 형성된 근세포(BrdU^pos 및 ki67^pos)의 수를 각각의 수준에서 경색, 경색주위 및 말단 영역에 대해 정량하였다. ×63 확대로 각각의 영역에 대해 총 3000개의 세포(대략 20개의 필드)를 계수하였다. 동물당 3개의 슬라이드를 평가하였다. 수는 계수된 세포 총수에 대한 백분율로 나타내었다. 경색 및 경색주위 영역에서 동물당 50개의 BrdU^pos 새로 형성된 근세포의 크기를 루시아 지 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

vWF(DAKO)에 대한 항체로 염색함으로써 경색 영역에서의 모세혈관의 밀도를 평가하였다. 사용된 2°AB는 HRP(Santa Cruz)와 콘쥬게이트된 동키 항-래비트(donkey anti-rabbit)이었다. 상기 절편에서 내인성 퍼옥시다제를 실온에서 15분동안 PBS 중의 3% 과산화수소로 차단하였다. 색소원 3,3-디아미노벤지딘(DAB)(Sigma)을 사용하여 혈관을 보이게 하였다. 핵의 동정을 위한 헤마톡실린을 사용하여 슬라이드를 대비 염색제로 염색하였다. (vWF-포지티브 혈관둘레를 스패닝(spanning)한 1개 또는 2개의 내피세포로서 정의되는) 모세혈관의 수를, ×40 확대로 수준 C 및 D에서 경색구역 중의 10개의 필드/절편을 계수함으로써 측정하였다. 총 3개의 슬라이드/동물을 평가하였다. 0.2mm 당 모세혈관의 수를 나타내었다.

세포자멸사를 검출하기 위해서 절편들을 래비트 항-인간 활성화된 카스파제-3 기본 항체(R&D Systems) 및 동키 항-래비트 HRP-콘쥬게이트된 2°AB로 염색하였다. 색소원 DAB(Sigma)를 사용하여 세포자멸사 심금세포를 보이게 하였다. 이어서 절편들을 해마톡실린으로 대비 염색제로 염색하고 영구 배치한 다음, 광현미경으로 검사하였다. 수준 C 및 D의 경색주위 구역에서 카스파제-3 양성 근세포의 수를, ×40 확대로 20개의 랜덤한 필드/절편을 계수함으로써 측정하였다. 총 3개의 슬라이드/동물을 평가하였다. 카스파제-3 양성 근세포의 양을 계수된 근세포의 총수에 대한 백분율로 나타내었다.

통계학적 분석

데이터는 평균 ± SD로 보고된다. 2 그룹 사이의 유의성을 스튜던트 티 시험(Student's t test)에 의해서 및 분산의 분석에 의한 다중 비교(ANOVA)로 결정하였다.

본페로니 포스트 호크 방법(Bonferroni post hoc method)을 사용하여 그 차이를 밝혀냈다. 유의성은 P<0.05로 정해졌다.

실시예 1

PLGA 미세구의 제조

하나의 세트는 인간혈청 알부민(HSA) 및 인슐린-유사 성장인자 1(IGF-1)의 혼합물을 함유하고 다른 세트는 HSA 및 간세포성장인자(HGF)의 혼합물을 함유하는 2개의 세트의 PLGA 및 알기네이트의 미세구를 제조하였다. HSA를 사용하여 필요한 매우 소량의 성장인자로 주어진 에멀젼에 충분한 벌크를 제공하였다.

PLGA 미세구를 형성하기 위해서 사용된 조건은 다음과 같다: 포커싱(focussing)된 액체가 PLGA+HSA+성장인자의 에멀젼이며 포커싱하는 액체가 물인 액-액 원심분리에 분무기 플로우 포커싱 오브 인제니이이트릭스(Flow Focussing of Ingeniatrics)(D=150㎛, H=125)를 사용하였다.

지질상은 EtOAc(에틸아세테이트) 중의 5% PLGA로 구성된다. 수성상은 H₂O 중의 5% HSA, 0.1% 성장인자, 0.45% NaCl, 0.25% 트윈(Tween) 20로 구성된다.

2개의 상의 혼합물을 30분동안 초음파 처리하였다. 미세소적은 2% 폴리비닐 알콜의 욕(PVA, Fluka Chemica)에서 생성된다.

입자의 크기는 포커싱된(Qd) 및 포커싱하는(Qt) 유체의 유동용적에 의해서 조절된다. 15±1 미크론의 입자를 얻기 위해서, Qd=3.5 mL/h 및 Qt= 3 mL/h가 사용되었다. HSA+IGF-1 혼합물의 엔캡슐화 효율은 37%이었다. 입자의 크기는 광학 및 전자현미경에 의해서 확인되었다(도 8 참조).

미소 변형을 갖는 동일한 과정을 사용하여 HGF-함유 PLGA 입자를 제조하였다.

실시예 2

직경 15㎛의 단분산 PLGA 미세구 생성의 최적화

투여되는 미세구의 수를 감소시키도록 엔캡슐화 효율을 최적화하기 위해서 하기 파라미터에서의 변형으로 사용된 조건을 최적화하였다:

a. 지질상에서의 에멀젼화제의 도입

최적의 조합은 5시간까지 안정될 수 있는 에멀젼을 생성한 트윈 80 및 스팬(Span) 60의 혼합물인 것으로 밝혀졌다.

b. 단백질(인간혈청알부민; HSA) 농도의 최적화

5% 대신에 20%의 HSA

c. 0.45% 대신에 0.2%로의 수성상 중의 NaCl 농도의 최적화

d. EtOAc 중에서 5% 대신에 5.5%로의 PLGA 농도의 최적화

e. 초기 혼합물에서 HGF-1의 농도는 0.4%이었다.

따라서 수성상은 20% HSA, 0.4% IGF-1; 0.2 NaCl; 0.1 트윈 20; 0.15 스팬 60으로 구성된다. 유기상은 EtOAc(에틸 아세테이트) 중의 5.5% PLGA로 구성된다.

실시예 1에서 기술한 조건을 사용하여 단순 유동 포커싱함으로써 미세소적을 얻었다.

SEM에 의해서 결정된 입자의 크기는 14.36㎛이었으며, 이때 표준편차(SD)는 0.91이었고, 엔캡슐화 효율은 82.4이고 13.1%의 포착률을 가졌다. 정량적인 ELISAs에 의해서 보완된 단백질 측정은 각각 1 x 10⁶개의 미세구가 IGF-1 3㎍ 및 HSA 348㎍을 보유한 것임을 기록하였다. 생세포의 IGF-1 수용체를 결합하고 활성화하는 능력에 의해서 시험된 미세구에 함유된 IGF-1의 생물학적 시험관내 평가는 동결건조 및 재현탁의 1 라운드 후에 엔캡슐화된 IGF-1이 원래 생물학적 활성의 82%를 유지하였음을 보여준다. 따라서, 미세구 1백만개 각각은 고유 IGF-1 2.5㎍의 생물학적 활성 당량을 가졌다.

유사한 프로토콜을 사용하여 HGF를 엔캡슐화하였으며, 1 x 10⁶개의 입자당 엔캡슐화된 HGF 1.7㎍은 원래의 63% 생물학적 활성을 가졌다. 따라서, HGF 미세구 100만개 각각은 활성 HGF 1㎍ 당량을 전달할 수 있다.

c-kit 수용체를 위한 리간드인 SCF(줄기세포인자)의 엔캡슐화는 c-kit 수용체의 활성화를 통해서 측정한 바와 같이 원용액의 76% 활성을 갖는 1 x 10⁶개의 미세구당 SCF 2.3㎍을 함유하는 입자를 생성하였다.

결론: 사용된 단일 유동 포커싱 과정은 HSA 및 상이한 성장인자의 혼합물의 엔캡슐화에서 매우 효율적이다. 성장인자에 대한 HSA의 초기비를 변경시키는 경우 6% 이하의 변이계수(variation cofficient)를 갖는 직경 15㎛의 PLGA의 1 x 10⁶개의 미세구당 원하는 약리학적 단백질 350㎍까지의 로딩값에 이를 수 있다.

실시예 3

단분산 알기네이트 ( ALGINATE ) 미세구의 제조 및 IGF -1의 엔캡슐화

미세구의 제조에 사용된 시료 및 장비는 다음과 같다:

- 알기네이트: Protanal LF 10/60; FMCBioPolymer(G/M≥1,5); Protanal LF10/60LS; FMCBioPolymer(G/M≤1).

- 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터의 HSA(인간혈청알부민, 97-99%, A9511)

- 프리프로텍트(PreProtect)로부터의 IGF-1

- CaCl₂; 삼염기성 시트르산나트륨

- 액체-기체 원심분리에서 단순한 분무기 FF(Nebulizers FF): L2(D=lOO㎛, H=1OO) 및 L3(D=lOO㎛, H=1OO)

- 하바드 펌프 11 플러스(Harvard pump 11 plus)

적절한 조건을 설정하는 120회 이상의 평가 후에, 알기네이트의 혼합물은 단일의 알기네이트 보다 좋은 결과를 제공하는 것임이 명백해졌다. 0.7%:0.3% 비에서 Protanal LF 10/60:Protanal LF10/60LS는 최적의 결과를 얻었다. 분무를 위한 최적의 거리는 10㎝인 것으로 밝혀졌다. 혼합물 중의 HAS의 최적농도는 14%이고 IGF-1은 0.3%이었다. 이러한 혼합물은, 포커싱 유체로서 기체를 사용하는 액체-기체 원심분리(ΔPt=300 mbar, Qd = 5 mL/h)에서 FF(D=100㎛, H=100)를 사용하여 분무된다. 분무기는 진탕욕 중의 3% CaCl₂ 용액의 10㎝에 위치시키고, 30분 후 원심분리로 수집하고 세척하여 CaCl₂를 제거한다. 입자의 크기분포를 유동 세포측정기 및 SEM으로 측정하였다. HSA의 엔캡슐화 효율은 단백질 정량화 및 표준곡선으로 측정하였다. hrHGF-1의 엔캡슐화는 실시예 2에서 기술한 ELISA에 의해서 측정되었다.

SEM에 의해서 측정된 입자의 크기는 15.87㎛이었으며, 이때 SD는 1.83이었고, 엔캡슐화 효율은 71.4이고 11.6%의 포착률을 가졌다. 정량적인 ELISAs에 의해서 보완된 단백질 측정은 각각 1 x 10⁶개의 미세구가 IGF-1 대략 2㎍ 및 HSA 269㎍을 보유한 것임을 기록하였다. 생세포의 IGF-1 수용체를 결합하고 활성화하는 능력에 의해서 시험된 미세구에 함유된 IGF-1의 생물학적 시험관내 평가는 동결건조 및 재현탁의 1 라운드 후에 엔캡슐화된 IGF-1이 원래 생물학적 활성의 67%를 유지하였음을 보여준다. 따라서, 미세구 1백만개 각각은 고유 IGF-1 1.5㎍ 이하의 생물학적 활성 당량을 가졌다.

이러한 프로토콜은 FF 분무기 뿐만 아니라 기타 분무방법을 사용하는 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT) 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)[Poly Active(등록상표)]의 폴리에테르-폴리에스테르 분절된 블록 공중합체와 같은 상이한 유형의 중합체가 사용되는 것에 적합할 수 있다.

결론: 알기네이트는 15㎛의 적절한 직경을 갖는 단분산 미세구의 제조 및 다량의 단백질의 엔캡슐화에 적절한 중합체이다. 사용된 프로토콜은 IGF-1 대 HSA의 비를, 활성 화합물의 로드를 2개 등급 초과의 규모까지 증가시키는 60:40까지 증가시키도록 변형될 수 있다. 얻어진 결과로부터, 15㎛의 피크 주위에서 크기범위는 여기서 시험된 알기네이트들의 조합을 갖는 것보다 PLGA를 사용하는 경우에 더 좁다. 다수의 상이한 알기네이트 제제를 제공하는 경우 여기서 발견된 미립자의 균질성이 현저히 개선될 수 있을 것으로 고려된다.

실시예 4

활성 화합물이 입자의 표면에 위치되는 미세구를 생성하기 위해서 결합되는 활성 화합물에 대해 반대신호의 전하의 PLGA 대신에 고분자전해질을 사용하여 위에서 나타낸 미세구를 제조할 수 있다. 상기 고분자전해질의 예는 아라비아검, 펙틴, 단백질, 핵산, 다당류, 히알루론산, 헤파린, 카복시메틸셀룰로즈, 키토산, 알긴산 및 다수의 중합체이다. 고분자전해질이 활성 화합물에 대해 반대신호의 전하를 갖는 경우 활성 화합물의 용액으로부터의 흡수에 의해서 그것을 미립자에 부착시킬 수 있다.

실시예 5

직경 15㎍의 미세구가 체순환에 대한 유출(spillover)없이 심장내 투여후 모세혈관 포착에 최적이다.

암컷 요크셔 화이트 피그(n=2)(27kg)를 텔라졸(lOOmg, I.M.)로 진정시키고, 항온시키고 쉐이빙(shaving)하였다. 정맥내 카테터를 말초 이정맥에 위치시켰다. 동물을 수술실로 옮기고, 지지판 위에 놓고, 사지 결합기구(limb binding)로 수술대에 고정시켰다. 동물들은 이소플루란(O₂ 중의 2%)를 사용한 마취를 유지시키고 그들의 EKG를 그 과정 전반에 걸쳐서 연속적으로 모니터링하였다. 형광투시(fluoroscopic guidance)를 위한 휴대가능한 방사선원(제조원: GE STENOSCOP, GE Medical Systems USA)을 사용하여, 좌측 주심장동맥을 프로토콜용으로 특수 설계된 길이 40㎝의 6F 유도 카테터 JR 3.5(6F guiding catheter JR 3.5; 제조원: Cordynamic-Iberhospitex S. A. Barcelona, Spain)로 항온하였다. 베이스라인 심장 조영을 수행하였다.

두 동물 모두에서, 직경 2㎜의 심장 유도 카테터를 좌측 심장동맥의 기원에 대해 유도 와이어(Hi-Torque Balance Middle-Weight 0,014") 위로 전진시켰다. 이러한 카테터를 통해서 내경이 0.014"(0.3mm)이고 그의 선단이 좌측 전방 심장동맥(LAD)의 근위부분에 위치된 마이크로카테터를 제 1 관통동맥의 기원 바로 아래로 전진시켰다. 이것은 실험적 심근경색을 유발하고 위에서 기술한 성장인자들의 용액의 투여를 위해 사용된 것과 동일한 위치이다. 또 다른 카테터를 심장정맥굴에 위치시켜서 그 과정동안 심장정맥피 샘플을 수집하였다. 투여를 시작하기 전에 말초성, 심장정맥 및 동맥피 샘플을 수집하였다. 풍부한 심실주기외수축 또는 심실 세동의 경우에 1 내지 3mg/kg의 리도케인을 정맥내 투여하였다. 수술전 약물처치는 75mg의 클로피드로겔(Plavix) 및 250mg의 아스피린으로 수술 하루 전에 투여하였다. 수술후 약물처치는 치사시까지 매일 75mg의 클로피드로겔(Plavix) 및 125mg의 아스피린으로 이루어졌다.

모세혈관망에 충분히 포집되는 미세구의 최적 크기를 결정하기 위해서 각각 상이한 염료[Invitrogen 및 Polysciences Inc.로부터 구입함. Cat # F8830, F8858; F8824; 폴리비드 블랙 염색된 미세구(Polybead Black dyed microsphere) 6.0㎛, 메가비드(Megabead) NIST 12.0㎛ 및 F8842]로 표지된 직경 2㎛, 4㎛, 6㎛, 10㎛; 12㎛ 및 15㎛의 형광 폴리스티렌 미세구들의 혼합물을, 각각 mL 당 6 사이즈의 1 x 10⁶개의 미세구의 농도로 PBS 20mL의 현탁액에서 혼합하고 균질한 현탁액을 담보하도록 5분동안 와류시켰다. 상기 현탁액을, 3마리의 피그의 좌측 심장동맥의 기원에서 하바드 펌프에 의해서 조영 카테터(angiography catheter)를 통해서 1mL/min의 속도로 투여하였다. 각각의 mL(1백만개의 미세구)의 투여후, 그 주입액을 심장정맥굴 혈액 샘플이 수집되는 동안인 3분동안 현탁시켰다. 혈액 샘플을 얻는 즉시 혈액도말표본 슬라이드를 제조하여 형광 미립자의 존재에 대해 체크하였다. 20mL 미세구 현탁액의 완전 투여후, 심장정맥굴 혈액 샘플을 추가로 3시간동안 매 30분 간격으로 수집하였다. 실험의 종결시점에서 동물을 치사시키고, 심장을 절개하고, 고정시키고 절개를 위해 샘플을 취한 다음 조직학적 및 형광 현미경 검사를 실시하였다.

상이한 크기의 미세구는 동등한 수로 투여되었기 때문에 심장정맥굴 정맥류 및 심근에서의 그것들의 비는 서로 거울상이어야 한다. 모세혈관상을 통과하는 상기 입자들은 심장동맥굴 혈액 중에서 높은 농도 및 실험 말기에 심근에서 낮은 농도를 가져야 한다. 그 반대는 모세혈관상을 통과하지 않는 입자들에 대해서 참이어야 한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 10㎛ 이하의 크기만이 심근에 효과적으로 유지되지만, 이들 미세구의 19%와 8% 사이가 각각 체순환으로 통과하므로 10㎛ 및 12㎛의 미세구 조차도 유의미한 정도로 누출된다. 한편, 15㎛ 입자들의 1% 이하가 모세관상으로 통과하여 심장정맥굴에 도달하였다.

미세구 크기(㎛)	2	4	6	10	12	15
심장으로의 유출	95	73	53	19	8	≥1
(계산된) 굴(sinus) 비율(%)
투여후 3시간에 심근에 유지된 비율(%)	≤3	15	41	77	90	≥99

위에서 나타난 결과가 심근에 대해 특이적이었는지 또는 다른 조직으로 확장될 수 있는지를 결정하기 위해서, 동일한 프로토콜을 사용하여 우측 다리의 대퇴동맥을 통해서 동일한 미세구 현탁액을 투여하였다. 대퇴정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하고 사두근 샘플을 분석하여 골격근에서 상이한 미세구의 성능을 결정하였다. 그 결과가 하기 표 3에 요약되어 있다.

미세구 크기(㎛)	2	4	6	10	12	15
복귀정맥혈으로의 (계산된) 유출률(%)	92	67	59	12	11	≥1
3시간 후 골격근에서 유지된 비율(%)	≤1	11	27	72	83	≥99

유익한 조직에서 99% 이상의 유지율을 보장하는 미세구의 최소크기는 직경 15㎛이다. 모세혈관이전세동맥을 차단함으로써 허혈의 미세병터(micro foci)의 생성을 최소화하기 위해서 최소 유효 크기를 사용하는 것이 중요하기 때문에 직경 크기는 그의 모세혈관상을 통해서 물질을 특정 조직으로 국부 전달하는 것에 대해 최적이다.

실시예 6

심장동맥순환에서 미세구의 투여

PBS 중의 1x10⁶/mL 농도의 15㎛의 형광 폴리스티렌 미세구[인비트로겐(Invitrogen), Cat # F8842, FluoSpheres(등록상표) 폴리스티렌 미세구]의 현탁액 20mL를 제조하고 5분동안 와류시켰다. 상기 현탁액을, 주요 좌측 심장동맥의 기원에서 하바드 펌프에 의해서 조영 카테터를 통해서 1mL/min의 속도로 투여하였다. 각각의 mL(1백만개의 미세구)의 투여후, 그 주입액을 심장정맥굴 혈액 샘플이 수집되는 동안인 3분동안 현탁시켰다. 혈액 샘플을 얻는 즉시 혈액도말표본 슬라이드를 제조하여 형광 미립자의 존재에 대해 체크하였다. 20mL 미세구 현탁액의 완전 투여후, 심장정맥굴 혈액 샘플을 추가로 3시간동안 매 30분 간격으로 수집하였다. 나머지 샘플은 효소결정(enzyme determination)을 위해서 비축하였다. 그 과정을 심전도가 심근허혈과 일치하는 최소 변경을 나타낼 때까지 계속하였다. 실험의 시작시에 및 입자 현탁액의 투여후에 심장혈액유동(TIMI)을 측정하였다. 2마리의 피그를 회수하고, 24시간에 재검사하고 그후 치사시켰다.

결 과 :

1번 동물에서 현탁액 16mL(1600만개의 미세구)의 투여후 제 1 EKG 변경이 검출되었다. 두번째 동물에서 18mL(1800개의 미세구)의 투여후까지 EKG 변경이 나타나지 않았다. 두 동물에서, 심장혈액유동은 그 과정의 말미에서 TIMI 3(정상)이었다. 1번 동물을 주입종료후 24시간에 치사시켰다. 치사전에 완전한 EKG 및 혈액 샘플을 수집하였다. 육안 및 현미경적 검사를 위해서 심장을 가공하였다.

24시간에서 2번 동물은 정상 EKG 및 심장혈액유동(TIMI 3)을 가졌다. 한 세트의 혈액 샘플을 얻은 후, 동물을 치사시키고 육안 및 현미경적 검사를 위해서 심장을 가공하였다.

심장정맥굴로부터 취한 샘플 및 1번 및 2번 동물로부터 취한 체순환으로부터의 모든 혈액도말표본을 저배율 및 고배율에서 형광 현미경으로 검사하였다. 어느 샘플에서도 형광 비드는 검출되지 않았다. 이것은 직경 15㎛ 미세구의 모세혈관망에서의 포집이 매우 효율적임을 나타낸다. 더욱이, 테베시우스 정맥(Thebesius vein)을 통한 주입방법으로 심장동맥으로부터 우심실로의 기능적 션트(functional shunt)가 있는 경우 그것들은 소수이거나 여기서 사용된 방법에 의해서 검출되지 않는다.

효소 측정치들(표 4)은, 1번 동물은 혈액 중에서 심장 특이적 트로포닌 T((TnT)의 증가된 수준[0.01 ng/ml 초과의 값은 비정상이다]에 의해서 나타난 바와 같이 작은 심근경색을 발병시키는데 반하여 2번 동물은 정상임을 보여주고, 상기 동물은 입자의 투여도중 오로지 일과성 허혈만을 발병시키고 영구적 심근손상없이 회수하였음을 시사한다. 이러한 해석은 하기 나타낸 병리학에 의해서 확인되었다. 1번 동물 심장의 육안관측 절편은 괴사의 병터(옅은 영역)를 보여주고 2번 동물의 절편은 정상이다. 이러한 결론은 조직병리학에 의해서 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).

결론: 심장에서 좌측 전방하행심장동맥(LAD)에 의해서 관주(灌注)된 영역에서 직경 15㎛의 15x10⁶개의 미세구까지의 투여가 잘 가능하게 되며 심근손상을 일으키지 않는다. 15x10⁶개의 미세구를 상회하는 용량은 영구적인 흉터를 남기는 작은 허혈영역을 발생시킬 높은 위험성을 안고 있다. 따라서, 직경 15㎛의 1x10⁶개의 미세구 당 단백질 1㎎의 중합체인 PLGA로 수득한 값의 중간범위에서의 로딩으로 좌심장동맥에 의해서 관주된 심근의 모세혈관상으로 치료학적 제제를 15㎎까지 전달할 수 있다.

실시예 7

성장인자로 로딩된 PLGA 미세비드의 투여

일단 15㎛ 미세구의 안전용량범위가 결정되면 동일한 프로토콜을 사용하여 동일 영역의 심근에 10x10⁶개의 PLGA 미세구(직경 15㎛)를 투여하였다. 미세구 현탁액은 인간 재조합 인슐린-유사 성장인자 1(IGF-1) 총량 2㎍로 로딩한 4x10⁶개의 PLGA 미세구; 인간 재조합 간세포성장인자(HGF) 총량 l㎍로 로딩한 4xlO⁶ PLGA 미세구로 구성된다. 또한 혈액 및 조직학적 절편들에서의 육안검사를 용이하게 하기 위해서 이들 두 가지 유형의 미세구를 형광 그린 염료로 로딩하였다. 또한, 현탁액은 인비트로겐으로부터 오렌지 범위에서 2x10⁶개의 폴리스티렌 형광을 함유하였다. PLGA 미세구의 안정성 및 분포를 위한 대조로서 인비트로겐 구를 포함시켰다. 생리학적 PBS 10mL 중의 현탁액을 위에서 기술한 바와 같이 기구설치된(instrumented) 피그에 투여하였다.

두 동물에의 현탁액의 투여는 평온 무사하였고 허혈의 심전도 신호는 없었다. 모세혈관 혈액유동은 과정(TIMI 3) 도중 및 후에 정상이었다. 한 동물(3번 피그)를 그 과정후 30분에 치사시키고 다른 것(4번 피그)은 과정 후 24시간에 치사시켰다. 두 심장을 육안검사 및 현미경적 분석을 위해서 가공하였다.

이들 두 동물의 말초 또는 심장정맥굴 샘플의 어느 것도 다수의 혈액도말표본에서 인비트로겐 또는 PLGA 비드에 대한 존재를 보여주지 않았다. 이들 두 동물의 폐, 간 및 비장 절편들의 일차 분석 또한 미세구 유형의 존재를 검출하지 못하였다.

표 4 및 표 5의 범례:

Markers: CK, 크레아틴 키나제; MB, 심장 특이적인 크레아틴 키나제의 MB 이소형태(isoform); TrT, 심근손상에 대해 가장 특이적이고 민감한 표지인 심장 트로포닌 T; PRE INJ CS, 과정을 시작할 때 심장정맥굴에서 취한 혈액 샘플; PRE INJ, 과정을 시작할 때 취한 전신 혈액 샘플; POST CS, 과정을 끝낼 때 심장정맥굴에서 취한 혈액 샘플; POST, 과정을 끝낼 때 취한 체순환으로부터의 혈액 샘플; POST 14H, 과정 후 14시간에 취한 전신 혈액 샘플; POST 24H, 동물 치사전에 과정후 24시간에 취한 전신 혈액 샘플.

이들 2마리의 동물의 육안관측 절편(macroscopic section)은 완전히 정상이다(나타내지 않음). 형광 현미경 하의 3번 피그의 절편의 분석은, 투여된 혼합물의 조성으로부터 예측되는 바와 같은 1:4의 적절한 비율(도 10 참조)에서 PLGA 비드(그린) 및 폴리스티렌 비드(레드/오렌지)의 분포를 나타내었다. 검사된 심장 영역의 어디에서도 현미경적 조직손상의 증거는 없었다. 4번 피그에서 PLGA 비드(그린)의 수는 이미 상당히 감소하였고 이들 비드 대 폴리스티렌 비드(레드/오렌지)의 비는 1:1에 근접한다(도 11 참조)하며, 이는 PLGA 비드가 대략 16시간의 반감기로 분해됨을 뜻한다.

상주심장줄기세포를 자극하는 미세구에 투여된 IGF -1 및 HGF 의 효능

위에서 기술한 바와 같이, 심장동맥을 통해서 투여된 IGF-1 및 HGF의 조합물은 상주심장줄기세포의 활성화를 자극하는데 매우 효과적이었다. 이러한 예비평가에 있어서, 본 발명자들은 해당 영역에서의 줄기세포의 활성화가 있는지, 미세구가 전달되는지를 평가하고 그것을 좌심장동맥에 의해 관주되지 않은 좌심실의 영역과 비교하였다. 도 11의 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 비처리 심근에서 대부분의 상주줄기세포는 무활동성(quiescent)(화살표/화살표 머리로 하이라이트 표시됨)인데 반해, 처리된 영역의 것은, 세포주기 표지 ki-67의 발현에 의해 나타낸 바와 같이(도면에서 핵에서는 황색 표시되고 하이라이트 영역에는 밝은 "스팟(spot)"으로 표시됨) 세포 속으로 진입하였다. 따라서, 성장인자들을 모세혈관으로 전달하고 그것들이 둘러싸인 세포 사이의 공간으로 언로딩(unloading)될 때까지 거기에 유지시키는 고체 기질 상의 성장인자들의 투여는 외인성 상주줄기세포 집단의 자극을 위한 효과적인 성장인자투여방법이다.

결론: 모세혈관을 가로질러서 체순환으로 진입하는 것을 불가능하게 하는 직경의 생분해성 미세비드에 의해서 심근의 특정 정역으로의 IGF-1 및 HGF의 국부 전달은 요법에 의해서 표적화되지 않은 것에 영향을 주지 않고 조직의 특정 영역의 상주줄기세포를 자극하는데 효과적이다.

실시예 8

돼지 c- kit ^pos 심장줄기 및 원종세포는 다효능성이며 다른 동물종의 것과 현상적으로 유사하다.

24±3 kg을 칭량한 3마리의 요크셔 피그로부터의 심근의 조직학적 절편을, 대다수의 CSCs에 의해 발현되는 것으로 알려진, 공통적인 상주세포 표지에 양성인 세포, c-kit, 상주세포인자(SCF)에 대한 수용체의 존재에 대해 동일초점 현미경으로 검사하였다. c-kit(c-kit^pos)에 양성인 작은 세포들이 심방(좌심방 및 우심방 사이의 차이가 없으며, 데이터는 나타내지 않음) 및 심실어펙스에서 다른 심장 영역에 비해 높은 밀도를 갖는(도 1C 참조) 심방 및 심실 심근 전반에 결쳐서 분포되었다(도 1A 및 1B 참조). 이러한 분포 패턴은 인간을 포함한 다른 동물종의 심장에서의 c-kit^pos CSCs의 해부학적 위치와 대등하다. 따라서, 피그 심장에서의 c-kit^pos 세포의 밀도는 인간 및 설치류의 심근과 유사하다: 1,000개 이하의 심근당 1개의 세포 또는 조직 1g 당 50,000개 이하의 c-kit^pos 세포.

돼지 심장 영역으로부터의 심근 조직 샘플을 효소적으로 증해시켜서 근세포-고갈 세포 집단, 각각 심방, 심실 및 어펙스(apex)로부터 출발 근세포-고갈 심장세포 집단의 10±3%, 3±2% 및 7±3%을 구성한 c-kit^pos 세포를 얻었다(도 1D).

MACS 기술(21)을 이용하여 c-kit^pos 세포를 분리하여 c-kit^pos 세포의 90% 초과를 구성한 매우 풍부한 세포 제제를 수득하였다(도 1E). FACS 분석은 c-kit^pos 풍부 심장세포가 범백혈구표지(pan leukocyte marker) CD45) 및 내피성/조혈성 원종표지 CD34에 대해 음성인 것임을 나타내었다(도 1E). 높은 분율(87%)의 c-kit^pos 돼지 심장세포는 CD90, (공통적인 비특이적 중간엽 표지) 및 CD 166(부착분자)를 발현하였다(도 1E). 조혈성/내피성 원종들의 표지, CD 105 및 CD 133에 대해 작은 분율만이 양성이었다(Suppl Figure 1). c-kit^pos 심장세포는 CD13, CD14, CD31, CD38, CD44, CD33을 포함한 다른 조혈성, 중간엽 및 내피성 세포에 특이적인 CD 표지에 대해 분석하였을 때 음성이었다. 이들 분석으로부터 본 발명자들은 돼지 c-kit-저장된 심장세포가 c-kit^pos, CD90^pos, CD166^pos, CD105^low, CD133^low 및 CD45^neg, CD34^neg, CD31^neg, CD44^neg인 것으로 결론지을 수 있다.

심방, 심실 및 어펙스로부터 신선하게 분리된 c-kit^pos 심장세포를 배양(4 패시지(passage))에서 팽창시킨 다음 단일 세포로서 96-웰 테라사키 플레이트에 침착시켜서 단일 세포 클론을 생성하였다(도 2A 및 2B). 돼지 세포의 클론 효율은 모든 심장 위치에 대해 및 설치류 CSCs의 종래 보고된 클로닝 효율(도 2C)[Beltrami et al. Cell 2003]과 유사하였다. 본 발명자들은 심방, 심실 및 어펙스-유도된 세포 각각으로부터 2개의 클론을 채취하고 그것들을 추가로 팽창시켰다. 이들 클론은 대략 30시간의 배가시간을 나타내었고 65 패시지 초과동안 증식시키고 성장 정지 또는 노화에 이르지 않으면서 매 10 패시지당 아클로닝시켰다. 이들 c-kit^pos 심장세포는 검출가능한 염색체 변경없이 정상적인 핵형을 유지하였다.

클로닝된 c-kit^pos 돼지 심장세포를 면역세포화학을 이용하여 복장(sternness) 및 심장-계통 참여(commitment)의 표지에 대해 분석하였다. 세포는 c-kit(90±8%), Flk-1(86±9%), Oct3/4(62±11%), Nanog(46±5%), 텔로머라제(81±10%), Bmi-1(70±14%), Nkx2.5(52±8%), Isl-1(8±6%)에 대한 가능성을 보여주었다(도 2D). 단일 세포로부터 유래된 클론으로 인하여 그들의 자손에서 다효능 유전자의 발현은 부모세포집단에서 이들 유전자의 발현수준이 매우 높음을 시사하였다. 불행하게도, c-kit^pos 세포의 기본 집단은 CSCs, 원종체 및 전구체의 혼합물이며 본 발명자들은 '실제' CSCs에 대해 특이적인 표지를 여전히 갖는다. 따라서, 그들의 자손들의 분석을 통해서 이들 세포의 표현형을 추론할 수 있을 뿐이다.

클로닝된 c-kit^pos 돼지 심장세포를 변형된 세균 접시(bacteriological dish)(Corning)에서 변형된 심장구 형성 배지(mCSFM)에서 평판 배양하는 경우 그들은 현탁액에서 성장하고 이른바 '심장구'라 불리우는 구형 클론을 생성하였다 (도 2E)[Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114:763; Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(21): 12313-12318; Matsuura K, Nagai T, Nishigaki N et al. Adult cardiac Sea-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. J Biol Chem 2004; 279(12):11384-11391]. 심장구를 심장성 분화 배지를 갖는 라미닌-코팅된 플라스틱 디쉬에 위치시켰을 때 그것들이 부착되고 세포들은 평판 형태를 획득한 구로부터 확산한다(도 2E). 평판 배양후 4 내지 6일에 이들 말초 평판 세포는 근세포(27±4%), 내피(10±6%) 및 평활근 세포(34±5%) 계통을 발현하였다(도 2E). 이러한 결과들은 참줄기세포 특징, 즉 복장의 표지를 발현하고, 클론원성, 자가-갱신성 및 다효능성임을 나타낸다. 따라서, 돼지 c-kit^pos 심장줄기세포(이하 pCSCs'라 함)는 다른 종으로부터 분리된 c-kit^pos CSCs와 일치하는 표현형 및 유전자 발현의 패턴을 갖는다[Ellison et al., 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397].

돼지 CSCs 는 활성화를 조절하는 무손상 IGF -1, HGF and SCF 신호경로를 발현한다.

결과는 돼지 심장에서 참 pCSCs의 존재를 보여준다.

pCSCs는 생체내 및 시험관내에서 IGF-1 및 c-met 수용체를 발현한다(도 2F). 배양에서 성장하였을 때, 신선하게 분리된 pCSCs는 세포증식(도 2G) 및 이동(도 2H)으로 hrIGF-1, hrHGF 및 hrSCF에 의한 자극에 반응한다. 리간드 결합시에 즉이적 다운스트림 효과인자 경로는 pCSCs에서 활성화되었다(도 2I). 팽창된 단일 세포 클론으로부터의 세포로 유사한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, pCSCs는 심근재생 프로토콜을 시험하기 위해 생체내에서 이용될 수 있는 기능적으로 커플링된 GF 수용체 시스템을 갖는다.

실시예 9

피그에서 심근경색의 발병, 심실기능의 모니터링 및 성장인자를 갖는 상주심장줄기세포의 자극에 의한 자체 심근재생

모든 동물연구는 적절한 위원회(Escuela Veterinaria y Hospital de Leon, Leon, Spain)에 의해서 승인받았다. 암컷 요크셔 화이트 피그(n=26)(27±3kg)를 테라졸(lOOmg, I.M.)로 진정시키고, 항온하고 쉐이빙하였다. 정맥내 카테터를 말초 이정맥에 위치시켰다. 동물들을 수술실로 옮기고, 지지판 위에 놓고, 사지 결합기구로 수술대에 고정시켰다. 동물들은 이소플루란(O₂ 중의 2%)를 사용한 마취를 유지시켰다. 모두 26마리의 동물에서 심장 유도 카테터를 유도 와이어 위로 전진시키고 제 1 천공 동맥의 기원 아래의 좌측 전방 심장동맥(LAD)의 근위부분에 위치시켰다. 피그들은 경색이 유발되기 전에 125UI/kg의 헤파린으로 주어지고, 그 후 경색과정동안 헤파린 주입(10UI/kg/h)을 하였다. 경색을 유발하기 위해서 LAD 심장동맥을 75분동안 풍선 팽창법(직경 2.5㎜)으로 교합시켰다. 항-부정맥 약물처치에 있어서, 경색전 15분에 시작하여 피그들에 아미다로나(Amiodarona)(Trangorex)(5mg/kg/h)을 그 과정 전반에 걸쳐서 주입하였다. 풍부한 심실 주기외 수축 또는 심실 세동의 경우에, 1 내지 3mg/kg의 리도케인을 정맥내 투여하였다. 수술전 약물처치는 75mg의 클로피드로겔(Plavix) 및 250mg의 아스피린으로 수술 하루 전에 투여하였다. 수술후 약물처치는 치사시까지 매일 75mg의 클로피드로겔(Plavix) 및 125mg의 아스피린으로 이루어졌다.

인간 재조합 IGF-1 및 HGF(Peprotech)를, 심장 재관류(coronary reperfusion) 후 30분에 제 1 중격동맥(septal artery)의 기원으로 즉시 원위 전진시킨 관류풍선 카테터를 통해서 17마리의 피그에 차별 용량(2㎍ 내지 8㎍ 범위의 IGF-1 및 0.5㎍ 내지 2㎍ 범위의 HGF)으로 투여하였다. 매 5㎖ 투여후 2분 재관류로 GFs를 15㎖의 PBS 중에서 2.5㎖/min의 속도로 투여하였다. 동일한 프로토콜을 사용하여 MI(식염수-플라세보 대조군: CTRL)을 갖는 또 다른 9마리의 피그에 식염수를 단독으로 주사하였다. 26마리의 동물 중 5마리(2마리는 CTRL 군이고 3마리는 GF 군이다)은 급성 심근경색(AMI)도중에 사망하였다(30% 이하의 급성 치사율). 후속적으로, 3마리의 동물이 후증식기간에 사망하였다: 1마리는 1일째에(CTRL 군), 1마리는 13일째에(CTRL 군), 1마리는 14일째에(GF 군)에 사망하였다. 연구 프로토콜을 완성한 나머지 18마리의 피그 중에서, 13마리는 GF-처리군이고 5마리는 GTRL 군이었다. 특히, 18마리의 생존 동물 중에서, 4마리의 GF-처리 동물은 1배 용량의 GF(2㎍ IGF-1 및 0.5㎍ HGF; GF-1x)를 받았고, 5마리의 동물은 2배 용량(4㎍ IGF-1 및 l㎍ HGF; GF-2x)를 받았으며, 4마리의 동물은 4배 용량(8㎛의 IGF-1 및 2㎛의 HGF; GF-4x)을 받았다. GFs 또는 식염수 단독 투여 직후, 모든 생존 동물들에 연구기간도중 0.5M BrdU 용액 10㎖로 로딩한 삼투 펌프를 이식하였다. MI 및 성장인자 투여후 21일에 피그를 치사시켰다. 각각의 피그가 속하는 군은 면역조직화학적 분석을 실행하는 인베스티게이터(investigator)를 위해 막힘을 유지하였다.

심장기능측정

심장교합 직후 및 치사전에 베이스라인에서 심장초음파검사에 의해서 심장기능을 측정하였다. 간단하게는, M-모드 및 2차원 에코 영상으로 복장옆 장단축도를 얻었다. 중간척삭 수준(midchordal level)에서 심실의 장축에 대해 수직인 LV 치수(LVEDD 및 LVESD)를 측정하였다. LV 박출률 및 방사 염색을 계산하였다.

국부적 심장내 IGF -1/ HGF 주사는 경색된 조직의 기구를 보존하고 급성 심근경색후 심근세포 생존을 향상시킨다.

인간 재조합 IGF-1 및 HGF(이하 'IGF-1/HGF' 또는 'GFs'라 함)를 차별 용량으로 급성 심근경색후 30분에 심장내 주사로 피그에게 투여하였다. 추가적인 피그들에 식염수 단독을 동일 용량으로 투여하였으며, 이는 대조군(CTRL)을 구성한다.

면적측정으로 측정한 바와 같이, 심장둘레면적의 백분율로서 경색 크기는 GF-처리 및 CTRL 군 사이에 차이가 없었다(GF-1x, -2x 및 -4x 각각 28±5%, 26±7%, 29±5% 대 CTRL 27±4%)

H&E 및 시리어스 레드는 경색 구역의 섬유증흉터조직(fibrotic scar tissue) 중에 분포된 생존 심근 조직의 먼쪽, 경계 및 경색 구역 노출 섬 중의 심장조직의 횡구역을 염색시켰다. CTRL-처리된 동물들에서 보다 GF-처리된 심근의 경색 영역에서 상기 생존한 심근 섬들이 훨씬 풍부하였다(도 3A 내지 3B). 동일초점 현미경에 의해서 분석된 절편의 BrdU 및 α-사르코머릭 액틴에 대한 이중 면역형광 염색은 상기 섬들이 주로 큰 α-사르코머릭 액틴 양성, BrdU 음성 심근세포, 예비경색 심근 및 그들의 성숙체로서의 생존, 심지어는 비대 성질을 확인한 표현형으로 구성됨을 나타낸다(도 3C). 더욱이, GF-처리된 피그 심장은 경색 영역에서 CTRL에 비해 상당히 적은 섬유증 조직을 가졌다(도 3D 내지 3F). 보다 흥미롭게는, 상기 질병은 투여된 GF의 용량과 포지티브 선형 관계를 나타내었다(도 3F).

연구는 조기 세포사에 대한 GF 요법의 효과를 모니터링하도록 특별히 조정(gearing)되지는 않았다. 그러나, 이후 제시된 결과로부터 근세포사는 심장교합/재관류 사고후 긴 시간동안 경색주위/경계 구역에서 매우 높게 지속하는 것임이 분명하다. 이것은 형태학적 적용과 지속된 세포사 사이의 부정고리(vicious circle)를 설정하는 것으로 알려진 병리학적 리모델링의 효과에 기인하는 것으로 여겨진다. 도 3G 내지 3H에 나타낸 바와 같이, IGF-1/HGF 투여는 CTRL과 비교하여 활성화된 카스파제-3에 대해 양성인 근세포 수의 감소로 표시된 바와 같이 용량 의존 방식으로 늦은 근세포사를 상당히 감소시켰다. 해부학적 형태의 보존, 근세포 생존 및 감소된 리모델링과 일치하게, GF-처리된 심장은 CTRL과 비교하여 감소된 근세포 비대 반응을 나타내었다(도 31). 이러한 발견과 함께 급성 MI 후 IGF-1/HGF 투여는 심근세포수 및 심근벽 구조를 보존하고, 생존 근세포에 대한 로드른 감소시키는데 중요한 효과를 가지는 것으로 나타나며, 이것은 생존 심근의 비대 및 근세포사에 대한 감소된 자극 및 증진된 심근 리모델링을 결과한다.

급성 심근경색 후 IGF -1/ HGF 의 심장내 투여는 상주 pCSCs 를 활성화시킨다 .

정상(도시되지 않음) 및 포스토-MI 심장에서, 대략 90%의 c-kit^pos pCSCs는 면역조직화학에 의해서 검출된 바와 같이 IGF-1 및 c-met(HGF) 수용체를 자체 발현한다(도 4A 내지 4B). 따라서, GF-처리된 경색된 피그 심장은 경계 영역에서의 c-kit^pos pCSCs 수의 상당한 증가 및 경색된 영역에서의 더욱 높은 증가를 나타낸다(도 4C 내지 4D). 이러한 c-kit^pos pCSCs의 증가가 GF 투여의 결과인 것은 투여된 GF-용량에 대한 직접적인 상관관계에 의해서 확인된다(도 4D). 최고의 GF 용량에서, 경색된 영역에서의 c-kit^pos pCSCs의 수는 CTRL 심장에서 보다 6배 더 많다(도 4D, SupplTable). 더욱이, 1배와 4배 용량 사이의 선형 증가분은 본 발명자들이 최대 재생반응을 생성하기 위한 포화 용량에 도달하지 못하였음을 나타낸다. 다수의 pCSCs는 MI의 발병 후 그들의 출생을 기록한 픽스쳐(fixture)인 BrdU 양성이었다. 그들의 순환 성질은 세포 주기에 있거나 최근에 있었던 세포를 표지하는 Ki-67 염색에 의해서 확인되었다(도시되지 않음). 다수의 c-kit^pos 세포들은 주심장계통, 즉 근세포, 내피 및 평활근 세포 쪽으로의 분화를 암시하는 전사인자 Nkx-2.5, Ets-1 또는 Gata6을 발현하였다. 정량분석은 c-kit^posNkx2.5pos 세포(참여 근세포/혈관 전구체)의 수가 GF-용량 의존 방식으로 GF-처리된 피그 심장의 경색 및 경계 영역에서 상당히 증가하여 CTRL 심장에서 보다 10배 초과인 수준에 이르는 것으로 나타났다.

IGF -1/ HGF 처리는 급성 심근경색후 강건한 심근재생을 생성한다.

경색에서 및 경색주위/경계 영역 둘 다에서 GF-처리된 심장은 아직 말기 분화상태에 도달하지 못한 BrdU^pos 매우 작은 새로 형성된 근세포의 큰 집단을 하버링(harboring)하였다(도 5). 이들 데이터는 작은 새로 형성된 근세포에서 Ki67의 발현에 의해서 확인되었으며(도 5C 및 F), 이중 일부는 그들의 미숙성 성질을 확인하는 유사분열 및 세포질분열 중에 있었다(도 5I). 새로 형성된 BrdU^pos 근세포는 또한 미처리 식염수-주사 CTRL 피그의 경색주위/경계 영역에 존재하였다. 그러나 그들의 수는 처리된 심장의 1/10 이하이었으며 그들은 경색구역에 존재하지 않았다(도 5).

pCSCs에 대한 경우와 같이, 경색 및 경계 영역 둘 다에서 작은 BrdU^pos/Ki67^pos 새로 형성된 근세포들의 수와 GF-용량 사이에는 직접적인 상관관계가 있었다(도 5G 내지 5H). GF-처리된 심근에서 BrdU^pos 근세포들은 경색구역에서 재생 대역들의 클러스터로서 조직화되었다(organized).

이들 재생 대역은 그 구조가 보다 조직화되었으며, GF 용량이 증가함에 따라 치밀 및 조밀해졌다(도 5A 내지 5B). 최종적으로, GF-처리 동물과 GTRL 동물 사이에에서 경색(여분의 심근)으로부터의 원위 영역에서 새로 형성된 심근(BrdU^pos 또는 Ki67^pos)의 수 또는 그의 외관 중 어느 것도 유의미하게 상이하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

또한, 새로 형성된 BrdU-양성 혈관구조는 경계 및 경색된 심근에서 명백하였다(도 6A 내지 6C). GF-처리된 심장은 식염수-처리된 CTRL에 비해 경색구역에서 증가된 수의 모세혈관 및 세동맥을 나타내고 이러한 반응은 용량 의존적이었다(도 6D 내지 6F). 흥미롭게, 새로운 미세-혈관(micro-vessel)은, 위에서 높은 밀도의 새로 형성된 작은 BrdU^pos 근세포 및 재생 대역을 가진다고 언급한 경색구역 내의 심근의 생존 섬(survived island)[Gandia, C. et al., 2008. Stem Cells 26:638]을 가장 뚜렷하게 둘러싸고 있었다. 이러한 조직화는 pCSCs에 작용하는 성체 여분 근세포에 의한 심장생성인자[Behfar, A. et al., 2007. J. Exp. Med. 2007 204: 208]의 생성을 시사한다.

MI 후 21일에 경색구역에서 재생된 근세포는 그들의 평균크기에 의해서 뿐만 아니라 그들 중 다수가 Ki-67의 발현에 의해서 여전히 순환한다는 사실에 의해서 입증되는 바와 같이 미숙상태이었다(도 5I F). 성숙 근세포의 심장생성 역할에 대한 제안된 역할에 따라 성숙한 것과 접촉하거나 또는 근접하여 (즉, 경계 구역에서) 새로 형성된 근세포는 여분 조직에 근접하지 않는 흉터의 중간에 있는 것보다 크기가 상당히 넓다(도 5). 또한, GE-처리는 증가된 GF 용량을 갖는 증가된 평균 근세포 크기로 나타낸 바와 같이 근세포를 성숙시키는 역할을 하는 것임이 명백하다.

돼지 심장의 크기 및 경색된 영역의 부피가 주어지는 경우 손실된 근세포의 수 또는 GF 처리에 의해서 재생된 근세포의 수를 정확히 결정할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 전부는 아닐지라도 28일째에 GF-처리된 경색된 심장이 손실된 근세포를 대부분 재생시킨다는 것은 의심의 여지가 없다.

실시예 10

심장내 GF 투여는 심실기능을 보존하고 향상시킬 수 있다.

심장초음파 사진은 좌심실 박출률(LVEF)이 심장교합에 따라 상당히 저하되는 것으로 나타났다(도 6G). 그러나 AMI 후 28일에 LVEF는 CTRL에서는 다소 악화된데 반해, CTRL과 비교하여 GF-처리에 의해서 상당히 보존/향상되었다(도 6G). 국부적인 심장기능에 관한 추가적인 사항을 얻기 위해서 조직 도플러 초음파를 사용하여 CTRL과 비교하여 GF-처리된 피그에서 현저히 개선된 전방중격 레디알염색(antero-septal radial strain)을 측정하였다. 심장기능 보존/개선은 GF 용량을 증가시키는 것과 상관관계를 가졌다(도 6).

실시예 11

직경 15㎛ PLGA 미세구로 엔캡슐화된 IGF-1 50㎍까지의 심장내 투여는 체순환으로 유출되지 않는다.

실시예 5에 의해서 입증된 바와 같이, 직경 15㎛ 미세구의 99% 이상은 표적 조직, 특히 심근의 모세혈관망으로 포집된다. 그러나, 이들 데이터는, 활성 분가가 로딩되는 것이 조직 내부에 유지되는지 또는 그것이 모세혈관순환 및 복귀정맥혈로 걸러지는지의 문제에 주목하지 않는다. 이러한 문제를 조사하기 위해서, 총 50㎍의 rhIGF-1를 로딩한 5 x 10⁶ 미세를 실시예 5 내지 7에 제시된 것과 동일한 투여 프로토콜에 따라 좌측전방하행동맥의 기원에서 심장내 투여하였다. 카테터가 목정맥 전반에 걸쳐서 심장정맥굴에 남겨졌다는 것이 주요한 상이점이다. 혈청을 준비하고 그 샘플을 수집이 완료될 때까지 LN2에 동결시켰다. 모든 샘플을, 돼지 IGF-1과 교차 반응하지 않는 인간 IGF-1 검출 키트(R&D, Minneapolis, Minnesota, USA)를 사용하는 ELISA에 의해서 분석하였다. 심장정맥굴 또는 전신복귀정맥혈로부터의 샘플 중 어느 것도 양성으로 평가받지 못하였다. 본 발명자들에게 있어서 평가의 최소 검출 제한은 IGF-1에 대해 52.5ng/ml이었다. 따라서, ELISA의 검출수준 아래의 일부 누출이 발생하는 것이 가능할지라도 IGF-1dlm 대부분은 결코 심근에 남아있지 않음이 명백하다.

실시예 12

손상된 골격근에 대한 IGF-1/HGF의 동맥내국부투여는 근줄기세포의 활성화를 유도하고 재생을 자극한다.

손상된 심근을 치료하는데 사용된 프로토콜이 다른 조직의 치료에 효과적인지를 시험하기 위해서 동일한 프로토콜을 대퇴동맥의 45분 완전풍선폐쇄에 의해서 손상된 허혈이 발병된 3마리의 피르의 우측 다리의 포스트-허혈성 골격근를 치료하는데 사용하였다. 심근의 경우에서와 같이, 풍선의 공기빼기에 의한 30분 재관류후에, 직경 15㎛의 IGF-1 및 HGF 미세구를 함유하는 PBS 20mL의 현탁액을 8㎛의 IGF-1 및 2㎛의 HGF 총 선량에 대해 실시예 2에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 3주 후에 동물들을 치사시키고 사두근의 생검을 면역조직학에 의해서 분석하여 병터에서의 줄기세포의 활성화도를 측정하였다.

심근에 대해 기술한 바와 같이, 대퇴동맥의 폐쇄후에 동물들에 모든 복제세포에 효과적으로 표지하는 것으로 알려진 BrdU의 용액을 연속적으로 전달하는 삼투펌프를 이식하였다. 이러한 방식으로 요법의 시작후에 태어난 모든 세포들은 BrdU 표지이고, 이것은 대조군과 처리된 동물 사이의 재생반응의 비교를 가능하게 한다. 각각의 경우에 있어서 좌측 다리의 사두는 손상되지 않은 대조군으로서 기능하였다.

도 12 및 표 6에서 나타낸 바와 같이, 직경 15㎛의 PLGA 미세구로 엔캡슐화된 IGF-1/HGF의 국부투여는 플라세보 제외 허혈 처리된 대조군과 비교한 반대쪽 다리가 아닌 처리된 다리에서 근육조직의 재생을 자극하는데 매우 효과적이었다.

성장인자의 국부투여에 대한 반응에서의 골격근 재생

1×103개의 근섬유 핵당 BrdU 표지된 근섬유 핵의 #
동물번호	손상된 다리	반대쪽 다리
1	337	17
2	289	22
3	364	13

결론: 손상된 조직/기관의 모세혈관망을 표적화하는 전달 시스템용으로 기대되는 바와 같이, 미세구의 투여부위로부터 하향하는 영역으로 국부화되는 심근 이외의 손상된 조직에 대한 성장인자의 국부투여는 손상된 조직의 재생반응에서 자극효과를 갖는다.

실시예 13

IGF-1/HGF/SCF의 심장내 주입은 IGF-1/HFG 단독 보다 CSCs의 활성화 및 심실기능의 보존에 있어서 강력한 효과를 갖는다.

위의 실시예들에서 기술한 프로토콜에 대한 새로운 인자의 부가가 경색후 심근의 재생반응을 증진시키는지를 시험하기 위해서 3마리의 동물군에 4㎍의 SCF와 함께 실시예 9에서 사용된 IGF-1(8㎍) 및 HGF(2㎍)을 보다 높은 용량으로 투여하였다. 이들 인자 각각을 실시예 2에서 기술된 직경 15㎛의 PLGA 미세구로 엔캡슐화시켰다. 경색의 발명, 미세구 현탁액의 모니터링 투여를 위한 프로토콜은 실시예 5 내지 7에서 기술한 바와 같았다. 동물들을 처리 후 4주에 치사시켰다.

도 13a 및 13b에서 나타낸 바와 같이 3가지 인자 프로토콜에 의해 생성된 재생은 재생의 수준 뿐만 아니라 IGF-1/HGF의 조합에 의한 재생된 근세포의 성숙에서 상당히 양호하다. 표에서 나타낸 바와 같이 세포 및 조직학적 및 기능성 파라미터는 사용된 인자들 중에서 상승효과를 확인하고 재생반응을 변형시키는 치료학적 화합물의 다중 변형체를 생성하는 기술된 발명의 안정성을 기록한다. 이들 데이터로부터, 특정한 인자들을 갖는 입자의 부가 또는 제거 이외에 다른 변동이 특정한 인자 또는 일련의 인자들의 용량, 특정 인자들에 대한 방출/언로딩의 프로파일, 로딩의 정도 등의 변화를 수반할 수 있다.

결론: 본 발명은 각각의 인자가 상이한 용량, 상이한 패턴의 방출 및 비제한적 다른 인자들과의 조합으로 사용될 수 있는 빌딩 블록(building block)의 제한된 세트로부터 출발하여 치료학적 화합물들의 거의 무수한 수의 특정 조합의 제형을 가능하게 한다. 이것은 단일 투여에서 각각이 상이한 세포 표적 상에서 상이한 시간에 작용할 수 있는 상이한 조합의 치료학적 제제로 특정 조직을 표적화하는 것을 가능하게 하며 상이한 유효 용량을 요구한다. 이러한 가능성은 심근 및 대부분의 내부기관과 같은 반복적으로 접근될 수 없는 상이한 접근 곤란한 조직에 대해 특히 유리하다.

도면 범례

도 1: 성체 피그 심장에서 c- kit ^pos 심장세포의 분포 및 특성화

(A-B): 정상 피그 심장의 우심방(A) 및 좌심실(B)에서 c-kit 양성(c-kit^pos; 화이트) 세포의 대표적인 동일초점 사진. 심근세포는α-사르코머릭 액틴(α-사르크 액트)에 의해서 레드로 염색하였고(도면에서 그레이(grey)로 나타낸) 핵은 DAPI로 블루로 염색하였다. (C): c-kit^pos 세포들은 심방 및 심실 심근세포 전반에 걸쳐서 우 및 좌심실(RV, LV)과 비교하여 심방 및 어펙스에서 높은 밀도로 분포된다. ^*p＜0.05 대 RV 및 LV. (D): 심방, 심실(RV), 및 어펙스를 위한 근세포-고갈된 심장세포 집단 내부에서 c-kit^pos 세포들의 대표적인 FACS 분석. (E): MACS를 사용하여 얻은 c-kit^pos 세포들은 90% 초과 풍부를 나타낸다. c-kit^pos 풍부 돼지 심장세포의 FACS 분석은 조혈세포계통의 표지 CD45 및 CD34에 대해 음성인 것으로 나타났다. 또한, 높은 분율의 c-kit^pos 세포들은 중간엽세포계통 표지, CD90 및 CD 166을 발현한다.

도 2: c- kit ^pos 돼지 심장세포는 복장표지를 발현하고, 클론원성 , 자가- 갱신 성, 심장구 - 형성성 및 다효능성의 줄기세포특성을 보유하며, 그들의 활성화를 조정하는 무손상 신호 IGF -1/ HGF 시스템을 발현한다.

(A): 4번째 통과에서 c-kit^pos 돼지 심장세포를 나타내는 광 현미경 사진. (B): 단일 c-kit^pos 돼지 심장세포가 단일 세포 클론을 생성하는 테트라사키 플레이트의 벽으로 침착된 후 클론의 광 현미경 사진. (C): c-kit^pos 돼지 심장세포의 클론원성은 심실 전체가 유사하였고 마우스 및 설치류 CSCs와 비교하였다. (D): c-kit^pos 돼지 심장세포의 면역형광염색은 c-kit (화이트)의 발현을 확인하였고, Flk-1, Oct-4, Nanog, Tert, Bmi-1, Nkx2.5 및 Isl-1(모두 그레이로 나타냄)의 발현을 나타내었고, 이것은 심장 줄기 및 원종세포의 혼합물인 것임을 뜻한다. 사진은 인세트(inset)로서 줌 포착(zoom capture)으로 20×확대이다. (E): 클로닝된 c-kit^pos 돼지 심장세포는 심장구 (a)를 형성하였다. c-kit^pos (화이트) 심장구 (b)를 심장배지 중의 라미닌-코팅된 접시에 위치시켰을 때 심장구 세포는 구 (c)로부터 확산한다. 4 내지 7일 후 구의 주변부 상의 세포들은 심근세포의 생화학적 표지(α-사크로머릭 액틴, α-사르크 액트; d), 평활근(평활근 액틱, SMA: e), 내피(von Willebrand 인자, vWF; f)(모두 그레이 형광으로 나타냄)의 발현을 증가시켰다. (F): 면역형광염색은 c-kit^pos 돼지 CSCs가 IGF-1 및 HGF 수용체(각각 그레이, Igf-1R 및 c-met)를 가지는 것으로 나타난다. (G-H): 배양에서 성장하였을 때 신선하게 분리된 돼지 c-kit^pos 심장세포는 세포증식(G; ^*p<0.05 대 베이스, †p<0.05 대 CTRL, ‡p<0.05 대 HGF) 및 이동(H; †p<0.05 대 CTRL, ‡p<0.05 대 IGF-1)에 의해서 IGF-1 및 HGF의 자극에 반응한다. 웨스턴 블롯 분석은 리간드 결합시 효과인자 다운스트림 경로가 c-kit^pos 돼지 심장세포에서 활성화된 것으로 나타났다. phos = 포스포릴화됨, FAK = 국소 부착 키나제

도 3: IGF -1 및 HGF 의 심장내 주입은 AMI 후 심근세포 리모델링을 증진시킨다.

(A): GF-처리된 피그 심장의 H&E 염색은 재생 및 섬유증 층 사이에 배치된 경색구역(화살표)에서 생존 심근조직의 섬을 나타냈다. (B): 이들 심근 섬은 드물었으며 식염수-처리된 CTRL 피그 심장에서 덜 정의되었다. (C): 이들 심근 섬은 주로 BrdU 음성 심근세포(심장 트로핀 I, cTnI; 세포의 중간에서 검은 원인 핵을 갖는 그레이)로 구성되었고, 그들의 생존 및 성숙 표현형을 기록하였다. 경색 후 태어난 세포들은 BrdU 양성이고 그들의 핵은 화이트 도트로 나타내었다. (D-E): 시리어스 레드 염색은 GF-처리된(D) 및 식염수-처리된 CTRL(E) 피그 심장에서 경색구역의 횡단면에서 섬유증 조직(그레이 염색) 및 근육(옐로우 염색)을 동정하였다. (F): GF-처리된 (IGF-1/HGF) 피그 심장은 식염수-처리된 CTRL 피그에 비해 경색구역에서 섬유증의 감소된 면적백분율을 가졌다. ^*p<0.05 대 CTRL. †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x. (G): 활성화된 카파제-3(브라운; 화살표머리)에 대한 염색은 AMI 후 CTRL 피그 심장의 경색주위/경계 구역에서 세포자멸성(apoptotic) 근세포를 나타내었다. (H): IGF-1 및 HGF 주입은 식염수-처리된 CTRL에 비해서 경색주위/경계 구역에서 감소된 수의 세포자멸성 근세포를 초래하였다. ^*p<0.05, 대 CTRL, †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x, ‡p<0.05 대 IGF-1/HGF 2x. (I): 근세포 직경 분석은 GF-처리된 피그가 식염수 처리된 CTRL 동물과 비교하였을 때 AMI 후 감소된 근세포 비대반응을 가졌다. Normal = CTRL 심장 중의 경색된 영역으로부터 먼/원위 영역 ^∧p<0.05 대 Normal, ^*p<0.05 대 CTRL. †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x.

도 4: AMI 후 IGF-1 및 HGF 투여는 심장계통에 대한 참여를 견인하는 내인성 CSCs를 활성화시킨다.

(A-B): 돼지 c-kit^pos CSCs(화이트)의 대부분은 Igf-1(A, 그레이) 및 c-met(B, 그레이) 수용체를 생체내에서 발현한다. (C): GF-4x 처리된 피그 심장의 경색 영역에서의 c-kit^pos CSCs (화이트)의 클러스터. (D): c-kit^pos CSCs의 수는, 식염수-처리된 CTRL과 비교하였을 때 경계에서는 상당히 증가하였지만 GF-처리된 피그의 경색 영역에서는 더 많았다. ^*p<0.05, 대 CTRL, †p<0.05 대 IGF- 1/HGF 1x, ‡p<0.05 vs. IGF-1/HGF 2x. (E): GF-처리된 피그 심장에서의 다수의 c-kit^pos CSCs(화이트)는 새로 형성된 상태의 표지인 BrdU(그레이)에 대해 양성이었다. (F): c-kit^pos CSCs(화이트)는 심장원종세포를 나타내는 심장전사인자, Nkx2.5(그레이)를 발현하였다. 핵은 DAPI(블루)로 염색되었다. (G): c-kit^posNkx2.5^pos 심장원종세포는 GF-처리된 피그 심장 중의 경색 및 경계구역에서 증가하였다. ^*p<0.05, 대 CTRL, †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x, ‡p<0.05 대 IGF-1/HGF 2x. (H-I): 일부 c-kit^pos CSCs(화이트)는 각각 평활근 및 내피세포 분화의 표지인 전자인자, GAT A6 (H; 그레이) 및 Ets-1(I; 그레이)를 발현하였다.

도 5: IGF -1/ HGF 심장내 투여는 MI 후 실질적으로 새로운 근세포 형성을 유발한다.

(A-B): GF-1x(A) 및 GF-4x(B) 처리된 피그 심장의 경색영역에서 작은 새로 형성된 BrdUpos(화이트) 근세포(그레이; α-사르코머릭 액틴, α-사르크 액트)의 재생 대역. GF 양의 4x 투여후 재생 대역의 증가된 크기임. 또한, GF 양 4x 투여후 근세포는 보다 조밀, 치밀해지고 심근으로서 조직화됨. (C): 심근구역에서는 상기 재생 대역 내부에는 근세포(그레이; α-사르크 액트)를 증식시키는 작은 Ki67^pos(화이트)였다. (D-E): GF-1x(D) 및 GF-4x(E) 용량 후 경계구역에서 새로 형성된 작은 BrdU^pos(화이트 핵) 근세포(그레이; α-사르크 액트 세포질). (F): 작은 Ki67^pos(화이트) 근세포(그레이; α-사르크 액트)는 또한 GF-주입 후 경계구역에 존재하였다. (G-H): 작은 BrdU^pos 및 Ki67^pos 근세포의 분율은 경계에서 상당히 증가하였지만 GF 주입후 경색영역에서는 더 증가하였다. ^*p<0.05, 대 CTRL, †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x, ‡p<0.05 대 IGF-1/HGF 2x. (I): GF-4x 처리된 피그 심장의 경색구역에서의 작은 Ki67^pos 유사분열 근세포.

도 6: 성장인자 투여는 경색된 피그 심장에서 새로운 혈관구조의 생성을 증가시켰고 심장기능을 개선시켰다.

(A): 새로 형성된 동맥구조(BrdU, 화이트; α-평활근 액틴, SMA, 화이트; 미오신 중쇄, MHC, 그레이; DAPI, 블루)가 GF-처리된 피그 심장의 경색 영역에서 뚜렷하였다. (B-C): 또한 새로 형성된 모세혈관이 IGF-1 및 HGF 주입후 경색된 영역에서 뚜렷하였다(BrdU, 화이트; vWF, 그레이; DAPI, 어두운 그레이). (D-F): GF-처리된 피그에서 모세혈관의 수는 식염수 처리된 (어두운 그레이 염색) CTRL과 비교하였을 때 경색구역에서 상당히 증가하였다. ^*p<0.05 대 CTRL, †p<0.05 대 IGF-1/HGF 1x, ‡p<0.05 대 IGF-1/HGF 2x. 사진(2Ox 확대)은 식염수-처리된 CTRL(D) 및 GF-4x(E) 처리된 심장에서 vWF 염색(어두운 그레이)을 나타낸다. 모세혈관은 1개 또는 2개의 내피세포로 구성된 혈관으로서 정의된다. (G-H): GF-처리된 심장은 식염수-처리된 CTRL과 비교하였을 때 개선된 좌심실(LV) 박출률(G) 및 레디알 염색(H)을 나타내었다. ^*p<0.05 대 베이스라인, ＃p<0.05 대 AMI, †p<0.05 대 CTRL, ‡p<0.05 대 GF-1x. (I): CTRL(a-c) 및 GF-4x(d-f) 처리된 피그로부터 추적하는 대표적인 조직 도플러 레디알 염색. CTRL(b) 및 GF-4x(e) 처리된 피그(들)은 90분의 심장교합(AMI)에 따라 전방-중격 수축의 동등한 비동기화를 가졌다. 치사(포스트-MI)시에 비동기화된 수축은 CTRL에서는 악화된데 반해 GF-처리된(f) 피그에서는 개선되었다.

위에서 나타낸 결과들은 이들 성장인자들의 마이크로그램 용량이 심근 리모델링을 개선시키고, 광대한 새로운 심근형성을 발생시키는 상주 CSCs의 활성화를 촉진시키는 것임을 입증하며, 이것은 임상적으로 실행가능한 프로토콜을 사용한 인간과 유사한 크기 및 해부학의 동물심장에서 용량의돈방식으로 LV 기능을 개선시킨다. 따라서 IGF-1/HGF 주입은 투여된 GF 용량에 비례하여 심장 리모델링 및 자가혈액 세포재생에 관한 폭넓고 다양한 유리한 효과를 제공하였다.

도 7은 위에서 기술한 처방으로 수득한 IGF-1을 함유하는 PLGA 입자들의 광학현미경 사진을 도시한다.

도 8은 위의 도면에서 나타낸 입자들의 동일 배치(batch)의 전자현미경사진을 나타낸다.

도 9는 1번 피그(좌측 사진) 및 2번 피그(우측 사진)의 심장의 절편들을 나타낸다. 1번 피그의 좌심장동맥에 의해서 관류된 좌심실의 전방벽은 다수의 미세 경색(옅은 영역)을 나타내는데 반해, 2번 피그의 심근은 균일한 착색으로 표시된 바와 같이 정상이다.

도 10a는 폴리스티렌(그레이, 큰 직경, 매끄러운 원으로서 도면에서 레드 비드로 표시됨) 및 PLGA+성장인자(화이트, 작은 직경 및 보다 불규칙한 형상으로서 도면에서 그린 비드로 표시됨) 비드의 혼합물의 투여후 30분에 치사시킨 3번 피그의 심근의 절편들을 도시한 것이다. 레드와 그린 입자들 사이의 외관상 크기 차이는 레드의 보다 높은 형광에 기인한다.

도 10b 및 10c는 폴리스티렌(그레이, 보다 큰 직경, 매끄러운 원으로서 도면에서 레드로 표시됨) 및 PLGF+성장인자(화이트, 작은 직경 및 보다 불규칙한 형상으로서 도면에서 그린으로 표시됨) 비드들의 혼합물 투여후 24시간에 치사시킨 4번 피그의 심근의 절편들을 도시한 것이다. 그린 대 레드 비드의 비는 PLGA 미립자의 분해 때문에 상기 동물에서 상당히 작다. 좌측의 4개의 패널에서는 레드 비드만이 검출된데 반해, 우측의 것에서는 1:1에 근접한다.

도 11은 4번 피그의 2개 영역의 현미경적 절편들을 도시한다. 근세포는 그레이이다. 핵은 보다 어두운 그레이이다. 내인성 심장줄기세포(CSCs)는 화살표머리(상부) 및 화살표(하부)로 표시되었다. 그들의 멤브레인은 옅은 그린으로 표지된다. 상부도면에서 핵은 세포가 무활동성(quiescent)이기 때문에 투명하다. 하부 도면에서 모든 CSCs는 세포주기로 진입한 세포의 표지인 단백질 Ki-67을 동정하는 핵에서 옅은 그레이 염색을 갖는다.

도 12: 15㎛ PLGA 미세구로 엔캡슐화된 IGF -1 및 HGF 의 국부투여는 손상된 골격근의 재생을 강화시킨다.

대조 및 손상된 사두근육의 조직학적 사진. 패널 A: 우측 근육 상의 병터를 발생시킨 후 5일에 우측 근육 (대조)의 조직학적 사진. 이러한 다리에 아무런 치료도 제공되지 않았다. 패널 B: 치료없이 손상을 발생시킨 후 5일에 우측 사두의 조직학적 절편(손상된 대조). 화살표머리는 핵의 농도가 재생반응을 개시시키는 것으로 나타나는 경우 2개의 몇몇 광대한 영역의 세포괴사를 지칭한다. 패널 C: 병터를, 16㎍ IGF-1 및 4㎍ HGF의 총 투여 당량을 갖는 IGF-1로 로딩한 미세구 및 HGF로 로딩한 미세구의 혼합물로 처리한 후 3일에 우측 사두의 우측 생검. 화살표 모리는 바로 그 재생 공정에서 손상된 영역에서 젊은 마이크로 섬유쪽을 가리킨다. 패널 D: 2일 후(병터 처리후 5일) 패널 C에서 나타난 동일 근육의 생검. 보다 작은 크기의 어두운 섬유들이 배아 미오신 중쇄에 대한 항체, 표지 또는 재생된 섬유로 표지한 재생된 섬유이다. 이 패널에서 사진은 패널 B에서의 것과 동등하다. 2개의 사진들 사이의 두드러진 차이는 요법의 효능을 보여준다.

도 13: 직경 15㎛의 PLGA 미세구로 엔캡슐화된 심장내 투여된 IGF -1/ HGF / SCF 의 조합의 증강된 심근 재생능력.

도 13a의 막대그래프는 (하나는 IGF-1로 로딩한 것이고 다른 하나는 HGF로 로딩한 것인) 화이트 막대들과 3가지 유형의 미세구(hrIGF-1, hrHGF, 및 hrSCF)의 조합으로 처리한 동물들을 나타내는 블랙 막대인 2가지 유형의 미세구의 조합으로 처리한 포스트-AMI 피그에서 재생된 심근세포의 수에 있어서의 효과를 비교한 것이다. 사용된 3가지의 상이한 농도에서 각각 상이한 인자로 로딩한 3가지 유형의 미세구들의 조합은 2가지 유형만의 조합에 비해서 명백히 우수하다. CTRL=플라세보로 처리한 대조동물; 화이트 막대: 생물학적 활성인 2㎍ IGF-1 및 0.5㎍ HGF의 등량으로 로딩한 미세구를 투여한 1X 동물; 2X=4㎍ IGF-1 및 l㎍ HGF 및 4X 용량=8㎍의 IGF-1 및 2㎍의 HGF. 화이트 막대에 의해 표시된 동물 플러스 2, 4 및 8㎍의 생물학적 활성 hrSCF에 대해 등량인 SCF로 로딩한 미세구에 대한 IGF-1 및 HGF의 동일량.

도 13b는 상이한 조합의 미세구들로 처리한 피그들의 초음파심장도 검사로 측정한 포스트-AMI 이전, 직후 및 4주 후에 좌심실 박출률을 나타낸 것이다. 베이스라인=AMI 직전의 LV 박출률; AMI=AMI 후의 LV 박출률; 포스트-AMI=AMI 및 국부 GF 처리 후 4주의 LV 박출률; C=플라세보 포스트-AMI로 처리한 대조동물; ○=용액 심장내에서 IGF-1 + HGF의 4X 용량으로 처리한 동물; ▼=심장교합의 부위에 대한 오로지 다운스트림으로 투여한 PLGA 미세구로 엔캡슐화된 IGF-1 + HGF의 4X 용량으로 처리한 동물; △=심장교합의 부위에 대해 오로지 다운스트림으로 투여된 PLGA 미세구로 각각 개별적으로 엔캡슐화된 IGF-1+HGF+SCF의 4X 용량으로 처리한 동물.

본원 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐서 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 용어 '포함한다', 및 그의 변형어구 '포함하는'은 언급된 구성요소 또는 단계 또는 구성요소들 또는 단계들의 군을 포괄하는 것을 뜻하는 것으로 이해되어야 하며, 상기 용어 및 그들의 변형어구는 다른 구성요소 또는 단계 또는 구성요소들 또는 단계들의 배제를 뜻하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본원에서 본 발명의 양태들은 구성요소들을 포함하는 것으로 기술되어 있다. 또한 본원의 개시는 상기 구성요소들로 구성되거나 또는 필수적으로 그 구성요소들로 구성된 별도의 양태들로 확장된다.

또한 본 발명의 개시는 기술적으로 실행될 수 있는 본원에서 기술된 하나 이상의 양태의 조합으로 확장되는 것으로 파악되어야 한다.

본원에서 언급된 모든 특허 및 특허출원은 그 전체가 참조로 인용된다. 이러한 기술 및 청구범위의 일부를 구성하는 출원은 후속출원에 대한 우선권의 기준으로서 사용될 수 있다. 상기 후속출원의 청구범위는 본원에서 기술된 특징들 또는 특징들의 조합에 관한 것일 수 있다. 이들은 생성물, 조성물, 방법 또는 용도 청구항의 형태를 취할 수 있으며, 실시예에 의해서 및 하등의 제한없이 청구대상들을 포함할 수 있다.

Claims (33)

1. 활성 성분 및 생분해성 중합체 부형제를 함유하는 입자를 포함하는 표적 조직에 비경구 투여하기 위한 약학 제형으로서, 상기 입자의 90% 이상은 10 내지 20 미크론의 직경을 갖고 상기 제형은 50 미크론 초과 및 5 미크론 미만의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없어서 제형이 표적 조직의 업스트림(upstream)으로 투여되는 경우 표적 조직을 통과하고 체순환으로 전환하는 능력이 제한되는 것인 약학 제형.
2. 제 1 항에 있어서,
   50 미크론 초과 및 5 미크론 미만의 직경을 갖는 입자가 실질적으로 없는 것인 약학 제형.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   입자의 90% 이상이 15 내지 20 미크론의 직경을 갖는 것인 약학 제형.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   입자의 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 10 내지 20 미크론의 직경을 갖는 것인 약학 조성물.
5. 제 3 항에 있어서,
   입자의 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 15 내지 20 미크론의 직경을 갖는 것인 약학 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
   입자의 크기가 단분산되어 있는 것인 약학 조성물.
7. 제 6 항에 있어서,
   입자의 68% 이상이 평균입자크기의 +/- 1 미크론의 크기를 가지는 것인 약학 조성물.
8. 제 7 항에 있어서,
   입자의 99% 이상이 평균입자크기의 +/- 1 미크론의 크기를 가지는 것인 약학 조성물.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
   입자가 15 미크론의 평균입자크기를 가지는 것인 약학 조성물.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    허혈성 조직에 비경구 투여하기 위한 약학 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,
    심장 허혈성 조직에 비경구 투여하기 위한 약학 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,
    추가로, HGF(간세포성장인자); IGF-1과 같은 IGF(인슐린-유사 성장인자), PDGF-β와 같은 PDGF(혈소판-유도된 성장인자); aFGF(FGF-1) 또는 bFGF(FGF-2) 및 FGF-4와 같은 FGF(섬유모세포 성장인자), SDF-1(간질세포-유도된 성장인자 1); EGF(표피성장인자); VEGF(혈관내피성장인자); EPO(적혈구형성인자); TGF β(전환성장인자 β); G-CSF(과립구집락자극인자); GM-CSF(과립구대식세포집락자극인자), 골형태원성단백질(BMPs, BMP -2, BMP-4); 액티빈 A; IL-6; 예를 들어 NGF(신경성장인자), BDNF(뇌-유도된 신경영양인자), NT-3(신경자극호르몬-3), NT-4(신경자극호르몬-4) 및, NGF, BDNF, NT-3 및 NT-4와 구조적으로 관련되지 않은 NT-1(신경자극호르몬-1)과 같은 신경자극호르몬; TPO(혈전형성인자); GDF-8(미오스타틴); GDF-9(성장분비인자-9); 페리오스틴(Periostin), WINT 3A 및 신경게울린(neurogeulin)으로부터 선택된 성장인자를 포함하는 약학 제형.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    HGF 및/또는 IGF를 포함하는 군으로부터 선택된 활성 성분을 함유하는 약학 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    추가로, PDGF-β와 같은 PDGF(혈소판-유도된 성장인자); aFGF(FGF-1) 또는 bFGF(FGF-2) 및 FGF-4와 같은 FGF(섬유모세포 성장인자); SDF-1(간질세포-유도된 성장인자 1); EGF(표피성장인자); VEGF(혈관내피성장인자); EPO(적혈구형성인자); TGF β(전환성장인자 β); G-CSF(과립구집락자극인자); GM-CSF(과립구대식세포집락자극인자), 골형태원성단백질(BMPs, BMP -2, BMP-4); 액티빈 A; IL-6; 예를 들어 NGF(신경성장인자), BDNF(뇌-유도된 신경영양인자), NT-3(신경자극호르몬-3), NT-4(신경자극호르몬-4) 및, NGF, BDNF, NT-3 및 NT-4와 구조적으로 관련되지 않은 NT-1(신경자극호르몬-1)과 같은 신경자극호르몬; TPO(혈전형성인자); GDF-8(미오스타틴); GDF-9(성장분비인자-9); 페리오스틴(Periostin), WINT 3A 및 신경게울린으로부터 선택된 성장인자를 포함하는 약학 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,
    추가로 SCF-1을 포함하는 약학 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    활성 성분의 농도가 1ng/1 x 10⁶개의 입자 내지 4mg/1 x 10⁶개의 입자의 범위인 약학 조성물.
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    활성 성분의 30% 이상이 투여 후 표적 조직에 유지되는 약학 제형.
18. 제 17 항에 있어서,
    활성 성분의 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 가령 80% 이상이 유지되는 약학 제형.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    비경구 투여가 동맥내 투여인 약학 조성물.
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    치료를 위한 약학 제형.
21. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    선택된 조직 또는 기관을 표적화하기 위한 약학 제형.
22. 제 21 항에 있어서,
    상기 기관이 심장, 폐(들), 간, 신장(들), 방광, 자궁, 고환, 췌장, 비장 또는 창자로부터 선택되는 것인 약학 제형.
23. 제 22 항에 있어서,
    심장 조직을 표적화하기 위한 약학 제형.
24. 제 23 항에 있어서,
    급성 또는 만성인 심근경색(MI), 심근경색의 존재 또는 부재하의 허혈성 심장병의 치료를 위한 약학 제형.
25. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 정의된 약학 조성물을 심장 조직의 순환 업스트림으로 투여하는 단계를 포함하는 국부 전달의 방법.
26. 제 25 항에 있어서,
    국부 전달이 동맥내 투여를 통해서인 방법.
27. 성숙 심장조직에 상주하는 줄기세포를 자극함으로써 심장조직에서 재생을 위한 HGF 또는 IGF-1의 용도.
28. 허혈성 손상으로부터 심장조직-특이적 줄기세포의 세포보호를 유도하고 세포자멸사 및/또는 괴사에 의한 그들의 치사를 감소시키기 위한 제 12 항에 정의된 성장인자의 용도.
29. OCT4-발현 줄기세포를 자극하기 위한 제 12 항에 정의된 성장인자의 용도.
30. 심장조직-특이적 줄기세포가 또한 자극되는 제 12 항에 정의된 성장인자의 용도.
31. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    뇌혈관사고(뇌졸중)의 치료를 위한 약학 제형.
32. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    감소된 혈류(허혈)의 결과로서 유발된 세포 손실 또는 다른 조직에서의 퇴행성 질병의 치료를 위한 약학 제형.
33. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    입자들의 혼합된 집단을 포함하되, 상기 집단이 제 1 활성 성분을 갖는 입자들을 하나 이상의 추가적인 별개의 활성 성분들을 갖는 입자들과의 혼합물로 포함하는 약학 조성물.

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