JP2020075895A

JP2020075895A - 移植片及びその使用

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Publication number: JP2020075895A
Application number: JP2018211288A
Authority: JP
Inventors: 昌治竹内; Shoji Takeuchi; 文智小沢; Fumitomo Ozawa; 翔伍長田; Shogo Nagata
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2020-05-21
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: EP3878512A1; CN113271892A; US20220088272A1; JP7306647B2; EP3878512A4; WO2020095974A1

Abstract

【課題】免疫攻撃を受けることなく細胞を生体内に移植することができ、生体外に取り出すこともできる、移植片を提供する。【解決手段】移植片であって、前記移植片は、生体内に移植された場合に体液に接触するシェル部と、前記シェル部の内部に位置し、前記体液とは実質的に接触しないコア部とを有し、前記コア部は細胞を含む複数の第１のハイドロゲルファイバを含み、前記シェル部は半透膜として機能する第２のハイドロゲルを含み、前記移植片は外径１．５ｍｍを超える大きさを有する、移植片。【選択図】図１

Description

本発明は、移植片及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、移植片、移植片製造装置及び移植片の製造方法に関する。

近年、ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ｉＰＳ細胞）、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞から分化させた細胞、組織幹細胞から分化させた細胞、ヒトやブタから採取した細胞等を、生体内に安全に移植する技術が求められている。

通常、同種他家又は異種の細胞を生体内に移植すると、宿主の免疫機構により移植細胞が拒絶され、移植した細胞の機能が低下してしまう。そこで、この問題を解決するために、カプセル化した細胞を移植片として移植する方法が検討されている（例えば、特許文献１を参照）。

特表２００６−５０３０８０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、緊急時等に移植片を取り出すことが困難な場合があり、また、異物反応による移植片の機能低下にまだ課題がある。また、大量の細胞を移植する場合に移植片が大きくなる傾向にあり、中心細胞壊死等により機能的な移植細胞が減少してしまう場合がある。

そこで、本発明は、免疫攻撃を受けることなく細胞を生体内に移植することができ、生体外に取り出すこともできる、移植片を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］移植片であって、前記移植片は、生体内に移植された場合に体液に接触するシェル部と、前記シェル部の内部に位置し、前記体液とは実質的に接触しないコア部とを有し、前記コア部は細胞を含む複数の第１のハイドロゲルファイバを含み、前記シェル部は半透膜として機能する第２のハイドロゲルを含み、前記移植片は外径１ｍｍ以上の大きさを有する、移植片。
［２］前記半透膜の分画分子量が７０，０００〜５００，０００である、請求項１に記載の移植片。
［３］前記移植片は、生体内に移植した場合に体液が侵入する凹部を有する、［１］又は［２］に記載の移植片。
［４］生体内に移植して２週間後において、表面に付着した前記生体由来の細胞の数が５×１０^５個／ｃｍ^２以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の移植片。
［５］前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、前記生体と同種他家又は異種である、［１］〜［４］のいずれかに記載の移植片。
［６］前記移植片の表面と、前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞との間の距離が、前記細胞が生存可能な距離である、［１］〜［５］のいずれかに記載の移植片。
［７］前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、内分泌細胞、外分泌細胞、神経系細胞、骨格筋系細胞、血液細胞及び間質細胞からなる群より選択された少なくとも１種の細胞である、［１］〜［６］のいずれかに記載の移植片。
［８］前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、複数種類の細胞を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の移植片。
［９］容器部と、前記容器部の内部に着脱可能に配置された複数の柱状冶具と、を含む、移植片製造装置。
［１０］［９］に記載の移植片製造装置の前記容器部に第２のゾルを注入し、第２のハイドロゲルを形成する工程と、前記第２のハイドロゲルの形成後に前記複数の柱状冶具を除去し、前記柱状冶具が存在していた部分が凹部を形成した第２のハイドロゲルを得る工程と、前記凹部に細胞を含む第１のゾルを注入し、第１のハイドロゲルを形成する工程と、を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の移植片の製造方法。
［１１］第１の円筒部と、前記第１の円筒部の内部に配置された複数の第２の円筒部と、を含む、移植片製造装置。
［１２］［１１］に記載の移植片製造装置の一方から前記第１の円筒部に第２のゾルを供給し、前記移植片製造装置の他方から排出される、前記第２のゾルの層流を形成するとともに、前記第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成する工程と、前記移植片製造装置の一方から前記第２の円筒部に細胞を含む第１のゾルを供給し、前記移植片製造装置の他方から排出される、前記第１のゾルの層流を形成するとともに、前記第１のゾルをゲル化させて第１のハイドロゲルを形成する工程と、を同時に行う、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の移植片の製造方法。

本発明によれば、免疫攻撃を受けることなく細胞を生体内に移植することができ、生体外に取り出すこともできる、移植片を提供することができる。

（ａ）は移植片の一例を示す模式図である。（ｂ）は、（ａ）に示す構造を有する移植片の写真である。（ａ）は移植片の変形例の一例の構造を示す斜視図である。（ｂ）は移植片の変形例の一例の構造を示す断面図である。移植片製造装置の一例の構造を示す模式図である。（ａ）は移植片製造装置の一例の構造を示す模式図である。（ｂ）は移植片製造装置の具体例を示す写真である。ハイドロゲルファイバの製造過程の一例を説明する模式図である。実験例２の結果を示すグラフである。実験例４において、移植片をマウスに移植している様子を撮影した写真である。実験例４において、マウスの血中グルコース濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。実験例４において、マウスの血中のヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した結果を示すグラフである。実験例５において、マウスの血中グルコース濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。実験例５において、マウスの血中のヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した結果を示すグラフである。実験例６において摘出した移植片の写真である。実験例６における、Ｃ−ペプチド及びグルカゴンの濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例６における、移植片の薄切切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

［移植片］
１実施形態において、本発明は、移植片であって、前記移植片は、生体内に移植された場合に体液に接触するシェル部と、前記シェル部の内部に位置し、前記体液とは実質的に接触しないコア部とを有し、前記コア部は細胞を含む複数の第１のハイドロゲルファイバを含み、前記シェル部は半透膜として機能する第２のハイドロゲルを含み、前記移植片は外径１ｍｍ以上の大きさを有する、移植片を提供する。

図１（ａ）は本実施形態の移植片の一例を示す模式図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）に示す構造を有する移植片の写真である。図１（ａ）に示すように、移植片１００は、シェル部１１０とコア部１２０とを有する。シェル部１１０は移植片の表面に位置し、生体内に移植された場合に体液に接触する。コア部１２０はシェル部１１０の内部に位置し、生体内に移植された場合においても実質的に体液に接触することはない。ここで、実質的に体液に接触しないとは、例えば移植片の端部においてはコア部が移植片の表面に露出している場合があり、この部分においてはコア部が体液に接触することを許容する意味である。

コア部１２０は、複数の第１のハイドロゲルファイバ１３０を含む。ハイドロゲルとは多量の水を含んだ三次元の網目構造をもつゲルである。ハイドロゲルは、水溶性高分子の水溶液等のゾルをゲル化することにより形成することができ、詳細は後述する。本明細書において、ハイドロゲルファイバとは、繊維状のハイドロゲルを意味する。

コア部１２０が複数の第１のハイドロゲルファイバ１３０を含むことにより、移植片が含む細胞１４０の数を増やすことができる。また、後述する外径Ｄを適切な大きさにし、かつ移植片１００の表面と、細胞１４０との間の距離を、細胞１４０が生存可能な距離に調整しやすくなる。

ハイドロゲルファイバ１３０は、細胞１４０を含む。シェル部１１０は半透膜として機能する第２のハイドロゲルから構成されている。シェル部１１０は、分画分子量が７０，０００〜５００，０００の半透膜として機能することが好ましい。これにより、移植片１００を生体内に移植した場合、シェル部１１０は、酸素、栄養分、細胞１４０の分泌物質等を透過させるが、生体内の免疫細胞、抗体等を透過させない。

このため、移植片１００を生体内に移植した場合、細胞１４０は宿主の免疫攻撃を受けることがない。また、細胞１４０の分泌物質はシェル部１１０を透過し、生体内に分泌される。

シェル部１１０の分画分子量は、第２のハイドロゲルの密度を調整すること等により、目的に応じて任意に制御することができる。

移植片１００の軸方向に直行する面の断面形状は、特に限定されず、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等であってもよい。ここで、移植片の軸方向は、移植片の長さ方向であってもよく、第１のハイドロゲルファイバ１３０の長軸方向であってもよい。

移植片１００は外径Ｄを有する。ここで、外径Ｄは、移植片の軸方向に直行する面の断面積と同一面積を有する円の直径であってもよい。外径Ｄは、１〜１００ｍｍであってもよい。外径Ｄの下限値は１．５ｍｍであってもよく、２ｍｍであってもよく、３ｍｍであってもよく、４ｍｍであってもよく、５ｍｍであってもよく、６ｍｍであってもよい。また、外径Ｄの上限値は、１００ｍｍであってもよく、８０ｍｍであってもよく、６０ｍｍであってもよく、４０ｍｍであってもよく、３０ｍｍであってもよく、２０ｍｍであってもよく、１０ｍｍであってもよく、９ｍｍであってもよく、８ｍｍであってもよく、７ｍｍであってもよい。上記外径Ｄの下限値及び上限値は任意に組み合わせることができる。１実施形態において、外径Ｄは１．５ｍｍ超の大きさを有していてもよい。

実施例において後述するように、移植片の外径Ｄが上記の範囲であると、生体内に移植して２週間後においても、移植片の表面に付着した生体由来の細胞の数が５×１０^５個／ｃｍ^２以下に保たれる傾向にある。このため、生体内の組織と移植片との癒着が抑制され、移植後長期間経過した後においても、必要に応じて移植片を容易に生体外に取り出すことができる。

また、移植片の長さは移植対象の症状や移植目的に応じて適宜調整することができ、例えば１〜１００ｃｍの範囲であることが好ましい。

移植片１００の表面と、第１のハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞１４０との間の距離は、細胞１４０が生存可能な距離であることが好ましい。ここで、移植片１００の表面とは、生体内に移植片１００を移植した場合に、体液が接触する面である。上記距離は、２ｍｍ以下であることが好ましく、１ｍｍ以下であることがより好ましい。

第１のハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞１４０は、移植片１１０を移植する生体と同種他家又は異種であってもよい。

再生医療では、自家の細胞を移植するよりも同種他家又は異種の細胞を移植することが現実的な場合が多い。しかしながら、生体に同種他家又は異種の細胞を移植すると、宿主の免疫機構により移植細胞が拒絶され、移植した細胞の機能が低下してしまう。これに対し、本実施形態の移植片によれば、細胞１４０が同種他家又は異種であっても宿主の免疫攻撃を受けることがない。

第１のハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞１４０としては、内分泌細胞、外分泌細胞、神経系細胞、骨格筋系細胞、血液細胞、間質細胞等が挙げられる。ここで、内分泌細胞としては、例えば、神経分泌細胞、下垂体細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵島細胞、胃腸内分泌細胞、心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、副腎細胞、性腺細胞等が挙げられる。また、外分泌細胞としては、例えば、消化管上皮細胞等が挙げられる。また、神経系細胞としては、神経幹細胞、中枢神経細胞、末梢神経細胞、グリア細胞等が挙げられる。また、骨格筋系細胞としては、骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。また、血液細胞としては、造血幹細胞、白血球、赤血球、血小板等が挙げられる。また、間質細胞としては、繊維芽細胞、血管細胞等が挙げられる。

これらの細胞はｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等から分化誘導された細胞であってもよい。実施例において後述するように、例えば細胞１４０が膵島細胞である場合、本実施形態の移植片を生体内に移植することにより、糖尿病を治療することができる。

第１のハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞１４０は、複数種類の細胞を含んでいてもよい。これにより、互いに相互作用する細胞を移植片の内部に配置して、移植片の内部で相互作用させることができる。複数種類の細胞は、上述したいずれかの細胞の混合物であってもよい。あるいは、複数種類の細胞は、内分泌細胞、外分泌細胞、神経系細胞、骨格筋系細胞又は血液細胞と、間質細胞との混合物であってもよい。互いに相互作用する細胞としては、例えば、膵島細胞と血管内皮細胞の組み合わせ、肝細胞と非実質細胞の組み合わせ等が挙げられる。

ハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞が複数種類である場合、１本のハイドロゲルファイバ１３０に複数種類の細胞が混合して含まれていてもよいし、１本のハイドロゲルファイバ１３０は１種類の細胞を含んでおり、複数の第１のハイドロゲルファイバ１３０のうちの一部が他の第１のハイドロゲルファイバ１３０とは異なる種類の細胞を含んでいてもよい。

（変形例）
移植片１００において、コア部１２０の内部における第１のハイドロゲルファイバ１３０の配置は、図１（ａ）に示すものに限られない。図１（ａ）では、コア部１２０の辺縁部に第１のハイドロゲルファイバ１３０が間隔をおいて配置されている。

これに対し、第１のハイドロゲルファイバ１３０の数を増加させて、コア部１２０の辺縁部に多数の第１のハイドロゲルファイバ１３０を密着させて配置してもよい。この場合、ハイドロゲルファイバ１３０は円環状に配置されることになる。これにより、移植片１００が含む細胞１４０の数を増やすことができる。

また、移植片１００において、シェル部１１０とコア部１２０の配置は図１（ａ）に示すものに限られない。図２（ａ）は移植片１００の変形例の１つである、移植片１００ａの構造を示す斜視図である。図２（ａ）に示すように、移植片１００ａは、シェル部１１０とコア部１２０とを有する。

移植片１００ａのシェル部１１０は外側と内側の二重構造になっている。外側シェル部１１０の内部にはコア部１２０が位置している。また、内側のシェル部１１０の内部にもコア部１２０が位置している。コア部１２０は、複数の第１のハイドロゲルファイバ１３０を含む。ハイドロゲルファイバ１３０は、細胞１４０を含む。

移植片１００ａにおいて、外側のシェル部１１０と内側のシェル部１１０の間の空間は、移植片１００ａを生体内に移植した場合に体液が侵入する凹部を形成している。

凹部の表面も移植片１００ａの表面である。凹部に体液が侵入することにより、移植片１００ａの表面と、第１のハイドロゲルファイバ１３０に含まれる細胞１４０との間の距離が、細胞１４０の生存可能な距離である領域を拡大することができる。これにより、移植片１００ａ中で生存可能な細胞１４０の細胞数を増加させることができる。

移植片１００ａの外面には、貫通孔１５０が設けられていてもよい。貫通孔１５０は、移植片１００ａの外面と、移植片１００ａの凹部とを連通している。移植片１００ａを生体内に移植した場合、貫通孔１５０からも体液が侵入することになる。

図２（ｂ）は移植片１００の変形例の１つである、移植片１００ｂの構造を示す断面図である。図２（ｂ）に示すように、移植片１００ｂは、シェル部１１０とコア部１２０とを有する。

移植片１００ｂは、内部に凹部を有している。この例では、凹部の断面形状は、凹部の中心から３つの直方体が放射状に並んだような形状となっている。移植片１００ｂを生体内に移植した場合には、凹部に体液が侵入する。

移植片１００ｂにおいて、凹部に接する領域もシェル部１１０である。シェル部１１０の内部にはコア部１２０が位置している。コア部１２０は、複数の第１のハイドロゲルファイバ１３０を含む。ハイドロゲルファイバ１３０は、細胞１４０を含む。

［移植片製造装置］
（第１実施形態）
第１実施形態の移植片製造装置は、容器部と、前記容器部の内部に着脱可能に配置された複数の柱状冶具と、を含む。図３は、本実施形態の移植片製造装置の構造を示す模式図である。図３に示すように、移植片製造装置３００は、容器部３１０と、容器部３１０の内部に着脱可能に配置された複数の柱状冶具３２０とを含む。第１実施形態の移植片製造装置によって、上述した移植片を製造することができる。

（第２実施形態）
第２実施形態の移植片製造装置は、第１の円筒部と、前記第１の円筒部の内部に配置された複数の第２の円筒部と、を含む。図４（ａ）は、本実施形態の移植片製造装置の構造を示す模式図である。図４（ａ）に示すように、移植片製造装置４００は、第１の円筒部４１０と、第１の円筒部４１０の内部に配置された複数の第２の円筒部４２０とを含む。第１の円筒部４１０には、第１の円筒部４１０に第２のゾルを供給するチューブ４１１が接続されていることが好ましい。また、第２の円筒部４２０には、第２の円筒部４２０に第１のゾルを供給するチューブ４２１が接続されていることが好ましい。図４（ｂ）は、第２実施形態の移植片製造装置の具体例を示す写真である。第２実施形態の移植片製造装置によって、上述した移植片を製造することができる。

［移植片の製造方法］
（第１実施形態）
第１実施形態に係る移植片の製造方法は、上述した第１実施形態の移植片製造装置を用いる製造方法である。本実施形態の方法では、まず、移植片製造装置３００の容器部３１０に第２のゾルを注入し、第２のハイドロゲルを形成する。

続いて、第２のハイドロゲルの形成後に複数の柱状冶具３２０を除去する。この結果、柱状冶具３２０が存在していた部分が凹部を形成した第２のハイドロゲルが得られる。続いて、第２のハイドロゲルの凹部に、細胞を含む第１のゾルを注入し、第１のハイドロゲルを形成する。細胞としては、上述したものを用いることができる。この結果、上述した移植片を製造することができる。

第１実施形態に係る移植片の製造方法は、第１のハイドロゲルを形成した後に、第１のハイドロゲルの露出部分を第２のハイドロゲルで覆う工程を更に含むことが好ましい。これにより、細胞を含む第１のハイドロゲルを第２のハイドロゲルで完全に覆うことができる。この結果、細胞が第２のハイドロゲルで完全にカプセル化され、生体内に移植した場合に、細胞が免疫攻撃を受ける可能性を更に低下させることができる。

本実施形態の製造方法において、ゾルとしては、金属イオンの存在下でゲル化してハイドロゲルを形成するゾル、温度に応答してゲル化しハイドロゲルを形成するゾル、ｐＨに応答してゲル化しハイドロゲルを形成するゾル、光に応答してハイドロゲルを形成するゾル、磁場に応答してハイドロゲルを形成するゾル等を用いることができる。以下、ゾルとゲルを区別せずに呼称する場合がある。

ゾルをゲル化するためには、用いたゲルの特性に応じて、金属イオンを接触させる、温度をゲル化条件に調整する、ｐＨをゲル化条件に調整する、ゲル化条件の光を照射する、ゲル化条件の磁場を与える等の操作を行えばよい。

金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲルとしては、二価又は三価の金属イオンの存在下でゲル化するアルギン酸ゲル、カルシウムイオンやカリウムイオンの存在下でゲル化するカラギーナンゲル、ナトリウムイオンの存在下でゲル化するアクリル酸系合成ゲル等が挙げられる。

温度応答性ハイドロゲルとしては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をポリエチレングリコールで架橋した温度応答性ハイドロゲル（市販名：メビオールゲル）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレンオキシドのトリブロック共重合体（市販名：プルロニック、ポロキサマー）、アガロース、ポリビニルアルコール等が挙げられる。

ｐＨ応答性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、キトサンゲル、カルボキシメチルセルロースゲル、アクリル酸系合成ゲル等が挙げられる。

光応答性ハイドロゲルとしては、骨格にアゾベンゼンとシクロデキストリンを組み合わせた合成ゲル、フマル酸アミドをスペーサーとした超分子からなるゲル、ニトロベンジル基を介して架橋されたないしは結合されているゲル等が挙げられる。

磁場応答性ハイドロゲルとしては、磁性粒子を含有させた架橋ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）からなるゲル等が挙げられる。

（第２実施形態）
第２実施形態に係る移植片の製造方法は、上述した第２実施形態の移植片製造装置を用いる製造方法である。本実施形態の方法では、第１のゾルの層流と第２のゾルの層流を形成しゲル化することにより移植片を製造する。第１のゾルと第２のゾルは、いずれかが先にゲル化することが好ましい。

具体的には、移植片製造装置４００の一方（図４（ａ）における上側）から、第１の円筒部４１０に第２のゾルを供給し、移植片製造装置４００の他方（図４（ａ）における下側）から排出される、第２のゾルの層流を形成するとともに、第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成する工程と、移植片製造装置４００の一方（図４（ａ）における上側）から第２の円筒部４２０に細胞を含む第１のゾルを供給し、移植片製造装置４００の他方（図４（ａ）における下側）から排出される、第１のゾルの層流を形成するとともに、第１のゾルをゲル化させて第１のハイドロゲルを形成する工程と、を同時に行う。細胞としては、上述したものを用いることができる。この結果、上述した移植片を製造することができる。

第２実施形態に係る移植片の製造方法は、第２のハイドロゲルを形成する工程と第１のハイドロゲルを形成する工程とを同時に行う工程の前及び後に、第２のハイドロゲルのみを形成する工程を更に含むことが好ましい。

すなわち、まず、第２のゾルのみの層流を形成するとともに第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成し、続いて、上述したように第２のハイドロゲルを形成する工程と第１のハイドロゲルを形成する工程とを同時に行い、続いて、第２のゾルのみの層流を形成するとともに第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成することが好ましい。

この結果、製造される移植片は、細胞を含む第１のハイドロゲルを第２のハイドロゲルで完全に覆うことができる。この結果、細胞が第２のハイドロゲルで完全にカプセル化され、生体内に移植した場合に、細胞が免疫攻撃を受ける可能性を更に低下させることができる。

第１の円筒部４１０への第２のゾルの供給は、チューブ４１１を通じて行うことができる。また、第２の円筒部４２０への第１のゾルの供給は、チューブ４２１を通じて行うことができる。

第２実施形態の製造方法において、ゾル及びハイドロゲルとしては第１実施形態の製造方法におけるものと同様のものを用いることができる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、細胞の有効量を含む移植片を、治療必要とする患者に移植することを含む、疾患の治療方法であって、前記移植片は、生体内に移植された場合に体液に接触するシェル部と、前記シェル部の内部に位置し、前記体液とは実質的に接触しないコア部とを有し、前記コア部は前記細胞を含む複数の第１のハイドロゲルファイバを含み、前記シェル部は半透膜として機能する第２のハイドロゲルを含み、前記移植片は外径１．５ｍｍを超える大きさを有する、治療方法を提供する。

本実施形態の治療方法において、細胞の種類は疾患に応じて選択される。例えば、糖尿病の治療には膵島細胞を移植することが有効である。また、肝臓疾患の治療には肝細胞を移植することが有効である。また、パーキンソン病の治療には神経細胞を移植することが有効である。

以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（ハイドロゲルファイバの作製）
まず、ハイドロゲルファイバの作製方法を説明する。ハイドロゲルファイバの作製方法は特に限定されないが、例えば、図５に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅ）を用いることにより簡便に作製することができる。２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置は、例えば、Wonje Jeong, et al., Hydrodynamic microfabrication via "on the fly" photopolymerization of microscale fibers and tubes, Lab Chip, 2004, 4, 576-580 のＦｉｇ．１にも具体的に説明されている。

図５は、ハイドロゲルファイバ６００の製造過程の一例を説明する模式図である。ここでは、コア部の材料にコラーゲン溶液を用い、シェル部の材料に架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を用いた場合について説明する。

まず、マイクロ流体装置５００の導入口５１０から、コラーゲン溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置５００の導入口５２０から、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置５００の導入口５３０から、塩化カルシウム溶液を導入して射出する。すると、シェル部のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、コア部６１０がコラーゲンゲルであり、シェル部６２０がアルギン酸ゲルであるハイドロゲルファイバを製造することができる。

導入口５１０及び５２０における溶液の射出速度は特に限定されないが、マイクロ流体装置５００の口径が５０μｍ〜２ｍｍ程度である場合には、１０〜５００μＬ／分程度であってもよい。導入口５１０及び５２０における溶液の射出速度を調節することにより、コア部の直径及びシェル部の被覆厚みを適宜調節できる。導入口５３０における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば１〜１０ｍＬ／分程度であってもよい。

本実験例では、図５に示すマイクロ流体装置を用いて外径サイズがそれぞれ異なるハイドロゲルファイバを作製した。外径サイズは０．３５ｍｍ、０．５ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、６ｍｍとした。また、ハイドロゲルファイバの長さは３ｃｍとした。

図５に示すように、マイクロ流体装置の同軸マイクロ流路に、コア流体としてコラーゲン溶液又はアルギン酸を含むラミニン溶液を供給した。また、シェル流体としてアルギン酸ナトリウム水溶液を供給した。また、シース流体として塩化バリウム水溶液を供給した。これにより、シェルとシースとの界面でゲル化が誘起され、ハイドロゲルファイバが得られた。ハイドロゲルファイバのシェルは、アルギン酸バリウムのゲルであった。

［実験例２］
（ハイドロゲルの移植）
実験例１で作製した各ハイドロゲルファイバを、免疫機能を有する健常なＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内にそれぞれ移植し、その影響を検討した。

各ハイドロゲルファイバの移植から１４日間経過した後、各ハイドロゲルファイバをマウスの腹腔内から取り出した。なお、１４日間という期間は、移植された組織に対する異物反応（ＦＢＲ：ＦｏｒｅｉｇｎＢｏｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ）を観察するのに適した期間とされている。

続いて、各ハイドロゲルファイバの表面に付着した細胞の数を計測した。図６は、各ハイドロゲルファイバの表面に付着した細胞の数を計測した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は細胞密度（個／ｃｍ^２）を示す。

その結果、外径が０．３５ｍｍ、０．５ｍｍのハイドロゲルファイバへの細胞付着は多いが、外径が１ｍｍ以上のハイドロゲルファイバへの細胞付着は少ないことが明らかとなった。この結果は、移植片の外径が１ｍｍ以上であると、生体内の組織と移植片との癒着が抑制されることを示す。

［実験例３］
（移植片の作製）
図４（ａ）及び（ｂ）に示す移植片製造装置を用いて移植片を作製した。第１のゾルとしてはコラーゲン溶液又はラミニン溶液を使用した。第１のゾルは、ある一定以上の温度条件下でゲル化するものであった。また、第１のゾルにはヒトｉＰＳから分化誘導したヒト膵島細胞を混合した。また、第２のゾルとしてはアルギン酸溶液を使用した。第２のゾルは、多価カチオンを含む液体と反応するとゲル化するものであった。

移植片製造装置の一方から第１の円筒部に第２のゾルを供給し、移植片製造装置の他方から排出される、第２のゾルの層流を形成するとともに、第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成する工程と、移植片製造装置の一方から第２の円筒部に細胞を含む第１のゾルを供給し、移植片製造装置の他方から排出される、第１のゾルの層流を形成するとともに、第１のゾルをゲル化させて第１のハイドロゲルを形成する工程と、を同時に行った。この結果、移植片製造装置の他方側に移植片が形成された。

移植片は長さ２０〜３０ｍｍの円筒形をしており、外径は６ｍｍであった。また、移植片１個あたり、６×１０^６個又は１．２×１０^７個の膵島細胞を含む２種類の移植片を作製した。

［実験例４］
（免疫不全糖尿病モデルマウスへの移植片の移植）
免疫不全糖尿病モデルマウスの腹腔内又は皮下に、実験例３で作製した移植片を移植し、血中グルコース濃度の推移を測定した。移植片としては、移植片１個あたり１．２×１０^７個の膵島細胞を含むものを使用した。また、免疫不全糖尿病モデルマウスとしては、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスを使用した。図７は移植片をマウスに移植している様子を撮影した写真である。

移植片を移植後のマウスの非空腹時の血中グルコース濃度を、少なくとも１日１回行った。血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄＬ以下を正常血糖と判断した。図８は、マウスの血中グルコース濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。

その結果、移植片の移植前に２００ｍｇ／ｄＬ以上であった血中グルコース濃度が、移植片の移植後に２００ｍｇ／ｄＬ以下に維持されたことが明らかとなった。また、移植から４か月後に移植片を除去すると、血中グルコース濃度が再び２００ｍｇ／ｄＬ以上に上昇した。この結果は、移植片の存在により血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄＬ以下に維持されていたことを示す。

また、マウスの血中のヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した。図９は、ヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した結果を示すグラフである。なお、Ｃ−ペプチドは、インスリンの前駆物質であるプロインスリンの構成成分である。膵島細胞内でインスリン部分とアミノ酸３１個のＣ−ペプチド部分に分離されて血中に放出される。したがって、血中のヒトＣ−ペプチドの濃度は、移植片に含まれるヒト膵島細胞が分泌したヒトインスリンの量に対応するといえる。ヒトＣ−ペプチドは、抗ヒトインスリン抗体やマウスインスリンの存在下でも測定が可能である。

図９の結果から、移植片の移植から２４週間後においても、移植片に含まれるヒト膵島細胞の機能が維持されたことが確認された。

［実験例５］
（免疫機能を有する糖尿病モデルマウスへの移植片の移植）
免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの腹腔内又は皮下に、実験例３で作製した移植片を移植し、血中グルコース濃度の推移を測定した。移植片としては、移植片１個あたり６×１０^６個の膵島細胞を含むものを使用した。また、免疫機能を有する糖尿病マウスとしては、ストレプトゾシン（ＣＡＳ番号：１８８８３−６６−４）の投与により糖尿病を誘起したＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。

移植片を移植後のマウスの非空腹時の血中グルコース濃度を、少なくとも１日１回行った。血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄＬ以下を正常血糖と判断した。図１０は、マウスの血中グルコース濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。

その結果、移植片の移植前に２００ｍｇ／ｄＬ以上であった血中グルコース濃度が、移植片の移植後に２００ｍｇ／ｄＬ以下に維持される傾向が認められた。この効果は移植後少なくとも１８０日間維持された。

また、マウスの血中のヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した。図１１は、マウスの血中のヒトＣ−ペプチドの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１１の結果から、移植片の移植から１０週間後においても、移植片に含まれるヒト膵島細胞の機能が維持されたことが確認された。

［実験例６］
（移植片の検討）
実験例５で移植片を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスから、４か月後に移植片を摘出し、解析した。図１２は摘出した移植片の写真である。

まず、移植片を培地中でインキュベートし、培地中のグルコース濃度を３ｍｇ／ｍＬに調整し、低血糖状態にした場合に培地中に分泌されたヒトＣ−ペプチド及びグルカゴンの濃度を測定した。続いて、培地中のグルコース濃度を２２ｍｇ／ｍＬに調整し、高低血糖状態にした場合に培地中に分泌されたヒトＣ−ペプチド及びグルカゴンの濃度を測定した。続いて、培地中のグルコース濃度を３ｍｇ／ｍＬに調整し、再び低血糖状態にした場合に培地中に分泌されたヒトＣ−ペプチド及びグルカゴンの濃度を測定した。なお、グルカゴンはインスリンとは反対に血糖値が下がって糖を必要とするようになった場合に膵島細胞から分泌されるペプチドホルモンである。

図１３は、Ｃ−ペプチド及びグルカゴンの濃度の測定結果を示すグラフである。図１３中、「ｌｏｗ」は低血糖状態における測定結果であることを示し、「ｈｉｇｈ」は高血糖状態における測定結果であることを示す。

続いて、摘出した移植片の薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色した。図１４（ａ）及び（ｂ）は、ヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。図１４（ｂ）は図１４（ａ）の一部を拡大して撮影した顕微鏡写真である。

その結果、移植片が４か月間マウスの体内に移植されていたにもかかわらず、移植片に含まれるヒト膵島細胞が生存していることが確認された。

また、実験例４で移植片を移植したＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスからも４か月後に移植片を摘出して同様の解析を行った。その結果、本実験例と同様の結果が得られた。すなわち、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスにおいても、移植片が４か月間マウスの体内に移植されていたにもかかわらず、移植片に含まれるヒト膵島細胞が生存していることが確認された。更に、摘出した移植片に含まれるヒト膵島細胞は、培地中のグルコース濃度に応じてＣ−ペプチド及びグルカゴンの濃度を変化させることが確認された。

１００，１００ａ，１００ｂ…移植片、１１０，６２０…シェル部、１２０，６１０…コア部、１３０…第１のハイドロゲルファイバ、１４０…細胞、１５０…貫通孔、３００，４００…移植片製造装置、３１０…容器部、３２０…柱状冶具、４１０…第１の円筒部、４２０…第２の円筒部、４１１，４２１…チューブ、５００…マイクロ流体装置、５１０，５２０，５３０…導入口、６００ハイドロゲルファイバ、Ｄ…外径。

Claims

移植片であって、
前記移植片は、生体内に移植された場合に体液に接触するシェル部と、前記シェル部の内部に位置し、前記体液とは実質的に接触しないコア部とを有し、
前記コア部は細胞を含む複数の第１のハイドロゲルファイバを含み、
前記シェル部は半透膜として機能する第２のハイドロゲルを含み、
前記移植片は外径１ｍｍ以上の大きさを有する、移植片。
前記半透膜の分画分子量が７０，０００〜５００，０００である、請求項１に記載の移植片。
前記移植片は、生体内に移植した場合に体液が侵入する凹部を有する、請求項１又は２に記載の移植片。
生体内に移植して２週間後において、表面に付着した前記生体由来の細胞の数が５×１０^５個／ｃｍ^２以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の移植片。
前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、前記生体と同種他家又は異種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の移植片。
前記移植片の表面と、前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞との間の距離が、前記細胞が生存可能な距離である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の移植片。
前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、内分泌細胞、外分泌細胞、神経系細胞、骨格筋系細胞、血液細胞及び間質細胞からなる群より選択された少なくとも１種の細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の移植片。
前記第１のハイドロゲルファイバに含まれる細胞が、複数種類の細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の移植片。
容器部と、
前記容器部の内部に着脱可能に配置された複数の柱状冶具と、
を含む、移植片製造装置。
請求項９に記載の移植片製造装置の前記容器部に第２のゾルを注入し、第２のハイドロゲルを形成する工程と、
前記第２のハイドロゲルの形成後に前記複数の柱状冶具を除去し、前記柱状冶具が存在していた部分が凹部を形成した第２のハイドロゲルを得る工程と、
前記凹部に細胞を含む第１のゾルを注入し、第１のハイドロゲルを形成する工程と、
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植片の製造方法。
第１の円筒部と、
前記第１の円筒部の内部に配置された複数の第２の円筒部と、
を含む、移植片製造装置。
請求項１１に記載の移植片製造装置の一方から前記第１の円筒部に第２のゾルを供給し、前記移植片製造装置の他方から排出される、前記第２のゾルの層流を形成するとともに、前記第２のゾルをゲル化させて第２のハイドロゲルを形成する工程と、
前記移植片製造装置の一方から前記第２の円筒部に細胞を含む第１のゾルを供給し、前記移植片製造装置の他方から排出される、前記第１のゾルの層流を形成するとともに、前記第１のゾルをゲル化させて第１のハイドロゲルを形成する工程と、を同時に行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植片の製造方法。