CN107645952A - 薄膜细胞包囊装置 - Google Patents

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Abstract

提供了包囊用于移植到受试者体内的细胞的薄膜装置，例如多层薄膜装置。还提供了使用主题装置的方法及其制备方法。所述薄膜装置包括第一多孔聚合物层和第二多孔聚合物层，所述第一多孔聚合物层和第二多孔聚合物层在其之间界定管腔并包囊管腔中的细胞群。该薄膜装置可以通过第一聚合物层和/或第二聚合物层中的孔促进血管化进入装置的管腔；限制异物对装置的响应；通过第一和第二聚合物层限制细胞、免疫球蛋白和细胞因子进入管腔；并从第一聚合物层和/或第二聚合物层释放由所述细胞群分泌的分子。

Description

薄膜细胞包囊装置
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年3月23日提交的美国临时专利申请号62/136,997的权益，该申请以引用形式完整地并入。
前言
在过去几年内细胞替代疗法已经取得了空前的进展，包括通过胰岛移植在人体中实现胰岛素不依赖性的能力(Atkinson等人,Lancet 2014,383,69–82；Orlando等人,Diabetes 2014,63,1433–1444；Hatziavramidis等人,Ann.Biomed.Eng.2013,41,469–476)。干细胞技术的进步保持了克服许多患者供体短缺的潜能，这些患者可以得益于胰岛替代疗法。特别地，干细胞衍生的β细胞提供了实现胰岛素不依赖性的富有希望的新的细胞来源。令人遗憾地，需要终生全身免疫抑制来防止使得患者处于器官损伤、感染和恶性肿瘤风险中的移植细胞被排斥(Ludwig等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,110,19054–19058；Shapiro等人,N.Engl.J.Med.2000,343,230–238)。细胞包囊提供了保护移植细胞不发生与免疫抑制相关的并发症的可替代方法。尽管正在研究许多策略(Huang等人,PLoSOne 2013,8；Shah,Biomatter 2013,3,1–7；Song等人,Mater.Sci.Eng.C.Mater.Biol.Appl.2014,40,197–203；De Faveri等人,Neuroeng.2014,7,7.；Robles等人,Cell Transplant.2013；Tomei等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2014,111,10514–10519)，但是存在几个与这些方法相关的挑战：可恢复能力(retrievability)、控制多孔尺寸、生物相容性、规模可伸缩性和可再现性的制造方法。
包囊装置的关键功能是创建允许作为对血糖波动的响应的正常胰岛素分泌的环境，同时通过隔离免疫系统和有效的营养物质和废物交换维持细胞活力。为了产生免疫保护的β细胞的目的，在过去的几十年中已经开发了各种微囊化和巨囊化方法(Scharp等人,Adv.Drug Deliv.Rev.2014,67-68,35–73；Weir,Diabetologia 2013,56,1458–1461；Buder等人,Immune Netw.2013,13,235–239,Julien等人,Fontiers Biosci.(Landmark Ed.)2014,19,49–76)。微观与宏观装置之间的根本区别在于规模问题：微囊化方法包囊单个细胞或胰岛，其使表面积与体积之比最大化并促进营养物交换的改善(Cala等人,ClinicalApplication of MicroencapsulatedActual Prospectives on Progressand Challenges.2014,68,84–92；Cornolti等人,Cell 2009,18,195–201)。然而，微囊化对膜厚度和孔径的控制是有限的。
另外，由于胰岛被单独包囊，所以每个移植物需要数以千计的微型装置，并且囊的大小使得实时成像和追踪成为重大挑战。相反，巨包囊装置容纳许多细胞或胰岛(Lathuilière等人,Biomaterials 2014,35,779–791)。这些较大的装置允许更好地控制膜参数，例如孔径和孔隙率，但是由于装置厚度和大的装置储库而受到有限的营养物扩散和细胞响应的困扰。除了这些挑战之外，典型地与巨包囊装置相关的锐利刚性结构可以导致异物响应且随后装置因纤维化包囊而失效(Ward,J.Diabetes Sci.Technol.2008,2,768–777；Ward等人,Biomaterials 2002,23,4185–4192)。
本公开解决了在生物材料递送领域中对有此需要的受试者的这些和另外的需求。
概述
提供了包囊细胞以便将细胞移植到受试者中的薄膜装置。还提供了制备本主题装置的方法和使用本主题装置的方法。该薄膜装置包括第一层、细胞群和第二层，其中第一层和第二层在设置在第一层和第二层之间的细胞外围的周围彼此接触。该薄膜医疗装置用于在受试者中提供包囊的移植细胞的方法中。该方法包括将薄膜装置移植到受试者中；促进装置的血管化；和/或抑制异物反应；和/或限制细胞因子、免疫球蛋白和细胞进入装置；并释放包囊细胞分泌的分子。
在某些实施方案中，公开了用于将细胞移植到受试者中的方法。该方法可以包括：(a)提供薄膜装置，其包含：(i)第一纳米多孔或微米多孔聚合物层；(ii)第二纳米多孔或微米多孔聚合物层，其中所述第一和第二层界定所述第一和第二层之间的管腔；和(iii)设置在第一和第二层之间的管腔中的细胞群，其中第一和第二聚合物层厚度各自小于15μm，并且该装置具有1cm2-5cm2的表面积，(b)将所述装置移植到受试者体内，其中观察到以下的一个或多个：(i)经由所述第一聚合物层和/或所述第二聚合物层中的所述孔血管化入所述装置的管腔；(ii)对所述装置的有限的异物反应；(iii)细胞、免疫球蛋白和细胞因子通过第一和第二聚合物层有限的进入管腔。
在某些实施方案中，该方法还可以包括从第一聚合物层和/或第二聚合物层释放由细胞群分泌的分子。
在某些实施方案中，所述细胞群可以在移植后存活至少一个月。
在某些实施方案中，所述细胞群包含胰岛细胞，并且其中密封在装置内的胰岛细胞通过分泌胰岛素来响应受试者的葡萄糖水平。在某些实施方案中，所述受试者患有糖尿病或倾向于发生糖尿病。
在某些实施方案中，第一和第二聚合物层是纳米多孔聚合物层，并且可以各自包括支持层，例如粘附到纳米多孔聚合物层的表面的微米多孔背层。
在某些实施方案中，第一和第二聚合物层是微米多孔聚合物层。
在某些实施方案中，第一聚合物层是纳米多孔聚合物层，且第二聚合物层是微米多孔聚合物层。
在某些实施方案中，使用聚合物聚己内酯(PCL)制造第一和第二聚合物层。
在某些实施方案中，第一和第二聚合物层沿装置的整个周边密封，从而提供封闭的管腔。
在某些实施方案中，所述管腔包括开口，在该开口处第一聚合物层和第二聚合物层不相互密封。
在某些实施方案中，所述管腔包括开口，在该开口处第一层和第二层彼此不接触，该装置还包含具有第一端和远离第一端的第二端的管道，其中所述管道的第一端位于所述开口中，并且所述第二端被配置为将所述细胞群导入所述管腔。
在某些实施方案中，所述管腔包含第一开口和第二开口，在第一开口和第二开口处第一层和第二层彼此不接触，所述装置还包含第一管道和第二管道，第一和第二管道各自包含第一端和远离所述第一端的第二端，其中所述第一管道的所述第一端位于所述第一开口中，并且所述第二管道的所述第一端位于所述第二开口中，并且其中每个管道的第二端用于流体从管腔进入或流出。
在某些实施方案中，该方法包括在移植之后，将第一和第二管道的第二端连接到填充端口。在某些实施方案中，填充端口包含在填充端口处与第一管道的第二端流体连通的第一腔室；以及在填充端口处与第二管道的第二端流体连通的第二腔室。
在某些实施方案中，提供了用于将细胞移植到受试者中的薄膜装置。该装置包括第一纳米多孔或微米多孔聚合物层；第二纳米多孔或微米多孔聚合物层，其中所述第一和第二聚合物层界定所述第一和第二聚合物层之间的管腔；和设置在所述第一聚合物层和所述第二聚合物层之间的管腔中的细胞群，其中第一层和第二层的厚度小于15μm，并且所述装置具有1cm2-5cm2的表面积，并且其中(a)第一和第二聚合物层中的孔限制细胞、免疫球蛋白和细胞因子通过第一和第二层进入管腔；和/或(b)孔的大小被设定为促进血管化入装置的管腔；和/或(c)所述装置被配置成限制异物对移植装置的反应；和(d)所述孔的大小被设定为释放由所述细胞群分泌的分子。在某些实施方案中，第一和第二聚合物层是纳米多孔层，并且可以各自包括支持层，例如粘附到纳米多孔聚合物层的表面的微米多孔背层。
在某些实施方案中，提供了用于制造本文公开的装置的方法。该方法可以包括将第一纳米多孔或微米多孔聚合物层置于第二纳米多孔或微米多孔聚合物层上，其中第一和第二聚合物层具有类似的尺寸；沿着聚合物层的周边密封第一和第二聚合物层，在沿着周边的位置处留下未密封的区域，以提供进入在第一、第二层与聚合物层密封在一起的聚合物层的周边之间界定的管腔的开口，通过开口将细胞群放入管腔中；并密封开口。在某些实施方案中，第一和第二聚合物层通过施加加热密封在一起。在某些实施方案中，第一和第二聚合物层通过涂覆粘合剂而彼此密封在一起。
本发明的这些和其它目的、优点和特征对于本领域技术人员在阅读下面更全面描述的装置和方法的细节后将变得显而易见。
附图简述
结合附图阅读下面的详细描述可以最好地理解本发明。需要强调的是，按照惯例，图的各种特征不是按比例的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意地扩大或缩小。图中包括以下数字：
图1.用于细胞包囊装置的PCL微米和纳米多孔薄膜制造。小图A)装置两步热封和细胞包囊的示意图。小图B)微米多孔薄膜的横截面SEM和(插图)膜表面的自上而下的图像。小图C)纳米多孔薄膜的横截面SEM和(插图)纳米多孔薄膜表面的自上而下的图像。小图D)装配装置的图像，展示装置的灵活性。
图2.体外装置功能。小图A)如使用mCherry荧光测定的包囊的MIN6细胞的体外装置生存力。小图B)包囊在微米或纳米多孔装置中的MIN6细胞的葡萄糖刺激指数。小图C)包囊在微米多孔装置中的初级胰岛的葡萄糖刺激。(p≤0.5,n≥3)
图3.体内装置图像和追踪。小图A)具有植入小鼠背部皮下空间中的包囊的MIN6细胞的装置。小图B)具有植入在小鼠肝脏上方的皮肤和肌肉下的包囊的MIN6细胞的装置。小图C)没有将细胞直接植入肾囊中的装置对照。具有在小图D)1天、小图E)30天、小图F)90天后具有植入的包囊的MIN6细胞的装置。
图4.微米多孔屏障抑制细胞侵入。小图A)在体内1个月后附着于微米多孔薄膜装置外表面的细胞的自上而下SEM图像。小图B)体内1个月后的微米多孔薄膜装置的横截面SEM图像，其显示了膜的完整性和内部和外部细胞的分离。
图5.细胞因子保护。1周内具有(实线)和无(虚线)细胞因子的细胞在微米多孔装置(小图A)和纳米多孔装置(小图B)中的生存力。(n≥4)
图6.装置血管化。小图A)7天、小图B)14天、小图C)30天和小图D)90天后植入的装置的明视野图像，具有在第7天和第90天的放大图像。小图E)从第7至第90天的装置血管化定量。(n＝3)
图7.装置外部SEM。小图A)植入前的装置外部。小图B)体内2个月后的装置外部。
图8.细胞因子影响细胞生存力。通过(-)无细胞因子对照、(+)细胞因子与TNFα、IL1β和IFγ的组合以及单独的TNFα、IL1β和Ifγ的cyquant测定对细胞数量量化。
图9.用于装置血管化的无细胞装置对照。小图A)多孔-PCL、小图B)无孔PCL、小图C)PLGA和小图D)PVDF 50天后植入的装置的明视野图像。
图10.装置的组织学。小图A)在体内2个月后用马森三色染色的装置的横截面。小图B)装置横截面放大图，其显示最小的纤维化反应。
图11.示例性薄膜装置。小图A)圆形薄膜装置，其包括用于进入装置管腔的开口，该开口包括用于进入装置管腔的管。小图B)具有细长开口和用于进入装置管腔的管的矩形装置。
图12.显示20nm PCL膜限制IgG扩散的示意图。
图13.显示包囊在纳米或大多孔装置中的人胚胎干(hES)绿色荧光(GFP)-胰岛素细胞在体外存活长达5周的示意图。
图14.小图A描绘了从包囊在具有有约2μm直径孔(200nm连通性)或有约20nm孔径的聚合物层的装置中的胰岛细胞释放c-肽。小图B描绘了包囊的胰岛细胞的葡萄糖刺激指数(GSI)。
图15.小图A)移植后2周内聚丙烯薄膜装置显示显著的异物反应(FBR)。小图B)移植后5个月PCL薄膜装置诱导最小的FBR。
图16.显示胰岛到达所述装置的入口和自所述装置的出口的机构的示例性薄膜装置。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本教导的实践或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是下面描述一些示例性方法和材料。
“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物，例如小鼠，大鼠，山羊，狗，猪，猴，非人灵长类动物或人。
如本文所用，“生物相容性”是指允许与受试者中延长接触组织而不引起毒性或显著损害的材料的性质。
如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treatment”、“treating”)是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或可以是部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的不良反应的治疗性的。如本文所用，“治疗”("treatment")涵盖受试者、特别是在人类中对疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病但尚未诊断为该病的受试者中预防疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，例如导致疾病消退，例如完全或部分消除疾病症状。
“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间期限下有效达到所期望的治疗结果的量。
如本文所用的“管道”(“tubing”)或“管”(“tube”)是指具有界定内部空间的圆柱形壁的细长结构。管道沿着管道的长度可以具有基本恒定的内径。细长结构的长度可以比宽度长5、10、20或更多倍。
如涉及管道的末端所使用的“末端”意在表示管道的末端或末端部分。管道的末端并不一定是指管的物理终端，不过管道的末端在某些情况下可能与管道中的物理中断相同，这取决于环境。
如涉及管道所使用的“内部体积”是指由内壁限定的管道中的空间的体积。
在本公开的装置的上下文中使用的“管腔”是指通过在装置的边缘周围密封第一和第二层而产生的空间或内部容积，其中这些层典型地是多孔的。
在本公开的装置的上下文中使用的术语“层”、“薄膜”或“膜”及其复数是指典型地由聚合物形成的装置的各个层。用于制造本公开的多孔装置的“层”、“薄膜”或“膜”典型地是多孔的并且可以是纳米多孔或微米多孔的。短语“纳米多孔层”、“纳米孔层”、“纳米多孔膜”、“纳米孔膜”、“纳米多孔薄膜”和“纳米孔薄膜”可互换使用，并且均指其中已经产生了纳米孔的聚合物层。纳米多孔层可以包括用于结构支撑的背层或支持层。背层可以是微米多孔层。短语“微米多孔层”、“微米孔层”、“微米多孔膜”、“微米孔膜”、“微米多孔薄膜”和“微米孔薄膜”可互换使用，并且均指其中已经产生微米孔的聚合物层。
如在本文提供的装置的管腔中设置的细胞环境中所使用的“包囊的”是指在装置的第一层与第二层之间界定的管腔中包含在装置内的细胞。
在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应当理解的是，这里使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个居间值至下限单位的十分之一也是具体公开的。在所述范围内的任何规定值或居间值与该规定范围内的任何其它规定值或居间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在外，并且其中任一个、两者无一或两个限制都包括在较小范围内的每个范围也包含在本发明内，在规定的范围内进行任何具体排除。在所述范围包括限制值的一个或两个情况下，排除那些所包括的限制值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述一些潜在且优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，并且描述以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解的是，本公开取代存在矛盾的程度上所结合的出版物的任何公开。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，对“一个细胞”的涉及包括多个这类单元，并且对“装置”的涉及包括对一个或多个装置的涉及等。
提供本文讨论的出版物仅仅是因其在本申请的提交日期之前公开。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这类出版物。此外，所提供的出版日期可能与需要独立确认的实际出版日期有所不同。
详细描述
如上所概述的，提供了用于将细胞群移植到受试者中的薄膜装置。本文还描述了用于制造这种装置的方法和使用这类装置的方法。
用于细胞移植的装置和使用方法
在某些实施方案中，用于将包囊的细胞群移植到受试者体内的装置可以包括第一纳米多孔或微米多孔聚合物层、第二纳米多孔或微米多孔聚合物层，其中第一和第二层接触沿着所述第一和第二层的外围彼此相互接触，从而在所述第一与第二层之间界定封闭的空间或管腔；以及设置在第一与第二层之间的管腔中的细胞群。
该装置构造成诱导最小的异物反应并促进血管化入装置。薄膜装置的多孔材料允许经由孔交换分子(例如氧气、营养素、细胞代谢废物、治疗性蛋白质的扩散)，但基本上不可渗透细胞和大蛋白质如免疫球蛋白，并且限制较小的蛋白质例如细胞因子转运通过所述孔。因此，本文公开的装置将存在于装置管腔中的细胞与受试者的免疫系统分离，但允许交换支持移植细胞的生存力和功能的小分子。
当包含细胞的可植入装置通过将其装入细胞不可渗透的层中而从免疫系统中分离出来时，可植入装置通常刺激局部炎症应答，称为异物反应(FBR)，其早已被认为是限制了需要溶质转运的植入装置的功能。FBR在文献中已被充分地描述，并由三个主要层组成。与植入装置相邻的最内侧的FBR层由巨噬细胞和异物巨细胞组成。这些细胞在植入装置的表面上形成紧密相对的细胞单层。相对于装置位于第一层远侧的中间FBR层是主要由成纤维细胞和纤维基质组成的宽区域(30-100微米)。最外面的FBR层是包含新血管的疏松结缔颗粒组织。在诱导FBR时，将植入装置与限制分子与植入装置交换的体内环境隔离，从而限制植入装置的应用并且导致植入装置内提供的任何细胞死亡。
本文公开的装置不诱导显著的FBR，如通过本公开的植入装置周围缺乏纤维化以及装置中的细胞长时间生存力而证明的。
本文所公开的装置在移植到受试者中时支持存在于装置管腔中的细胞存活至少1个月、至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年、5年或以上。
本公开的装置对于细胞是基本不可渗透的，使得细胞不以可检测的数量穿过第一和第二聚合物层。本公开的装置对于免疫球蛋白是基本上不可渗透的，使得进入装置管腔的任何免疫球蛋白的浓度低于针对存在于装置管腔内部的细胞的免疫应答所需的水平。本公开的装置基本上限制细胞因子进入装置的管腔，使得进入装置的管腔的细胞因子的浓度低于针对装置管腔内部存在的细胞的免疫应答所需的水平。
本文公开的装置典型地是平面的并且可以具有任意二维平面形状。在某些实施方案中，该装置可以是圆形、椭圆形、正方形、矩形或其组合。在一些实施方案中，该装置可以是基本上圆形的并且可以具有在1cm-5cm之间的直径。
在某些实施方案中，所述装置可以包括用于增加装置的刚性的附加层。例如，该装置可以包括沿该装置的侧边设置的材料层。附加层可通过防止装置在放置到受试者中的过程中和/或在放置到受试者中之后折叠而有助于维持装置为基本上平面的装置。材料层可以是与用于第一层或第二层的材料相同的材料，或者可以是不同的材料。
在某些实施方案中，所述装置可以完全沿着装置的边缘密封，从而形成完全封闭的内部空间或管腔。在其他实施方案中，所述装置可以在装置的边缘处的一个或多个位置处开放，以允许进入装置的内部空间或管腔。当该装置包括两个进入装置管腔的开口时，两个开口可以彼此相对地定位，例如在平面装置的相对侧上。
在某些实施方案中，该装置可以包括具有一个或多个开口的管腔，在该开口处第一和第二聚合物层不密封在一起。该装置可以进一步包括插入所述开口中的管道。在某些实施方案中，可以通过在开口处将第一层和第二层密封到管道的外壁来将管道附连到装置。在某些实施方案中，管道的第一端可以被放置在开口处并位于管腔中，使得最小体积的管腔被管道接纳，同时允许流体装载到装置的管腔中。管道的远离第一端的第二端可以用作经由管道将流体导入管腔的端口。
在某些实施方案中，该装置可以包括两个开口，在该开口处第一层和第二层不被密封在一起，从而界定具有两个开口的管腔。每个开口可以包括放置在开口处的管道。第一开口可以被用作用于将流体(例如，包含细胞的细胞培养基)导入到装置的管腔中的进入端口，并且第二开口可以被用作用于将流体(例如，包含死细胞、细胞碎片等的流体)从装置的管腔中排出的外出端口。如本文所述，置于管腔内的管道的长度可以保持在最小以使管腔中的细胞群可用的体积最大化。通过将装置的第一层和第二层在每个管道的第一端处密封到管道的外壁，可以将管道附连到装置。形成一个或多个进入装置管腔的进入端口的管道的第二端可以在不用于进入管腔的内部时被关闭。第二端可以通过在第二端处形成塞而被封闭。在某些情况下，所述塞可以是硅酮塞。
可以基于许多因素来选择管道的长度。例如，在将细胞群离体装载入装置的管腔时，例如在将装置放置到受试者体内之前，可使用较短的管道。如果在将所述装置放置到受试者中之后将所述管道用于将流体导入和/或从所述装置的管腔中去除流体，则可以使用较长的管道。
在某些情况下，所述装置可以包括第一聚合物层和第二聚合物层，所述第一聚合物层和所述第二聚合物层沿着所述边缘彼此密封，而非生成由所述密封边缘界定的且具有两个开口的管腔的两个位置。第一管道的第一端可以放置在两个开口中的第一个处。第二管道的第一端可以放置在两个开口中的第二个处。第一和第二管道的第一端可以通过将第一层和第二层密封到装置的外壁而固定到装置上，使得管腔围绕管道的外壁密封。第一和第二管道的第二端可以连接到将装置转换成可再填充的封闭系统的远程填充端口。远程填充端口可以包含实体可检测背层，如果背层是磁性的，则允许例如经由磁体探测器对端口进行经皮定位。远程填充端口可以包括位于端口中的两个分开的腔室，用于进入第一管道的第二端和第二管道的第二端。在某些情况下，所述管道可以是例如硅酮管道。端口还可以在其基部包含缝合垂片以允许在植入时缝合到软组织，从而有助于抵抗端口的转动或移动。WO 2016/028774中描述了示例性的远程填充端口，该文献在此通过引用整体并入。
在某些实施方案中，所述装置和/或装置中的细胞群可以在将装置放置到受试者体内之后进行可视化。例如，所述装置和/或细胞可以是荧光的，并且因此可以通过对其中放置有装置的受试者的身体的一部分进行成像来可视化。如果所述将装置完全放置在受试者体内，则荧光装置可以有利于移除所述装置和/或接近装置的管道。
如本文所述，所述装置可以包括可以是纳米多孔或微米多孔的第一层和可以是纳米多孔或微米多孔的第二层。微米多孔和/或纳米多孔层可以如美国专利申请公开号20140170204中所述那样形成，其全文以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，所述装置的第一和/或第二层可以是微米多孔的。微米多孔层中的孔径范围可以为1μm-5μm，例如，1μm-4.5μm、1μm-3.5μm、1μm-2.5μm、1μm-2μm、1.5μm-3μm、1.5μm-2.5μm、1.5μm-3μm、1.5μm-5μm，例如，1μm、2μm或3μm。如本文所解释的，微米多孔层中的孔可以通过形成包括水不溶性聚合物和作为水溶性聚合物的成孔剂的层来形成。成孔剂在不溶于水的聚合物层中形成球体，该球体沿水不溶性聚合物层的宽度并且通过水不溶性聚合物层的厚度分散。该球体确定孔直径，并且当跨越水不溶性聚合物层的厚度(水不溶性聚合物层的横截面)连接时，多个球体在球体溶解时提供穿过水不溶性聚合物层的连续通道。为了形成微米多孔层，通过将该层暴露于水溶液中来溶解水溶性聚合物的球体，从而在整个微米多孔膜中形成空间/孔。所述空间/孔可以具有约1μm-5μm的直径。一系列空间/孔可以以依次通过水不溶性聚合物层的厚度的形式存在，并互连以提供通道，该通道可具有变化的直径。例如，在两个空间连接的通道中的区域(例如，在孔形成剂的两个球彼此接触并且被溶解以提供彼此连接的两个空间的情况下)可以具有比通道中的其它区小的通道直径。通道的最小直径可以被称为连通性直径。在某些实施方案中，连通性直径的范围可以在900nm-100nm、例如，900nm-150nm、900nm-200nm、700nm-100nm、700nm-150nm、700nm-200nm、500nm-100nm、500nm-150nm、300nm-100nm、300nm-150nm或300nm-200nm。
在某些实施方案中，所述装置的第一和/或第二层可以是纳米多孔的。纳米多孔层中的孔径可以为10-300nm、例如，20-300nm、30-300nm、10-200nm、20-200nm、30-200nm、10-100nm、20-100nm、30-100nm、30-50nm、30-40nm、20-250nm、20-150nm或25-150nm，例如，30nm、50nm、100nm、150nm或300nm。在某些实施方案中，纳米孔层可以包括背层以在结构上支撑纳米孔层。在某些实施方案中，背层可以是微米多孔层，例如本文所述的微米多孔层。
在某些实施方案中，所述装置的第一和/或第二层可以具有至少50％，例如至少55％、至少60％、至少65％或至少70％、例如50％-70％、55％-70％或55％-65％的孔隙率，所述装置的第一纳米多孔聚合物层和第二纳米多孔聚合物层的％孔隙率可以由用于制造该层的纳米棒的数量来控制。类似地，该装置的第一微米多孔聚合物层和第二微米多孔聚合物层的％孔隙率可以通过在微米多孔聚合物层的制造期间使用的成孔剂(例如，水溶性聚合物)的量来控制。
如本文所述，所述装置是薄层装置，其中所述装置的各个第一和第二层的厚度均小于30μm。照此，第一层和第二层的厚度小于30μm，例如小于25μm、20μm、15μm、10μm或5μm，例如，厚度为20μm-10μm、25μm-5μm、20μm-5μm、15μm-5μm、15μm-10μm、13μm-10μm、13μm-8μm、12μm-8μm、11μm-9μm、10μm±5％。
在某些实施方案中，整个装置的厚度小于60μm并且具有0.5cm2-5cm2的表面积，例如大于0.75cm2、大于1cm2、大于1.5cm2、大于2cm2、大于2.5cm2、大于3cm2、大于3.5cm2、大于4cm2、大于4.5cm2和至多5cm2的表面积。装置可以包括第一层和第二层。两层都可以是微米多孔或纳米多孔的。微米多孔聚合物层中的孔的直径在1μm-5μm，连接直径在本文所述的范围内。纳米多孔聚合物层中孔的直径为10nm-300nm，例如，20-300nm、30-300nm、10-200nm,10-50nm、20-200nm、30-200nm、10-100nm、20-100nm、30-100nm、20-250nm、20-150nm或25-150nm，例如，20nm、30nm、50nm、100nm、150nm或300nm。
在某些实施方案中，整个装置的厚度小于50μm并且具有0.75cm2-4.5cm2/侧的表面积。微米多孔聚合物层中的孔的直径在1μm-3μm，其中孔的连通性直径(穿过通道的直径)可以在900nm-100nm，例如，900nm-150nm、900nm-200nm、700nm-100nm、700nm-150nm、700nm-200nm、500nm-100nm、500nm-150nm、300nm-100nm、300nm-150nm或300nm-200nm。纳米多孔聚合物层中的孔的直径为20nm-100nm，例如，40-100nm、30-50nm、20-50nm或25-100nm，例如，20nm、30nm、50nm或100nm。
在某些实施方案中，整个装置的厚度小于40μm并且具有1cm2-4cm2/侧的表面积。微米多孔聚合物层中的孔的大小在1μm-3μm，其中该范围内的连通性直径如本文所述。纳米多孔聚合物层中的孔的大小为25nm-100nm，例如，25-75nm、30-50nm、25-50nm或25-40nm，例如，25nm、30nm、50nm或100nm。
在某些实施方案中，整个装置的厚度小于30μm并且具有1cm2-2cm2/侧的表面积。微米多孔聚合物层中的孔的直径在1μm-3μm，其中该范围内的连通性直径如本文所述。纳米多孔聚合物层中的孔的直径为30nm-100nm，例如，30-75nm、30-50nm、40-100nm、40-75nm、40-50nm、50-100nm或50-75nm，例如，30nm、40nm、50nm、60nm或80nm。例如，第一层和第二层可以各自为10μm±3μm厚度。在某些实施方案中，第一层可以是微米多孔的，而第二层可以是纳米多孔的，或反之亦然。
在某些实施方案中，所述装置包括第一层和第二层，每层厚度各自为10μm±3μm，其中整个装置每面具有1cm2-2cm2/侧的表面积。第一层和第二层是纳米多孔的，并且纳米多孔聚合物层中的孔的直径在30nm-100nm，例如，30-75nm、30-50nm、40-100nm、40-75nm、40-50nm、50-100nm或50-75nm，例如，30nm、40nm、50nm、60nm或80nm。在其它实施方案中，第一层和第二层是微米多孔的，并且微米多孔聚合物层中的孔的直径在1μm-3μm(例如2μm±0.5μm直径)，连通性直径范围在900nm-100nm，例如，900nm-150nm、900nm-200nm、700nm-100nm、700nm-150nm、700nm-200nm、500nm-100nm、500nm-150nm、300nm-100nm、300nm-150nm或300nm-200nm。
本公开的装置被构造成防止免疫细胞进入装置的管腔并且基本上抑制抗体和细胞因子进入管腔，同时促进与包囊的细胞的营养物交换和由包囊的细胞分泌的治疗性蛋白的释放以及代谢废物从装置中扩散出来。形成本公开的薄膜装置的薄层的孔和厚度被配置为允许小分子例如盐、糖、氨基酸、多巴胺、葡萄糖、胰岛素的通过，并且基本上抑制大分子例如抗体、C3b、细胞因子(例如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等)和细胞通过。第一和第二多孔聚合物层被构造成允许具有小于10kDa的分子量和/或小于2nm的流体动力学半径的小分子交换。第一多孔聚合物层和第二多孔聚合物层被配置为基本上限制具有大于15kDa的分子量和/或大于2nm的流体动力学半径的大分子穿过所述层并进入装置的管腔。
可以使用任何聚合物材料来形成本文公开的装置的第一和第二多孔层。代表性的聚合物包括甲基丙烯酸酯聚合物，聚乙烯亚胺和硫酸葡聚糖，聚(乙烯基硅氧烷)-共聚聚乙烯亚胺(ecopolymerepolyethyleneimine)，磷酰胆碱，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚氨酯，聚(乙二醇)，聚(乳酸-乙醇酸)，羟基磷灰石(hydroxyapetite)，聚(乳酸)，聚羟基戊酸酯和共聚物，聚羟基丁酸酯和共聚物，聚己内酯，聚二氧环己酮(polydiaxanone)，聚酐，聚氰基丙烯酸酯(polycyanocrylates)，聚(氨基酸)，聚(原酸酯)，聚酯，胶原蛋白，明胶，纤维素聚合物，壳聚糖和藻酸盐或其组合。可用于涂覆支架的其它实例包括但不限于：胶原蛋白，纤连蛋白，胞外基质蛋白，纽蛋白，琼脂和琼脂糖。应当理解，可以使用聚合物的不同混合物。
在某些实施方案中，第一层和/或第二层可以由聚(己内酯)(PCL)形成。用于形成第一层和/或第二层的PCL可以具有高于50kDa的数均分子量(Mn)，例如高于55kDa、60kDa、65kDa或70kDa和至多200kDa，例如，50-200kDa、55-200kDa、60-200kDa、65-200kDa、70-200kDa、50-150kDa、55-150kDa、60-150kDa、65-150kDa、70-150kDa、50-100kDa、55-100kDa、60-100kDa、65-100kDa、70-100kDa、50-90kDa、55-90kDa、60-90kDa、65-90kDa或70-90kDa。此外，PCL聚合物的分子量可以基于在基本上没有聚合物降解的情况下将装置维持在受试者体内的持续时间来选择。
在生理学条件下，可生物降解的聚合物例如PCL聚合物通过随机断链降解，这导致两相降解。最初，随着分子量降低，物理结构不受显著影响。降解发生在整个聚合物材料中，并且进行至达到临界分子量时，此时降解产物变得足够小以被溶解。在这一点上，结构开始变得明显更多孔和水合。在某些情况下，当装置用于向受试者提供移植细胞至少一年时，可以使用较高分子量的聚合物。例如，当需要装置维持多孔聚合物层的完整性达至少一年时，多孔聚合物层可以由聚合物制成，该聚合物具有至少70kDa Mn，例如，至少75kDa Mn、至少80kDa Mn或至少85kDa Mn或至少90kDa Mn和至多100kDa Mn。在其中装置被配置为降解6个月的实施方案中，第一和第二多孔聚合物层可以由较低分子量的聚合物形成，例如具有10-20kDa的Mn的聚合物。
在一些实施方案中，生物可降解聚合物包括聚合物的共混物，其中聚合物可以具有相同或不同类型的聚合物，并且每种聚合物可以具有不同的MW。在一些实施方案中，生物可降解聚合物包括高MW聚合物和低MW聚合物的共混物。高MW聚合物可以具有约25kDa或以上，例如约30kDa或以上、约40kDa或以上、约50kDa或以上、约60kDa或以上、约70kDa或以上、约80kDa或以上、约90kDa或以上或约100kDa和至多150kDa。低MW聚合物可以具有约20kDa或以下，例如约15kDa或以下、约10kDa或以下、约8kDa或以下、约6kDa或以下和低至4kDa。
在一些实施方案中，聚合物共混物中高MW聚合物与低MW聚合物的质量比约为1:9-约9:1，例如约2:8-约8:2、约2:8-约6:4或约2:8-约1:1。在某些实施方案中，高MW聚合物与低MW聚合物的质量比约为3:17、约2:8、约1:3、约3:7、约7:13、约2:3、约9:11、约1:1、约11:9或约3:2。
在某些实施方案中，用于将细胞移植到受试者体内的薄膜装置不包含聚(乳酸-共-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚偏氟乙烯(PVDF)、藻酸盐、胶原蛋白、明胶、琼脂糖、硅、磷酸纤维素或聚丙烯(PP)。
在某些实施方案中，装置的外表面可以通过设置改善装置的一种或多种试剂来改性。例如，促进装置的血管化或抑制对装置的免疫或炎症应答的分子可以被设置在装置的外部上。这类分子包括但不限于VEGF(血管内皮生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、FGF-1(成纤维细胞生长因子)、血管生成素MCP-1、αvβ3、αvβ5、CD-31、VE-钙依粘连蛋白、肝配蛋白、纤溶酶原激活剂、血管生成素、Del-1、aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)、vFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、卵泡抑素、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、HGF(肝细胞生长因子)、瘦素、胎盘生长因子、PD-ECGF(血小板衍生内皮生长因子)等。
本公开的装置用于在受试者中提供包囊细胞。提供包囊的细胞的方法包括提供如本文提供的薄膜装置，例如多层薄膜装置；将薄膜装置移植到受试者中；通过第一聚合物和/或第二聚合物层中的孔促进血管化入装置的管腔；限制异物对装置的响应；通过第一和第二聚合物层限制细胞、免疫球蛋白和细胞因子进入管腔；并从第一聚合物层和/或第二聚合物层释放由细胞群分泌的分子。本文公开的装置可以促进血管化入装置的管腔，使得装置的至少20％在移植入受试者后一个月内血管化，例如移植入受试者后一个月内至少30％血管化，40％血管化，50％血管化，60％血管化。本文公开的装置可以限制细胞因子和免疫球蛋白通过第一聚合物层和第二聚合物层中的孔扩散，使得与没有屏障层的存在下的扩散相比的扩散率小于50％，小于40％，小于30％，小于20％。
将本公开的装置的尺寸确定为容纳用于治疗有需要的受试者的移植细胞的有效数量。例如，受试者可以患有由功能性细胞缺乏引起的病症，例如，其中典型地由功能性细胞分泌的分子不被分泌或以导致病症的水平分泌。提供功能细胞可以缓解这种病症。示例性的病症包括1型糖尿病、帕金森病、肌营养不良症等。
可以将装置移植到体内任意适合的位置，例如皮下，腹膜内或脑中，脊髓，胰腺，肝，子宫，皮肤，膀胱，肾，肌肉等。可以基于需要治疗的患病/损伤组织来选择植入部位。为了治疗例如糖尿病(DM)这样的疾病，可以将该装置放置在临床上方便的位置，例如皮下空间或网膜。
使用本文描述的装置进行移植的细胞群包括但不限于骨髓细胞；间充质干细胞，基质细胞，多潜能干细胞(例如诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞)，血管细胞，源自脂肪组织的前体细胞，骨髓衍生的祖细胞，肠细胞，胰岛，Sertoli细胞，β细胞，胰岛的祖细胞，β细胞的祖细胞，外周血祖细胞，从成人组织分离的干细胞，视网膜祖细胞，心脏祖细胞，骨祖细胞，神经元祖细胞和遗传转化的细胞，或其组合。包囊的细胞可以来自受试者(自体细胞)，来自另一个供体(异体移植细胞)或来自其他物种(异种细胞)。可以将细胞导入装置的管腔中，并且可以将该装置即刻(在一天内)植入受试者中或可以将细胞培养较长期限，例如大于一天，以便在植入前允许细胞增殖。导入装置管腔中的细胞数量可以变化并且可以根据经验确定。
在某些实施方案中，本文公开的装置可用于治疗患有糖尿病例如1型糖尿病的人。该装置可以包括胰岛细胞或可以包括能够分化成胰岛细胞的干细胞。在某些实施方案中，多潜能干细胞(PSC)可以在装置内分化成胰岛细胞，且然后将包含分化的胰岛细胞的装置置于受试者中(例如在网膜中，与胰腺或肝脏相邻)。在一些情况下，该装置可以包括PSC，并且该装置可以被植入在受试者的胰腺或肝脏附近。
如本文所述，本文公开的装置可以将移植细胞维持在功能和活力状态至少1个月，并且自多为至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月的期限或至多1年或更长的期限。在某些情况下，将装置的完整性维持至少一年，并且装置中的细胞可以使用附接到装置的管道(例如，通过远程填充端口)用新的细胞群代替，而该装置位于受试者体内。
本文公开的方法和装置可以用于人临床和兽医应用。因此，施用该装置的受试者或患者可以是人，或者在兽医应用的情况下，可以是实验室、农业、家庭或野生动物。本装置和方法可应用于动物，包括但不限于人类，实验室动物，例如猴和黑猩猩，家养动物，例如狗和猫，农业动物，例如牛，马，猪，绵羊，山羊，和圈养中的野生动物，例熊，熊猫，狮子，老虎，豹，大象，斑马，长颈鹿，大猩猩，海豚和鲸鱼。
制备方法
还提供了制备主题装置的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得或制造第一微米多孔或纳米多孔聚合物层和第二微米多孔或纳米多孔聚合物层，其中第一和第二层的尺寸相似。第一层具有第一表面和与第一表面相对的第二表面。第二层也具有第一表面和与第一表面相对的第二表面。该方法进一步包括将第二层定位在第一层上，使得层的边缘对齐，并且第二层的第二表面与第一层的第一表面面对配置。该方法还包括将第二层的第二表面密封到第一层的第一表面上。密封物可以沿着第一和第二层的侧边缘形成，从而在第二层的第二表面与第一层的第一表面之间形成封闭的空间或管腔。密封物最初可以沿着第一和第二聚合物层的侧边缘形成，同时留下未密封的边缘。可以通过开口将细胞群导入管腔中，然后可以通过将第二层的第二表面密封到第一层的第一表面上来封闭开口，由此将细胞群装入装置内。
可以使用任何获得或制造微米多孔或纳米多孔聚合物层的方法。例如，可以使用如下文献中公开的方法制造微米多孔聚合物层和纳米多孔聚合物层：专利申请公开号US20140170204,Steedman等人,Biomedical Microdevices,12(3)(2010)363-369,Bernards等人,J.Ocul.Pharmacol.Ther.2013,29,249–257；Bernards等人,Adv.Mater.2010,22,2358–2362；或Bernards等人,Nano Lett.2012,12,5355–5361，其各自通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，可以经由开口将细胞群装载到管腔中。在其它实施方案中，可以将管道插入开口并将其用于将细胞群装载到管腔中。在某些情况下，可以使管道从开口缩回，并且在细胞群已经被导入管腔之后密封开口。
在某些实施方案中，通过将第二层的第二表面和第一层的第一表面密封到管的外壁，可以将插入到开口中的管道固定到装置上。
在某些实施方案中，所述密封物可以最初沿着第一和第二聚合物层的侧边形成，同时在两个位置留下未密封的边缘，由此提供进入管腔的第一和第二开口。第一管道的第一端可以插入到第一开口中，并且通过将第一层和第二层密封到管道的外壁而将管道原位固定。第二管道的第一端可以插入到第二开口中，并且通过将第一层和第二层密封到管道的外壁而将管道原位固定。每个管道的第二端可以被配置为附接到远程填充端口以形成可再填充的封闭系统，例如，在体内放置该装置之后，每个管道的第二端可以被附接到远程填充端口，例如WO 2016/028774中描述的远程填充端口。
将第一层和第二层彼此密封或将第一层和第二层与管道密封可以使用粘合剂或通过使用加热或溶剂熔化层来进行。两层的密封可以在层的最外边缘处或在与层的最外边缘相邻的位置处。
在一些实施方案中，所述装置可以包括沿着装置的边缘设置的第三聚合物层，以便向该装置提供较厚的边缘。该第三聚合物层可以沿着装置的整个边缘或其一部分设置。由第三聚合物层覆盖的装置的边缘的部分可以通过装置将被布置的体内位置来确定。可以通过使用粘合剂、加热或溶剂以将这些层熔合在一起将第三层固定在装置的边缘上。第三层可以是无孔聚合物层或微米多孔聚合物层。第三层可以具有至少10μm的厚度，例如，至少30μm、100μm、300μm、500μm、1mm或2mm或以上，例如，100μm-2mm、300μm-2mm、500μm-2mm或1mm-2mm。
在其中使用纳米多孔聚合物层来制造装置的实施方案中，纳米多孔层可以包括微米多孔背层。用于结构支撑纳米多孔聚合物层的微米多孔聚合物层可以由与纳米多孔层相同的聚合物制成。将微米多孔聚合物层施加到纳米多孔层，使得两层在两层的表面上彼此接触。当形成所述装置时，具有微米多孔背层的纳米多孔层可以以任一取向使用。
在某些实施方案中，使用可被加热的环形套管来进行密封。一种示例性的方法包括使用加热至用于制造该装置的聚合物(例如，PCL)的熔化温度以上的温度(例如80℃)的U形金属丝。可以将该金属丝放置在两层下方并加热，从而在邻近金属丝的位置熔化两层。在一些实例中，第一和第二多孔聚合物层可以放置在包埋在PDMS(Sylgard 184)中的U形镍铬合金丝上。丝的直径可以基于管腔的期望的体积来选择。为了固定第一和第二层，可以将重物(例如PDMS重量)放置在保持它们平坦的第一和第二层上。然后可以将电流施加到金属丝上以熔化各层并界定管腔形状并留下开口。可以选择金属丝的尺寸和形状以产生期望尺寸的装置。在将细胞装载入管腔内之后，可以封闭装置的开放侧。
在某些实施方案中，使用激光束来进行主题方法的密封步骤以加热薄膜层的界定区域，例如围绕其中排布细胞的区域的圆形区域。在某些实施方案中，主体方法的密封步骤通过在第一层和第二层中的一个或两个上设置粘合材料来进行。例如，可以将粘合材料设置在第一层和/或第二层上围绕其中形成管腔的区域的区域中。当两层接触时，粘合剂可以密封两层。或者，粘合剂可以是热敏粘合剂或压敏粘合剂。在这些实施方案中，可以施加热或压力以密封薄膜装置的各层。本领域技术人员将会理解，有效地将第一层和第二层相互密封或与管道密封的任何方法都可用于制造本文所述的装置。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为其发明的范围，也不预期代表下面的实验是全部或者唯一的实验。已经努力确保所使用的数字(例如数量，温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是在大气压或接近大气压。
材料和方法：
除非另有说明，否则化学品购自Sigma Aldrich，且细胞培养材料购自Universityof California,San Francisco(UCSF)的细胞培养设施。所有的薄膜以1000rpm旋转铸塑到硅晶片上30秒，然后以2000rpm的速度旋转30秒。用Carl Zeiss Ultra 55Field-Emission扫描电子显微镜、使用透镜内二次电子检测器来表征装置。
微米多孔薄膜制造
由通过在65℃搅拌至溶解制备的150mg/mL PCL(70-90kDa Mn)和聚乙二醇(PEG,2kDa Mn)在2,2,2-三氟乙醇中的溶液旋转铸塑微米多孔PCL薄膜。旋转-铸塑后，通过浸入水1小时溶解PEG，得到具有约2μm直径的孔的微米多孔PCL薄膜。装置为1cm直径，导致表面积为1.57cm2/侧，其中孔隙率为67.5±1.3％，且密度为0.37±0.02。
纳米多孔薄膜制造
使用在另外部分中报道的建立的基于模板的方法形成纳米多孔PCL膜(Bernards,D.A.and Desai,T.A.,Adv.Mater.2010,22,2358-2362)。简言之，将在2-甲氧基乙醇中的乙酸锌二水合物和乙醇胺的0.5M溶液旋转铸塑到硅晶片上，并在热板上在300℃退火以生成氧化锌(ZnO)晶种层。从这种晶种层，在85-90℃在5mM乙酸锌溶液中热水生长ZnO纳米棒2小时。然后将150mg/mL PCL溶液旋转铸塑到纳米棒上，接着旋转铸塑150mg/mL PEG:PCL溶液提供微米多孔支撑，从而形成具有微米多孔背衬支持层的纳米多孔薄膜。将该薄膜浸泡在稀硫酸溶液中以蚀刻去除ZnO纳米棒并且还溶解PEG，从而得到由微米多孔背层支撑的具有30nm-100nm的孔的纳米多孔膜。先前确定了膜表征和ZnO纳米棒形态(Bernards等人,J.Ocul.Pharmacol.Ther.2013,29,249–257；Bernards等人,Adv.Mater.2010,22,2358–2362；Bernards等人,Nano Lett.2012,12,5355–5361)。
无孔膜制造
无孔PCL膜由150mg/mL PCL(70-80kDa Mn)在2,2,2-三氟乙醇中的溶液(其通过在65℃下搅拌直至溶解制备)铸塑。由300mg/mL PLGA(85:15LA：GA 45kDa Mn)在2,2,2-三氟乙醇溶液中的溶液旋转铸塑无孔聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)薄膜。聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜由Sigma预制并切割成形。
薄膜装置的组装
装置由使用镍铬合金线的电阻加热而热密封在一起的两个PCL薄膜组成。使用两步热封方法，其中1.2Amp的电流流经镍铬合金线，描绘待密封的区域。对于第一个密封步骤，将两个膜放置在包埋在PDMS(Sylgard 184)中的直径1cm的U形镍铬合金线上。为了固定膜，将PDMS重物放置在薄膜上，使其保持平坦。1.2Amp电流在金属丝中流过持续30秒钟，并将该装置密封成U形，从而确定了装置的腔体形状，并为细胞注射留下了开放侧。将高糖Dulbecco改进Eagle(DME)中的150万MIN6细胞通过剩余的开口侧注入装置。其次，通过将开放边缘放置在包埋在PDMS中的直镍铬合金线上并用1.2Amp电流热封30秒来密封装置的剩余侧。
使用扫描电子显微镜检查对薄膜和装置的表征
将微米多孔和纳米多孔薄PCL膜固定在具有胶体石墨的平坦SEM架上(Ted Pella,Inc.)。将横截面在异丙醇中快速浸渍，随后液氮冷冻断裂，然后固定。将来自体内实验的装置用3.7％甲醛固定30分钟，用去离子水洗涤3次，然后在递增的乙醇浓度下依次脱水并固定。
细胞培养
使用标准培养基条件(Miyazaki,等人,Endocrinology 1990,127)培养MIN6细胞。在UCSF使用由Lentiviral Core设计的慢病毒属构建体导入mCherry和嘌呤霉素抗性的基因。使用感染复数为2的标准方案转导细胞，并且使用嘌呤霉素选择转导的细胞。将编码萤火虫萤光素酶和绿色荧光蛋白的基因类似地导入MIN6细胞中。使用标准胰岛分离方案在UCSF通过Islet Core分离初级胰岛(Szot等人,J.Vis.Exp.2007,1640,255)。
葡萄糖刺激的胰岛素分泌
使用葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定分析胰岛素分泌。将细胞在包含5mM葡萄糖的培养基中静置30分钟，然后使用包含15mM葡萄糖的培养基进行刺激。在加入高葡萄糖后30分钟和60分钟，收集培养物上清液。使用酶联免疫吸附测定法(Mercodia)测量培养上清液中的胰岛素蛋白质含量。使用在高至低葡萄糖条件下分泌的胰岛素的比例来计算葡萄糖刺激指数。
细胞因子测定
为了确定细胞因子对包囊的β细胞生存力的影响，在由在具有10％胎牛血清、1％青霉素和1％链霉素的高糖DME培养基中的TNFα(300ng/mL；VWR)、IL1β(110ng/mL；VWR)和IFNγ(200ng/mL；Fisher)组成的细胞因子混合物中培养在微米或纳米多孔装置中的250,000个细胞。使用标准分光光度计，将装置每天成像mCherry信号。对于每个相应的装置测量7天的信号强度，并相对于初始信号进行校准。
生物发光成像
将具有表达萤光素酶的MIN6(MIN6.LUC)细胞的薄膜装置植入MOD.Cg-PrkdcscidIIl2rgtm1Wjl/SxJ(NSG)或BALB/C小鼠的背面皮下空间、肌肉壁与肝脏之间的腹腔(NSG)。通过使用Xenogene IVIS 200成像系统(Perkin Elmer)监测萤光素酶活性来评估体内包囊细胞的持久性。移植了MIN6.LUC细胞的动物在成像之前8分钟用D-荧光素溶液(Goldbio,St.Louis,MO)以150mg/kg的剂量IP注射以捕获生物发光强度峰值，如前所述(Fowler等人,Transplantation 2005,79,768–776)。将小鼠用异氟醚混合物(在98％O2中2％)麻醉，并通过使用Xenogen IVIS 200成像系统成像。获取生物发光图像1分钟，然后使用Living Image分析软件(Xenogen Corp.,Alameda,CA)分析。感兴趣区域(ROI)集中在生物发光区域中心。在采集时间内，在ROI内计数光子。结合相同的成像方案确保一致的信号检测，并使我们能够比较至少3个月内获取的数据。
组织学
采集小鼠组织样品并在4％多聚甲醛中固定24小时，用磷酸盐缓冲盐水在4℃洗涤48小时，然后用30％蔗糖洗涤24小时。然后将样品带到UCSF的Mouse Pathology Core，并且在最佳切割温度(OCT)包埋，切片，并且进行苏木精-伊红染色或马森三色染色，或者在UCSF由Mouse Pathology Core或His tology and Imaging Core染色。
脉管系统
在移植后7、14、30和90天，用腹膜内注射2.5％阿佛丁溶液(Sigma)麻醉带有PCL装置的小鼠，并使用Leica MZ16F显微镜(Leica Biosystems,Wetzlar,Germany)进行光学成像。通过颈椎脱臼使动物安乐死，并且采集包囊的装置用于进一步分析。使用ImageJ软件分析包囊的移植物的图像。通过红色像素的自动计数除以装置内ROI的面积来测量血管密度；预先为红色通道设置了阈值以扣除背景。
本公开描述了制造和表征的聚己内酯(PCL)薄膜巨囊化装置作为解决现有微囊和巨囊化方法的挑战的创新策略。薄柔性设计允许类似于微胶囊方法的扩散和灵活性，而所述装置表面积允许精确的膜控制和可回收性，即与更大的巨囊化技术相关的特征。本文描述的研究显示包囊细胞显示生存力、功能、免受免疫细胞侵入而受到的保护、免于细胞因子介导的细胞死亡和新生血管形成。PCL已经被用于FDA批准的医疗装置中，并已经在多种动物模型中证明了长期的生物相容性(Bernhardt等人,Biomatter.2012,2,158-265；Bernards,D.A.和Desai,T.A.Soft Mater.2011,6,1621-1631；Bernards等人J OculPharmacol Ther.2013,29,249-257；Bernards,D.A.和Desai T.A.Rev Adv MaterSci.2010,22,2358-2362；Abedalwafa等人Rev Adv Mater Sci.2013,34,123-140；Angius等人,Biomaterials 2013,33,8034-8039)。另外，可以调整PCL降解以匹配包囊细胞的寿命，而不需要去除装置(Bernards,等人,Nano Lett.2012,12,5355-5361；Mendelsohn等人,Langmuir.2010,26,9943-9949)。多孔PCL薄膜的应用允许设计具有微米或纳米级特征的薄且柔性的装置，从而导致更好的营养物交换、精确的膜控制和装置追踪。在这项研究中，MIN6细胞系(一种已知能够以胰岛素分泌来响应葡萄糖的公认的小鼠胰岛素瘤细胞系)被用作胰岛β细胞的模型。使用MIN6细胞在整个实验中提供了可持续和一致的细胞来源。初级胰岛也被用来证明包裹细胞的长期生存力。
我们描述了微米多孔和纳米多孔PCL薄膜细胞囊包囊置的制造、这些装置中的细胞行为以及这些装置在同种异体移植物小鼠模型中的体内整合。为了设计这些包囊装置，改造几何结构以合并巨囊化装置的精确膜控制的优点与微囊化装置的改进的营养物交换。此外，PCL的选择基于其分子量范围、可调节的降解特性、灵活性以及在FDA批准的医疗装置中作为无毒性材料的应用。使用两种不同的方法来制造用于薄膜装置的微米和纳米多孔膜。微米多孔膜利用溶液中PEG和PCL的相分离。在该方法中，在铸膜之后，成孔剂(PEG)被溶解，留下微米多孔薄膜(Bernards等人,Nano Lett.2012,12,5355-5361)。通过调节两种聚合物薄膜的比例和组成的浓度，可以针对各种孔隙率和结构调整膜(Bernards等人,SoftMater.2011,6,1621–1631；Bernards等人,Nano Lett.2012,12,5355-5361；Lu等人,Int.J.Pharm.2011,419,77–84；Lin等人,J.Control.Release 2003,89,179–187；Rong等人,Int.J.Pharm.2012,427,242–251；Anzai等人,Colloids Surfaces B Biointerfaces2015,127,292–299；Lei等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2011,78,49–57；Online,V.A.；Ledeuil,J.B.；Uhart,A.；Allouche,J.；Dupin,J.C.；Martinez,H.New Insights intoMicro/Nanoscale Combined.2014,11130–11140)。纳米多孔薄膜由氧化锌纳米棒模板制成，并以微米多孔支持层为背层。可以容易地调节氧化锌纳米棒的尺寸，从而允许宽范围的孔径并且使得能够进一步改进这些装置(Kim等人,Nanotechnology 2014,25,135609；Zhang等人,Chemistry 2005,11,3149–3154)。
图1,小图A图示地详述了用于热封两个薄膜以产生单个装置的方法。两步密封将装置的形状从细胞包囊中分离出来。第一热封步骤控制装置尺寸。一旦装置轮廓被密封，则细胞被插入到薄膜装置的管腔中，并且第二热封步骤包囊细胞。可以基于界定装置密封的镍铬合金线的形状任意选择装置几何形状，典型地直径为1cm-5cm，允许装置根据需要扩大规模以包含更多的细胞。
使用扫描电子显微镜(SEM)观察具有约2μm孔径和约10μm的膜厚度的微米多孔薄膜(图1,小图B)。类似地，具有微米多孔背层的纳米多孔薄膜的SEM图像横截面和自上而下的图像显示10μm的膜厚度和30nm-100nm范围内的纳米孔隙(图1,小图C)。薄的设计、柔韧性、材料的顺应性和装置的结构作为整体产生了细胞包囊装置，其易于以精确地膜控制进行处理(图1,小图D)。注意到在水溶液中的氧扩散是100μm-200μm，这些具有10μm膜厚度的薄膜装置减少了对足够的氧消耗所需的脉管系统的接近度(Wendt,等人,Adv.Mater.2009,21,3352–3367；Martin等人,Biomaterials 2005,26,7481–7503)。鉴于装置的薄膜特性，总细胞含量随装置面积按比例变化，而细胞距装置外部营养源的平均距离得以维持，从而结合了微包囊技术和巨包囊技术的优势。该装置的薄膜设计结合快速装置血管化将为包囊细胞提供足够的氧气。
如由mCherry信号中的持续性所定义的，通过6天包囊在微米或纳米多孔装置中的表达mCherry的MIN6细胞在体外维持活力，并且能够维持葡萄糖刺激的胰岛素分泌(图2,小图A)。葡萄糖刺激指数是通过比较高葡萄糖状态下的胰岛素释放相对于静息状态的比率来量化β细胞功能的量度。包囊在微米或纳米装置中的MIN6细胞在其葡萄糖刺激指数上没有统计学显著性改变(图2,小图B)。此外，包封在这些装置中的新鲜分离的小鼠胰岛在体外20天期限内维持其葡萄糖刺激指数，其相对于单独游离的胰岛显著改善，其自第1天起葡萄糖刺激指数降低超过25％(图2,小图C)。这证明β细胞胰岛素对葡萄糖的反应保持在纳米和微米多孔薄膜装置中。此外，作为β细胞主要功能的葡萄糖传感和胰岛素分泌不受微米-或纳米-装置中包囊的影响。
使用生物发光成像可以在受体小鼠中实时监测移植细胞的生存力和持久性。该技术用于监测体内表达萤光素酶的MIN6(MIN6.LUC)细胞，其被包囊到植入肝脏上方的腹部(图3,小图A)下的薄膜装置中或者在小鼠背侧的皮下空间中的肌肉层上(图3,小图B)或植入同基因B6小鼠的肾囊(图3C)中的未包囊的细胞。薄膜装置设计与生物发光成像兼容，因此允许在体内追踪包囊的细胞。表达萤光素酶的MIN6.LUC细胞被包囊入薄膜装置中，并将装置植入肝脏上方的腹部下方或小鼠背侧皮下空间中的肌肉层上方(图3,小图D-F)。生物发光信号随装置植入深度而降低，并且两个植入的装置位置在视觉上比无装置肾囊对照更明亮。生物发光信号的持久性表明通过植入90天维持生存力。由于生物发光信号追踪装置的位置，所以它也提供了一个非侵入性的方法来追踪装置的运动。因为包囊的细胞没有被固定在装置内，并且装置本身没有被缝合或束缚到任何组织，所以包囊的细胞的细胞重组或者每日的小鼠移动可以导致生物发光信号的移动。
理想的免疫保护需要物理排除免疫细胞以及限制免疫介体例如对β细胞有毒性的细胞因子的扩散。通过将细胞包裹在微米多孔装置中，可以实现细胞接触介导的免疫保护，并且可以利用纳米多孔装置实现另外的细胞因子介导的免疫保护。包囊在薄膜装置中的细胞与体内环境物理隔离，正如在图4,小图A清楚地观察到的，其中细胞附着于装置的外表面，但没有发现渗入装置管腔。尽管细胞粘附在装置表面上，但是孔最可能由于周围组织的有限的纤维化反应而保持不阻塞(图7)。图4,小图B显示SEM横截面，其中细胞附着于装置的外表面。未观察到细胞过程延伸到装置中，通过从周围的体内组织中分离包囊的细胞，进一步证实装置防止细胞-接触介导的相互作用的能力。通过进一步控制膜的孔隙率，可以另外实现细胞因子介导的免疫保护。已知肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)和干扰素γ(IFNγ)炎性细胞因子分别杀伤β细胞，并且当联合存在时协同起作用。选择它们是为了测试该装置防止细胞毒性细胞因子的能力(Tracey,K.J.The Inflammatory Reflex.2002,420,853–859；Bastiaens,P.When It Is Time to Die.2009,459；Libert,C.A NervousConnection.2003,421,328–329；Wang等人,Cell 2008,133,693–703.).(图8)(Fonseca等人,Int.Immunopharmacol.2014.；Roff等人,Front.Immunol.2014,4,498；Yang等人,Mol.Endocrinol.2014,me20131257)。有意义地，尽管微米多孔薄膜装置不能维持细胞生存力(图5,小图A)，但在这些薄膜装置中使用纳米多孔层缓解了细胞因子介导的生存力降低(图5,小图B)。目前尚不清楚细胞因子是否完全从装置的管腔分离，鉴于与纳米孔相关的细胞因子的大小，预计一部分细胞因子通过膜。纳米多孔装置的保护作用是细胞因子通过膜的有限运输和扩散导致，使得细胞对细胞因子浓度降低无应答。考虑到所使用的细胞因子混合物浓度超过已知的细胞毒性浓度10倍，我们预计大部分细胞因子受到纳米多孔屏障的限制。这进一步强调了如何使用微米多孔和纳米多孔膜来控制期望的细胞响应。
体内装置血管化对于包囊细胞的长期存活是必不可少的。包囊在薄膜装置中的包围细胞的血管化对于包囊细胞的功能和存活是重要的。为了监测装置血管化的状态，将装置植入，然后在7、14、30和90天时移除并成像(图6,小图A-D)。在植入后14天观察到细胞包囊的薄膜装置的血管化的第一个可见迹象(图6，小图B)。这些装置在两个月期限内表现出每日1.5％的体内血管形成稳态增加(图6,小图E)。如同植入的具有类似血管形成的无细胞装置所示(图9,小图A,B)，这些PCL装置的血管化在没有任何补充的前血管生成因子情况下发生。当与常用聚合物植入材料PLGA(图9,小图C)和PVDF(图9,小图D)比较时，PCL无细胞装置展现出发育更显著和更多分支的脉管系统。此外，观察到相对最小的异物反应(图10)。
图11,小图A描述了PCL薄膜装置。该装置包括在其间限定管腔的两个纳米多孔层。每个纳米多孔层具有用于结构支撑的微米多孔背层。两个纳米多孔层在装置的周边处沿着整个圆周彼此附接，而非在所述层没有彼此接触并限定进入装置的管腔的开口的入口区。将塑料管插入开口并保持在两层之间的位置。另外，沿装置的周边设置1mm-2mm厚的PCL层的第三层，以增加周边处的刚性。图11,小图B描述了具有两个其间界定了管腔的纳米多孔层(每个纳米多孔层具有微米多孔背层)的PCL薄膜装置的另一个实施方案。
图12描绘了IgG穿过无孔层、20nm多孔层和200nm多孔层的扩散的结果。构建了3种不同的薄层PCL装置。每个装置包括两个PCL层，所述两个PCL层在所述装置的周边沿着整个圆周彼此附接，而非在所述层没有彼此接触并限定进入装置的管腔的开口的入口区。使用两个PCL层构建无孔膜装置，在制造期间纳米多孔或微米多孔未被导入到所述PCL层中。使用两个纳米多孔层构建20nm的多孔膜装置，每个纳米多孔层具有20nm的平均孔径并且在结构上由微米多孔背层支撑。使用两个平均孔径为2μm、连通性直径为200nm的微米多孔层构建200nm的多孔膜装置。将IgG装载到每个装置中，然后将装置密封封闭，然后使装置浸泡在标准缓冲盐溶液中，其中使用标准蛋白质测量分析来测定IgG通过多孔层从装置管腔向外部溶液的释放。
图13示例hES GFP-胰岛素细胞在根据本文公开的方法制备的微米多孔或纳米多孔薄膜装置中存活40天。用于产生数据的微米多孔装置由两个在～10μm厚的PCL薄膜中形成的具有～2μm宽孔的微米多孔PCL层制成(薄膜中的通孔具有约200nm的连通性直径)。用于产生数据的纳米多孔装置由两个纳米多孔PCL层制成，其具有在～10μm厚的PCL膜中形成的30nm-100nm宽的孔。将该装置皮下植入BalbC小鼠的背侧。
图14使用了与图12所使用的相同的装置。小图A描绘了包囊在200nm的多孔膜装置或20nm的多孔膜装置中的胰岛细胞的c-肽释放。将装置中的胰岛细胞暴露于包含2mM葡萄糖或20mM葡萄糖溶液的培养基中。暴露于2mM或20mM葡萄糖后30min时采集培养物上清液。使用酶联免疫吸附测定法(Mercodia)测量培养上清液中的胰岛素蛋白质含量。小图B示例了葡萄糖刺激指数(计算为高与低葡萄糖条件下分泌的胰岛素之比)。
图15显示对由聚丙烯制成的薄膜装置(小图A；等级4)和根据本文公开的方法制成的PCL装置(小图B；等级2)的异物响应(FBR)。聚丙烯(PP)薄膜装置包括切成与PCL装置相同大小的两个PP薄层。PP层是无孔的。PCL装置包括两个PCL层，其中一层是微米多孔的，而另一层是纳米多孔的。将PP装置皮下移植到BalbC小鼠的背侧，并在2周后测定。将PCL装置皮下移植到BalbC小鼠的背侧，并在5个月后测定。
图16描绘了具有两个进入在薄膜层之间形成的管腔的开口的薄膜装置的示意图。两个开口使得入口管和出口管原位固定。入口管和出口管可以在使用之间通过使用塞例如硅塞封闭。薄膜装置还可以包括抑制免疫系统的分子(例如，PD-L1蛋白)。
发明人已经证明了结合微包囊和巨包囊策略的一些益处的创新的细胞包囊装置的成功制造和使用。柔韧性的薄膜几何形状允许精确的膜孔隙率选择来指导期望的细胞响应和相互作用，同时维持包囊的β细胞的正常葡萄糖响应。小储存容量可以对外部刺激做出快速响应，从而限制装置储器的稀释干扰。类似于具有大的表面积与体积比的微囊化装置，本文所述的薄膜装置结构不受装置厚度的限制。此外，包囊在微米或纳米装置中的细胞表现出与未包囊的细胞一致的葡萄糖刺激指数，这表明葡萄糖传感和反应性胰岛素分泌被成功保留。本文描述的装置允许足够的生物发光透射穿过装置膜以用体内成像系统测定。正如体内所示，装置膜在包囊的细胞与宿主环境之间产生物理屏障，从而以物理方式防止细胞接触启动的信号传导。此外，并入纳米多孔膜使得这些装置阻碍细胞因子通过并保护被包囊的细胞免受细胞因子介导的细胞死亡。另外，体内研究显示具有有限的纤维化的装置周围的血管形成，这表明对于该装置作为长期的细胞包包囊置提供了巨大希望。
本文描述的用于细胞移植的薄膜细胞包囊装置可用于通过控制孔尺寸-抑制特异性相互作用来直接研究细胞接触依赖性或可溶性因子介导的信号传导。这些装置具有防止免疫细胞与包囊细胞接触的能力，并且纳米多孔装置可以保护包囊细胞免于细胞因子诱导的细胞死亡。其它用途包括使用这些装置体内研究免疫攻击的模式，无论是接触还是可溶性因子介导的。这些薄膜PCL装置作为用于治疗例如1型糖尿病这样的疾病的可植入细胞包囊置具有巨大的潜能。
上述仅示例了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，尽管本文没有明确地描述或示出，但具体体现了本发明的原理并且被包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为推进本领域而贡献的理念，并且应被解释为不限于这类具体描述的实例和条件。此外，在本文中列举本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。此外，预期这类等效物包括当前已知的等效物和即将研发的等效物，即，研发的执行相同功能的任何元素，而与结构无关。因此，本发明的范围并不旨在限于本文所示和所述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来具体体现。

Claims (33)

1.用于将细胞移植到受试者中的方法，该方法包括：
(a)提供薄膜装置，其包含：
(i)第一纳米多孔或微米多孔聚合物层；
(ii)第二纳米多孔或微米多孔聚合物层，其中所述第一和第二层界定第一和第二层之间的管腔；和
(iii)设置在第一与第二层之间的管腔中的细胞群，其中第一和第二聚合物层的厚度小于15μm，且所述装置具有1cm2-5cm2的表面积；
(b)将所述装置移植入受试者，其中观察到如下情况中的一种或多种：(i)经由所述第一聚合物层和/或所述第二聚合物层中的孔隙血管化入所述装置的管腔中；(ii)对所述装置的异物反应有限；(iii)经由第一和第二聚合物层进入管腔的细胞、免疫球蛋白和细胞因子有限。
2.权利要求1的方法，还包括从第一个聚合物层和/或第二聚合物层中释放由所述细胞群分泌的分子。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞群在移植后存活至少1个月。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述细胞群包含胰岛细胞，且其中该胰岛细胞通过分泌胰岛素响应于受试者的葡萄糖水平。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述受试者具有糖尿病或倾向于发生糖尿病。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中第一和第二聚合物层为纳米多孔聚合物层。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中第一和第二聚合物层为微米多孔聚合物层。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中第一聚合物层为纳米多孔聚合物层，且第二聚合物层为微米多孔聚合物层。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中第一和第二聚合物层包含聚己内酯(PCL)。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中第一和第二聚合物层沿所述装置的整个周边密封，由此提供封闭的管腔。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述管腔包含开口，在所述开口处第一和第二聚合物层没有彼此密封。
12.权利要求1-8任一项的方法，其中所述管腔包含开口，在所述开口处，所述第一层和所述第二层彼此不接触，所述装置还包含管道，所述管道包含第一端和远离第一端的第二端，其中所述管道的所述第一端位于所述开口中，并且所述第二端被构造成将所述细胞群导入所述管腔。
13.权利要求1-8任一项的方法，其中所述管腔包含第一开口和第二开口，在所述第一开口和所述第二开口处，所述第一层和所述第二层彼此不接触，所述装置还包含第一管道和第二管道，所述第一和第二管道中的每一个包含第一端和远离所述第一端的第二端，其中所述第一管道的所述第一端位于所述第一开口中，并且所述第二管道的所述第一端位于所述第二开口中，并且其中每个管道的第二端用于流体从管腔进入或流出。
14.权利要求13的方法，其中该方法包括在移植后，使第一和第二管道的第二端附接到填充端口。
15.权利要求14的方法，其中所述填充端口包含在所述填充端口处与所述第一管道的所述第二端流体连通的第一腔室；以及在填充端口处与第二管道的第二端流体连通的第二腔室。
16.用于将细胞移植到受试者体内的薄膜装置，所述装置包含：
第一纳米多孔或微米多孔聚合物层；
第二纳米多孔或微米多孔聚合物层，其中所述第一和第二聚合物层界定所述第一和第二聚合物层之间的管腔；和
置于第一和第二聚合物层之间的管腔中的细胞群，
其中第一层和第二层的厚度小于15μm，并且所述装置具有1cm2-5cm2的表面积，并且其中(a)第一聚合物层和第二聚合物层中的孔限制细胞、免疫球蛋白和细胞因子经由第一和第二层进入管腔；(b)所述孔的大小被确定为促进血管化入所述装置的管腔；(c)所述装置被配置为限制对所述移植装置的异物反应；以及(d)孔的大小被确定成释放由所述细胞群分泌的分子。
17.权利要求16的装置，其中所述第一和第二聚合物层为纳米多孔层。
18.权利要求16的装置，其中所述第一和第二聚合物层为微米多孔层。
19.权利要求16的装置，其中所述第一聚合物层为纳米多孔聚合物层，且所述第二聚合物层为微米多孔聚合物层。
20.权利要求16-19任一项的装置，其中第一和第二聚合物层包含聚己内酯(PCL)。
21.权利要求16-20任一项的装置，其中所述第一和第二聚合物层沿所述装置的整个周边密封，由此提供封闭的管腔。
22.权利要求16-20任一项的装置，其中所述管腔包含开口，在该开口处所述第一和第二聚合物层彼此不密封。
23.权利要求16-20任一项的装置，其中所述管腔包含第一开口和第二开口，在所述第一开口和第二开口处所述第一和第二聚合物层彼此不接触。
24.权利要求16-20任一项的装置，其中所述管腔包含开口，在所述开口处所述第一聚合物层和所述第二聚合物层彼此不接触，且所述装置还包含管道，所述管道包括第一端和远离第一端的第二端，其中所述管道的第一端位于所述开口中，并且所述第二端被构造成将所述细胞群导入所述管腔。
25.权利要求16-20任一项的装置，其中所述管腔包含第一开口和第二开口，在所述第一开口和第二出口处所述第一聚合物层和所述第二聚合物层彼此不接触，且所述装置还包含第一管道和第二管道，所述第一和第二管道各自包含第一端和远离第一端的第二端，其中所述第一管道的第一端位于所述第一开口中，并且所述第二管道的第一端位于第二开口中，且其中所述管道的第二端用于流体从管腔进入或流出。
26.权利要求25的装置，其中所述装置包含连接至所述第一管道和所述第二管道的第二端的填充端口。
27.权利要求26的装置，其中所述填充端口包含在所述填充端口处与所述第一管道的所述第二端流体连通的第一腔室；以及在所述填充端口处与所述第二管道的所述第二端流体连通的第二腔室。
28.用于制造如权利要求16-27任一项所述的装置的方法，该方法包括：
将第一纳米多孔或微米多孔聚合物层置于第二纳米多孔或微米多孔聚合物层上，其中所述第一和第二聚合物层具有类似的尺寸；
沿着聚合物层的周边密封所述第一和第二聚合物层，在沿着周边的位置处留下未密封的区域，以提供进入在所述第一、第二层与聚合物层密封在一起之处的聚合物层周边之间界定的管腔的开口；
通过开口将细胞群体放入所述管腔；和
密封所述开口。
29.权利要求28的方法，其中所述第一和第二聚合物层为纳米多孔层。
30.权利要求28的方法，其中所述第一和第二聚合物层为微米多孔层。
31.权利要求28的方法，其中所述第一聚合物层为纳米多孔聚合物层，且所述第二聚合物层为微米多孔聚合物层。
32.权利要求28-31任一项的方法，其中所述第一和第二聚合物层通过施加加热而被密封在一起。
33.权利要求28-31任一项的方法，其中所述第一和第二聚合物层通过施加粘合剂而被密封在一起。
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